Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рибосомные белки Thermus thermophilus. Выделение, физико-химические свойства и кристаллизация

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рибосомные белки Thermus thermophilus. Выделение, физико-химические свойства и кристаллизация"



ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

СЕДЕЛЬШКОВА Светлана Эртельевна

РИБОСОМНЫЕ БЕЖИ ГНЕЯШЙ ТНЕНМОРШШБ ВЫДЕЛЕНИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискании ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

УДК 577.963.3

Москва - 1991

Работа выполнена в Институте белка АН СССР Научный руководитель: кандидат биологических наук, М.Б.Гарбер

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, В.Р.Мелик-Адамян кандидат биологических наук Е.К.Давыдова

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им.

В.А.Энгельгарда АН СССР

Защита состоится "13" рктуТрь 1991 г. в _ час

на заседании Специализированного ученого совета Д.098.12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции • промышленных микроорганизмов по адресу: 112545, Москва, 1-й Дорожный пр., д.1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Всесоюзногс научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Автореферат разослан смтл^ря 1991 г.

Ученый секретарь Совета

кандидат биологических наук

В.И.Щербаковг

-1-

Общая характеристика работы

Актуальность^троблемы. Изучение молекулярного механизма ■разования пептидной связи в рибосоме является одной из даейших задач молекулярной биологии. Для понимания молекулярных ханизмов работы рибосомы необходимо изучить ее структуру не 'лько на молекулярном, но и на атомном уровне. Такой уровень ¡ания может обеспечить, только рентгеноструктурный анализ. За юледние годы наметился прогресс в применении этого метода к ;учению структуры рибосомы. Это стало возможным после получения металлов рибосом и их субчастиц из термофильных и галофильных жрооргашзмов ( ВасиНиз згеагоШегторМДиз, ТЬегтиэ 1егторМ1иэ, Ба1оЪас1ег1ит тог1БЮОгШ1). В настоящее время |Иболее перспективными для рентгенографических исследований ;ляются рибосомы экстремального термофила Т1г. ШегторЬПиз. •лучены кристаллы ЗОБ и 50Б субчвстиц и целой. 70Б рибосомы из 'ого микроорганизма. Многокомпонентная, несимметричная рибосома, 'Стоящая из трех различных молекул РНК. и примерно пятидесяти клекул различных белков, с общей молекулярной массой около 6"106Д, является очень сложным объектом для нтгеноструктурного анализа. Поэтому важно параллельно с следованием кристаллов рибосом и субчастиц проводить •нтгвнострунтурныв исследования отдельных компонентов рибосом,

том числе и . рибосомных белков. Полученные для них нтгенографические данные высокого разрешения позволят в даль-йшем уточнить данные, полученные, для субчастиц и 70Б рибосом.

Ц§5ь_работы - выделение, физико-химическая характеристика и металлизация рибосомных белков из ТЬегтиэ гЬегторЬИиэ.

На^чная_новизна_и_практетеская_цещост . Данная

|бота посвящена созданию биохимической базы для дальнейших 'руктурных исследований рибосомных белков из ТЬегтиз 1еглюрМ1ш. Она содержит ряд оригинальных методик для работы с [босомами из этого микроорганизма, в том числе методики очистки ¡босом и разделения их на субчастицы, методику выделения ряда [босомных белков из 503 субчастиц без применения денатурирующих ■ентов, методику получения пригодных для рентгеноструктурного [ализа кристаллов белка ТБ9(56) из малых субчастиц рибосом._ В

результате впервые получены в препаративных количествах 11 Селю из 5QS субчастиц рибосом Thermus thermophilus. Для ряда эта белков получены физико-химические характеристики - определе: молекулярные массы, аминокислотный состав, коэф£ицие! экстинкции. Два из них (TL5 и TL7) получены в кристаллическс форме. Впервые были выращены кристаллы бежа TS9 (S6), пригодш для рентгеноструктурного анализа.

