Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецепторная роль первичных ДмИ+-генераторов в системе бактериального таксиса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рецепторная роль первичных ДмИ+-генераторов в системе бактериального таксиса"

РГ6 од

- ^рОЗОШчОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

Гришанин Руслан Николаевич

РЕЦЕПТОРНАЯ РОЛЬ ПЕРВИЧНЫХ ¿¡¡п+ - ГЕНЕРАТОРОВ В СИСТЕМЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ТАКСИСА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993 г.

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, МГУ.

Научный руководитель: академик Российской Академии Наук I В.П.Скулачев

Официальные'оппоненты: доктор биологических наук, профессор

A.А.Кондрашин кандидат биологических наук

B.Л.Габай

Ведущая организация: Институт биохимии им.А.Н.Баха Российской Академии Наук

Защита состоится "_"_1993 года в_часов

на заседании специализированного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва П9899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_" _1993 г.

Ученый секретарь

специализированного•совета кандидат биологических наук

Ю.Н.Лейкин

- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы - Система бактериального таксиса является наиболее детально изученным механизмом обработки информации в живой клетку. Однако, несмотря на успехи в изучении этой системы, механизм ряда таксиеных реакций остается предметом дискуссии уже на протяжении более 15 лет. В частности, ато касается функционирования первичных, мембранных преобразователей энергии в качестве рецепторов системы таксиса. К механизмам рецепции такого рода относят аэротаксис микроорганизмов и фототаксис некоторых фотосин-тезируквдшг бактерий. Аэротаксис - это механизм активного поиска бактериями оптимальных концентраций кислорода. Большинство бактерий реагируют на кислород как на аттрактант и как на репеллент в зависимости от его концентрации, благодаря чему образуют "аэротактическую полосу" в пространственном градиенте кислорода (Shioi et al., 1987; Taylor, 1983). Видимо, оксидазы дыхательной системы несут функцию рецепторов кислорода в таксисе, однако не являются рецепторами в прямом смысле слова: для рецепции существенным является электронный транспорт в дыхательной цепи (baszio et al., 1984; Laszlo and Taylor 1984; Taylor 1983; Shioi et al., 1988). Как и аэротаксис, фототаксис эубак^ерий как-то связан с системой электронного транспорта (Armitage, 1992). Ингибирование фотосинтетического электронного транспорта приводит к потере фотореакций, что указывает на тесную взаимосвязь фотосинтетической активности и поведенческой реакции (Armitage and Evans 1981; Anal tage et al., 1985). В настоящее время существует несколько гипотез, по-разному объясняющих механизмы аэротаксиса и фототаксиса бактерий. Согласно гипотезе "протометра", выдвинутой Глаголевым, Барытевым и Скулаче-вым (Glegolev,i980; Baryshev et al.,1981), существует рецептор Ард+л генерируемой в процессе работы дыхательных или светозависи-мых протонных помп. В последнее время гипотеза подвергается крити-

ке с различных позиций (Armitage 1992; Oeeterhelt and Ifarwan, 1987). Параллельно существует гипотеза oö опосредовании как аэро-n тактической, уак и фототактической реакций "ре доке-рецепцией" (Glagolev, 1984; Glagolev and Sherman 1984; Lengeier 1991). Концепция предполагает, что рецепция в аэротаксисе и фототаксисе осуществляется через измерение уровня окисленности/восстановлен-ности некоего компонента дыхательной системы, возможно, хинона. Ни гипотеза "4^+ - рецепции", ни "редокс-рецецции" не получили прямых экспериментальных доказательств . Лишь результаты, полученные Рейнер и Оконом (1986) при изучении аэротаксиса Azospiriiium ьгasi tense могли бы служить прямым доказательством в пользу концепции опосредования аэротаксиса "редокс-рецепцией". Система электронного транспорта а.ьгasílense терминируется тремя оксидаза-ми - аа,3, £, и SL. пь мнению Рейнер и Окона только транспорт электронов в аатимицин А - чувствительной ветви дыхательной системы (терминируемой оксидазой о) необходим для аттракции бактерии кислородом, остальные ветви не несут рецепторной функции, хотя и поддерживают генерацию Такая специализация ветвей дыхатель-

ной системы свидетельствует в пользу механизма "редокс-рецепции". Трудности в понимании процесса рецепции и транедукции сигнала в аэротаксисе и фототаксисе бактерий, опосредуемых активностью электрон-транспортных систем, видимо, связаны с их чрезвычайно сложной организацией. Проверка гипотезы о Ajlg+ - рецепции требует использования экспериментальной модели, в которой изменения в уровне А|Дц+ не являлись бы обусловленными изменениями активности работы редокс-системы. На такую модель могли бы претендовать поведенческие реакции в отношении протонофоров, но в 'связи с их неспецифическими эффектами (для Rh.sphaeroldes показано, что различные протонофоры взаимодействуют с мотором флагеллярного аппарата (Evans and Armitage 1985)) этот подход часто критикуется 2

(Armitage 1982). В идеале решение задачи заключается в исследовании поведенческих реакций организма, обладающего первичной Дцн+ -генерирующей системой, независимой от системы электронного транспорта. В качества объекта для такого исследования представляется подходящей архебактерия Ня1 оьао* <»г1нш «¡m i nariu» (прежнее название На i ohac t prium haiobi ni») т обладающая уникальной светозависимой протонной шмпой - бактериородопсином. Близкая гомологичность системы таксиса галобактерий с системой таксиса эубактерий, по крайней мере, бацилл (Alam and Hazelbauer 1991), оправдывает этот выбор. Цели и задачи исследования - Настоящая работа посвящена изучению механизма сенсорной трансакции в таксисе, опосредованном работой ¿¡1^+ - генерирующих систем - аэротаксисе и фототаксисе, и проверке гипотезы о наличии системы Лц^ч- - рецепции у бактерий. Круг исследований ограничили следующими задачами: 1. Изучить эффект ингибиторов дыхания в аятимицин А-чувствительной ветви дыхательной системы д brasilera на аттракцию этого организма в пространственном градиенте кислорода. 2. В целях выявления значения различных ветвей дыхательной системы для рецепции кислорода, а также для получения данных о механизме репелдирования бактерий его высокими концентрациями исследовать поведение л hrasii&nsa в градиенте альтернативного акцептора электронов. 3. Исследовать эффект инги-бирования терминальных оксидаз на реакцию репеллирования д. brasil&nse кислородом. 4. Изучить фоторецепторные свойства светозависимого - генератора н.saiinarium - бактериородопсина с использованием штаммов, лишенных специализированных фоторецеп-торных систем и несущих бактериородопсин в качестве единственного ретинальсодержащего белка, а также решить вопрос, ответственны ли свойства бактериородопсина как Ajljj+ - генериратора за индукцию сигнала фототаксиса, либо сигнал производится бактериородопсином как близким структурным аналогом сенсорного родопсина I.

