Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляторные участки ДНК в минихромосомах инфузории Stylonychia lemnae, несущих гены α1- и α2-тубулина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Райхель, Ирина Борисовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ВЫБОР ОБЪЕКТА И МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ.И

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Организация генома макронуклеуса у брюхоресничных инфузорий.

1.2. Регуляторные последовательности ДНК, контролирующие репликацию у эукариот.

1.3. Регуляторные последовательности ДНК, контролирующие репликацию у инфузорий.

1.4. Регуляторные последовательности ДНК, контролирующие транскрипцию у эукариот.

1.4.1. Понятие о кор-промотере.

1.4.2. ТАТА-бокс.

1.4.3. Инициатор.

1.4.4. Правый промоторный элемент.

1.4.5. Другие элементы кор-промотора.

1.5. Регул яторные участки, контролирующие транскрипцию макронуклеарных генов, кодирующих белки брюхоресничных инфузорий

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы:.

2.1.1. Клопы it условия культивирования брюхоресничиых инфузорий.

2.1.2. Штаммы бактерий и условия их культивирования.

2.1.3. ДНК олигонуклеотиды.

2.1.4. Векторы и ДНК-конструкции.

2.2. Методы.

2.2.1. Трансфекция S. lemnae и получение клональных клеточных линий.

2.2.2. Молекулярно-биологические методы.

2.2.3. Приготовление смеси искусственных минихромосом и котрансфекция клеток S. lemnae.

2.2.4. Анализ ДНК методом пропорциональной ПЦР.

2.2.5. Анализ ДНК методом блот-гибридизации по Саузерну.

2.2.6. Анализ РНК методом обратной транскрипции.

2.2.7. Сиквенс ДНК и определение точек начала транскрипции.

2.2.8. Индукция экспрессии генов тубулина обработкой клеток S. lemnae лектгшом Кон А.;.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Разработка метода котрансфекции инфузории Stylonychia lemnae

3.1.1. Разработка метода котрансфекции инфузории S. lemnae применительно к изучению репликации ДНК минихромосом.

3.1.2. Разработка метода котрансфекции инфузории S. lemnae применительно к анализу регуляции транскрипции.

3.2. Поиск регуляторных последовательностей, контролирующих репликацию в минихромосоме, кодирующей ген al-тубулина.

3.2.1. Замена 5'- и З'-иекодирующих участков гена а1-тубулгша не влияет на репликацию ДНК.

3.2.2. Удаление 5 - и З'-некодирующих участков гена а\-тубулина не влияет на репликацию ДНК.

3.2.3. Замена участка, кодирующего al-тубулин, не влияет на репликацию ДНК.

3.2.4. Линейные векторы, лишенные теломеров, не поддерживаются в макронуклеусах трансфецированных инфузорий S. lemnae.

3.3. Поиск регуляторных по следовательностей. контролирующих транскрипцию в минихромосоме, несущей геи а1-туг>улина.

3.3.1. Делеционный анализ 5 '-декодирующего участка гена а1-тувулина.

3.3.2. Анатз 5 '-некодирующего участка гена а1-тубулина с помощью несущих замены конструкций.

3.3.3. Определение элементов промотора в генах S. lemnae. кодирующих тубулины, путем сравнения последовательностей.

3.3.4. Поиск регуляторных последовательностей, контролирующих индукцию транскрипции в минихромосоме, кодирующей ген а2-тувулина.

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Адекватность метола котрансфекции поставленным задачам.

3.2. Особенности репликации минихромосом в макронуклеусе инфузории S. lemnae.

3.2.1. Репликация минихромосом, несущих ген а 1-тубулина, не зависит от каких-либо последовательностей ДНК, расположенных в 3'-, З'-некодирующих участках и в кодирующем участке минихромосомы.

3.2.2. Теломеры как сайты инициации репликации в минихромосомах инфузорий.ЮО

3.2.4. Проблема поддержания постоянства числа копий минихромосом в макронуклеусах инфузорий.

3.3. Элементы кор-промотора в генах, кодирующих тубулины у S. lemnae

3.4. Эффективность транскрипции генов а1- и а2-тубулина.

3.5. Индукция транскрипиии гена а2-тубулина контролируется последовательностью его промотора.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляторные участки ДНК в минихромосомах инфузории Stylonychia lemnae, несущих гены α1- и α2-тубулина"

Представители типа Ciliophora (Инфузории) за последние два десятилетия стали одним из наиболее популярных объектов клеточной и молекулярной биологии. С использованием инфузорий в качестве модельных обьектов были изучены такие явление, как отклонения генетического кода от универсального (Caron, Meyer, 1985; Fox, 1985; Horowitz, Gorovsky, 1985; Preer et al., 1985) и основы эпигенетического наследования (Meyer, Duharcourt, 1996; Preer, 2000). Именно на инфузориях были выполнены основополагающие работы по строению и функции теломеров (Blackburn, 1986). Было признано, что работы в области изучения посттранскрипционного сайленсинга, выполненные, в частности, на инфузориях, являются одним из приоритетных направлений научных исследований в 2002 году (Couzin, 2002).

Такой интерес исследователей к инфузориям как модельным объектам вызван, в первую очередь, особенностями организации генома этих животных. Ядерный аппарат инфузорий состоит из ядер двух типов - макронуклеусов и микронуклеусов, различающихся морфологически и функционально (Ammermann, 1990; Blackburn, 1986; Klobutcher, Prescott, 1986; McTavish, Sommerville, 1980; Nanney, 1986; Prescott, 1994; 1998; Raikov, 1982; Райков, 1978; Осипов, 1981). Транскрипционно активный макронуклеус развивается из синкариона - зиготического ядра, образовавшегося в результате слияния продуктов мейоза микронуклеуса, которое происходит во время конъюгации. Макронуклеус обладает очень специфической организацией генома. Так, геном макронуклеуса брюхоресничных инфузорий составляют от 12 тысяч до 36 тысяч различных типов молекул ДНК, называемых "молекулами ДНК размером с ген" ("gene-sized DNA molecules") (Swanton et al., 1980), "минихромосомами" (Hoffman et al., 1995) или "макронуклеарными хромосомами" (Kreyenberg et al., 1998).

Брюхоресничные инфузории (Hypotrychida) представляют для исследователей особенный интерес. Каждая минихромосома у брюхоресничной инфузории Stylonychia lemnae имеет размер от нескольких сотен п.н. до 20 тысяч п.н. и представлена в макронуклеусе в среднем 15000 копий (Ammermann, 1990; Prescott, 1994). Типичная минихромосома содержит кодирующий участок, 5'- и З'-нетранслируемые участки и короткие теломеры. Каждая минихромосома представляет собой автономную репликационную и транскрипционную единицу (Klobutcher, Prescott, 1986; Осипов, 1981). Этим объясняется интерес исследователей к изучению процессов репликации и транскрипции у брюхореснич-ных инфузорий.

Мшшхромосомы S. lemnae во время вегетативного роста клеток реплицируются, и последовательность ДНК, контролирующая этот процесс, неизвестна. Вообще у эукариот последовательности, определяющие репликацию, и сайты инициации репликации изучены до настоящего времени мало. Наиболее детально они определены у Sciccharomyces cerervisiae (см. обзор: Francon et al., 1999) и Tetrahymena thermophila (Blomberg et al., 1997; Reischmann et al., 1999). Изучение регуляторных последовательностей, контролирующих репликацию у инфузории S. lemnae, имеет большое значение для понимания фундаментальных основ процесса репликации у эукариот в целом.

Типичный эукариотный базовый промотор, инициирующий транскрипцию с помощью РНК полимеразы II, содержит ТАТА-бокс, расположенный на 25-30 п.н. выше точки начала транскрипции, и Инициатор, окружающий эту точку (Lee, Young, 2000). Такие элементы эукариотного промотора, как СААТ-бокс, энхансер и индуктор, модулируют транскрипцию. До настоящего времени основные функциональные элементы промотора были описаны лишь у небольшого количества генов брюхоресничных инфузорий. Это связано с тем, что в своем анализе исследователи чаще всего используют сравнение последовательностей и ищут последовательности, которые характерны для высших эукариот (Conzelmann, Helftenbein, 1987; Helftenbein, 1985; Helftenbein et al., 1989; 8

Helftenbein, Muller, 1988). Экспериментально промоторы инфузорий изучены мало. В ряде работ высказаны предположения о том, что промотор брюхорес-ничных инфузорий не содержит элементов типичного эукариотного промотора (Ghosh et al., 1994; Hoffman et al., 1995). Экспериментальное определение элементов промотора у брюхоресничной инфузории S. lemnae позволит существенно расширить представления о транскрипции у эукариот в целом.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы был поиск и анализ регуляторных участков ДНК в минихромосомах макронуклеуса у инфузории S. lemnae.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

На основе макронуклеарных хромосом S. lemnae, несущих гены al - и а2-тубулина, сконструировать искусственные минихромосомы, содержащие мутации (делеции и замены) в 5'- и З'-некодирующих областях и теломерах, предположительно участвующих в регуляции транскрипции и репликации.

