Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рентгеноструктурные исследования противовирусных агентов нуклеотидной природы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рентгеноструктурные исследования противовирусных агентов нуклеотидной природы"

о и^ 5 а *

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИИСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

БОЧКАРЕВ Алексей Всеволодович

УДК 548.737 : 547.963

РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОТИВОВИРУСНЫХ АГЕНТОВ НУКЛЕОТИДНОЙ

ПРИРОДЫ

(03.00.03 — молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Мое ква —

19 92

Работа выполнена в группе дифракгометрии Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители:

кандидат физико-математических наук А. С. Жданов, кандидат физико-математических наук Г. В. Гурская.

доктор химических наук М. Ю. Антипин,

доктор физико-математических наук Г. В. Фетисов.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАН.

I

Защита диссертации состоится .««лРи^ 1992 г. в 14 часов на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу. 117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии РАН.

Автореферат разослан 1Ъ 1992 года.

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь специализированного советг кандидат химических наук

'■ " 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

......г I

,. , Ь,

г/К'Г. лц^уадьнос^ь проблемы, Разработка-аффективных ликарстеннмх ^Ш^ЙЙр'аТ0 », способны* подавлять вирус иммуиодес^т.ит« челонекп (ВИЧ).являете* одной из центральных задач биологической науки по вс»м мир* , Йозмажчов действие т.чкого препарата может состоять и ТпМ, чтобы |)сиусст8(Л1НЬ|м путои селективно блокирипагв функционирование < «лвтмах организма рДин и? специфически* ферментов, необходимы* для ^иави-Гня вируса. Хорошей мишеньй для такого воздействий Являете* обратная Транскриптаза ратроннруса.

Ь йаатоишев »реи* ч медицинской практике широко испо.н.зует-сн пр»((арОТ А2Т ( 2 '-4зидр-2*, 3 '- дидезокситимидин ), 5 '-трифосфат крторого в значительной стереци подавляет репродукцию ретроииру-са, т»рммМру*| биосинтез ДНК, катализируемый его обратной транс-«риптаюй. К цожаМний, ^тот препарат токсичен и имеет высокую Оввестоимрет«,, ЧрвлшЧайно актуальном является поиск и исследование более аффективны* н двшепы* препаратов, обладающих аналогичной рвойетвамИ и меньией токсичностью, Для решения этой т-ДЙЧИ Необходимо знание структура И меь-низма функционирования ан'ГИ»НЫ* центров различных ДНК/РНК синтезирующих комплексов и и< рубсТратОв, Я наотояидев время проводятся рентгеноструктурние и^слвдсцвнич Обратной трЬнвкриптазы. Предстоит изучить строение М функциоийров^ни» ее активного центра. Для этого нужнц данные о точном прОетр«лет»»Нн-ч Строении различных модифицированных нук-ЛвртидоЧ * субстратрэ, терминаторов и ингибиторов процессов йио-«ичт«зв, НЯУИИХ о участием обрйТной транскриптаэы. Особый интерес представляет получение данных по коНформационио ограниченным Сов4ИНвнй*Ч( как они позволяют зафиксировать одну из ао>ио*-иык конфармаЦий субстратов » активном центра продуктивных комплексов,

ЦрЛЕ диссертационной работы - исследование истодом РСА (рвнтгвноструктурного анализа) пространственной структуры ряда модифицированных нуклеоэидор, у которых-обнаружена или предполагается антивирусная активность, определение их хонформаиионных характеристик и выявление корреляций' между пространственным строением исследованных аналогов и их биологической активностью.

Научная новизна работы. Получены данные о точном пространственном строении трех конформашюнно ограниченных по сахарному кольцу нуклеозидов.: 2', 3'-ликсоан гидротимидина (1аТ}, 2',3'-ри-

боангидро.чденозина ( г и Л ) и 2 ' , 3 ' "-цидемкс и-í ' , Э' ».¿иде ГИДРО'ГИМИ* дина (U4T), Наличие биологической цктицис.-тц у этих соединений Р форме 5 ' -трпфосфатов по отношению к обратным -гранс«риптц»йм и »i<."koto|jm»i ДНК-полимера jaw дает рвадеми« о büjmo*hwü кои^оркшиН"* сахара в активны* центрах этрх фермента».

Определены про«траист»«ины« структуры трек 'щиДоТйМИД!!!»-» подобных" , т.е. имеющий объемный /1ий»йнмй зць«естцт^-íjh в З-т-поЛО" ¿копии, соелннеицц: . . -'

3' -мотилиминр-З' , З'-дидезоксипшиДинр (iiil1( 3'NHMa )), 3'-O-míti'ттирыегил-2!-дазокеитимидии.ц ( ilî( 3 ' ОМзБМе П и 3 ' -0-мс*тилсул ьф1>ксимйТ1(л-2 ' «-лозочсит»|милина ( dT( 3 ' OMí SDMi? ).), Coiiocтаилениа пространственного слоения не? ^едочанни!* çop« дининий-н их биолргичеркЬн активности позволяет чценИ'П» изаминри подстраипаемосуи активного цен/фа ДНК^родимерд!/ рбррт-iLi,¡x транскриптаj и 3'»-заместителей раз.тичногч объеИЙ и формц.

Установлена пространственная структура 1»-( З'-СлметМ-З'« де зоксирибофуранрэнл (тимииа ( í)T( З'Ые )), Это «овдинйНЙ« » форме S'-трпфосфати не у?н(гвт<?я ни .адням Д|1К~сннте пирующим круп/цр|щ;рм• 'Зкспониментадыю подтверждено получмни« па ориги^йдн^чР ме-lu дик« N4 цроичводрого тс «фмлдина т 9-(|-1Ы<«илоф),рвН01И'1т?рфИ'!ЯИ*-пц ( ху I о— i he о ) и i ' , 3'-:иоксолинц ,( £~DOwT ),

flpiiKTнческая значимость работы. QrpsCoTftHu 4 проверена Н8 . практики методика съемки и расшифровки íTpyit.fjp. чя.^омвдем^нр'г пых соединении с использованием iioncifp peMlTH!QPeM9l"o «амги^^ей ( лифриктоыетр-комльют^ргпакеты программ ) , ílpítMA^hii Дор^отя*)\ рядд программ' KOKin/joiçcî» применительно |< ^меюдому?« оборудоцаник).