5. Изучить механизм транс'дукции сигнала фототаксиса, генерируемого бактериородопсином а) определить, чем опосредован сигнал фототаксиса: рецепцией внутреннего рН либо Д^; 0) исследовать участив системы метилирования трансдукторов в передаче сигнала фототаксиса, опосредованного активностью бактеридродопсина. Научная новизна работы,. Впервые получены прямые доказательства в пользу гипотезы о существовании Ацн+ - рецепции, по крайней мере, для н.saiinarium. Исследования подтвердили факт реализации в природе механизма фоторецепции, основанного на функционировании в качестве фотосенсора двух составляющих - светозависимого генератора АДц+ - бактериородопсина и рецептора Др^ч-. Впервые показано, что эта система может выступать в роли сенсора, способного обеспечивать различение длинноволнового и коротковолнового света, и объяснена природа этого явления. Получены свидетельства, что как антимицин А - чувствительные, так и резистентные цепи дыхательной системы a. brasiignse способны обеспечивать рецепцию кислорода в аэротаксисе, вопреки ранее опубликованным данным (Reiner and Okon.1986). Наши данные непротиворечиво описываются в рамках концепции "протометра". Впервые получены данные, указывающие на то, что редокс-система имеет функцию рецептора кислорода не только как аттрактанта, но и как репеллента.

Практическое значёние работы. Представлены прямые доказательства .в пользу наличия механизма рецепции - ДДд+ у галобактерий, и данные, предполагающие наличие этого механизма у представителя эубвктерий a. brasiiensa - азотфиксирулцего микроорганизма ризосферы злаковых культур. Результаты исследования механизма аттракции и репеллиро-вания этого организма кислородом могут иметь значение для понимания организации ассоциативных взаимодействий растений и микроорганизмов. Данные, полученные при изучении фоторецепторных свойств бактериородопсина, интересны с точки зрения эволюции ретиналь-4

содержащих фотосенсорных Сежов.

Апробация работы. Результаты работы были изложены на Теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (Москва, 1993), 118 конференции Общества общей микробиологии (Йоркский университет, Великобритания, 1991), 13 Школе Эдмонда Ротшильда (Израиль, 1991), Международной конференции по ретинальсодержащим белкам (Дурдан, Франция, 1992). Публикации. По материалам исследования опубликовано 7 работ, 1 работа принята к публикации.

Структура диссертации: Текст диссертации -состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 30 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали Azoaplrlllum brasilense г ШТЗММ Sp7 (дикий тип), генетически и биохимически идентичный Cd (De Mot and. Vanderleyden, 1989), а также штаммы Halobacterlum sallnarlum: R1M1 (BR+HR+SR-I,II+), ET1001(BR+HR+SR-I,II+), Pho81(BR~HR~SR-I,II~)Î Pho81B4(BR+HR~SR-I,II" ), Pho81 -D96N-8(BR(D96N)+HR"SR-I,II")**. Клетки штаммов Pho8iB4 и Pho8i-D96N-8 были получены трансформацией Pho8l и несли ген ьор на плазмидном векторе р319, который также содержал ген, обусловливающий устойчивость к мевинолину. Клетки д. ьгasílense выращивали в синтетической среде, описанной Нельсоном и Кноулесом (1978), в условиях, описанных этими авторами, до середины экпоненциальной фазы роста (od530=O.G). Затем их отделяли от среды центрифугированием и промывали дважды 10 мМ К2НР04/КН2Р04, 0.1 мМ ЭДТА, рН 7.0. Окончательно клетки ресуспензировали в том же буфере до необходимой концентрации, н.saiinarium выращивали в среде и условиях, описанных Барышевым и др. (1981). до ранней

*- Идентифицировано отсутствие Htr-r - бактериотрансдуцина I.

- Бактериородопсин несет замену аспартата 95 на аспарагин (D96N).

стационарной фазы роста. Клетки отмывали от среды культивирования NaCIr-буфером (4270 MM КаС1, 27 MU KCl, 81MU MgSO^, 25 MM MOPS, pH 7.0) центрифугированием при 3.5 g в течение Ю vom, после чего ресуспензировали в среде NaCl до подходящей для наблюдений концентрации. Перед выращиванием культуры для вксперимента A.brasiions» и н. saiinarium селекционировали на подвижность по стандартной процедуре (Armstrong and Adler 1969). Среда для селекции штаммов Pho8l-B4 и РКо81 -D96N-8 содержала 20 мкМ мевинолина.

Анализ хемотаксиса был выполнен путем регистрации распределения клеток в пространственном градиенте хемоэффектора. Применено несколько методов анализа. Аэротаксис наблюдали с использованием плоской микрокамеры (толщина водного слоя 0.2 мм). В суспензию клеток в микрокамере вводили пузырек воздуха. Пространственный градиент растворенного кислорода создавался благодаря его диффузии через раздел фаз вода/воздух и, с другой стороны, потребления кислорода дышащими клетками. В условиях ингибирования дыхательной активности клеток цианидом пространственный градиент кислорода создавался диффузией кислорода через раздел фаз вода/воздух и потреблением кислорода за счет окисления глюкозы глюкозоксидазой. В клеточную суспензию в камере вводили небольшое количество глюко-зоксидазы и каталазы. Блок 1.5% агарозы, содержащей 1 ьМ глюкозу, помещали в микрокамеру. Дистанция между краем пузыря и блоком агарозы составляла 3-4 мм. Для создания пространственного градиента феррицианида в присутствии изотропных концентраций Т1МД в микрсЯсамеру помещали агарозный блок, содержащий необходимое количество феррицианида и ту же концентрацию ТКЩ, что и в тестируемой суспензии. Клеточная суспензия (0%30 = 1.2), помещаемая в микрокамеру, содержала малат В"качестве субстрата, ТМФД, и 20 мМ K0N, для ингибирования терминальных оксидаз и предотвращения формирования градиента кислорода.. В качестве контроля попользовали оуспен-6