Разработать метод котрансфекции инфузории S. lemnae одновременно векторами двух типов, один из которых полностью соответствует исследуемой нативной минихромосоме и используется в качестве контроля, а второй содержит мутантные ДНК-последовательности в изучаемых областях минихромосомы. Получить соответствующие трансфецированные клоны инфузории.

Сравнить эффективность репликации in vivo искусственных минихромо-сом, несущих ген al-тубулина и содержащих натнвные и мутантные участки ДНК. Определить ДНК-последовательности, выполняющие функции сайта инициации репликации в минихромосомах S. lemnae. Определить роль тел ом еров в репликации мшшхромосом в макронуклеусе S. lemnae.

Сравнить эффективность транскрипции in vivo векторов, несущих натив-ные и мутантные участки ДНК в нетранскрибируемой области 5'-участка минихромосомы al-тубулина. Выявить участки, необходимые для корректной инициации транскрипции этого гена. На основе сравнения с последовательностями ДНК других минихромосом брюхоресничных инфузорий выявить кон-сенсусные последовательности различных элементов промотора гена al-тубулина.

Проанализировать in vivo транскрипцию мутантных версий минихромосомы а2-тубулина в нормальных условиях и при индукции синтеза тубулина ю под воздействием лектина Конканавалина А. Определить локализацию индуктора транскрипции в этом гене.

ВЫБОР ОБЪЕКТА И МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ

Генетическая трансформация, выбранная нами в качестве основного метода исследования, является наиболее распространенным методом изучения функции генома у различных организмов. В наших экспериментах этот метод позволял оценивать влияние тех или иных изменений исследуемых участков ДНК на процессы транскрипции и репликации. С его помощью мы определяли регуляторные области, ответственные за контроль над этими процессами.

Существуют несколько вариантов метода генетической трансформации, а также способов введения чужеродного генетического материала в геном исследуемой клетки. Для экспериментов, представленных в настоящей работе, наиболее подходящим был метод стабильной трансфекции макронуклеуса инфузорий линейными векторами, разработанный ранее (Skovorodkin et al., 1999). Трансформированные таким образом стилонихии поддерживают интродуциро-ванные последовательности ДНК в неизменном виде в большом количестве копий (до нескольких миллионов на один геном макронуклеуса) в течение длительного времени, ограниченного только продолжительностью жизни данной клеточной линии (клоны S. lemnae жизнеспособны в течение нескольких лет). Для успешной и эффективной трансформации вегетативных особей инфузорий требуется введение в макронуклеус большого количества копий вектора. Единственным методом, позволяющим добиться необходимых результатов, является микроинъекция. S. lemnae представляет собой удобный объект для микроинъекции. Макронуклеус этой инфузории имеет достаточно большие размеры (порядка 100 мкм в длину) и гантелеобразную форму, причем каждая из двух его половин по форме близка к сферической. Это дает возможность при микроинъекции вводить раствор ДНК в обе половины макронуклеуса. Перед делением и i клетки эти две половины объединяются. Таким образом, количество инъецируемой ДНК оказывается вдвое больше, чем при однократной инъекции. Вместе с тем, необходимо отметить, что микроинъекция, даже при использовании самого современного оборудования, остается весьма трудоемким методом, требующим определенных навыков. Поэтому при использовании этого метода ученым приходится ограничиваться небольшими выборками, обычно не превышающими 3-5 успешно трансформированных инфузорий, для каждого варианта эксперимента.

Большинство генов стилонихий, изученных к настоящему времени, не имеют интронов. Это свойство мшшхромосом стилонихий оказывается особенно полезным при анализе сайта инициации транскрипции. Наличие интронов значительно затрудняет выполнение этой задачи, поскольку длина зрелой мРНК, прошедшей вырезание интронов и сплайсинг, отличается от длины соответствующей ей ДНК-затравки, что делает невозможным их прямое сравнение.

Наконец, стилонихии — крупные (для одноклеточных организмов) объекты, обладающие высоким темпом деления — до двух делений в сутки. Учитывая, что каждая клетка содержит до 1 нг ДНК и более 5 нг РНК, в течение сравнительно короткого времени можно получить достаточно материала для анализа с помощью таких методов, как блот-гибридизация по Саузерну и обратная транскрипция. Обычно для получения необходимого количества ДНК и РНК достаточно выращивать культуру этих инфузорий в течение 2-3 недель. Для анализа ДНК с помощью ПЦР в принципе достаточно одной клетки инфузории. Однако мы использовали для этих целей ДНК, выделенную минимум из 10 особей для повышения воспроизводимости результатов.

Минихромосомы, несущие ген al-тубулина, были выбраны нами для исследования репликации и транскрипции у S. lemnae исключительно из тех соображений, что они ранее предлагались в качестве удобного модельного объекта для экспериментов по генетической трансформации этих инфузорий

12

Skovorodkin et al., 1999). Гены а- и р-тубулинов наиболее хорошо изучены у стилонихий. Они первыми были клонированы и секвенированы (Conzelmann, Helftenbein, 1987; Helftenbein, 1985). В генах а- и [3-тубулинов стилонихий были определены точки инициации транскрипции и на основании сравнения сик-венсов сделаны предположения относительно структуры промотора и сайта инициации репликации этих генов (Conzelmann, Helftenbein, 1987; Helftenbein, 1985; Helftenbein et al., 1989; Helftenbein, Muller, 1988).

У стилонихии обнаружено две изоформы а- тубулина и две - р-тубулина (al, a2 и pi, Р2, соответственно) (Conzelmann, Helftenbein, 1987; Helftenbein, 1985). Минихромосомы, несущие эти гены, представлены разным числом копий в геноме макронуклеуса. Для al- и pl-тубулинов это число составляет примерно 150000 копий, для а2- и Р2- в пять раз меньше - около 30000 копий (Helftenbein et al., 1989). Эффективность же транскрипции генов а2- и Р2-тубулинов, наоборот, в пять раз выше, чем генов al- и pi-тубулинов (Witte et al., 1995). Кодирующие участки генов al- и а2-тубулинов гомологичны на 97%, - pi- и Р2- тубулинов - на 97,2% (Conzelmann, Helftenbein, 1987; Helftenbein, Muller, 1988), в то время, как некодирующие регионы значительно различаются по размерам и нуклеотидному составу. Кроме того, было показано, что в результате обработки стилонихий лектином Кон А увеличивается интенсивность транскрипции гена а2-тубулина, в то время как уровень транскрипции а 1-тубулина остается неизменным (Witte et al., 1995). Таким образом, в нетранслирующихся участках этих генов следует искать не только основные элементы, ответственные за репликацию и транскрипцию, но и последовательности ДНК, обеспечивающие более тонкую регуляцию этих процессов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Впервые был разработан метод котрансфекцин инфузории S. lemnae одновременно векторами двух типов, один из которых полностью соответствует исследуемой нативной минихромосоме и используется в качестве контроля, а второй содержит мутантные последовательности ДНК в изучаемых областях минихромосомы. Были получены соответствующие трансфецированные клоны инфузории.

Впервые экспериментально показано, что у S. lemnae на всей протяженности минихромосомы, несущей ген al-тубулина, за исключением теломеров, не существует никаких регуляторных последовательностей, играющих роль сайтов инициации репликации. Высказано предположение о том, что регуля-торными последовательностями, контролирующими репликацию, являются те-ломеры.

Впервые экспериментально проанализирована структура промотора гена a 1 -тубулина S. lemnae.

