Регуляция уровня оксида азота в крови под действием альбумина и эмульсии перфторуглеводородов

Рафикова, Ольга Валериевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция уровня оксида азота в крови под действием альбумина и эмульсии перфторуглеводородов
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция уровня оксида азота в крови под действием альбумина и эмульсии перфторуглеводородов"

На правахрукописи

Рафикова Ольга Валериевна

РЕГУЛЯЦИЯ УРОВНЯ ОКСИДА АЗОТА В КРОВИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ АЛЬБУМИНА И ЭМУЛЬСИИ ПЕРФТОРУГЛЕВОДОРОДОВ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

специальность 03.00.13 - физиология

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова и на кафедре биохимии Нью-Йоркского университета.

Научный руководитель: Научный консультант:

кандидат биологических наук, профессор Нудлер Е. А. доктор биологических наук, профессор Кошелев В. Б.

Официальные опоненты:

доктор биологических наук, профессор Ванин А. Ф. доктор биологических наук, профессор Реутов В. П.

Ведущая организация: медицинский факультет Российского университета дружбы народов

Защита диссертации состоится 18 апреля 2005 года в 15 30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 18 марта 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор биологических наук

Б.А.Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Оксид азота (N0) играет важнейшую роль в гомеостазе сердечно-сосудистой системы. Он регулирует тонус сосудов и проницаемость сосудистой стенки, угнетает адгезию лейкоцитов к поверхности эндотелия, тормозит пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток, обладает антиатеросклеротическим действием, принимает участие в процессе адаптации клеток к различным стрессорным воздействиям (Малышев et al, 1998). Поскольку известно, что N0 образуется не только в эндотелиальных клетках, но и в эндокарде, и в кардиомиоцитах, а также депонируется в сосудистой стенке (Манухина et al., 2002; Власова, et al., 2003), можно предположить, что он является необходимым условием нормальной работы сердечно-сосудистой системы.

Действительно, на многочисленных животных моделях было подтверждено, что угнетение синтеза N0 приводит к гипертензии, множественным тромбозам, активации взаимодействия лейкоцитов с эндотелиальными клетками, нарушению нормального процесса васкуляризации, ускоряет атерогенез и ремоделирование сердечно-сосудистой системы. У людей все основные факторы, повышающие риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, включая гиперхолестеринемию, гипертензию, сахарный диабет и курение, были ассоциированы с дисфункцией эндотелия, характеризующейся нарушением синтеза N0.

Поэтому, восстановление биологической активности N0 позволит как снизить риск возникновения сердечно-сосудистых патологий, так и улучшить прогноз при их лечении. В последнее время данный подход становится частью общей терапевтической стратегии лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Один из современных способов коррекции заключается в использовании (3-блокаторов нового поколения, модулирующих синтез N0 в эндотелии (Бувальцев, et al., 2002) Однако, различные доноры N0, использующиеся для восстановления уровня N0, обладают рядом побочных действий в первую очередь за счет повышения образования в тканях пероксинитрита, обладающего выраженным цитотоксическим действием.

Именно поэтому не только недостаток N0, но и его избыточный синтез N0 лежит в основе многих патологических процессов и подтвержден большим объемом экспериментальных данных. Так, например, показано, что избыток N0 в миокарде во время хронической ишемии за счет активации индуцибельной NOS (Kelly et al., 1996) угнетает нормальную"работу эндотелиальной N0 синтазы, что приводит к повышению давления и увеличению нагрузки на сердце. Уровень N0 резко повышается и во время острой ишемии. При этом N0 образуется не за счет работы eNOS, как это происходит в нормальных условиях, а из нитрита напрямую, за счет реакции диспропорционирования, или под действием ряда редуктаз (Реутов et al., 1998). При этом концентрация N0 в тканях может увеличиваться более чем в 100 раз (Takahashi et al., 2003). При воспалении также наблюдается бесконтрольное увеличение уровня N0 за счет активации экспрессии iNOS под действием бактериальных липополисахаридов, цитотоксинов и других медиаторов воспаления. Восстановление адекватного снабжения кислородом при гипоксии или

активация макрофагов во время воспаления сопровождается резким всплеском в образовании кислородных радикалов и, следовательно, ONOO, обладающего выраженным цитотоксическим действием.

Современные способы коррекции данных состояний связаны с угнетением синтеза эндотелина (Петрухина et al., 2000; Медведева et al., 2001) или основаны на использовании ингибиторов NOS. Однако, синтезируемый в очаге воспаления NO необходим для борьбы с патогенами и блокада его синтеза нарушает естественный ход событий, снижает эффективность защитных реакций организма. В условиях ишемии, когда высокий уровень образования NO не связан с активностью NO-синтаз, блокада NOS вообще не может оказать выраженного положительного действия.

Несмотря на активное изучение проблемы NO, на сегодняшний день остается открытым большое количество вопросов, касающихся детального понимания механизма участия NO и его метаболитов в различных физиологических процессах. В частности, это относится к проблеме образования нитрозотиолов (RSNO). Биологическая активность нитрозотиолов находит все большее и большее подтверждение. Их принято рассматривать как основной интермедиат, передающий NO сигнал на мишени. Однако, механизм их синтеза продолжает оставаться неясным, поскольку прямая реакция между NO и тиолами не приводит к образованию RSNO, а основной нитрозилирующий агент - N2O3 образуется слишком медленно, чтобы сформировался наблюдаемый в крови пул нитрозотиолов. Показано, что динитрозильные комплексы негемового железа (ДНКЖ) могут принимать участие в образовании RSNO in vivo (Ванин, 1998). В настоящей работе предлагается еще один механизм образования RSNO за счет работы мицеллярного катализа окисления NO.

Существует также противоречие в понимании физиологической роли плазматического NO. Поскольку эндотелий находится в непосредственном соприкосновении с кровотоком, часть синтезированного в эндотелиальных клетках NO попадает в кровяное русло. Раньше считалось, что, взаимодействуя с оксигемоглобином крови, NO окисляется до стабильный производных, таких как нитрит и нитрат и выводится из организма. Однако известно, что NO обладает способностью оказывать физиологическое на удалении от места его синтеза. Это означает, что в крови существуют активные метаболиты и депо NO, защищающие его от оксигемоглобина крови и осуществляющие транспорт NO к клеткам-мишеням. К ним относятся нитрозотиолы, ДНКЖ и нитрит, способный восстанавливаться в NO под действием редуктаз и низкой рН (Реутов et al., 1998; 2003). В настоящей работе обсуждается возможность участия белков' с гидрофобным ядром и синтетических гидрофобных веществ в формировании в плазме крови источника биологически активного NO.

В настоящее время существует большое количество исследований, посвященных роли NO в развитии повреждения клеток миокарда при ишемии/реперфузии (И/Р). Однако, результаты использования NO доноров и NO ингибиторов у различных исследовательских групп различаются вплоть до противоположных. Таким образом, несмотря на больший интерес многих ученых

к данной проблеме, участие N0 в процессе развития клеточной гибели во время И/Р остается неизученным. В тоже время, очевидно, что понимание данного процесса очень важно не только в научном, но и прикладном значении, оно откроет совершенно новые возможности в лечении постишемических повреждений, а использование препаратов, регулирующих уровень N0 в тканях, приобретет вместо хаотичного вполне ясный и обоснованных характер.

Таким образом, актуальность и перспективность исследования отдельных этапов метаболизма N0, его распределения в организме, участия в развитии повреждения клеток при И/Р, а также возможности коррекции избыточного или недостаточного содержания N0 в тканях не вызывает сомнений и представляет интерес как для фундаментальной физиологии, так и для практической медицины. Цель и задачи настоящего исследования. Целью работы являлось выяснение основных закономерностей регуляторного действия гидрофобных веществ на уровень оксида азота крови. В работе решались следующие задачи: t. Изучить способность гидрофобной фазы накапливать N0 и N2O3

2. Исследовать влияние мицеллярного катализа окисления N0 на уровень нитрозотиолов in vitro и in vivo и механизм образования нитрозотиолов при помощи молекулы альбумина

3. Изучить зависимость уровня артериального давления от объема вводимой гидрофобной фазы и от степени «насыщенности» гидрофобных частиц оксидом азота

4. Показать возможность использования тиолов и их комбинации с гидрофобными веществами для снижения среднего артериального давления у крыс

5. Исследовать роль оксида азота в развитии повреждения миокарда при ишемии/реперфузии

6. Изучить возможность уменьшения уровня повреждений миокарда за счет использования синтетических высокогидрофобных соединений

Научная новизна. Впервые экспериментально показано, что гидрофобная часть молекул альбумина и мицелл «Перфторана» обладает способностью накапливать оксид азота и ангидрид азотистой кислоты - N2O3. На основании экспериментальных данных впервые установлена способность насыщенной NO/N2O3 гидрофобной фазы вызывать синтез низкомолекулярных нитрозотиолов. Изучен механизм образования нитрозотиолов под действием BSA. Установлена резонансноподобная зависимость эффективности мицеллярного катализа окисления N0 от концентрации гидрофобной фазы в среде. Впервые высказано и экспериментально подтверждено предположение о «насыщенности» глобулярных белков плазмы NO/N2O3 в нормальных физиологических условиях. В экспериментах на животных изучено регуляторное влияние различных доз гидрофобной фазы на уровень среднего артериального давления. Установлена зависимость уровня артериального давления от баланса между уровнем N0 внутри гидрофобной фазы и во внешней водной среде. Впервые показано, что использование тиолов юга их комбинации с гидрофобными веществами вызывает понижение уровня артериального давления за счет увеличения количества