зию клеток в тех же условиях, но в отсутствие ТМФД. Распределение бактерий в градиентах наблюдали под микроскопом. Другой метод, разработанный нами и использованный для оценки хемотаксиса, был основан на принципе измерения оптической плотности клеточной суспензии в пространственном градиенте хемоэффектора, образующегося при его диффузии из геля. Микрокамера, описанная выше, была использована как горизонтальная оптическая кювета. Небольшой блок 1.5% агарозы, содержащий хемоэффектор, помещался в микрокамеру. Микрокамера размещалась на специально оборудованном сканирующем столике микроскопа, денситометрическое сканирование проводилось с использованием фотометрического аппарата (ФМЭЛ-1 A, JI0M0, СССР), который был установлен на микроскоп "Ergavai"-Zeise. Аппарат был сопряжен с самописцем. Сканирование проводилось при увеличении 25х. Таксис в пространственном градиенте разобщителя наблюдали по методу, описанному Шерманом и соавт. (1981). Наблюдения фототактических реакций н. saiinarium проводались во временном градиенте света, клетки отслеживались визуально. Реакции наблюдали с использованием фотомикроскопа Univar (Reiohert), при комнатной температуре. Для измерений реакций клеток при интенсивностях освещения ниже разрешающей способности человеческого зрения использовалась видеокамера ночного видения ROA, сопряженная с видеомонитором Panasonio. Для получения статистически достоверных данных отслеживалось 7Б клеток и более. Величина ответа измерялась как вероятность изменения направления движения клетки на противоположное после изменения интенсивности света. Данные представлялись как гистограммы вероятности реверсии клеток в интервалы, равные 1 с течение 20 с, либо в виде кривых зависимостей интенсивностей ответов от ветчина интересующего параметра. За интенсивность реакции принималась вероятность реверсий клеток в течение первых 6 секунд после подачи стимула. При измерении реакций штаммов

Pho8i -в4 и Pho8i -B4-D96N-8 на увеличение интенсивности синего света использовался 9-секундный интервал в связи с более длительным периодом задержки ответа на этот стимул.

Измерение генерации A® BR проводилось по методике Драчева и соавт. (1981, 1984). 6 целях освещения ячейки оранжевым или синим светом применялись оптические фильтры с X > 500 пш и 400 ± 30 nm, соответственно, источником освещения служила лампа КГМ, 70 Вт.

Контроль ЛрЯ осуществляли на качественном уровне путем регистрации распределения 6-карбоксифлюоресцеина. Наблюдения за эффектом проводились при помощи флюоресцентной микроскопии с использованием микроскопа Univar, а также фдюориметрической, с использованием флюориметра Hitaohi МРР-б и спектрофотометричвской, с использованием спектрофотометра Hitaohi U-3400, регистрации распределе-/ ния красителя в суспензии клеток. В микроскопических исследованиях 6-карСоксифлюоресцеин использовался в концентрации 100 мкМ, в остальных случаях - в концентрации 20,мкМ.

Мочение метил-акцептирувдих белков н. saiinarium было выполнено по методике, описанной Бибиковым и др^-(1982), их электрофорез и авторадаографию проводили по методике ¿лама и соавт (1989).

Скорость поглощения кислорода клетками измеряли в 1 мл камере с кислородным электродом типа Кларка, измерения проводили с использованием полярографа Radelkis 0Н-105 (Венгрия).

РЕЗУЛЬТАШ ИССЛЕДОВАНИИ

1. РОЛЬ СВЕТ0НЕЗАВИС1Ш0Г0 ГЕНЕРАТОРА - ДЫХАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ В СЕНСОРНЫХ РЕАКЦИЯХ БАКТЕРИЙ. АЭРОТАКСИС azospirillum brastlense. 1.1. Действие ингибиторов убихинол: цитохром с оксидоредуктазы на кислородный таксис Azosplrlllum brasil ens» В ПРОСТраНСТВОННОМ градиенте. Кы изучила влияние антимицина А и HQNO (ингибиторов Ъо1 комплекса - компонента цепи переноса электронов, терминируемой

цитохромом О В A. brasilensa) на аЭрОТвКСИС A. brasil ansa в ПрОСТ-8

ранствошом 1'радиинтв кислорода, образующегося в суспензии дцша:,-л'л клеток. Оба ингибитора подавляли дыхание клеток д ьгач! 1 не Оолее чем на 50% (эндогенное дыхание подавлялось и 73.6 1! .9 до уровня 37.4 + 5.2 нМ х мг балка' х мин1), при использовании в концентрациях 20 мкМ и более и при этом не имели ингибирующего действия на образование аэротактической полосы. Полоса формировалась несколько дальше от раздела фаз вода/ьоздух, и время, требуемое для ее образования, было больше чем в контроле, по причине изменения скорости формирования градиента кислорода и его крутизны из-за уменьшения дыхательной активности. Активация дыхания таких клеток 10 мМ аскорбатом с 50 мкМ ТШЩ (до 142.7 .* 17.9 нМ х мг белка-' х мин-') либо 50 мМ малата приводила к образованию полосы на меньшей дистанции от границы раздела фаз, чем в контроле (клетки в буфере без субстратов и ингибиторов).

Миксотиазол иш'ибирует окисление убихинола железо-серным белком, тогда как антимицин А и НОЫО ингибируют восстановление убихинона цитохромом ь. Поэтому совместное действие этих ингибиторов должно полностью блокировать транспорт электронов в редокс-цепи и изменения в редокс-сосгоянии компонентов ьс< комплекса. В наших экспериментах миксотиазол (20 мкМ) ишибнриъги потребление кислорода клетками в той же степени, что и антимицин А и нош и не ингибировал формирования аэротактической полосы. Одновременное добавление 20 мкМ НОЖ) и 20 мкМ миксотиазола имело тот ке эффект. Эти результаты показывают, что в условиях полного ингиби-рования комплекса остающиеся при этом функциональными цепи электронного транспорта (около 50% от исходного уровня дыхательной активности) поддержиэают аэротаксис д. ьгаанопэ». 1.2. Поведение д в пространственном градиенте ферри-

цианида в присутствии ТШ>Д. В качестве искусственного акцептора электронов в дыхательной системе мы использовали феррицианид в

присутствии ТМФД. Клетки д ьга^поп«;«» не обладают феррицианид-редуктазной активностью. Это было подтверждено спектрофотометри-ческими измерениями при 422 нм (максимум поглощения ферридианида) густой (OD550= 1.5 (1.6 х Iо"клеток/мл)) бактериальной суспензии, содержащей 0.I мМ феррицианида, против суспензии в отсутствие фер-рицианида: изменений в поглощении не наблюдалось. Кроме того, фер-рицианид не оказывал влияная на скорость поглощения кислорода суспензией д. brasi lense в довольно широком ряду концентраций. Однако, при добавлении 50 мкМ ТМФД в суспензию клеток, содержащую I мМ феррицианида, на некоторый период времени (около 20 минут) поглощение кислорода клетками тормозилось. ТМФД действовал как переносчик электронов с каких-то компонентов дыхательной цепи (вероятно, цитохромов хрушш с) на феррицианид. Мы исследовали таксис в градиенте феррицианида в присутствии изотропных концентраций ТМФД. В течение 1-2 мин инкубации наблюдалось формирование полосы сконцентрировавшихся клеток, сходной с аэротактической полосой (Рисунок 1).

