Регуляция транскрипции генов класса II у инфузории Stylonychia lemnae

Пименов, Александр Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция транскрипции генов класса II у инфузории Stylonychia lemnae
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция транскрипции генов класса II у инфузории Stylonychia lemnae"

003058389 На правах рукописи

ПИМЕНОВ Александр Юрьевич

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ КЛАССА II У ИНФУЗОРИИ ЭТУЮЫУСША ¡-ЕМЫАЕ

03 00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003058389

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Скарлато Сергей Орестович Сковородкин Илья Николаевич

Официальные оппоненты

доктор биологических наук

Снигиревская Екатерина Сергеевна

доктор биологических наук, профессор Хованских Александр Егорович

Защита состоится " мая 2007 г е 1асов на заседании Диссертационного совета Д 002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064, г Санкт-Петербург, Тихорецкий пр, дом 4, факс (812) 297-0341, электронная почта сеНЬю@та|| с^эрЬ гев! ги

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Ведущая организация

Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет

Автореферат разослан

апреля 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета . кандидат биологических наук

Каминская Е В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Инфузории (тип Ciliophora) являются одними из наиболее высоко организованных представителей царства Protista (Догель, 1981, Brusca, Brusca, 2002) Многие аспекты их строения, локомоции, размножения и организации ядерного аппарата на протяжении многих лет привлекают внимание специалистов из разных областей науки Большой интерес для исследований в области клеточной и молекулярной биологии представляет группа брюхоресничных инфузорий, которые ввиду особенностей организации их генома являются удобными модельными объектами для экспериментов

В настоящей работе мы придерживаемся классификации, согласно которой тип Ciliophora включает класс Spirotrichea, содержащий отряды Spirotrichida (роды Stylonychia и Oxytricha (Sterkiella)) и Hypotrichida (род Euplotes), класс Oligohymenophorea (род Tetrahymena) и класс Nassophorea (род Paramecium) (Lynn, Small, 1985) При этом представителей отрядов Spirotrichida и Hypotrichida исторически принято объединять в группу брюхоресничных инфузорий Поэтому, говоря о родах Stylonychia, Oxytricha (Sterkiella) и Euplotes, мы будем использовать в равной степени термины брюхоресничные инфузории и инфузории-спиротрихи

Ядерный гетероморфизм, характерный для всех представителей типа Ciliophora, у инфузорий-спиротрих выражен наиболее ярко (Райков, 1978, Осипов, 1981, Klobutcher, Prescott, 1986) В транскрипционно активном макронуклеусе этих протистов содержаться короткие линейные молекулы - минихромосомы, каждая из которых несет, как правило, один единственный ген Таким образом, каждый макронукпеарный ген представляет собой автономную репликационную и транскрипционную единицу (Осипов, 1981, Klobutcher, Prescott, 1986) (рис 1)

Такая организация генетического материала наиболее удобна для изучения процессов реализации генетической информации, в том числе и регуляции инициации транскрипции (Пименов и др , 2006) Действительно, все регуляторные элементы молекулы ДНК, необходимые для корректной инициации транскрипции, сосредоточены в сравнительно короткой лидерной фланкирующей области минихромосомы, что значительно сужает диапазон исследования

J слс4а,с<

G<TÍC T,G,T,GJ,G,

ОЛО.Т^ДЛЛО! С<АЛаА,С< I

Рис 1 Обобщенная схема строения минихромосомы Stylonychia lemnae (по Пименов и др , 2006) В рамках справа и слева указаны нуклеотидные последовательности теломер

Изучение регуляции инициации транскрипции генов класса II у эукариотических организмов привело к созданию классической схемы строения промоторной области (Lee, Young, 2000) Так, для генов класса II большинства эукариот постулировано присутствие таких регуляторных нуклеотидных последовательностей, как СААТ-бокс и ТАТА-бокс в положениях 100-150 и 25-30 п н левее точки начала транскрипции, соответственно, и инициатора транскрипции - нукпеотидной последовательности, окружающей точку начала транскрипции Одновременно с этим изучение генов класса II у представителей типа Ciliophora привело исследователей к выводу об отсутствии в этих генах описанных у других эукариот классических элементов регуляции (Ghosh et al, 1994) Причина этого заключается в том, что основным методом большинства исследователей был

теоретический анализ нуклеотидных последовательностей различных генов с целью поиска уже известных регуляторных нуклеотидных последовательностей в их классических положениях (так называемый сравнительно-молекулярный метод) (Helftenbein, 1985, Conzelmann, Helftenbein, 1987, Helftenbein, Muller, 1988, Helftenbein et al, 1989, Steinbruck, 1990, Пименов и др, 2006) При этом экспериментальная проверка соответствующих областей минихромосомы отсутствовала, что ставит под сомнение все выводы, сделанные исследователями

Появившееся в литературе большое количество противоречивых данных относительно состава основного промотора генов класса II представителей типа Ciliophora дало толчок к разработке экспериментальных подходов в изучении рассматриваемого вопроса (Пименов и др , 2006) Так, научно-исследовательской группой, в которую входит автор настоящей диссертации, с использованием инфузории-спиротрихи Stylonychia lemnae в качестве модельного объекта был разработан метод котрансфекции инфузорий мутантными векторами, содержащими делеции и нукпеотидные замены в интересующих участках 5-некодирующей области гена, что позволяет с высокой точностью локализовать присутствующие регуляторные последовательности ДНК (Skovorodkin et al, 1999) С использованием этого метода был частично проанализирован промотор гена а1-тубулина S lemnae (Pimenov et al, 2002, Zassoukhina et al, 2002, Райхель, 2003, Пименов и др , 2006, Skovorodkin, Pimenov et al, 2007)

Однако, несмотря на уверенное внедрение экспериментальных подходов в изучение строения промоторной области генов класса II инфузорий и значительные успехи в разработке методов котрансфекции инфузорий мутантными векторами, до настоящего времени еще ни один промотор генов инфузорий не был проанализирован полностью До сих пор не получена полная схема элементов, осуществляющих регуляцию транскрипции у ресничных простейших, не найдены возможные энхансеры, репрессоры и индукторы, описанные для многих генов эукариот

Цель настоящей работы - изучить структуру компонентов регуляторной области генов класса II у инфузории Stylonychia lemnae, контролирующих инициацию транскрипции

Задачи исследования состояли в следующем

1 Определить точки начала транскрипции в ряде генов инфузории S lemnae

2 На основе минихромосом, несущих гены а1- и а2-тубулина S lemnae, создать необходимые мутантные конструкции, содержащие делеции и нукпеотидные замены в 5-некодирующей области генов

3 Сравнить эффективность транскрипции мутантных конструкций и нативных минихромосом, несущих исследуемые гены in vivo

4 Определить и описать нукпеотидные последовательности ДНК в 5'-некодирующей области гена а1-тубулина S lemnae, необходимые для регуляции транскрипции

5 Сравнить эффективность транскрипции мутантных конструкций и нативных минихромосом, несущих исследуемые гены <х1- и а2-тубулина S lemnae в нормальных условиях и при индукции синтеза тубулина под воздействием лектина конканавалина А

6 Определить местоположение регуляторного элемента, контролирующего индукцию, в гене а2-тубулина

7 Сопоставить полученные экспериментальные данные о строении основного промотора генов <х1- и а2-тубулина S lemnae с данными по другим генам инфузорий-спиротрих

Основные положения, выносимые на защиту

1 У инфузории S lemnae 5'-некодирующая область минихромосомы, несущей ген а1-тубулина, содержит следующие нуклеотидные последовательности, необходимые для корректной инициации транскрипции

(а) инициатор, имеющий нукпеотидный состав ТАТАА, где второй нуклеотид А - точка начала транскрипции,

(б) классический ТАТА-бокс, представленный нуклеотидной последовательностью ТАААТА и расположенный между позициями -23 и -28 п н левее точки начала транскрипции,

(в) СААТ-бокс, имеющий нукпеотидный состав САТАТ и расположенный между позициями -45 и -49 п н левее точки начала транскрипции,

(г) энхансер - GC-бокс, имеющий нукпеотидный состав GATCCC и расположенный между позициями -75 и -82 п н левее точки начала транскрипции,

(д) репрессор, расположенный между позициями -155 и -114 п н левее точки начала транскрипции

2 Способность гена а2-тубулина инфузории S lemnae к индукции лектином конканавалином А регулируется индуктором расположенным в промоторной области гена длиной 36 п н между позициями -21 и -92 п н левее точки начала транскрипции

3 Регуляция транскрипции генов класса II представителей типа Ciliophora осуществляется при участии промоторов разного строения Промоторы генов класса II этих организмов могут быть подразделены на три основные группы

(а) промоторы, построенные по классической схеме, характерной для многих эукариот, и содержащие только ТАТА-бокс и инициатор,

(б) промоторы, также характерные для многих эукариот и содержащие наряду с ТАТА-боксом и инициатором ряд дополнительных регуляторных элементов, таких как СААТ-бокс, GC-бокс, различные энхансеры и репрессоры,

(в) промоторы, содержащие специфические регуляторные нуклеотидные последовательности, характерные для некоторых генов и групп инфузорий

4 Наиболее адекватным методом определения точек начала транскрипции как в генах тубулина S lemnae, так и в некоторых других генах брюхоресничных инфузорий является сопоставление результатов секвенирования и обратной транскрипции При этом обязательным условием при подготовке материала для проведения секвенирования является фосфорилирование праймеров нерадиоактивным фосфором

Научная новизна результатов работы В результате проведенной экспериментальной работы получены данные, расширяющие представление о механизмах регуляции транскрипции генов класса II представителей типа Ciliophora

1 Впервые для промоторной области гена а1-тубулина S lemnae описаны такие классические эукариотические регуляторные нуклеотидные последовательности, как СААТ-бокс, ТАТА-бокс и инициатор

2 Впервые для генов класса II инфузорий-спиротрих на примере гена а1-тубулина S lemnae были экспериментально найдены и описаны дополнительные регуляторные нуклеотидные последовательности ДНК-энхансер и репрессор

3 Впервые для генов класса II инфузорий-спиротрих путем экспериментального анализа генов а1- и а2-тубулина S lemnae была локализована нуклеотидная

последовательность в составе основного промотора, контролирующая индукцию транскрипции гена а2- тубулина

Теоретическая и практическая ценность работы Результаты проведенных исследований вносят значительный вклад в изучение механизмов регуляции транскрипции генов класса II представителей типа Ciliophora

С использованием экспериментальных подходов впервые полностью проанализирован промотор генов класса II инфузорий на примере гена а1-тубулина S /етпае Описаны такие классические эукариотические регуляторные элементы, как инициатор, ТАТА-бокс, СААТ-бокс, энхансер и репрессор При этом инициатор, энхансер и репрессор были описаны для генов класса II инфузорий впервые Сделаны выводы о классическом механизме регуляции транскрипции в ряде генов класса II инфузорий, характерном для многих эукариот