образующихся в плазме крови нитрозотиолов. Предложены

механизмы регуляции артериального давления за счет использования нетоксичных тиолов, являющихся естественными компонентами плазмы крови и внутриклеточной среды и различных доз биологически инертных эмульсий перфторуглеводородов. Установлена важная роль оксида азота в развитии повреждения миокарда во время И/Р. Высказано предположение о наличии оптимальной концентрации N0 в тканях во время ишемии, при которой уровень повреждения и гибели клеток во время ишемии минимален. Показано, что увеличение или уменьшение уровня N0 относительно этого оптимума вызьшает увеличение зоны повреждения миокарда. Впервые экспериментально показано, что использование высокогидрофобных эмульсий в начальный момент реперфузии приводит к значительному уменьшению области некроза и практически полностью предотвращает повреждение миокарда, вызванного реперфузией. Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе результаты впервые экспериментально доказывают высокую физиологическую активность гидрофобных областей, входящих в состав эндогенных белков и их участие в регуляции уровня оксида азота и его активных метаболитов в крови. Представленные в работе данные демонстрируют также возможность регуляции уровня N0 и низкомолекулярных тиолов путем введения строго определенных количеств синтетических гидрофобных соединений и их комбинаций с эндогенными тиолами. Согласно полученным в работе результатам, препараты на основе перфторуглеводородов могут быть предложены в качестве терапевтических средств для коррекции состояний, связанных как с избыточной продукцией оксида азота (воспаление, ишемия/реперфузия и др.), так и для состояний, характеризующихся пониженной биологической активностью N0 (гипертензия, атеросклероз, старение и др.)

Результаты наших исследований позволяют также предложить дальнейшее изучение возможности использования эндогенных тиолов (цистеина и глутатиона) самостоятельно и в комбинации с гидрофобными веществами в качестве терапевтических агентов, позволяющих вызывать тонко регулируемую пролонгированную гипотензию.

Представленные в работе результаты расширяют теоретические представления о роли оксида азота в формировании клеточного повреждения при ишемии/реперфузии. Показано, что повышение концентрации N0 в зоне ишемии приводит к достоверному возрастанию степени повреждения миокарда. В тоже время снижение его уровня ниже определенных значений приводит к потере антиоксидантной защитной функции N0. Результаты применения «Перфторана» для снижения области некроза миокарда после ишемии/реперфузии позволяют расширить применение этого препарата для лечения реперфузионных повреждений миокарда.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы быта представлены на Российском конкурсе молодых ученых и студентов по разделу «Медицинские науки» (2000, Москва), First international conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications ofNitric Oxide (2000, Сан Франциско, США),

Gordon conference: Biochemistry of Nitric Oxide (2001, Вентура, США), Second International Conference of the Nitric Oxide Society (2002, Прага, Чехия), The third international conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide (2004 Hapa, Япония), XIX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (2004, Екатеринбург), III Российском конгрессе по патофизиологии (2004, Москва).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов экспериментов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Основной материал изложен на 123 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, 6 схем и 3 таблицы. Список литературы включает 212 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение коэффициента распределения NO (QNO). ДЛЯ определения QNO В среде вода/альбумин, холодный калибровочный раствор (H2SO4 + KI) дегазировали продуванием аргона, после чего в раствор добавляли бычий альбумин (BSA). Температуру доводили до 20°С и в реакционную среду помещали электрод ISO-NO Mark II. Выделение NO достигалось за счет введения в раствор 0.4 мл NaNO2. Для определения QN0 в среде вода/«Перфторан», охлажденный «Перфторан» (PFC) дегазировали путем продувания через него аргона в течение 6 часов. Затем в среду добавляли раствор NO, приготовленный путем продувания газообразного NO, проходящего предварительно через 1М раствор КОН для очищения от высших оксидов, через воду до тех пор, пока концентрация NO в воде не достигнет Температуру реакционной среды доводили до 20°С,

после чего в нее опускали ISO-NO МагкП электрод. Эксперименты проводились в безкислородной атмосфере. рассчитывали по формуле

V|,x[NO]h2o> где [NO]h - концентрация NO в гидрофобной фазе, [NO]h2o_ концентрация NO в воде, Д - изменение в [NO]h20 после добавления гидрофобной фазы, полученное экспериментально, V), - объем гидрофобной фазы. Определение тиолов и нитрозотиолов. Общий уровень тиолов в плазме крови определяли при помощи реагента Эллмана (Ellman et al. (1959)). Глутатион (GSH) плазмы определяли методом HPLC на 230 нм, используя колонку С18 и мобильную фазу, состоящую на 99% из 0.1 М монохлорацетата (рН 3) и на 1% из метанола. Для определения общего уровня нитрозотиолов (RSNO) in vitro или в плазме, RSNO разлагались путем добавления 1.5 тМ р а с т в (СрСЗ^ NO, выделяющийся при этом, определяли электрохимически при помощи NO электрода. В качестве стандарта использовали нитрозоглутатион (GS-NO), который получали путем инкубации эквимолярных количеств GSH и в

кислой среде при температуре 0°С. Низкомолекулярные нитрозотиолы (LMW RSNO) плазмы определяли путем инкубации свежей плазмы с в течение 3

минут с одновременной регистрацией количества NO при помощи NO электрода. Для определения катализа образования GS-NO в плазме 20 JJJI 100 шМ раствора GSH в 80 шМ Tris. H Cl (рН 7.9) и 10 ЦЛ СиС12 (100 тМ) были добавлены к 100 цл

плазмы, и количество образовавшегося в этих условиях N0 было определено при помощи N0 электрода. Для приготовления 100 |UJI свежей плазмы, 0.5 мл артериальной крови собирали в гепаринизированные пластиковые пробирки и центрифугировали на 4,500 об/мин в течение 3 минут. Плазма использовалась сразу же после приготовления.

Определение нитрозотирозина в клетках миокарда методом Вестерн-блот анализа. Образцы сердечной мышцы лизировали при помощи гомогенизатора. Затем лизат разводили PBS буфером до концентрации по белку 2мг/мл. 1 мкл лизата из каждого образца наносили на нитроцелюллозную мембрану и оставляли при комнатной температуре. После высыхания, мембрану блокировали 5% раствором молока в PBS буфере. Первичные антитела в соотношении 1мкл на 1мл раствора молока выдерживали с мембраной в течении 1 часа. Затем мембрану промывали 1% раствором Tween 20 в PBS буфере. После промывки мембрану выдерживали со вторичными антителами в течении 40 минут. Мембрану отмывали от вторичных антител 1% раствором Tween 20 в PBS буфере и проявляли с помощью SuperSignal Pico West (Pierce) субстрата для пероксидазы хрена. Сигнал снимали на пленку (Kodak). Проявленную пленку сканировали и измеряли плотность сигнала при помощи программы bnageJ NIH.

Хирургическая подготовка животных. Эксперименты были выполнены на 400 крысах - самцах нормотензивной популяции Wistar весом 300-400 г. Непосредственно перед экспериментом под уретановым наркозом (1.2 г/кг интраперитонеально) животным производили катетеризацию бедренной артерии и вены с использованием полиэтиленовых катетеров (РЕ-50, WPI). Бедренная артерия была катетеризирована для дальнейшего подключения к датчику регистрации АД и забора образцов крови, а бедренная вена - для внутривенного введения лекарственных препаратов. Скорость введения всех препаратов и физиологического раствора была одинакова во всех экспериментах (0.2 мл/мин). Среднее артериальное давление (MAP) и частота сердечных сокращений (HR) измерялись в брюшной аорте с помощью датчика давления, соединенного с усилителем. Сигнал от усилителя передавался на цифровой преобразователь PowerLab 200, соединенный с компьютером.

Моделирование регионарной ишемии/реперфузии миокарда. Моделирование регионарной И/Р производили по методике Sievers et all (1989). После введения наркоза, животных помещали на подогреваемый операционный стол и фиксировали их положение. Для интубации использовали полиэтиленовые трубки (РЕ 240), которые устанавливали в трахее и соединяли с аппаратом искусственного дыхания (Harvard small animals respirator). Искусственную вентиляцию проводили в режиме 70 - 80 дыхательных движений в минуту, объем подаваемого воздуха - 1 мл/ 100 г веса. После удаления участка четвертого ребра и перикардаотомии, полипропиленовая нить (Sharpoint, black monofilament, 7-0) вводилась в миокард ниже выхода левой легочной артерии и выводилась на поверхность в центре условной линии, соединяющей место выхода левой легочной артерии и выдающуюся часть ушка левого предсердия. Таким образом, левая коронарная артерия охватывалась нитью сразу на ее выходе из-под ушка левого предсердия.

Оба конца нити пропускали через ~1.5 см кусочек полиэтиленовой трубочки (РЕ 50), формируя петлю вокруг артерии. Петля затягивалась путем вытягивания свободных концов нити и их фиксирования при помощи зажима. Прекращение тока крови по левой коронарной артерии устанавливали по резкому возникновению цианоза левого желудочка. После этого грудная клетка зашивалась нейлоновой нитью (Look, black monofilament, 4-0), с оставлением над поверхностью участка полиэтиленовой трубочки с зажатой в ней нитью и трубочки, помещенной в медиастинальное пространство для эвакуации воздуха. Для восстановления тока крови по левой коронарной артерии, зажим снимался с нити и это вызывало расслабление петли вокруг сосуда.

