Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция структурно-физических и функциональных свойств сывороточного альбумина физико-химическими факторами среды

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция структурно-физических и функциональных свойств сывороточного альбумина физико-химическими факторами среды"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

БИОФИЗИКИ

РГ 8 ^

На правах рукописи

1 ь КАЯ шз

ДОРЖИЙН НЯМАА

УДК 577, 112, 591, 175

РЕГУЛЯЦИЯ

СТРУКТУРНО-ФИЗИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ ФАКТОРАМИ СРЕДЫ

03.00.02 - БИОФИЗИКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПУЩИНО • 1993

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научный консультант: доктор биологических наук Э.А.Бур-штейн

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ф.И.Атауллаханов

доктор биологических наук З.А.Подлубная

доктор физико-математических наук А.И.Котельников.

Ведущая организация: Институт фотобиологии АН Беларуси, Минск, Беларусь. - j/по

Защита состоится 08 АПРЕЛЯ 1993 г.в 'н—ч на заседании Специализированного Ученого совета д. 200.22.01. при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (142292, г. Пущино, Моск. обл. ИТЭБ РАН)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан 05" 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета _

кандидат биологических наук/ / {J¿i,^ff¡fi>П.А.Нелипович

/ —....

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

ДОРХИЙН НЯМАА

УДК 577,112,591,175

РЕГУЛЯЦИЯ

СТРУКТУРНО-ФИЗИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ ФАКТОРАМИ СРЕДЫ

03.00.02-БИОФИЗ ИКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПУШИМО-1993

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Сывороточный альбумин-один из основных бедно», циркулирующих по всему организму позвоночных животных с кровью и межклеточной жидкость» - является важнейшим элементом транспортной и защитной системы организма. Связывая низкомолекулярные метаболиты и посторонние вещества различных структурных классов« как органической,так и неорганической природы, он выполняет функцию главного транспортера в процессах направленного транспорта этих лигандов от одних органов и тканей к другим. Альбумин принимает участие в защите организма от токсического действия активных форм кислорода (антиокислительнке свойства) и чужеродных низкомолекулярных токсических веществ(например тяжелых металлов, органических токсинов) играет роль фактора роста клеток печени, регулирует структурно-функциональные свойства капилляров.

Очевидно,что для того,чтобы понять механизм регуляции структурных и функциональных свойств альбумина,необходимо исследовать его функциональные, структурно-физические свойства и их изменения под действием различных физических и химических факторов,которые определяют особенности пространственно организованной среды организма: жидкостей, различных органов и тканей организма. Наиболее универсальными из таких факторов являются температура,кислотность (рН), ионная сила и ионной состав. Учитывая, что функциональная активность белков и белковых систем (ферментных, регуляторных, механо-химических, транспортных и др.) нередко резко зависит от характеристик всех этих факторов среды в физиологическом диапазоне, логично предположить, что в процессе эволюции эти зависимости могли быть развиты и использованы как механизмы системной регуляции активности белхов-исполнителей. Это является основной концепцией, выдвигаемой нами в настоящем исследовании. Потенциальную возможность такой регуляции мы попытались выявить на примере транспортной функции сывороточного альбумина.

Актуальность проведения целенаправленных исследований транспортных систем на молекулярном уровне с позиции этой концепции диктуется следующими предпосылками и обстоятельствами:» молекулах альбумина заложены возможности изменений его структурно-физиологических свойств в широких интервалах изменения температуры и кислотности, в том числе и п^и средних физиологических значениях.Известные структурные перестройки альбуминов и их влияние на связывание лигандов требуют уточнений,какие из этих изменений факторов

среды являются физиологически значимыми.Нормальные функциональные процессы сопровождаются большими или меньшими отклонениями параметров внутренней среды от их среднего гомеостатичесгого значения (гомеоклаз). Становится все более очевидным, что в зависимости от физиологического или патологического состояния организма,от локализации того или иного органа (ткани) в теле животного,от физико-химических факторов окружающей среды температура,кислотность,ионный состав, содержание активных форм кислорода и другие характеристики локальной среды могут изменяться в достаточно широких пределах, что нуждается в детальном систематическом анализе в сопоставлении с активность» белков. Далее, на уровне взаимодействия альбумина и его комплексов с лигандами, со стенкой сосудов кровеносного русла и поверхностью клеток, кроме системного механизма регуляции'загрузки" и "разгрузки* лигандов,изменений основных характеристик факторов локальной микросреды.проявляется специфические механизмы, связанные с особенностями каждого типа клеток и клеточных слоев, мобилизацией макродепо (системы циркуляции), которые могут приводить к изменению концентрации белков и лигандов, а также с изменением структурно-функциональных свойств альбумина при связывании на поверхности клеток и стенок сосудов и др. Этими факторами должно определяться динамическое поведение транспортных систем и их согласованное функционирование с ферментными и другими системами, что можно выяснить с помощью теоретических методов математического моделирования.

Все эти соображения легли в основу задач, решаемых в настоящем диссертационном исследовании.

Цели и задачи работы.

Сформулированная выше гипотеза о регуляции функционирования транспортной и депонирующей функции сывороточного альбумина физико-химическими факторами среды требует разносторонней проверки и обоснования на молекулярном и физиологическом уровнях. Главной целью этой работы является выявление молекулярных, структурных и физико-химических предпосылок специфической по лигандам регуляции связывания ("загрузки") и диссоциации ("разгрузки") лиганда физико-химическими факторами среды,которые заложены в свойствах самого сывороточного альбумина и в системах гомеостаза.а также теоретический анализ динамического поведения транспортных систем с учетом факторов, приводящих к нелинейным кинетическим явлениям.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи.

(.Провести анализ литературных данных о диапазоне физиологических изменений температуры, кислотности и ионного состава внутренних сред организма в сопоставлении со структурными, физико-химическими и функциональными перестройками в сывороточных альбуминах под действием этих факторов.

2.Целенаправленно исследовать изменения структурно-физических и лиганд-связываюших свойств сывороточных альбуминов при изменениях температуры, рН и ионной силы раствора,а также под действием ионов кальция, меди, хлоридов и сульфатов.

3.Исследовать антиокислительные защитные свойства альбумина, процессы взаимодействия его с активными формами кислорода и защиты лиганжами альбумина от окислительного и фотоокислительного повреждения.

Попытаться теоретическими методами выявить возможность возникновения нелинейных (в том числе, колебательных) режимов кинетики функционирования транспортных систем в моделях, учитывающих ввод и вывод транспортера,его депонирование и структурно-функциональные перестройки, а также сопряжение с ферментными системами, потребляюпими транспортируемый лиганд.

5.Полученные результаты проанализировать как экспериментальные доказательства принципиальной возможности избирательной регуляции транспортной функции сывороточного альбумина за счёт изменений основных физико-химических факторов среды (температуры, кислотности, ионной силы и др.).

Научная новизна результатов.

Анализ литературных данных о диапазоне встречающихся в организме теплокровных животных изменений температуры, кислотности, ионного состава и содержания активных форм кислорода и других характеристик микросреды показал, что кроме регулярного отклонения от среднего гомеостатческого значения в нормальных физиологических условиях, они могут изменяться в достаточно широких пределах в зависимости физиологического и патологического состояний отдельных органов,тканей и целого организма.Это позволило выдвинуть новую концепцию о системной регуляторной роли этих факторов в функционировании белков и белковых систем.

Обнаружены и охарактеризованы ранее неизвестные температурно и рН-индуцируемые структурные перестройки альбуминов сыворотки

крови в условиях,близких к средним гомеостатическим значениям температуры до 42*С, рН до 8,0, ионной силы до 0,2 и неорганических ионов (кальция, хлоридов, сульфатов и меди). Получены прямые экспериментальные доказательства того,что сравнительно небольшие вариации указанных факторов среды в диапазоне их физиологических изменений способны существенно и по разному изменять сродство альбумина к лигандам разных классов. Это доказывает принципиальну» возможность регуляции физико-химическими факторами среды'загрузки" и "разгрузки" специфических центров связывания альбумина, то есть его транспортной функции. Обнаружены специфические центры альбумина для захвата активных форм кислорода, ответственные за окислительное повреждение и фрагментацию белка.Экспериментально доказано, что активация органических лигандов и белковых групп в специфических центрах их связывания в альбумине под действием активных форм кислорода вызывает центроспецифическое образование ко-ньюгатов альбумин-лиганд, что приводит к эффектам зашиты функциональных центров белка от окислительного повреждения.Продемонстрирован локальный и центроспецифический характер процессов фотоокисления при действии оптического излучения на хромофоры эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов,чувствительность которых сильно зависит от структурных состояний (например, температурно и рН-ин-дуцируемых) альбумина.Это позволило значительно уточнить механизм защитной функции (антиокислительной, антигенной и др.) альбумина и выявить регулируемость процессов окислительного и других путей повреждения или деградации белка активными формами кислорода,концентрацией лигандов и неорганических ионов.изменениями физиологических (температуры, рН и ионной силы) и экологических или клинических (облучение) факторов среды.

Построены нелинейные математические модели транспортных систем и выявлены условия возникновения колебательных режимов кинетики их функционирования, что может лежать в основе экспериментально наблюдаемого колебательного поведения концентрации некоторых транспортируемых белками эндогенных и экзогенных лигандов.