ЩОшсацш_и_агтробащя_работы. По теме диссертащ опубликовано 10 работ. Материаллы диссертации представлялись i Международном Симпозиуме "Молекулярная организация биологичесга структур" (Москва, 1989), Третьей и Четвертой Международа Конференции "Кристаллизация биологических макромолеку. (Вашингтон, 1989, Фрайбург, 1991), на конкурсах научных раб< Института белка (1987, 1989, 1991).

Стр2ктща_[и_объем_работы. Диссертация состоит из введена обзора литературы, экспериментальной частй,, результатов и ¡ обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (140 ссылок Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включа! 41 рисунок и 14 таблиц.

Основное содержание работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ посвящен структурным исследование рибосомных белков. В историческом плане обозревается развит] этих исследований, приводятся данные по выделению и очисл индивидуальных« рибосомных белков, по первичной, вторичной пространственной структуре этих белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ представлены в шести главах.

Глава I. Очистка рибосом Thermus thermophilus и з разделение на субчастицы.

Количество и качество препаратов рибосом являютс фундаментом для всех дальнейших процедур в наших исследования: Так как нам необходимо получать препараты рибосомных белков больших количествах (десятки миллиграммов), мы стремимся получи1 препараты рибосом и субчастиц с максимальным выходом и достаточ: чистые.Для очистки рибосом и их разделения на субчастицы i

(FH^SO^M

О,?

работали методики, основанные на применении колоночной дрофобной хроматографии на носителе Butyl-Toyopearl 650S. Эти тодики примерно в десять раз эффективнее применявшихся ранее тодик с использыванием ультрацентрифугирования и зонального нтрифугирования. На рисЛ приведен профиль разделения субчастиц указаны условия, хроматографии на колонке с Butyl-Toyopearl ■OS.

иг/ил

Рис Л.Профиль элюцни рибосомных субчастиц Th.thermophilus с колонки с Butyl-Toyopearl 650S. Рибосомы (3,5 г) нанесены на колонку объёмом 350 мл в растворе, содержащем IM (NH4)2S04, 0.05М MgCL2, 0,15М

ffli4CL, 0.05М трис-HDL рН 7,5. Затем колонка промыта раствором,содержащим 1М (Ш4)504,0,002М MgCL2

0,4М NaCL, рН 5,0.Субчастицы элю-ировались в 1,4л градиента концентрации (NH4)2S04 от 0,7 до 0.I5M

в растворе, содержащем 0,4М У&СЬ

0.002М 5,5.

Глава 2. Выделение рибосомных белков из 50S субчастиц рибосом Thermua thermophilus.

Наиболее эффективные из известных методик выделения ¡босомных белков предусматривают применение денатурирующих 'ентов как для отделения белков от РНК, так и в процессе их ¡следующего хроматографического разделения. Для кристаллизации ¡обходимо получать препараты белков в возможно более нативном ¡де, поэтому мы отработали методику выделения группы белков из Б субчастиц без использывания денатурирующих агентов.

ч

N

503 \ У 30 S

2,6 Р ^ } 0,9 г • t

70S 0,44 р

10 20 30 40 50 60

а) Экстракция белков Th.thermophilus

из 50S субчастиц рибосом

В основе предложенной наш методики экстракции группы белков 5 50S субчастиц - обработка субчастиц 50% этанолом при. агрввании в присутствии одновалентных солей. При этом от 50S, Гбчастиц достаточно селективно отделяется группа из 9 белков П2. TL4-TL8, TL11*, TL12, ТЫ4) (Рис.2).

в «и»»--'

«« .„. • a

""«»á?.» ' ■

О"» в«.

Рис.2. Двумврше электрофореграммы белков из 30S субчастиц (а) 50S субчастиц (б) рибосом Th.thermophilus '

Были испытаны различные условия экстракции белков этс группы из 50S субчастиц в присутствии 50% этанола. Buj показана,что варьируя вид соли (NH^CL, LiCL, NaCL), í концентрацию и температуру обработки, от 50S субчастиц мош отделить группы белков, приведенные в таблице I.