Рисунок 1. Тактичес-^ ® кие полосы в суспен-

зии Д. brasilense В микрокамере. 1 -аэротактическая полоса вокруг пузыря воздуха; 2 мин инкубации. Б - "редокс"-тактическая полоса в суспензии (с©530 = 1.2) в градиенте феррицианида (концентрация в агарозе 10 мМ) в присутствии 200 мкМ ТМОД.

Рисунок 2. Образование тактической ПОЛОСЫ В . суспензии A. brasil ansa В зависимости от концентрации феррицианида в блоке агарозы. Концентрация ТМФД в агарозе и суспензии 200 мкМ. Каждая точка представляет среднее шести измерений: Представлены стандартные отклонения.

3.5 10 2.Э 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

10

С («М)

Расстояние- между полосой и краем блока агарозы, являющегося

никим феррицианида, ¿ъьидедь от его концентрации (Рисунок. 2). Снести 5-6 мин (5 мМ феррицичнида в геле) или 10-15 мин (10 м!»' Феррицианида ь геле) тактическая полисы "размывалась" и приемка льсь к блоку агарозы как результат рассеивания градиента феррицианида и восстановления этого вещества клетками. В контроле (ъ отсутствие ТМФД) клетки были распределена практически равномерно в течение этого времени. Это указывало на то, что репеллвнтн'эя компонента в образовании полосы не зависела от концентрационного градиента феррицианида, а, как и аттракташная, определялась "редокс"- градиентом ТМФД. Это поведение имело все характерные особенности аэротаксиса. В редокс-градиенте ТМФД. как и в пространственном градиенте кислорода, бактерии аккумулировались в узкой области, ньляющейся оптимальной для них. Миграция тактической полосы а ьгдч1сп--..' зависела от степени окисленности ТМФД (от концентрации форрицианида) в той же степени, как миграция аэротактической полосы а it^i (Barak et ч! . , 1982) и J уп'лии™ (Shioi et 'ii., 1987) зависит о г концентрации кислорода в цростран ственном градиенте. Добавление антимицини А (20 мкМ) к клеточной суспензии предотвращало образование полосы в пространственном градиенте феррицианида в присутствии ТМФД. Это указывает, что ьс( комплекс ответственен за ток алектронив к данному акцептору электронов, и, таким образом, принимает участие в рецепции окисленного ТМФД.

I.3. Поведение д. brasi т wc» в искусственно сформированном градиенте кислорода. Роль дыхательной системы в репеялировании а ьг дс.1 lffrvig. кислородом исследовалась путем наблюдения поведения клеток д hra^iicn^" ь искусственно сформированном градиенте кисло рода при том, что дыхание клеток было подавлено цианидом. Искусственный градиент кислорода создавался при помощи окисления глюкозы

кислородом, катализируемого глюкозоксидазой. Бактерии слабо ат-

трактировались кислородом (Рисунок 3).

Рисунок 3. Профили распределения клеток А. ЬгачПепяо В микрокамере. (1) - Клетки в присутствии 20 мМ КСЯ, градиент кислорода не преформиро-ван; 20 минут инкубации. (2) -Клетки в присутствии 20 мМ кси, в преформированном градиенте кислорода; 20 минут инкубации. (3) - Клетки без кси, градиент кислорода не ирефирмирован, 2 мин инкубации. Стрелкой показан пик, соответствующий аэротактической полосе. По ординате - оптическая плотность суспензии в относительных единицах.

Уход бактерий из области, соседней с блоком агарозы, не мог быть вызван действием глюкозы и глюконата (продукта окисления глюкозы), так как глюкоза не является хемоэффектором, тогда как глюконат является слабым аттрактантом для а. ьгаянепао (Ле1п1го1<1 et а1., 1985; гьиНп еь а1., 1988). Очевидно, тактические реакции, наблюдаемые в эксперименте, являлись результатом слабой аттракции клеток кислородом, сохраняющейся за счет цианид-резистентного дыхания (3% от исходного уровня). Из этого следовало, что элект-рон-трансцортная активность дыхательной системы является необходимой не только для рецепции кислорода как вттрактанта, но и как репеллента, так как не наблюдалось "чистого" репеллирования кислородом в этих условиях. Эти результаты вместе с данными, полученными из наблюдения таксиса клеток а. ьгаянепэе в "ре доке "-градиенте ТМФД, могут быть объяснены с позиций непосредственного участия дыхательной системы в рецепции ретоллентных концентраций кислорода.

Данные, полученные при изучении рецепторных функций дыхательной системы а.ьгачиеп^е. указывают на то, что не существует

ММ

какой-либо специфичности среди ре доке цепей а. ьга^иеп^е в осуществлении функции рецепции кислорода, что противоречит данным, опубликованным Рейнер и Оконом (1986). Причиной расхождения результатов, видимо, является артефакт методов, использованных этими авторами, связанный с неучетом того, что кислород является эффектором, потребляемым в рецецторном акте. Наш результат согласуется с данными Шиои и соэвт.,(1988), полученными при изучении аэротаксиса штаммов е. сЫ1, дефектных по одной из терминальных окевдаз -о или й, и не противоречит гипотезе об опосредовании сигнала в рецепции кислорода через измерение уровня Л^*.

