Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляцiя рецепцii дофамiну в тканинах центральноi нервовоi системи молюска Lymnaea stagnalis

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляцiя рецепцii дофамiну в тканинах центральноi нервовоi системи молюска Lymnaea stagnalis"

РГО оя

* ' V АКЛДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГИ ХМ. О. 0. БОГОМОЛЬЦЯ

На правах рукопису

ПРУДНІКОВ Ігор Михайлович

РЕГУЛЯЦІЯ РЕЦЕПЦІЇ ДОФАМІНУ В ТКАНИНАХ ЦЕНТРАЛЬНОЇ НЕРВОВОГ СИСТЕМИ МОЛЮСКА ЬУМНАЕА БТАСНАЬІв.

Спеціальність:

Біофізика - 03.00.02

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Офіційні опоненти :

доктор біологічних наук Веселовський Н. С.

канд. біологічних наук . Слінченко н.И.

Провідна установа - Jнет 1 тут фізіологи Київського Університету 1к. Тараса Шевченка

Офіційний захист дисертації відбудеться < 27 » квітня 1994 р. на эас спеціалізованої ради Д-016. 15.01 при інстітуті фізіології їм.0.0.Бого Alt України за адресою м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією ножно познайомитися в бібліотеці Інституту фізі їй. О. 0. Богомольця АН України

Автореферат розісланий « » 1994 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради доктор біологічних наук

3. 0. СорокІна-Маріна

AKAЛЕНІ Я НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ їм. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

На правах рукопису

ПРУДНІКОВ Ігор Михайлович

РЕГУЛЯЦІЯ РЕЦЕПЦІІ ДОФАМІНУ В ТКАНИНАХ ЦЕНТРАЛЬНОЇ НЕРВОВОЇ СИСТЕМИ МОЛЮСКА ЬЇМИАЕА ЗТАСИАІЛЗ.

Спеціальність:

Біофізика -03.00.02

Авторрферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Офіційні опоненти :

доктор біологічних наук Веселовський М. С.

канд. біологічних наук . Слінченко Н. Н.

-Провідна установа - Інстітут фізіологи Київського Університету їй. Тараса Шевченка

Офіційний захист дисертації відбудеться < 27 > квітня 1994 р. на »ас спеціалізованої ради Д-016. 15. 01 при Інстітуті фізіології їй.0.0.Бого АН України за адресою и. Київ. вул. Богомольця., 4.

З дисертацією можно познайомитися в бібліотеці інституту фізі їм. 0. 0. Богомольця АН України

Автореферат розісланий < * 1994 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради доктор біологічних наук

3. 0. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Більшість процесів міжнейронної сигналізації обумовлено діяльністю великого сімейства трансмембранних глікопротеї ні в, здатних розпізнавати 1 зв'язувати медіаторні речовини, а також взаємодіяти з ГТФ-зв'язуючими регуляторними-білками (Є-білками). Активація трансмембранних рецепторів впливає на здатність є-білків змінювати активність ферментів та провідність Іонних каналів. ■

Функціонування білків, які зв'язуються з ГТФ 1 здійснюють координацію дії позаклітинних передатчиків з ефекторники системами, регулюється за допомогою різних механізмів. Частіше за все вивчаються зміни в активності є-білків, до яких приводять ковалентні модифікації амінокислотних залишків цих протеїнів при їхньому фосфорилюванні або рибозилюванні (34,46,50,58) В останні роки з'явилась характерна тенденція до вивчення аллостеричної регуляції є-білків як білковими регуляторами (кальмодулін)1, так 1 більш простими сполуками : гуаніновими нуклеотидами та Іонани магнію

(33,42) Еагаточисельні регуляторні феномени обумовлені в біологічних системах на молекулярному рівні ковалентною модифікацією білків. Серед такого роду модифікацій переважас одна - фосфорилювання /дефосфорилювання/. Фосфорилювання за участю цАМФ-залежної протеінкінази А (ПКА), протеї нкінази С, кінази /9-адренорецептор1в призводить до зменшення ефекту дії нейромедіаторів, при цьому фосфорилюванню піддаються рецептори (4, 6,29,37), Іонні канали (58,

97, 102 ), Б-бІлки (92, 107). Рецептори нейромедіатора. дофаміна (ДА)

в тканинах хребетних тварин часто використовуються як модель десенситІзаціІ (29, 66). Дослідження пластичності т8рансмембранноІ

сигналізації з участю дофамінових рецепторів на класичних некробіологічних моделях - нейронах молюсків - також досить багаточисельні, але проведені в більшості випаднів з використанням непрямих електрофізіологічних підходів (71, 99). Значно менше

Досліджено у молюсків пластичність нейрональної трансміссії за допомогою лряких біохімічних тестів.

В запропонованому дослідженні за об'єкт обрано прісноводного молюска І.утпаеа гіадпаНз (великий п'явушник). В його ендокринних клітинах , що продукують Інсуліно-подібний гормон росту,

електрофізіологічними методами охарактеризовані дофакінові рецептори,

подібні та Д2 рецепторам хребетних тварин (98, 108, ПО). Описано також збільшення чутливості Д2 рецепторів до дофаміну в культурі цих клітин (109, 110) та модулювання інгібітором фосфодіестераз Іонної

провідності, індукованої дофаміном в нейроендокринних клітинах.

ЦІЛІ ТА ЗАВДАННЯ: мета проведеної роботи полягала в тому, щоб більш детально дослідити механізми пластичності трансмембранної дофамінової сигналізації у молюсків а використанням електрофізіологічних та біохімічних методів. Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1) Вивчити вплив ДА на іонну провідність в мембранах

нейроендокринних клітин, що продукують інсуліно*подібний фактор росту. Дослідити десенситізацію відповідей на ЛА в умовах електрофізіологічного експерименту та вплив на цей процес змін концентрацій внутрішньоклітинного З' , 5' -циклічного

аденозин-монофосфату (ЦАМФ).

2) Дати характеристику впливу ДА на активність аденілатциклази в мембранній фракції, одержаній з нейронів ЦІІС молюска.

3) Вивчити рецепцію ДА мембранними рецепторами в нервовій тканині молюска та вплив на регуляцію! цього процесу ендогенних модуляторів активності G-білків - гуанінових нуклеотидів та іонів магнію.

4)- Дослідити вплив цАМФ-залежногб фосфорилювання на взаємодію ДА рецепторів з відповідними їм G-білками та аденілатциклазою.

НАУКОВА НОВИЗНА. Показано, цо дофамін в ЦНС п' явушника

зв’язується з двома типами мембранних рецепторів. Це викликає зміни в іонній провідності нейрональнхх мембран, а також призводить до ГТФ-залежноІ активації та інгібуванню аденілатциклази. Наведені

процеси супроводжуються підвищенням активності ГТФ-зв'язуючих білків. Доведено, що наявність гуанінових нуклеотидів веде до зменшення афінності однієї з популяцій рецепторів ДА та підсилює спорідненість рецепторів до- антагоністів в другій популяції. Виявлено, що цАМФ-залежне фосфорилювання нейрональних мембран підсилює стимуляцію активності адені латциклази ГТФ-зв' язуючими білками, зменшує швидкість викликаного дофаміном ГТФ *=* ГДФ обміну та інгібує ГІФ-залежне збільшення афінності рецепторів до ДА.

ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ. Одержані результати можуть бути використані

для створення та вивчення нових фармакологічних препаратів, які або безпосередньо зв' язуються з дофакіно'вики рецепторами або впливають на його рецепцію.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріал« дисертації доповідались та

обговорювались на загальноінститутських семінарах сектору нейрофізіології Інституту фізіології їм. 0.0. Богомольця АН України (Київ 1922).

ОБ'ЄМ ТА СТРУКТУРА ДИСЕРТАЦІЇ. Дисертація складається з вступу 8 глав огляду літератури, описання нетодкк та експеринеитів, обговорення одержаних результатів, п'яти висновків та списку використаної літератури з 115 першоджерел. Робота викладена на 105 сторінках друкованого тексту, Ілюстрована 23 малюнками. ’

. МЕТОДИКА . '

■ 1. Тварини 1 матеріали.

Досліди проводили на тканині навкояоглоткового нервового кільця молюсків Lynnaea stagnalis ( Mollusca, Pulmonata).

Електрофізіологічні досліди проводили на клітинах , що продукують інсуліно-подібиий гормон росту (КГР), які Ідентифікували в церебральному ганглії відповідно критеріям, запропонованим в роботах голандських дослідників (47, 54, 108, 110). Для вивчення відповідей

на дофамін (ДА-вІдповідей) в КГР в експериментах використовували метод фіксації потенціалу 1 реєстрації трансмембранного струму. '

Оцінка- умов одержання мембранних препаратів проводилась за допомогою морфологічних та біохімічних методів. Для морфологічних експериментів використовували флюоресцентний мікроскоп, за допомогою якого ідентифікували клітини, з ядрами розміром 2-3 мКм... Для Ідентифікації клітинних ядер застосовували фарбник Bisbenzimide Н 33342 (Serva, Німеччина), який, зв'язучись з ДНК, утворює флюоресцентний продукт, який випромінює в зеленій області спектру. Зазор між стінкою скляного гомогенізатора 1 тефлоновим пестиком, вибирали такий, . щоб, кількість зовні непошкоджених, гліальних клітин в осаді після центрифугування була найбільша. Оптимальний,' розмір зазору складав 10-12 мкм, прк цьому клітини крупних розмірів (нейрони! в Інтактному стані в осаді не знаходились.

Виділені мембранні фракції з мозку молюсків, що використовувались для радіолігандного аналізу (65) заморожували при -60 С 1 використовували за необхідністю (65). Мембрани, що потрібні були для вивченя активності аденілп-циклази виділяли згідно з (25) та використовували протягом 3 часів. Для характеристики виділених мембраних препаратів визначали в них активність маркерних ферментів та наявність рецепторів медіаторів: за зв'язуванням міченого ДА,

активності гормон-залежної аденілатциклази (АЦ), с аг\ Na*K* -залежної АТФази (відповідно до запису, який наведанний в Практикуні по біохімії під редакцією С.Е.СеверІна та Г. А. Соловйової, // Москва . МГУ 1989 с 33-391).

Для вивчення зв'язування мічених лігандів з ембранами, препарат мембран інкубували в темряві при 4 С в 110 мкл суміші: Тріс-НСІ або МОФС-NaOH, 50 ммоль/л, аскорбінова к-та 0, і мг/мл або метабісульфат на 0,2 мг/мл, ЕГТА 2 нмоль/л , серотонін 100 мкмоль/л або катансерін 25 мкмоль/л, [3Н] SKF 38393 або [7.8 Зн] дофамін в різних

концентраціях, 0.0154 луброла WX. Кількість білка в пробі в різних

експериментах була від 7 до ЗО мкг.

При дослідженні фосфорилювання 250-300 мкг мембранного білку преінкубували у 0,02!; розчині луброла WX в 0, 5 мл слідуючого розчину (в ммоль/л): буфер ( МОФС або Тріс ) pH 7. 2 - 50, АТФ ( АффКНф В

контролі) - 3 ”, МдС1г - о. 8 , 0. 5 - S мкг на пробу каталітичної

субодиниці цАНФ - залежної протеінкінази (ГІКА) (з активністю 41 - 240 нмоль/мкг фермента), окадеінової кислоти-0. 02, ЕГТА - 2 , протягом 10 хв при 28 °С (14). Реакцію зупиняли 10-кратним розбавленням

охолодженим буфером. j

Для визначення активності препарату ПКА використовувався метод .який був запропонований в роботі (14).

В експериментах з застосуванням антитіл мембрани попередньо інкубувались з імуноглобулінами протягом 60-90 хвилин на льоду. За контроль бралася нормальна сироватка того ж розбавлення. Антитіла кролика в концентрації 6 мг/мл (фракція IgG) були одержані до

синтетичного пептиду з такою амінокислотною послідовністю: НН2-А1а

Asn Аєп Leu Arg Gly Cys Glu Leu Tyr-COOH (345-334 консервативних амінокислотних залишків G^a хребетних тварин) та до суміші £,+ Рг нативних субодиниць G-білків (18). Препарати антитіл вироблені фірмою НЕМ (США) та люб'язно надані нам проф. В. А. Ткачуком ( ВкНЦ, Москва).

Активність AU визначали за накопиченням цАМФ, відповідно нетоду, запропонованому Соломоном з співавт (86).

ГТФазна активність визначалась в системі, яка описана в роботах (20, 43)

При вивченні мембранної ГТФазноІ активності Фосфорилювання мембран каталітичною субодиницою ПКА проводилось при наявності 0. 5 ммоль/л AT«rS. 2 ммоль/л 11-3 мкг ПКА.

Зв'язування ГТФ-гі- "р проводилось в проГп.шо містила мембранний

білок - 450 - 300 НКГ; ТрІС-НСХ буфер 50 ММОЛЬ/Л, pH » 7,4; ЕГТА 2 нмоііь/Л; ДТТ 1 мноль/л; 0,3 « 10s - 1 «10 імп/хв радіоактивної

МІТКИ; БСА О, 1 МГ/МЛ; ГТФ S НКМОЛЬ/Л; 100 мкмоль/л АМФФШФ ; АТФ -регенеруючу систему; Тритон X-100 0.02У. (82). Інкубація проходила пр* 30°С протягом ЗО хв, після чого в суміш додавався ДА (в кіипевій концентрації Ю нкмоль/л) 1 TTirS (5 ккколь/л) або тільки ГТФгБ (82).

В окремих дослідах використовувалась кПКА. Склад і кількість радіоактивних гуанінових иуклеотипів вивчалась за допомогою тонкошарової хроматографії (3). - '

Після внесення ГТФуЗ проба фільтрувалась через фільтр Whatman ' GF/C. •

Кількість гуанозии ди- та грифосфатів визначали спектрофотометрично за рівнем поглинання при довжині хвилі 252 нм, pH 7.0 1 с рійним 13700 для 1 коль/л речовини.

Кількість білка визначали за методом Лоурі (23).

РЕЗУЛЬТАТИ

І. ЯА-Індуковані струми в клітинах, шо виділяють гормон росту.