Получение« данные нералъзонзны Д/)я ерц&цйтедьиогй , ilHBIHííi к'онформиднЛ модифицированные нуклера^дрр по данным метрдов РСД, ЯМГ и теоретических расчетов мйтоддми мол^улярнрй ц^х^ИЙ««) Р'ж могут быть полезны при компьютерной ЦСС/Wдо^арии -.ЩТИМНЫХ UPflTw роа Í1ÍIK/РНК—с в и з(а1вающих и?нтррв методами модекудярнрй графики. Получомные результаты могут быть ^использованы для црденцнрйи'ден'-' ннги конструировании обье^тор è нужными биологическими свийстр'а-мн, » том числе и ингибиторов ВИЧ, Подтверждено Получение ожидаемых продуктпо новых« оригинальным методи^имЧинген'.мто предоставляет интерес дл* специалиста» ь области органическогр синт«-)»,

Aflpofimwn работы. OcuotiHua материалы были in ".чстанлены ни |*ду!Фродром симпозиум» '"Synthetic oligonucleotides: problem td frortt ief* of practical »ppl i en t Ion" (Москна, 1!>9! ), ме*дуна->днрЙ «квле^вимоозиуме "Crystal Qrouih с/ biologic«! Ma с г omul t— llei" (U(iiv»r)ilty of frelbuig, Germany. August 1<J9I ), VIM сим-Икума "The chaitjUfy of niiilclc acid components" (Jlechyno Htle, Ch^fOijoVdkU, September 1990), VT Всесоюзном совещцмии > органическое кристаллохимии (Киев, 1991) и конкурсах работ <«т1-)тутв молекулярной биологии им. В.А.Энгелыардта РАН (1Ж) (овмйй, 1990 п )991 ).

Пу^лИкцшП>, Пр материалам работы опубликовано 8 статен » ¡■44ведренны* и зарубежны* журнала*, а также тезисы ряда докладе.

ОЛъем и структура работы, Диссертационная работа изложена t 'fplo'wраницйч машинописного текста и содержит ¿о таЛлиц и

рисункО», О.ча состоит из введении, литературного об юра, 1сп»)рим*нтал ьиом части i обсуждения результатов, выоодой и с пне-i литературы рсылок),

ЦаЦШ1 йсолвлоанния t дргдари.хуМ • Соединения для .исследований оы-i ейитезирраанч и любёзно предосталлвны сотрудниками лаборато-(и кнкичовкого и биологического анализа биополимеров и клеток Ш, i-оеудйрсгвениого Университета, лаборатории сте-

!0*имии .ф«рМ»чт**«аН'1х реакций ИМЕ, Московской медицинской ака-!мяи км. Сочвиоаа и объединении "Кимгех", Конформащнжнме рас-, mi («о Программе MMX8S )■ выполнены совместно с М,А,Лукиным ( ла-1{кпторн* К биолог, анализа биополимеров и клеток :iML).

:ви им автор яйражввТ свой глубокую Признательность,

(Ср^о^аллЬ) Дл» рентгеновскойсъемки былй получены метолом »дленного испарения растворителя при комнатной температура и >и 4°С. .

Определение параметре« элементарных ячеек и сбор экспери-¡нтальных дайны»; для всех исследовании* соединений были еыпол-Miw с помощью автоматического чвгУрехкружного дифрактометра VD4F (Eppaf Nonips, Но I 1 а лс|) на Си Ка излучении с использонани-л граф(<то*огО моцохрочатора, Используемый метод сканирования -io. Определение и уточнение кристаллически* структур исс.чсдо-1нных соединений проводилось в раыка* программного комплекса )Р4 (Enraf Nonius, Holland) на Ш1 MicroVax ■ II .

Табличц 1

Основный кристаллографические и экспериментальное характеристики исследованных сцедийоиий

Соодининиц Брутто Прост п, Число Чцсло Ц-фактор

Формула группа мо;инул йтрй-

1! ЭЛ.ИЦ. »енцй

«ит с10м2о4ни Р! г (¿70 Л. 4

1(1 г С10''205Н12 Р1 ' 2 1862

Пи» С1бМ5°3НП 2 - 1376

0Т( З'Ме) СиМ20£Щ4 рз( ? 114?

) спи3о4н17 4 , В41 4,8

"»'СМеХМ.г) •н2о 4 1272 М

1'.Т( 3'0Ме50Ии Р21 2 168(1 2', 8.

Л у 1и-'П)ЧО 4 1117 М

И-ООтТ С10«2О5Я(4 Р1 > ; ■г- 15)4 4,4

Мола¿ули А Молек у пи В

Рисуми* 1. Строение молекул Л.Т

OCHOHHOE СОЛЕ РЖАНИЕ РАГ.ОТЫ

Но авеценнИ «броноввна Актуальность исглелопшшя пространственного строений модифицированы* иуклготиао» и сппостонлении

1ОЛУ'10ЧЦМ* р<МуЛЬТйТ(Н с биологической ККТИПИОСГЬЮ.

Псщяпн ХММ Диссертации спдоржнт обзор литератур". Проверено обсуждение дойных биологически* исследований модифицированных мунл«01)1л0п - потенцимьны* ингибитором ролродукшш вируса шМуипдеффицит& Челрйена (ВИЧ), и их сопоставление с результатами струн*урнмв наследований ряд» аналогом этого класса,

Вторая г/1 а,вg носит методический характер. Ii пои мринеденм летодИк!) получения Мочокристаллои исследуомых соединений, пред-ofas/ieHW и* рентгенографические характеристики, описями прогр.ш-лнй-мет&дичаской работа, вылолнеНнан автором.