Выявлены ДНК-последовательности, контролирующие корректную транскрипцию этого гена в 5'-нетранскрибируемой области минихромосомы, несущей ген al-тубулина. Впервые получены результаты, демонстрирующие, что промотор гена al-тубулина S. lemnae содержит последовательности, соответствующие известным элементам эукариотного промотора.

Впервые показано, что у S. lemnae в отсутствие в промоторе гена al-тубулина ТАТА-бокса эффективность транскрипции снижается, и появляются альтернативные точки начала транскрипции.

В минихромосоме al-тубулина впервые определен участок, в отсутствие которого транскрипция гена идет менее эффективно. Предположительно этот участок содержит энхансер.

Впервые показано, что в нетранскрибируемой области 5'-некодирующего участка гена а2-тубулина находится регуляторная последовательность, контролирующая индукцию экспрессии этого гена.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Полученные данные расширяют представления о регуляции репликации ДНК и экспрессии генов в макронуклеусе брюхоресничных инфузорий и способствуют пониманию общих механизмов репликации и транскрипции в эука-риотной клетке.

У S. lemnae на примере минихромосомы, несущей ген al-тубулина, показано, что кодирующий и 5'- З'-некодирующие участки гена не содержат последовательности ДНК, определяющей репликацию, и только теломеры важны для эффективной инициации репликации.

Экспериментально проанализирован промотор гена al-тубулина инфузории S. lemnae и выявлены его элементы, соответствующие элементам классического эукариотного промотора.

Метод котрансфекции инфузории S. lemnae, впервые разработанный в настоящей работе, может быть полезным для изучения особенностей строения и функции минихромосом брюхоресничных инфузорий.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на 20-м ежегодном съезде Немецкого протозоологического общества (Бонн-Роэтген, 2001), на международной конференции по биологии парамеций (Гонолулу, 2001), на XI Международном протозоологическом конгрессе ICOP (Зальцбург, 2001), на 21-м ежегодном съезде Немецкого протозоологического общества (Констанц, 2002), а также на научных семинарах Лаборатории структурной организации генома и Лаборатории цитологии одноклеточных организмов Института цитологии РАН.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Райхель, Ирина Борисовна

выводы

1. У инфузории S.lemnae на всей протяженности молекулы ДНК минихромосомы, несущей ген al-тубулина (за исключением теломеров) не обнаружено никаких регуляторных последовательностей, контролирующих репликацию.

2. Минихромосомы S.lemnae, лишенные теломеров, не поддерживаются в макронуклеусе инфузорий. Возможно, у брюхоресничных инфузорий теломеры играют роль сайтов инициации репликации минихромосом.

3. 5'-нетранскрибируемая область минихромосомы al-тубулина содержит следующие ДНК-последовательности, контролирующие корректную транскрипцию этого гена:

ТАТССАТТСААА, расположенный на 47 п.н. левее точки начала транскрипции;

ТАААТА, расположенный на 28 п.н. левее точки начала транскрипции;

АТТАТАА, расположенный на 5 п.н. левее точки начала транскрипции;

4. Эти последовательности соответствуют следующим известным элементам эукариотического промотора:

СААТ-бокс (консенсусная последовательность - ССААТ) ТАТА-бокс (консенсусная последовательность - ТАТАА) Инициатор (консенсусная последовательность — YYANT/AYY)

5. В области -55 - -114 п.н. левее точки инициации транскрипции минихромосомы al-тубулина находится участок, в отсутствии которого транскрипция гена идет менее эффективно. Предположительно этот участок содержит энхансер.

6. В нетранскрибируемой области 5'-некодирующего участка гена а2-тубулина находится регуляторная последовательность, контролирующая индукцию экспрессии этого гена.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Райхель, Ирина Борисовна, Санкт-Петербург

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Д. 1994. Молекулярная биология клетки. М., Мир.

2. Борхсениус С. Н., Белозерская Н. А., Меркулова Н. А., Ирлина И. С., Воробьев В. И. 1977. Возможность неоднократной репликации части ядерной ДНК инфузории Tetrahymena в течение одного S-периода. Молекулярная биология. 11(1):171-180.

3. Жимулев И. Ф. 2002. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск, Изд-во Новосиб. ун-та, Сиб. унив. изд-во, 459 с.

4. Осипов Д. В. 1981. Проблемы гетероморфизма ядер у одноклеточных организмов. Л., Наука, 167 с.

5. Пименов А. 2003. Характеризация инициатора в генах тубулинов брюхо-ресничной инфузории Stylonychia lemnae. Диссертация на соискание степени магистра биологических наук. Санкт-Петербург: Санкт-Петербургский Государственный Университет. 73 с.

6. Райков И. Б. 1978. Ядро простейших. Морфология и эволюция. Л., Наука, 378 с.

7. Райков И. Б., Аммерманн Д. 1976. Новые успехи в изучении макронуклеуса инфузорий. В кн.: Кариология и генетика простейших. Л., Наука, 1:64-90.

8. Фонбрюн П. 1951. Методы микроманипуляции. Москва, Изд-во иностранной литературы, 230 с. с.

9. Хеймс Б., Хиннинс С. 1987. Транскрипция и трансляция. Методы. М., Мир, 400 с

10. Allen R. L., Olins A. L., Harp J. М., Olins D. E. 1985. Isolation and characterization of chromatin replication bands and macronuclei from Euplotes eurystomus. Eur J Cell Biol. 39(1 ):217-223.

11. Ammermann D. 1990. The contribution of hypotrichous ciliates to ourunderstanding of molecular biology and evolution of ciliates. Zoological Science. Supplement 7:13-22.

12. Ammermann D, Hellmer K, Zassoukhina I, Skovorodkin I. 2003. Responseto X-ray and cis-Pt-induced damage in Stylonychia lemnae (Ciliata, Protozoa). Eur. J. Protistol. 39:223-230.

13. Ammermann D, Steinbruck G, von Berger L, Hennig W. 1974. Thedevelopment of the macronucleus in the ciliated protozoan Stylonychia mytilus. Chromosoma. 45(4):401-429.

14. Arkhipova I. R. 1995. Promoter elements in Drosophila melanogaster revealedby sequence analysis. Genetics. 139(3): 1359-1369.

15. Ascenzioni F, Lipps H. J. 1986. A linear shuttle vector for yeast and thehypotrichous ciliate Stylonychia. Gene. 46(1): 123-126.

16. Ausubel F. M, Brent R, Kingston R. E, Moore D. D, Seidmann J. G, Smith

17. J. A, Struhl K. 1998. Current protocols in molecular biology. In: Chanda VB, editor: John Wiley & Sons.

18. Bangur C. S, Pardee T. S, Ponticelli A. S. 1997. Mutational analysis of the

19. Dl/El core helices and the conserved N-terminal region of yeast transcription factor IIB (TFIIB): identification of an N-terminal mutant that stabilizes TATA-binding protein-TFIIB-DNA complexes. Mol Cell Biol. 17(12):6784-6793.

20. Barberis A, Superti-Furga G, Busslinger M. 1987. Mutually exclusiveinteraction of the CCAAT-binding factor and of a displacement protein with overlapping sequences of ahistone gene promoter. С ell. 50(3):347-359.

21. Bardele C. F. 1969. Acineta tuberosa. II. The distribution of microtubules inthe macronucleus during asexual reproduction. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 93(1):93-104.

22. Bell S. D., Jackson S. P. 1998. Transcription in Archaea. Cold Spring Harb

23. Symp Quant Biol. 63:41-51.

24. Bell S. D., Jackson S. P. 2000. Mechanism of autoregulation by an archaealtranscriptional repressor. J Biol Chem. 275(41):31624-31629.

25. Bell S. D., Jackson S. P. 2001. Mechanism and regulation of transcription in

26. Archaea. Curr Opin Microbiol. 4(2):208-213.

27. Bell S. P., Stillman B. 1992. ATP-dependent recognition of eukaryotic originsof DNA replication by a multiprotein complex. Nature. 357(6374): 128-134.

28. Bender J., Klein A. 1997. The telomere binding protein of Euplotes crassusprevents non-specific transcription initiation but has no role in positioning transcription initiation complexes. Nucleic Acids Res. 25(14):2877-2882.

29. Berger J. D. 1982. Effects of gene dosage on protein synthesis rate in

30. Paramecium tetraurelia. Implications for regulation of cell mass, DNA content and the cell cycle. Exp Cell Res. 141(2):261-275.