Спираючись на літературні дані (47, 99, 108-111), ми намагалися

застосовуючи електрофізіологчі методи, знайти та Д2 рецептори ДА в UHC Lymnaea Для цього використовувались розташовані в церебральному ганглії КГР (47, 34). '

Приблизно в половині випадків, апплікація ДА (230 мкмоль/л) на клітини КГР викликала появу вхідних струмів (Нал. 1 ), в інших -вихідних (Man. 1 ). Нечасто удавалось зареєструвати двофазну

відповідь. Електричні відповіді клітин на ДА залежали від концентрації ДА в мікропіпетці Аналіз вольт-амперних характеристик цих струмів (BAD свідчить про те, що потенціал реверси вихідного струну дорівнює приблизно -90 иВ, та с близьким до рівноважного

потенціалу для К+, вхідного: ніж -10 та -S мВ (Нал. 1). Останнє

значення ноже свідчити про те, що канали, які активуються ДА та відповідають за виникнення вхідного струму або не селективні до іонів натрію та калію, або має місце одночасна активація провідностей для різних іонів.

Вихідні ДА-струми зворотньо блокувалися антагоністом сульпіридом (100 ккмоль/л). Аплікація агоніста ДА - 6,7-АДТН (50 мкмоль/л) -

приводила до появи вхідного струму. На відміну від дії ДА, 6,7-АДТН

вже при повторній аплікації викликав більш довгий за часом струм, на фоні якого наступні аплікації не приводили до виникнення вхідних

струмів (вихідний струн не досліджувався) (Мал. 2). Такий ефект агоністу ДА може вказувати на розвиток десенситизації, яка обумовлена прикладанням нейротрансміттера. •

Для більш детального вивчення процесу десенситизаціІ аплікації ДА проводились одразу ж після виходу на початковий рівень струму, який виник в результаті попередньої аплікації. Як правило, після третьоі-четвертоі аплікації медіатору амплітуда Відповіді зменшувалась на 30-40 х. За таких умов двсенситизація вхідних струмів при частому прикладанні ДА не спостерігалась (Мал,2).

Щоб з'ясувати можливий вплив зміни рівня цАМФ на ДА-струми в мембранах КГР, ДА апікували на нейрони з Інтервалом 100 хвилин (для попередження десенситизаці І) в присутності 100 мкмоль/л Інгібітору фосфодіестераз - ІБМК. Ефект ІБМК - пригнічення як вхідних, так 1 вихідних (Мал. 1 а, б) струмів - був зворотнім та розвивався на 3-І хв, досягаючи свого максимального значення на 20 хв. ВАХ ДА-струні в в присутності ІБНК демонстрували відсутність змін потенціалу реверсії струму. Цей факт свідчить на користь того, по іонна природа ДА-струнів не змінювалась, якщо я розчині Рінгеру був присутній

Інгібітор фосфодіестераз. ,

11. Вивчення властивостей аденілатциклазя.

1. Виділення плазматичних неибран.

Якість фракціонування тканевого гомогенату в результаті

диференціального центрифугування оцінювали, міряючи активність в різних фракціях центрифугата трьох ферментів. Иа*К*-, СА2*- залежних

АТФаз і аденілатциклази ( в перерахунку на мг. білка за хв. ).

Знайдено, що 65% активності Иа*К*-залежної АТФази, відносно активності цього ферменте у всьому клітинному гомогенаті, припадає на фракцію мембрани. Активність СА2,-залежноі АТФази спостерігалась в супернатанті (58%) 1 в мембранній фракціях (9X1. Фракція гомогената, з непошкодженними клітинами, ядра, глію 1 шматки тканини, одержані після першого центрифугування, містила біля 29% тотальної активності Са2*-залежноІ. АТФази. • •

Активність АЦ, стимульована фторидом алюмінію також реєструвалась, головним чином, в мембранній фракції: більше 50% від загальної

активності. '

Питоме специфічне з в', язув.ання тритованого ДА 1 БКґ 38393 з препаратами різних фракцій було найбільшим в мембранній фракції 1 майже повністю було відсутнє в супернатанті. Кількість питомого

Вихідні струми в

клітинах. які продукують

інсуліноподібний гормон

' -о.

росту (КГР), викликанні

ашіикацісю дофаніна.

а. Вихідні струни при

різних лідтринусних *30

потенціалах (показані

зліва, мВ) •• 1 - контроль; "70

2 - після 20 хв суперфузії-юо

розчином з 1,4-ізобутил

2-мвтил-ксангинон (І БИК)

(0,1 • ммоль/л).

концентрація ДА о,25

Кноль/л. б. Вольт-амперні

характеристики (ВАХ)

вихідних срунів в контролі

(1) 1 ПІСЛЯ Дії ІБМК (2).

Мал. 2. '

ВХІДНІ струми в КГР, викликанні трьома

послідовними аплікаціями дофаміну (б.- через 20 хв. Після послідових аплікації)

тотального зв'язування нітки з «гліальною» фракціє» гомогената досягало рівня загального зв'язування з мембранною фракцією, але специфічне зв'взування в цьому випадку складало лише 5-10Х від такої ж величини для мембранної фракції.

2. Загальні властивості нембранноі аденілатциклази.

Відповідно до результатів наших експериментів, в мембранах Ьутпаеа ряд відомих кейромвдіаторів (мет- 1 леу-енкефаліни; простагландіни Е1 и Е2; фрагмент* 1-24, 1-13 я 4-Ю адренокортикотропіна - АКТІ)

змінювали активність АЦ дозозалежним шляхом. Всі дослід* з

нвйропептидами 1 простагландінами проводились при наявності в середовищі 10 икмоль/л ГТФ. Енкефаліни 1 морфін в концентраціях

більше 80 мкмоль/л помітно інгібували, а в меншій кількості, стимулювали АЦ. АКТГ 1 його фрагменти, особливо 4-Ю, виявились

сильними стимуляторами АЦ. Простагландини Е( и Еа в концентрації 5 мкноль/л збільшували активність АЦ більше ніж в два рази, а 10 мкмоль/л -в 4.3 раза- У всіх випадках додавання в інкубаційне середовище не тільки ГТФ (10 мкноль/л), а і ГДФ0В (1-10 ккмоль/л) викликало повне Інгібування активності АЦ. Внесення в Інкубаційну суміш ГТФуЗ (5 мкмоль/л), замість ГТФ, призводило до чіткого збільшення активності АЦ, але не потенціювало дію медіаторів. Для

прямої активації АЦ, виключаючи •участь рецепторів 1 в-біякіо, використовують дитерпен форсколін І БО). в мембранних препаратах з 11НС [.утпаеа форсколін у 4 - 4,5 рази збільшував активність АІІ.

3.вплив ДА на активність АЦ.

Базальна активність А1І зростала із збільшенням концентрації ГТ*: при 10, 25 н 100 ккноль/л ГТ* активність АЦ складала відповідно :

2, 7; 5 и 7,9 пмоль/хв. мг білка. ДА мав подвійний вплив на активність фермента, інгібуюча або стимулююча дія ДА залежала від концентрації ГТФ. При концентрації ГТ* рівної 10 мкмоль/л, внесення в пробу дл у всіх випадках тільки стимулювало АЦ, збільшення концентрації ГТФ до 25 мкноль/л призводило до появи двофазної відповіді на ДА 100 мкмоль/л ГТФ - тільки до інгібування активности АЦ.; Вплив ДА був 1 на фоні стимуляції активності АЦ форсколінон або Кого аналогом (50 икйоль/л). При активуванні форсколіном АЦ, ДА в присутності 1 мкмоль/л ГТФ збільшував активність АІІ, 100 нкмоль/л - зменшував (мал.