Таблица I. Группы белков, экстрагирующиеся из 50S субчастш. рибосом Th.thermophilus при различных условиях экстракции смесью этанол-соль

Состав группы белков ! Условия экстракции

I) ТЫ 1* 0,5 М NH4CL, , 55°С, 50% EtOH

2) TL11 *, TL7, миноры TL2, TL5, TL8 1 ,2 М L1CL, 35°С, 50% EtOH

3) TL11 * ТЫ 4 . TL2, TL5-TL8, ТЫ 2, 1 ,5 М LiCL, 45°С, 50% EtOH

4) ТЫ 1 * , TL2, TX4-TL8, TL12, 1 м NH4CL, 60°С, 50% EtOH

TL14 0,5 М NH4CL, , 60°С, 50% EtOH

5) TL2, TL4-TL6, TL8-TL10.TL12, TL14, Т117, TL19, TL21, Т124, ТЬ25, TL27728, TI29 1,8 М LiCL, 45 С, 50% EtOH после экстракции группы 2) 1,2 М L1CL, 35°С, 50% EtOH

Показано, что по "экстрагирующей способности" использованные >ли можно расположить в ряд NH^Clx NaCL< L1CL. Повышение ¡мпературы экстракции при прочих равных условиях приводит к зеличению числа экстрагируемых белков и к повышению их выхода.

Группа белков, наиболее прочно связанных с 23S РНК, включает себя белки TL1, TL3, TL9, ТЫ О, ТЫЗ, TL15, TL16, ТЫ8, TL20 и жег быть удалена с РНК 6 М раствором ЫСЬ.

б) Разделение смесей рибосомных белков; экстрагирующихся из 50S субчастиц рибосом Th.tnermoph.llus смесью этанол-соль

Для хроматографического разделения полученных фракций зпользывались колонки с CM-Sepharose CL6B, CM-Sepharose Fast Low, CM-Toyopearl 650S, SP-Toyopearl 650S. Наилучшее разделение звяти белков достигается на колонке с CM-Sepharose CL6B (Рис.3).

Рис.3. Разделение белков,

экстрагированных из 5СБ субчастиц 50%-шол ШОП в присутствии 0,5!«! МВ^И.

при 60°С, на колонке с СМ-БерЬагозе СЪбВ. Объем колонки - 30мл,количество белка 200мг,скорость элюции II мл/час, объём фракции 5,8мл. Элюция градиентом концентрации ГГаСЬ от 0,04 до 0.44М в 0,6л раствора, содержащего о,05М На-Ас рн 5,6 0.005М р-меркаптоэтанола

в) Разделение фракции рибосомных белков, остающихся на РНК после обработки 50S субчастиц смесью атавол-соль

Белки, наиболее прочно связывающиеся с 23S РНК, были разделены на колонке с CM-Toyopearl 650S. При этом в чистом виде «ли получены белки ТЫ и ТЫЗ.

Итак, предложенная нами методика позволяет получать без [рименения денатурирующих агентов следующие белки из 50S ¡убчастиц рибосом Th.thermophilus: ТЫ, TL2, TL4, TL5, TL6, TLT,

TL8, TL11*, TL13 в препаративных количествах (5-20 мг белка из 2 г 50S субчастиц или из ~700 г биомассы). Белки ТЫ2 и ТЫ4 были получены в количестве 1-2 мг. Этих количеств достаточно для подбора.условий кристаллизации этих белков.