Оценка размеров зоны некроза. За 5 минут до окончания эксперимента левую коронарную артерию снова пережимали и через катетер в бедренной вене животным вводили краситель (Evans blue, Sigma, 1 мл 2% раствора), вызывающий окрашивание областей сердца, не подвергавшихся ишемии. Ишемизированная зона в результате пережатия сосуда и прекращения притока крови не окрашивалась. По истечении 5 минут производили эвтаназию путем введения высокой дозы нембутала (200 мг/кг). Сердце вынимали из грудной клетки и отмывали в холодном PBS буфере. После этого правое и левое предсердия отсекали, а желудочки нарезали перпендикулярно продольной оси сердца на кусочки толщиной 2-3 мм, сканировали на сканере Epson Perfection 3170 с разрешением 1200 dpi с двух сторон и помещали во вторую краску (Nitro Blue Tetrazolium, Sigma, 0.5 мг/мл) на 37 °С в течение 20 минут. Данная краска вызывала окрашивание живых, неповрежденных клеток в темно-фиолетовый цвет, в то время как погибшие клетки оставались первоначального, бледно-розового цвета. Таким образом, удавалось выявить зону некроза. По истечении 20 минут миокард переносили в ледяной PBS буфер, снова сканировали с двух сторон и взвешивали. Объем контрастной области в обоих случаях (для определения зоны ишемии после первого красителя и зоны некроза после второго) вычисляли по формуле ((Sil+Si2)/2)*mi где i- порядковый номер куска, S- площадь контрастированной области, m - масса куска. Размер области некроза представляли как процент от области ишемии ОН/ОИ* 100% , где ОН- область некроза, ОИ- область ишемии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ускорение реакции окисления оксида азота альбумином плазмы и «Перфтораном». Гидрофобные свойства NO и кислорода позволяют предположить, что реакция окисления NO внутри гидрофобной фазы будет протекать быстрее, чем в окружающей водной среде. Для определения максимального ускорения (Н) реакции окисления NO необходимо знать коэффициент распределения NO в системе гидрофобная фаза/вода (Q). Для реакции третьего порядка, какой является реакция окисления NO кислородом, H = Q2no х Qo2 - т.е. ускорение окисления NO зависит в первую очередь от QNO Согласно полученным нами результатам, Qno внутри BSA равно 120, что означает, что альбумин вызывает ускорение реакции окисления NO по крайней мере в 1202

или 1.4 х 104 раз. Близкое к этому значение для QNO было получено и в тех экспериментах, где вместо альбумина использовали сухую плазму крови. Это позволяет предположить, что гидрофобная фаза, образованная внутренним ядром альбумина вносит основной вклад в формирование суммарной гидрофобной фазы белков плазмы крови, которая в свою очередь является абсорбентом свободного N0 в крови.

А В

t,UHH t,MHM

Рис. 1. Кинетика образования нитрита в растворе как доказательство мицеллярного катализа окисления N0 под действием альбумина плазмы. А - образование нитрита в отсутствие BSA (точки) или присутствии BSA (квадраты) или "'BSA (треугольники). В - эффект протеолиза альбумина на образование нитрита. Разницу (квадраты) между уровнем нитрита в присутствии (треугольники) и отсутствии (точки) протеиназы К использовали для расчета времени полужизни (ti^NiCh внутри BSA.

Для дополнительного подтверждения процесса сорбции N0 альбумином плазмы и определения времени полужизни NjOj (tj/j) внутри гидрофобной фазы использовали энзиматический протеолиз, с помощью которого возможно быстрое разрушение гидрофобной части белка и высвобождения N2O3 в окружающую водную фазу. Для этого свежеприготовленный раствор N0 в воде, из которой предварительно аргоном выдували кислород, в бескислородных условиях добавляли к раствору BSA и следили за скоростью образования нитрита. Добавление раствора BSA снижало скорость образования нитрита по сравнению с контролем, где вместо BSA использовали бескислородную воду. Этот результат предполагает, что задерживается внутри гидрофобной фазы белка.

Добавление протеиназы К вскоре после обработки раствора BSA оксидом азота привело к протеолизу в первую же минуту более 99% BSA, что означает разрушение если не всей, то большей части гидрофобной фазы белка. Это вызывало быстрое накопление нитрита в растворе до уровня плато, поскольку та часть которая была задержана гидрофобной фазой белка, после разрушения

гидрофобной зоны вышла в водную среду. Основываясь на этих результатах было определено, что для внутри BSA составляет минут (рис 1.)

Коэффициент распределения (Q) для системы PFC/вода был определен нами как равный 200. Поскольку Q для кислорода равно 12, для тримолекулярной реакции образования Данный расчет

предполагает, что если в крови будут циркулировать даже небольшие количества

PFC, они смогут изолировать из кровотока значительное количество N0. В то же время накопление N0 и кислорода в малом объеме мицеллы приведет к увеличению скорости образования N2O3 в сотни тысяч раз.

Катализ образования низкомолекулярных нитрозотиолов под действием альбумина in vitro. Мы предположили, что гидрофобная фаза альбумина может также быть катализатором нитрозилирования низкомолекулярных тиолов (LMW RSH), находящихся в ближайшем окружении альбумина. Для подтверждения данной гипотезы мы сравнили скорость образования LMW RSNO в присутствии и отсутствии альбумина. Для экспериментов были выбраны два биоактивных LMW RSH - глутатион (GSH) и L-цистеин (Cys). Все эксперименты начинались с образования BSA™3, т.е. BSA, насыщенного N0, который получали путем обработки BS А 100 цМ раствором N0 в безкислородных условиях. Когда концентрация N0 в растворе BSA снижалась ДО ~ 1 цМ, добавляли GSH или Cys. Во всех вслучаях присутствие BSA вызывало значительное ускорение образования LMW RSNO (рис.2).

««шпшшлсиош о 9 га <» »

t сек GSK гаМ

Рис.2. Образование LMW RSNO под действием BSAN203. Оригинальная запись, сделанная при помощи N0 электрода в присутствии Си2+ (слева), образование GS-NO под действием BSAN203 как функция от концентрации GSH (справа).

Способность насыщенного BSAN203 генерировать нитрозоглутатион (GS-NO) снижается с течением времени (рис. ЗВ). При этом скорость этого снижения -ОакгевиоcthI/z) 10 мин - была близка к скорости полувыхода N7O3 из гидрофобной фазы белка. Эффективность катализируемого альбумином S-нитрозилирования зависит также от концентрации самого альбумина в пробе. Максимальный эффект наблюдается при 25 jxM BSA (рис. ЗА). Этот факт легко объясняется при помощи теории мицеллярного катализа окисления N0, согласно которой относительно малый «оптимальный» объем гидрофобной фазы (в данном Случае - альбумина) вызывает максимально ускорение реакции.

После обработки протеазой К, вызывающей быстрое расщепление альбумина на короткие пептиды, BSA оказывается неспособным катализировать образование нитрозоглутатиона (рис 4). Это, по видимости, происходит в

результате невозможности расщепленного BSA накапливать NO/ N2O3. С другой стороны, если протеаза была добавлена к уже насыщенному BSAN203 наблюдается резкое образование GS-NO, свидетельствующее о том, что в результате протеолиза выход значительного количества N2O3 привел к нитрозилированию добавленного глутатиона. Эти результаты напрямую показывают, что мицеллярный катализ окисления N0 является тем самым механизмом, за счет которого и происходит нитрозилирование LMW RSNO в присутствии альбумина.

Рис.3. Образование GS-NO в присутствии BSAN2O3 . А - как функция от концентрации BSA. В - как функция от времени (GSH добавляли в раствор после указанных промежутков времени).

Рис. 4. Эффект протеолиза на образование GS-NO, катализируемое BSAN2O . Протеиназу К добавляли перед добавлением раствора N0 к BSA (А) или после того, как концентрация N0 в растворе BSA достигала ~ 1 jlM (В).

Рис. 5. Роль гидрофобного участка BSA (CWBSA) и аминокислотных остатков Cys-34 (CBSA) и Тгр-214 (WBSA) в синтезе LMW RSNO.

NO+, образующийся из N2O3 внутри гидрофобной фазы альбумина может быть перенесен на LMW RSNO по крайней мере тремя возможными способами (рис.5). Прямое взаимодействие тиола с NO+ возможно в случае, если тиол проникает своим гидрофобным «хвостом» внутрь гидрофобной части альбумина (путь I). Альтернативой ему является взаимодействие тиола и NO+ за пределами гидрофобной фазы белка за счет внутримолекулярного транспорта NO+ на цистеиновый (Cys-34) или триптофановый (Тгр-214) аминокислотные остатки и дальнейшей реакции транснитрозилирования (пути II и III). Для определения того, какой из этих путей является преобладающим при образовании LMW RSNO, мы синтезировали химически модифицированный BSA, у которого либо Cys-34 ( BSA), либо Trp-214 ( BSA), либо оба аминокислотных остатка (^BSA) были ковалентно заблокированы и потому не могли участвовать в процессе S- или N-нитрозилирования. Затем мы сравнили способность обычного и модифицированных альбуминов нитрозилировать глутатион. Очевидно, что ковалентная модификация Cys-34, Trp-214 или обоих аминокислот должна исключить нитрозилирование тиолов по пути II и (или) III. Эксперименты с cwBSAN2H показали его способность вызывать образование GS-NO с эффективностью 35% от нативного bsaN203 , что позволяет предположить, что путь I играет значительную роль в нитрозилировании LMW RSH (рис. 5). cbsan203 и

WBSAN203 демонстрируют соответственно 60% и 70% активности от нативного BSAN203 (рис. 12). Это позволяет предположить что вклад путей II и III в образование нитрозотиолов интактным BSAN203 соответственно около 40% и 30%. Необходимо отметить, что при низких, близких к физиологическим, концентрациях GSH, эффективность CWBSAN203 была практически идентична эффективности нативного BSAN203. Этот факт позволяет предположить, что in vivo путь I, возможно, преобладает.