Экспериментальное изучение механизмов индукции гена а2-тубулина S lemnae при обработке инфузорий конканавалином А позволило найти специфический регуляторный элемент в составе промотора гена, контролирующий увеличение интенсивности синтеза мРНК

На основе экспериментальных и сравнительно-молекулярных исследований сделана попытка классифицировать возможные варианты механизмов регуляции транскрипции генов класса II инфузорий

Метод котрансфекции инфузорий искусственными векторами, содержащими необходимые мутации, применим для изучения функциональной роли любых нукпеотидных последовательностей во всех макронуклеарных генах инфузорий-спиротрих

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 21-м ежегодном съезде Немецкого протозоологического общества (Германия, г Констанц, 2002) и научных семинарах Лаборатории цитологии одноклеточных организмов Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2005, 2006 и 2007)

Финансовая поддержка работы была получена от Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 03-04-48505, 04-04-49209, 07-04-00662)

Публикации По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы, в том числе 1 статья в рецензируемом российском журнале «Цитология» и 1 статья в международном рецензируемом журнале «Eukaryot Cell» (импакт-фактор 4,303)

Структура и объем диссертации Диссертация объемом 106 страниц включает введение, 4 главы, выводы, список литературы (147 названий), 27 рисунков и 2 таблицы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы подробно рассматривается организация ядерного и генетического аппарата представителей типа Ciliophora и, в частности, инфузорий-спиротрих Анализируются литературные данные относительно механизмов регуляции транскрипции генов класса II как у эукариотических организмов в целом, так и у представителей типа Ciliophora Рассматриваются основные подходы в изучении строения промоторов генов класса II, делаются выводы о малой изученности механизмов регуляции транскрипции у инфузорий, обосновывается удобство и необходимость применения экспериментальных подходов при изучении регуляции транскрипции генов класса II спиротрих

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объект исследования Использован клон инфузории S lemnae, полученный в результате скрещивания двух клонов, один из которых был выделен из природных популяций водоема в г Дорум (Dorum) в северной Германии, другой - из природных популяций водоема в г Петергофе (Россия) Инфузорий культивировали в минеральной среде Прингсгейма, в качестве корма использовали одноклеточные водоросли Chlorogonium sp (Ammermann et al, 1974)

Светооптические методы исследования инфузорий Прижизненное изучение инфузории S lemnae и микрофотосъемку проводили с использованием микроскопа Amplival с полуавтоматической фотонасадкой MF-matic и микроскопа МБС-9

Для электронной микроскопии инфузорий фиксировали в 1 5 - 3 0%-ном растворе глутаральдегида в 0 1 М кокодилатном буфере (1 ч при 0° С) Затем клетки постфиксировали в 1-2%-ном растворе OsÜ4 в 0 1 М кокодилатном буфере (1 ч при 0" С), обезвоживали и заключали в смесь Аралдита с Эпоном Ультратонкие срезы получали с помощью ультрамикротома LKB III, окрашивали уранил-ацетатом и цитратом свинца и изучали с использованием электронных микроскопов JEM-7A и JEM-100C

Исследуемые гены Минихромосомы, несущие гены a1-, <x2-, ß1-, ß2-тубулина, а также белка теплового шока 70 и катепсина, выделены и клонированы в плазмидах pUC12 и pTZ18U Е Хельфтенбайном и Е Мюллером (Helftenbein, Muller, 1988) и получены нами из коллекции доктора Штайнбрюка (Steinbruck, Зоологический ин-т Тюбингенского ун-та, Германия)

Для клонирования всех использовавшихся конструкций использованы минихромосомы a1-wt и a2-wt, содержащие гены а1- и а2-тубулина S lemnae, соответственно Конструкция pTubalf клонирована ранее (Skovorodkin et al, 1999) и представляет собой ген а1-тубулина S lemnae с меткой 19 п н , вставленной в кодирующий участок в позицию 66 п н правее точки начала трансляции

Трансфекцию вегетативных клеток S lemnae проводили с помощью метода микроинъекции в макронуклеус искусственных минихромосом - линейных векторов, снабженных теломерами (Skovorodkin et al , 1999) Для трансформации инфузорий использовали метод котрансфекции, для чего в макронуклеус инфузории инъецировали одновременно векторы двух типов, созданных на основе минихромосом, несущих ген а1-тубулина Оба вектора содержали в кодирующей области олигонуклеотидную вставку, которая позволяла отличать их друг от друга и от нативных макронуклеарных минихромосом S lemnae Количество копий каждого из векторов, инъецируемых в клетку, приблизительно соответствовало количеству нативных минихромосом а1-тубулина (около 100000 копий)

Выделение плазмидной ДНК Е coli осуществляли либо при помощи набора реактивов QIAprep Miniprep Kit по стандартному протоколу фирмы-производителя, либо при помощи экспресс-метода выделения плазмидной ДНК (Speedprep) (Goode, Feinstein, 1992, Ausubel et al, 1998)

Реакции рестрикции и лигирования ДНК, фосфорилирования и дефосфорилирования олигонукпеотидов, обработку ДНК ферментом Кленова, электрофорез в агарозном и полиакриламидном гелях и большинство других молекулярно-биологических процедур выполняли по стандартным методикам (Sambrook et al, 1989) и протоколам фирм-производителей соответствующих реактивов

Амплификацию ДНК проводили с помощью метода ПЦР в присутствии фермента Expand (Roche, Германия), обеспечивающего наименьшую частоту ошибок, или Taq-полимеразы (Peqlab, Германия) Температуру отжига праймеров и время элонгации ДНК в каждом случае определяли эмпирически

Выделение ДНК из трансформированных инфузорий Для выделения суммарной ДНК S lemnae необходимое количество инфузорий собирали на фильтре, переносили в буфер для протеиназы К, после чего производили депротеинизацию с последующей экстракцией фенолом и осаждением этанолом РНК удаляли, обрабатывая пробы РНК-азой А

Выделение РНК из трансформированных инфузорий Для выделения суммарной РНК S lemnae необходимое количество инфузорий собирали на фильтре, переносили в буфер для протеиназы К, после чего производили депротеинизацию с последующей экстракцией фенолом и осаждением этанолом Оценка интенсивности транскрипции инъецированных конструкций Интенсивность транскрипции генов а1- и а2-тубулина в исследуемых векторах оценивали опосредованно по соотношению количеств мРНК С этой целью тотальную РНК трансформированных инфузорий выделяли методом, описанным выше мРНК, синтезированную на основе инъецированных конструкций, а также собственную мРНК а1- и а2-тубулина инфузорий анализировали с помощью реакции обратной транскрипции, продукты которой наносили на 6%-ный полиакриламидный (ПАА) гель Количественные соотношения исследуемых мРНК определяли, оценивая оптическую плотность электрофоретических полос с помощью программы TotalLab

Индукция синтеза тубулина Принцип метода индукции синтеза тубулина состоит в том, что конканавалин А, связываясь с рецепторами на поверхности ресничек, вызывает их склеивание Клетки становятся неподвижными Однако если удалить из среды конканавалин, они вновь обретают подвижность благодаря формированию новых ресничек (Frisch et al, 1976) В клетках, регенерирующих реснички, усиливается транскрипция генов тубулина Индукцию синтеза тубулина проводили по методу Витте (Witte et al, 1995)

Определение точки начала транскрипции Точку начала транскрипции в исследуемых генах определяли с использованием реакций секвенирования и обратной транскрипции В случае анализа продуктов этих реакций на одном ПАА геле при использовании одних и тех же праймеров продукты реакции секвенирования являются размерным маркером, сопоставление которого с продуктами реакции обратной транскрипции дает возможность говорить о точном местоположении нуклеотида, с которого начинается синтез мРНК

ГЛАВЫ 3 и 4 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Светооптические и электронно-микроскопические исследования инфузорий

Негативы с фотографиями общего вида S lemnae, а также электронные фотографии ультраструктуры Ма S lemnae, были любезно предоставлены И Н Сковородкиным Ядерный аппарат вегетативной особи S lemnae представлен двумя Ми и одним гантелевидным Ма, узкая перемычка которого содержит пучки микрофиламентов Оболочка Ма имеет классическое двухмембранное строение На ультратонких срезах хроматин Ма организован в виде сети анастомозирующих тяжей, среди которых выявляется несколько крупных ядрышек При делении Ма во время фазы сферического тела хроматиновые тяжи утрачивают связь с внутренней

мембраной ядерной оболочки, к которой они были прикреплены в остальных фазах клеточного цикла

Делеционный анализ 5'-некодирующего участка гена а1-тубулина

S lemnae

Для определения участков в 5'-нетранскрибируемой области гена а.1-тубулина, содержащих элементы промотора, были синтезированы четыре конструкции, в которых последовательно частями были удалены интересующие последовательности между 5'-теломером и точкой начала транскрипции (рис 2)

В конструкции Del-1 были удалены первые 40 п н от 5'-теломера В конструкциях Del-2, Del-З и Del-4 были удалены первые 99, 119 и 144 пн, соответственно

Таким образом было показано, что удаление последовательности между 5'-теломером и позицией -114 пн левее точки начала транскрипции приводит к достоверному увеличению уровня синтеза мРНК (Del 1, рис 2) Одновременно с этим снижение эффективности транскрипции наблюдали при удалении последовательностей между 5'-теломером и позициями -55, -35 и -11 п н (Del 2, Del 3 и Del 4, рис 2)

Характер изменения уровня синтеза мРНК на конструкции Del 1 свидетельствует о наличии в указанной области гена нуклеотидной последовательности, оказывающей на транскрипцию подавляющее воздействие Основываясь на литературных данных о механизмах сборки транскрипционного комплекса и особенностях ее регуляции, можно утверждать, что в области между теломером и позицией -114 пн расположен репрессор, ранее не описанный у инфузорий

Значительное снижение эффективности транскрипции при удалении последовательности между 5'-теломером и позицией -11 пн (Del 4, рис 2) показывает, что последовательность между позицией -114 пн и точкой начала транскрипции содержит элементы промотора, присутствие которых необходимо для корректной транскрипции гена

Анализ 5'-некодирующего участка гена а1-тубулина S lemnae с помощью конструкций, несущих нуклеотидные замены

С целью дальнейшего изучения области промотора гена а1-тубулина был проведен анализ этой области с помощью замен нукпеотидов, что позволило точнее определить границы участков, содержащих регуляторные последовательности Замены производили по следующему правилу нуклеотид А заменяли на нуклеотид С и наоборот, а нуклеотид Т заменяли на нуклеотид G и наоборот Были синтезированы одиннадцать конструкций, каждая из которых содержала блок нуклеотидных замен в определенном участке анализируемой области промотора между -95 п н и +2 п н относительно точки начала транскрипции (рис 2) Используя конструкции pSub-1, pSub-2, pSub-3, pSub-4, pSub-5, pSub-6, pSub-7, pSub-8, pSub-9, pSub-10, pSub-11 для получения линейных векторов, были произведены эксперименты по котрансфекции клеток этими векторами и контрольным вектором Tuba1g-lt

<1*11

ЕГ

кк^'Ь »)>1 »; ыЪ** »«»И

« ««V !« % 1$

'I Г*!-.....!М -

кк;

Рис. 2. Экспериментальный анализ лромоторной области гена а 1-тубулина 31у1опусЫа ¡етпае с помощью искусственных конструкций, несущих делеции и нуклеотидные замены (по: БкоуогосИ^п, Р1тепоу е1 а1.р 2007).