Глава 3. Некоторые физико-химические характеристик индивидуальных белков из 50S субчастиц рибосс Thermus thermophilus

а) Молекулярная масса

Молекулярная масса индивидуальных белков из 50S субчастк была оценена с помощью электрофореза в присутстви додецилсульфата натрия. Применение этого метода не гарантируе точного определения молекулярной массы из-за аномальног связывания додецилсульфат ионов некоторыми белками. В частности для рибосомных белков из E.coli истинная молекулярная масс оказалась на 10-15% ниже, чем определенная методе SDS-электрофореза. Поэтому мы использывали в качестве маркере молекулярной массы не только стандартные смеси белков (фир\ "Serva"), но и имевшиеся у нас белки из 30S субчастиц рибосс E.coli.Калибровочный график, построенный по этим белкам прошел ï 10% ниже.и параллельно графику,полученному для стандартных белке В таблице 2 приведены два значения молекулярной массы для каждого бежа, определенные по каждому из двух калибровочных графиков

б) Спектры поглощения в ультрафиолетовой области и коэффициенты экстинкции

Рибосомные белки - небольшие белки, содержащие небольше количество ароматических остатков в составе молекулы, поэтому и спектры поглощения в ультрафиолетовой области веськ характеристичны, для многих из них эти спектры могут применятьс для быстрой идентификации. Для некоторых белков были определен коэффициенты экстинкции (Таблица 3).

в) Аминокислотный еостав

Для белков ТЫ, TL2, TL5, TL6, TL7, ТЫЗ, ТЫ1*,бы определен аминокислотный состав. Определение проводили в повторностях4. Цистеин не определяли.

Таблица 2. Молекулярная масса ряда индивидуальных рибосомных • белков из ТПЛпегшорЬИиз (по данным БОБ-электрофореза)

Белок Молекулярная масса (кД) ! Число ! определений

по рибосомным белкам-маркерам ! по стандартным ! белкам-маркерам

ТЫ 27,1 30,0 1

тьг 23,8+0,7 26,2+0,8 3

ТЬ4 20,3+1,0 22,3+1,1 3

ТЬ5 21,8+0,5 24;0+0,6 4

ТЬ6 14,8+0,8 16,3+0,9 3

ТЬ7 21,4+0,5 23,5+0,6 3

ТЬ8 15,5+0,2 17,0+0,3 2

ТЫ 1 * 18,5; 13,5* 1

ТЫ 2 16,0+0,5 17,6+0,7 3

ТЫЗ 15,7+0,2 17,1+0,2 2

ТЫ 4 15,1+0,2 16,6+0,3 3

комплекс ТЫ1* содержит два вида полипептидов с массой молекулы, 1ределенной как 18,Б кД для большего и 13,5 кД для меньшего.

Таблица 3. Коэффициенты экстинкции для ряда индивидуальных белков из БОБ субчастиц рибосом ТЬ. ШегшорЬИиз

Белок

ТЫ Т12 ТЬ5 ТЬ6 ТЬ7 ТЫЗ

279

276 275 281

277

278

Коэффициент экстинкции ЩИ^ако.

1,23+0,08 0,46+0,02 0,43+0,02 0,64+0,03 0,47+0,03 1,14+0,09

-8- .

Глава 4. Кристаллизация индивидуальных белков субчастиц рибосом Thermus thermophilus

ИЗ 50

Некоторые из полученных рибосомных бблков были использованы в опытах по кристаллизации. Применялся метод диффузии паров в висящей капле. Белки

TL5 и ТL7 были полутени в кристаллической форме. Образование микрокристаллов белка TL5 наблюдалось при

использывании сульфата аммония в качестве осадителя. Кристаллы белка TL7 в виде гексогональных палочек

с соотношением диаметра к длине 1:5 были получены в присутствии сульфата аммония при рН 6,1. Максимальные

Рис.4.Кристаллы белкЕ TL7

размеры кристаллов составляли 0,07 мм

в диаметре и 0,35 мм в длину (Рис.'4).

Эти кристаллы слишком малы для их рентгеноструктурного айализа. Продолжается работа по получению более крупных кристаллов.