Катализ образования LMW RSNO под действием PFC in vitro. Чтобы определить стимулирующий эффект PFC на образование RSNO, мы использовали

1% (об/об) PFC, который в присутствии кислорода был насыщен N0 (конечная концентрация 0.5 цМ). В этих условиях PFC повысил скорость образования GSNO в 10 раз (рис. 6А). Сходные результаты были получены и для L-цистеина. Процесс S-нитрозилирования под действием PFC зависит от концентрации PFC в пробе (рис 6В). При этом

резонансноподобный максимум

наблюдался при введении в реакционную среду 1% (об/об) «Перфторана». Большее или меньшее количество PFC прогрессивно уменьшало эффект. Данный результат идентичен тому, что наблюдался при изучении мицеллярного катализа окисления N0 под действием BSA и объясняется тем, что относительно небольшие «оптимальные» количества гидрофобной фазы вызывают максимальное увеличение скорости реакции. Таким образом, можно сделать вывод, что использование различных объемов PFC позволит регулировать уровень эндогенных LMW RSNO плазмы

Рис.6. Катализ образования GSNO под действием PFC. A - оригинальная запись, сделанная при помощи N0 электрода в присутствии 1% PFC при добавлении Си2+ и GSH к раствору N0; В - образование GSNO под действием PFC как функция от концентрации PFC.

Альбумин как депо NO in vivo. Чтобы определить способность гидрофобных участков молекулы альбумина сорбировать NO in vivo и определить физиологическую роль данного процесса, мы изучали способность нативного или насыщенного NO (B S AN20 3) экзогенного альбумина влиять на уровень артериального давления у крыс. Для исключения потенциальных

гемодинамических эффектов S- и N- нитрозопроизводных BSA, мы использовали ковалеитио модифицированный альбумин - CWBSA. Внутривенное введение ^BSA (0.12 мг/кг в 1мл) приводило к достоверному подъему среднего артериального давления (САД) по сравнению с контролем, который получал аналогичный объем физиологического раствора (рис. 7 А). В то же время введение аналогичного количества CWBSAN203 вызывало лишь незначительные изменения САД (рис. 7В).

Рис. 7. Эффект нативного и насыщенного BSA на САД у крыс. А - оригинальная запись изменения давления с течением времени на введение BSA (светло-серые колонки), CWBSA (темные колонки) и солевого раствора. В - оригинальная запись и изменения давления на введение насыщенного BSA без и после предварительной блокады NOS при помощи L-NAME. С - схематическое изображение гемодинамических эффекторов альбумина. Экзогенный альбумин (пустые кружки) быстро абсорбирует свободный N0, вызывая вазоконстрикцию. Насыщенный BSA (закрашенные кружки) генерирует путем мицеллярного катализа NO+, который обладает свойствами вазодилататора. Экзогенный насыщенный BSA не меняет NO/NO+ баланса и не вызывает гемодинамических эффектов. Ингибирование NOS истощает депо N0 внутри гидрофобной фазы и вызывает сокращение сосудов. В этом случае насыщенный экзогенный BSA за счет испускания N0+ работает как вазодилататор.

Однако, тот же самый С™В8АШ03, вводимый на фоне интраперитонеальной инъекции ингибитора N0 синтазы - М-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (Ь-

NAME), приводил к обратному эффекту, вызывая значительное понижение САД. Эксперименты с нативным BSA давали аналогичные результаты.

Данные наблюдения очень хорошо согласуются с нашей моделью, приведенной на рис. 7С. Мы предполагаем, что гидрофобная фаза альбумина плазмы работает как резервуар N0 и N2O3. Экзогенный альбумин, введенный в кровяное русло, не насыщен N0 и, потому, начинает быстро абсорбировать его внутрь своей гидрофобной области. Это приводит к понижению концентрации N0 в плазме и вызывает повышение артериального давления. Вследствие постоянно синтезирующегося при помощи работающей NO-синтазы нового N0, равновесие между пулом свободного N0 и N0, растворенного внутри белков плазмы восстанавливается и давление возвращается к исходному уровню. Экзогенный

CWnOAN203 Ti О А N203

BSA или BSA не изменяет уровня артериального давления именно потому, что он уже насыщен N0 и не сорбирует плазменный N0, т.е. не вызывает нарушения данного равновесия. Если же вводить насыщенный альбумин на фоне дефицита N0, вызванного блокировкой NO-синтазы, то N 0 + в виде нитрозотиолов, начнет выходить из гидрофобного кора белка и потенциировать снижение САД.

Альбумин плазмы как катализатор процесса образования RSNO in vivo. Высокое значение коэффициента распределения (Q) в среде гидрофобная фаза/вода для N0, а также полученные нами in vitro и in vivo результаты позволяют предположить, что в обычных условиях, вследствие процесса сорбции N0 гидрофобными участками, белки плазмы должны накапливать N0. А, поскольку концентрация свободного кислорода, растворенного в крови высокая, мицеллярный катализ окисления N0 должен приводить к тому, что значительная часть белков, циркулирующих в кровотоке, будет насыщена N2O3. Мы предполагаем, что насыщенный в естественных условиях альбумин будет работать как катализатор образования LMW RSNO. Чтобы напрямую убедиться в этом, мы изучали способность плазмы крови вызывать образование GS-NO. Для этого был поставлен эксперимент, идентичный тому, что представлен на рис. 2, с той разницей, что вместо насыщенного BSA использовали свежеприготовленную плазму крыс (рис. 8А). Несмотря на то, что к плазме не было добавлено никакого дополнительного N0, добавление к ней глутатиона вызывало образование значительного количества нитрозоглутатиона. Количество вновь образованного GS-NO превышало уровень уже существовавших в плазме нитрозотиолов более, чем в 2 раза. Это говорит о том, что значительная часть вновь образованных нитрозотиолов не может быть объяснена процессом транснитрозилирования. Более того, если плазму оставить стоять в течении 60 минут прежде чем добавлять глутатион, количество GS-NO, который будет образовываться в этом случае уменьшится в 2 раза. Аналогичная зависимость способности синтезировать нитрозотиолы от времени наблюдалась in vitro в экспериментах с BSAN203 (рис. ЗВ). Данные результаты подтверждают гипотезу насыщенности плазматических белков NO/N2O3 и их способность выступать в роле катализатора образования LMW RSNO in vivo.

Мы также изучили эффект GSH на образование LMW RSNO и уровень артериального давления у крыс. In vitro образование LMW RSNO в присутствии насыщенного альбумина или плазмы зависит от исходной концентрации тиолов (рис. 2). Для изучения того, существует ли подобная зависимость и in vivo, мы измеряли уровень циркулирующих в плазме крови LMW RSNO и САД в ответ на введение крысам трех различных доз глутатиона. Как видно из рис. 8С, введение 0.4 г/кг GSH приводило к более, чем 4-кратному повышению уровня LMW RSNO в плазме. Этот эффект совпадал с одновременным снижением артериального давления, которое оставалось на пониженном уровне приблизительно в течение часа. Эффект глутатиона на уровень давления и нитрозотиолов зависел от дозы и хорошо коррелировал с дозозависимой кривой образования GS-NO in vitro. Данные результаты предполагают, что механизм мицеллярного катализа образования S-нитрозотиолов действительно существует и играет важную роль в регуляции сосудистого тонуса в организме млекопитающих.

Рис 8. Катализ образования RSNO ш vivo и их эффект на СДЦ. А - катализ образования GSNO свежей плазмой и после ее стояния при 25 °С в течение 1 часа. В - схематическое обоснование вазодилаторного эффекта экзогенного GSH. С - введение GSH приводит к дозозависимому снижению САД (справа), что

коррелирует с повышающимся уровнем образования LMW RSNO (слева). Вставка - изменения концентрации GSH в плазме как функция от времени.

PFC как способ изоляции NO плазмы in vivo. Для оценки способности PFC абсорбироать NO in vivo, изучали эффект введения плазмозаменителя «Перфторана» на уровень среднего артериального давления у крыс. Внутривенное введение 1г/кг PFC (~7% от объема циркулирующей крови (ОЦК)) характеризовалось достоверной гипертензией в течение первых 40 минут, сменявшейся потом слабо выраженной гипотензией (рис. 9А). Согласно этим данным, мы предположили, что повышение САД на введение биоинертного «Перфторана» обусловлено его способностью сорбировать N0 внутрь мицелл. Для доказательства этого механизма был проведен эксперимент, в котором животным сначала вводили неселективный ингибитор N0 синтазы - L-NAME, а затем, на фоне стойкого повышения давления, вызванного ингибированием синтеза N0 -PFC (7%). Поскольку в этом случае PFC оказывался неспособным вызывать дополнительное повышение САД (рис.9В), мы сделали вывод о том, что N0 необходим для реализации гипертензивного действия PFC.

Дополнительным обоснованием зависимости действия PFC от уровня N0 в плазме крови стал эксперимент, в котором после ингибирования синтеза N0 при помощи L-NAME, вводили донор N0 - нитрит натрия (NaNCb). Это привело к снижению САД. Последовавшее за этим введение PFC вызвало гипертензивную реакцию, вернув уровень САД к уровню, наблюдавшемуся после введения L-NAME (рис. 9С). Таким образом, способность PFC нейтрализовывать эффект, вызванный действием N0 донора, свидетельствует о накоплении N0 плазмы внутри мицелл и, следовательно, его изоляции от потенциальных физиологических мишеней. Более того, данные результаты позволяют рассматривать N0, растворенный в плазме не как потерянный для организма, а как способный влиять на общий сосудистый тонус, т.е. оказывать свое физиологическое действие.