1 - Делеционный анализ 5'-некодирующего участка гена «1 -тубулина Э. /етпае.

А - Общая схема произведенных делеций. Белые прямоугольники - кодирующая область гена, черные прямоугольники -вставки 19 п.н., точка начала транскрипции обозначена флажком, одинарная линия - 5'-некодирующая область гена, В, Е - Анализ продуктов реакции обратной транскрипции и ПЦР с использованием мутантных векторов и нативных минихромосом, несущих ген а1-тубулмна. С, Р - Соотношения интенсивности электрофоретических полос, соответствующих продуктам реакции обратной транскрипции и ПЦР на основе мутантных векторов со вставкой 19 п.н.(81) и векторов со вставкой 49 п.н. (II - контроль).

2 - Анализ 5'-некодирующего участка гена а1-тубулина с помощью конструкций, несущих нуклеотидные замены.

И - Общая схема произведенных нуклеотидных замен. Представлена нуклеотидная последовательность 5'-некодирующего участка гена а1-тубулина Б. ¡етпае и участки промоторной области гена, несущие нуклеотидные замены соответствующие каждой из конструкций.

В результате анализа 5'-некодирующего участка гена а1-тубулина с помощью несущих замены конструкций было показано, что замена нуклеотидов в областях между позициями -95 и -85, -65 и -55, -35 и -26 и между позициями -19 и -4 п H относительно точки начала транскрипции не меняет эффективности транскрипции гена, что свидетельствует об отсутствии регуляторных последовательностей в этих областях Замена нуклеотидов в областях между позициями -85 и -65, -52 и -34 и между -7 и +2 п н значительно снижает эффективность транскрипции, но никак не влияет на корректность инициации транскрипции Замена нуклеотидов в области между -27 и -18 п н приводит как к снижению эффективности транскрипции, так и к появлению двух дополнительных продуктов реакции обратной транскрипции, соответствующих аберрантным точкам начала синтеза мРНК (рис 2)

Рассмотренные участки молекулы ДНК, функциональная роль которых доказана, соответствуют локализации таких классических эукариотических элементов промотора, как инициатор (+2 -7 п н ), ТАТА-бокс (-20 -27 п н ) и СААТ-бокс (—44 -52 п н ) Основываясь на литературных данных относительно строения классического эукариотического промотора генов класса II и нуклеотидного состава консервативных регуляторных элементов, можно сделать выводы о точном местоположении этих последовательностей в гене а1-тубулина S lemnae Так, СААТ-бокс, определяемый по формуле 5'-GG(T/C)CAATCT-3', имеет нукпеотидный состав САТАТ (-45 —49 п н ), ТАТА-бокс, определяемый по формуле 5'-ТАТА(А/Т)А(АЯ)-3',- ТАААТА (-23 -28 п н ), инициатор, определяемый по формуле YYANT/AYY,- ТАТАА, где второй нукпеотид А - точка начала транскрипции (рис 2) Таким образом, основываясь на полученных данных, можно говорить о том, что регуляция транскрипции гена а1-тубулина осуществляется по стандартной схеме с участием ТАТА-бокса и инициатора транскрипции

Интересным фактом является то, что замена нуклеотидов в области между -27 и -18 пн, то есть в области ТАТА-бокса, привела не только к снижению количеств синтезированной мРНК, но и к появлению дополнительных продуктов реакции обратной транскрипции, соответствующих аберрантным точкам начала транскрипции (рис 2) Причина этого может состоять в распределении функций регуляции между ТАТА-боксом и инициатором В норме функция присоединения фактора транскрипции TFIID и, соответственно, точного определения точки начала синтеза мРНК лежит на ТАТА-боксе В его отсутствие, инициатор выступает как нуклеотидная последовательность, определяющая точку начала транскрипции Действительно, в случае нарушения нуклеотидной последовательности ТАТА-бокса ТАТА-бокс связывающий белок (ТСБ) может связываться с молекулой ДНК с некоторым смещением, что приводит к неточному присоединению ТСБ -ассоциированных факторов (ТАФ) В результате вся функция определения точки начала транскрипции ложится на ТАФ, которые взаимодействуют с подходящими нуклеотидными последовательностями ТАА, присутствующими в необходимой области мутантной минихромосомы Таких нуклеотидных последовательностей в гене а1-тубулина три, что соответствует трем образующимся точкам начала транскрипции

При нарушении нуклеотидной последовательности инициатора и сохранении ТАТА-бокса снижение интенсивности транскрипции может быть вызвано тем, что ТСБ, распознавая необходимую последовательность, связывается с молекулой ДНК точно в области ТАТА-бокса Это взаимодействие пространственно обуславливает место присоединения ТАФ, эффективность взаимодействия которых с молекулой ДНК резко падает в отсутствие необходимой нуклеотидной последовательности ТАА инициатора

Как показано в экспериментах с нуклеотидными заменами в области промотора гена а1-тубулина, в регуляции синтеза мРНК принимают участие и дополнительные нуклеотидные последовательности, такие как СААТ-бокс

СААТ-бокс является типичным для эукариот элементом промотора (Жимулев, 2002) При этом его функция заключается в контроле первоначального связывания РНК-полимеразы II с промотором, что, в свою очередь, обеспечивает правильное позиционирование прединициационного комплекса транскрипции на соответствующем сегменте молекулы ДНК Известно, что если промотор содержит только инициатор транскрипции и отсутствуют другие основные транскрипционные факторы, очищенная РНК-полимераза II инициирует транскрипцию малоэффективно (Carcamo et al, 1991) Некоторые другие данные, например снижение эффективности транскрипции в результате сайт-специфических мутаций последовательностей ДНК, расположенных в определенных областях промотора, также подтверждают предположение о том, что СААТ-бокс модулирует эффективность транскрипции у эукариот (McKnight, Kingsbury, 1982, Graves et al, 1986, Barberis et al, 1987) По-видимому, у S lemnae СААТ-бокс в гене, кодирующем а1-тубулин, также играет роль вспомогательного элемента кор-промотора, усиливающего эффективность транскрипции этого гена

Анализ 5'-некодирующего участка гена а1-тубулина с помощью несущих замены конструкций позволил идентифицировать еще одну функционально значимую последовательность, нарушение нукпеотидного состава которой приводит к достоверному снижению интенсивности транскрипции Участок молекулы ДНК, расположенный между -85 и -65 п н левее точки начала транскрипции, по своему расположению соответствует так называемым дополнительным элементам регуляции, среди которых у эукариот наиболее часто встречается GC-бокс, или энхансер (Hoffman et al , 1995, Жимулев, 2002) Местоположение этих элементов не является одинаковым для разных генов и варьирует в районе 50-150 пн левее точки начала транскрипции В гене а1-тубулина S lemnae дополнительный регуляторный элемент, работающий по принципу энхансера, расположен внутри нуклеотидной последовательности TTAAGATCCCCTTATCAAA (-65 и -86п н) (рис 2) Сопоставление рассматриваемых данных с литературными данными относительно регуляции транскрипции генов класса II эукариотических организмов позволяет утверждать, что в промоторе гена а1-тубулина S lemnae присутствует GC-бокс Допуская возможность некоторых отклонений от классической нуклеотидной последовательности GC-бокса, которая представлена нуклеотидами 5'- GGGCGGG -3' или 5'-CCCGCCC -3', можно сделать предположение, что в гене а1-тубулина S lemnae GC-бокс представлен нуклеотидами GATCCC, расположенными между позициями -75 и -82 п н (рис 2)

Определение точек начала транскрипции в генах инфузорий-спиротрих

В результате секвенирования исследуемых генов - a1-, cc2-, ß1-, р2-тубулина, белка теплового шока 70 и катепсина - были определены нуклеотидные последовательности в области точек начала транскрипции и трансляции Во всех случаях определенные таким образом нуклеотидные последовательности совпадали с установленными ранее при секвенировании соответствующих минихромосом (Helftenbein, 1985, Conzelmann, Helftenbein, 1987, Helftenbein, Muller, 1988, Helftenbein et al, 1989, Steinbruck, 1990)

При использовании сочетания секвенирования и обратной транскрипции, были определены точки начала транскрипции в исследуемых генах Согласно нашим данным в генах a1-, a2-, ß1-, р2-тубулина, белка теплового шока и катепсина синтез

мРНК начинается с нуклеотидов, расположенных на 38, 38, 28, 36, 34 и 11 п н левее точки начала трансляции, соответственно (рис 3)

В ходе экспериментов по определению точек начала транскрипции нами было обнаружено, что в случае использования в реакции секвенирования нефосфорилированных праймеров, что рекомендуется стандартным протоколом, на получаемой фотографии ПАА геля наблюдается явный сдвиг электрофоретических полос, который затрудняет точное толкование результата Мы определили, что причина этого состоит в присутствии фосфорилированных групп на 5'-конце праймеров, используемых в реакции обратной транскрипции, и их отсутствии у праймеров для секвенирования Такого сдвига полос можно избежать при использовании в реакции секвенирования праймеров, фосфорилированных нерадиоактивным фосфором

Результаты, полученные нами при экспериментальном определении точек начала транскрипции в генах тубулина инфузории S lemnae, отличаются от ранее опубликованных данных (Helftenbein, 1985, Conzelmann, Helftenbein, 1987, Helftenbein, Muller, 1988, Helftenbein et al, 1989, Steinbruck, 1990, Skovorodkin et al, 1999) При этом в рассматриваемой литературе также наблюдаются некоторые расхождения в результатах экспериментов по определению нуклеотидов, с которых начинается синтез мРНК Классическим способом определения точек начала транскрипции, популярным у большинства исследователей, является так называемый метод "Si nuclease mapping", основанный на гибридизации меченных по 5'- или З'-концу двухцепочечных фрагментов молекулы ДНК и тотальной РНК организма с последующим расщеплением двухцепочечных молекул нуклеазой Si (Conzelmann, Helftenbein, 1987, Helftenbein, Muller, 1988) Существует вероятность того, что ДНК-РНК-гибридизация может происходить неоднозначно при различных повторностях опыта в виду образования разного рода петель и шпилек в молекуле РНК, что допускается температурным режимом реакции В результате, комплекс ДНК-РНК и, следовательно, конечный продукт расщепления может варьировать по длине, что приведет к неправильному определению точки начала транскрипции