Глава 5. Пентамерный комплекс ÍL11 * ( аналог комплекс (17/Ы2)2Ы0 из Е.coli ) и белок TL11 ( анало1 белка L7/L12 из E.coli)

Пентамерный комплекс, образуемый в рибосомах E.cöli четыры молекулами белка L7/LI2 (белок L7 - ацетилированная по Н-концев? му остатку форма белка LI 2 ) и одной молекулой белка ЫО или ш аналогами из других организмов,является одним из самых интересш компонентов рибосомы. Функционально он связан с^дрохождением ГТ< зависимых реакций на рибосоме. Интересна структура комплекса. Б< лок L7/L12 из E.coli существует в растворе в виде димера. Предл< жены модели его структуры. В пентамерном комплексе два димера L7/L12 взаимодействуют с белком LIO.Окончательный ответ на вопр< о структуре этого комплекса, может дать только рентгеноструктур ный анализ. К настоящему времени с высоким разрешением получена структура глобулярного С-концевого домена белка L7/L12. Получен кристаллы комплекса из B.stearothermophilus.HO они оказались не

пригодаыми для рентгеноструктурного анализа. Таким образом, вопрос о структуре комплекса остается актуальным. Здесь мы приводим характеристику пентамёрного комплекса из Tli.thermophi.lus.

а) Выделение пентамерного комплекса ТЫ 1 * и белка TL11

Пентамерный комплекс ТЫ 1 * экстрагировали из 50S субчастиц 50%-ным этанолом в присутствии 0,5-1,0 M NH^CL или LtCL. В присутствии 0,5 M NH^CL комплекс ТЫ 1 * экстрагируется из рибосом Th.thermophilus при более высокой температуре, чем его аналоги из E.coli и В.stearothermophilus:

микроорганизм ¡ температура, необходимая для экстракции ! более 90% комплекса из 50S субчастиц

E.coli

В. s tearothermophilus

Th.thermophilus ¡ 55UC

Очист! комплекса проводили или на колонке с Sephacryl S-300 или на катионообменниках, как описано в главе 2 (Рис.3).

Белок TL11 экстрагировали из 50S субчастиц при 0°С 50%-ным этанолом в 0,5 M КН^СЬ. Очистку экстрагированного белка проводили на колонке с DEAE-Sepharose CL6B при рН 7,5. Чистота препарата белка более 9Ь% была достигнута после рехроматографии на колонке с DEAE-Toyopearl 650М при рН 6,5.

б)Молекулярная масса белков, составляющих комплекс ТЫ 1 *

На Рис.5 приведена SDS-электрофореграмма комплекса ТЫ 1 * и пентамерного комплекса из E.coli. Подвижность обоих компонентов комплекса TL11 * заметно меньше, чем у их аналогов из E.coli и соответствует белкам, молекулярная масса которых примерно на 14% больше. Таким образом, значения

молекулярной массы определяются Рис.5. SDS-электрофореграмма как 14 кД для меньшего компонента комплексов ТЫ 1 * (а) и и 19 кД для большего. (ЬТ/Ы2)2Ы0 из E.coli (б)

- - LIO

L7/LI2

а б

-10в) Стехиометрия комплекса TL11* и олигомерное состояние .белка ТЫ1 в растворе

Молекулярная масса комплекса TL11*, определенная методом равновесного центрифугирования, оказалась равной 76,4±5,5 кД, что хорошо согласуется со значением, рас.читанным, исходя из предположения о стехиометрии комплекса 4:1, то есть, 4 молекулы с молекулярной массой 14 кД и одна молекула с молекулярной массой 19 кД. (По аналогии с пентамерным комплексом (17Л,12)2Ы0 из E.coli).

Молекулярная масса белка TL11 в растворе была определена методом равновесного центрифугирования. Значение молекулярной массы белка было определено как 54 кД, что при молекулярной массе мономера в 14 кД соответствует тетрамерному состоянию.Итак, белок ТЫ 1 находится в растворе в основном в тетрамерной форме, в отличии от его аналога из E.coli, белка LT/L12, существующего в растворе в виде димера.