Предкцрител^н^Й анали» пригодности «¡чнонристиллоп дли рсит-Г^ноструктурнога исйяедоианИя проводили методой сьенки ренугено--гримЫ йравдеоий H« полцроиануш (1л«ику, В процессе определения ла-эпм0трЬв элрмект8Р*10Й ячейки наализирокалм профиль пчкй. Исо t>c ?ЛедизвНиыа нриеталли имели игольчатую форму. Следует отметить гилЬную склоиноеть 0бъвкт-о«: изучемного класса к образоиапию tut-»уаяьио неразличимы* крист8лл0в»-двойин1<ов, Эти особенность тре-">ует очень внимательного подхода к отбору экспериментальных образцов, Основные кристцллофяфическив и экспериментальные характеристики исиледовамнмх среаинений представлены а табл. 1,

Определение: структур»! иссдодопанных соединении проводили прямыми rt0 программе NiULTAN. Bcts структуры ут< nienu

ЮйиЬыатрИчнмм ывтодом наименьших квадратов в анизотропном нри-5лц*внии для нвиодорряиых атомов. Поэимии атомов иолорода в основном определили по разностным синтезам Фурье, ß структур« З'^метиламиноог',J'-дидеюкситимидина координаты большинства ви-вдродны* этомор о^еделеим исход* in юоиетрии молекулы. В большинстве случйей »одородиве äTqmu уточняли в иютрцпиои приближении; (Цп|>авцу-на роглсшвкив, обусловленное формой кристаллов, анреили с помощь» прагр»м«ы DIFAfiS. 1

Р процессе работы, котора* выподиялась с использованием нового рентгеновского комплекса, в последнем был выявлен ряд несоответствий между документацией и программами, а так*е логические зшибки во взаимодействии отдельны* программ. Прогрйммм колену-парной графики 0RTEP и PLU10, входящие в состав программною

комплекса CAD*, были перенесены и идиптираоаиы «втором для рр6о-> ты о римиах операционной системы MS-DOS и» 1ВМ-»РС >» ровмветммо^ персональном компьютере, осн«ц«НЧОм EDA или VGA цвети*.»! нидвой'-дшп'сром/монитором. Ь программах рр-йЛ^эивцни ИОЗМ0*нй?т> ИЗЧбрйг жении атомов пи экране дисплея разными цветки)' Разриботанй программы для получение д&втны* |коп»|й изображений ий Hsfкодеки* пня»* плотеров и черное-белых копий - ии лазерном принтере.

Литором иыпаднено подключение (зерсощльной ЭВМ ¡BVWfC * Э|М MicroVax II для рСе<:пи<8мкя pfKipeTfiBHorp ц^мрмй дцвдыъи. мвгвду itiiMH. Написана [¡рограцмд д/|в ри?ч«та усред^ннИ* Периметров псеидоаращония и фуракрз.шх циклах.

р третей глцас приводится ойиодНие и рбсуждени« ардСе^нрсл тей молекулярных структур И^^ДЙ'^ИНН* •

Ренпс.нргр.афнчедк11 установлена еуру^туря 2',3'* 2',3'-Лиде1илротимкдиН(1 (<1„Т) ? рубеТр&ТЙ

ДИК-полиМсраз с крнформ^ццойнр с^грдцич^нньвд' ^зчмеирйбр^ИМ. НИКт лом. Двойная связь в роложенин С^'^СЗ' в %тон -ВД«(Д()Н'|*НИЙ рон.ича»: st конформашщнную по^йнжноеп» фур(хнозногри уп^рщоет *fBt И« рис. 1 представлено, стрт^нле двух ^ристаллйгрцфнчесри ННМЙ-с им), ix молекул с!цТ. BiuMMji^» йри^тацир реновация-и среарнрго остатки в этих молекула* cyiuacT^SHim Qfjm'li^Te^, TpfigiiQMtiiiiij у^рл

04'-С 1 '-N1-C?) о молекуле A pai^ij г172(йР, » вдл^ул? -85,1°, что соответствует анти? И выеркйй

Фураноаны? циклы в обеих «йл^кулй!' jl^t v рр^ктичйе^и.ГИйс.ч кие . Макс|1маль)(ая1 амплитуду, i молекула доа-

тавлявг 4,8°,д в молекуле В.*. 'Цбычня .кедЦЧрэдй'

;чч>1ид1>в и нуклйчтидов находятся р «мт^рииле ,

угол лсевдонрищения Р» в-.мс>'л<гкуле А ра?ен 90,4® (04!«:шДй кинг формация сахарного цикла),, и молекуле у^Ол 1*в«»1рЗ, 6.® (04'-зидо-Cl'-экзо конфор^цция), Ei-ли ПйЯ'в^СТН'

плоскость через все а-сом>1 фурайрзйа-го-.цикла,' то ртклвнения ^томов находятся для молекулы-А а интервале О.ООН-О,!}?"/^, -а ЦЦ9 - ® -ft ингириале 0,002-0,035$. Конформа4»я обе'^х молекул fl.T отнйси-толы«о экзотерической емзи 04'-С5' - гры', т'Рй?ИО»(ЦЬ|й угбл 1(й5'-С5'-С4'-СЗ') равен 54,)и для молекулы А и "з5,6° - .алу В Г

J_jT 5'-1 ркфосфат ь .качеству т*;рминиторного еустрата яря' нгх'огпрых ЛИК-полим^раз на одйн-дви порядка более эффектна^,

нее np> г ие 111)Чснныс ранее соединения. Этот результат можно .H'l.scmiif reu, что уплощенная концюрмании имитирует конфир-

Ь

кшцию субстрата а активном центра,

Ин рисунке 2 представлено строение 2',З'-ликсоангмдротими-дина (1аТ), В пил» 5'-трйфосфата это соединзни«1 действует как конформицяонно ограниченный селективный топмнкатормчй субстрат Обратных транскриптаз ретропируеов и концевой лалоксинуклео-'идил трачсферазЬг млекопитающих. икличенмв С2' и СЗ' атомов фураноэы » эпоксидный Цикл, расположенный над фуронозным кольцом со стороны основания, привело как к ограничению ({информационной гклдяижности фуранозного цикла, так и к ограничению вращения относительно гликозидной связи. В результате обе кристаллографически независимые молекулы 1аТ имеют одну и ту же конформацию сахара - 04'-эндо-С 1 *-»эк^о, при которой достигается наибольшие удалоиие основания и сахарного остатка друг от друга.