Другой вариант определения точек начала транскрипции, опробованный на ряде генов инфузорий родов Euplotes и Stylonychia и основанный на совместном использовании реакций обратной транскрипции и секвенирования, дает возможность избежать ошибок и неточностей метода "Si nuclease mapping", однако также таит в себе ряд трудностей Обнаруженный нами сдвиг электрофоретических полос, соответствующих продуктам реакции обратной транскрипции, относительно электрофоретических полос реакции секвенирования на ПАА геле при использовании стандартных протоколов делает невозможным точное определение нукпеотида, с которого начинается синтез мРНК Именно это, по нашему мнению, и явилось причиной неточностей и отсутствия однозначных выводов в опубликованных ранее работах (Kaufmann, Klein, 1992, Ghosh et al, 1994, Bender, Klein, 1997, Skovorodkin et al , 1999)

Основываясь на полученных данных, мы пришли к заключению, что наиболее адекватным и точным методом определения точек начала транскрипции как в генах тубулина S lemnae, так и в ряде других генов брюхоресничных инфузорий является совместное использование реакций секвенирования и обратной транскрипции При этом обязательным шагом при подготовке материала для реакции секвенирования является фосфорилирование праймеров нерадиоактивным фосфором

Индукция транскрипции генов <*1- и а2-тубулина инфузории S lemnae

Для проведения экспериментов по изучению механизмов, контролирующих индукцию транскрипции гена а2-тубулина S lemnae, была создана конструкция, в которой участок 5-некодирующей области гена а1-тубулина между позициями -21 и -174 пн относительно точки начала транскрипции был заменен на нуклеотидную последовательность из промоторной области гена а2-тубулина, расположенную между позициями -21 и -92 п н относительно точки начала транскрипции Выбор области замен определялся, с одной стороны, предположением о том, что регуляторный элемент, контролирующий индукцию а2-тубулина, расположен в промоторной области гена, а, с другой стороны, необходимостью исключить возможное влияние различий в стабильности мРНК а1- и а2-тубулина

В результате анализа мРНК инфузорий, не обработанных конканавалином А, которые использовались в качестве контроля, и мРНК инфузорий, обработанных конканавалином А, было показано, что ген а2-тубулина индуцируется в большей степени, чем ген а1-тубулина, что согласуется с данными литературы (Witte et al, 1995) Анализ мРНК, синтезированной на мутантной конструкции, показал, что транскрипция данной искусственной минихромосомы и гена а2-тубулина индуцировалась при воздействии конканавалина А одинаково Таким образом было показано, что индукция транскрипции гена а2-тубулина контролируется последовательностью промотора длиной 36 п н , расположенной между позициями -21 и -92 п н относительно точки начала транскрипции

Сравнение экспериментальных данных по строению промотора гена а1-тубулина S lemnae с данными по другим генам инфузорий-спиротрих

Сопоставление экспериментальных данных по трансформации инфузории S lemnae векторами, синтезированными на основе минихромосы, несущей ген а1-тубулина, с данными по другим генам S lemnae, точка начала транскрипции в которых была определена нами экспериментально, дает возможность говорить об идентичности нуклеотидного состава ТАТА-бокса и инициатора в этих генах (рис 3)

Действительно, ТАТА-бокс в генах а1-, а2- и р2-тубулина представлен последовательностью ТАААТА, расположенной в случае генов <*1- и а2-тубулина в позиции -23 п н , а в случае р2-тубулина - в позиции -24 п н относительно точки начала транскрипции Строение ТАТА-бокса в промоторе гена ßl-тубулина несколько отличается, он представлен нуклеотидами ТАТАА, расположенными в позиции -24 п н относительно точки начала транскрипции (рис 3)

Определение точек начала транскрипции в генах a1-, a.2-, ß1-, р2-тубулина S lemnae, а также катепсина и белка теплового шока 70, позволило охарактеризовать нуклеотидную последовательность инициатора - классического регуляторного элемента, функциональное значение которого в гене а1-тубулина было нами экспериментально доказано При сравнительном анализе данных видно присутствие сходных нукпеотидных последовательностей в области нуклеотида, с которого начинается синтез мРНК (рис 3) Так, в генах катепсина, а1-, а2- и ß2-тубулина это нукпеотидная последовательность ТАТАА, в генах ßl-тубулина и белка теплового шока последовательность несколько иная - АТТАА Однако во всех генах присутствует последовательность ТАА, где первый нуклеотид А является точкой начала транскрипции (рис 3)

ai- rvSyrant ATCTTAAATA СТГАААПТА ACTACTWrttr.ATAAJTTA-ПТ CATTTTJTCA AACAAAATCA ACTCTTCATC ЙТС

-32 ~~ " "-22 -12 -2 8 *•} »11 + 28 +38

02- vySymm CCTA7AAA7& GCGAAA7MA STGSGAAAljT ATMjCTTTAT TTTATATTAA AACAAAATCA AATCTTCATC ST8

-32 -22 -1? -2 0 +7 + 17 +28 »38

£.1- губу8и ТАААТТТГАА ATTCAGAGAA T5AATA7AAG GATACCAATT TTAABAAGifk TTAAftTATTC TTAATTTTCA AAAACAAACC ЙТС

-12 -22 -12_ -2 0 +7 +17 +28

f><2- ту&уяин TSTTATMAT ATGC&CCCTC TCTMCTMT ^ГАТАДТТСА ААТААТПТС AAMCAAAAC TCAAGTCACA ЖТ&

-34 -24 -14 -4 8 +5 +15 +25 +35

Ks?encJM ТАЛ TTATAGTCAC TAOSATCCAA ATTAAlfSTA AAfrAATTATA STG

-29 . -19 -9 0 +10

белок теплового вока H?p70 ТСАТГАТ TTAAGAGCGC TTAGTTAAAT CAAGAITA/j'r TGTTAAATAA AGA7ACCCTA ACAAACACAA 4TC

-27 -17 -7 0 +2 +12 +22 +32

-78 -60 -3« -40 -30 -20 -10 0

Рис 3 Сравнительный анализ промоторных областей генов тубулина, белка теплового шока 70 и катепсина инфузории Stylonychia lemnae

Представлены нуклеотидные последовательности 5-некодирующих участков минихромосом Триплеты ATG, с которых начинается кодирующая область генов, выделены жирным шрифтом, точки начала транскрипции, определенные экспериментально, подчеркнуты одинарной линией, предполагаемые нуклеотидные последовательности инициаторов транскрипции заключены в рамки, предполагаемые нуклеотидные последовательности ТАТА-боксов подчеркнуты одинарной линией

Эти данные позволяют утверждать, что по крайней мере в исследованных генах инфузории S lemnae присутствует консервативный эукариотический регуляторный элемент - инициатор, ранее не описанный у инфузорий При этом, в нуклеотидный состав инициатора входит последовательность ТАА, в которой первый нукпеотид А является точкой начала транскрипции

Сходство нуклеотидного состава ТАТА-бокса и инициатора в исследованных генах побудило нас провести сравнительно-молекулярный анализ и других генов брюхоресничных инфузорий, точка начала транскрипции в которых была определена другими авторами Наряду с этим мы решили исследовать промоторные области в генах а1-, a2-, J31- и р2-тубулина, а также катепсина и белка теплового шока у таких представителей типа Ciliophora, как Euplotes, Sterkiella (Oxytricha), Paramecium и Tetrahymena

Основываясь на сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей, окружающих точку начала транскрипции, в генах, исследованных другими авторами, можно распространить гипотезу о наличии инициатора и на другие гены брюхоресничных инфузорий родов Stylonychia и Sterkiella (Oxytricha) Так, консервативная последовательность инициатора ТАТАА была найдена во всех 9 исследованных генах инфузорий рода Stylonychia и в 6 из 9 генах инфузорий рода Sterkiella (Oxytricha) В трех генах инфузорий рода Sterkiella (Oxytricha) было обнаружено смещение консервативной последовательности инициатора на 3 п н относительно точки начала транскрипции Эти данные позволяют утверждать, что, по крайней мере, в исследованных генах присутствует консервативный эукариотический регуляторный элемент - инициатор, ранее не описанный у инфузорий

Поиск ТАТА-бокс-подобных последовательностей в представленных генах инфузорий родов Stylonychia и Sterkiella (Oxytricha) дал более противоречивые результаты ТАТА-бокс, имеющий консервативную последовательность ТААТА, установленную нами в результате анализа генов а1-, a2-, р1- и р2-тубулина S lemnae, был обнаружен только в трех из шести генах инфузорий родов Stylonychia и в пяти из восьми генах инфузорий рода Sterkiella (Oxytricha)

В ходе сравнительно-молекулярного анализа нуклеотидных последовательностей промоторных областей в генах a1-, a2-, pi- и р2-тубулина, а также катепсина и белка теплового шока, у таких представителей типа Ciliophora, как Euplotes, Sterkiella (Oxytricha), Paramecium и Tetrahymena, мы столкнулись с тем, что в указанных генах точка начала транскрипции еще не определена ни одним исследователем В соответствии с этим на основании имеющихся нуклеотидных последовательностей нами были сделаны предположения относительно нуклеотидного состава ТАТА-бокса и инициатора, а также местоположения точки начала транскрипции В результате, нуклеотидные последовательности, которые могли бы соответствовать инициатору, были обнаружены в 10 генах из 13 В соответствии с предполагаемым положением точки начала транскрипции ТАТА-бокс-подобные последовательности были обнаружены в 7 генах

Подводя итог сравнительно-молекулярному анализу генов класса II различных представителей типа Ciliophora, можно прийти к выводу, что, по крайней мере, в ряде генов этих животных присутствуют такие классические нуклеотидные последовательности, как инициатор и ТАТА-бокс При этом поиск этих элементов регуляции транскрипции с помощью сравнительно-молекулярных методов возможен только тогда, когда точка начала транскрипции определена экспериментально В этом случае, при нахождении классических последовательностей ТАТА-бокса и

инициатора, можно говорить о механизмах регуляции транскрипции в исследуемых генах

Наряду с ТАТА-боксом и инициатором в состав промотора генов класса II инфузорий могут входить дополнительные элементы регуляции, как консервативные для эукариот (СААТ-бокс и СС-бокс), так и специфические (энхансеры и репрессоры) Определение присутствия, нуклеотидного состава и местоположения дополнительных элементов регуляции возможно только экспериментально ввиду сильной вариабельности их нуклеотидного состава

ВЫВОДЫ

1 У инфузории 5(у/олус/иа /етпае 5'-некодирующая область минихромосомы, несущей ген и1-тубулина, содержит следующие нуклеотидные последовательности, необходимые для корректной инициации транскрипции

(а) инициатор, имеющий нуклеотидный состав ТАТАА, где второй нукпеотид А - точка начала транскрипции,

(в) СААТ-бокс, имеющий нуклеотидный состав САТАТ и расположенный между позициями -45 и -49 п н левее точки начала транскрипции,

(г) энхансер - вС-бокс, имеющий нуклеотидный состав вАТССС и расположенный между позициями -75 и -82 п н левее точки начала транскрипции,