31. Berk A. J. 2000. TBP-like factors come into focus. Cell. 103(l):5-8.

32. Berroteran R. WWare D. EH ampsey M. 1994. The s ua8 suppressors о f

33. Saccharomyces cerevisiae encode replacements of conserved residues within the largest subunit of RNA polymerase II and affect transcription start site selection similarly to sua7 (TFIIB) mutations. Mol Cell Biol. 14(l):226-237.

34. Blackburn E. H. 1986. Telomeres. In: The molecular biology of ciliatedprotozoa. New York, Academic Press: 155-178.

35. Blomberg P., Randolph С., Yao С. H., Yao M. C. 1997. Regulatory sequencesfor the amplification and replication of the ribosomal DNA minichromosome in Tetrahymena thermophila. Mol Cell Biol. 17(12):7237-7247.

36. Bourgain F. M., Katinka M. D. 1991. Telomeres inhibit end to end fusion andenhance maintenance of linear DNA molecules injected into the

37. Paramecium primaurelia macronucleus. Nucleic Acids Res. 19(7): 1541-1547.

38. Brandl C. J., Martens J. A., Liaw P. C., Furlanetto A. M., Wobbe C. R. 1992.

39. TATA-binding protein activates transcription when upstream of a GCN4-binding site in a novel yeast promoter. J Biol Chem. 267(29):20943-20952.

40. Breathnach R., Chambon P. 1981. Organization and expression of eucaryoticsplit genes coding for proteins. Annu Rev Biochem. 50:349-383.

41. Brunk C. F., Sadler L. A. 1990. Characterization of the promoter region of

42. Tetrahymena genes. Nucleic Acids Res. 18(2):323-329.

43. Bucher P. 1990. Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNApolymerase II promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences. J Mol Biol. 212(4):563-578.

44. Buratowski S., Hahn S., Sharp P. A., Guarente L. 1988. Function of a yeast

45. TATA element-binding protein in a mammalian transcription system. Nature. 334(6177):37-42.

46. Burke T. W., Kadonaga J. T. 1996. Drosophila TFIID binds to a conserveddownstream basal promoter element that i s present i n many TATA-box-deficient promoters. Genes Dev. 10(6):711-724.

47. Burke T. W., Kadonaga J. T. 1997. The downstream core promoter element,

48. DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes Dev. 11(22):3020-3031.

49. Burley S. K., Roeder R. G. 1996. Biochemistry and structural biology oftranscription factor IID (TFIID). Annu Rev Biochem. 65:769-799.

50. Butler J. E., Kadonaga J. T. 2002. The RNA polymerase II core promoter: akey component in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16(20):2583-2592.

51. Carcamo J., Buckbinder L., Reinberg D. 1991. The initiator directs theassembly of a transcription factor IID-dependent transcription complex. Proc Natl Acad Sci USA. 88(18):8052-8056.

52. Caron F., Meyer E. 1985. Does Paramecium primaurelia use a differentgenetic code in its macronucleus? Nature. 314(6007): 185-188.

53. Cavalier-Smith T. 1974. Palindromic base sequences and replication ofeukaryote chromosome ends. Nature. 250(5466):467-470.

54. Cech T. R., Brehm S. L. 1981. Replication of the extrachromosomal ribosomal

55. RNA genes of Tetrahymena thermophilia. Nucleic Acids Res. 9(14):3531-3543.

56. Chen W., Struhl K. 1985. Yeast mRNA initiation sites are determinedprimarily by specific sequences, not by the distance from the TATA element. Embo J. 4(12):3273-3280.

57. Cheriyath V., Roy A. L. 2001. Structure-function analysis of TFII-I. Roles ofthe N-terminal end, basic region, and I-repeats. J Biol Chem. 276(11):8377-8383.

58. Cho E. J., Buratowski S. 1999. Evidence that transcription factor IIB isrequired for a post-assembly step in transcription initiation. 274(36):25807-25813.

59. Cleffmann G. 1975. Amount of DNA produced during extra S phases in

60. Tetrahymena. J Cell Biol. 66(l):204-209.

61. Cleffmann G. 1980. Chromatin elimination and the genetic organisation of themacronucleus in Tetrahymena thermophila. Chromosoma. 78(3):313-325.

62. Colombo M. M., Swanton M. Т., Donini P., Prescott D. M. 1984. Micronuclear

63. DNA of Oxytricha nova contains sequences with autonomously replicating activity in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 4(9): 1725-1729.

64. Conaway J. W., Hanley J. P., Garrett K. P., Conaway R. C. 1991. Transcriptioninitiated by RNA polymerase II and transcription factors from liver. Structure and action of transcription factors epsilon and tau. J Biol Chem. 266(12):7804-7811.

65. Concino M. F., Lee R. F., Merryweather J. P., Weinmann R. 1984. Theadenovirus major late promoter TATA box and initiation site are both necessary for transcription in vitro. Nucleic Acids Res. 12(19):7423-7433.

66. Conzelmann К. K., Helftenbein E. 1987. Nucleotide sequence and expressionof two beta-tubulin genes in Stylonychia lemnae. J Mol Biol. 198(4):643-653.

67. Corden J., Wasylyk В., Buchwalder A., Sassone-Corsi P., Kedinger C.,

68. Chambon P. 1980. Promoter sequences of eukaryotic protein-coding genes. Science. 209(4463): 1406-1414.

69. Couzin J. 2002. Breakthrough of the year. Small RNAs make big splash.

70. Science. 298(5602):2296-2297.

71. Cox J. M., Hayward M. M., Sanchez J. F., Gegnas L. D., van der Zee S.,

72. Dennis J. H., Sigler P. В., Schepartz A. 1997. Bidirectional binding of the TATA box binding protein to the TATA box. Proc Natl Acad Sci USA. 94(25): 13475-13480.

73. Crowley Т. E., Hoey Т., Liu J. K., Jan Y. N., Jan L. Y., Tjian R. 1993. A newfactor related to TATA-binding protein has highly restricted expression patterns in Drosophila. Nature. 361(6412):557-561.

74. Dantonel J. C., Wurtz J. M., Poch O., Moras D., Tora L. 1999. The TBP-likefactor: an alternative transcription factor in metazoa? Trends Biochem Sci. 24(9):335-339.

75. DeDecker B. S., O'Brien R., Fleming P. J., Geiger J. H., Jackson S. P., Sigler

76. P. B. 1996. The crystal structure of a hyperthermophilic archaeal TATA-box binding protein. J Mol Biol. 264(5): 1072-1084.

77. DePamphilis M. L. 1999. Replication origins in metazoan chromosomes: factor fiction? Bioessays. 21(1):5-16.

78. Doerder F. P., Debault L. E. 1975. Cytofluorimetric analysis of nuclear DNAduring meiosis, fertilization and macronuclear d evelopment in the ciliate Tetrahymenapyriformis, syngen 1. J Cell Sci. 17(3):471-493.

79. Dynlacht В. D., Hoey Т., Tjian R. 1991. Isolation of coactivators associatedwith the TATA-binding protein that mediate transcriptional activation. Cell. 66(3):563-576.

80. Emami К. H., Jain A., Smale S. T. 1997. Mechanism of synergy between

81. TATA and initiator: synergistic binding of TFIID following a putative TFIIA-induced isomerization. Genes Dev. 11(22):3007-3019.

82. Fairley J. A., Evans R., Hawkes N. A., Roberts S. G. 2002. Core promoterdependent TFIIB conformation and a role for TFIIB conformation in transcription start site selection. Mol Cell Biol. 22(19):6697-6705.

83. Fox T. D. 1985. Diverged genetic codes in protozoans and a bacterium. Nature.314(6007):132-133.

84. Francon P., Maiorano D., Mechali M. 1999. Initiation of DNA replication ineukaryotes: questioning the origin. FEBS Lett. 452(l-2):87-91.

85. Frisch A., Bessler W. G., Lipps II. J., Ammermann D. 1976. Immobilization of

86. Ciliates by Concanavalin A. J. Protozool. 23(3):427-430.

87. Gaunitz C., Witte I I., Gaunitz F. 1992. Primary structure of a gene-sized DNAencoding calmodulin from the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae. Gene. 119(2): 191-198.