Торсионный угол *(04'СГМС2) о молекул® А ранен -121,9°. что соответствует обычной анти-копформации, и молекуле И гш составляет 121,2° и соответствует редко встречающейся а структурах' высокой син-канформации (90о<яг<120°), Интересно отметить, что высокая син-конформация встречается а оснонком ь 2,2'-аш и.чро-нуклеозйяах, » которых она жестко закреплена. Фачоные углы псим.-довращения р для молекул А й В раины 98,9 и 97,6°, что ссотпет-ствует 04'ч-эндо-С1'-экэо конформации сахара, При ■»том отклонения атомов 04' от плоскостей атомов С2',СЗ',С4' в обеих молекулах* превышают отклонения атомов С1 * почти в 3 раза и равны 0,308 и 0,115 8 для молекулы л, 0,368 и 0,111 X для молекулы А соответственно .

В Молекулах 1&Т наблюдается некоторое уплошение фуранозных циклов по сравнений с прнродньми 2'-дезоксинуклеозидами, с чем свидетельствуют заниженные значения максимальных амплитуд псеи-довраиени* (0гаА ■ 29,2°; ф^Ъ - 33,1° проти» « 35-45°, обычно наблюдаемых в молекулах природных 2'-деэокеннуклеозидов ).

Конформации обеих молекул IаТ относительно чкзоииклической связи С4'-С5' также совпадают. Торсионные углы 05'С5'С4'СЗ' раь-иы -167,7° а молекуле А и -177,5° в молекуле В,что соответствует транс-ориентации связи С5'-05' относительно фуранозы. Связь С2'-СЗ',включенная в эпоксидный цикл, оказалась на 10а короче аналогичной связи в тимидяне.Кроме того, присутствие* эпоксидного цикла в молекулах 1&Т привело* увеличению по сравнению с тимидкиом эндоииклических углов СГС2'СЗ' и С2-СЗ'С4' фуранОгилных циклов в среднем на 2,4 и 6,3°, соответственно.

1-2Л2

7

Па рис. 4 представлено стросин? 2',З'-рибоцигидроадб^озиНа (гиЛ). 5'-»трифосфат этого соединении проя.вднит ^аойетвр '^рм^ч^г торного субстрата для рвдр ДИк-прли^орцз. Ь я^efltiv; присутствуют два кристаллографически нез»нисимы«? молекула! гаА - ^рлв^улы А И В. Как и с1цТ, гаА характеризуется уплншен^ым строением фураирз-II«* HUM«» и возможностью вращения основан»!« aqKpyr У-гцимрэнд-НОЙ связи. Следует отметить ЙДИЗаСТР ррелним ГОО^ртр^ЧРРКИМ размерам углеводных остатков в молекула* и (laTj.

Взаимная ориентация фураноэног^ цикла И основания в Молекулах А и П различна, В. молекуле А торсионцыЯ угол РА'-СГ'т N9-C4) раьеи 50,8й и соответствует сич-конформации МУ^леодида Относительно J7!HKQ3Hfti|0fl СВЯЗИ. Сцп-крнфррмацич QOtlp/JHffTMbflil стабилизирована аиутримодвкулврноЯ (¿дородной евязыа Oi'-H, , .N3 длиной 2,775 Я. & иодекула В тор^чн.чнй, у гол что tso*

ответствует анти-конфррмаци'й/ Крнфармадиоинйя' подвижнреть оснй" вания. н молекуле гаА относительно Н-гликрзуднрЙ. облегчена благодаря yiiaotaamtiq фу рана тык циклей, а елрйр||ИТМИ но, и 'уменьшений еторически* зитрудн? нш'ь ii0 3|lfiKiiioi)^i( qpH даН**-нш« основании относительно атомов фуранрзрь)* Циклов^

Конформацин фураноз!'чх цп.клое в мрлв)<уя$»и А и 6 разлч« чаются между собой. В молекуле Д мчке^ма^ы^ая .а'мрлиту^а рсердр-врашенчн ^jJ)A=ii,-if, фазовой угол лс«рдавршй(?мия Это

Соотнетстнует С1'-экзо квнфодмации рц^ар.Ц,' 'НУЯЦ СТ_"цыр^д^н плоскости атомов С2- ,СЗ* ,С4? и 04' ни ' 0 , ?. ■ В (^/¡екуле : ¡1 нмН угол рсе.вдрарашения Рв=250,Й1* (С4'гондр-р^'.<-3)0,0 моцформц-Ц11я), максимальная амплитуда..пс^ад».»р1)цеиия 1р,Атвмь1 С4* fi

04' отклонены от плоскости..атомри .Cj.' ¡£2' ,C.V на V,07$, w li.1)6$ Я соответственно • Вели провести H/TpcsocjM ч.ерээ

все атомы фурцнозныж цщс/дее, pT|ti}PHi»bf}§

от них составят р. 046 8 в молекуле ^ yi ¡3,049 К молр^уде В. '

Конфррмацнц обеик молекул относительно эк.зяцйкличее.кнй связи C.4*-Ci' - row*. торс||рннМЙ угол |г( 05.'- ) в молйну-ле А ранен 42,9°, а в молекуле й - 43,У°. . . ■ "'■•,"