(д) репрессор, расположенный между позициями -155 и -114 п н левее точки начала транскрипции

2 Способность гена а2-тубулина инфузории в 1етпае к индукции пектином конканавалином А регулируется индуктором, расположенным в промоторной области гена длиной 36 п н между позициями -21 и -92 п н левее точки начала транскрипции

3 Регуляция транскрипции генов класса II у представителей типа СНюрИога осуществляется при участии промоторов разного строения Промоторы генов класса II этих организмов могут быть подразделены на три основные группы

(б) промоторы, также характерные для многих эукариот и содержащие наряду с ТАТА-боксом и инициатором ряд дополнительных регуляторных элементов, таких как СААТ-бокс, вС-бокс, различные энхансеры и репрессоры,

4 Наиболее адекватным методом определения точек начала транскрипции как в генах тубулина 5 Iетпае, так и в некоторых других генах брюхоресничных инфузорий является сопоставление результатов секвенирования и обратной транскрипции При этом обязательным условием при подготовке материала для проведения секвенирования является фосфорилирование праймеров нерадиоактивным фосфором

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Pimenov А , Zassoukhina I В , Ammermann D , Skovorodkin I N 2002 Characterization of transcription initiator in alpha and beta tubulin genes of Stylonychia lemnae In 21 Jahrestagung der deutschen Gesellschaft fuer Protozoologie Konstanz 35

2 Пименов А Ю , Райхепь И Б , Сковородкин И Н , Подлипаева Ю И , Скарлато С О 2006 Stylonychia lemnae - модельный объект для изучения минихромосом макронуклеуса инфузорий Цитология 48(8) 619-635

3 Skovorodkin I, Pimenov А , Raykhel I, Schimanski В , Ammermann D , Gunzl А 2007 Analysis of a-tubulin minichromosome promoters in the stichotrichous ciliate Stylonychia lemnae Eukaryot Cell 6 28-36

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Догель В А 1981 Зоология беспозвоночных М Высшая школа 606 с , Жимулев И Ф 2002 Общая и молекулярная генетика Новосибирск Изд-во Новосиб ун-та 459 с , Осипов Д В 1981 Проблемы гетероморфизма ядер у одноклеточных организмов Л Наука 167 с , Райков И Б 1978 Ядро простейших Морфология и эволюция Л Наука 328 с , Райхепь И Б 2003 Регуляторные участки ДНК в минихромосомах инфузории Stylonychia lemnae, несущих гены а1- и р2-тубулина Автореф канд дисс СПб СПб гос политех ун-т 26 с , Ammermann D eta! 1974 Chromosoma 45 401-429, Ausubel F M etal, 1989 Current protocols in molecular biology, Green Publ Ass , Barberis A etal 1987 Cell 50 347-359, Berger J D 1982 Exp Cell Res 141 261 -275, Brusca R, Brusca G 2002 Invertebrates 2nd ed p 936, CarcamoJ etal 1991 Proc Nat Acad Sei USA 88 8052-8056, Conzelmann К К, Helftenbem E 1987 J Mol Biol 198 643-653, Frisch A etal 1976 J Protozool 23 427-430, GhoshS etal 1994 Nud Acids Res 22 214-221, Goode В L, Feinstem SC 1992 BioTechniques 12 148-149, Graves В J etal 1986 Cell 44 565-576, Helftenbem E 1985 Nucl Acids Res 13 415-433, Helftenbem E etal 1989 Eur J Protistol 25 158-167, Helftenbem E, Muller E 1988 Curr Genet 13 425-432, Hoffman DC etal 1995 Macronuclear gene-sized molecules of hypotnchs Nucl Acids Res 23 1279-1283, Kaufmann J, Klein A 1992 Nucl Acids Res 20 44454450, Klobutcher L A , Prescott D M 1986 The special case of the hypotnchs In The molecular biology of ciliated protozoa NY Acad Press 111-154, Lee TH, Young RA 2000 Annu Rev Genet 34 77-137.McKmghtS L, Kingsbury R 1982 Science 217 316-324, Skovorodkin IN etal 1999 Europ J Protistol 35 70-80, SambrookJ etal 1989 Molecular cloning A laboratory manual 2nd ed 1-3 Cold Spring Harbor Lab Press, Witte et al 1995 Europ J Protistol 31 268-274

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 16 04 2007 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 1517Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пименов, Александр Юрьевич

Страница

Список сокращений.,

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Особенности организации генома инфузорий.

1.2 Stylonychia lemnae - удобный модельный объект для изучения организации генома спиротрих.

1.2.1 Особенности морфологической и ультраструктурной организации макронуклеуса S. lemnae.

1.2.2 Минихромосомы макронуклеуса S. lemnae.

1.3 Регуляция и индукция транскрипции генов класса I) эукариотических организмов.

1.3.1 Основные механизмы регуляции транскрипции генов класса II эукариотических организмов.

1.3.2 Регуляция транскрипции генов класса II у инфузорий-спиротрих.

Цель и задачи исследования.

Гпава 2. Материал и методика.

Объект исследования.

Светооптические методы исследования инфузорий.

Электронно-микроскопические методы исследования инфузорий.

Исследуемые гены.

Олигонукпеотиды.

Трансфецирование клеток S. lemnae исскуственными

ДНК-минихромосомами

Анализ ДНК S. /етлае.

Секвенирование.

Фосфорилирование праймеров.

Наращивание плазмид, содержащих исследуемые гены.

Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.

Подбор праймеров для секвенирования и обратной транскрипции.

Выделение тотальной ДНК инфузорий.

Пропорциональная ПЦР.

Рестрикция ДНК.

Лигирование фрагментов ДНК.

Обработка ДНК ферментом Кленова.

Стандартная ПЦР.

Оценка интенсивности транскрипции инъецированных конструкций.

Анализ РНК S. /ешпае.

Обратная транскрипция.

Выделение макронуклеарной РНК инфузорий.

Электрофорез в лолиакриламццных гелях.

Электрофорез в агарозных гелях.

Определение точки начала транскрипции.

Индукция синтеза тубулина.

Глава 3. Результаты.

3.1 Светооптические и электронно-микроскопические исследования инфузорий.

3.2 Котрансфекция инфузорий S. lemnae.

3.2.1 Котрансфекция инфузорий S. lemnae векторами на основе минихромосомы, несущей ген а1-тубулина.

3.2.2 Делеционный анализ 5'-некодирующего участка гена а1-тубулина.

3.2.3 Анализ 5'-некодирующего участка гена а1-тубулина с помощью конструкций, несущих нуклеотидные замены.

3.3 Определение точек начала транскрипции.

3.4 Индукция транскрипции генов а1- и а2-тубулина инфузории S. lemnae.

3.5 Сравнение экспериментальных данных по строению промотора гена a 1-тубулина S. lemnae с данными по другим генам инфузорий-спиротрих.

Глава 4. Обсуждение.

4.1 Котрансфекция инфузорий S. lemnae.

4.1.1 Котрансфекция инфузорий S. lemnae векторами на основе минихромосомы несущей ген а1-тубулина.

4.1.2 Делеционный анализ 5'-некодирующего участка гена а1-тубулина.

4.1.3 Анализ 5'-некодирующего участка гена а1-тубулина с помощью конструкций, несущих нуклеотидные замены.

4.2 Определение точек начала транскрипции генов инфузорий-спиротрих.

4.3 Индукция транскрипции генов а1- и а2-тубулина инфузории S. lemnae.

4.4 Сравнение экспериментальных данных по строению промотора гена а1-тубулина S. lemnae с данными по другим генам инфузорий-спиротрих.

Глава 5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция транскрипции генов класса II у инфузории Stylonychia lemnae"

Инфузории (тип Ciliophora) являются одними из наиболее высоко организованных представителей царства Protista (Догель, 1981; Brusca, Brusca, 2002). Многие аспекты их строения, локомоции, размножения и организации ядерного аппарата на протяжении многих лет привлекают исследователей из разных областей науки. Большой интерес для исследований в области клеточной и молекулярной биологии представляет группа брюхоресничных инфузорий, которые ввиду особенностей организации их генома являются удобными модельными объектами для экспериментов1.

Ядерный гетероморфизм, характерный для всего типа Ciliophora, представлен у инфузорий-спиротрих наиболее ярко (Осипов, 1981; Klobutcher, Prescott, 1986). ДНК в транскрипционно активном макронуклеусе этих животных представлена короткими линейными молекулами - минихромосомами -кодирующими, как правило, один единственный ген. Таким образом, каждый макронуклеарный ген представляет собой автономную репликационную и транскрипционную единицу (Осипов, 1981; Klobutcher, Prescott, 1986).

Такая организация генетического материала наиболее удобна для изучения процессов реализации генетической информации, в том числе и регуляции инициации транскрипции (Пименов и др., 2006). Действительно, все регуляторные элементы молекулы ДНК, необходимые для корректной инициации транскрипции, сосредоточены в сравнительно короткой лидерной фланкирующей области минихромосомы, что значительно сужает диапазон исследования.

1 В настоящей работе мы придерживаемся классификации, согласно которой тип Ciliophora включает класс Spirotrichea, содержащий отряды Spirotrichida (род Stylonychia и род Oxitricha (Sterkiella) и Hypotrichida (род Euplotes), класс Oligohymenophorea (род Tetrahymena) и класс Nassophorea (род Paramecium) (Lynn, Small, 1985). При этом представителей отрядов Spirotrichida и Hypotrichida исторически принято объединять в группу брюхоресничных инфузорий, поэтому, говоря о родах Stylonychia, Oxitricha (Sterkiella) и Euplotes, мы будем использовать в равной степени термины брюхоресничные инфузории и инфузории-спиротрихи.

Одновременно с этим, изучение представителей типа Ciliophora привело исследователей к выводам об отсутствии в генах класса II этих организмов описанных классических элементов регуляции (Ghosh et al., 1994). Причина этого заключается в том, что основным методом большинства исследователей служил теоретический анализ нуклеотидных последовательностей различных генов с целью поиска уже известных регуляторных нуклеотидных последовательностей в их классических положениях (так называемый сравнительно-молекулярный метод) (Пименов и др., 2006; Helftenbein, 1985; Conzelmann, Helftenbein, 1987; Helftenbein, Muller, 1988; Helftenbein etal., 1989; Steinbruck, 1990). При этом экспериментальная проверка соответствующих областей минихромосомы отсутствовала, что ставит под сомнение все выводы, сделанные исследователями.