Очевидно, двойное действие кислорода как аттрактанта и как репеллента обусловливается функционированием редокс-системы, при этом, вероятно, аттрактантный сигнал опосредуется через измерение уровня Лц^. В пользу этого механизма также свидетельствуют и результаты нашех'о исследования свойств протонофоров (ХКЦФ и ДНФ) в качестве хемоэффекторов для д. ьгаз11<?п5ет согласно которым эти вещества являются практически единственными сильными репеллентами для бактерий этого вида (данные не приведены). Возможно, репел-лентная компонента аэротаксиса обусловливается функционированием гипотетического редокс-сенсора, связанного с каким-то дыхательным переносчиком электронов, и измеряющего высокую степень окисленнос-ти этого компонента в присутствии высоких концентраций кислорода.

2. ПРОТОННАЯ ПОМПА ЕАКТЕРИОРОДОШИН В РОЛИ ФОТОРЕЦЕПТОРА 2.1. Фототактическое поведение н. ышапив, опосредованное активностью бактериородопсина. Развитие генетики галобактерий позволило получить из штамма Р1ю81, лишенного всех ретинальсодержащих пигментов и бактериотрансдуцина-1 и, следовательно, "слепого", трансформанта Р1го81-В4, синтезирующего ви. Это дало нам возможность подвергнуть критической проверке гипотезу "протомет-ра". Клетки штамма Р1ю81-В4 были использованы в анализе фэторецеп-

торных свойств ви. Приблизительно у 90% клеток спонтанно происходили ре- версии в течение первых двух минут от начала наблюдения в условиях отсутствия световых стимулов. Процент клеток, реверсировавших в течение первых 5 секунд при отсутствии стимулов, был менее ЮЖ.

Клетки, адаптированные к свету реагировали реверсией направления движения на снижение освещенности, тогда как клетки родительского штамма Р1ю81, использованные как контроль, не проявляли поведенческой реакции. В среднем время от стимула до ответа составляло 3 с, как и в реакциях, опосредуемых SR-I.II. Однако, в отличие от клеток, содержащих сенсорные родопсины, коротковолновый свет, как и длинноволновый, был аттрактивным для трансформанта (Рисунок 4).

Рисунок 4. Реакции штаммов ?1ю81 -Б4 (А,В) И РЬо81 (Б,Г) на световые стимулы с различными длинами волн. Световой стимул - 40% падение интенсивности света. А,Б -- оранжевый свет (А>540 нм), В,Г - синий свет (300-400 нм). Исходная интенсивность света была установлена равной 300 Вт/м2.

Таким образом, ВН как фотосенсор способен предотвращать попадание фототрофно растущих клеток в темноту, индуцируя реверсии направлений движения при падении интенсивности света. С другой стороны, 511-1, как известно, вызывает ту же реакцию при уменьшении интенсивности длинноволнового света (максимум поглощения Вй при 570 нм сравним с Бй-1 при 590 нм) Данные, представленные на рисунке 5, показывают, что оба механизма функционально комплементарны. В то время как вн позволяет клеткам реагировать на изменения интенсивности при высокой яркости светового потока, обеспечивает 14

реакции при более низких интенсивности*., насыщаясь при высоких.

Следует отметить, что относительная величина стимула ь эксперименте была постоянной. Таким образом, галобактерии имеют два эффективных механизма фоторецепции, позволяющие при совместной работе реагировать на фотостимулы при различных интенсивностях фонового

Рисунок 5. Поведенческие ответы штаммов Р]по81-Б4 (А.Е.В) и Р1х15 (Г,Д,Е) на уменьшение яркости оранжевого света разной интенсивности. Стимулы представляли собой 8х уменьшение интенсивности света (А.=572+10 нм)

(в квантах х мм_сх с-'): А,Г -от 3.8x10"' до 4.7х!013; Б,Д - от 4.7х1013 до 6.! х! 01г; В,Е - от 6.1х1012 до 7.6х1011.

Из предположения об опосредовании фоторецепторной функции Бй рецепцией АД^ следовало, что работа светонезависимых генераторов ДДН+ должна снижать интенсивность фотореакций Р1ю81-В4, уменьшая вклад вя в генерацию Ми предположили, что цианид, ингибирун

-генерирующую активность дыхательной цепи и увеличивая вклад ВК ь генедоция Оуд.."» сеиоабйла^лр^оа»и клетки к сылу. С

другой стороны, стимулирование работы светонезависимых ДЦд-»- -генерирующих систем должно уменьшать чувствительность фоторецепции. Эксперимент подтвердил данные предсказания. 1мМ цианид увеличивал величину реакции на фотостимул. Более высокие концентрации цианида (5мМ) сильно ингибировали фотореценциы. Для штамма 71x3, обладающего только и 8Н-П, все использованные в данном

эксперименте концентрации цианида проявляли скорее слабое ингиби-рущее, чем стимулирующее действие (Рисунок С).

света.

4Л I.

<Ш| «

а ;

:о ?

__-«! ..Шм--------: 1_И1!кш._____!

••> ¿«> «'> -> »'.у о ¿к> 0 5 (О ?.0

Б ! Г

1 г

I .

В !

'О 20

г : г д; г Е :

! I 1

Un « .

5 10 15 20 о

K=>

"io 15 20 o

Рисунок 6. Дейст-B вив цианида калия на фотореакцию штаммов í>ho8l-B4 (А,Б,В) и Flx3 s ю 15 го (Г.Д.Е): А,В - без Е J добавления цианида; Б,Д - 1 мМ KCN; Г,Е - 5 мМ KCN. Фотостимул - 40%

5 10 15 20

уменьшение интен-1 ^ 1''' сивности освеще-

ния, К = 572±10 нм.

Светонезависимая генерация" Д}1н+ была стимулирована добавлением

аргинина. Аргинин ферментируется галобактериями с образованием

Рисунок 7. Реакция Pho8i-В4 на фотостимул, как функция величиш падения интенсивности света - контроль, - 29 мМ аршнина. Стимул

- выключение белого света 1200 Вт/мг. На оси абсцисс

- интенсивность фонового освещения. Для каждой точки оценивалось 100 клеток.

1003 1300 2000 zs00

В«/к*

АТФ, так что последующий гидролиз АТФ н+-АТФазой может увеличивать уровень Ацн+. Добавление аргинина сильно подавляло фоточувствительность клеток штамма РЬо81-В4. Измерение величины реакции Р1ю81-В4 на отключение света в зависимости от яркости фонового освещения показало, что в присутствии 29 мМ аргинина фоторецепция, опосредованная активностью Вй, насыщается при более низких интен-сишостях фонового света (Рисунок 7).