Практическая значимость работы:

Полученные результаты можно рассматривать как вклад в общую молекулярную теорию транспортной,депонирующей и защитной физиологической функции сывороточного альбумина. Их необходимо учитывать как при разработке молекулярно - биофизических представлений о

транспортной и защитной функции крови, так и в физиологических и фармакологических исследованичх распределения вешеств(в частности, лекарств) в организме.Полученные данные и развиваемые подходы могут быть также полезны при изучении значимости сдвигов гомеостаза в организме в особых физиологических и патологических состояниях. Они могут быть использованы в таких направлениях исследования как молекулярная иммунология, молекулярная фотобиология,радиобиология, теория динамических систем и др.Полученные данные являются фундаментом для выяснения молекулярных основ разработки методов уменьшения падежа скота, повышения его продуктивности и понижения его чувствительности к токсинам пастбищных растений. Они могут лечь в основу теории профилактического действия крови,предварительно облученной светом оптического диапазона.

Апробация работы: Основные результаты работы были представлены на ряде конференций и симпозиумов: Всесоюзном совещании по биологическому действию ультрафиолетового излучения (Горький, 1973); Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров ( Харьков, 1981),на ряде ежегодных (1973-1989 гг.) конференций стран-учстниц по проблеме "Исследования в области биологической физики".

Публикации: Результаты работы опубликованы в 34 рабатах.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения,семи глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 277 страницах, включает 10 таблиц и 43 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 508 наименований.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

I.Сформулирована концепция о возможной системной регуляции функционирования белков (ферментов,транспортеров,регуляторов и т. д.^) посредством специфических для органов, тканей,клеток физиологических и патологических сдвигов гомеостаза по основным физико-химическим характеристикам - температуре, кислотности,ионной силе и т.п. Согласно этой концепции,изменение этих характеристик в физиологическом, иногда достаточно широким диапазоне может переключать отдельные белки и целые белковые системы с одного функционального режима на другой посредством активации, ингибирования, изменения специфичности и других параметров проявления активности

белков.

2.Анализ литературных данных о реализуемых в организмах теплокровных животных изменениях температуры, рН,ионной силы и ионного состава в сопоставлении с литературными и собственными данными о зависимости от этих характеристик структурно-физических и функциональных (число центров связывания для лигандов разного типа,константы ассоциации) свойств главного транспортного белка плазмы крови и интерестициальной жидкости привел к заключенно о принципиальной возможности специфических по типу транспортируемых лигандов изменений сродства и.следовательно,эффективности "загрузки" и "разгрузки" различных лигандов в отдельных тканях и при особых состояниях ткани (и организма в целом) за счет различий или изменений во временя универсальных физико-химических факторов (температуры, рН, ионной силы и ионного состава) локальной среды.

3.Для сывороточных альбуминов человека, крупного рогатого скота,верблюда выявлены и охарактеризованы структурно-физические перестройки при изменении температуры в диапазоне 25-40'С, ионной силы в диапазоне 0,05-0,2, рН в диапазоне 5,6-7,5, специфически изменяющие сродство к одним лигандам, и не влияющие на сродство к другим.

4.С позиций возможной регуляторной функции охарактеризовано влияние температуры и ионной силы на известный рН-индуцируемый структурный К-Р-переход сывороточных альбуминов и выявлено расщепление на две стадии при 37*С и ионной силе 0,2 или при понижений ионной силы во всем температурном дийпазоне. Выявлена связь между фазами М-Р-перехода с изменением главных и вторичных центров связывания красителей. Выявлено комплексное влияние температуры и ионной силы на положение в шкале рН К-В-(Л-А)-перехода в нейтральной зоне кислотности (рН 7,0-8,5).

5.Выявлено значительное влияние ионной силы.природы аниона(СГ, 50ч ) на связывание М-формой альбумина красителей,ионов Са**и ионов меди. Эффект сложным образом проявляется при сочетании изменений температуры.ионной силы,рН и ионного состава среды, что может обуславливать тонкую регуляцию связывания и диссоциации различных лигандов.

(.Выявлены следующие функциональные следствия высокой реактивности сывороточного альбумина по отношению к активным формам кислорода: а) активные формы кислорода сокращают время жизни альбумина в циркуляторном русле; б) высокое содержание альбумина в крови, межклеточной жидкости и в лимфе приводит к защите других

систем организма от поражающего действия активных форм кислорода;

в) окисление кислородом альбумина значительно изменяет сродство и характер взаимодействия его с транспортируемыми лигандами;

г) реакции альбумина с активным кислородом зависит от наличия связываемых лигандов (зашита) и от физико-химических характеристик среды. Предсказана локализация в белке центров, ответственных за модификацию и фрагментацию молекулы альбумина при окислении кислородом.

7.Разработаны нелинейные математические модели процесса транспорта белком, учитывающие введение белка-транспорта ('синтез"), его вывод ("деградацию"), зависимость от структурного состояния, индуцируемого связыванием лиганда, сопряжение с системами генерации и утилизации транспортируемого лиганда (ферментными системами), продемонстрировали возможность колебательных режимов транспорта лигандов. Такие режимы описаны в литературе для макротранспорта (по содержанию лекарственных препаратов в крови животных) и могуть играть регуляторную роль, в частности для сопряжения с другими метаболическими осцилляторами.

СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О СТРУКТУРНЫХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВАХ МОЛЕКУЛ СЫВОРОТОЧНЫХ АЛЬБУМИНОВ I.Транспортно-депонируюшая функция альбуминов.

Пространственная структура молекулы альбумина определяется взаимной упаковкой трёх крупных доменов,шести субдоменов или девяти петель.При этом 17 дисульфидных связей располагаются лишь внутри демонов, обеспечивает практически параллельную упаковку трех отдельных участков в длинной петле каждого домена [Brown 1977].

Сывороточные альбумины осуществляют транспортирование и депонирование слаборастворимых в крови веществ эндогенного и экзогенного происхождения,В этой связи классификация и харахтеризация центров связывания этих лигандов, их взаимодействия имеет,важное значение в выяснении структурно-функциональных свойств альбумина.

Литературные данные по взаимодействию лигандов с альбуминами и конкуренции лигандов между собой за место связывания показывают, что молекула альбумина имеет шесть участков для связывания различных лиганжов'.высших жирных кислот;триптофаиа,тироксина и ионов хлора; билирубина, варфарина и различных красителей; ионов меди и никеля; гемина; салициловой кислоты и некоторых лекарственных ве-леств (Kragh-Hanien,I9811.Однако специфичность центров связывания

лигандов как правило относительна: первичные ("сильные") центры обладает сравнительно высокой специфичностью, а для вторичных,более слабых центров нередко наблюдается конкуренция между лиганда-ми за место связывания разного класса.

Основное наше внимание было уделено характеризации центров связывания анионных лигандов с гидрофобными участками(красителей.жирных кислот,детергентов и др.). Выбор этих лигандов обусловлен тем, что именно они образуют с альбумином более прочные комплексы и полученные результаты должны существенно облегчить интерпретацию экспериментальных данных с позиции выдвинутой нами концепции.Измерение параметров связывания (числа центров и констант связывания) красите»«-1-*нцшн-Я-няАтвлмисулнфоната(АНС),альбумином позволило выделить два типа центров сильного связывания с константами ассоциации ,различающимися в 5-6 раз.К первому типу,характеризующемуся высоким сродством ( при ионнои -----

>й силеуЧ-0,2;К1»(2.1-4,5)*10 М* ), |у же(приу*=0,2¡Кг»(4, 2-7,3) *1 О* М-1 )

относится один центр;ко второму же(при/*=0,2;К2»(4,2-7,3)*10 М ) -два центра на молекулу альбумина.

Присутствие пятикратного молярного избытка пальмитата выявляет эффективную конкуренцию с АНС лишь за один из вторичных центров связывания,не влияя на сродство АНС главному центру.Додецилсульфат в той же концентрации приводит к исчезнованип всех вторичных центров и снижению константы ассоциации главного центра АНС.

Стехиометрическое связывание' отдельных молекул додецилсульфата альбумином оказывает существенное влияние на окружение и состояния ароматических аминокислотных остатков (тирозина,триптофана) в области его концентрации, где прямого взаимодействия между детергентом и хромофорами не происходит. Более глубокие структурные изменения происходят при включении молекул белка в мицеллярную структуру в области высоких концентрации детергента(>10 М ).

Анализ собственных и литературных данных показывает, что изучение связывания АНС с альбуминами позволяет получить информации о свойствах первичных центров билирубина,триптофана и вторичных центров высших жирных кислот на молекуле белка.

Были также выявлены и охарактеризованы специфические центры для связывания некоторых химических соединений кумаринового ряда (даурозида, дауронила, фраксетнна), выделенных и очищенных из лекарственных растений Монголии. Более четкий механизм регуляции их взаимодействия факторами среды выявлен на примере связывания фраксетнна альбумином верблюда.

В области рН 7,0-7,$ при 20*С 2 молекулы фраксетина, вы делен-

ного из Солянки лиственницелистной (5а1»оПа ЬапсПоНа ТигС1.ех. 1И(,), связывается с сывороточным альбумином с эффективной константой 1,2*10*м"1 Эффективное число молекул фраксетина,связывающиеся одной молекулой белка уменьшается примерно вдвое при снижении рН до 6,0 ( Ка~4,7Ч0вМ~У

Таким образом изменение рН в этой области может регулировать взаимодействие между альбумином и фраксетином. Повышение температуры от 20 до 37*С уменьшает величину эффективной константы связывания фраксетина примерно на порядок, но не сказывается на стехиометрии связывания.

РЕГУЛЯЦИЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ АЛЬБУМИНОВ ПОСРЕДСТВОМ ИЗМЕНЕНИЙ ТЕМПЕРАТУРЫ СРЕДЫ

(.Физиологические вариации температуры в организме животных.

Температура у одного и того же организма не только неодинакова в разных участках тела и органах, но может значительно холебаться в зависимости от внешних воздействий и физиологического в т.ч.патологического состояния организма. Регулярное суточное колебание средней внутренней температуры у человека,млекопитающих, а также у птиц в пределах 1 -2еС присуще самому организму и имеет истинно эндогенный характер [Антонов, 1989; Шмидт-Нильсон, 1982; Хочачка, Сомеро, 1988].

Анализ литературных данных показывает,что в зависимости от физиологического состояния организма, от локализации того или иного органа (ткани) в теле животного, от температуры и влажности окружающей среды и от специфики и интенсивности биоэнергетических процессов »"данной ткани температура в кровяном русле и в интер-стициальном пространстве может меняться в пределах от 10 до 44*С [Тау!ег, 1972 ; 5с1)ли(Л-Же1|еп е1.а1 ., 1967].Этот фактор неизбежно должен был сказаться на эволюции физических и функциональных свойств отдельных белков и белковых систем в организме,особенно белков, циркулирующих по всему организму.

В случае такого транспортного белка как сывороточный альбумин, изменение с температурой сродства и скорости связывания и диссоциации различных транспортируемых веществ может быть использовано организмом как один из факторов регуляции эффективности ор-гано-специфической "адресовки'транспорта ("загрузки'и "разгрузки" альбумина) отдельных метаболитов, продуктов метаболизма и ксенобиотиков.

2.Температурно-индуцируеиые структурные переходы сыюроточных альбуминов ■ нейтральной зоне рН. Сушествованне температурно-индуцнруемых структурных и функциональных неденатурационнмх изменений в белках и ферментах в физиологическом диапазоне температур показана давно. Эти изменения обнаруживаются по изменению как физических свойств белка, так и его функциональных характеристик [Александров,1985; Конев и др, 1970; Goldberg et.al 1976].

Пользуясь методами собственной флуоресценции альбумина и связанного АНС.мы исследовали влияние температуры на состояние единственного остатка триптофана и центры связывания лигандов или функциональные свойства белка. Выбирая режимы проведения эксперимента (ионная сила,рН и т.я) можно выявить изменения как конфор-мационных.так и функциональных свойств альбумина.

Наши данные показывают существование не менее трех состояний альбумина человека в зависимости от температуры, что сопровож-Д max.nm

340 —

336 -

332

1,4

1,3

1,2

1,1

1,0

©, Б

Щп

1 ©П. 1 1

20

30

40 t С

1,1 1,2 1,3 ^ Рис.I.Температурно-индуцируеиые структурные переходы сывороточного альбумина человека. А - зависимость от температуры положения максимума спектра собственной флуоресценции САЧ:1-0,2М ИаСI,рН7,0; 2-0,2М ИаС 1 ,рН 5,6 и 0,001М N801,рН 7,0; 3-0.001М N301,рН 5,6. Б-фазовые графики структурных переходов. 1320/ Б, >эбо/ ^ - отношения интенсивности флуоресценции при 320 и 360 нм к плошали под спектром. Очерченные области соответствуют: I-40-50°С,0,001М N301, рН 5,6; 11 -8-25вС, 0.001М Иаа.рН 5,6 и 40-50вС, 0,2М N801,рН 5,6: 1П-8-35вС, 0,2М N801,рН 5,6 и 8-50*0, 0,2М N801,рН 7,0.

дает« изменением микроокружения остатки триптофана Рис.1А. Переходи вежду зтими формами при нагревании хорошо »идны на фазовых графжах,изображенных на Рис.1Б.

Виано,что в интервале температуры от 25 до 40°С при рН 5,6 и высоой ионной силе (^»0,2) или при рН 7,0 и низкой ионной силе (^■вя001) происходят структурные изменения,приводящие,повидимому, к образованию новых гидрофобных участков в окрестности остатка триптофана (Т^-35-36*С) .Подобный неденатурационный тепловой переход обнаруживается в изменении свойств центра связывания красителей да рН 7,0 и высокой ионной силе (уч«0,2).

Кснфоркационкме изменения, наблюдаемые в интервале температур от 20 до 45*С, сопровождаются существенным изменением состояния функциональных центров связывания альбумина (Таблица 1).

Таблица 1. Число центров (п ) и константы

ассоциации (Ка) АНС с альбумином человека при различных температурах

-в -1 -в -л

Темгнратур : Ионная : рН : nt : Kt40 М : па : Ка* 10 М

"t : сила : : : :

20 0,2 7,0 1 2,35 2,0 0,41

35 0,2 7,0 0,9 3,8 2,8 0,22

42 0,2 7,0 0,9 5,2 2,8 0,22

Водно, что повышение температуры от 20 до 42 С в присутствии 0,2 М NaCI приводит примерно к двукратному росту константы ассоциации АНС первичным центром связывания в белке. При температурах же 35 м 42*С наблюдается уже три вторичных центра с несколько уменькиной.по сравнению с 20*С, константой связывания,за которые эффекжако конкурируют додецильсульфат и пальмитат и др.Литературных данные показывают, что при повышении температуры от 18 до 38*С зкньшаются константы связывания альбумином человека ацетил-Ь-триягофана.скатолаДОс.Мепату, 1964] и билирубина (Jacobten,1977J.

Осх&й характер температурной зависимости связывания был обнаружен 1 красителя бутилового оранжевого, имеющего максимум сродства овило 20-25°C. ( Reddy. 1985; Takag; Shi et.al 1974]. Влияня температуры на центры связывания жирных кислот различ-

ного класса имеет неодинаковый характер [Spector et.al, 1965].

Таким обраюм, эти данные указывают на различия в чувствительности к нагревания связывания лигандов в разных функциональных участках молекул сывороточных альбуминов. Они свидетельствуют о том, что при изменении температуры в организме загрузка и разгрузка разных метаболитов будет изменяться, и изменяться по-разному.

РЕГУЛЯЦИЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ АЛЬБУМИНОВ СДВИГОМ КИСЛОТНОСТИ СРЕДЫ I.Диапазон изменения рН в организме.

Избыток водородных ионов (ацидоз), либо их недостаток (алкалоз) приводят к резким изменениям в обмене веществ организма. Ускоренный катаболизм «ирных кислот или сниженный уровень использования углеводов могут привести к снижению рН в крови,тканях и органах. Алкалоз и ацидоз могут иметь как физиологический,так и патологический характер у различных позвоночных,как теплокровных, так и холоднокровных,рН крови варьирует в пределах от 7,4 до 8,2 в зависимости от температуры тела.Причем при нагревании у самых различных позвоночных снижается рН крови ( Хочачка, Сомеро, 1988; Мак-Мюррей, 1980]. В различных органах и тканях теплокровных обнаруживаются свои характерные средние значения рН в пределе от 6,7 до 7,2 при 37°С [Katz et.al., 1988; Но I па rd et.al., 1988; Ли-тинская и др., 1987, 1988; Марголис и др, 1988].

Отклонения рН от средней величины при общем ацидозе или алкалозе в капиллярах и интерстициальном пространстве отдельных органов,тканей,а также в определенных патологических ситуациях,не может не изменять сродства сывороточного альбумина к разным классам транспортируемых им по организму низкомолекулярных веществ.

2.Индуцируемые закислением среды структурно-функциональные изменения сывороточных альбуминов.

Хорошо известно,что рН индуцируемые структурные переходы сывороточных альбуминов при изменении рН от 5,0 до 3,4 ( N-F-переход) и ниже 3,4 ( "кислотное расширение" или F-E-переход) сопровождаются существенным изменением параметров их собственной флуоресценции, дисперсии оптического вращения, скорости водородно-дейтерие-юго обмена, характеристической вязкости и других физико-химичес-сих свойств белка [ Luetscher, 1939; Aoku,Foster, I957;Sogami,et. il, 1968]. Практически полная обратимость, которая регистрируется >азными физическими и физико-химическими методами,с одной стороны,

и потенциальная возможность локального закисления крови или интер-стициальной жидкости в особых физиологических условиях до весьма низких значениях рН,с другой,позволяют думать, что в ряде случаев Л-Р-перестройка,приводящая к резкому изменению физических и связывающих свойств белка,может играть функциональную роль при экстремальных сдвигов рН в организме(например,в зонах воспаления и т.п).

Мы исследовали этот вопрос с учётом различных вариантов изменения температуры и ионной силы среды. Экспериментальние данные показывают, что Н-Р-переход осуществляется как двухстадийный процесс при нормальных физиологических условиях, то есть при/Ч»0,2 и 37°С. Понижение ионной силы и нагревание приводят к углублению этого процесса (Рис.2 А). ч

Дшах,пш

340

1/1о,отн.ед.