г) Калориметрические характеристики белка TL11 .

Определение калориметрических характеристик белка TL11 было проведено совместно с Е.И.Тиктопуло в Институте белка АН СССР. Полученные калориметрические характеристики белка ТЫ1 сравнили с аналогичными данными, полученными Гудковым с соавторами для белка L7/L12 из E.coli. Белок TL11 оказался гораздо более термостабильным, температура его плавления равна 92°С, а у белка L7/112 - 71°С. При этом энтальпия перехода оказалась одинаковой для обоих белков. Следовательно, термостабильность белка'ТЫ1 достигается за счет энтропийного фактора.

д) Кристаллизация фрагмента белка TL11

Учитывая интерес к структуре пентамерного комплекса и необходимость еб рентгеноструктурного анализа , мы предприняли попытки закристализовать как пентамерный комплекс TL11*, так и белок TL11. Попытки получить кристаллы пентамерного комплекса пока не увенчались успехом.Кристаллизация же белка ТЫ 1 оказалась невозможной из-за фрагментации молекул белка после непродолжительного хранения, как это наблюдается и для белка L7/L12 из

E.coli. Из таких препаратов фрагментированного белка при использовании в качестве осадителя сульфата аммония можно получить кристаллы (Рис.6) Эти кристаллы пока слишком малы для рентгенографических исследований. Работа с ними продолжается.

Глава 6. Белок TS9 (S6) из малых субчастиц рибосом Thermus thermophllus. Получение кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа

Кристаллы самого кислого белка из малых субчастиц рибосом TJi. thermophllus , обозначенного как TS9, были получены ранее С.Ч.Агаларовым и И.А.Елисейкиной. Определение аминокислотной последовательности на Я-концэ молекулы этого белка позволило идентифицировать его как S6.K сожалению, полученные кристаллы оказались мозаичными и не могли быть использованы для рентгенографических экспериментов. Здесь мы описываем получение кристаллов этого белка, пригодных для рентгеноструктурного анализа.

а) Получение препаратов белка TS9 (S6) для выращивания кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа

Мы предположили, что мозаичность кристаллов белка TS9 может быть обусловлена гетерогенностью молекул этого белка по длине и заряду, как это характерно для белка S6 из E.coll, имеющего на С-конце молекулы блок, содержащий от I до 6 остатков глутаминовой кислоты;. Мы провели фракционирование препарата белка TS9 на анионообменнике DEAE-Toyopearl 650И и получили после разделения 3 фракции белка - I, II, III (Рис.7).

Рис.6. Кристаллы фрагмента белка TL11.

ш

Рис.7.Хроматография белка ТБ9

0,3

0,2

I НаЗД.Н \ М

на 0ЕАЕ-Тоуореаг1 65Ш Количество белка 5 мг, объём колонки 1,5 мл, объём фракции 0,5 мл,

скорость элвдии 15мл/час

0,1

к

Градиент концентрации

КаСХ, от 0 до 0,1 М объё-

мом 40 мл в растворе, содержащем 0,02М трис-НСЬ рй20ос 9,0.

объЗ

ю '¿о

30

«о

б) Оптимизация условий кристаллизации белка ТБ9

При кристаллизации полученных ■ препаратов белка ТБ9 в условиях, предложеных С.Ч.Агаларовым, а именно: в каплях с белком содержится 0.05М трис-НСЬ рН 7,5 и 0,15 М ИаСЬ, в противорастворе - 25% МЦЦ и 0,4 М ЯаСЬ, наблюдалось образование кристаллов в препарате белка фракции III. Эти кристаллы были несовершенны, слоисты. В препаратах белка фракщш I и II образования кристаллов не наблюдалось. Был проведен поиск более благоприятных условий кристаллизации. Варьировался солевой состав раствора белка.Оказалось, что наилучшие кристаллы вырастают в присутствии 0,1 - 0,2 М фтористого калия в растворе белка. Размеры этих кристаллов зависят от концентрации белка в маточнике и достигают 0,35*0,35/ 0,17 мм при концентрации белка 12 мг/мл. Кристаллы имеют форму ромбической призмы (Рис.8а).Добавление 0,01-0,02 М МбИ», в маточник приводит к появлению более изометричных кристаллов (Рис.86).