Исследование природы фактора, обусловливающего десенсибилизацию системы фоторецепции РЬо81 -ВА в условиях высокой интенсивности фонового освещения (Рис.7, Рис.8 А,Б,В), показало, что данным фактором является поскольку добавление разобщителя вновь

Рисунок 8. Действие ХКЦФ на фоточувствительность клеток Йю81 -В4 при высокой интенсивности фонового освещения (\ > 500НМ). СТИМУЛ

- уменьшение интенсивности (в Вт/м2) света с 1300 до 160

(А,Г), со 160 до 20 (Б,Д), и с 20 до 2.5 (В,Е). А,Б,В - в отсутствие ХКЦФ, Г,Д,Е - в присутствии 2x10-6 м ХКЦФ.

йце одно указание на то, что Арн+ включен в процесс трансдук-ции сигнала в фотореакг.аях, опосредованных ВК, было получено в икеибрйкйктах с мутантом ?ьо81-С9бК-8, аналогом штамма Ню81-В4, с точечной мутацией в гене ьо^ (Аер9б заменен на Авп), Мы обнаруки-ли очень низкую чувствительность реакции мутанта на снижение интенсивности оранжевого света, что соответствует данным о том, что замена ВЭбИ приводит к сильному ингибированда активности протонной помпы - ВИ (Но1г et а!., 1989. Драчев и др., 1989, Butt ег а!., 1989, СепгехЧ е1; а1., 1989). Мы предположили, что азид, который, как известно, способен восстанавливать активность мутант-ного ВИ В96Я (Т1«о1> et а!., 1990), должен стимулировать способность клеток Р1го81-0961}-а к рецепции длинноволнового света. Эксперимент подтвердил данное предположение (Рисунок 9). Следует отметить, что ингибитор дыхания цианид не активировал реакции РИо81-Б9бК-8 на свет, что указывает на специфический эффект азида в отношение мутанта. Так как азид ускоряет фотоцикл Бй 09би, его эффект предполагает не регистрацию фотостационарных концентраций интермедиатов ВИ в системе таксиса (как это происходит с участием

17

сенсибилизировало клетки (Рисунок 8).

10 15 20 о 5

I ¿О 1 (с)

Г

] [Дат

10 15 20 0 5 10 15 20

I (с)

БЛ-1 и БН-П). а "счет оборотов цикла", что шолне согласуется с гипотезой о<5 участии Др^ -измерушдего устройства в качестве посредайка в фототаксисе.-

40 ,

30 -

8 20 О.

10 с

■l»l. I. 1J

Б i

10 15 20 О t (=)

5 10 15 20 t 'el.

Рисунок 9. Действие азида на чувствительность клеток РЬо81-1)9би-8 к уменьшению интенсивности оранжевох'о света: А - в отсутствие азида; Б - в присутствии, б мМ азида. Фотостимул -уменьшение интенсивности 572 ± 10 нм света от 3.8 х 10й до 7.6 х Ю13 квантов х мм~2х с-'.

Наши исследования обнаружили, что в условиях интенсивного (свыше 1000 Вт/м2) диинноволновохч) (>500 нм) фонового освещения включение синего света вызывает слабую репеллентную реакцию клеток РЬо81-В4. 0 увеличением интенсивности фонового освещения происходило подавление аттрактаитной реакции на синий свет и наблюдалось появление решллентной реакции (Рисунок 10).

Рисунок 10. Реакции Ию81-В4 в ответ (■ ) - на включение, (а) - на выключение синего (4501-20 нм) света интенсивностью 3.67 х 101ьквантов х мм~2х с-1,в зависимости от интенсивности фонового 200 400 600 800 юоо 1200 > 600 нм света. Доя каждой 8,/м" точки оценивалось 120 клеток.

Зависимость реиеллентной реакции на синий свет от длинноволнового фишвох1« освещения напоминала свойства реакции, опосредованной вн-1. Вещества, влияющие на уровень ДЛц+ в клетке, имели на вту реакцию действие, противоположное эффекту на аттрактаатную реакцию: аргинин сенсибилизировал клетки к репеллентному действию ошего света, тогда как ХКЩ» ь концентрации, активирующей фоторе-цш1цию аттрактантного света на фоне нркош освещения, в данном

случае имел десенсибилизирующее действие (данные не приведены). Из 16

этого следовало, что редаллентная реакция на синий свет, опосредо ванная BR, зависит не только от интенсивности длинноволнового фонового освещения, но и от уровня ¿jig* в клетке.

Мы объяснили явление на основе хорошо известных фотохимических свойств BR. Известно, что при поглощении кванта коротковолнового света интермедиатом фотохимического цикла происходит превращение этого интермедиата в исходную форму, BR^gg (Qasterheit and Hess, 1973). Этот процесс сопровождается генерацией Affl с полярностью, обратной существующей на мембране клетки (Karvaly and Danoshazy, 1977; Danoshasy et al., 1978). Таким образом, претендует на роль рецептора синего света как репеллентного эффектора, при участии Арц+ - сенсора. Предположение объясняет как фотохромную зависимость рецепции репеллентного света от длинноволнового освещения, так и зависимость от факторов, влияющих на уровень АДд+(ДФ) в клетке: высокий уровень ДФ тормозит фотоцикл на стадии распада м412, длинноволновый свет обеспечивает как генерацию так и образование формы. Гипотезе была проверена с использованием штамма Pho8i-D96N-8: в мутантном BR D96N фотоцикл ингибироввн на стадии распада м412 - интермедиата.

Рисунок 11. Реакции клеток Fho8i-B4 и Pho8l-D96N-8 в ответ на включение синего света на фоне оранжевого освещения: <•) - клетки штамма Pho8l- D96N-8, (■) -клетки штамма Pho8i-B4.

Фоновый свет: 572±10 нм, 3.8 х 1014квантов х мм_2х с-1. Зависимость репеллентной реакции от интенсивности синего света оценивалась как вероятность реверсии клетки в течение 9-секунд с момента включения синего света. Для каждой точки оценивалось 75 клеток.

Вт/ж*

Эксперимент показал, что синий свет, даваемый на фоне оранжевого, является гораздо более сильным репеллентом для клеток этого штамма, чем штамма Р1ю81 -В4 (Рисунок 11). Азид, ускоряя распад «412 в мутантном ВЯ, сильно сникал репеллентную реакцию Р1ю81 -Б9бН-8 на синий свет, и, при умеренной яркости оранжевого фонового освещения, инвертировал ее в аттрактантную (Рисунок 12).