336

332

2,0 3,0 4,0 5,0 рН 3,0 4,0 5,0 6,0рН Рис.2. Расщепление И-Р-перехода сывороточного альбумина человека на две стадии. А-зависимость от рН положения максимума спектра триптофановой флуоресценции САЧ: 1-20*С, • 0,2; 2-20°С /«»0,001; 3- 37вС,/<«0,2. Б- Зависимость от рН относительной интенсивности при 470 ни флуоресценции АНС в комплексе с САЧ (1:1): 1 -1 0*С; 2-35"С, 3-45'С (/4-0,2).

Подобное расщепление Л-Р-перехода выявляется и на кривых флуоро-метрического титрования раствора комплекса альбумин+АНС по флуоресценции красителя в широких интервалах изменения температуры. Увеличение температуры сопровахдается смещением перехода в нейт-

ральную зону рН, может облегчить регуляцию транспортной функции альбумина ( Рис 2 Б).

Сродство первичного центра связывания АНС, присущее N-форме (рН 7,0),не изменяется при переходе в форму FI (рН 4,0). При этом наблюдается незначительное уменьшение констант связывания АНС вторичными центрами без изменения их числа. Следовательно,на первой стадии N-F-перехода общая доля связанных молекул красителя практически не изменяется.

В отличие от АНС,на этой стадии перехода наблюдается резкое ослабление связывания некоторых производных триптофана [Pande,et.al, 1974 J. З-чметние' из*енен*ч- т-аххя отинм» лля сзгзавани я билирубина [Gei son, et.al, 1977] и для окрестностей свободной сульфогидриль-ной группы [Cornell et.al., 1978].

Существенное разрушение центров связывания АНС происходит при переходе к форме F2: константа ассоциации для первого центра падает при рН 3,5 в 5 раз, и утрачивается связывающая способность

A

вторичных центров (Ка<5*10 М ).

Полученные нами данные иллюстрируют простейшие регуляторные возможности комплексного изменения кислотности среды и температуры на транспортную функцию сывороточного альбумина.Очень важно, что сочетание разнонаправленных изменений рН,ионной силы и температуры приводят к широкому набору разных изменений функциональных свойств.

3.Структурные переходы сывороточных альбуминов в зоне рН от 5 до 10.

Известно, что изменения ряда свойств сывороточных альбуминов в области рН от 7,0 до 9,0 интерпретируются как структурная перестройка, названная "нейтральным" переходом из формы N (натнвной) в форму В (основную).Этот N-B-переход наблюдается не только в изолированных альбуминах в растворах,но и цельной сыворотке человека [Klotz et.al., 1952; Harmien et. a I., 19Л ; Vandergi esen et. a I., 1983). По мнению Stroupe et.al.(1973) существует erne одна изомерная форма,названная формой А, процентное содержание которой возрастает при увеличении рп от 7,0 so 9,0. Однако механизмы регуляторной возможности этих переходов изучены недостаточны. В связи с этим нами были проведены систематические исследования, с точки зрения зрения регуляции функциональной активности белка.

Согласно нашим данным при низкой ионной силе (0,001 М NaCI) и

при 20°С середина N-B-перехода находится при рН 8,2-8,3;а при повышении ионной силы по 0,2 смешается до 8,7 при 37*С.

При изменении рН в зоне от 5,7 до 6,7 при низкой ионной силе и при 20*С и 37°С нами была обнаружена ранее неизвестная перестройка в окружении единственного триптофана в альбумине человека,что приводит существенному изменению полярности микроокружения (Рис.ЗА). В участках локализации вторичных центров связывания АНС в альбумине при 20*С в 0,2М растворах NaCI в зоне от рН 7,0 до 8,5 происходит перестройка с средней точкой при рН 7,9. С изменением температуры от Ю*С до 45*С при постоянной ионной силе 0,2 наблюдается смешения N-B-перехода и денатурационной перестройки в области рН>9,0 сторону в более низких значений рН.Уменьшение ионной силы до 0,001 при 20 С позволяет выявить,по-видимому,разделение изомерных форм N-B и В-А в зонах рН 6,5-7,5 и 7,5-8,5 со-ответственно(Рис.ЗБ).

A max,nm Л шах,пш

Рис.3. Конформационные перестройки САМ в нейтральной зоне рН: А-Влияние температуры и ионной силы раствора на зависимость от рН положения максимума спектра триптофановой флуоресценции САЧ.1-20°С, 0.001М №С1; 2-37*С,0,01М ИаС1; 3-37*С, 0,2М№С1. Б--Влияние ионной силы на зависимость от рН положения максимума спектра флуоресценции АНС в комплексе с САЧ.1-0,001(КаС1), 2-0,01 (N801), 3-0,2 (N30)(0.067М ).Температура 20*С.

Структурная перестройка в зоне рН 6,0-7,5 также обнаруживается

у альбумина верблюда при 20 С и высокой ионной силе.При этом,изменяются и функциональные свойства альбумина верблюда (связывание фраксетина).

Описанные выше результаты вместе с литературными данными свидетельствуют о том, что изменение рН в физиологическом диапазоне (от 6,0 до 8,0) вызывает изменение структуры сывороточного альбумина в окрестности триптофанового остатка и в области вторичных центров связывания красителей (билирубинового центра),что влечет за собой изменение сродства к лигандам.Все эти факты являются дополнительными предпосылками того,что отклонение значений рН, температуры и ионной силы от средних гомеостатических величин могут служить эффективным механизмом регуляции тра|кпорта альбумином низкомолекулярных веществ.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ИОНОВ С АЛЬБУМИНАМИ.

Изучение влияния концентрации неорганических солей на структурное состояние белковых молекул представляет специальный интерес,так как такие соли в относительно большой концентрации присутствуют в жидкостях организма.Поэтому одним из механизмов регуляции скорости и эффективности связывания диссоциации отдельных классов переносимых альбумином лигандов может быть специфическое изменение в капиллярах и интерстициальном пространстве тканей ионной силы и ионного состава.

Сравнительный анализ данных, полученных нами с помощью собственной флуоресценции и флуоресценции АНС,связанного с альбумином позволяет выявить общность и специфичность влияния ионной силы и ионного состава на физическое,функциональное свойства альбумина. Общим в действии увеличивающихся концентраций ЛаС1 и Лаа504 является уменьшение подвижности диполей,окружающих центров связывания красителя при у* < 0,1.Этот эффект,по-видимому,можно приписать влиянию ионной силы как таковой,которое может приводить к изменению в физических свойствах центра связывания АНС. Однако здесь проявляется специфичность аниона: под действием сульфата коротковолновый сдвиг спектра флуоресценции наблюдается при меньших значениях ионной силы и имеет большую амплитуду, чем при действии хлорида. Более эффективное тушение флуоресценции происходит ионами хлора (Рис 4А). Отметим, что замена ионов БО^ ионами хлора при постоянной ионной силе (/**■ 0,2) полностью обращает эффекты сульфата.

Рис.4.Влияние ионной силы и ионного состава раствора на конфор-мационное состояние САМ. А-Изменение параметров флуоресценции АНС в комплексе с САМ.Кривые 1и 2-степень тушения флуоресценции(Iо/I),

| „I

кривые I и 2 -изменение положения максимума спектра под действием ионной силы, создаваемой N301 (I и 1) и N3^50^(2 и 2 ),соответственно. Б-зависимость положения максимума спектра собственной флуоресценции САЧ от ионной силы, создаваемой №С1 (2) и СаС12 (1).

Анализируя характер изменения параметров флуоресценции красителя показали, что обнаруженные специфичности анионов обусловлены наложением двух эффектов: во-первых, прямого взаимодействия ионов со связанным на поверхности белка АНС в возбужденном состоянии и, во-вторых, снижения константы связывания АНС с САЧ с увеличением содержанием соли.

Полученные нами данные о влиянии ионной силы на связывание альбумином АНС коррелируют с фактом уменьшения при повышении ионной сиды его сродства к билирубину и производным триптофана.

Ионы щелочно-земельных металлов (Са ,М8 ) связываются альбумином со сравнительно низким сродством и с малой относительной специфичностью. Сывороточный альбумин имеет от 5 до 12 центров

о

связывания ионов кальция с константами ассоциации порядка 10 -

3 -1

Ю М .сродство которых сильно зависит от рН и ионной силы раст-

вора [Pede г sen,I972 , I 974 ¡. Наши данные показывают,чго повышение ионной силы (при увеличении концентрации NaCI) до 0,1 вызывает резкое уменьшение эффективной константы связывания ионов кальция с альбумином человека. При дальнейшем увеличении ионной силы раствора (до 0,4) величина сродства практически не изменяется.Сравнительные исследования связывания катионов Na и Са при изменении ионной силы в интервале отО,001 до 0,01 показывают,что связывание кальции создает низкополярное микроокрухение в области локализации индольного хромофора остатка триптофана, что свидетельствует о специфическом характере взаимодействия Са++с белком ( Рис.4 Б). Связывание ионов кальция с альбумином сопровождается смещением в кислую сторону средней точки конформацнонного N-B-перехода [Peder-sen , 1971 ] .

В присутствии ионов кальция в растворе сродство альбумина увеличивается к дикумзрнну,уменьшается по отношению к салициловой кислоте,но не изменяется по отношению к варфарину и диазепину [Per г iп, el . а I . , I 982 ].Все эти факты говорят о возможной роли ионов кальции в регуляции структурно-функциональных свойств альбумина.

Ионымикроэлементов (хром,марганец,железо,кобальт,никель,медь, цинк и т.д.),образ уют координационные связи с донор^ыми группами, специфическими для определенных ионов металлов. Связывание ионов меди с альбуминами происходит путем образования плоскоквадратного хелата с участием N-концевого fC-аминного азота аспаргиновой кислоты, азота имидазольной группы Н13-З,двух атомов азота пептидной группы альбумина челоеека(Asp-AIa-His) или быка(Asp-1hr-H¡s). Замена гистидина в третьем положении N-концевой части молекулы альбумина человека,быка и крысы на тирозин (альбумин собаки) сопровождается потерей главного центра связывания ионов меди [Lau el. al..1971; Reynolds e I . а I ., I9 70 J.

Анализ собственных и литературных данных позволяет идентифицировать 2 типа комплексов иона меди с альбумином быка: с высокополярным (рН 5,5 тип I) и низкополярным (рН 9,0 тип II)окружением. Причем, координационная сфера имеет ромбическую симметрию в нейтральной и щелочной средах и аксиальную при рН < 5,0. Аналогичное изменение геометрии комплекса в зависимости от рН наблюдается для комплекса Ni -альбумин: при низких рН ион Ni** находится в окта-эдрическом окружении,а в щелочных условиях координационная сфера имеет плоско-квадратную геометрию [Асатурян и др., 1988; Сепур и др., 1984;].

Связывание первого иона меди главным центром,находящимся на NI я

концевой части альбумина практически не вызывает возмущения в окружении остатка триптофана и центров связывания АНС. Связывание последующих 3-4 ионов меди, повидимому, происходит кооперативно и вызывает резкий рост эффективности тушения флуоресценции обоих хромофоров (Рис.5).

Рис.5. Связывание ионов меди с альбумином человека. Тушение флуоресценции АНС в комплексе с САЧ (А) и тушение трилтофановой флуоресценции САЧ (Б) ионами меди в координатах Штерна-Фольмера. 1-рН 4,0; 2-рН 6,0; 3-рН 7,05; 4-рН 9,0.

Видно,что эффективность тушения собственной флуоресценции белка сильно зависит от рН среды или рН-индуцируемых конформационных состояний альбумина. Это свидетельствует о существенном значении рН среды на регуляцию.связывания ионов меди альбумином.

РЕГУЛЯЦИЯ ЗАЩИТНЫХ ФУНКЦИЙ АЛЬБУМИНА АКТИВНЫМИ ФОРМАМИ КИСЛОРОДА (.Генерация активных форм кислорода и их реакции. Важным реактивным агентом вне и внутриклеточной среды аэробных организмов являются активные формы кислорода: супероксидный радикал, синглетный кислород,гидроксильный радикал.перекись водорода и т.п. Образование и выброс их во внеклеточную среду при фагоцитозе и реакциях протекающих с участием некоторых ферментов(окскдаз,мо-нооксигеназ и др), при функционировании металл содержащих белков

необходимо для удовлетворения определенных потребностей организма. Три нарушении оптимальных условий (по рН,температуре и р02) и во многих паталогических процессах реакции окисления усиливаются,что s конечном итоге может привести к тяжелым биологическим последст-)иям за счет нарушения структуры биополимеров и других клеточных (омпонентов, накопления и действия токсичных конечных продуктов [ Дубинина,1989; Мерзляк и др, I97S; Fridovich, 1978 ; Halliwell, 1978 ¡Владимиров и др. 1971]. Однако реакция свободно-радикаль-<ого окисления в организме регулируются эндогенными противоокис-¡ительными защитными системами. Известно, что определенную защитою функцию несут структурная организация и состав биологических :труктур,ферменты,ответственные за гибель активных форм кислорода i свободных радикалов, некоторые низкомолекулярные вешества(токо->еролн,убкжно^ы, витамины группы К, флачоноидн.алк?лоиды,кароти-юиды,салицилат.фосфолипиды и др) и высокомолекулярные соединения ; белки,полисахариды и т.д.)[Бурлакова и др, 1985; Cía Vind,1963; .arson, 1 988].

2.Противоокислительные свойства альбуминов.

Сыворотка крови обладает сильным антиоксидантным действием, |бусловленным белками и низкомолекулярными компонентами.По спо-обности ингибировать свободно-радикальные реакции белки распола-аются в последовательности:церрулоплазмин > трансферрин>альбумин супероксиддимутаза >иммуноглобулин [Шаронов и др,19881-Нами было показано, что антиокислительные свойства альбумина роявляются на снижение интенсивности хемилюминесценции гепарина, звестно, что гепарин обладает высоким сродством к многим низко высокомолекулярным веществом, в том числе к белкам-фибриногену, -глобулину и альбуминам^ j ¡ et.al., 1984 , David et .al., 1987] .Эти акты вызывают интерес к исследованию взаимодействию альбумина с епарином.

Характер снижения свечения гепарина в системе На0я+ Fe^ipw раз-ичных концентрациях альбумина человека указывает на возможность сушествления захвата гидроксильных радикалов молекулами альбуми-ами с последующим им окислением белка, взаимодействием между ак-4вными частицами на поверхности молекул белка и гепарина, приво-зщим к образованию комплекса "гепарин + белок".

Противоокислительная активность белков, может быть обусловлена 1ределенным взаиморасположением аминокислотных остатков,обладаю-IX высоким сродством к свободным радикалам в их первичных струк-фах и их локальным распределением в конкретных типах структур

(оС-спиралн-структуры и др) и на конкретных участках доменов и субъединиц белков [Daviei et.al., 1987; Fridovich et.al., 1986; Dean, 1987].

Наш анализ первичной структуры сывороточного альбумина человека иоС-спиральной карты, полученной путем 'закручивания* всей полипептидной цепи белка в единую оС -спираль,паказал,что в каждом из структурных доменов альбумина содержится от4 до 5 участков,где локализуются аминокислотные остатки, способные служить ловушками свободных радикалов. Из них наиболее мощные центры модификации, на наш взгляд<находятся на следующих участках первичной структуры белка: в первом домене остатки 9-11,27-39,98-105,123-128,144-169, во втором домене 206-208, 242-247,326-341,360-379 и в третьем домене 437-452,461-477,507-514, 548-559. Предсказание центров свободно-радикальной модификации и фрагментации белка на основании известной первичном структуры может позволить получить дополнительную информацию для интерпретации экспериментальных результатов.

3.Защита специфических центров альбумина лигандам.

Образование хоныогатов.

Известно,что связанные с белками лиганды защищают их от протео-литического гидролиза и увеличивают время полужизни. Этот эффект имеет важное значение в регуляции концентрации белков и лигандов в организме и носит универсальный характер [Markui et.al., 1976; Goldberg et.al., 1 976]. Вопрос о локализации центров-ловушек свободных радикалов и связывания экзогенных или эндогенных лигандов, о их взаимодействии оставался открытым.

Используя модельную систему сывороточный альбумин человек + HtOa + Fe + I-анилин-8-нафталинсульфокат, мы провели исследование защитного действия лиганда (АНС) от атаки радикалами "ОН -генерируемыми в данной системе (система Фентона).

Инкубация свободного альбумина (без АНС) в системе Фентона приводит к повреждению центров связывания АНС в белке.Модифицирован -ный таким образом альбумин обладает меньшим сродством к АНС и у комплексов его с АНС необнаруживается N-F-перехода по флуоресценции красителя.

N-F - переход белка наблюдается тогда, когда добавлен АНС до инкубации. Уменьшение амплитуды перехода и смешение средней точки его в более щелочную сторону указывает на структурные изменения в других участках полипептидной цепи белка вследствие захвата радикалов *0Н.

Эти данные говорят о том,что при окислительной модификации молекул альбумина гидроксильными радикалами в комплексах белка с лигандом,лиганды защищают белок от атаки радикалами (ОН).С другой стороны, можно предположить, что возле главного центра альбумина для связывания АНС локализована одно из ловушек гидроксильных радикалов, приводящих к разрушению центра в отсутствия красителя.

Сравнительный анализ собственных и литературных данных показал, что активация специфических центров связывания лигандов.с одной стороны,и образование реакционно-способных промежуточных форм ли-гандов, с другой,видимо приводят к образованию коньюгатов,имеющих практического значения.

ДЕЙСТВИЕ ОПТИЧЕСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА СТРУКТУРНО -ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА АЛЬБУМИНОВ

Известно,что npii фотоокисленни белков образуются активные промежуточные продукты: радикалы ароматических и иных групп белков, триплетные состояния, синглетный кислород и др.[Владимиров, 1965; Каюшин др. 1976; Конев и др,1971; Сапежинский, 1983 ; Creed, 1984).

Квантовый выход фотодеструкции остатков триптофана при прямом воздействии светом с длиной волны 302 нм составляет 10,6*10 3 для глюкагона,где триптофан полностью экспонирован в водное окружение ( максимум спектра флуоресценции Лщш * 348 нм, ширина спектра АА «61 нм). Для нуклеазы с внутренним триптофаном в сравнительно полярном окружении(Лпэд'335 нм.дЯ »53 нм) он равен 5,1-10 3; для рибонуклеазыТ1 с триптофанилом в неполярном окружении (^^>325 нм, аЯ »47 нм ) 4,8- 10~3. [ Pijault et.al., 1984).

Приведенные выше данные показывают, что природа локального микроокруження' остатка триптофана и пространственная структурная организация белков влияют фоточувствительность триптофанилов и характер течения фотоокисления белков.

Одним из важных вопросов,касающихся фотоокисления белков является в взаимодействие фотоактивных центров в молекуле белка,что дает возможность выяснения механизма изменения функциональных свойств белков под действием света.

Полученные нами данные показал,что специфические центры связывания красителей обладают разной чувствительностью фотодинамическому действию собственного белкового сенсибилизатора-триптофана при облучении светом ультрафиолетового диапазона.

Облучение комплексов белков с органическими лигандами в полосе поглощения лигандов приводит к сенсибилизированному окислению

белков [Сапежинский 1 983 ;FooIе 1 976 ; Gottfried et.al., 1988].

Анализ литературных и собственных экспериментальных данных показывает,что при непродолжительном освещении сенсибилизаторов основное фотодинамическое действие красителей протекает около их центров связывания в белке ( "центро-спеиифическое действие" ),и зависит от структурно-физического состояния белка и природы сенсибилизатора.

НЕЛИНЕЙНЫЕ МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ СИСТЕМ ТРАНСПОРТА.

КОЛЕБАТЕЛЬНЫЙ РЕЖИМ.

1.Двухкамерная модель транспортной системы с учетом синтеза.и- деградации.транспортера.

Экспериментальные факты, установленные нами и другими исследователями о зашите белков лигандами,о-структурных-перестройках альбумина при изменении факторов локальной среды и при его взаимодействии с поверхностью клеток и последующем всасывании лигандов клетками, о транспорте альбумина через клеточные слои крупных сосудов и последующей его деградации, структурно-функциональной интегрированности транспортных и ферментных систем и др.[Weiliger 198S; Horie et.аI., 1988;Уголев, 1986] требуют новых подходов в моделировании транспортных систем.

Нами была рассмотрена упрощенная и несколько абстрактная модель системы транспорта из конпартмента (ячейки) 1 в ячейку 2.

Предполагается,что транспортный белок в двух компартментах находится в различных структурно-физических состояниях: Т - в первом (например,в плазме) и Т* - во втором ( например,на стенке сосудов, поверхности клеток и пр.). в зависимости от физико-химических характеристик лекальной среды, от природы взаимодействия транспортера со стенками сосудов и поверхностью клеток и др. Свободный транспортер обратно переходит в компартмент I с константой скорости Ii.я (десорбция) .Константа скорости Ц -характеризует вывод (или распад) альбумина из первой ячейки, а k't ■ всасывание белка, в частности,клеточным слоем сосудов и его деградацию.Коне -танта скорости к2 включает в себе процессы транспорта комплекса (AT) во вторую ячейку и диссоциации его из-за структурно-физического состояния транспортера.Существенным является допущение о том, что транспортный белок в комплексе AT не подвержен катаболичес-кому распаду ( например, не расщепляется протеазами ) т.е.имеется кинетическая индукция белка лигандом (схема 1):

-де А-лиганд, Т-транспортный белок, Уа -скорость поступления ли--анда,У4 -скорость поступления транспортера.

На основе принятых допущений изменений безразмерных концентра-1ий лиганда и транспортера в без размерном времени описывается <атегатической моделью:

I (1х х у --=. |--

оС <1Т (1 + 1г)х

<1у У(/3+ е11Г х) (1) - . |--

ЛГ (р е,,1г)((1 + 1г)х+^)

гдеоС.^З, (г, е^-безразмерные параметры.

Стационарные значения переменных .в модели (1) равны: х ■ I, ' =1 + 1г. В размерной форме полная концентрация переносчика шределяется выражением:

V*

Т*.- — +- ( 1-»(г(1-е,|| (2)

к* к а

ри условии |г(1-е^> 0 имеет место явление кинетической индук-ии.т.е. при увеличении скорости поступления лиганда полная кон-ентрация транспортного белка увеличивается.

Математический анализ модели такой простой транспортной систе-ы показывает, что при условии,когда транспортный белок во втором омпартменте,менее подвержен разрушению (к* ) чем в первом,всегда

выполняется условие кинетической индукции и в системе могут возникать затухавшие колебания в ответ на резкое увеличение концентрации лигандов (Уа) (рис.6).

г г

1,99

1,02

1,0

0,98

Рис.б.Примеры результатов численного интегрирования модели. Х-кониетрация свободного лиганда, У-полная концентрация транспортера,¿-концентрация транспортера во второй ячейке.

Резкое увеличение концентрации связываемых альбумином лигандов наблюдается например, после приема пищи, при физической нагрузке введении лекарственных веществ и т.п. Область значении параметров, где отсутствует индукция и следовательно, колебательное поведение тем шире, чем больше отношение констант скоростей поступления и вывода транспортера во втором компартменте.Период собственных колебаний.пропорционален временем обновления транспортера (УП. Аналогичная картина наблюдается и в случаях, когда часть популяции транспортного белка находится в депонированном состоянии .

Теоретический анализ модели, в которую включено депо, показал что при условии, когда основная популяция транспортного белка находится в депонированном состоянии,в системе возможно возникновение осциллятора с трением в ответ на резкое возмущение транспортной системы,и следовательно,появление резонансного отклика на периодическое возмущение определенной частоты.

Обнаруженная нами возможность возникновения колебательных режи-

мов в простой модели транспортной системы может иметь функциональное значение для физиологии и фармакологии.

2.Колебания в сопряженной транспортно-нетаболической системе.

Для многих эндогенных и экзогенных лигандов альбумина известна направленность их транспорта в организме от одних органов и гканей к другим. Органические токсины и многие лекарственные ве-иества после доставки в конечный пункт подвергаются действию :оответствуюших ферментных систем. Такой метаболит как триптофан юставляется главным образом в центральную нервную систему, где ) частности, превращается в нейромедиатор серотонин. В некоторых >рганах, в частности, в стенке тонкого кишечника транспортные и >ерментные системы интегрированы и пространственно,и функциональ-ю. Таким образом, многие метаболические процессы могут регу-1ироваться совместным действием макро и микротранспортных и фер-1ентных систем.Однако вопрос о механизме взаимодействия этих сис-ем изучен недостаточно.

В связи с этим мы провели исследования модели транспортной истемы, сопряженной с простой метаболической реакцией, где субтрат $ для фермента Е связывается с транспортером Т в первом омпартменте и переносится во второй компартмент в комплексной орме (ЭТ).Освобождение субстрата от комплекса транспортер-субст-ат осуществляется в результате изменения конформационного сос-ояния транспортера во второй ячейке (Т).Там же протекает фермен-ативная реакция превращения субстрата (5),в продукт (Р) по кине-нке Михаэлиса-Ментена (Схема 2):

(2)

Анализ полученных результатов показывает.что транспортная сис-ма как депо субстрата не влияет на частоту колебаний в фермен-тивной реакции,но может повлиять на степень затухания колебаний реакторе в зависимости от отношения времени жизни свободного анспортного белка и свободного фермента. Чем меньше это отноше-

ние.тем колебания а реакторе быстрее затухает,а амплитуда колебаний, возникающих в транспортной системе,увеличивается.

Таким образом, в транспортной системе, сопряженной с простой ферментативной реакцией,где происходит затухающие колебания • ответ на резкое однократное возмущение скорости поступления субстрата, так же возникают затухающие колебания с такой же частотой,что и в чистой биохимической реакции.Причем,более быстрый уход транспортного белка из реакционного пула,чем фермента позволяет исключить опасность быстрого накопления субстрата при увеличении потока метаболитов. Не исключено, что такая регуляция стационарной концентрации субстрата может служить одним из механизмов, позволяющих справиться с увеличением метаболитического потока и обеспечить резервные мощности ферментов.

Полученные данные могут служить основой для выяснения механизма взаимодействия транспортных систем с другими биохимическими осцилляторами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, выше сформулирована новая концепция возможной системной регуляторной роли изменения универсальных физико-химических факторов внутренной среды организма в функционировании ферментных, транспортных и других активных элементов метаболизма,имеющих белковую природу. С позиции этой концепции проведен анализ различных экспериментальных данных, которые позволили существенно расширить традиционные представления о функциональной роли гомеостаза н его изменений(гомеоклаза) по основным физико-химическим факторам внутренней среды таким,как температура, рН, ионная сила, ионный состав и активные формы кислорода. Средние значения каждой из этих характеристик среды не одинаковы в разных участках организма, в отдельных органах и тканях,и может значительно колебаться в зависимости то их локализации,природы и от физиологического или патологического состояний тканей и органов. Это означает, что такие изменения факторов среды неизбежно должны приниматься во внимание при рассмотрении эволюции отдельных белков и белковых систем, активности ферментных и транспортных систем в организме, и особенно для белков, циркулирующих по всему организму.

Результаты проведенных нами исследований влияния рН,темтемпера-туры, ионной силы, ионов С1, ЭО " Са"^ Си^и активных форм кисло-

ода на транспортно-депонируюшую и защитную функции альбумина озволили «о многих отношениях уточнить поведение этого белка при змененим главных физико-химических характеристик среды. Наряду с итературными данными, эти результаты показывают,что сывороточный льбумии обладает свойствами легко и дифференцированно регулируе-ого устройства, способного управляемо связывать лиганды одного ипа при одних условиях и освобождать их - при других, в то время ак для лигандов другого типа,связываемых в других участках моле-улы транспортера, при таком хе изменении условий сродства может ибо не изменяться,либо изменяться противоположным к первой группе бразом.

Значительное изменение сродства и емкости связывания для опре-еленных центров может достигаться сравнительно небольшими смеше-иями каждого из регуляторных факторов. Это иллюстерируется уже ем, что при средних условиях гомеостаза,поддерживаемых в крупных ровеносных сосудах в нормальном физиологическом состоянии( рН7.4^, емпература 36 . 5-37. 0вС, ионная сила 0.1-0.15 и т.д.) состояние ывороточного альбумина человека соответствует смеси соизмеримых онцентраций N и В-форм(см. гл.З); М-форма находится в равновесии ежду высоко-температурной и низкотемпературной формами(см.гл.2); ентры связывания хлорида и красителей лишь частично заполнены см.гл.4). Это означает, что физиологически небольшие смешения по юбому из физико-химических параметров гомеостаза должны сместить то сложное равновесие состояний альбумина, усилив сродство к одни лигандам и ослабив к другим. Более значительные смещения го-еостаза необходимы для того, чтобы регуляторной стала перестрой-а в окружении триптофана с срединой при рН б или В-А-переход и, ем более Л-Р,, и Р, - Ра-переходы.

В экспериментальных физиологических (например, физическая наг-узка) или патологических состояниях эти механизмы, связанные со рачительным гомеоклазом,вполне вероятны.Хорошо известно,что аль-гмин обладает антиокислительной активностью, принимает участие в :токсикации чужеродных токсических веществ и в образовании анти-;л к низкомолекулярным соединениям. Это говорит о том,что альбу-1н может играть важную роль и в регуляции защитных систем и оки-жтельных процессов в организме.

Полученные в настоящей работе данные позволяют рассматривать ¡йствие активных форм кислорода как одного из важнейших факторов >еды для регуляции этих уникальных функции альбумина.Как показа-• в настоящей работе, альбумин имеет специфические центры для

захвата активных форм кислорода ("центры охисления") и ингибирует свободно-радикальные реакции других биологических систем,например гепарина.

Возможно, что активные формы кислорода не только регулируют функциональные свойства ааьбумииа, но и отвечают за деструкцию и фрагментацию белка. Активация специфических центров для связывания различных лигандов и самых лигандов с участием активных форм кислорода может служить основным механизмом ковалентного связывания низкомолекулярных веществ с альбумином(коньюгация).Это в свою очередь может определять,с одной стороны.защитное действие лигандов,что приводит к увеличению времени полужизни альбумина в организме и антигенную активность комплекса альбумин-лиганд, ведущую к образованию анти-тела к гаптенам,с другой стороны. Как нами показано, защитное действие лигандов и конъюгация в частности,происходят в центрах связывания красителей и алкалоидов. Этот эффект, видимо,имеет универсальный характера чем свидетельствуют результаты исследований,проведенных другими исследователями с использованием различных лигандов.

Взаимодействие активных форм кислорода с альбумином зависит от действия других факторов среды (рН, температуры и др.). Об этом свидетельствует тот факт, что температурно - и рН - индуцируемые структурные состояния альбумина обладают разной чувствительностью к действию свободных радикалов.Аналогичное явление обнаруживается и при воздействии оптического излучения на естественные и связанные с белком хромофоры.Синглетный кислород и трипдетные состояния хромофоров, генерируемые под действием излучения,вызывают окисление главным образом в области локализации фотоактивных центров.

Известно, что альбумин регулирует структурно - функциональные свойства капилляров, облегчает всасывание связанных с ним лигандов клетками при взаимодействии его со стенками сосудов и поверхностью клеток. Эта функция альбумина видимо определяет взаимодействие между макро- и микро-транспортными системами,а также микротранспортной и ферментной системами клеток. Анализ литературных данных показывает, что на этом же уровне также обнаруживается ре-гуляторная роль изменения физико-химических факторов среды.

Особое внимание в последнее время уделяется исследованию транспорта альбумина через клеточные слои стенок крупных сосудов и деградации белка. Конвективный и диффузионный механизмы, транспорт микровезикулами являются основными путями транспорта альбумина.

Полученные нами данные и анализ литературных данных с позиции

выдвинутой нами концепции выявляют некоторые новые закономерности регуляции свойств альбумина,таких как равновесие между различными структурно-функциональными формами белка,защитное действие лиган-дов, ускоренное всасывание лигандов клетками в присутствии альбумина, структурные изменения белка на поверхности стенки сосудов и клеток, транспорт и деградация белка и др. Это означает, что при построении различного рода схем и моделей транспортных систем необходимо учитывать эти факты.Нами сделаны первые попытки заложить представлений о роли этих факторов в регуляции динамического поведения транспортных систем. Показано, что в простой двухкамерной модели транспорта с учетом эффекта защитного действия лигандов, синтеза и деградации, структурного изменения транспортера может реализоваться колебательный режим в ответ на резкое увеличение концентрации лиганда. Амплитуда и частота колебаний концентрации лигандов и белков зависят от времени жизни белка и от параметров, определяющих стабилизацию белка лиганцами. Колебательные режимы могут реализовываться также в условиях, когда часть популяции транспортного белка находится в депонированном состоянии и когда транспортная система сопряжена с фермеитой системой.Эти данные могут служить основой для интерператации далеко не понятых экспериментальных данных,например, о колебаниях в крови концентрации лекарственных веществ, сильно связываемых с белком. Кроме того, они указывают на возможность регуляции транспортных систем при их взаимодействии с другими биологическими осцилляторами с помощью таких физических явлений как резонанс, синхронизация и др.

Отметим, что теория регуляции транспортных систем физико-химическими факторами среды в настоящее время лишь начинает развиваться. Необходимо знание характера взаимодействия транспортных систем на разных уровнях организации организма и сопряженного функционирования их с ферментативными, иммунными и другими системами .

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

(.Систематический анализ накопленных к настоящему времени литературных данных о диапазонах реализуемых в организма животных изменений основных физико-химических факторов внутренней среды показал, что в зависимости от локализации в организме и специфики отдельных органов и тканей,от их физиологического или патологического состояния, от условий окружающей среды температура, кислотность, ионный состав, содержание активных форм кислорода и др.мо-

гут варьироваться в достаточно широких пределах (например, температура от 10 до 44*С, рН от 5,6 до 8,2). Такие изменения этих характеристик неизбежно должны приниматься во внимание как регуля-торный фактор при рассмотрении эволюции и ахтивности отдельных белков и белковых систем.

2.В результате систематических исследований структурно-физических и функциональных свойств альбуминов человека, крупного рогатого скота и верблюда, с позиции выдвинутой нами концепции роли физико-химических факторов внутренной среды в регуляции активности белковых систем,выявлены и охарактеризованы струк-турно-физи-ческие перестройки альбуминов при изменении температуры в диапазоне 25-40*С,ионной силы в диапазоне 0.05-0.2,рН в интервале 5,67,5. Обнаружено, что путем выбора различных вариантов сочетания изменений этих факторов можно достичь условия для избирательного до типам транспортируемых лигандов изменения сродства альбумина.и следовательно,эффективности'загрузки" и "разгрузки'этих лигандов.

3.Охарактеризован известный М-Г-переход альбумина как двухфазный процесс при температуре 37*С и ионной силе 0,2,который способен изменять сродство главных и вторичных центров связывания красителей. Выявлено смешение положения в шкале рН известные Л-Р и N-6 (В-А) переходов в нейтральную сторону при повышении температуры и ионной силы, что позволяет предположить регуляторное функциональное значения этих переходов при особых состояниях тканей и органов.

4.Получены экспериментальные доказательства того,что изменение ионной силы среды от 0,01 до 0,2, связывание анионов (С1 , 504) и катионов (Са**, Си") альбумином вызывают кооперативные и локальные структурные перестройки белка и проявляют кооперативный и специфический характер их взаимодействия с альбумином.Анализ собственных и литературных данных показывает,что связывание ионов хлора уменьшает сродство альбумина к анионным лигандам и ионам кальция, ионы кальция смещают равновесие структурного N-8- перехода; вариация температуры и рН среды в диапазоне их физиологических изменений сопровождается изменением сродства альбумина к ионам меди и геометрии координационной сферы меди.Все эти факты говорят о возможности регуляции взаимодействия альбумина с неорганическими ионами за счёт изменений комплекса факторов среды.

5.Анализ первичной структуры альбумина человека позволил предсказать специфические центры (ловушки) активных форм кислорода, ответственные за окислительное повреждение и деградацию белка. '

Захватывая активные формы кислорода альбумин может играть защитную роль для других биологических систем от окислительного повреждения (антиокислительные свойства).Это было продемонстрировано на конкретной системе альбумин-гепарин.Вместе с тем,в присутствии лигандов в системе окисления происходит центроспецифическое кова-лентное связывание лигандов, приводящее к защите этих центров от окислительного повреждения,что было экспериментально показано для системы альбумин-краситель и альбумин-алколоид.Это говорит о возможности избирательной регуляции защиты белка лигандами разного класса и деградации транспортера. Локальное центроспецифическое действие активных форм кислорода происходит в центрах, содержащих слабо связанные переходные металлы или под действием оптического излучения на фотодинамически активные центры белка. Чувствительность этих процессов сильно зависит от температурно- и рН-индуци-руемых и других структурно-физических перестройк,что свидетельствует о возможности специфической регуляции защитных функции альбумина, его локального повреждения и деградации за счёт изменений содержания активных форм кислорода и других факторов среды.

6.Математическое моделирование транспортных систем с учетом изменения конформационного состояния белка при связывании лигандов и при взаимодействии с поверхностью клеток (адресатов) депонирование белков,защитного действия лигандов и др. позволило выявить возможность колебательных режимов кинетики этих систем в ответ на резкое увеличение концентрации лигандов. Частота, амплитуда и скорость затухания концентрационного колебания зависят от времени жизни транспортера и параметров,характеризующих депонирование, стабилизацию белка в комплексной с лигандами форме.

7.Полученные нами данные служат основным экспериментальным доказательством принципиальной возможности избирательной регуляции транспортной и защитной функции альбумина,а также деградации белка при изменении основных физико-химических факторов среды и концентрации органических,неорганических лигандов.Это можно рассматривать как первый этап в создании нового направления в экспериментальном и теоретическом изучении внутри организменного транс-юрта веществ белками и его пространственной и временной физиологической регуляции.

Список основных работ,опубликованных по теме диссертации

1. Нямаа Д..Катибников М.А.,Конев C.B. Исследование конформацион-ных изменений сывороточного альбумина быка под действием доде-цил сульфата натрия. Изв.АН БССР,сер.биол,1973,б,63-67.

2. Нямаа Д.,Конев C.B..Катибников М.А. Люминесцентное исследование денатурации сывороточного альбумина человека додецилсуль-фатом натрия. Изв.АН БССР,сер.биол,1973,5,82-87.

3. Нямаа Д.,Катибников М.А.,Конев C.B. Люминесцентное исследование производных индола в мицеллярном растворе. Изв.АН БССР,сер. физич,1974,4,93-96.

4. Нямаа Д.,Конев C.B.,Катибников М.А., Нисенбаум И.Д. Исследование взаимодействия сывороточных альбуминов с додецилсульфатом натрия методом фотохемилюминесценции. Изв. АН БССР, сер.биол, 1974,6,88-91.

5. Нямаа Д..Катибников М.А.,КоневС.В. Исследование взаимодействия сывороточного альбумина быка с додецилсульфатом натрия методом флуоресцентного зонда. Изв. АН БССР,сер.биол, 1975,3,73-78.

6. Нямаа Д.,Конев C.B..Катибников М.А.Люминесцентное исследование влияния температуры на конформационное состояние фибриногена. Биофизика 1975,20,4,586-589.

7. Нямаа Д.,Конев С.В..Катибников М.А. Спектрально-люминесцентное исследование рН-зависимых конформационных изменений фибриногена. Биофизика 1975,20,5,380-384.

8. Нямаа .Д Сенсибилизированная красителями фотохемилюминесценции сывороточного альбумина бика. Тр.Инст. Физ. и Мат. АН МНР, 1976, 16, 21-24.

9. Нямаа Д., Найдан Д..Бат-Эрдэиэ 0. Усиление фотохемилюминесценции сывороточного альбумина бика 1 -анилин-8-нафталинсульфона-том. Тр. Инст.Физ. и Техн. АН МНР, 1979, 16, 76-79.

10.Бат-Эрдэнэ 0..Калиниченко Л.П..Нямаа Д. Влияние рН.ионной силы раствора на связывание ионов кальция сывороточным альбумином человека. Тр.Инст.Физ. и Техн. АН МНР, 1981, 21, 24-29.

1 К.Нямаа Д., Чулуун Т. Колебания в простой биохимической реакции, связанной с транспортной системой. Изв. АН МНР, 1983, 4, 14-21.

12.Нямаа Д., Чулуун Т. Колебания в биохимической реакции с учетом конформационного изменения ферментов. Тр. ИФТ АН МНР, 1984,22, 35-39.

13.Нямаа Д., Бат-Эрдэнэ 0., Бурштейн Э.А. Влияние среды на структурные и функциональные свойства сывороточных альбуминов.

(.Влияние ионной силы раствора на сывороточный альбумин человека в N-форма. Мол.биол. 1984, 18, 3, 839-847.

14.Нямаа Д., Бат-Эрдэнэ 0., Бурштейн Э.А. Влияние среды на структурные и функциональные свойства сывороточных альбуминоа.

П.Влияние температуры на И-форму сывороточного альбумина человека. Мол.биол. 1984, 18, 4, 972-977.

15.Нямаа Д., Бат-Эрдэнэ 0..Бурштейн Э.А. Влияние среды на струк-______

турные и функциональные свойства сывороточных альбуминов.

II.Зависимость Л-Р,Р • Р и Р ■ Е переходов сывороточного альбумина человкеа от температуры и ионной силы. Мол. биол.1984, 19, 833-840.

16.Нямаа Д., Бат-Эрдэнэ 0., Бурштейн Э.А. Влияние среды на структурные и функциональные свойства сывороточных альбуминов.

1У. Состояние сывороточного альбумина человека в зоне рН от 5 до 10. Мол.биол. 1985, 19, 1679-1683.

17.Нямаа Д.. Бат-Эрдэнэ 0., Жамьянсурэн Д. К исследование связывания низкомолекулярных веществ с белками. Изв. АН МНР, 1987, 4, 62-70.

!8.Нямаа Д., Бат-Эрдэнэ 0., зааодник И.Б. Изучение взаимодействия ионов меди с молекулой сывороточного альбумина человека. Тр. Инст. Физ. и Техн. АН МНР, 1985, 24, 36-40.

19.Нямаа Д., Чулуун Т. Влияние обратимости ферментативной реакции на природу колебательных явлений в биохимической системе. Изв. АН МНР, 1985, 2, 38-43.

20.Нямаа Д., Чулуун Т., Баатар Д. Обратимость реакции - как один из факторов регуляции временных структур в биохимической системе. 51и<18а ЫорГ>уз., 1985, 107, 1 , 53-60.

21.Найдан Д., Нямаа Д., Сапажинский И.И., Алтангэрэл Н.Сенсибилизированная 1-анилин-8-нафталинсульфонатом фотохемилвминесцен-ции растворов бычьего сывороточного альбумина.БикПа ЫорИу»., 1985, 107, 2, 97-102.

22.Жамьянсурэн Д., Батсурэн Д., Нямаа Д.Исследование спектроскопических свойств дауразида Д и его взаимодействия с альбумином. Тр.Инст. Физ. и Техн. АН МНР, 1985, 24, 20-24.

23Ламьянсурэн Д.,Батсурэн Д..Бургэдбазар Д.,Нямаа Д.Исследование спектральных свойств даурозида Д. Х.прикл.спектроск. 1986, 45, 2, 318-320;—----------ми■■«! ' - ~—

24.Нямаа Д., Чулуун Т. Теоретическое исследование механизмоТ*рёгу-ляции химического гомеостаза транспортной системой. I.Модель с синтезом и распадом переносчика. Тр.ИФТ АН МНР,1986, 25, 91-98.

25.Нямаа Д., Чулуун Т.Теоретическое исследование механизмов регуляции химического гомеостаза транспортной системой. П.Модель с депо переносчика. Тр. ИОТ АН МНР, 1987, 26, 27-32.

26.Найдан Д..Сапехинский И.И. О механизме сенсибилизированной эозином фотохемилвминесценции растворов сывороточного альбумина человека. Биофизика, 1987, 23, I, 24-28.

27.Найдан Д., Нямаа Д., Гандулам С. Тушение хемилюминесценции гепарина альбумином. Тр.Инст.обш. и экспер.биол. АН МНР,1989,20, 73-77.

28.Бат-Эрдэнэ 0., Гандулам С., Нямаа Д. Зашита центра связывания альбумина лигандам. Техника и технология, (МНР) 1990, 4, 26-29.

29.Бат-Эрдэнэ 0.,Энхзаяа Д.,Мягмар X., Сэлэнгэ Д.,Нямаа Д. Получение коньюгата сывороточный альбумин-алкалоид. Техника и технология (МНР), 1990, 1, 31-32.

30.Нямаа Д., Алтангэрэл Н., Пурэвдорх Д., Найдан Д., Даваадорх Ц. Исследование влияние ультразвука на сывороточный альбумин методом фотохемилюминесценции. Тр.Гос.Пед.Института, Улан-Батор, 1989, 4, 9-15.

31.Нямаа Д., Алтангэрэл Н., Пурэвдорх Д., Даваадорх Ц. Исследование влияние ультразвука на конформацию альбумина методом флуоресценции. Тр. Гос.Пед.Института, Улан-Батор, 1989, 4,16-20.

32.Нямаа Д., Алтангэрэл Н., Пурэвдорх Д., Найдан Д., Гандулам С. Влияние ультразвука на рН-индуцируемое конформационное состояние альбумина. Тр. Гос.Пед. Института, Улан-Батор, 1989, 4, 20-23.

ЗЗ.Чулуун Т., Иямаа Д. Теоретическое исследование адаптивных и резонансных свойств открытой биохимической системы. В сборнике: Применение математического моделирования в естествознании. Улан-Батор, 1989, 39-48.

34.Bunhtein Е.А., Nyamaa D., Bat-Erdene 0., Enkzaya D., Burgedba-zar В. Emelyanenko Y.I., Permyakov E.A. An interaction of albumin from Camel serum with fraxetin. Studia Biophyj.1990,135, I, 15-24.