Появившееся в литературе большое количество противоречивых данных относительно состава основного промотора генов класса II представителей типа Ciliophora дало толчок к разработке экспериментальных подходов в изучении рассматриваемого вопроса (Пименов и др., 2006). Так, научно-исследовательской фуппой, в которую входит автор настоящей диссертации, с использованием инфузории-спиротрихи Stylonychia lemnae в качестве модельного объекта, был разработан метод котрансфекции инфузорий мутантными векторами, содержащими делеции и нуклеотидные замены в интересующих участках 5-некодирующей области гена, что позволяет с точностью локализовать присутствующие регуляторные последовательности ДНК (Skovorodkin et al., 1999). С использованием рассматриваемого метода был частично проанализирован промотор гена а1-тубулина S. lemnae (Pimenov et al., 2002; Zassoukhina et al., 2002; Райхель, 2003; Пименов и др., 2006; Skovorodkin, Pimenov et al., 2007). Были найдены такие классические элементы регуляции как СААТ-бокс, ТАТА-бокс и инициатор, ранее не описанные для генов S. lemnae. При этом инициатор был описан для генов инфузорий-спиротрих впервые.

К моменту написания настоящей диссертации мы завершили изучение гена а1-тубулина S. lemnae с целью получить полную схему элементов регулирующих транскрипцию этого гена, а также провести сравнительный анализ строения промотора генов S. lemnae и других инфузорий на основе анализа данных литературы и собственных результатов.

В результате проведенной экспериментальной работы были получены данные, расширяющие представление о механизмах регуляции транскрипции генов класса II представителей типа Ciliophora.

1. Впервые для промоторной области гена а1-тубулина S. lemnae описаны такие классические эукариотические регуляторные нуклеотидные последовательности, как СААТ-бокс, ТАТА-бокс и инициатор.

2. Впервые для генов класса II инфузорий-спиротрих на примере гена а1-тубулина S. lemnae были экспериментально найдены и описаны дополнительные регуляторные нуклеотидные последовательности ДНК -энхансер и репрессор.

3. Впервые для генов класса II инфузорий-спиротрих путем экспериментального анализа генов а1- и а2-тубулина S. lemnae была локализована нуклеотидная последовательность в составе основного промотора, контролирующая индукцию транскрипции гена а2-тубулина.

Материалы диссертации были представлены на 21-м ежегодном съезде Немецкого протозоологического общества (Pimenov et al, 2002), в двух статьях (Пименов и др., 2006; Skovorodkin, Pimenov et al., 2007), а также на научных семинарах Лаборатории цитологии одноклеточных организмов Института цитологии РАН.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Пименов, Александр Юрьевич

Выводы

1. У инфузории Stylonychia lemnae 5'-некодирующая область минихромосомы, несущей ген а1-тубулина, содержит следующие нуклеотидные последовательности, необходимые для корректной инициации транскрипции: а) инициатор, имеющий нуклеотидный состав ТАТАА, где второй нуклеотид А - точка начала транскрипции; б) классический ТАТА-бокс, представленный нуклеотидной последовательностью ТАААТА и расположенный между позициями -23 и -28 п.н. левее точки начала транскрипции; в) СААТ-бокс, имеющий нуклеотидный состав САТАТ и расположенный между позициями -45 и -49 п.н. левее точки начала транскрипции; г) энхансер - GC-бокс, имеющий нуклеотидный состав GATCCC и расположенный между позициями -75 и -82 п.н. левее точки начала транскрипции; д) репрессор, расположенный между позициями -155 и -114 п.н. левее точки начала транскрипции.

2. Способность гена а2-тубулина инфузории S. lemnae к индукции лектином конканавалином А регулируется индуктором, расположенным в промоторной области гена длиной 36 п.н. между позициями -21 и -92 п.н. левее точки начала транскрипции.

3. Регуляция транскрипции генов класса II у представителей типа Ciliophora осуществляется при участии промоторов разного строения. Промоторы генов класса II этих организмов могут быть подразделены на три основные группы: а) промоторы, построенные по классической схеме, характерной для многих эукариот, и содержащие только ТАТА-бокс и инициатор; б) промоторы, также характерные для многих эукариот и содержащие наряду с ТАТА-боксом и инициатором ряд дополнительных регуляторных элементов, таких как СААТ-бокс, GC-бокс, различные энхансеры и репрессоры; в) промоторы, содержащие специфические регуляторные нуклеотидные последовательности, характерные для некоторых генов и групп инфузорий.

4. Наиболее адекватным методом определения точек начала транскрипции как в генах тубулина S. lemnae, так и в некоторых других генах брюхоресничных инфузорий является сопоставление результатов секвенирования и обратной транскрипции. При этом обязательным условием при подготовке материала для проведения секвенирования является фосфорилирование праймеров нерадиоактивным фосфором.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пименов, Александр Юрьевич, Санкт-Петербург

1. Борхсениус С. Н., Белозерская Н. А., Меркулова Н. А., Ирлина И. С., Винникова Н. В. 1977. Ультраструктурные изменения макронуклеусов Dileptus anser O.F.M. во время конъюгации. Acta protozool. 13: 97-107.

2. Винникова Н.В. 1974. Ультраструюурные изменения макронуклеусов Dileptus anser O.F.M. во время конъюгации. Acta protozool. 13:97-107.

3. Воробьев В. И. 1977. Возможность неоднократной репликации части ядерной ДНК инфузории Tetrahymena в течение одного S-периода. Мол. биол. 11 (1): 171-180.

4. Догель. 1981. Зоология беспозвоночных. М.: Высшая школа. 606 с.

5. Жимулев И. Ф. 2002. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Изд. Новосиб. ун-та. 459 с.

6. Осипов Д. В. 1981. Проблемы гетероморфизма ядер у одноклеточных организмов. Л.: Наука. 167 с.

7. Пименов А.Ю., Райхель И.Б.,. Сковородкин И.Н., Подлипаева Ю.И., Скарлато С.О. 2006. Stylonychia lemnae модельный объект для изучения минихромосом макронуклеуса инфузорий. Цитология, 48(8):619-35.

8. Райков И. Б. 1978. Ядро простейших. Морфология и эволюция. Л.: Наука. 328 с.

9. Райков И. Б. 1989. Ядерный геном простейших. В кн.: Организация генома. М.: Наука. 110-154.

10. Райков И. Б. 1992. Ядерная дифференцировка и гетероморфизм ядер у простейших. Цитология. 34 (7): 3-16.

11. Райков И. Б., Аммерманн Д. 1976. Новые успехи в изучении макронуклеуса инфузорий. В кн.: Кариология и генетика простейших, изд. Л.: Наука. 1: 64-90.

12. Райхель И. Б. 2003. Регуляторные участки ДНК в минихромосомах инфузории Stylonychia lemnae, несущих гены а1- и р2-тубулина: Автореф. канд. дисс. СПб: СПб гос. политех, ун-т. 26 с.

13. Сергеева Г. И. 1977. О структуре хроматина макронуклеуса инфузории Bursaria truncatella. Цитология. 19 (7): 3-16.

14. Скарлато С. О. 1977. Ультраструктура ядерного аппарата инфузории Stentor coeruleus. Цитология. 19 (5): 478-483.

15. Скарлато С. О. 1978. Элекгронномикроскопическое исследование изменения макронуклеуса инфузории Stentor coeruleus в процессе конъюгации. Цитология. 20 (6): 607-611.

16. Aigner S., Cech Т. R. 2004. The Euplotes telomerase subunit p43 stimulates enzymatic activity and processivity in vitro. RNA. 10:1108-1118.

17. Alonso P. 1978. Les chromosomes polytenes des cili6s. Ann. Biol. 17: 369386.

18. Ammermann D. 1964. Riesenchromosomenin der Makronucleusanlage des Ciliaten Stylonychia spec. Naturwissenschaften. 51: 249.

19. Ammermann D. 1965. Cytologische und genetische Untersuchungen an dem Ciliaten Stylonychia mytilus Ehrenberg. Arch. Protistenk. 108:109-152.

20. Ammermann D. 1970. The micronucleus of the ciliate Stylonychia mytilus', its nucleic acid synthesis and its function. Exp. Cell Res. 61:6-12.

21. Ammermann D. 1971. Morphology and development of the macronuclei of the ciliates Stylonychia mytilus and Euplotes reticulates. Chromosoma. 33: 209238.

22. Ammermann D. 1987. Giant chromosomes in ciliates. Results Probl. Cell Differ. 14: 59-67.

23. Ammermann D. 1990. The contribution of hypotrichous ciliates to our understanding of molecular biology and evolution of ciliates. Zool. Sci. Suppl. 7: 13-22.

24. Ammermann D., HellmerK. H., Zassoukhina I., Skovorodkin I. 2003. Response to X-ray- and cis Pt-induced DNA damage in Stylonychia lemnae (Ciliata, protozoa). Eur. J. Protistol. 39: 223-230.

25. Ammermann D., Schlegel M. 1983. Characterization of two sibling species of the genus Stylonychia (Ciliata, Hypotricha): S. mytilus Ehrenberg, 1838 and S. lemnae n. sp. I. Morphology and reproductive behavior. J. Protozool. 30: 290294.

26. Ammermann D., Steinbruck G., von BergerL., Hennig W. 1974. The development of the macronucleus in the ciliated protozoan Stylonychia mytilus. Chromosoma. 45:401-429.

27. Ardeii D. H., Lozupone C. A., LandweberL. F. 2003. Polymorphism, recombination and alternative unscrambling in the DNA polymerase alpha gene of the ciliate Stylonychia lemnae (Alveolata; class Spirotrichea). Genetics. 165: 1761-1777.

28. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R. E., Moore D.D., Seidmann J. G., Smith J. A., Struhl K. 1989 Current protocols in molecular biology; Green Publ. Ass.

29. Barberis A., Superti-Furga G., Busslinger M. 1987. Mutually exclusive interaction of the CCAAT-binding factor and of a displacement protein with overlapping sequences of a histone gene promoter. Cell. 50: 347-359.

30. Bardele C. F. 1969. Acineta tuberosa. II. The distribution of microtubules in the macronucleus during asexual reproduction. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 93. 93-104.

31. BergerJ. D. 1982. Effects of gene dosage on protein synthesis rate in Paramecium tetraurelia. Implications for regulation of cell mass, DNA content and the cell cycle. Exp. Cell Res. 141:261-275.

32. Bergemann J., Florian V., Kremser T. and Klein A. 1996. Two different macronuclear EF-1 alpha-encoding genes of the ciliate Euplotes crassus are very dissimilar in their sequences, copy numbers and transcriptional activities. Gene. 168:109-112.

33. Brusca, Richard C., Gary J. Brusca. 2002. Invertebrates, Second Edition, p. 936

34. Brunk C. F., Sadler L. A. 1990. Characterization of the promoter region of Tetrahymena genes. Nucl. Acids Res. 18: 323-329.

35. Carcamo J., BuckbinderL., Reinberg D. 1991. The initiator directs the assembly of a transcription factor IID-dependent transcription complex. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 88: 8052-8056.

36. CavalcantiA. R., Dunn D. M., Weiss R., Herrick G., LandweberL. F., Doak T. G. 2004a. Sequence features of Oxytricha trifailax (class Spirotrichea) macronuclear telomeric and subtelomeric sequences. Protist. 155: 311-322.