Катализ образования LMW RSNO под действием PFC in vivo и регуляция уровня артериального давления. Как следует из рис. 6, PFC не только снижают концентрацию N0 в плазме за счет процесса сорбции, но и вызывают увеличение образования LMW RSNO. Образованием вазоактивных RSNO может объяснить небольшое, но воспроизводимое во всех случаях понижение давления через 60 минут после введения PFC, представленное на рис. 9А. Введение нитрита (рис. 9С) на фоне ингибитора NOS также приводит к отсроченному (через 30 мин.) снижению давления ниже исходного уровня у животных, получавших инъекцию PFC по сравнению с контрольными, которым вводили аналогичный объем солевого раствора и у которых давление продолжает оставаться на 25 мм рт.ст. выше исходного даже на фоне N0 донора. Мы считаем, что данные результаты следует объяснять тем, что во время первой фазы действия PFC происходит быстрая сорбция N0 плазмы, вызывающая снижение уровня N0 в крови и первоначальное повышение САД; однако, поскольку локальная концентрация N0 и 02 внутри мицелл PFC становится высока, скорость образования N2O3 значительно возрастает и это приводит к накоплению вазоактивных RSNO.

Рис. 9. Взаимосвязь между уровнем N0 и гемодинамическими эффектами PFC. А - Эффект высокой дозы PFC на САД. Стрелки обозначают моменты введения PFC или КГ; В - инактивация NOS убирает гемодинамическое действие PFC, С - введение источника N0 на фоне ингибирования его синтеза восстанавливает гемодинамические эффекты PFC. Нижняя панель - схематическая интерпретация экспериментальных результатов. Показана артерия с эндотелиальными клетками, продуцирующими N0 во всех направлениях. А - мицеллы PFC (серые кружки) быстро абсорбируют N0 плазмы, что вызывает вазоконстрикцию; В - при инактивации NOS концентрация' N0 в плазме снижается и это предотвращает вазоконстрикцию под действием PFC; С - восстановительные компоненты крови вызывают образование N0 из N02-, это приводит в частичному расслаблению сосудов. Однако, при введении PFC, экзогенно введенный N0 начинает накапливаться в мицеллах, что является причиной повторной гипертензии.

Для подтверждения этой гипотезы, мы провели серию экспериментов, в которых использовалось в 10 меньшая доза PFC, чем в предыдущих исследованиях. Такой выбор рабочей концентрации PFC не был случаен и обосновывался данными, представленными на рис 6В. Именно такая концентрация PFC - 1% от ОЦК -является оптимальной, т.е. при ней наблюдается максимальное «напряжение» мицеллярного катализа и, следовательно, ускорение реакции окисления N0 и образования RSNO in vitro. Действительно, инфузия крысам «низкой» дозы PFC не вызвала какого-либо заметного повышения САД по сравнению с контролем (рис. 10А). Вместо этого результатом введения такой дозы PFC было быстрое и достоверное снижение САД в течение 40 минут. При этом уровень LMW RSNO плазмы повышался в 10 раз в течение первых 10 минут после введения PFC (рис. 10В). В дальнейшем происходило постепенное понижение количества нитрозотиолов до исходного уровня. Такое резкое возрастание уровня RSNO, вызванное введением PFC и объясняет снижение САД, приведенное на рис. 10А. Важно заметить, что из-за высокой нестабильности LMW RSNO, какая-то их часть могла распасться во время приготовления образца. Таким образом, определяемый нами прирост уровня RSNO может являться лишь частью от их действительного увеличения.

s' 4

X О

i ?

-12 ■16

« PFC ft % v/V)

солевой |н»

оЦ\ гсЦ ao loo iio 140

t, мин

50-

40-

30'

о al-

io-

-10-

t ¡■■PFC (1% v/v) солевой р-р

0 3 У 15 20 23 t, мин

i 'no

J NO

с :>к< I

пап

РЖ)

ЙЭ1

- ^

Рис.10. Эффект «низкой» дозы PFC на САД и образование RSNO. А -снижение САД в ответ на введение PFC (1 %). Стрелки обозначают моменты введения PFC или КГ, В -PFC стимулирует образования LMW RSNO, С - схематическое объяснение вазодилаторного

эффекта PFC. Введение в кровь PFC в объеме 1% от ОЦК (серые кружки) приводит к абсорбции N0 и Ог плазмы и образование N^ по механизму мицеллярного катализа. NzO3 затем нитрозилирует тиолы плазмы, в результате чего в крови увеличивается пул вазоактивных нитрозотиолов, вызывающих

расширение сосудов

Поскольку в экспериментах in vitro наблюдалась зависимость уровня образования RSNO от количества тиолов, вводимых в реакционную среду, мы предположили, что образование RSNO в плазме крови может быть лимитировано относительно низким уровнем восстановленных низмолекулярных нитрозотиолов в плазме. Чтобы скомпенсировать потенциальный дефицит LMW RSH плазмы, мы вводили крысам дополнительные количества экзогенных LMW RSH на фоне введения PFC и изучали эффекты образования LMW RSNO и уровень артериального давления. Как показано на рис. ПА, введение 2 мг/кг GSH на фоне PFC приводит к достоверному повышению количества LMW RSNO одновременно вызывает выраженное снижение САД. Еще более выраженное увеличение уровня LMW RSNO и снижение САД наблюдается при введении L-цистеина (0.8 мг/кг внутривенно) на фоне PFC (рис. 11В). В то же время без PFC ни глутатион, ни цистеин в указанных дозах не вызывают эффекта увеличения нитрозотиолов плазмы или снижение САД. Таким образом, установленная нами взаимосвязь между концетрацией тиолов в плазме и выраженностью гипотензии является дополнительным подтверждением наших предположений о том, что расширение сосудов в присутствии PFC происходит за счет увеличения эндогенного образования RSNO.

Время полужизни «Перфторана» в крови животных и человека превышает 24 часа, поэтому восстановление САД после однократного введения RSH более вероятно происходит за счет быстрого захвата RSH/RSNO тканями организма, чем за счет инактивации PFC. Результаты, представленные на рис. ПС подтверждают данное предположение. На повторное введение цистеина через 2 часа после первого введения, животные реагируют повторной волной

вазодилатации, идентичной по выраженности первоначальному

ответу. Данный результат наглядно демонстрирует, что путем однократного введения PFC и дальнейших инъекций небольших доз тиолов через определенные промежутки времени можно поддерживать артериальное давление на заданном, пониженном уровне в течение относительно длительного времени.

У«0

fish но

Рис.11. Совместный эффект экзогенных RSH и PFC на уровень САД и плазменных RSNO. А -расширение сосудов и повышение синтеза RSNO в ответ на совместное введение PFC и GSH. Стрелки обозначают моменты введения PFC или КГ; В - расширение сосудов и повышение синтеза RSNO в ответ на совместное введение PFC и Cys. С - повторная гитотензия в ответ на повторное введение Cys на фоне PFC. Стрелки обозначают моменты введения Cys. D - схематическое объяснение вазодилаторного эффекта при совместном введении PFC и тиолов. Повышение содержания LMW RSH в плазме крови приводит к более высокой продукции вазоактивных RS-NO в результате действия механизма мицеллярного катализа окисления N0.

Роль N0 и PFC в развитии повреждений миокарда при ише.мии/реперфузии. Пережатие левой коронарной артерии вызывает формирование обширной зоны ишемии, затрагивающей практически всю стенку левого желудочка. Введение «высокой» дозы PFC в начальный момент реперфузии (рис. 12) приводит к снижению области некроза на 75% по сравнению с контролем. Использование вместо PFC ингибитора NO-синтазы - L-NAME также оказывает положительное действие и снижает область некроза'. Однако, эффективность протекторного действия L-NAME значительно ниже, чем у PFC.Данное наблюдение хорошо согласуется с современным представлением о несинтазном способе образования N0 во время ишемии. Поэтому, ингибитор NOS способен предотвращать образование N0 только в самый начальный момент ишемии, когда кислород еще не полностью израсходован и его недостаток не привел к ингибированию NOS, и во время реперфузии, когда приток кислорода к тканям восстанавливается.

В отличие от этого PFC способен изолировать N0 любого

происхождения, в том числе и тот, который образуется во время ишемии из нитрита. А поскольку, уровень повреждения после введения PFC гораздо ниже, чем при использовании L-NAME, можно сделать вывод о важной роли нитрит-продуцированного N0 в процессе повреждения клеток. Данное предположение

подтверждается нашими

результатами, согласно которым дополнительное введение нитрита нитрия за 40 секунд до начала ишемии приводит к

дополнительному увеличению

области некроза по сравнению с контрольными животными. Таким образом, можно сделать вывод о том, что клеточная гибель в зоне И/Р зависит от уровня NO в тканях во время стадии ишемии. Однако, совместное использование ингибитора NO-синтазы L-NAME и PFC, которое должно привести к дополнительному понижению

концентрации NO в тканях и, следовательно способствовать

дополнительному протекторному действию, вызывает увеличение степени повреждения и по сравнению с PFC, и по сравнению с одним только L-NAME. Этот факт позволяет предположить наличие оптимальной концентрации NO в тканях, при которой уровень повреждения во время И/Р минимален. Увеличение или уменьшение уровня NO относительно этого оптимального значения вызывает возрастание степени повреждения кардиомиоцитов. Способность PFC, вводимого на фоне действия ингибитора NO-синтазы вызывать увеличение области некроза может объясняться тем, что чрезмерное понижение уровня NO в тканях вызывает нарушение работы антиоксидантной защиты, обусловленной действием NO. Действительно, известно, что активные формы кислорода обладают резко выраженным цитотоксическим действием. Запуская процесс перекисного окисления липидов и оказывая прямое повреждающее действие на молекулы ДНК, кислородные радикалы активируют тем самым процесс клеточной гибели. NO, как показано в ряде исследований,

Рис.12. Сравнительный эффект нитрита натрия, L-NAME. PFC (7%об/об) и комбинации L-NAME/PFC на размер инфаркта миокарда у крыс. Верхняя панель - размер инфаркта предтавлен как процент от области ишемии, нижняя панель - размер зоны ишемии (AR) и некроза (NA) у контрольного (слева) и опытного (справа) животных.