5 10 15 2й О

I (С;

Рисунок 12. Действие азида на реакции клеток Р1ю81-096М-8 на синий свет в условиях оранжевого фонового освещения: А,В - в отсутствие азида; Б,Г - в присутствии 5 мМ азида;

A,Б - реакции на включение;

B,Г - реакции на выключение синего света (450+20 нм, 3.6? х 1015 квантов х мм~2х с~1). Фоновый свет, 572 ± 10 км, 6.9 х 1012квантов х ш~гх с-1.

Фотоэлектрические реакции, измеренные на пурпурных бляшках, содержащих .вк г^бИ (Рисунок 13), показали полную корелляцию ДДдЧ- -генерирующих свойств вн и характерных поведенческих реакций штамма РЬо81-П96Я-8 (ср. рисунки 9,11,12,13).

Рисунок 13. Генерация элект-

40

зо {-Б

20

А

¡0

о !

1«

ю

1 (с)

15

рического потенциала мутант-ным бактериородопсином И96П (Б-В) и бактериородопсином дикого типа'(А). (1)- включение оранжевого света, (2)-включение синего света, (3)-20 выключение оранжевого света, (4)- выключение синего света. А,В - в отсутствие, Б - в присутствии 5 мМ азида.

Наши данные предполагают следующий механизм рецеллирования синим светом при участии ВИ: в условиях, замедляющих распад 20

па фони длинноволнового света происходит накопление этой формы;

результатом появления в спектре синего света является мгновенный

возврат большого числа молекул Вй в ВЛ^д. Происходит захват

протонов из внешней среды, что вызывает резкое, но быстрорелакси-

рующее падение А®, роцептируемое Др^ь - сенсором как репелпентный

стимул. Из предложенного механизма следовало, что поведенческая

реакция должна быть ассимметрична: выключение синего света на фоне

длинноволновох'о освещения не должно индуцировать аттрактантную

реакцию: данный стимул не может индуцировать гииерполяризацию

мембраны, адекватную ее деполяризации при включении синего света.

Рисунок 14. Диаграмма вероятности реверсий клеток РЬо81-Б9611-8 в течение 9 се-| кунд: 0 1,11 - в отсутствие 1 фотостимулов; ЕЗ I - после включения синего 450±20нм света, 3.67 х 1015квантов х ' мм~гх I - после его

выключения. Фон: 572 ± 10 нм свет, 6.9 х 1012квантов х т~гх с~1; II- после

80

70 60

ьо

а.

Л

NN

| V Ч I

Т

| стдччш)

| \\ Хф>(

I Ч.ТХ-ЧЧ]

I у//А\ \

(ч.ЧЧ

к\ч

I \ Ч I

К4 о

— ^ ч Ч) I к ч Ч; ¡7771 ч ч I г/л ч ч ) И/'.'.Л ч Ч 1

V///тч Ч

Г/У/х. Ч Ч|_I

\// /а ч гагч

УУУА\ ч

[

Н

света, 6.9 х 101гквантов I ш с

8-кратного снижения интенсивности оранжевого 572±10 нм

II - после 8-кратного

.-1.

увеличения интенсивности 572+10 нм света, 6.9 х 1012квантов х

— Р — 1

мм х с . Данные представляют собой средние статистические ожида-

В

ния из трех экспериментов; показаны стандартные отклонения кавдом эксперименте оценивалось 60 клеток.

I - в отсутствие азида, II - в присутствии 5мМ азида.

Эксперимент, выполненный на штамме Р1ю81-Б9б!Г-8, йоказал, что предполагаемый нетривиальный эффект действительно существует (Рисунок 14): включение синего света индуцировало увеличение числа реверсий движения (репеллентная реакция), а его выключение не вызывало поведенческого ответа; в то ке время, в присутствии азида выключение оранжевого света индуцировало возрастание числа ревер-

21

сий, а его выключение - снижение числа реверсий ниже уровня спонтанных реверсий (аттрактантная реакция).

2.2. Механизм трансдукции сигнала в фоторецепциих. осуществляемой при участии бактериородопсина. Для е.сон и других бактерий описана рецепция внутреннего рН. Данный механизм мог бы опосредовать таксис, связанный с работой генераторов ДДд*, и являться альтернативой сенсору Однако, как мы показали, ацетат даже в концентрации 0.5 М не влиял на реакции клеток РЬо81-В4 на свет (для снятия ДрН было достаточно 50-100 мМ ацетата). Эти данные, вместе с данными о механизме рецепции синего света как репеллента, опосредованном ВЛ, который связан с быстрорелаксирующими изменениями ДФ, предполагают наличие сенсора Д!^ или ДФ.

В заключительной серии опытов мы исследовали роль метилакцоп-тирующих белков таксиса (МАЕ) н. ванпап»» в трансдукции сигнала таксиса, генерируемого Дцн+ - сенсором. Как ранее было показано нашей группой, ингибитор метилирования белков этионин подавляет фототактическую реакцию дикого типа н.^аппагдш». будучи добавленным в концентрации 1 мМ (ВагувЬет et а!., 1982). Мы воспроизвели этот эффект как на штамме Р1ю81-В4, обладающем только Вй, так и на штамме Р1х15, содержащем только згы и БЯ-Н (данные не приведены). Идентификация МАБов в различных штаммах н.заПпагчцт (ЕТ1001, 1ЦК|, Р1хЗ и РЬо81) показала, что, в соответствие с результатами предыдущих исследований штамм РЬо81 не имеет бактериотрансдуцина-1 (94кД) который принимает участие в процессинге сигнала таксиса, продуцируемого 5Я-1 (БриеНой et а!., 1988). Было обнаружено, что в штамме ЕШ1001 не выявляется полоса, соответствующая МАЕ 80кД, видимо, ответственному за рецепцию ряда хемоэффекторов (Бибиков, 1987). Так как имеются свидетельства, что этот штамм является способным к фототаксису, опосредуемому Вй (В1Ыко7 апа БкиХаоЬеу, 1989), есть основания предполагать, что сенсорные родопсины, Вй 22

как фоторецептор, а также рецепторы хемотаксиса используют различные МАВы в процессе передачи и обработки сигнала таксиса.

ВЫВОДУ

1. Исследования рецепторных функций дыхательной системы эубактерии а, brasj ] показали, что, как антимицин a (hqno)- чувствительные, так и резистентные цепи дыхательной системы способны обеспечивать рецепцию кислорода в аэротаксисе, вопреки ранее опубликованным данным (Reiner and Okon 1986). Полученные результаты наиболее непротиворечиво описываются в рамках концепции опосредования аттракции в аэротаксисе рецепцией Дцн+.

2. Результаты изучения поведения д. brasiiense в "редоке" - градиенте ТМФД и в преформированном градиенте кислорода в присутствии концентраций цианида, ингибирунцих дыхание, предполагают, что

система электронного транспорта играет роль рецептора кислорода и как аттрактанта, и как репеллента.

3. Исследование трансформантов я. saiman um, t несущих ген BR но дефектных но синтезу специализированных фоторецепторов подтвердило гипотезу (Glagolev, 1980; Baryshev et al., 1981; Bibikov and Skulaohev, 1989; Скулачев, 1988) что фотоны, поглощенные BR, могут вызывать поведенческие реакции, (2) фототаксис, обусловленный BR в качестве фоторвцептора, связан с его ттротонтранслоцирующей активностью, и опосредован работой специфического рецептора Ац^. Эта концепция объясняет такие свойства трансформанта, как (а) аттрак-тантное действие не только длинноволнового, но и коротковолнового света в отсутствие длинноволнового фонового освещения; (0) увеличение фоточувотвительности цианидом (благодаря подавлению светоне-сависимого (дыхательного) механизма генерации Дц^); и ее снижение в присутствии аршнина, стимулирующего светонезависимый (ферментация плюс н+-АТФаза) путь генерации Apjj+; (в) сенсибилизирующее действие разобщителя в условиях насыщения системы фоторецепции

очень высокими интенсивностями фонового освещения; (г) необходимость для фоторецепции довольно высоких интенсивностей света, достаточных для поддержания генерации Др^ч- за счет работы ВВ.; (д) низкая фоточувствительность трансформанта, вк которого несет мутацию, приводящую к повреждению его протонтранслоцируицих свойств (Б96Н мутант); (е) активация фоторецепторной функции ОДбн мутанта при добавлении азида, восстанавливающего активность бакте-риородопсинового н+- насоса; (ж) репеллентное действие синего света, подаваемого на фоне оранжевого освещения, особенно выражен-ноо в случае мутанта 09611; (з) подавление эффекта (ж) азидом; (и) зависимость рвпеллентного действия синего света от уровня Дрц+ в клетке; (к) характерная ассиметрия репеллентной реакции трансформантов на коротковолновый свет: отсутствие аттрактантного ответа на выключение синего света.

4. Эффекты ж - к указывают, что, тогда как ви56д функционирует как рецептор аттрактантного света, М-интермедиат ви может вызывать решллентные реакции на синий свет в условиях, когда происходит накопление интермедиата. Эта реакция опосредована "протометром".

5. Данные, приведенные в пунктах 3-4, указывают, что Л|1Н+<АЩ)-генерирупцие свойства нормального и мутантиого (вдби) вн коррелируют с поведенческими реакциями вл-содержащего трансформанта, как это было предсказано на основе гипотезы "протометра".

6. Реакции н.яаипапот на свет не опосредуются рецепцией рН цитоплазмы: изменения А®, индуцированные вя, являются достаточным фактором для индукции поведенческой реакции.

7. Путь передачи информации от вл к фдагеллярному мотору, опосредованный "протометром", включает в себя какой-то МАБ, отличный от белков 80 и 94 кД, участвующих в системах хемотаксиса, а также фототаксиса, осуществляемого при участии сенсорных родопсинов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Бибиков,С.И., Гришанин.Р.Н., Каулен.А.Д., Марван,В., Остерхельт.Д. Скулачев.В.П. Роль бактериородопсина в фоторецещии У Halobacterium halobium.// БИООрГ. ХИМИЯ, 1992, Т.18, № 10-11, С.I403-1422.

2. Bibikov,S.I., and Grishanin.R.N. Evidence for the direct involvement of bacteriorhodopsin in the photoreception in halobac-teria. Abstr. 13th Edmond De Rothschild School, 1991, P.58.

3. Bibikov,S.I., Grishanin.R.N., Kaulen.A.D., Oesterhelt,D., Skulachev,V.P. Direct evidence for involvement of bacteriorhodopsin in photosensory process in halobacteria via the receptor of the energy level - protometer.// Abstr. 5th International Conf. on Retinal Proteins, Dourdan, France, 1992, P.28. 4

4. Bibikov,S.I., Grishanin.R.N., Kaulen.A.D., Oesterhelt,D., Skulachev,V.P. Direct evidence for involvement of bacteriorhodopsin in photosensory process in halobacteria via" the receptor of the energy level - protometer.// In: Structures and Functions of Retinal Proteins, Ed. by J.-L. Rigaud, John Libbey Eurotext, Colloque Inserm, 1992, V.221, P.333 -336.

5. Bibikov,S.I., Grishanin.R.N., Marwan.W., Oesterhelt,D. , Skulachev,V.P. The proton puap bacteriorhodopsin is a photoreceptor for signal transduction in Halobacterium halobium.// FEBS Lett., 1991, V.295, P.223-226.

6. Grishanin R.N., Chalmina I.I., and I.B.Zhulin. Behaviour of Azospirillum brasilense in a spatial gradient of oxigen and in 'redox' gradient of an artificial electron acceptor. J. Gen. Microbiol., 1991, V.137, P.2781-2785.

7. Grishanin.R.N., and Zhulin,I.B.. "Redox"-taxis in Azospirillum brasilense.// Abstr. 118th Meeting of Society for General Microbiology, 1990, P.35.

8. Bibikov,S.I.i Grishanin,8.N., Kaulen.A.D., Oesterhelt,D., Skulachev,V.P. Bacteriorhodopsin is involved in halobacterieU photoreception.// Proc.Natl.Acad.Sci.USA. , 1993, in press.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ.

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота, ДНФ - 2,4 динитрофенол, МАЕ -метилакцептирупций белок таксиса, ТМФД - n.n.n'n'-тетраметил-р-фе-нилендиамин, ХКЦФ - карбонилцианид m-хлор-фенилгидразон, ЭдГА -этилендиаминтетрауксусная кислота, br - бактериородопсин, hr -галородопсин, sr-i - сенсорный родопсин-i, sr-ii - сенсорный родопсин-ц, Htr-i - бактериотрансдуцин i, hqno - 2-гептил-4-гидроксихинолин n—оксид, mops - 3-и-мосфолино)пропансульфоновая кислота., ¿я