а

Рис.8. Кристаллы белка Т39 получённые в присутствии КГ. а) без МвСЬ2, б) с добавлением 0,02 М МвОЬ2-

в)Рентгенографические исследования кристаллов белка TS9

Предварительные исследования кристаллов были проведены совместно с Н.П.Фоменковой на рентгеновском генераторе с вращающимся анодом "Эллиот Gx-13"работающем при 35 кВ и 35 мА,и прецессионной камере "Энраф-Нониус". Эти исследования показали отсутствие мозаичности кристаллов, выращенных в присутствии фтористого калия из препарата белка фракции III. В таблице 4 приведены параметры этих кристаллов.

Таблица 4. Параметры кристаллов белка TS9 (S6), выращенных в присутствии фтошстого калия

Пространственная группа кристалла ■ Параметры элементарной ячейки £ Максимальное разреше-ние,2 Стабильность в рентгеновском пучке, час Параметр Метьюза Р/л

С 2 2 2 а = 106,7 b = 52,8 с = 41,0 2,0 60 число молекул в ассиметри-ческой части ячейки

одна две

3,4 1,7

Лаузграммы кристаллов, выращенных в присутствии хлористого натрия из препаратов белка фракции III показывают отсутствие мозаичности, присущей кристаллам, полученным из нефракционирован-ього бежа, но, тем не менее такие кристаллы все-таки недостаточно упорядочения. Таким образом, нам удалось путем фракционирования белка TS9 на анионообменнике получить достаточно гомогенный препарат, из которого можно вырастить немозаичные кристаллы. Введение в маточник фтористого калия позволило получить кристаллы высокого качества, пригодные для рентгеноструктурного анализа с разрешением до 2 8. Ведется работа по сбору дифракционных данных с нативных кристаллов и поиск их изоморфных производных.

ВЫВОДЫ

1. Разработана оригинальная методика выделения группы индивидуальных белков из 50S субчастиц рибосом Ihermus. thermophilus без применения денатурирующих агентов. В препаративных количествах получены белки: TL1, TL2 (аналог белка LI из'Е.coll), Т14, TL5, TL6, Т17, TIB, ТЫ1*(аналог пентамерного комплекса (L7/L12)2110 из E.coli), ТЫ2, TL13, TL14.

2. Охарактеризован пентамерный комплекс TL11 * из рибосом Thermus thermophilus. Показано, что молекулярная масса всего комплекса и обоих его компонентов на 15% выше, чем у их аналогов из E.coli. Состав комплекса ТЫ 1 * такой же, как у его аналога из E.coli: 4 молекулы белка ТЫ 1 (аналога 17/112) и одна .молекула белка, аналога 110. Определен аминокислотный состав и коэффициент экстинкции комплекса ТЫ1*.

3. Определен аминокислотный состав, оценена молекулярная масса, измерены спектры поглощения в ультрафиолетовой области, определены коэффициенты экстинкции для белков Т11, Т12, TL5, TL6, Т17, Т113.

4. Получены в кристаллической форме белки Т15 и TL7.

5. Выделен белок TL11( аналог белка 17/112). Показано, что в растворе этот белок находится преимущественно в тетрамерной форме. Показана высокая термостабильность этого белка.

6. Закристаллизован фрагмент белка TL11, продукт спонтанного протеолиза этого белка.