37. CavalcantiA. R., Stover N. A., Orecchia L., Doak T. G., LandweberL. F. 2004b. Coding properties of Oxytricha trifailax (Sterkiella histriomuscorum) macronuclear chromosomes: analysis of a pilot genome project. Chromosoma. 113:69-76.

38. Cleffmann G. 1975. Amount of DNA produced during extra S phases in Tetrahymena. J. Cell Biol. 66:204-209.

39. Cleffmann G. 1980. Chromatin elimination and the genetic organisation of the macronucleus in Tetrahymena thermophila. Chromosoma. 78: 313-325.

40. Conzelmann К. K, Helftenbein E. 1987. Nucleotide sequence and expression of two beta-tubulin genes in Stylonychia lemnae. J. Mol. Biol. 198: 643-653.

41. DoerderF. P., Lief J. H., DoerderL. E. 1975. A corrected table for macronuclear assortment in Tetrahymena pyriformis, syngen 1. Genetics. 80: 263-265.

42. Elsevier S. M., Lipps H. J., Steinbruck G. 1978. Histone genes in macronuclear DNA of the ciliate Stylonychia mytilus. Chromosoma. 69:291-306.

43. Foissner W., BergerH. 1999. Identification and Ontogenesis of the nomen nudum Hypotrichs (Protozoa: Ciliophora) Oxytricha nova (= Sterkiella nova sp. n.) and O. trifallax (= S. histriomuscorum). Acta protozool. 38: 215-248.

44. Fokin S. I., OssipovD. V. 1981. Generative nucleus control over cell vegetative functions in Paramecium. Acta protozool. 20: 51-73.

45. Frisch A, Bessler W., Lipps H.J., Ammermann D. 1976. Immobilization of ciliates by Concanavalin A. J. Protozool. 23:427-430.

46. Gamier O., Serrano V., Duharcourt S., Meyer E. 2004. RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell Biol. 24: 7370-7379.

47. Gaunitz C, Witte H., Gaunitz F. 1992. Primary structure of a gene-sized DNA encoding calmodulin from the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae. Gene. 119:191-198.

48. Ghosh S, Jaraczewski J. W„ KlobutcherL. A, Jahn C. L 1994. Characterization of transcription initiation, translation initiation, and poly(A) addition sites in the gene-sized macronuclear DNA molecules of Euplotes. Nucl. Acids Res. 22: 214-221.

49. Gil R., Alonso P., Perez-Silva J. 1972. Ultrastructure of the macronuclear anlage in Stylonychia mytilus. Exp. Cell Res. 72: 509-518.

50. Goode B. L, Feinstein S. C. 1992 "Speedprep" purification of template for double-stranded DNA sequencing., BioTechniques 12:148-149

51. Graves В. J., Johnson P. F., McKnight S. L 1986. Homologous recognition of a promoter domain common to the MSV LTR and the HSV tk gene. Cell. 44: 565-576.

52. Gray J. Т., CelanderD. W., Price С. M., Cech T. R. 1991. Cloning and expression of genes for the Oxytricha telomere-binding protein: specific subunit interactions in the telomeric complex. Cell. 67: 807-814.

53. Grell K. G. 1953. Die Konjugation von Ephelota gemmipara R. Hertwig. Arch. Protistenk. 98: 287-326.

54. Greslin A. F., Loukin S. H, Oka Y., Prescott D. M. 1988. An analysis of the macronuclear actin genes of Oxytricha. DNA. 7: 529-536.

55. Greslin A. F., Prescott D. M., Oka Y., Loukin S. H., Chappell J. C. 1989. Reordering of nine exons is necessary to form a functional actin gene in Oxytricha nova. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 86: 6264-6268.

56. Hahn S., Buratowski S., Sharp P. A., Guarente L. 1989. Yeast TATA-binding protein TFIID binds to TATA elements with both consensus and nonconsensus DNA sequences. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 86: 5718-5722.

57. Helftenbein E. 1985. Nucleotide sequence of a macronuclear DNA molecule coding for alpha-tubulin from the ciliate Stylonychia lemnae. Special codon usage: TAA is not a translation termination codon. Nucl. Acids Res. 13:415-433.

58. Helftenbein E, Conzelmann К. K., Becker K. F., Fritzenschaf H. 1989. Regulatory structure of gene expression, DNA-replication and DNA-rearrangement in macronuclear genes of Stylonychia lemnae, a Hypotrichous Ciliate. Eur. J. Protistol. 25:158-167.

59. Helftenbein E., MullerE. 1988. Both alpha-tubulin genes are transcriptionally active in Stylonychia lemnae. Curr. Genet. 13:425-432.

60. Hoffman D. C., Anderson R. C., DuBois M. L, Prescott D. M. 1995. Macronuclear gene-sized molecules of hypotrichs. Nucl. Acids Res. 23:12791283.

61. Hoyle H.D., Turner F.R, Brunick L.,Raff E.C. 2001. Tubulin sorting during dimerization in vivo. Mol. Biol. Cell. 12:2185-2194.

62. Hutchens J.A., Hoyle H.D., Turner F.R.,Raff E.C. 2001. Structurally similar Drosophila a-tubulins are functionally distinct in vivo. Mol. Biol. Cell. 8: 481-500.

63. Jahn С. L, Klobutcher L. A. 2002. Genome remodeling in ciliated protozoa. Ann. Rev. Microbiol. 56:489-520.

64. Javahery R., KhachiA., Lo K., Zenzie-Gregory В., Smale S. T. 1994. DNA sequence requirements for transcriptional initiator activity in mammalian cells. Mol. Cell Biol. 14:116-127.

65. Jonsson F., Steinbruck G., Lipps H. J. 2001. Both subtelomeric regions are required and sufficient for specific DNA fragmentation during macronuclear development in Stylonychia lemnae. Genome Biol. 2:1-5.

66. Kaney A. R., Speare V. J. 1992. A genetic screen for vegetative gene expression in the micronucleus of Tetrahymena thermophila. J. Protozool. 39: 323-328.

67. KarrerK. M. 1986. The nuclear DNAs of Holotrichous ciliates. In: The molecular biology of ciliated protozoa. New York: Acad. Press. 85-110.

68. Kaufmann J., Klein A. 1992 Gene dosage as a possible major determinant for equal expression levels of genes encoding RNA polymerase subunits in the hypotrichous ciliate Euplotes octocarinatus. Nucleic Acids Res. 20, pp. 44454450.

69. Kim C. S., PreerJ. R., Jr., Polisky B. 1992. Bacteriophage lambda DNA fragments replicate in the Paramecium macronucleus: absence of active copy number control. Dev. Genet. 13: 97-102.

70. Kimball R. F., Prescott D. M. 1962. Deoxyribonucleic acid synthesis and distribution during growth and amitosis of the macronucleus of Euplotes. J. Protozool. 9: 88-92.

71. Klobutcher L. A., Prescott D. M. 1986. The special case of the hypotrichs. In: The molecular biology of ciliated protozoa. New York: Acad. Press. 111-154.

72. Klobutcher L. A., Swanton M. Т., Donini P., Prescott D. M. 1981. All gene-sized DNA molecules in four species of hypotrichs have the same terminal sequence and an unusual 3' terminus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 78: 30153019.

73. Kloetzel J. A. 1970. Compartmentalizationof the developing macronucleus following conjugation in Stylonychia and Euplotes. J. Cell Biol. 47: 395-407.

74. Kraut H., Lipps H. J., Prescott D. M. 1986. The genome of hypotrichous ciliates. Int. Rev. Cytol. 99: 1-28.

75. Kreyenbeng И., Witte И., Ammermann D. 1998. A comparison of overamplified macronuclear chromosomes in the ciliate Stylonychia lemnae. Eur. J. Protistol. 34:29-38.

76. LandweberL. F., Кио Т. C., Curtis E. A. 2000. Evolution and assembly of an extremely scrambled gene. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 97: 3298-3303.

77. Larson D. D., Umthun A. R, Shaiu W. L. 1991. Copy number control in the Tetrahymena macronuclear genome. J. Protozool. 38: 258-263.

78. Lee Т.Н., YoungR.A. 2000. Transcription of eukaryotic protein-coding genes. Annu. Rev. Genet. 34: p. 77-137.

79. Lescasse R., Grisvard J., Fryd G., Fleury-Aubusson A., Baroin-Tourancheau A. 2005. Proposed function of the accumulation of plasma membrane-type Ca2+-ATPase mRNA in resting cysts of the ciliate Sterkiella histriomuscorum. Eukaryot. Cell. 4:103-110.

80. Li У., Flanagan P. M., Tschochner H„ Komberg R. D. 1994. RNA polymerase II initiation factor interactions and transcription start site selection. Science. 263: 805-807.

81. Lipps H. J., Nock A., Riewe M., Steinbruck G. 1978. Chromatin structure in the macronucleus of the ciliate Stylonychia mytilus. Nucl. Acids Res. 5:46994709.

82. Lo K., Smale S. T. 1996. Generality of a functional initiator consensus sequence. Gene. 182:13-22.

83. Longcor M. A., Wickert S. A., Chau M.-F., Orias E. 1996. Coassortment of genetic loci during macronuclear division in Tetrahymena thermophila. Eur. J. Protistol. 32: 85-89.

84. Lozupone C. A., Knight R. D., LandweberL F. 2001. The molecular basis of nuclear genetic code change in ciliates. Curr. Biol. 11:65-74.

85. Lu L, Ng S. F. 1991. Somatic Function of the Micronucleus of Stylonychia mytilus during Asexual Propagation. Eur. J. Protistol. 27:1-98.

86. Lynn D. H., Small E. B. 2002. Phylum Ciliophora. In: An Illustrated guide to the Protozoa. Lawrence, Kansas: Society of Protozoologists. 371-656.

87. McKean P.G., Vaughan S.,Gull K. 2001. The extended tubulin superfamily. J. Cell Sci. 114:2723-2733.

88. Maercker С., Kortwig H., Lipps H. J. 1999. Separation of micronuclear DNA of Stylonychia lemnae by pulsed-field electrophoresis and identification of a DNA molecule with a high copy number. Genome Res. 9:654-661.

89. McKnight S. L, Kingsbury R. 1982. Transcriptional control signals of a eukaryotic protein-coding gene. Science. 217: 316-324.

90. Merriam E. V., Bruns P. J. 1988. Phenotypic assortment in Tetrahymena thermophila: assortment kinetics of antibiotic-resistance markers, tsA, death, and the highly amplified rDNA locus. Genetics. 120: 389-395.

91. Meyer E., Beisson J. 2005. Epigenetics: Paramecium as a model system. Med. Sci. (Paris). 21: 377-383.

92. Meyer F., Schmidt H. J., Plumper £., Hasilik A., Mersmann G., Meyer H. E., Engstrom A., Heckmann К 1991. UGA is translated as cysteine in pheromone 3 of Eupiotes octocarinatus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 88: 3758-3761.

93. Meyers G., Helftenbein E. 1988. Transfection of the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae with linear DNA vectors. Gene. 63: 31-40.