100-

80-

Q" О

60-

40-

20-

И-Р *

s X

И-Р

л §

о.

Ё &

И-Р

обладает способностью предотвращать эти повреждающие воздействия путем нейтрализации кислородных радикалов с образованием менее реакционно способного пероксинитрита, быстро разрушающегося под действием СО2. Таким образом, снижение уровня N0 в тканях ниже определенной оптимальной концентрации приводит к тому, что ткани остаются незащищенными от

повреждающего действия

перекисных радикалов. Очень важно отметить, что размер некроза у животных

подвергшихся повреждающему действию И/Р и леченных инъекцией PFC достоверно не отличается от размера некроза у животных перенесших только 30 мин ишемии. Эти данные означают, что использование PFC позволяет практически полностью нивелировать повреждающее действие стадии реперфузии. Возможно, благодаря тому, что накопление N0 внутри мицелл PFC является физическим процессом, зависящем от концентрации N0 в окружающей водной среде, PFC может обеспечивать и поддерживать то самое оптимальное содержание N0 в крови и тканях, при котором повреждение кардиомиоцитов во время реперфузии минимально. Иными словами, введение PFC во время И/Р с одной стороны приводит к удалению токсичного избытка N0 в тканях, с другой -обеспечивает сохранение

антиоксидантного действия N0 за счет выхода N0 (или RSNO) назад в кровоток в случае снижения его уровня ниже оптимального.

Для того, чтобы подтвердить наши предположения об изменении уровня N0 в кардиомиоцитах во всех группах животных, представленных на рис. 12, мы измерили общее количество нитротирозина в зоне ишемии. Нитротирозини -хорошо известный маркер содержания пероксинитритав тканях и, потому, может быть использован для оценки уровня N0. Согласно полученным нами результатам, (рис. 13) животные, получавшие дополнительные количества нитрита перед начало

а> Е <о Z

И-Р

а.

Li.

из

£ «

Рис. 13 Содержание 3-нитротирозина в зоне ишемии у контрольных крыс и у животных, которым вводили нитрит натрия, L-NAME, PFC (7%об/об) и комбинацию L-NAME/PFC. Верхняя панель -оптическая плотность образца у животных, получавших нитрит натрия принята за 100 %. Все остальные результаты представленны как процент от нитритной группы Нижняя панель - оригинальные результаты дот-блот анализа.

ишемии имеют наиболее высокий уровень нитротирозина в тканях. У контрольных животных содержание нитротирозина меньше, однако выше, чем у животных получавших L-NAME. У животных, которым вводили PFC наблюдается более, чем 8-кратное снижение уровня нитротирозина по сравнению с контролем. Минимальное количество нитротирозина найдено у тех животных, которым совместно вводили PFC и L-NAME. Это подтверждает идею о том, что совместное действие PFC и L-NAME вызывает максимальную убыль N0 в тканях. Таким образом, данные с измерением нитротирозина очень хорошо коррелируют с нашими предположениями о том, что протекторное действие PFC связано с его способностью уменьшать содержание N0 в тканях, а также о важной роли оптимального количества N0 для защиты кардиомиоцитов от повреждающего действия стадии реперфузии.

ВЫВОДЫ.

1. Гидрофобная фаза в составе молекул BSA и мицелл «Перфторана» обладает способностью сорбировать N0 из окружающей водной среды. Концетрирование N0 и кислорода в малом объеме гидрофобной фазы значительно ускоряет реакцию окисления N0 в N2O3.

2. Насыщенная N2O3 гидрофобная фаза, обладает способностью вызывать образование экзогенных низкомолекулярных нитрозотиолов in vitro и in vivo.

3. Гидрофобные участки белков плазмы насыщены N0 и принимают участие в формировании эндогенного пула нитрозотиолов.

4. Введение в кровь BSA, ненасыщенного NO/N2O3 вызывает повышение среднего артериального давления. Насыщенный NO/N2O3 BSA не вызывает достоверного изменения в уровне САД в обычных условиях, но приводит к понижению артериального давления в условиях ингибирования эндогенного синтеза N0.

4. «Перфторан» в дозе 1% от ОЦК вызывает увеличение уровня низкомолекулярных тиолов плазмы и понижение САД. Доза «Перфторана» 7% от ОЦК не обеспечивает адекватной работы мицеллярного катализа окисления N0 и не вызывает образования нитрозотиолов. Поэтому, введение 7% от ОЦК приводит к повышению САД.

5. Использование тиолов или их комбинации с гидрофобными веществами вызывает достоверное дозозависимое снижение САД. Повторное введение цистеина на фоне действия «Перфторана» дополнительно пролонгирует данный эффект. Это делает комбинацию «Перфторана» и низкомолекулярных тиолов перспективной в качестве гипотензивного средства с возможностью строгого дозирования выраженности и длительности действия.

6. Показано существование оптимального уровня N0 в миокарде во время ишемии/реперфузии, при котором повреждение клеток минимально. Отклонения от оптимального значения в сторону увеличения или уменьшения концентрации N0 ведет к увеличению размеров некроза в зоне ишемии.

7. Введение «Перфторана» в объеме 7% от ОЦК в начальный момент реперфузии снижает повреждение миокарда на 75% от уровня повреждений у контрольных животных, т.е. практически полностью нивелирует повреждающее действие фазы реперфузии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Беда Н.В., Гордин ВА., Недоспасов А.А., Рафиков P.P., Рафикова О.В., Сунцова Т. П. (1999) Метод одноэлектронного окисления оксида азота при помощи мицеллярного катализа. Патент, Россия, N 99119464

2. Рафикова О.В. (2000) Мицеллярный катализ окисления N0 в эмульсиях перфторуглеводородов и его влияние на цикл N0 млекопитающих. Российский конкурс молодых ученых и студентов по разделу «Медицинские науки», Москва, С. 57

3. Rafikova О., Rafikov R., Nedospasov A., Nudler E. (2000) Regulation of the nitric oxide cycle in mammals by the hydrophobic phase. First international conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications ofNitric Oxide, San Francisco, USA, suppl., P. 16

4. Beda N.V., Gordin V.A., Nedospasov A.A., Rafikov R.R., Rafikova O.V. and Suntsova T.P. (2000) A Method for modulating metabolism of nitric oxide, a composition for realizing thereof (variants) and a method for effecting organism. Патент PCT/RU 00/00362

5. Rafikova O., Rafikov R., Nudler E. (2001) Plasma albumin and S-nitrosothiols formation. Gordon conference: Biochemistry ofNitric Oxide, Ventura, USA, C. 108

6. Rafikova O., Rafikov R., Nudler E. (2002) Catalysis of S-nitrosothiols formation by serum albumin: The mechanism and implication in vascular control. Proceedings of the National Academy of Science. V.99, N. 9, P.5913-5918.

7. Rafikova O., Rafikov R., Nudler E. (2002) Catalysis of S-nitrosothiols formation by serum albumin: the mechanism and implications in vascular tone control. Second International Conference ofthe Nitric Oxide Society, Prague, Czech Republic, P. 83

8. Rafikova O., Rafikov R., Nudler E. (2004) Catalysis of S-nitrosothiols formation by serum albumin: The mechanism and implication in vascular control. The third international conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide. Nara, Japan, P.I 17

9. Rafikova O., Rafikov R., Nudler E (2004) Control of plasma NO bioactivity by perfluorocarbons: physiological mechanisms and clinical implications. The third international conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide. Nara, Japan, P. 192

10. Рафикова О., Рафиков Р., Нудлер Е.(2004) Альбумин плазмы как активное депо оксида азота и катализатор синтеза нитрозотиолов. Роль альбумина в регуляции сосудистого тонуса. Российский физиологический журнал. Т.90, N.8, С. 274

11. Рафикова О., Рафиков Р. (2004) Перфторуглеводороды как способ контроля уровня оксида азота. Использование для предуперждения и лечения нарушений

коронарного кровотока и постишемических повреждений

миокарда. Третий Российский конгресс по патофизиологии, Москва, С. 58 12. Rafikova О., Rafikov R, Nudler E. (2004) Control of plasma NO bioactivity by periluorocarbons: physiological mechanisms and clinical implications. Circulation. V.110,N.23,P.3573-3580

Подписано в печать /б. 03. 200" года. Заказ №// . Формат 60х90/16. Усл. печ. л. 5,5 . Тираж/00 экз. Отпечатано на ризографе в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ.

22 МДР 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рафикова, Ольга Валериевна

1. Оглавление

2. Список сокращений

3. Введение

3.1. Актуальность исследования

3.2. Цель и задачи настоящего исследования

3.3. Научная новизна

3.4. Теоретическая и практическая значимость работы

4. Обзор литературы

4.1. Оксид азота

4.2. Основные этапы изучения оксида азота

4.3. Физико-химические характеристики оксида азота

4.4. Синтез N

4.4.1. NO - синтазный путь

4.4.2. Несинтазный путь синтеза N

4.5. Активные метаболиты N0 в крови

4.5.1. Нитрозотиолы

4.5.2. Нитрозильные комплексы железа

4.5.3. NO и гемоглобин

4.5.4. Пероксинитрит

4.5.5. NO модифицированные белки

4.6. Окисление N0 внутри гидрофобной фазы

4.7. Изменения метаболизма N0 в условиях ишемии/реперфузии

4.7.1. Ишемия/реперфузия

4.7.2. Продукция N0 во время ишемии/реперфузии

4.7.3. Значение активных форм кислорода и пероксинитрита в ишемии/реперфузии миокарда

4.7.4. Современные терапевтические подходы

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Рафикова, Ольга Валериевна

ВЫВОДЫ

2. Насыщенная N203 гидрофобная фаза, обладает способностью вызывать образование экзогенных низкомолекулярных нитрозотиолов in vitro и in vivo.

4. Введение в кровь BSA, ненасыщенного N0/N203 вызывает повышение среднего артериального давления. Насыщенный N0/N203 BSA не вызывает достоверного изменения в уровне САД в обычных условиях, но приводит к понижению артериального давления в условиях ингибирования эндогенного синтеза N0.

4. «Перфторан» в дозе 1% от ОЦК вызывает увеличение уровня низкомолекулярных тиолов плазмы и понижение САД. Доза «Перфторана» 1% от ОЦК не обеспечивает адекватной работы мицеллярного катализа окисления N0 и не вызывает образования нитрозотиолов. Поэтому, введение 7% от ОЦК приводит к повышению САД.

7. Введение «Перфторана» в объеме 7% от ОЦК в начальный момент реперфузии снижает повреждение миокарда на 75% от уровня повреждений у контрольных животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рафикова, Ольга Валериевна, Москва

1. Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в биологических системах // Биохимия. - 1998. - V.63. - N7. - Р.782-793

2. Ванин А.Ф. Окись азота в биологии: история, состояние и перспективы исследования // Биохимия. 1998. - Т.63. - N7. - С.867-869

3. Ванин А.Ф., Варич В.И. Образование нитрозильных комплексов негемового железа (комплексы 2.03) в такнях животных in vivo // Биофизика. 1979. - V.24. - N4. - Р.666-670

4. Ванин А.Ф., Стукан Р.А., Манухина Е.Б. Димерные и мономерные формы динитрозильных комплексов железа с тиол содержащими лигандами: физико-химические свойства и вазодилататорная активность // Биофизика.- 1997. V.42. - N1. - Р. 10-21

5. Волин М.С., Дэвидсон К.А., Камински П.М., Фейнгерш Р.П., Мохаззаб-Х К.М. Механизмы передачи сигнала оксидант оксид азота в сосудистой ткани//Биохимия. - 1998.-Т.63.-N7.-С. 958-965

6. Голубев A.M., Васильев А.Э. Медико-биологические аспекты применения эмульсий перфторуглеродов // Пущино. 1983. - С. 136-151

7. Горрен А.К.Ф., Майер Б. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота // Биохимия. —1998. —63. —С. 870—880

8. Железкова Е.В., Ковеленов А.Ю., Шилов В.В. Иммуномодулирующее действие эмульсии перфторана при радиационной патологии // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине. 1997. - С. 42-43

9. Иваницкий Г.Р., Воробьев С.И. Образование подвижных структур в кровотоке основа функционирования перфторуглеродной "искусственной крови" //Биофизика.- 1996.-Т.41.-N1.-С. 178-190

10. Клигупенко Е.Н., Бижно И.П., Слинченков В.В., Лещев Д.П. О некоторых механизмах действия перфторана в остром периоде термической травмы //

11. Перфторорганические соединения в биологии и медицине. 1997. -Пущино.-С. 187-196

12. Ладилов Ю.В.,Исламов Б.И., Воробьев С.И., Иваницкий Г.Р. Влияние различных доз эмульсии перфторуглеродов на гемодинамику и сократимость ишемического сердца. // Бюлл. эксперимент. Биол. и медицины. 1992. - Т.6. - С.593-595

13. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Маленюк Е.Б., Зенина Т.А., Покидешев Е.А. Гипотензивное действие и тканевое распределение донора оксида азота динитрозильных комплексов железа (ДКЖ) // Бюл. эксперм. биол. и мед. - 1998. - V.125. -N1. -Р.30-33

14. Манухина Е.Б., Смирин Б.В., Малышев И.Ю., Стоклет Д.К., Мюддер Б., Солодков А.П., Щебеко В.И., Ванин А.Ф. Депо оксида азота в сердечнососудистой системе // Изв. Акад. Наук Сер. Биол. 2002. — V.9-10. N5. -Р.585-596

15. Мороз В.В., Крылов JI.H., Иваницкий Г.Р. и др. Применение перфторана в клинической медицине // Анестезиол. и реаниматол. 1995. - Т.6. - С.12-17

16. Недоспасов А.А. Биогенный NO в конкурентных отношениях // Биохимия. 1998. - V.63. - N7. - Р.881-904

17. Панченко С.М. Состояние системы гемокоагуляции после инфузии эмульсии перфторированных органических соединений // Автореф. дис. канд. мед. наук. НИИ гематологии и переливания крови. Ленинград. -1990-к

18. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Косицын Н. С., Охотин В.Е. Проблема оксида азота в биологии и медицине и принцип цикличности // Москва. 2003

19. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н. С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих // Москва. 1998

20. Стокле Ж.К., Мюлле Б., Андрианцитохайна Р., Клещев А. Гиперпродукция оксида азота в патофизиологии кровеносных сосудов // Биохимия. 1998. - Т.63. - N7. - С. 976-983

21. Ханевич М.Д., Софронов Г.А., Тиканадзе А.Д. и др. Применение перфторана в неотложной и плановой абдоминальной хирургии // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине. 1997. - С. 112-113

22. Al-Sa'doni Н., Ferro A. S-Nitrosothiols: a class of nitric oxide-donor drugs // Clin. Sci. 2000. - V.98. - N.5. - P.507-520

23. Alvarez В., Radi R. Peroxynitrite reactivity with amino acids and proteins // Amino Acids. -2003. -N3-4. -P.295-311

24. Ambrosio G., Weisman H.F., Mannisi J.A., Becker L.C. Progressive impairment of regional myocardial perfusion after initial restoration of4s* postischemic blood flow // Circulation. 1989. - V.80. -N6. - P.l 846-1861

25. Ambrosio G., Zweier J.L., Flaherty J.T. The relationship between oxygen radical generation and impairment of myocardial energy metabolism following post-ischemic reperfusion // J. Mol. Cell Cardiol. 1991. - V.23. - N12. -P.1359-1374

26. Arstall M.A., Sawyer D.B., Fukazawa R., Kelly R.A. Cytokine-mediated apoptosis in cardiac myocytes: the role of inducible nitric oxide synthase induction and peroxynitrite generation // Circ. Res. 1999. - V.85. - N9.fT P.829-840

27. Asahi M., Fujii J., Такао Т., Kuzuya Т., Hori M., Shimonishi Y., Taniguchi N. The oxidation of selenocysteine is involved in the inactivation of glutathione peroxidase by nitric oxide donor // J. Biol. Chem. 1997. - V.272. - N31. -P.19152-19157

28. Ascenzi P., Colasanti M., Persichini Т., Muolo M., Polticelli F., Venturini G., Bordo D., Bolognesi M. Re-evaluation of amino acid sequence and structural consensus rules for cysteine-nitric oxide reactivity // Biol. Chem. 2000. -V.381. -N7. -P.623-627

29. Askew S.C., Barnett D.J., McAninly J., Williams D.L.H. Catalysis by Cu2+ of nitric oxide release from S-nitrosothiols (RSNO) // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1995. - V2. -P.741-745

30. Aversano Т., Zhou W., Nedelman M., Nakada M., Weisman H. A chimericM

31. I IgG4 monoclonal antibody directed against CD 18 reduces infarct size in aprimate model of myocardial ischemia and reperfusion // J. Am. Coll. Cardiol. -1995. V.25. -N3. -P.781-788

32. Becker L.B. New concepts in reactive oxygen species and cardiovascular reperfusion physiology // Cardiovasc. Res. 2004. - V.61. -N3. - P.461-470

33. Becker L.B., Vanden Hoek T.L., Shao Z.H., Li C.Q., Schumacker P.T. Generation of superoxide in cardiomyocytes during ischemia before reperfusion // Am. J. Physiol. 1999. - Y.277. - N6. - Pt2. - P.H2240-2246

34. Beda N.V., Suntsova T.P. Micellar catalysis for oxidation of nitric oxide (NO) in the multi-phase systems in vivo // FEBS Lett. 1999. - V.453. - N1-2. -P.229-235

35. Г 41. Bertuglia S., Giusti A. Microvascular oxygenation, oxidative stress, NO suppression and superoxide dismutase during postischemic reperfusion // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2003. - V.285. -N3. - P.H1064-H1071

36. Bloch W., Mehlhorn U., Krahwinkel A., Reiner M., Dittrich M., Schmidt A., Addicks K. Ischemia increases detectable endothelial nitric oxide synthase in rat and human myocardium // Nitric Oxide. 2001. - V.5. - N4. - P.317-33

37. Boyle M.P., Weisman H.F. Limitation of infarct expansion and ventricular remodeling by late reperfusion. Study of time course and mechanism in a ratл model // Circulation. 1993. - V.88. - N6. - P.2872-2883к

38. Bugge E., Ytrehus K. Bradykinin protects against infarction but does not mediate ischemic preconditioning in the isolated rat heart // J. Mol. Cell Cardiol. 1996. - V.28. -N12. -P.2333-2341