88. Ghosh S., Jaraczewski J. W., Klobutcher L. A., Jahn C. L. 1994.

89. Characterization of transcription initiation, translation initiation, and poly(A) addition sites in the gene-sized macronuclear DNA molecules of Euplotes. Nucleic Acids Res. 22(2):214-221.

90. Giardina C., Lis J. T. 1993. DNA melting on yeast RNA polymerase IIpromoters. Science. 261(5122):759-762.

91. Gilley D., Preer J. R., Jr., Aufderheide K. J., Polisky В. 1 988. Autonomousreplication and addition of telomerelike sequences to DNA microinjected into Paramecium tetraurelia macronuclei. Mol Cell Biol. 8(11):4765-4772.

92. Goode B. L., Feinstein S. C. 1992. "Speedprep" purification of template fordouble-stranded DNA sequencing. Biotechniques. 12(3):374-375.

93. Graves В. J., Johnson P. F., McKnight S. L. 1986. Homologous recognition ofa promoter domain common to the MSV LTR and the HSV tk gene. Cell. 44(4):565-576.

94. Gray J. Т., Celander D. W., Price С. M., Cech T. R. 1991. Cloning andexpression of genes for the Oxytricha telomere-binding protein: specific subunit interactions in the telomeric complex. Cell. 67(4):807-814.

95. Greslin A. F., Loukin S. H., Oka Y., Prescott D. M. 1988. An analysis of themacronuclear actin genes of Oxytricha. Dna. 7(8):529-536.

96. Grosschedl R., Birnstiel M. L. 1980. Identification of regulatory sequences inthe prelude sequences of an H2A histone gene by the study of specific deletion mutants in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 77(3): 1432-1436.

97. Grosveld G. C., Shewmaker С. K., Jat P., Flavell R. A. 1981. Localization of

98. DNA sequences necessary for transcription of the rabbit beta-globin gene in vitro. Cell. 25(1):215-226.

99. Hahn S., Buratowski S., Sharp P. A., Guarente L. 1989. Yeast TATA-bindingprotein TFIID binds to TATA elements with both consensus and nonconsensus DNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA. 86(15):5718-5722.

100. Hahn S., Hoar E. Т., Guarente L. 1985. Each of three "TATA elements"specifies a subset of the transcription initiation sites at the CYC-1 promoter of Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA. 82(24):8562-8566.

101. Hain J., Reiter W. D., Hudepohl U., Zillig W. 1992. Elements of an archaealpromoter defined by mutational analysis. Nucleic Acids Res. 20(20):5423-5428.

102. Hansen S. K., Takada S., Jacobson R. H., Lis J. Т., Tjian R. 1997.

103. Transcription properties of a cell type-specific TATA-binding protein, TRF. Cell. 91(l):71-83.

104. Hausner W., Frey G, Thomm M. 1991. Control regions of an archaeal gene. A

105. TATA box and an initiator element promote cell-free transcription of the tRNA(Val) gene of Methanococcus vannielii. J Mol Biol. 222(3):495-508.

106. Hawkes N. A, Roberts S. G. 1999. The role of human TFIIB in transcriptionstart site selection in vitro and in vivo. J Biol Chem. 274(20): 14337-14343.

107. Helftenbein E. 1985. Nucleotide sequence of a macronuclear DNA moleculecoding for alpha-tubulin from the ciliate Stylonychia lemnae. Special codon usage: TAA is not a translation termination codon. Nucleic Acids Res. 13(2):415-433.

108. Helftenbein E, Conzelmann К. K, Becker K. F, Fritzenschaf H. 1989.

109. Regulatory structure of gene expression, DNA-replication and DNA-rearrangement in macronuclear genes of Stylonychia lemnae, a Hypotrichous Ciliate. Eur. J. Protistol. 25:158-167.

110. Helftenbein E, Muller E. 1988. Both alpha-tubulin genes are transcriptionallyactive in Stylonychia lemnae. Curr Genet. 13(5):425-432.

111. Hoffman D. C, Anderson R. C, DuBois M. L, Prescott D. M. 1995.

112. Macronuclear gene-sized molecules of hypotrichs. Nucleic Acids Res. 23(8):1279-1283.

113. Holmes M. C, Tjian R. 2000. Promoter-selective properties of the TBP-relatedfactor TRF1. Science. 288(5467):867-870.

114. Hoopes В. С , L eBlanc J. F , H awley D. К. 1 992. К inetic a nalysis о f yeast

115. TFIID-TATA box complex formation suggests a multi-step pathway. J Biol Chem. 267(16):11539-11547.

116. Horowitz S, Gorovsky M. A. 1985. An unusual genetic code in nuclear genesof Tetrahymena. Proc Natl Acad Sci USA. 82(8):2452-2455.

117. Hu S. L, Manley J. L. 1981. DNA sequence required for initiation oftranscription in vitro from the major late promoter of adenovirus 2. Proc Natl Acad Sci USA. 78(2):820-824.

118. Hultmark D., Klemenz R., Gehring W. J. 1986. Translational andtranscriptional control elements in the untranslated leader of the heat-shock gene hsp22. Cell. 44(3):429-438.

119. Javahery R., Khachi A., Lo K., Zenzie-Gregory В., Smale S. T. 1994. DNAsequence requirements for transcriptional initiator activity in mammalian cells. Mol Cell Biol. 14(1): 116-127.

120. Juo Z. S., Chiu Т. K., Leiberman P. M., Baikalov I., Berk A. J., Dickerson R.

121. E. 1996. How proteins recognize the TATA box. J Mol Biol. 261(2):239-254.

122. Juranek S., Jonsson F., Maercker C., Lipps H. J. 2000. The telomeres ofreplicating macronuclear DNA-molecules of the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae. Protistology. 1(4): 148-151.

123. Kaltenbach L., Horner M. A., Rothman J. H., Mango S. E. 2000. The TBP-likefactor CeTLF is required to activate RNA polymerase II transcription during C. elegans embryogenesis. Mol Cell. 6(3):705-713.

124. Karrer К. M. 1986. The nuclear DNAs of Holotrichous ciliates. In: Themolecular biology of ciliated protozoa. New York, Academic Press: 85110.

125. Katinka M. D., Bourgain F. M. 1992. Interstitial telomeres are hotspots forillegitimate recombination with DNA molecules injected into the macronucleus of Paramecium primaurelia. Embo J. 11(2):725-732.

126. Kaufmann J., Smale S. T. 1994. Direct recognition of initiator elements by acomponent of the transcription factor IID complex. Genes Dev. 8(7):821-829.

127. Kays A. R., Schepartz A. 2002. Gal4-VP16 and Gal4-AH increase theorientational and axial specificity of TATA box recognition by TATA box binding protein. Biochemistry. 41 (9):3147-3155.

128. Kim С. S., Preer J. R., Jr., Polisky B. 1992. Bacteriophage lambda DNAfragments replicate in the Paramecium macronucleus: absence of active copy number control. Dev Genet. 13(2):97-102.

129. Kim J. L., Nikolov D. В., Burley S. K. 1993a. Co-crystal structure of TBPrecognizing the minor groove of a TATA element. Nature. 365(6446):520-527.

130. Kim Y., Geiger J. H., Hahn S., Sigler P. B. 1993b. Crystal structure of a yeast

131. TBP/TATA-box complex. Nature. 365(6446):512-520.

132. Klobutcher L. A., Prescott D. M. 1986. The special case of the hypotrichs. In:

133. The molecular biology of ciliated protozoa. New York, Academic Press: 111-154.

134. Klobutcher L. A., Swanton M. Т., Donini P., Prescott D. M. 1981. All genesized DNA molecules in four species of hypotrichs have the same terminal sequence and an unusual 3' terminus. Proc Natl Acad Sci USA. 78(5):3015-3019.

135. Kreyenberg H., Witte H., Ammermann D. 1998. A comparison ofoveramplified macronuclear chromosomes in the ciliate Stylonychia lemnae. Eur. J. Protistol. 34(l):29-38.

136. Kutach A. K., Kadonaga J. T. 2000. The downstream promoter element DPEappears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Mol Cell Biol. 20(13):4754-4764.

137. Lagrange Т., Kapanidis A. N., Tang H., Reinberg D., Ebright R. H. 1998. Newcore promoter element in RNA polymerase Independent transcription: sequence-specific DNA binding by transcription factor IIB. Genes Dev. 12(l):34-44.

138. Larson D. D., Umthun A. R., Shaiu W. L. 1991. Copy number control in the

139. Tetrahymena macronuclear genome. J. Protozool. 38(3):258-263.

140. Lee Т. I., Young R. A. 2000. Transcription of eukaryotic protein-coding genes.

141. Annu Rev Genet. 34:77-137.

142. Leuthcr К. К., Bushnell D. A., Kornberg R. D. 1996. Two-dimensionalcrystallography of TFIIB- and IIE-RNA polymerase II complexes: implications for start site selection and initiation complex formation. Cell. 85(5):773-779.

143. Lewis B. A., Kim Т. K., Orkin S. H. 2000. A downstream element in thehuman beta-globin promoter: evidence of extended sequence-specific transcription factor IID contacts. Proc Natl Acad Sci USA. 97(13):7172-7177.

144. Li Y., Flanagan P. M., Tschochner H., Kornberg R. D. 1994. RNA polymerase1. initiation factor interactions and transcription start site selection. Science. 263(5148):805-807.

145. Lipps H. J., Bessler W. G. 1977. Early nuclear events following the interactionof the ciliate Stylonychia mytilus with the plant lectin Concanavalin A. Cell Differentiation. 6:187-197.

146. Lipps H. J., Steinbruck G. 1978. Free genes for rRNAs in the macronucleargenome of the ciliate Stylonychia mytilus. Chromosoma. 69(l):21-26.

147. Liston D. R., Johnson P. J. 1999. Analysis of a ubiquitous promoter element ina primitive eukaryote: early evolution of the initiator element. Mol Cell Biol. 19(3):2380-2388.

148. Liston D. R., Lau A. O., Ortiz D., Smale S. Т., Johnson P. J. 2001. Initiatorrecognition in a primitive eukaryote: IBP39, an initiator-binding protein from Trichomonas vaginalis. Mol Cell Biol. 21(22):7872-7882.

149. Liu Y., Schepartz A. 2001. Kinetic preference for oriented DNA binding by theyeast TATA-binding protein TBP. Biochemistry. 40(21):6257-6266.

150. Lo K., Smale S. T. 1996. Generality of a functional initiator consensussequence. Gene. 182(1-2): 13-22.

151. Longcor M. A., Wickert S. A., Chau M.-F., Orias E. 1996. Coassortment ofgenetic loci during macronuclear division in Tetrahymena thermophila. European Jornal of Protistology. 32(Suppl. I):85-89.

152. MacAlpine D. M., Zhang Z., Kapler G. M. 1997. Type I elements mediatereplication fork pausing at conserved upstream sites in the Tetrahymena thermophila ribosomal DNA minichromosome. Mol Cell Biol. 17(8):4517-4525.

153. Martinez E., Chiang С. M., Ge H., Roeder R. G. 1994. TATA-binding proteinassociated factor(s) in TFIID function through the initiator to direct basal transcription from a TATA-less class II promoter. Embo J. 1 3(13):3115-3126.

154. Martinez E., Zhou Q., L'Etoile N. D., Oelgeschlager Т., Berk A. J., Roeder R.

155. G. 1995. Core promoter-specific function of a mutant transcription factor TFIID defective in TATA-box binding. Proc Natl Acad Sci USA. 92(25): 11864-11868.

156. Marx J. 1995. How DNA replication originates. Science. 270(5242).T5851587.

157. Matsui Т., Segall J., Weil P. A., Roeder R. G. 1980. Multiple factors requiredfor accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase II. J Biol Chem. 255(24): 11992-11996.

158. McKnight S. L., Kingsbury R. 1982. Transcriptional control signals of aeukaryotic protein-coding gene. Science. 217(4557):316-324.

159. McNeil J. В., Smith M. 1985. Saccharomyces cerevisiae CYC1 mRNA 5'-endpositioning: analysis by in vitro mutagenesis, using synthetic duplexes with random mismatch base pairs. Mol Cell Biol. 5(12):3545-3551.

160. McTavish C., Sommerville J. 1980. Macronuclear DNA organization andtranscription in Paramecium primaurelia. Chromosoma. 78(2): 147-164.

161. Merriam E. V., Bruns P. J. 1988. Phenotypic assortment in Tetrahymenathermophila\ assortment kinetics of antibiotic-resistance markers, tsA, death, and the highly amplified rDNA locus. Genetics. 120(2):389-395.

162. Meyer E., Duharcourt S. 1996. Epigenetic regulation of programmed genomicrearrangements in Paramecium aurelia. J Eukaryot Microbiol. 43(6):453-461.

163. Meyer F., Schmidt H. J., Plumper E., Hasilik A., Mersmann G., Meyer H. E.,

164. Engstrom A., Heckmann K. 1991. UGA is translated as cysteine in pheromone 3 of Euplotes octocarinatus. Proc Natl Acad Sci USA. 88(9):3758-3761.

165. Meyers G., Helftenbein E. 1988. Transfection of the hypotrichous ciliate

166. Stylonychia lemnae with linear DNA vectors. Gene. 63(l):31-40.

167. Mosch H. U., Graf R., Braus G. H. 1992. Sequence-specific initiator elementsfocus initiation of transcription to distinct sites in the yeast TRP4 promoter. EmboJ. 11(12):4583-4590.

168. Murti K. G., Prescott D. M. 1983. Replication forms of the gene-sized DNAmolecules of hypotrichous ciliates. Mol Cell Biol. 3(9): 1562-1566.

169. Murti K. G., Prescott D. M. 2002. Topological organization of DNA moleculesin the macronucleus of hypotrichous ciliated protozoa. Chromosome Res. 10(2):165-173.

170. Nagawa F., Fink G. R. 1985. The relationship between the "TATA" sequenceand transcription initiation sites at the HIS4 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA. 82(24):8557-8561.

171. Nakatani Y., Brenner M., Freese E. 1990a. An RNA polymerase II promotercontaining sequences upstream and downstream from the RNA startpoint that direct initiation of transcription from the same site. Proc Natl Acad Sci USA. 87(11):4289-4293.

172. Nakatani Y., Horikoshi M., Brenner M., Yamamoto Т., Besnard F., Roeder R.

173. G., Freese E. 1990b. A downstream initiation element required for efficient TATA box binding and in vitro function of TFIID. Nature. 348(6296):86-88.

174. Nanney D. L. 1986. Introduction. In: The molecular biology of ciliatedprotozoa. New York, Academic Press: 1-26.

175. Nanney D. L., Preparata R. M. 1979. Genetic evidence concerning the structureof the Tetrcihymenci thermophila macronucleus. J. Protozool. 26:2-9.

176. Nikolov D. В., Chen H., Halay E. D., Hoffman A., Roeder R. G., Burley S. K.1996. Crystal structure of a human TATA box-binding protein/TATA element complex. Proc Natl Acad Sci USA. 93(10):4862-4867.

177. Nikolov D. В., Chen H., Halay E. D., Usheva A. A., Hisatake K., Lee D. K.,

178. Roeder R. G., Burley S. К. 1995. Crystal structure of a TFIIB-TBP-TATA-element ternary complex. Nature. 377(6545): 119-128.

179. Nock A. 1981. RNA and macronuclear transcription in the ciliate Stylonychiamytilus. Chromosoma. 83(2):209-220.

180. Ohishi-Shofuda Т., Suzuki Y., Yano K., Sakurai H., Fukasawa T. 1999.

181. Transcription initiation mediated by initiator binding protein in Saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophys Res Commun. 255(1): 157163.

182. Ohler U., Liao G. C., Niemann H., Rubin G. M. 2002. Computational analysisof core promoters in the Drosophila genome. Genome Biol. 3(12):RESEARCH0087.

183. Oka Y., Shiota S., Nakai S., Nishida Y., Okubo S. 1980. Inverted terminalrepeat sequence in the macronuclear DNA of Stylonychia pustulata. Gene. 10(4):301-306.

184. O'Shea-Greenfield A., Smale S. T. 1992. Roles of TATA and initiator elementsin determining the start site location and direction of RNA polymerase II transcription. J Biol Chem. 267(2): 1391-1402.

185. Palmer J. R., Daniels C. J. 1995. In vivo definition of an archaeal promoter. J

186. Bacteriol. 177(7): 1844-1849.

187. Parker C. S., Topol J. 1984. A Drosophila RNA polymerase II transcriptionfactor contains a promoter-region-specific DNA-binding activity. Cell. 36(2):357-369.

188. Patikoglou G. A., Kim J. L., Sun L., Yang S. H., Kodadek Т., Burley S. K.1999. TATA element recognition by the TATA box-binding protein has been conserved throughout evolution. Genes Dev. 13(24):3217-3230.

189. Pinto I., Ware D. E., Hampsey M. 1992. The yeast SUA7 gene encodes ahomolog of human transcription factor TFIIB and is required for normal start site selection in vivo. Cell. 68(5):977-988.

190. Postberg J., Juranek S. A., Feiler S., Kortwig H., Jonsson F., Lipps H. J. 2001.

191. Association of the telomere-telomere-binding protein complex of hypotrichous ciliates with the nuclear matrix and dissociation during replication. J Cell Sci. 114(Pt 10):1861-1866.

192. Preer J. R., Jr. 2000. Epigenetic mechanisms affecting macronucleardevelopment in Paramecium and Tetrahymena. J Eukaryot Microbiol. 47(6):515-524.

193. Preer J. R., Jr., Preer L. В., Rudman В. M., Barnett A. J. 1985. Deviation fromthe universal code shown by the gene for surface protein 51A in Paramecium. Nature. 314(6007): 188-190.

194. Preer J. R, Preer L. B. 1979. The size of macronuclear DNA and itsrelationship to models for maintaining genie balance. J. Protozool. 26(1): 14-18.

195. Prescott D. M. 1994. The DNA of ciliated protozoa. Microbiol Rev. 58(2):233267.

196. Prescott D. M. 1998. Invention and mystery in hypotrich DNA. J Eukaryot1. Microbiol. 45(6):575-581.

197. Pugh B. F., Tjian R. 1991. Transcription from a TATA-less promoter requiresa multisubunit TFIID complex. Genes Dev. 5(11): 1935-1945.

198. Purdy J. E, Mann B. J, Pho L. T, Petri W. A, Jr. 1994. Transient transfectionof the enteric parasite Entamoeba histolytica and expression of firefly luciferase. Proc Natl Acad Sci USA. 91(15):7099-7103.

199. Purnell B. A, Emanuel P. A, Gilmour D. S. 1994. TFIID sequence recognitionof the initiator and sequences farther downstream in Drosophila class II genes. Genes Dev. 8(7):830-842.

200. Purnell B. A, Gilmour D. S. 1993. Contribution of sequences downstream ofthe TATA element to a protein-DNA complex containing the TATA-binding protein. Mol Cell Biol. 13(4):2593-2603.

201. Quon D. Y., Delgadillo M. G, Khachi A, Smale S. T, Johnson P. J. 1994.

202. Similarity between a ubiquitous promoter element in an ancient eukaryote and mammalian initiator elements. Proc Natl Acad Sci USA. 91(10):4579-4583.

203. Qureshi S. A, Bell S. D, Jackson S. P. 1997. Factor requirements fortranscription in theArchaeon Sulfolobus shibatae. Embo J. 16(10):2927-2936.

204. Qureshi S. A, Jackson S. P. 1998. Sequence-specific DNA binding by the S.shibatae TFIIB homolog, TFB, and its effect on promoter strength. Mol Cell. l(3):389-400.

205. Raikov I. В. 1982. The Protozoan nucleus. Morphology and evolution. In: Cell1. Biology Monographs. Wien.

206. New York., Springer Verlag, 9: 1 -474.

207. Ranish J. A., Yudkovsky N., Hahn S. 1999. Intermediates information andactivity of the RNA polymerase II preinitiation complex: holoenzyme recruitment and a postrecruitment role for the TATA box and TFIIB. Genes Dev. 13(l):49-63.

208. Reischmann K. P., Zhang Z., Kapler G. M. 1999. Long range cooperativeinteractions regulate the initiation of replication in the Tetrahymena thermophila rDNA minichromosome. Nucleic Acids Res. 27(15):3079-3089.

209. Reiter W. D., Hudepohl U., Zillig W. 1990. Mutational analysis of anarchaebacterial promoter: essential role of a TATA box for transcription efficiency and start-site selection in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 87(24):9509-9513.

210. Roeder R. G. 1998. Role of general and gene-specific cofactors in theregulation of eukaryotic transcription. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 63:201-218.

211. Rowlands Т., Baumann P., Jackson S. P. 1994. The TATA-binding protein: ageneral transcription factor in eukaryotes and archaebacteria. Science. 264(5163):1326-1329.

212. Roy A. L., Du H., Gregor P. D., Novina C. D., Martinez E., Roeder R. G.1997. Cloning of an inr- and E-box-binding protein, TFII-I, that interacts physically and functionally with USF1. Embo J. 16(23):7091-7104.

213. Roy A. L., Malik S., Meisterernst M., Roeder R. G. 1993. An alternativepathway for transcription initiation involving TFII-I. Nature. 365(6444):355-359.

214. Roy A. L., Meisterernst M., Pognonec P., Roeder R. G. 1991. Cooperativeinteraction of an initiator-binding transcription initiation factor and the helix-loop-helix activator USF. Nature. 354(6350):245-248.

215. Sabaneeva E. V., Tao W., Verbelen J.-P. 1999. Aphidicolin inhibits DNAreplication in the micronucleus and blocks cytokinesis in Paramecium caudatum. Cell Biology International. 23(12):859-862.

216. Sakurai H., Ohishi Т., Fukasawa T. 1994. Two alternative pathways oftranscription initiation in the yeast negative regulatory gene GAL80. Mol Cell Biol. 14(10):6819-6828.

217. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A laboratorymanual. Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

218. Sawadogo M., Roeder R. G. 1985. Interaction of a gene-specific transcriptionfactor with the adenovirus major late promoter upstream of the TATA box region. Cell. 43(1): 165-175.

219. Seegmiller A., Williams K. R., Herrick G. 1997. Two two-gene macronuclearchromosomes of the hypotrichous ciliates Oxytricha fallax and O. trifallax generated by alternative processing of the 81 locus. Dev Genet. 20(4):348-357.

220. Seto E., Shi Y., Shenk T. 1991. YY1 is an initiator sequence-binding proteinthat directs and activates transcription in vitro. Nature. 354(6350):241-245.

221. Shi Y., Seto E., Chang L. S., Shenk T. 1991. Transcriptional repression by

222. YY1, a human GLI-Kruppel-related protein, and relief of repression by adenovirus El A protein. Cell. 67(2):377-388.

223. Singer V. L., Wobbe C. R., Struhl K. 1990. A wide variety of DNA sequencescan functionally replace a yeast TATA element for transcriptional activation. Genes Dev. 4(4):636-645.

224. Singh U., Rogers J. В., Mann B. J., Petri W. A., Jr. 1997. Transcriptioninitiation is controlled by three core promoter elements in the hgl5 gene ofthe protozoan parasite Entamoeba histolytica. Proc Natl Acad Sci USA. 94(16):8812-8817.

225. Skovorodkin I. N., Bollgonn S., Ammermann D., Gunzl A. 1999. Stabletransfection of the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae with tagged alpha 1 tubulin minichromosomes. Eur. J. Protistol. 35(l):70-80.

226. Skovorodkin I. N., Zassoukhina I. В., Hojak S., Ammermann D., Gunzl A.2001. Minichromosomal DNA replication in the macronucleus of the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae is independent of chromosome-internal sequences. Chromosoma. 110(5):352-359.

227. Smale S. T. 2001. Core promoters: active contributors to combinatorial generegulation. Genes Dev. 15(19):2503-2508.

228. Smale S. Т., Baltimore D. 1989. The "initiator" as a transcription controlelement. Cell. 57(1): 103-113.

229. Smale S. Т., Jain A., Kaufmann J., Emami К. H., Lo K., Garraway I. P. 1998.

230. The initiator element: a paradigm for core promoter heterogeneity within metazoan protein-coding genes. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 63:21-31.

231. Smale S. Т., Kadonaga J. T. 2003. The RNA polymerase II core promoter.

232. Annu Rev Biochem. 72:449-479.

233. Smale S. Т., Schmidt M. C., Berk A. J., Baltimore D. 1990. Transcriptionalactivation by Spl as directed through TATA or initiator: specific requirement for mammalian transcription factor IID. Proc Natl Acad Sci U S A. 87(12):4509-4513.

234. Steinbrueck G. 1983. Overamplification of genes in macronuclei ofhypotrichous ciliates. Chromosoma. 88:156-163.

235. Steinbrueck G. 1990. Recent advances in the study of ciliate genes. Eur. J.1. Protistol. 26:2-14.

236. Stenlund A. 2003. Initiation of DNA replication: lessons from viral initiatorproteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 4(10):777-785.

237. Stinchcomb D. Т., Thomas M., Kelly J., Selker E., Davis R. W. 1980.

238. Eukaryotic DNA segments capable of autonomous replication in yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 77(8):4559-4563.

239. Sun С. HT ai J. H. 1 999.1dentification and сharacterization оf a ran genepromoter in the protozoan pathogen Giardia lamblia. J Biol Chem. 274(28): 19699-19706.

240. Sundquist W. I., Klug A. 1989. Telomeric DNA dimerizes by formation ofguanine tetrads between hairpin loops. Nature. 342(6251):825-829.

241. Suzuki Y., Tsunoda Т., Sese J., Taira H., Mizushima-Sugano J., Hata H., Ota

242. Т., Isogai Т., Tanaka Т., Nakamura Y. and others. 2001. Identification and characterization of the potential promoter regions of 1031 kinds of human genes. Genome Res. 11(5):677-684.

243. Swanton M. Т., Heumann J. M., Prescott D. M. 1980. Gene-sized DNAmolecules of the macronuclei in three species of hypotrichs: size distributions and absence of nicks. DNA of ciliated protozoa. VIII. Chromosoma. 77(2):217-227.

244. Takada S., Lis J. Т., Zhou S., Tjian R. 2000. A TRF1:BRF complex directs

245. Drosophila RNA polymerase III transcription. Cell. 101(5):459-469.

246. Tan M., Jahn C. L., Price С. M. 2003. Origin usage during Euplotes ribosomal

247. DNA amplification. Eukaryotic Cell. 2(1): 115-122.

248. Tanese N., Pugh B. F., Tjian R. 1991. Coactivators for a proline-rich activatorpurified from the multisubunit human TFIID complex. Genes Dev. 5(12A):2212-2224.

249. TsaiF.T., Littlefield O., KosaP.F., Cox J. M., Schepartz A., Sigler P. B.1998. Polarity of transcription on Pol II and archaeal promoters: where is the "one-way sign" and how is it read? Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 63:53-61.

250. Tsai F. Т., Sigler P. B. 2000. Structural basis of preinitiation complex assemblyon human pol II promoters. Embo J. 19(l):25-36.

251. Tschumper G., Carbon J. 1980. Sequence of a yeast DNA fragment containinga chromosomal replicator and the TRP1 gene. Gene. 10(2): 157-166.

252. Usheva A., Shenk T. 1994. TATA-binding protein-independent initiation:

253. YY1, TFIIB, and RNA polymerase II direct basal transcription on supercoiled template DNA. Cell. 76(6): 1115-1121.

254. Usheva A., Shenk T. 1996. YY1 transcriptional initiator: protein interactionsand association with a DNA site containing unpaired strands. Proc Natl Acad Sci USA. 93(24):13571-13576.

255. Wasylyk В., Derbyshire R., Guy A., Molko D., Roget A., Teoule R., Chambon

256. P. 1 980. Specific in vitro transcription ofconalbumin gene is drastically decreased by single-point mutation in T-A-T-A box homology sequence. Proc Natl Acad Sci USA. 77(12):7024-7028.

257. Wefes I., Lipps H. J. 1990. The two macronuclear histone H4 genes of thehypotrichous ciliate Stylonychia lemnae. DNA Seq. l(l):25-32.

258. Wegner M., Helftenbein E., Muller F., Meinecke M., Muller S., Grummt F.1989. Identification of an amplification promoting DNA sequence from the hypotrichous ciliate Stylonychia lemnae. Nucleic Acids Res. 17(21 ):8783-8802.

259. Weis L., Reinberg D. 1997. Accurate positioning of RNA polymerase II on anatural TATA-less promoter is independent of TATA-binding-protein-associated factors and initiator-binding proteins. Mol Cell Biol. 17(6):2973-2984.

260. Williamson J. R., Raghuraman M. K., Cech T. R. 1989. Monovalent cationinduced structure of telomeric DNA: the G-quartet model. Cell. 59(5):871-880.

261. Witte H., Kneer M., Ammermann D. 1995. Transcription of the higly amplifiedtubulin gene family of Stylonychia lemnae. Eur. J. Protistol. 31:268-274.

262. Wobbe С. R., Struhl К. 1990. Yeast and human TATA-binding proteins havenearly identical DNA sequence requirements for transcription in vitro. Mol Cell Biol. 10(8):3859-3867.

263. Wong J. M, Bateman E. 1994. TBP-DNA interactions i n the minor groovediscriminate between A:T and T:A base pairs. Nucleic Acids Res. 22(10): 1890-1896.

264. Wunning I. U, Lipps H. J. 1983. A transformation system for the hypotrichousciliate Stylonychia mytilus. Embo Journal. 2(10): 1753-1757.

265. Xu L. C, Thali M, Schaffner W. 1991. Upstream box/TATA box order is themajor determinant of the direction of transcription. Nucleic Acids Res. 19(24):6699-6704.

266. Yee J, Mowatt M. R., Dennis P. P, Nash Т. E. 2000. Transcriptional analysisof the glutamate dehydrogenase gene in the primitive eukaryote, Giardia lamblia. Identification of a primordial gene promoter. J Biol Chem. 275(15): 11432-11439.

267. Zahler A. M, Prescott D. M. 1988. Telomere terminal transferase activity inthe hypotrichous ciliate Oxytricha nova and a model for replication of the ends of linear DNA molecules. Nucleic Acids Res. 16(14B):6953-6972.

268. Zahler A. M, Prescott D. M. 1989. DNA primase and the replication of thetelomeres in Oxytricha nova. Nucleic Acids Res. 17(15):6299-6317.

269. Zhang D. Y, Carson D. J, Ma J. 2002. The role of TFIIB-RNA polymerase IIinteraction in start site selection in yeast cells. Nucleic Acids Res. 30(14):3078-3085.

270. Zhang Z, Macalpine D. M, Kapler G. M. 1997. Developmental regulation of

271. DNA replication: replication fork barriers and programmed geneamplification in Tetrahymena thermophila. Mol Cell Biol. 17(10):6147-6156.

272. Zhao X., Herr W. 2002. A regulated two-step mechanism of TBP binding to

273. DNA: a solvent-exposed surface of TBP inhibits TATA box recognition. Cell. 108(5):615-627.

274. Zhou Q., Lieberman P. M., Boyer T. G., Berk A. J. 1992. Holo-TFIID supportstranscriptional stimulation by diverse activators and from a TATA-less promoter. Genes Dev. 6(10): 1964-1974.

275. Zhou Т., Chiang С. M. 2001. The intronless and TATA-less human TAF(II)55gene contains a functional initiator and a downstream promoter element. J Biol Chem. 276(27):25503-25511.

276. Zimmermann K., Mannhalter J. W. 1996. Technical aspects of quantitativecompetitive PCR. Biotechniques. 21(2):268-272, 274-269.1. БЛАГОДАРНОСТИ

277. Я считаю своим приятным долгом выразить глубокую и искреннюю признательность профессору Дитеру Аммерманну и профессору Сергею Николаевичу Борхсениусу, под доброжелательным руководством которых была выполнена эта работа.

278. Особую признательность хочу выразить Илье Николаевичу Сковородки-ну, который являлся соавтором всех исследований, положенных в основу диссертации.

279. Хочу поблагодарить сотрудников лаборатории клеточной биологии университета г. Тюбинген за помощь в освоении методик и советы, сделанные во время выполнения работы и при обсуждении ее результатов.

280. Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории структурной организации генома Института цитологии за внимание, проявленное ими на всех этапах работы.

281. Автор благодарит Александра Юрьевича Пименова и Алексея Юрьевича Костыгова за сотрудничество.

282. Автор выражает искреннюю благодарность Сергею Ивановичу Фокину за постоянное внимание, которое он оказывал на всех этапах исследования.

283. Автор благодарит Российский Фонд Фундаментальных Исследований (грант 03-04-48505-а) и Немецкий Фонд Академических Обменов (DAAD) (грант 325/lin) за оказанную финансовую поддержку.