Сравнение параметров, описываши* конфвредаию фура^озных «икло» а соейинени«* 1аТ и м4,\ра#$зыа8ет, 'Iто иклюцеуце £2'. и С 3' йтоыо» t' люксиднцй цикл, нт-идящийся в .^-положении (laj), приводит к стабильной 04'-эндо конформации () при не .значительном уменьшении максимальной амплитуды рсевдовршаения фура-моиюго цикла () но сравнению с обычно наблюдаемой в иук-

fledSMaa* (5S0,-450}, Размещение эпоксидного ничла и >>- нолононии ( гeA) привадит к' звМетНому унлошенмт фурпнозного никла (tf.vO0), бдЙЗИОМу к тому, 4tÖ ЙабЛЮйаеТеи в tl^T (v')«"5°). Полученный ре-i(f/tblfef П()дтйер*д0Н Ь heäaaua опубликованной работе 1 с помоШью ЛЙС Йбгл^дор&йия й иЬНфо^ЦиЦионньц расчетов, il чтчй работе vn/io-iiuHHde фУРВНОЗНОв кЬльцО 0*apurt'i4»pM3Ü»sinr> как промежуточна» уп--лЬшеПиаи форма wirftay а'^эиДо Й З'-эйдо конфориациями. В этой же работ* экспериментально была обнаружена корреляции ычжлу иеличи-ЙЬ$ ГлиМЗМййого торсийннОГо угли И фйзи лсеядопрашеппя для ряда 2'¡3'- йЬнфсфмаЦИйИИо Йграничонных соединений, физический смысл которой, одйакй; «тйвйлся Под сомнение.

Все бьЬчепдречйслонйые эффекты Можно объяснить, если исходит« iii предположении, что йюстичлеккый цикл, включающий пять зйДоиИйлЙйеокЦх атомов фуранбзнЬго Цикла и зпоксилниД кислород, с+рекн^тси принять конформицйй ванны, Для проверки :»того предположения йцмй vjotöaOki молекулярной Меканйки был исслелопан нрооб-ßbi фурайозныИ Цн'кЛов цА и lät - зпокейзамешенный тетрагмярофу-(Зан (ЗТГф), ОкИалос^ что дл» stoJ-o соединения конформакин пан-(М Д&Йе+ьйтеЛьно йаяйНчя наиболее выгодной и имеет коиформаш -Онную эйёргйю на 2(13 I«хил/МОль меньшую, чем конформяиия кресла (рис,}), Ра^считб^ная оптййальна* конфориаиня дли ЭТГФ близка к экспериментально овмвружейной койформаиия ЗТГФ-остоац в струк*-турв Uf {pHfcil; öCHöeahrte « CS'OS'-группа максимально -удалены а структур!» lkt ¿p^t- üT Äjlyra). 31ТФ-0стоа « структуре raA стрс-MttTCii Нрййй+ь Öi'-r^Jö нонфорйашно^ максимально е6ли*и«ллуо осно-»4име и CS'ÖS4 Irpjfhrtyi йо ёзаммноа отталкйваййе препятствует ЭтеЦу. 1Г»кШ* образе»»! ййблйй'аейое уплоше'нйе в гаА ыо*но описать иак KoMrtpoMiKCHoi раановесное состояние Ыз^ду стремлением эпок-ейфуррйвйМ йетоиа прийять СН'-экзо конформайню с одной сюроиы й Найййъии отталкивание*.! СГ й Ci' заместителей - с другой. При вращении оснований »округ глйхозидпой саизй будет Меняться йодейст»)!© йе*ду CS'OS4 >руйп»й й атойаий оейоаайия, это Судет ейещать НйДоАенйе кокиз^ЬУйсейОЮ раЬйоЯесия; а это. в свою оче-peäb; будет ttTiWfcäHfci» b койфЬ^йанйй caJtajia; 0тек)да, вероятно, «ознйкает кЬ'^релйййй Ие4ду аеличймой глййозйайого угла и фа >ой Н5секдо!врййенйя1 фурано^НЬгй ййкла (рй'с 4).

'ki>6le L.il. U äl , - LOrg.Chee. «991, V.S6, No.24,

Молекул« Л

Молекула В

Рисунок 2. Строение молекул 1аТ. Е=74Я0 ккал/мол*» ' Е«= 10,0 S ккал/молм

Рисунок 3. Эпоксн-замвиепный тетрагкдрофурац. Конформации Кресло

и ванна.

Рисунок S. Стереоизображение молекули dT(J'Me),

Рисунок 6. Стереоизображение иолвкулы <ylo~tbeo.

Рисунок 7. Стереоизображение молекулы fl-DOmT.

Рисунок S. Стереоизображение молекулы üüt(3'NHMej[.

Рисунок 9. ttept!onjDöpii*eiiHs ^олекулм UTl VOMeSM«),

Рисунок ID. ttcpeuuîu6|>u*eu>ie молекулы dt(3"O^íeiStiKte ).

Риеуцок И. ВИмолецулирныв слои в кристалле гнА, Стер0О(1роекциЛ иа плоскость (Ьс).

рцсуиоН 13, Танки? гйфрйроИннмч слои в кристалле йТ( Э'ОМеБОМо), Проекции НА плоскости (Ьс) (А) (ас) (В).

Рисунок 13; Псенлослиральные нити в кристалл!1 а у 1 о-1 Ьйо . С1 ереопроокцнм на плоскости (Ьс).

На рис, 5 представлено строение 1-( 3*-С-метил-2'-дезокСИ-рибофуранозил )тимкна 1<1Т(3'Мо)]. Даже в форме 5'-трифосфат» это соединение не является субстратом ни одного ДНК-сиитезирукиивгр комплекса, По данным ЯМР фураиозное кольцо (ЩЗ'Ме) в растворе находится преимущественно в С2'~эндо конформации, Зта же ионфор-мация была обнаружена при рентгеноструктурном исследовании, На основе этих данных, а также на основе их срианения с исследованными ранее структурами модифицированный нуклеозидов, Имеющих а 2'- и 3'-8 положении метидьную группу, можно утверждать, что гш~ римппиниуклеоаиды с объемным заместителем в 3*-положении имеют относительно -жестко зафиксированную жонформаиию фуранозного цикла ,

Установлено, что (ЩЗ'Ме) карактеризуется аити-конформаиней ьокруг М-гликозкдной санзи (%{04' -С 1' -М1-С2 )« -И6,6°), СЗ'-зн- ■ до-П'-зкзо конфорыацией фуранозчого цикла (Р«157,5°, ^„,"38,00} и гош+ конформацией относительно экзрцикяической С4'-С5'-свази (у(СЗ'-С4'-С5'-05' ) «50,1°).

Установлена пространственна» структура недавно синтезированного соединения - 9 /3-0-ксидофуранизилтеофиллина (ху!о-{Ьео) (рис. 6), 'Гоофиляин, одно из основных лекарственных средств, ис-нользуемш при терапии бронхоспистических состояний, является сравнительно токсичным препаратом, поэтому представляет интерес синтез и изучение биологических «еойстп его различных производных. Рано® считалось, что гликозилирование 7-триметидсилил-тео-филлина пзрацилиропаинымм фуранозами приводит к образовании иск** лючигельио N7 изомеров нуклеозидов. В рассмотренном случае гли-козилнронанис произошло по N9 положению, что однозначно подтвер-. ждено настоящим рентгеПоструктурным исследованием.

Величин» гликоэидного торсионного угла х(04'—С 1 '-N9-04) равна -84,4°, что соответствует высокой анти-конформаиии. Взаимная ориентация нуринового основания и углеводного фрагмента, по-видимому, обусловлена стерическими ограничениями, определяющимися ксилй-конформациай З'-гидроксильиой группы.В исследуемом аналоге конформаиия сахара - (СЗ'-эндо-С4'-экзо). В терминах псевдовращения изгиб фуранозного цикла ху!о-1Ьео описывается максимальной амплитудой псевдооращения ^=40,4° и фазовым углом псевдовращения Р«33,5°. Коиформационные углы С00(0$*-С5'-С4*— 04') и 05"-С5'-С4'-СЗ" ), характеризующие вращение вокруг эк-зоциклической связи С4'-С5', имеют значения 176,9° и -68,2°, что

соответствует Г<ш* конформвини, которая в молекул«* иуклеозидов нтречавтс« крайне редка,

Ч+Р «налоги цуилзозИдов, на базе диоксоланоного цицлй « Рим служив в обладдюг близкой к своим фуранозным прооб-вцc^л0Г^^'^Sв^íQí, ритцвноетьк! по отношению к обратным трапс-крИПТДЗ«м. При ЗГОИ дионсоланоиьге аналоги имеют более высокую (•йдролНтичеекуК! стабильность,

ß. процессе ИР«лвдИйНМ Аотени^альИ111* ВИЧ-активных аналогов Hfl ввиоие flHQKçq/tftHa по оригинальной методика было синтезировано $О0ЯИН0НЩ г. {$^й«"»2,-5ТИИИН-^-'1<лм0Г((Л1-5'-гидроксмметил-> I ',3'-((î«t>Qi4T)i Структура которого представлена ни рис.7.

исСдеДраанК« соединения выполнено для подтвержден^ правильности оригинал&ной методики синтеза. Ii структуре ^умерлция MTOiMOo, принятая для фуранозид-н^ЦлеОз^ЙЙв, Это Сделано с н^лыо избежать путаницы в описании ^РНфор«8НИйИ!'Ы<! nf.p4»i<Tpos ^рдифицированкого сахарного остатка.

крнфррм^МИЯ дИ0Ч<5олднов«гя иЦкл« в исследуемом аналоге -ОЗ'^ан^о. Oji'JflBM? угод пй^вдоцр.адеййя Р" 166,3° (все значения «рифов/ми^!)!".!* Л]Врамвтдой'вмчйслчЛись ддя .О^изомара), Макси-. иаДьичр амплитуде - пррв^Оврй"}еция - vira?39t4?, что соотпетстаует П^цццо наблрдаемчЧ (?S°r4Sû ) s пряряднм* нуцлеозцдзх. Торси-инНые Уf/1 Ь(^ йрисывайКИе маниную Ориентацию основания и молифи-PH(-'ob«hhoiq ç^KîiPHPrfl oçx^T^a, следующие; ( 04 '-Cl '-Cl "-N1 )-65 . б", (aa'.Cl'-ClVNI ,2°r, (ei'-TCl"-NbC2>9S,40, (Cl'.-Cl"-Nl-C6)« »-Bö,?1', 8 cçjiiigd^eHHK. Наблшдаетсй тргшс-конформ^ций относительно Э1«зОЦИМИееир*1' Cj'-ÇS' СВЯЗИ (<р.(йЗ'*-С4\С5'~05' )=~17И,41\

Нр рис, 8 1)|эрд«Т{1а/!^н15 строение потенциального ингибитора .ВИИ * 3'-^етилг,ми}10-2', 3 '-дндезокритинидинй ddT( 3*NHMe ). ' Это соединение нидяется.цаибцлее простой модификацией З'-имипо-2*, 3'-дидезокситицид!(Нй )], 5'«-трифос^ат которого яв-

ляется корощо известим ¡4 высокоактивным терминатором синтеза ЯЦ8, катализиру^Чргч различными ДНК-ПОлммеразами. Введение в молекулу hiic.iejuißrq ыегил^ной группу приводит, как показали предварительные 'био^иыи^^с^ие испитой*1, H существенному повышению с^лентив^орти, ^'-трифосфата çJdT(3'NHMe) к обратным транскрипта-зам ретровирусов при общем понижении субстратных свойств по сравнению с 5'-трифосфатом tldT( 3'N^2 )• Данные рентгеноструктурного анализа показывают,что 3'- амино- и 3*-метиламино-производные имеют сходные конформацни молекул. Вероятна, поимыепио селектив-