2). Агоніст ДА рецепторів 6.7 АДТН змінював активність АЦ ГТФ-дозозалежним шляхом: в посутності 25 ккмоль/л ГТФ 6.7 АДТН в малих Концентраціях інгібував АЦ, а в великих - стимулював; при 100

ккмоль/л ГТФ спостерігалась тільки Інгібуюча Дія Б.7 АДТН. Дія ДА на активність АЦ блокувалась сі-ЬБО (5 мкмоль/л) -.який є відомим г-' . агоністом рецепторів катехол- 1 індоламінів як у хребетних тварин (76), так 1 у молюсків (28).

4. Вплив фосфорилювання на активність АЦ '

Для вивчення впливу фосфорилювання на ГТФ-залежну регуляцію активності АЦ ЯА використовували каталітичну субодиницю цАМФ-залежноі протеїнкінази (ПКА). В таких дослідах мембрани преїнкубували з каталітичною субодиницею ПКА (7 пит. од. активності на 25 мкг мембранного білка) протягом 10 хв при 30°С в присутності АТФ-регвнеруючоІ суміші (креатинфосфат- креатинкіназа) 1 5 ммоль/л МдвО^. В контрольних дослідах була вивчена можливість ПКА фосфорилювати мембранні білки в умовах експериментів на нейрональних мембранах молюсків. Для цього у Інкубаційний розчин добавляли АТФ-7-згр ( IX106 розп./хв. на пробу), -50 мкмоль/л АТФ 1 5 ммоль/л

ИдЭО^. В Негативному контролі ПКА була Інактивована нагріванням. В присутності ПКА в мембранні білки включалось О. 5-0.З пкмоль Р(/ мг менбранного білка за хв. на одну одиницю активності фермента. Після Інактивування ПКА включення радіоактивного неорганічного фосфату в білни не знайдено Після обробки мембран каталітичною субодиницею ПКА базальна активність АЦ при 100 мкмоль/л ГТФ зменшувалась до ІЗ'/. + 97. відносно контрольної величини, а ДА у всіх концентраціях впливав на активність АЦ тільки стимулююче, хоча в контролі вплив ДА . при таких концентраціях ГТФ був тільки Інгібуючим (мал. 3). Оскільки базальний рівень активності зменшувався ~ в 2 раза, то стимулююча дія ДА на АЦ ледь досягала контрольного базального рівня.

5. Вплиз фосфорилювання на гормон-незалежну активацію АЦ Активність АЦ в присутності 100 мкмоль/л ГТФ 1 АЇР4" в мембранних препаратах збільшувалась в 7 - 8 разів (мал. 4 є) (базальна

активність 7,9 пкмоль/хв. мг білка прийнята за 100 X). Якщо мембрани преї нкубували з каталітичною субодиницею ПКА а потім вносили А1Г4~, то в цих умовах активність АЦ зростала до 2000 - 2300У. (мал. 4. в). В випадку додавання фториду алюмінію до початку фосфорилювання, ефект А1Г4’ в умовах фосфорилювання мембран зменшувався (мал. 4 д). Для негативного контролю процесу фосфорилювання в Інкубаційну суміш під час преї нкубац і.і в розчин замісь АТФ добавляли його аналог що негідролізусться АМФФШІФ ( 50.мкмоль/л), він не с Інгібітором АЦ, 1 також не служить субстратом в реакції фосфорилювання. яку каталізує

ПКА (6). В контролі активність AU при наявності AlF*' та каталітичної субодиниШ ПКА незначно відрізнялась від такої в експерименті, де використовувався тільки фторид алюмінію (мал. 4 б, в, г). '

111. Зв'язування лігандів ДА рецепторів з нейрональними мембранами.

Специфічна рецепція [7,8 3Н] ДА та [3Н] SKF 38393 мембранними

рецепторами з нервової тканини молюска представлена як різниця між

тотальним та неспецифічним зв'язуванням в присутності 200 икмоль/л ДА. Неспецифічне зв'язування досягало 20% від рівня тотального, при цьому більша частина цtсі кількості припадалала на зв’язування

тритієвої мітки з матеріалам фільтрів. Специфічне зв' язування

характеризувалось насиченням, в тої час як неспецифічне було лінійним.

і:ГТФ-залежна рецепція агонистів ДА рецепторів.

Вивчення ролі G-білків -8 регуляції рецепції ДА' та Кого агоніста [3Н] SKF 38393 здійснювалії за допомогою псш Іклональних антитіл до консервативної амінокислотної послідовності СООІІ-терміналі а субодиниці G - білку та антитіл до нативних (3 1 а субодмниць G -

■ о • 12 •

білків, а також в присутності різноманітних гуаніновнх нуклеотидів та іонів Мдг' ( 18. 26, 39).

Виявлено, що при концентрації (3ît] BKF 38393 0.03-0.1 нмоль/л та 2 ммоль/л НГТА додавання до Інкубаційного середовища гуаніновкх нуклеотидів викликало збільшення зв'язування ліганду, збільшення концентрації f3H} ВКР 38393 до 1.5 нмоль/л приводило до того, то Гіф (1 особливо ГДФ), а також їх аналоги ингібували звізування мітки з ДА рецепторами мембран. Максимальний ефект ингібування проявляли аналоги ГДФ та ГТФ, що негідролізуються, а також ГДФ ; при цьому Інгібування досягало - 70 7,. ГТФ виявився менш ефективним. АНФ, АДФ та ГМФ ніяк не впливали на зв'язування ліганду рецепторів. В присутності Мдг+ зв'язування (3H]-SKF 38393 знениувалорь дозозалежним шляхом (максимально при 5 ммоль/л НдСІг на 40 - 45 X). Серед речовин, які зв' взуються а-субодиницею G-білків, найбільший ингібуючий вплив на зв'язування [3Н] - SKF 38393 проявлявся з боку A1F4- (2 нмоль/л NaF _ 50 мкмоль/л АІСІдї, який зменшував специфічне зв'язування на - 90 У.. Ми зробили спробу з'ясувати ефект різнонаправленого впливу гуаніновях нуклеотидів на зв' язування агонистів ДА з рецепторами в порівнянні з відомими літературними даними (18) за допомогою аналізу зв'язування в системі координат Скетчарда. Однозначного рішення задачі ця спроба

c

£

o>

E

\

0

E

n.

OJ

1

V

o

o

:\№\) і 9, і /* !

¡№0/¿M СІТІ1 * ІОО//М (ЛТ +. ікл

Adenylate cyclase activity

the presence of catalylic -.ubMinto í'KA

•Z№\)

two

>

<J

ПІ

O

<

■J і'’-

Han. 3. '

ДА-запежна активність а присутності каталіткчн субодиниці протеїнкінази (кПКА). Активність міряла при концентрації ГТФ і нкмоль/л, активність нПКА 240 ПМОЛЬ / мг. сек (7 м КПКА / 25 МКГ мембранно білку). 1 - активність ба 2 - в присутності кПКА.

ВІдносн

АЦ 1 1

Мал. 4.

Діаграма значень АЇР

залежноіактивності присутності' кПКА «кмоль/л ГТФ.

По горизонталі: а

котроль; 6-е - ’ п

додавані:б - кПКА; в спочатку кПКА, а пот АЇР4"; г - спочатку кПКА, потім АЇР4" + АМФФЯНФ 11 мкколь/л) ; Д - при умові спочатку АЇР4, потім кПК е - АЇР4": по вертикалі

активність по відношенню базальн.ого рівня ( 7

пмоль /нг /хв ), прийнято за 100 7..

. «РКЛ .гемм*- гаА

Alt“

AppM'j-

д

на принесла, ала з'явилася певна ясність: [3Н] SKF 38393 в

присутності 200 мкиоль/л ГДФ та 2 ммоль/л МдС12 зв'язуеться з двома популяціями ДА рецепторів: високоафінники з KD*l. 1 нмоль та В^-34

фмоль/мг белку 1 низькоафінними з К-31 нмоль та В -170 фмоль/иг білку. Наявності бівапентного характеру зв'язування [3Н] SKF 38393 достатньо, для того, «об провести порівняння з експериментами де гуанінови нуклеотиди не використовувались. Нагадаю, що агоніст ДА рецепторів в цьому разі демонструє моновалентний тип зв'язування. Доцільно було б припустити, що внесення В інкубаційне середовище ГДФМд викликає появу двох популяцій рецепторів. Одна з цих популяцій збільшує свою афінність до агонісгу в присутності ГДФ, друга" -зменшує.

При вивченні залежного від гуаніновнх нуклеотидів збільшення зв' пзування тритієвих лігандів з ДА рецепторами нейрональних менбран в запропонованій роботі використовувались як ГТФ, так 1 ГДФ та їх аналог«, які негідролізуються. Внесення в Інкубаційна середовище ГІФ в концентраціях від Ю"3 до 10'7 коль/л в незначній мірі. (на 5 - 15%)

Інгібувало зв'язування 2 нноль/я [7,8 3Н] ДА з иембраннинк

рецепторами при всіх концентраціях ГТФ крім однієї. Введення в інкубаційне середовища ІО'6 ноль/л ГТФ збільшувало специфічне зв'язування медіатора на 28±7 X- В присутності ЕГТА та ГДФ0Б специфічне зв'язування 2 нмоль/л [7,83Н) ДА з мембранними рецепторами значно збільшувалось (максимально до 250% - при концентрації

гуанінового нуклеотиду 10'5 моль/л) (Нал. 6). Заміна ЕГТА на ЕДТА викликала пригнічення ГДФ£8-стимульованного збільшення зв'язування [7,8 Зн] ДА та приводила до зсуву максимально ефективної концентрації аналогу ГДФ з 10"5 до 10~6 ноль/л. Подібний ефект ГДф^Э спостерігався 1 під час зв'язування з нейрональними мембранами 0. 8 нмоль/л [3Н) SKF 38393. Беручи до уваги, що ЕГТА слабоцелатує з розчину іони Мдг*. а зв'язування агоніста рецептора інгібується внесенням Мдг* в

Інкубаційне середовище, можна припустити існування Мд2' компоненту в ГТФ-1 ГДФ)-залежній регуляції афінкастІ ДА рецепторів до агонистів. На користь цього твердження свідчать літературні дані, що вказують на залучення Іонів Мд2+ а регуляцію активності G-бІлкІв (18, 40).

Для більш детального дослідження спряження ДА рецепторів з G-бІлками використовувались поліклональні антитіла до кативних G (0+0) субодиниць, що беруть участь у спряженні G-бІлків з рецепторами (18). Попередня Інкубація менбран з антитілами до (

приводила до незначного зменшення здатності ГДФРБ збільшувати специфічне зв' язування міченого ДА а присутності ЕГТА. Антитіла до консервативної -СООН терміналі (ділянка в-біпку, яка взаємодіє з рецептором (18, 26)), напевно, більш адекватні при вивченні

функціональних зв'язків рецепторів та ГТФ-зв'язуючнх білків (39). Після обробки мембран анти-С а антитілами специфічне зв' язування ДА

О

рецепторами [7,8 3Н] ДА в присутності ГДФ/35 наочно збільшувалось при всіх використаних концентраціях нуклеотиду (Нал. 6). При специфічному зв'язуванні [3Н] ЭКГ зазэз, яне вивчалось після Інкубації найрональних мембран з антитілами до <3 а, ефект ГДФЗЭ був подібний тому, який спостерігався в попередньому випадку: наявність ГДФ/ЗЭ в

розчині призводить до збільшення специфічного эв' язування ліганду. Варто відзначити, ідо висока концентрація ГДФ/5Я (10"3 моль/л) Інгібувала специфічне зв' язування агощсту ДА, що не спостерігалось при зв' дзуванні [7,8 3Н] ДА при тих же умовах.

2. Вплив фосфорилювання на ГТФазну активність та ГДФ/іЯ- залежне зв'язування.

Збільшення активності мембранних ГТФаз супроводжує активацію рецепторів та спряжених з ними б-білків (18, 33). Назальна актйвність Р1 зних ГТФаз в нейрональних мекбранах молюска складала 5.1+1 пмоль/нг білку/хв. Дофамін дозозалежнии чином збільшував активність ГТФаз в 4-5 разів (Иал. 8). Цей факт вказус на втягування в процес ДА-залежної трансмембранної сигналізації є-білків. Після попередньої інкубації мембран з каталітичною субодиницею ПКА практично повністю Інгібується ДА-залежна активність ГТФаз. Базальна ГТФазна активність в мембранному препараті в таких експериментах зменшувалась до 61% від Контрольного рівня (на мал. 8 базальний рівень в контрольному досліді та в досліді з використанням ПКА взятий за 100%). Щоб з'ясувати, чи являється ГТФ в даних експериментальних умовах субстратом для кПКА, а також для того, щоб запобігти негативного впливу (враховуючи характер експерименту) мембранних протеїнфосфатаз, АТФ в розчині був замінений на АффКНф або АТФтБ в тій же концентрації, що І АТФ. АффЫНф не являється субстратом для кПКА та мембранних фосфатаз 1 може бути використаний як конкурентний субстратной Інгібітор цих ферментів (6). АТФуБ підходить як субстрат для процесу фосфорилювання в тій же мірі, що 1 АТФ, але тіофосфатна група, перенесена на амінокислотний залишок субстратного білку проте 1нкіназой не доступна для дії протеїнфосфатаз.

Man. 5.

Зв'язування [7,83H]

дофаміна а нейрональними мембранами п' явушника в координатах Сквтчарда.

Нап. 6.

ГДФ/ЗБ-залежне специфічне зв’ язування з мембранами [7.83Н] . дофаміна в

концентрації 2 нмоль/л після обробки мембран антитілами, одержаними проти консерва- . тивної амінокислотної послідовності Є а субодиниці 1 - в

О

присутності ЕДТА (2 ммоль/л), після обробки нормальною сивороткою кроля; 2 . - ' в присутності ЕДТА (2 нмоль/л), після обробки мембран

антитілами, одержаними проти є а субодиниці є-білків.

H№.,»*1.111 і'Нн'І •Ji.jHHniiif/iiii: j'1"1»'''»

|чіи>1

(¡DP/yS-tU'priidtfiil 17ЛГ'П( (Uijiaminr huiUni"

in control Hint «ft<4 инІіІнмН ItfiHiwM

КПТЛ * wium

KD1A ♦ iu»tiln)«l,v

Експерименти показали, що заміна АффЛНф на АТФзгБ під час попередньої ІкубацІІ в контрольних експериментах (без ПКА) помітно не впливала на ДА-залежну 1 базальну ГТФазну активність (Кал. 8). В дослідах по вивченню впливу цАМФ-залежного фосфорилювання на ГДФ-залежна зв' язування ДА та його агоністу з иембранними рецепторами, мембранні білки фосфорклювались каталітичнною субрдиницею ПКА після обробки анти-в^« антитілами. Для фосфорилювання використовувались як

комерційні препарати ферненту («5ідгаа«, активність 41 пмоль /мг фермента сек.), так 1 виділені нами за методом(14). Під час

фосфорилювання 1 на протязі всього часу Інкубації з радіоактивним лігандом в інкубаційннаму розчині був присутній селективний Інгібітор протеїнфосфатаз - окадеінова кислота, в кінцевій концентрації, що дорівнює г нкмопь/л (ЗО). В контрольних експериментах АТФ було замінено на його аналог, що непдролізуеться,

- АффННф. Результат досліду представлено на мал. 7. З цих даних можна спостерігати,що обробка препарату мембран каталітичною

субодиницею ПКА знищує здатність ГДФ/Зв збільшувати зв'язування [7,8 3Б] ДА з ДА рецепторами після обробки антитілами до анти-Є а з.зв'язування ГДФ-а-''Р з нейрональними мембранами.

Для дослідження мембранних Є-білків що стимулюється медіатором в представленій роботі використовувався радіолігандній аналіз зв'язування гуанінових нуклеотидів С-б1лками (82, 91) (див. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ), якай дозволяє оцінити обмежуючий швидкість етап у ферментативному циклі цих регуляторних білків : дисоціацію ГДФ від а-субодиниці є-білку. При застосуванні методу тонкошарової

хроиатографі І інкубація мембран з ГТФ-а-33Р на протязі ЗО хвилин давала можливість спостерігати 65 V. загальної радіоактивності в досліджуваній пробі в нісці локалізації ҐДФ. Цей факт свідчить про

те, що більша частина всієї мітки, як зв'язаної з мембраною, так 1 тієї, що знаходиться у вільному стані являє собою ГДФ. Починаючи з 20 хвилини інкубації мембран з ГТФ-а-33Р на протязі наступних ЗО хвилин кількість мітки, що зв'залась, достовірно не змінювалась. Отримані результати вказують на те, що зв' язування ГДФ-а-33Р з мембранами

після 20 хвилин Інкубації є стабільним процесом. В цих умовах

внесення в інкубаційне середовище ГТФтЄ приводило до зсуву рівноваги 8 стані б-білків, що виявлялось в зменшенні з часом кількості зв'язаної радіоактивної мітки (мал. 9). В присутності ДА та ГТФгЗ зв'язування ГДФ-а-33Р зменшувалось на 80 -90 '/. на протязі 8 хвилин.

Швидкість зменшення зв'язування можна представити у вигляді К -i-Q І.С/С 1 '

t (хв ), де С - зв'язування в момент часу t>0, а CQ -

зве'язування ГДФ-а-33Р в момент t - О (91). В такій формі К - 0,07

хв'1 для ГТФгЗ та К 0,24 хв"1 для ДА + .Г.ТФТ8. Інкубація мембран з

радіоактивною міткою в присутності антагоністу рецепторів -

сульпіриду (100 мкмоль/п) - приводила до помітного (але не повного)

інгібування зменшення зв'язування ГДФ -<х-33Р при додаванні ДА та

ГТФгЯ (мал. 9). Агоніст ДА- 6,7-АДТН діяв як 1 ДА 10. Вплив

фосфорилювання на ГТФ «=» ГДФ обмін.

Фосфорилювання мембран під час їх преінкубації з кПКА викликало помітне зменшення базального рівня зв'язування радіоактивної мітки -на 45 X; змінювалось також 1 Індуковане ГТФгБ зменшення зв'язування ГДФ-а-33Р: К 0,05 хв'1. На мал. 9, базальний рівень зв'язування

ГДФ-а-33Р + кПКА зведений до рівня зв'язування в контролі, без кПКА. Під впливом ДА + ГТФгЗ на фосфорильовані мембрани К] витіснення ГЛФ-а-33Р дорівнювало 0,16 хв’1; для випадку з Б, 7-АДТН К » 0,07

хв"1.

ОБГОВОРЕННЯ

Отримані нами результати свідчать про те, що ДА впливає на

активність AU в мембранах нервових клітин молюска Lymnaea як

стимулюючим, так 1 Інгібуючим чином. При цьому ступінь проявлення та направленість дії ДА залежить від концентрації ГТФ. В цьому

відношенні, процес трансмембранної сигналізації, викликаний ДА, в нервовій тканині п'явушнкка схожий з цим же процесом в нервовій

системі хребетних тварин, де рецепція ДА веде,в залежності від

концентрації ГТФ в розчині до стимуляції або до інгібування АЦ (98). виходячи з одержаних нами даних, можна провести подальші аналогії властивостей АЦ в мембранах нервових клітин Lymnaea із властивостями АЦ хребетних. Медіатори, що традиційно впливають на активність АЦ хребетних : АК.ТГ, простагландіни та енкефаліни (18, 85) впливають 1

на активність АЦ в нервовій тканині Lymnaea, як в напрямку

стимулювання, так 1 Інгібування. Направленість ефекту нейропередатчиків залежить від концентрації ГТФ та Інгібується додаванням ГДФ(33. Стимулюючий вплив на АЦ проявляє форсколін та його агоніст 7-0-хек1сукцин1л 7-д1ацет1л форсколін. Як показали результати наших електрофізіологічних експериментів, в К.ГР ДА індукує виникнення двох типів відповідей (де-.та гіперполяризуючі), а також їх комбінації - двофазні Іонні струми. Оскільки відомо, що Ці

Мал. 7.

. ■ * .

ГДФ0Б-залежне специфічне за' язування з нейрональнини мембранами {7,8ЭН ] дофаиіна в концентрації 1.4 нмоль/л після їх обробки антитілами, одержаними проти консарвати-вної амінокислотної послідовності в а субодиниці

О

Б-білків. Мембрани

фосфорилювались каталітичною субодиницею цАМФ-залежноІ ' протвінніназя 1ПКА). 1. -

ПК А +■ АМффННф;2 - ПКА + АТФ.

Нап. 8.

Вплив фосфорилювання

мембран за допомог»

каталітичної субодиниці

протеїнкінази А (КПКА) на дофамін- залежну ГТФазну активність в нейрональних мембранах молюска. 1. -

АффШф; 2. - АТФ78; 3. -

АТФгЗ + КПКА.

Мал. 9.

зміни в часі кількості за' язаниого ГД*-а-33Р в присутності кПКА ( 10 нкг фермента / 200 мкг.

мембранного білку ) порівняно з контролем ПІСЛЯ додавання Б мкмоль/л ГТФгЭ +■

10 мкноль/л ДА (1) и 5 ккмоль/л ГТФтБ + 10 икмоль/л ДА + КПКА (2).

<;|)Г/і>. іі('|>гіі<іі'ііі ІТ.Н'ІІІ (|і>|іаііііік* іиінііііі' ... « ..„її..| .ГІгг .»міНіі ....... ГК \

* ...... • ЇМ МІГ

♦

ПА-іігіи-ікісці !»«іпіігапе (іТСач«*

ІІІ..Н.ІІ.-І ПІНІ .П--, ii.ohiI.ii.ih- сім.^-іхиіиіі»» »м>іВ І'КА

-Т *6 -Ь -1

• І .»«НІЛІ

• •АТІ'^ТкА • ■ ■ЛТГ 11 АТГіЯ

Ттіг. І—І

• І*п}».1тіп-ИГИ‘/'4

нейроендокринні клітини не чутливі до серотоніну (99), то можна припустити, що відповіді обох типів реалізуються лише 6 результаті активації ДА рецепторів.

Аналізуючи одержані нами ВАХ ДА-1ндукованних струмів, а також враховуючи літературні дані (39, В8, 09), кожна припустити, що Іонна природа вхідних струмів швидше за все - натрієва, а вихідних -калієва (85, 99).

Наведена точка зору співпадає з тим, що Дг рецепторі хребетних тварин стимулюють К* -провідність та інгібують AU (10, 18, 88).

Проведене нами дослідження властивостей АЦ в мембранах з нервової Тканини п' явушника продемонструвало існування ДА-залежної стимуляції та Інгібування активності All в цій тканині, оскільки відомо, що ін'єкція цАМФ в нейрони молюсків, викликає головним чином появу На*

струму <1, г, 83), то можна припустити, що і в нашому випадку

деполяризуючий компонент ДА-струну зв'язаняй а підвищенням активності

АЦ, в той час яі< гіперполярнзуючий компонент обумовлений процесами, спряженими з II Інгібуванням.

Фосфорилювання - один з найбільш загальних механізмів регуляції функціонування білків, в тому числі і рецепторах (16, 19). В

представленій роботі вивчались зміни в горкон-залежній активації НА АЦ в мембранній фракції, одержаній з нвйрональних тканин Lymnaea stagnalis, в результаті дії каталітичної субодиниці ПКА. Вплив каталітичної субодиниці ПКА приводив до зменшення базальної активності АЦ. знижувався на цьому фоні 1 стимулюючий ефект ЯА, але інгібуючого впливу на активність АЦ не спостерігалось. ІІеЙ феномен ми дослідили більш детально.

Активація АЦ за допомогою фториду алюмінію (пряма.' без участі рецепторів), після фосфорилювання мембран кПКА приводила до значного збільшення активності AU в порівнянні з контролем. Можливо, Що знайдений нани ефект відображає властивість фосфорильованих G-білків більш ефективно стимулювати АЦ, або ж вказує на зменшення здатності Е(-б1лкІв Інгібувати цей фермент. Не можна ігнорувати 1 можливість сполучення цих Процесів.

Ми здійсняли спробу проаналізувати один з вірогідних механізмів регуляції Дг-подібних відповідей в КГР, а саме, вплив цАМФ-залєжного фосфорилювання на цей процес. Пролонгуючи дію ендогенного цАМФ за допомогою Інгібування цАМФ-фосфодІестерази ІБМК, ми відкрили звороти дію ІБМК, шо Інгібує обидва типи ЛА-викликаного струму.

Рецепція дофаміну на клітинних мембранах, виділених з різноманітних тканин хребетних відбувається за участю як мінімум двох різних (в фармакологічному та генетичнному розумінні) сімейств трасмембранних рецепторів (Д та Д2), як спряжения з різники ГТФ-зв' язуючини регуляторними гетеротримерними білками (G-бІлкани) (18, 79). Рецепція біогенних амінів на нейрональних мембранах

молюсків вивчалась найбільш детально за допомогою міченого неселективного антагоністу ( dLSD ) в тканинах Aplysla californica та Helix pomada. При цьому виявилось, що рецепція ДА та серотоніну здійснюється різними рецепторами, але використання dLSD не дозволяє аналізувати ДА та 3-НТ рецептори незалежно один від одного (761. Вивчення зв’язування міченого ДА з мембранами з нервових тканин РіапогМз corneus продемострувало існування двох типів ДА рецепторів (високо- та низькоафінні) (34), а в нервових центрах та сітківці Octopus octopus за допомогою селективного антагоністу рецепторів -SCH 23390 - виявлено Існування Д4~ подібних рецепторів (60).

Радіолі ганяний аналіз зв'язування [7.83Н] ДА, а також агоністу Д5 рецепторів {3Н] SKF 38393, представление в цій роботі, дозволяс припустити, шо в нервовій системі Lymnaea stagnalla існують рецептори ДА, які мають високу та низьку спорідненість до цього нейропередатчика. Щільність вясокоафінних рецепторів, виміряна за допомогою радіолігандного аналізу зв'язування [3Н] SKF 38393 з мембранами, співпадає з щільність» вясокоафінних місць зв'язування, одержаною при аналізі зв'язування міченого ДА . IÍ1 результати, а також той факт, що ДА або стикулюс, або інгібує активність АЦ в нейрональних мембранах молюска в залежності від концентрації ГТі, дає можливість припустити, що трансдукція ДА сигналу в нервових тканинах молюсків подібна тій, яка описана у хребетних (98, 104).

Зміни вфінності мембранних ДА-рецепторів до [7.83Н] ДА та {3Н] -6KF 38393 у Lymnaea stagnalis демонструють явну залежність від присутності гуанінових нуклеотидів, що свідчить про те, шо ці ліганди с агоністами ДА рецепторів, спряжених з G-білкамя (18. 33). Рецепція ДА викликала в мембранах з нервових тканин Lymnaea stagnalls підсилення ГТФ-азної активності та прискорення ГДФ ♦-* ГТФ обміну, що безпосередньо свідчить про залучення G-білків до дії ДА (33). Отримані нами результати підтверджуються роботами інших дослідників. Так, участь G-білків ( G^-подІ бних) в дії ДА в нервовій систвні молюсків прямо показано при дослідженні ДА-викликаного Інгібування

потенціалзалежнкх Caz* каналів в нервових клітинах Lymnaea stagnalis ( 1, 39). Відсутність значних змін в ГДФ(9Б-залежному зв'язуванні

міченого ДА після обробки мембран антитілами до G(fT+fla) хребетних тварин, недостатньо, щоб говорити про механізм взаємодії ДА

рецепторів молюсків з різники субодиницями ГТФ-зв' язуючих білків.

Вплив гуанінових нуклеотидїв в експериментальних умовах in vitro зводиться частіше за все до значного зменшення споріднанності

рецепторів до агонистів (18). Нам вдалося виявити в літературі лише

одне виключення з такого правила. Рецептори, які зв' язують ПГЕ2 (простагландін Е^), виділені з нюхательних структур нервових тканин собак, збільшували спорідненість до ліганду в 2 - 3 рази в

присутності гуаніновнх нуклеотндів. Вплив нуклеотидів реалізовувався через чутливі до коклюшного токсину G-білки (106).

Виходячи з представлених в цій роботі даних, ножна припустити, що спільний механізм Існує 1 в нервових тканинах полюсиa Lymnaea stagnalis. В наших даних про ГДФ- та ГДФрв-залежну регуляцію зв'язування агонжстів ДА рецепторів можна відзначити декілька принципових моментів. Найбільш наявними з них варто вважати дані про гетерогенність популяції ДА рецепторів, афінність яких змінюється під впливом гуаніновнх нуклеотидів, в той час, як зв'язування [3Н] SKF 39393 в контрольних дослідах носить моновалентний характер. Внесення в інкубаційний розчин ГДФ та Mg2* призводить до появи рецепторів з низько- та Вйсокоафінним типом зв'язування. При цьому високоафінні рецептори складають меншість. ЦІ спостереження можуть свідчити про неоднакову чутливість G-білків до різних концентрацій гуаніновнх нуклеотидів, як це показано у випадку з G^a, спорідненість у якого до ГТФ (ГДФ) набагато вище, ніж у G^a (33). Зменшення' стимулюючого впливу ГДФЭБ на зв' язування міченого ДА вказус на те, що цАМФ-залежне фосфорилювання може змінювати взаємодію ДА рецепторів з G-білками.

Ми показали, що фосфорилювання менбран, одержаних з нервової тканини Lymnaea st., призводить до зменшення ДА-залежного Інгібування активності АЦ, а також в багато разів збільшує A1F4'-стимульовану активність цього ферменту.

Електрофізіологічни досліди також показали, що ДА-Індукований калієвий струм в клітинах, що продукують гормон .росту в ЦНС L. stagnalis, помітно зненшус свою амплітуду в присутності Інгібітору фосфодіестераз. ■

Таким чином, в.нервовій системі п'явушника стимуляція активності

АЦ ДА ножа приводити до розвитку двсенситізаці 1 як Д , так 1 Д2 рецепторів. Так як відомо, що інгібування ЛЦ та збільшення

1С*-пров І дност 1 відбувається за участю G -білків (18, 88), а серед

субстратів для ПКА знайдені G - та G -білки (але не G ( 16, 38, 46,

. І О 8

107)), то найбільш вірогідним слід вважати залучення в^подібних білків до ГДф-залежного збільшення афінності ДА рецепторів до їх агоністів в нервовій тканині п' явушника.

ВИСНОВКИ

1. Показано, що прикладання ДА до мембран ідентифікованих

нейроендокринних клітин Lymnaea stagnalis приводить до появи трансмембранних вхідних та вихідних струмів. Інгібітор

фосфодіестераз викликас зкеншення ДА-залежного вихідного струму. Зменшення ДА-викликаного вхідного струму спостерігається також npií частій аплікації ДА або його агоніста. Припускається, що в ЦНС молюска виникає десенситізація відповідей на ДА, яку частково можна пояснити участю каскада цАМФ.

2. Описано зв' язування ДА в мембранах, яке проходить за участю на

менш як двох типів рецепторів. Активація одного з них - Д(-под1бного

- приводить до збільшення активності мембранної АЦ. Активація

рецепторів n¿ типу Інгібує АЦ. стимуляція або інгібування активності АЦ залежить від концентрації ДА 1 ГТФ: порівняно великі концентрації медіатора 1 ГТФ (100 мкмоль/л) приводять до інгібування АЦ, менші (1-100 мкноль/л) - збільшують II активність.

Продемонстровано, що рецепція да мембранними рецепторами викликає прискорення ГТФ »=> ГДФ обміну 1 підсилює ГТФ-азну активність.

3. Вперше описано, що гуанінові нуклеотиди впливають на афінність ДА рецепторів до їх агоністів по різному. Частина рецепторів збільшує свою афінність до лігандів в присутності ГТФ, ГДФ 1 VM0S. Друга, більш багаточисельна популяція рецепторів, зменшує свою афінність під впливом гуанінових нуклеотидів. Зменшення 1, особливо, збільшення афінності, напевно, залежить від присутності іонів Мд2*.

Зміна ГДФ-залежноІ спорідненості ДА рецепторів до агоністів після обробки мембран антитілами, одержаними до субодиниць G-білків, імунологічно подібних ДО (9 , і G^a субодиниць G-білків хребетних тварин, свідчить про залучення цих білків в регуляцію рецепції ДА.

З'ясовано, що ГДф/33-залежне стимулювання зв'язування агоніста не Інгібується після обробки мембран антитілами до G а. що вказує на «непричетність» ло ГЛФ'викликаного збільшення афінності рецепторів до

ДА цієї форми С-б1лків. ■

4. Фосфорилювання мембран каталітичною субодиницею цАМФ-залежної протвінкінази повністю Інгібує стимулюючий вплив гу&нінових нуклеотидів на зв'язування агоністів з Дд рецепторами та помітно пригнічує ДА-залежну ГТФ-азну активність. Таке інгібування впливає На фосфорилювання 1 на швидкість ДА-викликаного ГТФ «-=» ГДФ обміну.

Вперше показано, що активність АЦ після фосфорилювання мембранних білків помітно змінюється, це видно по зменшенню базальної активності фермента та Інгібуючого впливу ДА на активність АЦ. Гормон-незалежна активація АЦ АЇР4' багаторазово підсилюється при фосфорилюванні мембранних білків, що може свідчити про більшу піцдатність б^подібних білків Інгібуючому впливу фосфорилювання ніж стимулючі Є-білки. .

5. Припускається, до в нервовій тканині п' явушника дофамінова стимуляція активності АЦ може приводити до розвитку десенситизаціІ як' Д^ так 1 Д2 рецепторів. Покільки Інгібування АЦ 1 збільшення калієвої провідності проходить за участю Є -білків, 1 серед субстратів для ПКА є як 6 -, так 1 Є -білки (не С ), . то найбільш

- ' 1 О в

ймовірно припустити включення Є ‘-подібних білків в ГДФ(ГТФ)-залежне збільшення афінності ДА рецепторів до їх агоністів цієї тканини.

ПЕРЕЛІК РОбІТ, ,ОПУБЛІКОВАНИХ ЗЛ ТЕМАТИКОЮ ДИССЕРТАЦІї.

1. Прудніков І. М. , Осіпенко 0. М. , Кастрикіна Т. Ф. , Цивкін В.Р. Вплив дофаміну на іонну провідність та активність аденілатциклази в центральній нервовій системі п' явушника. // Нейрофізіолгія, 1992,

Т. 24, N 4, С. 437-451. . ’

2. Прудніков і.м:, Цивкін В. Р. , Кастрикі на Т. Ф. ГТФ-залежна рецепція

дофаміну в тканинах центральної нервової системи великого п'явушника. // Нейрофізіолгія, 1992, Т, 24, N 4, с. 451-461. .

3. Прудніков І.М. // Зростання спорідненості до агоністів в дофамінових рецепторах нейронів п'явушника під впливом гуанінових нуклеотидів. // Нейрофізіолгія, 1993, Т. 25, N 5, С. -.

22

За каз '¿О.'/ .Тир. э кз. 199^/. г. У крспецмонта ?лэ о а іст