39. Burkart V., Koike Т., Brenner H.H., Imai Y., Kolb H. Dihydrolipoic acid protects pancreatic islet cells from inflammatory attack // Agents Actions. -1993. V.38. -Nl-2. -P.60-65

40. Butler A.R., Megson I.L., Wright P.G. Diffusion of nitric oxide and scavenging by blood in the vasculature // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V.1425. - N1. -P.168-176

41. Butler A.R., Megson I.L., Wright P.G. Diffusion of nitric oxide and scavenging by blood in the vasculature // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V.1425. - N1. -P.168-176

42. Calmels S., Hainaut P., Ohshima H. Nitric oxide induces conformational and functional modifications of wild-type p53 tumor suppressor protein // Cancer Res. 1997. - V.57. - N16. - P.3365-3369

43. Campbell D.L., Stamler J.S., Strauss H.C. Redox modulation of L-type calcium channels in ferret ventricular myocytes. Dual mechanism regulation by nitric oxide and S-nitrosothiols // J Gen Physiol. 1996. - V. 108. - N4. - P.277-293

44. Castro L.A., Robalinho R.L., Cayota A., Meneghini R., Radi R. Nitric oxide and peroxynitrite-dependent aconitase inactivation and iron-regulatory protein-1 activation in mammalian fibroblasts // Arch. Biochem. Biophys. 1998. -V.359. -N2. -P.215-224

45. Catani M.V., Bernassola F., Rossi A., Melino G. Inhibition of clotting factor XIII activity by nitric oxide // Biochem Biophys Res Commun. 1998. -V.249. -N.l. -P.275-278

46. Choi Y.B., Tenneti L., Le D.A., Ortiz J., Bai G., Chen H.S., Lipton S.A. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation //Nat. Neurosci. 2000. -Nl. - P. 15-21

47. Cooper C.E. Nitric oxide and iron proteins // Biochim. Biophy.s Acta. 1999. -V. 1411.- N2-3. -P.290-309

48. Cosby K., Partovi K.S., Crawford J.H., Patel R.P., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation // Nat Med.- 2003. V. 9. -N12. - P.1498-1505

49. Crow J.P., Ischiropoulos H. Detection and quantitation of nitrotyrosine residues in proteins: in vivo marker of peroxynitrite // Methods Enzymol. 1996. -V.269. - P.185-194,

50. Daiber A., Herold S., Schoneich C., Namgaladze D., Peterson J.A., Ullrich V. Nitration and inactivation of cytochrome P450BM-3 by peroxynitrite. Stopped-flow measurements prove ferryl intermediates // Eur. J. Biochem. 2000. -V.267. - N23. - P.6729-6739

51. De Groote M.A., Testerman Т., Xu Y., Stauffer G., Fang F.C. Homocysteine antagonism of nitric oxide-related cytostasis in Salmonella typhimurium // Science. 1996. - V.272. - N5260. - P.414-417

52. Depre C., Fierain L., Hue L. Activation of nitric oxide synthase by ischaemia in the perfused heart // Cardiovasc. Res. -.1997. V.33. - N1. -P.82-87

53. Dohi K., Ohtaki H., Inn R., Ikeda Y., Shioda H.S., Aruga T. Peroxynitrite and caspase-3 expression after ischemia/reperfusion in mouse cardiac arrest model // Acta Neurochir. Suppl. 2003. - V.86. - P.87-91

54. Duilio С., Ambrosio G., Kuppusamy P., DiPaula A., Becker L.C., Zweier J.L. Neutrophils are primary source of O2 radicals during reperfusion after prolonged myocardial ischemia // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001. -V.280. - N6. - P.H2649-2657

55. Eduardo da Silva-Santos J., Assreuy J. Long-lasting changes of rat blood pressure to vasoconstrictors and vasodilators induced by nitric oxide donor infusion: involvement of potassium channels // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1999. V.290. - P.380-387

56. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. -V.82. -Nl. - P.70-77

57. Engelman D.T., Watanabe M., Maulik N., Engelman R.M., Rousou JA., Flack , J.E. 3rd., Deaton D.W., Das D.K. Critical timing of nitric oxide supplementationin cardioplegic arrest and reperfusion // Circulation. 1996. - V.94. - N9 Suppl. - P.II407-411

58. Estevez A.G., Spear N., Manuel S.M., Radi R., Henderson C.E., Barbeito L., Beckman J.S. Nitric oxide and superoxide contribute to motor neuron apoptosis induced by trophic factor deprivation // J. Neurosci. 1998. - V.18. - N3. -P.923-931

59. Feelisch M., Rassaf Т., Mnaimneh S., Singh N., Bryan N.S., Jourd'Heuil D., x Kelm M. Concomitant S-, N-, and heme-nitros(yl)ation in biological tissues andfluids: implications for the fate of NO in vivo // FASEB J. 2002. - V.16. -N13. -P.1775-1785

60. Ferdinandy P. Nitric oxide and peroxynitrite in cardioprotection: The effect of hyperlipidaemia // Cardiovasc. J. S. Afr. -2004. V.l5. -N4 Suppl 1. - P.S4

61. Foster M.W., McMahon T.J., Stamler J.S. S-nitrosylation in health and disease // Trends Mol. Med. 2003. - V.9. - N4. - P. 160-168

62. Frustaci A., Kajstura J., Chimenti C., Jakoniuk I., Leri A., Maseri A., Nadal-Ginard В., Anversa P. Myocardial cell death in human diabetes // Circ. Res. -2000. Y.87. - N12. - P.l 123-1132

63. Furukawa Т., Kohno H., Tokunaga R., Taketani S. Nitric oxide-mediated inactivation of mammalian ferrochelatase in vivo and in vitro: possible involvement of the iron-sulphur cluster of the enzyme // Biochem. J. 1995. -V.310. - Pt.2. - P.533-538

64. Galkina S.I., Dormeneva E.V., Bachschmid M., Pushkareva M.A., Sudina G.F., Ullrich V. Endothelium-leukocyte interactions under the influence of the superoxide-nitrogen monoxide system // Med. Sci. Monit. 2004. - V.10. -N9. - P.BR307-BR316

65. Garcia-Ruiz C., Fernandez-Checa J.C., Kaplowitz N. Bidirectional mechanism p of plasma membrane transport of reduced glutathione in intact rat hepatocytesand membrane vesicles // J. Biol. Chem. 1992. - V.267. - N31. - P.22256-22264

66. Gaston В., Sears S., Woods J., Hunt J., Ponaman M., McMahon Т., Stamler J.S. Bronchodilator S-nitrosothiol deficiency in asthmatic respiratory failure // Lancet.- 1998.-V.351.-N9112.-P.1317-1319

67. Gaston В., Sears S., Woods J., Hunt J., Ponaman M., McMahon Т., Stamler J.S. , j Bronchodilator S-nitrosothiol deficiency in asthmatic respiratory failure //1.ncet. 1998. - V.351. -N9112. -P.1317-1319

68. Gervits L.L. Perflurocarbon-based blood substitutes. Russian experience. In Fluorine in medicine in 21st century, eds. Banks, R.E., & Lowe, K.C. (Shrewsbury, Rapra)- 1994

69. Giraldez R.R., Panda A., Xia Y., Sanders S.P., Zweier J.L. Decreased nitric-oxide synthase activity causes impaired endothelium-dependent relaxation in the postischemic heart // J. Biol. Chem. 1997. - V.272. - N34. - P.21420-21426

70. Gladwin M.T., Lancaster J.R., Jr., Freeman B.A., Schechter A.N. Nitric oxide's reactions with hemoglobin: a view through the SNO-storm // Nat. Med. 2003. -N5. -P.496-500

71. Godber B.L., Doel J.J., Sapkota G.P., Blake D.R., Stevens C.R., Eisenthal R,. ^ Harrison R. Reduction of nitrite to nitric oxide catalyzed by xanthineWoxidoreductase I IJ Biol Chem. 2000. - V.275. -N11. - P.7757- 7763

72. Gordin V.A., Nedospasov A.A. NO catastrophes in vivo as a result of micellar catalysis // FEBS Lett. 1998. - V.424. - P.239-242

73. Goss S.P., Singh R.J., Hogg N., Kalyanaraman B. Reactions of *NO, *N02 and peroxynitrite in membranes: physiological implications // Free Radic. Res. -1999. V.31. - N6. - P.597-606

74. Gow A.J., Stamler J.S. Reactions between nitric oxide and haemoglobin under ^ physiological conditions //Nature. 1998. -V.391. -N6663. -P.169-173

75. Grasemann H., Gaston В., Fang K., Paul K., Ratjen F. Decreased levels of nitrosothiols in the lower airways of patients with cystic fibrosis and normal pulmonary function // J. Pediatr. 1999. - V. 135. - N6. - P.770-772

76. Heyndrickx G.R. Myocardial stunning: an experimental act with a large clinical audience // Arch. Mai. Coeur. Vaiss. 2003. - V.96. - N6. - P.665-670

77. Hobbs A.J. Soluble guanylate cyclase: the forgotten sibling // Trends Pharmacol. Sci. 1997.-N12.-P.484-491

78. Hobbs A.J., Gladwin M.T., Patel R.P., Williams D.L., Butler A.R. Haemoglobin: NO transporter, NO inactivator or NOne of the above? // Trends Pharmacol. Sci. 2002. -N9. - P.406-411

Информация о работе

Рафикова, Ольга Валериевна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Регуляция уровня оксида азота в крови под действием альбумина и эмульсии перфторуглеводородов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы