Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репродукция вирусов гепатита А в различных эукариотических системах

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Репродукция вирусов гепатита А в различных эукариотических системах"

1 9 $

■Г?** • л *

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ИМЕНИ Д.И.ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

БЫЧЕНКО Андрей Борисович

РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ ГЕПАТИТА А В РАЗЛИЧНЫХ апСАРИОТИЧЕСКИХ СИСТШАХ

03.00.06 - вирусология

Аьторефорат

диссертации на соискание' учэной степени кандидата шдицинских каук

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

г -адемик А1.'Н СССР, профессор кандидат биологических наук

|В.М. Дданов

В. Р. Фарашян

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Я.Я. Цилинский М.И. Михайлов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН

в 14 ч. на заседании Специали )1

при Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук

А.М.~2уковски2

t'X - J. ( if ''.t —

i'.'j ч.'Ь.ОТ c'ïvA

ВВЕДЕНИИ

Aктуальность rrpog тали Среда кэвсстнцх в настоящее вреда пятя capycinrc гепатитов (А,В,С,Д и Е) гепатит А обусловливает са?ый ш-ООК1Й уровень заболеваемости во все:: регионах, особенно в развява-юдкхся странах. В индустриально странах гепатит А вызывает всгш-екл с вовлечением значительного чпсла лэдей.

При укудаешш соцкалькс-экономпчзспк условий заболеваемость гепатитом А быстро возраста»?. В налей стране ежегодно регистрируют около I мяJ. случаев вирусных гепатитов (£С£ из них гепатит А), кохоруо нанося? больной ¿хоногяпескаа ущерб.

Так как сфрэкт!!викя методов яечекня больных гопатгтом А пола нет, нагболзе перспоктяскш путо„( борьбы с этим заоодеванием, ^о гш -1ШО экспертов БОЗ,является сеош?этзсгля прсф1лактиг.г, а именно i',;,?.Qrmi2ai2i.i гаккинздга, обеспечнвавицг.а стойкий пялунитет.

Исследователи, здншшцгэся разработкой таких вйкшн, кеозк -данпо столпились с больпжл трудностям: при попагкз испозьзова-

мзтодоз генной к белковой шаонараи для их получения. Поэтог.у в ¡тстоящеэ время, к, по-зэдзкомг. в обозримом будущем, г/стодн :<ультивярования БГА в эукарпоткческих спстеь. :с рассматривается как наиболее перспоктшяга для получения значительнее количеств полноцзннкх впрусгшх антигенов, прцгодзах для лабораторной диагностики и сшцгфлэской щю^язюкиен ГА. О строглигелы. хт про? -pesos з этом зааргыонза сгкдвтзяьсхаусх вплаяенпз паразитов Ш, оАтадгэдпг сагггг-'.тлчсскк!! дзлехеде:.:, а езядз петунию других га-ркглхсз, вютчея rxat&ai с ослаблоилсЗ апдагеьгнсск.к, способны:: * К бНСТрОЙ рвпрсйзгкпш D ^*:>STBI!ÏSii.irXÎ ГЯШЯХ USO.-i-Ч бклгрэт??-гой к цело1щраз.г31ШЕК подбор сзстгм"ВГЛ - эукарксгкческая клот -га" it"к пр-"5м «я-.^сзчоской зпруссдсип, пс:-л не азчерпак своах ссзногшостоИ и нстользуоте- в бзалопкссзоЗ промаа*:-./кости и

учно-исследовательских лабораториях как единственный способ получения значительных количеств полноценных антигенов ВГА.

Цель и задачи исследования. Пелью работы било изучение условий культивирования шгаг.мов БГА, выделенных из разных источников, на различных ликисс меток для оптимизации получения больших о-личеств антигенов этого вируса, - Бшги поставлены следующие задача:

1. Составить коллекцию штаммов ВГА, полученных из разных географических зон.

2. Изолировать от больных гепатитом А кестныа птамма ВГА и изучить их свойства.

3. Разработать оптимальную схацу культивирования БГА/ позволяющую получить наибольший еыход антигенов этого вируса.

4.. Охарактеризовать полученные антигены при помощи физичас ких, серологических методов. -

5. Использовать полученные антигены БГА для лабораторного подтверждения диагноза ГА, а такяе щгя дальнеЕхего изучения свойств ВГА.

Работа выполнена в рамках программы борьбы с инфекционными болезнями Европейского Регионального Бюро ВОЗ (научные руководите -ли: В.М.Ддакоз и Б.Р.варашяя).

Научная новизна и практическая -ценность диссертации. В работе .впервые апробированы новые клеточные линии для культивирования БГА и выявлена зависимость репродукции ВГА от степени дафференца-рованности эухариотичэсжих клеток.

Отмечены особенности репродукции ВГА в процессе адаптации к чувствительным клеточным линиям.

Подучен отечественный штамм ВГА Ш-1, изолированный от больного ГА - г.Москве (Авторское свидетельство - 4617829). - Штамм адаптирован к чувствительным клеточным линиям, идентифицирован

как ВГА н может быть рекомендован для производства антигенов ВГА. Найдены оптимальные условия культивирования для нескольких атам-мов ВГА, выделенных в разных регионах. Штаммы адаптированы к клеточным линиям и кульгуральнкм средам, используемым в отечественных вирусологических лабораториях.

На примере С-х штаммов ЕГА изучена динамжа синтеза FHK ВГА и продушит антигенов ВГА з инфицированных эукарлотдческих клетках.

Полученные антигены ВГА били охарактеризованы по основным <Jn-зяхо-хккичесяим, серологическим свойствам к использованы для лабораторной диагностики ГА в кяяншее и в эпидемиологических исследованиях.

На основании проведенных исследований составлены методические рекомендации по лабораторной диагностике ГА, одобренные Ученым • советом Института е.ирусологш'им. Д.И.Ивановского и успешно апробированные в Первой клинической инфекционной больнице г.Москвы.а также в других научных и медицинских учреждения;:.

Апробация тяботн. Результаты исследований были доложены на: конференции колодах 'ученых Института вирусологии im.Д.И.Иванов- . ского, АМН СССР, декабрь 1886 г.

фрагмента наследований отражены в 12 научных статьях, опубликованных в отечественных научных журналах (см. список научных работ).

Объем и структура таботн. Диссертация состоит из введения, обзора.литературы, методической частя, результатов исследований, обсувдения и выводов. Общий объем работа составляет 154 страшны машинописного текста, иллюстрированного 22 таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает 190 наименований отечест -венных и зарубежных авторов.

Положения, выносимые на зашит. Два термоварианта (Т=32° и

Т=37°) вируса, изолированного от больного ГА в г.Москве п адаптированного к клеточной лгасш PlC/PEF/5, оказались тишташ:,;! представмтеляш ВГА, лрагоднамп в качество цтатасз-продуЕэнтои i^jrb-vpajibHoro антигена ЗГА.

Несмотря ¡¡а высокую гомологию генгаза ытаг.ыов БГА, их молено да^орошшроаать пс культуральныи характеристикам, а такхо по отнсиснив к те.-.шоратуро культшзлрозанкя. Относительная стабильность уха-ашшх признаков ко~эт нлгть значение upu производство антигенов ВГА.

Предлагаются экспзт:-;::.^:1тадько подобранкыз система родредук -ции БГА (на дриг/зре 3-х штажоз, адаптированна: к чувстзлтогп, -нш линияи), опкаизацвя которых зависит от условий куяьтизироения. Адаптирован :: линиям клето:-: PlC/PPP/5 игакм E.i-175, про-ядяяхкцай вдтопатаческос действие при 32°. Эта система удобна для проведения дальнейешх исследований.свойств ¿ГА, а тох&а для продукции Аг БГА.

В <--*язп с том, что :ia репродукцию БГА "ei. впиро" оиазпвао? сильнее маянло степень да*§арэнкпр0ЕаШ10Сти лшойсас глэтеп, этот факт необходимо учитывать при получении анкзчигоз ВГА.

ССЙЕРДАКхЕ РАБОШ. Ш2НШЫ У 13ГОДУ

В работе öata испсиьзовгда штампа НГА, кзеотрованниа в разных географических регионах, адаптированию и-разшы амточшал липши, с различной тишгратурей ^'льтпвироваапя. Шгслм HAS-I5 (301) был дабэзко предоставлен д-роа liaynàrd «¿£ ; втачка CP-S79, H-I4I, KMa-I, GEv!, »ESI, IH2S получена от д-ра Siosl G; штамм MBB/H/5 - от д-ра Dcinbanit У; итакл НИ-175 - от д-ра Locaxalni s.a. Е итамл МИ-I был изолирован от больного пз Первой клинической шфзкшокной бсяьниш г*. Москва.

Вирусы пассировали на клеточных линиях II.C/P2F/5, FRhK-4,

líi-2, D3-C-I, 46/47, Vero , T-24, JI34-240, IT, .134-120, 534. Линия FLC/PPF/5 была железно предоставлена д-ром Deinharit F. Остадыша лиши ölliii получены из лаборатор:и клеточных культур Института вирусологии к/. Д.И.Ивановского РАМН.

При пассировании агаг.коз ЕГА клеточные монослоз г.идоршшали в поддорлпзавди! среде до 20-10 дней, а в случае первичной адаптации до 120 дней л более.

Продуцируемый Аг ЕГА определяли в ИрА по стандартной метода- • газ по принципу сэндвич-реакции, последовательно сорбируя на твердую Фазу антк-ВГА-IeG, Аг ВГА и затем антп-ВГА-lE^ -конъюгат с пзрог.сидазой хрена, проявляя реакцию раствором субстрата (орто -í'п учптивал результата оптической плотности па спектрофотометре (ридер) при длине валы; 492 км /рис.1/. Коли -чество ЛгВГА вкраталп в относительных единицах ОД (отношение ептичеакк плотностей поло^ттелышх и отрицательных проб). А1гтп-ВГА-1££-коныэгат с пероксздазоД хрена получали по Farr A.G., Hakane Р.К./1931/.

Инфекцнонноств ВГА определяли в единицах ГкИДс^/г.'л. Очистку ■ п концентрации препаратов вируса проводили с помоз&в градиент -ногп центрифугирования. Получаемый вирусный антиген использо -вали для определения анти-БГА антител в сыворотках больных ГА п рокоявалеспэнтов в КОД. Були разработаны два метода шшгонзя остр'ос (анти-ВГА-ВИ) и суммарных (ан?к-ВГА-1е£+М!) антител /рис.1/.

В первом случае фракции IsM из еызороткк выделяли при пемокл антп-IsM (антп-^г) антител, сорбированных ua твердую £-азу. Суммарные антитела определяли методом конкуренции.

Для точечной гибридизации использовали полученные ДНК-ВГА последовательности в состазе бактериальных плазмид pBR 322, содер-

жавшие 99$ последовательности геномной вШК штамма ГЛВВ/11/5.

3?

ДНК-ВГА последовательности метши аньТа-' Р-дезоксинуклеозид-триг$о&$атаыи методом ник-трансляши. Для анализа .синтеза вРНК были использованы как плазмиды (ДК-БГА последовательности из бактериальных плазмид) с вставка!,и из структурной зоны вирус -ного генома (области генома- 990-3300; клоны 31,244,290), так и плазглиды с вставками из неструктурной зоны (область генома 3300-7300; кг.эны 193,217,232,300) . /рис.2,3/. Анализ полученного кульгутального АгЬГА. После скоростного ультрацентригругирования в 10-ЗС£ сахароз;:ом градиенте к плотностного ультрацентрифугирования в градиенте CsCI отмечали пики антигенног" материала в И$А. фракции с АгВГА, отличавшиеся друг от "друга плавучей плотностью и константа;,;: седиментации, тестировали в электронной микроскопии, белковом эле-

ор

ктрофорезе, а также методом точечной гибридизации с Р-ДЩК-ВГА. Для электронной микроскопии ВГА помета и на формвар-угояыше подложки ч контрастировали 1% водным раствором уранал ацетата. Препараты изучали в anei .-рояном микроскопе EM-I00 X при снстру -ментальном увеличении 50 ООО. Электрофорез вирусных белков проводили в 7,5-15% градиентном пйяиакрияашднои гела с последующим окрйшвашем серебром по шгеду Laemali U.K. /1970/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЕДЕЖЕ Куяьтавстование ВГА на клеточных линиях, ствклтелышй анапиз штаммов BFA. В работе была использована коллекция штаммов ВГА, включающая следующие генотипы: Северо-Амэржанскай (HAS-15, CF-973) Китайский (Н—141 >; Аветрало-Средаземномэрский (МВВД1/5, КГ.№-1; GM, ЗН-26). Вакным приобретением для коллекции бал ши -роко известный штаты Ш-175 (Австралия), обладающий вдтопатичес-ким действием. Мутанты этого штамма используются для .изучения свойств ВГА и для производства инактивированных вакцин рядом за-

рубежных фирм.

Изолированный нами в г.Москве штамм ВГ.1 (МИ—I) отнесен к Австрало-Средиземноморскому типу. Таким образом, коллекция составляет основу генофонда ВГА, который может быть попользован для научных и практических целей (табл.1).

Все штамма коллекции (9 штатов) были проверены на способ -кость к репродукции в различных условиях. За исключением штамма НМ-175, они не обладали циталитическтага свойствам! и продуцировали разные количества ВГА и АгБГА в зависимости от птамма, клеточной линии, питательной среды, качества добавленной в среду сыворотки, температуры инкубации, числа пассажей и т.д. При прочих равных условиях оценку качества штаммов-продуцентов было удобно проводить по двум параметрам: I) количеству АгВГА б ли зато клеток на 20-30-ый дни инкубации после инфицирова -шш клеток, и 2) по уровни инфекционного титра в те же сроки. Значения обоих параметров оказались взаимосвязанными. Однако, если внсоко?лу инфекционному титру всегда соответствовала высокая продукция АгВГА," то обратная связь была менее выраженной (табл. 2,3). Дл- удобства выбора наиболее активных ятаммов предложено определять ранги обоих показателей для каждого изученного штамма а рассматривать последние по минимальной сумме обоих показателей о точки зрения перспективности дня продукции АгВГА. В наших условиях штаммы Ш-51, ¡£3/11/5 и Ш-Г на линии клеток РЬС/Р5Г/5 давали наиболее воспроизводимые результата в отношении продукции АгВГА (инфекционные татры до 108 - Ю9 и ксяичест-во АгВГА по 30-40 О/К). Палучэшше результаты совпадают с дач -ными многих других исследователей, которым не удалось преодолеть "ин витро" верхний порог вышеуказанных показателей.

Усилия по адаптации итаидов коллекции к различным лин'.'-ям кче-ток, имевшихся в нзнаем распоряжений!, позволили сделать вывод,что

клетки крови человека ( 1С 5G2, Н9, Т-Н, BL), клетки карнпко-ш гортани чедоазка (Hep 2) и Kapisuic;.2i ¿eüi-ui t/дтки (HêLA) эа>шсь непригодны;.!;: дая продукции Аг ВГА, Exawai ВГА сгдячажсь дру" от друга но спектру чувствительных якнкй клеток :: характеризовались определенный консерватизме:: указанного пткхзка:а (та1".4). Зго свойство мо:г.от быть иска: j зевано гл;; ыадпгатор win контроля итаилоз-продуцоытоз на сггЛяльиссм. генома БГЛ глн • отдельных er учазткса. В яаазс усясзаяг нг^оолыхй скол Ar ВГЛ к 30-ку даэ игщубашп: получали >;:;' j„s:cí ly^i-tx*. PuC/Hi?/^« Оагодыш ита:л-щ (HAS—15, E.Î-I75) xupcao г^огшезй на .клотгах, к котором osa tíuwi ахдптгрогали псрво::ачзлвао в та: лзбормгорггк, «з которц?; си;; сыпи гюлусскы ^Sii&î н BS-C-I, соотвстс-гс^ило). В' лу^оссэ cacc:-.u;i ILV17G ровап к г.;:о-;глм ïlC/P£?/5 i; кронв/л сг,с*л u22o:;ûtîrjocriîo cícS -ства при 32°. Птаммы, ад&акзюааагар s асрэдэ..сн:их«г тгззу густотах .чини!;, паярн:.;ор, tXüKjpoünacra^ кл: сходную jsrsiswcqr ропрегукапи /рлs.*'/. Та ;.:э ач-адоцдая сг-isneia в oxkcsuos: по; зкссэж язяяЛ цочз:; council цар-tura: ('í6/ú7, "72г.0"). «abitase шсяыпз m едоптаказ ятамлоз ВГА x; оггрдед&елл якзтехч в направленны со;??здо:ся sni:<ytíaasc:n:c?o пз^сда kçuo-нов, позшгенпл szfùznz&zzoro г^тра :: ¿:c;:oïzî?û ¿г ЕЛ», (йиахо, если стаам copsoawssso о'-'д г. язгпоГ. клеточной л:::а1ы, зсссгаюглсаие его jc^k^tísuqü сассз&сизг. до махекдаа Цро2сход;:ло посяо ¡:ccl.:; тес;: . Наиболее аадздюа вдажлпо чзсяа аассзгзй is в1ЕЗД Д? ВГА cí*x-¿o отмечено ш у свекзвэдзленного KÎ-I, в ароцзссэ его адаптации к линии глоток PLC/PT/5, а та;-~о ври здапгацг: шж-мов к новым клеточным линиям. Только сапы ist&>.î.î кшлекгда (iüí-i75) обладал цптопатичоата дайстиыэм па глотки PLC/P2P/5

нрч : v.-opisypo лл'ргсзт;.;:: ».

"'л.;:-'. eu ::po.pyi:ii;::' Ar , г:-- :.:t '..то

'r/.'..:0'j"j.:j •wru :"• te:::.::::.'; :iee-c:í к^г-з-: '.- ' и no gtí:-<-

^льтуг.'-тыг": сгод n ¡:a т,зп"-одук::г> r.::~ J'/cü. op'.v:", с-.:.".-." ".i'','.*. • ,t:(:¿'.viif)'.r:¡cm ее:-:,

tviov (:',:пт:'дг;>, , , rpoc:i::;.i, трпито-

■J'!:: :: г.тлп::), более 0/:агс:1г::>:т::;;:л: дпя £ГЛ

u'C, !Г!}, чгм йякэ::ая :;о е-стг-пу j:

с^-дс .'гл.". :: • утязаяш-л лчгл Хот-;

г::: рпу:: v:"-.:. epryi rr::-.;.aw.o ссотолгпк голс-гл/' :■.

лг".г - л-лтел ^л-плст" "л

''г:-,:;-.-/л- <\p\v Г.™" Л1 Г-С pa:.

¡r -'pe.::.'";;-:': .'.л Г-;Л v ' • - i.v:\> v

г .. ■:: :: ■./•■sur.-,:'.'. ;: '"г- •'.••' гг.".' г:':-.-/.-

:y " p* суг:::'Ч г:-:' .-;:■:/:,, ;лгл-'м:;> -¡"о■••/.; -

л: ; ' рл:~:"лг;:> v. <лл.;; г. ст-л иг-.

v.; • •> К.: к p'";;::;;:?:;^: :¡ л":;i-

r;c!"j г;: 0,!5 ;;o S,!.,' m nr:\r~-;> v:i Nereus ¡'-tí

ре^глслп"; л. етс.*"' ел:;сро'л:л переели:; лерел ':: : ; Л r JTP

oo «»or/ira, c;v?-üo Гзрапго, ora с::чо -•

р^лл".; oo-'t-orr.::? ::ллл^;грулл;:о лоторло ovoyTctnynv в су -

v:.r:."r е;:лорплл'л:» Гг::''.елтрелп качостг^ мУад-ТгллькоД еллорелтл; дтл ггрллт^тл А? Dra, пря пе^с-р '.-о косб-лерл'..': !~/Л"Л'1Г™лолл;н:::. л- "гг-лг-елл". гонттед-. с тг^патьрс-гчттгог: хг» рлло ::гул':тл::л ллг.—r-, П7., Î23/IÏ/5, tí 1Гг-Т75.

лС'Лг-гснгго i) ер;'-™! плбог'д •::• '•;■::.:;: л у.г^ото емктрп

гъгХкотяяоэ ve о^азшзато отрпкагольного алзшпгя ¡грол^^т Аг ВГА. Наоборот, vipr. c?*:auc¡ от аиг::бкотаксп глчестсо ^юточясго Konoiarcü "лато ó:v.o яэудозлэтйохатэдыг.:« чз-за узкого '.:окро~

за, что сокращало сроют инкубаиаи. Температура пняубашк шинированных БГЛ клеток играла ваагую роль в продукции Аг БГА (табл.5; рис.6). Для бс-ьшшства итаглюа ходлехши теглзратура 32° более оптимальной, чем 37°. Этот факт шззг пьгэть значите при производстве Аг ЗГА. В прешло;.! аналогичные латания были опис"ни другигяг исследователями Так, например,Pravo:îй« сотрудниками заметили, что птаг.-лк ВГА быстрое едаптарокгксь г. клеткам ЖС-5 и о" при 32°, чем прп 37°. Daccas вируса в клетках "гаю" при 35° не происходил. НалэзгтаяьниЗ результат бал получен после того, как температура nnsydaisui была склона до. 32°» Любопытен тег ^акт, что в опытах Locarniai и др. пр:-7 1зьк:эратуро 3?° полная сборка Б^А (massa I2.Î-Ï7S) » ккажх " vezo" и огэ ссрн&шо гаасажя такзш но удавалась, По-аддпаому', температура отзывает влияние а на проявление цэтосатЕчэеаого действия Е.г-175. Eco это свидетельствует о HeoCte .дакостз самого тщательного изучения порога оптимальной Totaxpzz/p'J рзпро -дукции кандого штаюга-продуцента при производство Аг ВШ, С цзлыо повышения урояайн ил Ат ВГА на клеточной лизт PLC/P2P/Ù каш Ситл предпринят попит:® ызраегаБШШ гн|лцнро -вадашх клеток в бршной полссхя облучашшх шаеС я в задача» г.:ошказ хомяков. Эти эхспер:айа?ы показали пршвязальиув еоз-ткяоеть репродукции вируса с шюяьсоЕаюам даашх цодзлзй яин виво".

Яинамииа Р-згто.тукшд ЯГА. Дашлка нараетаяая ш^ашхегшс- 1 сти к количества Аг ВГА била изучаю. «а гримере нескольких систем "БГА-клекса". Бьио показано, что штамл 1ШЗ/П/5,исходно адаптированный па линии FlC/PHF/5, и но обладающий ЦПД, при пассировании на этой линии продуцар- -<ал вштяязше количества Аг ВГА моаду четвертым и седы.2&! дняш юиубацта /рис.6/. Макси -

- и -

маяьиое накопление Ar ВГЛ а лизатах клеток регистрировали к копну четвертой недели. Сводные по $орме кривые нарастания Аг ВГА била получат для этого и других активных стаммоа (Wft-GI, I.M-I). IIa даплоядшк линиях фиЗреЗласгов э?лбряона чгалсвока (ЛЭЧ-210, ЛЗЧ-120, С'ЭЧ) динамика репродукции штаи.п 'ffiB/II/5 была такой ко, кал и при использовании линии FLC-PSF/5.

При помощи метода точечной гибридизации увеличение количества вирусной РНК в клэточнух лизатах било обнаружено в первые гасы после инфицирования клеток /'рас. 7/. Содержание шрусиой РНК дос г лгал о максимума утке к концу первой недели, т.е. в тот период инкубирования клеток, когда кривая продукции Лг ВГА все еп<е кме-ла тяндешхип к круто*«],' подле;.^'. Эти процессы били изучены такш группой австралийских исследователей, показавши, что для пта!.?.а F'-I75 синтез РНК-ША в клетках линии BS-C-I, г. тагде с тру.: -турнык протеинов происходил п первые часы после инфицирования /Anderson D.Д., Locaraiai S.A., 1996/,

Рсшролзпэдкя ВГА на разных но степени трансуор:глтюванн_остп клеточных клонах. При использовании для пассирования ЗГА клоточ-ннх клонов, полученных от лини;: R.C/FHF/5 и различных по степей! трак с J ор?,с !ро ва ш i о с л; г, паки била пшшлона связь мздлу продукцией Аг ВГА и уровнем дкр^оронщфсвакнссти кдотс::. Более трансформированные клэткп, хагшстеразуюсреся внсокам тэтой роста, высокой отухеяорсдаостьо в босто^снизс вшах и назк?м содержанием альфа-фелапрогеика, оказались плохим субстратом дл.л рспрздуттнз БГА. Наоборот, более да^аренгвроиаюшо клвкш с аксэгога содэршшам альфа-про^ешт гзкернрогпли Аг ВГЛ с такой га интенсивностью, как и клетки базовой линии PLC/PEF/5 (табл.7, мены и 35 ). Описание этого феномена нам но удалось обнаружить в научной литературе. Не исключено, что он покат и»эть значение при выборе

лщрЯшс; usotou б Ерсазгадсгао Аг ЕГА,

Адаптация кзогятп ЕТ'А г?, ^ог.ьногр ГЛ г-

его уята'угплчпг-у^. Процесс раскрыта: разаосбрашак сволота ЬГА связан с zsoassxii iioeu;: ста^сз z к: asasraeicf. г. рмдкчшз: гдг-точшм zimzms. Слозгост:: иэозяха: ВГА ;.*орссо нзгесгн;; г.:;:о;*,:!: кг-следователям, загшмащгкся этой цробяокой. Созд&пгнЛ ь Cscfca -pai кзздународниИ ?.'*зс-1': ст&млов ВГА ктачао? no3Tc:.~ нклаогам более 55 зтсгс ппруса.

Адапта^ся "детх" птажоз ЕГА :: Гйотсчним л^-пх.: до кастся -«его вродап: прздстгьляег собой домаьао vpzzotvZTSi ироцосс,тр> фщка* от Еседейошгзлй большой cssypwiiocn: с р£ого и упорства

Группа сотрудн:п:о:з upof. О.Лайасахяга сбжд^жг здосжшя ЕГА в ккоткаг ЕЗЯ-5 только па 00-г:2 До;я> поело in: ias~ фгшровашх карус-содсрп^^» «гзагоа югого:: Ш?/£2?/5, г; uosersa охот штата биг адавхзрсЕаз. Если кгоист cajasaa вгегэ sKCTjQffipaas its ттсдрасгеазЗ «¡акаого чеаегэкг, го

триод ропрадукця; БГА сэставик 210 дцой. Вгрус jo оивгрзяа

i

почет: шфихгфсзаыкг: каркогзгеэ cgoaasor прпзна»! шжашоас: в клетках КЕС-5 «лш» чорза £33 даз2 щябз&х. црз 32°'<E«"K»t

Несмотрр ка зги '«трудности, сопс". е&йй пгайьтэз ЕГА а ¡зс адаптация к гукарасшгесш: глоткаа пзебясязи tsx. рагаирспня кашах знания о свойствах этого sapyea, гли: » для ps=:;nai праиттлзс-гах гадач здравооссракокия: nasyassni пршратоа,

шахюшровашгык к тзтзк (аттсаукрогашпс:) ваюпгя, кат. is: но располагала свадз!тгягс1 о Еггаглах ВГА, csa-otpotaumsc от больных на reppsTopsBs натй страны, наш бшш предприняты попытки выделения такех сгакао».

• Б padcro х:спйя.г>гоглли экстракта фехаллй бслышх гепатитом А пз rCîCP, 7:\ратаи, Белоруссии, Узбекистана к Таджикистана. Обработайся глсро?зр-."с:л IQ3 экстракта изучала при псмозз ИСА на калпчка Дг СТА (Г:СО проб) и отбирали та кз hie:, ноториа содержала ко 4,0 ОД аятзмки ОЗячно качогзтальп» проба сое -таплллл :>а IO-ÍO.' с? ::зслзлус:,;сП картин. Оксгрдкта, со -дзрдасю Лг ВГЛ ('12 прс5а) паслапгали на клеточный уонослой л алоткз гсуйзрогаях Зри 32° к 37® з тачонпв 60 лпоз (хютеа -Iß/'IV, PlC/Fj?/5, 2EhS4) з 120 давй (клока ЛсЧ-StO)... Угаса:пз:э г'г.^пльккэ срокл гнаубаезн сазясаля от ка-чзеттд ite-27c~5cro гпаесл:::!. Tesoro э т*яз случаях гз 42 а ворисс пассат п г-т-'гп SO-SO Л cizTçjzvsi щягйаь* роцредуя -CT ЕГА по карекгакк:) Ар ЙГЛ, гзгаотяясго s вюсзэ П5А. II тать-ко n едясм сяупэ удязсеа поепрсазкатк кк^акцкэ ВГЛ на клетках лист Д.С/Е1Г/5 ,{î2îfo.Ô). Ото С.к"о црз аспсаззсмизч оксграата йадкюго ГА зэ ПотаоЯ кгпспосзоХ бояышца

/I'23-г.Л псжпгстао Л? ЗГЛ з кетсрсд ескаЕяязо 10 ОД. Прз веккз soviel szijysssícsn з огэтрохта бняз ебпаруязка кь русиая Н55, а а сгззорстпэ Цельного — скясфпвсиаэ япгатэ-ла Sî'J.

Пэркзэ сассс^з »га эдэгтаз ПС/Ш?/5, ss^öspsrainanc пра

32°

а 37°, подгоорзш касто иеруеа а tawsss «катах m ЗОчй дэнь поаяэ Псаяэ готего пассп-п г-гз*5л пелэзешш Ар

БГА з здотстг-П лкгатгл çorpaïMocb до 5-7 дпэЯ, а продукция оитагэна 'ста3"~г:трс-гссс:зь п прззипла 14 ОД. Ноа?3 гзсяяг но обладав га?сгатзчоскк:к1 сзоПства'.а, Нв^скцксшпхй хатр для ита;«-ка МИ-I (гаркан?, культивируемый пря 32°) качали опроделять с 4-го пассата: . 10^ ТкИЛ^/л лвзата. После 10-го пассат пн^вк-ЦЯОННЫЙ ТЛ'Гр состагал I07 TKíUUq/йЛ.

Принадлежность изолированного штамма (L&I-I) к ВГА была подтверждена при помаци электронно;! микроскопии, методом точечной гибридизации, методом белкового электрофореза, а такао физико-химическими методами: определение константы седиментации и плавучей плотности /рас. 8,9,10/.

Вирионы втамыа МИ—I по своему размеру и форе были идентичны ■вирионам шташа г.ЗВ/11/5. Полноценные шрионн, содержавшие нуклеиновые кисло.л, имели коэффициент седиментации 1505 в отли -чие от дефектных вирусных частиц, но содьрааааих нукяоаноше кислоты (90S).

В CsCI градиенте плавучая плотность полноценна вяриопоз ЫИ-1 и ME3/II/5 C'd.ia 1,33 г/см3. При слектрофорезо вирусных бедкоз структурные белки вприонов штамма Ш-1 по молекулярному весу были идентичны белкам штамма ЫВЗ/1Г/5.

Лг ВГА, подученные при использовании различи: штатов коллекции и чувствительных глоточных линий, несмотря на свою кзодкород-ность по физическим и химическим параметрам, обладали высокой специфичностью в серадогичо'ких реакциях с полаклональиоН сывороткой. Эти антигены били' использованы в диагностических тест-системах ИФА при диагностике ГА в кдмкчзекпх условиях, а такта при езучзшш со-итояния иммунитета к ГА у больных групп населения в Средней Азии и PC2GP.

На основании проведенных исследований составлены "Мотодические рекомендации по изготовлении, контролю и приисканию тест-систем для- выявления вируса гона гита А в антител к ному с помощью ША". Рекомендации утверздены Ученым роветоы Института вирусологии им.Д.И.Иванозсхого 12.05,1936г. и применяются в клинических и эпидемиологических исследованиях по проблеме вирусных гепатитов.

Результаты исследования позволяют сделать следующие выводы:

ВЫВОДЫ

1. Адаптировзн при 32° п 37° к выращиванию в клеточных линиях РЬС/Р5Р/5 и ¡„К измят вируса, гепатита от больного, госпитализированного в гЛ,!оскве. Зтот штамм (МИ-1) по морфологическим, физико-хюлическжл и серологическим свойствам является вирусом .гепатита Л и г.;окет быть- использован для приготовления пдлуноди-агнсстячосклх препаратов.

2. Штггялн вируса гепатита А из различных регионов мира

(Э штатов) при Бнразазаняи в культурах чяеток различаются по спектру чувстгптзльных г.эточных линий, скорости и уровню продукции Аг ВГА, оптимальной температуре вкраивания и способ • ностл цнтопатичзаг'Д оффзкт.

3. Уросонь продукции Аг ВГА определяется штаммсм-продуцен - ■ том, типом клеточной линии, составом культурзльной средн. качеством и видом сыворотки, тсг'лоратурсЛ культивирования,

4. Репродукция вируса гепатита А в метках РьС/РЕР/5 зави сиг от степакя даффзрвяцпровашсста ктаточной .культуры. При использовании сильно трансформированных клонированных клеток ре -продукция вируса по происходила, а то врогл как з дифференцированных клонированиях клетках образованно Аг ВГА было таким ко^ как и в клотках базовой ля!ш1.

5. Вирус гепатита А способен рззтакоЕЭться а опухолях кзл.01Х грызунов (га\"'.а-облучзнкьа мыша-гябряда), полученных с помощью гаракенноЯ вярзсси клеточкой линии Р1С/ШУ5. Эхо свидетельст -вует о возмозясста использования данной модели для выращивания вируса.

6. При одноциклевой инфекции начало синтеза вРНК происходит в первые часы после заражения клотлк. Синтез вРНК и антигена достигает максимума дет штамма !УР-61 на 7-14 сутки, а для штамма МИ-1 -на 3-7 сутки после заражения.

Tnfcra I

О т о ы sí u 3 Г. Л

Шгсма БГА Число HSCCÛ- v.ot^ lipon:» A- Д0ИИ0 Голшаратутаэ кзль-тиваро- Кзоточаад ДЛИГЛ

1. HAS-15 (ЗЛ/ 2. С?-979 3,.üb3/II/5 12-" 12 сил США Саьавгзая •-ж., l.'íwil Снайцарал ат ' о?г v. J - Coaitas D7 37 32 ЛГ ¿t^-i—** Ü2C-5

4, 11-101 5. Eíi'-l , В. GEJ 7о IIÎ 23 3. V-TÄI За Li-Î-X Sd Ш-ï, I io. î:.î-iv5 0s 8s 5 S 32 Л Г) 3-2 bí С** s7 01 ur.o-5 '.'.y.ï-f: гхс/г; ...y? PIÔ/PILVî juo-i

Ойозаачошш: - чаодо пзсзшгоЯ. ври: -»ísec в цзвтрэ дроф. Г.Схгла {Läafcypyi).

Таблица 2

Сарэдагавас ранга стг^зг-продуцэитоБ ETA а caisicsüsста oï эгвдзязд шгзсхцэоипого титра

íM%>/sa> . •

1 15?аа iaicöiäfctöjmää ГтщЦо,^) Paar

СГ-С7Э Юу I

Ш- 61 - ю9 Ï

ЫВЗ/11/5 Ï08 2

'ш-i то7 3

СЕМ ю6 4

•ТаОд:;ца 3

олрэко*'lîîlo rnnrr, пг£гг.топ-пррдуцо«тоя ¿г DPA а огягскгдаста с; ктвзял U/JГ

Err.-?.' mm^i.-oi аО .лг ятл ....... Раг:г

IB3/II/5 31 I

Vilt-úl a 2

IZÏ-1 •зз 3 •

Gill SG «

C3>D79 21 5

Тс&ащз i

ív?.tLt;;r:'pcг^лж* 10 г.тг/моз ВГА вз 5-ти жшаях глоток

'¡¡".о^рс- ïrr-

ir.: Псугг.'-ЙСТ.-:- Дг ВГЛ (ï'V'i ivftTonnst тггг.гтгО .. , _

ьгл f'-'Г _ тг. Я/я, -чл jZJbzL

-f г и.о.

аг-1-тй ++ * » Í-. к. о.

rï-i 33 •<4 гч» п.е. и.о.

км, i 57 ++ M ■4- - п. 0.

32 +4 i- - tî.o.

П-141 32 ++ ++ IX. 0. - и.о.

пет 32 ++ ■ + и.о. - о.

GEÎ.Î 32 4-+ + t:.c. и.о.

IH по С? •i'4- ' « п. S. « и.о.

07 ++ - п. с. - и.о.

Î;%I7ÎI Si 44. 1Î.O. tu 0. п. о. ++

С&шгзтэг?;:.:; - <J«oo 30 + - иокое î<

± - ;.'22сэ 3 « - цокеа 2

tue. - по спрсдм^'л

Таблица 5

Продукция Аг БГА на клеточной, линии РЬС/РКБ/б при 32° и 37° (И$А клеточных лизатов посла 30-двевной инкубации)

штамм ВГА ¡) пас- сяпга Температура ис -хорной птятотхяр температура пн-етйисоранкч К-во Аг Ы.'Д (О/К)

МВВ/И/5 16 32 37 35 8

МИ-1 10 . 32 32 37 17 15

Ш-1,1 10 37 32 37 14 Т.4

Таблица 6

Продукция Аг ВГА (штамм МВВ/П/5) но разных клеточки: линиях при 32° и 37° (ИФА лизатов зареяошшх глоток посла ЗО-дкевной пнцубацля)

Клеточная ли—¿я Температура иик7 ¿атет Л0Д-Б0 АГ ¿1а'А (о/кГ •

РЬС/РЕР/5 37 8

ЛЭЧ-240 32 20

37 7

46А7 32 10

37 4

Таблица 7

Продукция Аг ВГА (шраязнная в О/К) на клзточшх клонах линии Р1С/Т)В?/5

Штамм БГА РЬС/РЕР/5 Клеточные клош

. А-У ■ ^ 1'Г>

№1-1 15 13 13

Ш-1,1 IX - 10 II

¡.1ВЕ/П/5 19 - » 14 17

. КЕ-61 18 - - н.о. в. с.

ИГ 26 " 14 - - и.о. Л. 0.

Обозначения: - - продукции пе било

и.о. - пе определяли

Таблица О

Про^п-.п Аг БГА па плеточных ллнгях при пспсльзоззнлп гкстрадта фекалиЯ бодьпогп ГА (1-Ш. хтегочкыя лиззтол, О/К)

Лпияя Темпазат7~ рэ хультп- Д пас-саза Еяруссо- датаааий Чсодгкцпл Аг БГА о/к

хтатск впроааная материал (циога - !! П

день* снятая яуро-зая" зн-риснсО 20. 30 40 50 СС

46/47 37 I Й. 3. _ з,с 2,9 2,1 2,0

2 кл./л.20 - «2 ■•2 '2 <2

О кл. /л. 40 - г 2 «2 .'2 <0.

3 кл./л.40 - <2 «2 ,2 ¡о

ЛЗЧ-240 37 I а.з. — <2,С З.Е 2.3 3,8

2 к!г. /л. -10 - 2,5 >2 •2 -

«? кл./л.60 - <2 <2 -

3 ■ . гл. /л. 33 - *2 «2 «2 •0. ■

X - «2 >2 2,4

' 2 зл./д.БО - <2 г2 ■>2 «2

ГЧО/Ш/Й I й.э. _ _ 2,0 3,2

2 гЛ. /д50 6,: II - - -

3 юг./л. 30. :о,з 15 - -- -

32 i - - 3,3 <2 2

2 пл./л.40 2,5 3,4 2,2 - -

2 ал./л.40П 14 - - -

3 2л./л.э0 - 19 - - -

Обозначения: " ?л./л.П - глоточкй .дзат, сконцентрированный с псмспдао ПЭГ (к. в. 60Ш)

ф. э. - фекальР'й экстракт

но определяла.

С'сС.

w

—*Л

¿ieLïi. 'J- £ДЬ

Е:я£л1-' ic Ar Ы.1 s ^Karoo2tiür.o¡. к/льг/тч ¡¡ли o:ícíTc¿::r£:: исгракиск:;!; cv öerinis;

ííí-

- С-Ц'П'.,

"i ч

.Л

2

o

<1.

>

Jr i>

v

¿r Gi!A

4

Д'тл кангутяиямго спр-Д^-^ ".т.тра

(IoM 'i- lo (г ) г cur, спадах бйпысй: рсвазд;;?; А

к рсхжГдг&гзсясщ'Ой

Pue. I. Сздки постеногог: ПОД.

V__!_2 Л___r, f v;.«f

Û 5 1Г1

4. и 1b-

7 Д.'.'

V йг

í /Т-о',7

i ?

Г\.:p,:r;.::c;:í'r: глвгл г.?.' УЛ/'Н/и ВГА,

I 2 '

Г»

.'. ; i. , .... ,

1 ". г.

и :са

г :

"ft/

'i

.тс

.. Г} 1

ГЧо. Г:сггк?::й сгпггогз 2?rüí ЗХЛ п «кетках готодсг

зчгл'соа гсята&зсипнио ВГД с жяхсет

•r.:.:~i"-".;;r:r:rcc3.:nic.t »••¿с-аТдай (а) " отдзлк-лпс ^ '0-rv¡jiK глпгоп (б) "С ••

¡2,3,Л - ёет:эз зГЬК а затагкмпг« лютдаг

югээ 6,12 часов л 21 г.г.ь псо.:о г.тс-::изгл • 02'j-r-j scraps mcî?c?..-

" « «f iö ~

о/«

ÍO

ю

to If

fwM

Ргс. 4. Процтая Аг БГА masse K33/II/5 га гослоагяых клеточных ляееос (г отво-евтельЕНХ tjuœnax оптической плот -eocîi:C/K.

Кязточшэ *гкгг --- - вН

Рг«. . йпагагэ варагтакгя Ir ВГА пикет ЮЗ/11/5 ta рзэгнх кизтотил лши в аяагсгясоя от теетэратла ^лметгротакия.

------ - ГЗМ - - ШУИГ/З 32°

—'—»— - ДЭЧ-120 ____________ 32°

, ____- 46/47 32е

- НЗЕТО" 37°

—»—» - гй-г«о

—•—о - 45/47 37°

«i 7 «о 14 sa

ît.c. 6 . JSnaazra тодукют Ar ВГА а маточное линия* ( у.:,\ jaaaTOD sapaseKHiCv urates* КЕЗ/И/5 метек).

Kistoчгт япьла

- - PLC/PEF/5 —

- - 46/47

-----131-2;;

- Т-24

t-t'-tt âv <Ы л ■ л

'.г- t • О У

kyr P'r-jr rr<y,

«'"•^óiC'Hín/i

M

w

Ркс. 7. Дяномика накоплена взруе^тс ?HK я Al* ЬП1 при эасагмгаи ВГА клеток R.C/PFP/5 (точечная ггйряязация).

Etc:.:* Ï.EÎ-I сессд засагенсем елсток сгодг-арятельпо от^сз s ссхзрозися i; С^СГгршаэятах: btcj.jj W2-6I прежтгг.-та хлэат эа~г£е"пызс глеток; количество вируса га клетку ОПрзДСЛЯЛД L EüröüfanOHHOCTIt ВГА (ТК ÏUC-q) ст:а 0£лсц2К-лово.Ч ¡шфешша ( 1—2 висусяые чэстжа ка jt¿arK7);

Пвегстгзлепьг адшкэ во гкйриззгдгя с вРЯХ гз згра-~бшых меток ("PrEKK-ВГА г "леконателъностеЯ яз аестстятугчой (нуыеотЗЬ jOO - 73 ООО) /а/ г-тя стгуктуон (кукдеотмз 990 - 33 ООО) /б/ ойластеЛ гезс:/а."

К ~ щклеановал кислота из клеток IbC/rsï/ô В - в?НХ кз вя-усэ, использованного un sajasonzí клеток (1-2 вгрусныа часткцц на клетгз).

а

•Л.Щ- I ¥Р'{

Рис.8. Электрофорез белков штамма Ш-1 и его терговаряанто Ш-1,1. Примечание: белковый электрофорез (7) в 7,5-15$ градиенте поли-акриламкдного геля. 3 - птвмм Ш-1

2 - штамм Ш-1,1

3 - итамм МаР./11/5

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОГОЪйЖОБЖЫХ ПО ТЭ.1Е ДГССЕРГЯЩИ

1. Соролог:!честно варианты вируса гоиетпта А.

A.Н.Бзоров, Н.Л.ФавороЕ, С.-..Аракагов, А.Б.Егаонко, А.М.Дой-глнокяй, В.Р.Фарашн. Сборник "Молеку-таркоя биология спру -сой гриппа гепатита А", Ы., 1235, с. I02-IQ7.

2. Использование культурального гаруса гопаткта А в issiymîop -иентнсм анализа для выявлзния спс-Есфичоских ентител в спво -ротках больных гелатптсм А п рскоотаяосцоэтов.

B.Р.Фарапян. А.Б.Быченко, А.Н.Езоров, И.А.Куза&па, К.Л.Агак-соевз. Сборник "Актуальные вопроса обаой и глэдпцпшжоЕ плру-сологиа", M., 1986, с. 67-70.'

3. Методические рекомендации по изготоилонии, коптрот и при.» -ввшпо тост-систем для гыетлония взд^са А и сптитед

к н8ыу помолы) им. . '

В.Р.£ара1дяи, А.Б.Еычедкэ, А.Н.Взоров, Е.С.Кетшгадзо, В.Ы.25дэ-нов. Утвэрэдгш Ученым сойотом Института вирусология км.ДЛ1. Ивановского 12.С5.1936.

4. Культивирование вируса гопатита А в разлив.,ах клеточных ли -нпях и использование кул* "урального вируса в диагностичооких целях.

В.'Р.еарашя, А.Б.Быченко, ИЛ ^узаова, В.М.Нданоз. Тезисы Всесоюзной конференции "Актуальные вопроса диагностики, мк-домиояогия и профилактики шрусмого гепатита А", Л., 21-24 апреля 1987.

Заболеваемость и юмупоструктура, как показатели спадами сдо-> гкчсокого процесса ГА среда населения некоторых районов Тод-*"какской ССР.

Т. О.Слепушгсяка, Д.М.Ярзшева, 'Б.р.сарапшв, А.Б. Ьгеоыко, Г.А. Данилина, Ю. А.Зотова. Сборник "Обзор центров, сотрудничающих о ВОЗ яо впруснкы анфоицаям", И квартал 1986, M., 1986, с. ¿2-28.

6. Эпидемиологические особенности вирусного гепатита на территории Кулябокой области Тадаянекой ССР.

Т.О.С&оцупшша, Д.М.Яраи0Ба, Т.А.Дапилииа, В.Р.Фарашян, А.Б.

Шченко. "НедшцшсиЯ реферативный журнал", разд. И, J& I,

19ГЗ, публ. 278.

7. Влруснш гепатита у лвд отарпю 40 лот и УзбококоД ССР. Е.И.Егрцева/А.Л. Беляева, А.Н.Сявпушетн, В.Р.Фаралян, И.В. Кругдов, АЛ.Хадгаев, В.В.Сазольев, И.А.Са'лоо«ова, А.А.А6~ дуяадороэ, А.Б,Еисш50, Т.О.Сшзпушова, А.К.Д^урахсдгаеа. Сборник "Обзор центров, сотхгудннчапук о 303 по вирусным аяфвяцкяа", И квартал 1987, М., 1538, о. 18-21. 0. Репродукция взруса гепатита А э алвточвах системах.

В.Р.Фарашя.л, А.Б.Вггенко. Тозясы международной конференции "Су1!дамептальнне ц прикладные вопросы СШ1Д, вируоных гепа -татов и гриша", Суздаль, 20-30 сентября 1388 , 0.36-37.

9. Штамм алруса гздатата А пеловока, используемый для приго -тозлэнгл диагностических препаратов.

В.Р.варазш, А.Б.Шченхо, И.А.1^заова, Е. К. Артемов, Ы.О.Са-воров, Й.П.Кздоеников. Авторское свлдетеластво й 4617329/13, солознтелшса рзшенго от 29.06.1939.

10. Культпварованиэ вируса гепатита А в различии клеточка дд -ниях п подучеяло ДЕК-поалодоватодьзостза.

В.Р.Озрадяя, А.Б.Еэт9н:50, П.А.Кузаева, Е.Х. Артемов, Т.МЛиз-еякоез, В.М.2далов. "Вопросы варусатогаы", й i, 1990, а 23-26.

11. Адаптация язоаята вируса гепатита А я репродукции а моточ -них культура*.

В.Р.Фаранин, А.Б.Шчанко, Н.А.Кузаэва, Е.К.Артемов,.Ю.П.Ка -допшякоз.. "Вопросы вирусологии", й 2, 1991, о. 117-119.

12. Репродукция вяруса гепатита А в клеточная культурах. В.Р.Фяраияи, А.Б.й1чанко, Е.К.Артемов, И.А.Кузаева. "Вопросы вирусология", Й 3, 1991, о. 209-212.

5а к. № 634 под п. к почата 17.11.02 р., тнр. 80 екч. Ротлпричг 1|:н1 мт раин