7. Получены кристаллы белка TS9 (аналога белка SG) из малых .субчастиц рибосом Thermus thermophilus, пригодные для рентгеноструктурного анализа с разрешением до 2 2. Проведено предварительное кристаллографическое исследование этих кристаллов

8.Разработана методика крупномасштабного разделения рибосом Thermus thermophilus на субчастицы с использованием гидрофобной хроматографии на Butyl-Toyopearl 650S, что позволило повысить выход субчастиц и в несколько раз сократить время и расход реактивов, необходимых для их получения. *

_Материаж_щсс8ртащи_1^едс2авлещ_в_слещвщм

I.Sedelnikova S.E., Agalarov S.Ch., Garber M.B., Yusupov M.M. Proteins of the Thermua thermophtlua rlbosome. Purification of several individual proteins and crystallization of protein TL7. -FEBS letters, 1987, 7.220, No.1, p.227-230.

2-Седельникова С.Э. Выделение индивидуальных белков из 50S субчастицы рибосом Thermua thermophilua. Кристаллизация белка TL7. - Биополимеры и клетка, 1987, т.З, No.3, с.163-166.

3. Agalarov S.Ch., Eliselkina I.A., Sedelnikova S.E., Garber M.B. Isolation and crystallization of ribosomal proteins from Thermua thermophilua. - Abstracts oi ICCBM-III,13-19 August, 1989, Washington, D.C.

4. Sedelnikova S.E., Agalarov S.Ch., Eliselkina I.A., Garber M.B., Muranova T.A. Ribosomal proteins from Thermos thermophtlua. - Abstracts of International Symposium "Molecular organization of biological structures", Moscow, 19-24 June, 1989.

ö.Garber M.B., Agalarov S.Ch., Eliselkina I.A., Tichenko S.V. Sedelnikova S.E., Shirokov V.A., Yusupov M.1J, Reshetnikova L.S., Trakhanov S.D., Tukalo M.A., Yaremchuk A.D. Purification and crystallization of components of the protein-synthesizing system from Thermua themophllua. - Abstracts of ICCBM-III, 13-19 August, 1989, Washington, D.C.

б-Garber M.B., Agalarov S.Ch., Eliselkina I.A., Tichenko S.V. Sedelnikova S.E., Shirokov V.A., Yusupov M.M, Reshetnikova L.S., Trakhanov S.D., Tukalo M.A., Yaremchuk A.D. Purification and crystallization of components of the protein-synthesizing system from Thermua themophllua. - J.Cryst.Grows, 1991, v.110, p.228-236

7. Agalarov S.Ch., Eliselkina I.A., Sedelnikova S.E., Fomenkova N.P., NIkonov S.V. and Garber M.B. Crystals of protein Ы from the 50S ribosomal subunit of Thermua thermophilua. Preliminary crystallographic data. - J.Mol.Biol., 1990, v.216, p. 501-502.

8. Sedelnikova 3-Е., Agalarov S.Ch., Eliselkina I.A.,Fomenkova K.P., NIkonov S.V., Garber M.B., Swensson A. and Lijas A. Crystals of protein S6 from 30S ribosomal subunit from Tfiermus thermophilua. - J.Mol.Biol., 1991, v.220, p.504-505.

-169. Sedelnikova S.E., Agalarov S.Ch., Eliselklna I.A.,Fomen-kova N.P., Nlkonov S.V., Shikaeva O.S., Garber M.B., and Lljas k. Ribosoroal proteins from Thermus thermophtlus lor crystallographlc studies. - Abstracts of ICCBM-IV, 18-24 August, 1991, Freiburg.

10.Garber M.B., Agalarov S.Ch.., Eliseiklna I.A., Fomenkova N.P. Lidas A., Nlkonov S.V., Sedelnikova S.E., Swensson A., Vaslllev D., Zdanov A.S. Stractural Investigations of rlbosomal Drotelns Irom Tftemus thermophilus. - Abstracts oi Internetional conierence "Protein Biosynthesis", Pushchlno, August 26-September 3, 1991 .

.6.09.91 r. Tup. 125 3K3. 3aK. 3580P. yg.-waj.j. 1,0.

OTneqaraHo B OHTH [HI AH CCCP