кости 5'-трифосфата <JdT(3'NMMe) с8ячано( в основном, с присутствием объемного заместителя при С^'-птом^, которой нроетраретрвн-•но затрудняет узнавание обычными HHK^MöjiWMCpujüMti, |io сохраннет эту способность по отношении к ВГфМНЫИ Ч'рикекрнптиши

Молекула d<IT(3'NHMe) характеризyetíи иМТИ-»оиформ»1т«й ВО» круг М- гликоэидной связи {*( 0+'-(Л '-М1-С2)« СЗ'-ЗНЙО-

С4'-экзо конформацией фуранозногб цикла (Р=28,8°, И

гои4 кйнформацией относительна 'Жчоциклнческой С4'~С5'«\С1'И1й {»>( C3'-C4'-C5'-0J' )я45,1°),

П рамках изучений 3'-модифицировании* нуклерншоь, потенциально способных проявлять активность по отноювщч» ьирусу СПИД, проведено исследований З'-О-ыйтил^мйметил-З' -дезоксмтимидищ моногидрата lilT(3'QtÁíSMü)]n íю .мидмфинишо! - 3'-0-м«гил«улЬфо<-симотил-2 '-дозоксит»1М!1Д1ша 1 *IT{ Ä*OM<iSOMe)] (риг «У И 1")-Проверки этих соединении пи (шолигичисную активность п форме $'-трИфос>-фатоп к настоящему иреннчш не проведена. Испытания на клетка*, по предиарительцым ;utuiwM, »окупали, что рассматриваемы!? моднфч-? иированныо нуклеоапды ни фшфорилируются клеточными кцназами. Молекула iU!T{, Í'OMoSaIo ) характеризуется анги-кпифпрмнццай »округ N-гликозидиой cum« (ü-í'-C Г-КЧ-С2 )= -Мб,2°), С2'-эц-до-СЗ'-ткзо цонформаццу|4 фураноэного цикла (Р«11>4,8°, 4,8°) н тош"1 конформаиией относ :>кзшиклическоГ* С4?-С5* связи

( СЗ'-С4*-С5 *-05 ' >52, Iй).

Молекула ildT(3'Ö.M4iSOMö ) имеет аити-кшфррмаишэ вокруг N-гликоаидмой спязи (ж! 0-»'-Cr~Nl-C2)* -148 ,8o), CÍ'-aiUQ-Cl '-эк-т эо конформацню фуранинюго цикла (p«¿'l 48,4я, й го«*

конформаиию относительно 5кзоцикличесхоП f4*-С5'-с вязи (¡р(СЗ'~ C4,-C5'-Q5')»41,4Ч),

Четвертая .глава поевлщеиа обсуждению способов кристаллической упаковки молекул иссл«Д011»»(НЫХ соединений. Анализ крис-тал 1ческих структур изученных аналвгоа показал, нто дйа реализуется тремч различным» способами.

Первый способ упакоьки (р«е> Н) охарак! ери^ов-ать как

толстые бимолекулярные слои. Тан* крмствллизуются соединения d^T, laT, raA, (ß-DOniT), üT( 3!0McSMe ), Молекулы образуют два замкнутых друг на друга подслоя, проиштмх системой водородных связей (иногда доаолано сложной). Вэанмо.ч*Астане между сло&мн осуществляется только за счет Ван-дер-ВаальсОКЫХ контактов. Ii зтих соединениях 3'-группа или отсутствует или не включаете» » образова-

ни* ме^модечуллрны)» водородных свизай,

1>+0рай способ упаиов«11 - "тонкие гофрирокцпиые слои" (рис. 12а). Ои наблюдается в кривталлих Соодиноинй с!Т( 3'), <1Т(3'Мв). Внутри тонкого сдои молекулы связаны разветвленной сети» водородных связей (рис, 126), Взаимодействие между слоями осущаетвдлетсл ю счет Врч-дер-ВааДьсоеых контактов,

Третий рмособ упимчинИ (рис, 13) образуется из бесконечных пеевдоспиралцных нит^й закрученных вокруг 2^ осей, Каждая нить связано еМетемйН водородных связей с четырьмя соседними (параллельными ей) обращу» трехмерную сеть водородных связей. Этот тип упаиовкИ ндблрдплея и гй(!дйне])ия* ху)о-1|1ео и £1с1Т( 3* Г1НМе ).

ВЫВОДЫ

]. Отрабртор«, 4(зукр.и!1лрктр1)аи;1 необходимыми программами и проверена Н^ практике методика решуНйя нткомолекуДярных крис-тп/1личаочНз( структур с использованием ноцого рентгеновского

3. Сдбрины знсрзр!1>,!ецтлльный дайныо и определена молекулярная и (¡ристплличе^ая структура девяти аналоге» нуклеозидов - ^Т, иг, гчЛ.,аТ(3'МвЬ иаТ(З'МИМв), .¿ТО'О-МэЕМе). 0Т(3'<>-Ме{»ЭД1ег), ху1ог|Ьвр и э»1)0тТ,

3, Подтйррчдено упдевепно? строение фуранозного цикла в О^Т с незначительный выходом (Н'-атома в эндо-положенис. Получены

нислймные характеристики этого уплрщйния.

4, 0|;слс[зимег)тал1)ЦО показано, что включение С2'~ и СЗ'-атомов

в эпоксидный щнгл, находящийся э /З-положенйи (1аТ), прииодит к (¡табилЬной 04'-3|{до нОнформс(ции при незначительном уменьшении макримялЫ)р)1 амллцтуды превдонра'!денни фураноэного цикла, по сравнйн|(!л с обы'нт нарлюдармйй о нуклеозидах. Размещение эпоксидного шода а ¡*-полажемии ( гаА). приводит к заметному .уплощению фура^азНого цикли, близкому к наблюдаемому в (1цТ. Предложено объяснение этого Эффекта

5, Г1о резулыатгш соросгдвления пространственного строения I-

( 3'-С-метнл-З'-дезоксирибрфуранозип )тимииа н близких ему аналогов высказано предположение об относительной конформанион-нои жесткости молекул пиримидиннуклеозидов, содержащих в 3'-З-положенпи объемный метильныи заместитель. (1. Экспериме 1папьио подтверждено получение по оригинальным мето-

/■икам N9 производного теофиллина - 9-0-.О~ксилофуричрзИлтао~ филлина и (*)иис-2'-тимин-1-илметил~5'-гиДроксимеТил-1' . 3 диоксолана.

7. Установлено скодстао конфсрйаций молекул З'-амкно*- (р форме хлоргидрита ) и З'-метила^ино производных Ти^идиНа. ПовыУ'ени? селективности dtlT( 3'NHMe } связано, наиболее вероятно, е при* сутствием объемного заместителя при С,1'~цтоме, v«TQpb|ii про4т~ ранствеино затрудняет узнвдание обМчннми ДНК-'ПОЛИмарцзрмй, цр сохраняет эту способность но оТнршеним к обрдтцмм трцн<;чрчП» тазам.

8. Показано, что основные формы крпит.вллине^май упакдвк)! nc<S/jfi*r дппшшыя аналогов иумеозидав, щодифицирлцанны* евхару -? гофрированные слои! биМолчкулярнь»* £лои и рсечдосрир^пьиы» нити.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ т

1, O.V. GuraUya, A|V, Bochkurpv, А.8. Ztlanov, A.V. Рцрсli 1 kht|t, P.J'. Purygin ant) A.A, Kniypvsky. • X-Ray analysis of ¡'¡i'r

I I xoanhydrot hymiil ine a conformatipnuiI у reiitrleted {ithib'tpr of retroviral reverse tfan»c'ript«sis 7 FEUS fetters , 199.0, V.265, No.J, P.63-66,

2. E,M.Kii?.i»iiia, Ya. E.Dezchinskyj Ц. A.Hoyj cov, S.CjHosen^erg, A, V,liochkure v , A.S.Zdanav, - Synt hesys of ' N-7 iinsi - tM theophylline nucleosides - Collect. Cs«eh, Chem, Conmiuo., V. 55, No .1, 1990. P. 41-44, Special insue, VIII SImpo»lUm on the chemistry of nucleic acid components,

3. G.V.Gurskayu , A. V.poch^arev, ^.S.Zdanov, N, В.Oya|kina, А.Д, Krayevsky - X-ray crystal Iographie itudy of 2' , 3 Vdltfetjxy-2*, З'-dldehydrpt hymidi no, confurinut I ona| I у rest r i с led lermi-nution substrate of DNA polymerases - Intern. J. of PiirM.e fttifl Puriraidlne Research 1991, V.2, No.I, f,SS-60.

4, ti.V.Gurskaya, Д.V.Bochkarev, E.N.Tsapk¡ha, A.S.Z(tanpy, A.A,Krayevsky. - Structure and biological цсиуиу correlation for sonie nucleoside analogues - Inhibitors of reproduction of human immunodeficiency virus (H1V-1). - Absiralls of international sympos i ura " Synt he t i с о | i gonuc Upt i d^s: problems and frontiers of practical application. June 23-30, 1991, Moscow, USSR." Nucluic Acids Research. Symposium series. 199!, No. 24, P.241.

IS

5. da)) ПК DUfubayii Alexey Bochk^rev, Alexander Zdartov,Alexander FapehiHhts and A|e*«nd«r Kr&yoviky, » Structural features of J' ,V»t|baanhydrtJ»der>o»lri», a «onfbrmatIon»lly t гiсted termination »ubitrate of l)NA polyrhamo» - Nucleotides and Hue I »011 d» i, V,li, Ko.l, M-9,

6. f ,MW?C!»M« 'A.HtMiwpM. А.С.КдиНо», А,В.Й»пчц*ии, П.П.Пу-

Ц Д. Ai Хриями*, * |»«H1T*>1t>eti>y>«Typ4Qe наследование 3' > ЗИ«ли#«0»НГИ4|>ОТИМИЛИИ& * конформвцнонна-ограничейного ингибитор» аЙрвТйИ* т(?»нйКрИпт»> ретровйруео». - Доклады

АН iCC^i. 11W..T. SUi No.l, «.101-106,

?, Г t9ifypCHBi, A j.SiHHpie. Н.М*1"киич и А.А.Кра-

йний; РййТг^^труцтурное й«вл?доваиич V ,У-дидеюкси-3', З'-ДИДв^ЦДР^йНИДЦй* -г tepHMH^tophqrft субстрата ДНК - п<>-/l.'iMfpfl^ с йГР^Нйценной конфорйациониой подвижностью. -Ма^ену^яривя бм^Логи»,199J.T.li) No,?, стр.483-491.

8. ГА.Й.ЕвчНРвя. А'С^я»моа( А,В,Папчияин, П.И.Пу-рыГНН, А-АДраммий. ~ Р*ИРенсегруктурнр? исследование З^ЗЧйчбРйнгияряйдаиоаин^ •» »онформаццамно'-ограничейного fipMMHifopHtfro субстрата 4нК~п{>/1ИМер«)э, - Д оклад»! АН СССР,

}9Sl, T,3i6t No.fi, СТР^НОИМОЗ.

9, А.В.Бочкар$«.r.l.f^lKM.A• С;Яденр»,Э.М,Каз«мина,И.И.Федоров.

И крмйТЛлЛйй^^ц» «Tfly»Typft Н З'-С-метил-а'-дн^нфур^нмйд" J991, т.17, Но,

ctp, lOSir-JlOpi /