94. Moiienbeck M., Gavin M. C., KlobutcherL. A. 2004. Evolution of programmed ribosomal frameshifting in the TERT genes of Eupiotes. J. Mol. Evol. 58:701-711.

95. Nanney D. L, Preparata R. M. 1979. Genetic evidence concerning the structure of the Tetrahymena thermophila macronucleus. J. Protozool. 26: 2-9.

96. Ng S. F. 1986. The somatic function of the micronucleus of ciliated protozoa. In: Progress in Protistology. Bristol: Biopress. 1:215-286.

97. Nock A. 1981. RNA and macronuclear transcription in the ciliate Stylonychia mytilus. Chromosoma. 83:209-220.

98. Patikoglou G. A., Kim J. L, Sun L, Yang S. H., Kodadek Т., Burley S. K. 1999. TATA element recognition by the TATA box-binding protein has been conserved throughout evolution. Genes Dev. 13:3217-3230.

99. Pimenov A., Zassoukhina I. В., Ammermann D., Skovorodkin I. N. 2002. Characterization of transcription initiator in alpha and beta tubulin genes of

100. Stylonychia lemnae. In: 21 Jahrestagung derdeutschen Gesellschaft fuer Protozoologie. Konstanz. 35.

101. Postberg J., Alexandrova 0, Cremer Т., Lipps H. J. 2005. Exploiting nuclear duality of ciliates to analyse topological requirements for DNA replication and transcription. J. Cell Sci. 118: 3973-3983.

102. PreerJ. R., PreerL. B. 1979. The size of macronuclear DNA and its relationship to models for maintaining genie balance. J. Protozool. 26:14-18.

103. Prescott D. M. 1994. The DNA of ciliated protozoa. Microbiol. Rev. 58: 233-267.

104. Prescott D. M. 1997. Origin, evolution, and excision of internal elimination segments in germline genes of ciliates. Curr. Opin. Genet. Dev. 7:807-813.

105. Prescott D. M. 1998. Invention and mystery in hypotrich DNA. J. Euk. Microbiol. 45: 575-581.

106. Prescott D. M. 2000. Genome gymnastics: unique modes of DNA evolution and processing in ciliates. Nat. Rev. Genet. 1:191-198.

107. Prescott D. M., Bostock C. J., Murti K. G., Lauth M. R., Gamow E. 1971. DNA of ciliated protozoa. I. Electron microscopic and sedimentation analyses of macronuclear and micronuclear DNA of Stylonychia mytilus. Chromosoma. 34: 355-366.

108. Prescott D. M., Prescott J. D, Prescott R. M. 2002. Coding properties of macronuclear DNA molecules in Sterkiella nova (Oxytricha nova). Protist. 153: 71-77.

109. Raikov I. B. 1972. Nuclear phenomena during conjugation and autogamy in ciliates. In: Research in protozoology. Oxford, New York: Pergamon Press. 4. 7-289.

110. Raikov I. B. 1982. The Protozoan nucleus. Morphology and evolution. In: Cell Biology Monographs. Wien, New York: Springer Verlag. 9: 474 p.

111. Raikov I. B. 1985. Primitive never-dividing macronuclei of some lower ciliates. Int. Rev. Cytol. 95:267-325.

112. Raikov I. B. 1994a. The diversity of forms of mitosis in Protozoa: a comparative review. Eur. J. Protistol. 30: 253-269.

113. Raikov I. B. 1994b. The nuclear apparatus of some primitive ciliates, the karyorelictids: structural and divisional reorganization. Boll. Zool. 61:19-28.

114. Raikov I. В. 1995. Structure and genetic organization of the polyploid macronucleus of ciliates: a comparative review. Acta protozool. 34:151-171.

115. Raikov I. B. 1996. Nuclei of ciliates. In: Ciliates as organisms. Stuttgart, Jena, New York: Gustav Fisher Verlag. 221-242.

116. Riley J. L, Katz L. A. 2001. Widespread distribution of extensive chromosomal fragmentation in ciliates. Mol. Biol. Evol. 18:1372-1377.

117. Roth M., Prescott D. M. 1985. DNA intermediates and telomere addition during genome reorganization in Euplotes crassus. Cell. 41:411-417.

118. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. 1989 Molecular cloning: A laboratory manual, sec. Eds. 1-3: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

119. SeegmillerA., Williams K. R., Herrick G. 1997. Two two-gene macronuclear chromosomes of the hypotrichous ciliates Oxytricha fallax and O. trifallax generated by alternative processing of the 81 locus. Dev. Genet. 20: 348357.

120. Singer V. L, Wobbe C. R., Struhl K. 1990. A wide variety of DNA sequences can functionally replace a yeast TATA element for transcriptional activation. Genes Dev. 4: 636-645.

121. Skovorodkin I. N., Bollgonn S., Ammermann D., GunzlA. 1999. Stable transfection of the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae with tagged alpha 1 tubulin minichromosomes. Eur. J. Protistol. 35:70-80.

122. Skovorodkin I. N., Zassoukhina I., Ammermann D., GuenzlA. 2001a. Characterization of the promoter region in alpha-1 tubulin gene of the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae. In: XI Intern. Congr. Protozool. Salzburg. 13.

123. Skovorodkin I. N., Zassoukhina I. В., Hojak S., Ammermann D., GunzlA. 2001b. Minichromosomal DNA replication in the macronucleus of the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae is independent of chromosome-internal sequences. Chromosoma. 110: 352-359.

124. Skovorodkin I., Pimenov A., Raykhel /., Schimanski В., Ammermann D., GQnzl A. 2007. Analysis of a-tubulin minichromosome promoters in the stichotrichous ciliate Stylonychia lemnae. Eukaryot. Cell. 6: 28-36

125. Smale S. Т., Baltimore D. 1989. The "initiator" as a transcription control element. Cell. 57:103-113.

126. Smale S. Т., Kadonaga J. T. 2003. The RNA polymerase II core promoter. Ann. Rev. Biochem. 72:449-479.

127. Soares H., Cyme L., Barahona I. and Rodriguez-Pousada C. 1991. Different patterns of p-tubulin genes during reciliation. Eur. J. Biochem. 197: 291299.

128. Steinbrueck G. 1990. Recent advances in the study of ciliate genes. Eur. J. Protistol. 26: 2-14.

129. Swanton M. Т., Greslin A. F., Prescott D. M. 1980. Arrangement of coding and non-coding sequences in the DNA molecules coding for rRNAs in Oxytricha sp. DNA of ciliated protozoa. Chromosoma. 77: 203-215.

130. Tarn L. W., Ng S. F. 1987. Genetic analysis of heterocaryons in search of active micronuclear genes in stomatogenesis of Paramecium tetraurelia. Eur. J. Protistol. 23:43-50.

131. Tartar V. 1961. The biology of Stentor. New York, Paris, Pergamon Press, 413 p.

132. Tausta S. L, Klobutcher L. A. 1990. Internal eliminated sequences are removed prior to chromosome fragmentation during development in Euplotes crassus. Nucl. Acids Res. 18:845-853.

133. Walker G. K., Goode D. 1976. The role of microtubules in macronuclear division in the hypotrich ciliates Gastrostyla steinii and Stylonychia mytilus. Cytobiologie. 14:18-37.

134. Wang W., Zhi H., Chai В., Liang A. 2005. Cloning and sequence analysis of the micronuclear and macronuclear gene encoding Rab protein of Euplotes octocarinatus. Biosci. Biotechnol. Biochem. 69: 649-652.

135. Wefes I., Lipps H. J. 1990. The two macronuclear histone H4 genes of the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae. DNA Seq. 1:25-32.

136. Wegner M., Helftenbein E., Muller F., Meinecke M., Muller S., Grummt F. 1989. Identification of an amplification promoting DNA sequence from the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae. Nucl. Acids Res. 17: 8783-8802.

137. Weiden M., Osheim Y. N. Beyer A. L, Van derPloeg L. H. T. 1991. Chromosome structure: DNA nucleotide sequence elements of a subset of the minichromosomes of the protozoan Trypanosoma brucei. Mol. Cell Biol. 11: 3823-3834.

138. Williams К. R., Herrick G. 1991. Expression of the gene encoded by a family of macronuclear chromosomes generated by alternative DNA processing in Oxytricha fallax. Nucl. Acids Res. 19:4717-4724.

139. Witte H., Kneer M., Ammermann D. 1995. Transcription of the highly amplified tubulin gene family of Stylonychia lemnae. Europ. J. Protistol. 31: 268274.

140. Wobbe C. R, Struhl K. 1990. Yeast and human TATA-binding proteins have nearly identical DNA sequence requirements for transcription in vitro. Mol. Cell Biol. 10: 3859-3867.

141. Wunning I. U., Lipps H. J. 1983. A transformation system for the hypotrichous ciliate Stylonychia mytilus. EMBO J. 2:1753-1757.

142. Wu Q., Chang W., Rickers-Haunerland J., Higo Т., Haunerland N.H. 2002. Characterization of a new fatty acid response element that controls the expression of the locust muscle FABP gene. Mol. Cell Biochem. 239:173-180.

143. Yao M. C., Fuller P., XiX. 2003. Programmed DNA deletion as an RNA-guided system of genome defense. Science. 300:1581-1584.

144. ZahlerA. M., Prescott D. M. 1988. Telomere terminal transferase activity in the hypotrichous ciliate Oxytricha nova and a model for replication of the ends of linear DNA molecules. Nucl. Acids Res. 16: 6953-6972.

145. ZahlerA. M., Prescott D. M. 1989. DNA primase and the replication of the telomeres in Oxytricha nova. Nucl. Acids Res. 17:6299-6317.

146. Работа была выполнена в Лаборатории цитологии одноклеточных организмов и цитоэкологии Института цитологии РАН.

147. Финансовая поддержка работы была получена от Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 03-04-48505, 04-04-49209, 07-0400662).

148. Большой вклад в настоящее исследование внесли мои зарубежные коллеги, Артур Гензел и Бернард Шимански, экспериментальная работа которых значительно ускорила получение интересующих нас результатов.

149. Автор диссертации благодарен Наталье Аркадиевне Михайловой за предоставление оборудования для проведения ПЦР и за ценные консультации.

150. Автор диссертации благодарен Евгению Ефремовичу Махлину за консультации по оформлению работы и помощь в работе над текстом.

151. Автор диссертации благодарен Александру Львовичу Юдину за консультации по вопросам оформления работы и автореферата.

152. Автор диссертации также признателен всему коллективу Лаборатории цитологии одноклеточных организмов и цитоэкологии Института цитологии РАН за теплое отношение и содействие в выполнении моей работы.

153. Особая благодарность — моей семье за постоянную поддержку, понимание и бесконечное терпение.

Информация о работе

Пименов, Александр Юрьевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2007
ВАК 03.00.25

Диссертация

Регуляция транскрипции генов класса II у инфузории Stylonychia lemnae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы