Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Зависимость сопряжения рецепторов дофамина с G- белками от редокс-статуса сульфагидрильных групп мембранных белков в нервоной системе моллюска

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Зависимость сопряжения рецепторов дофамина с G- белками от редокс-статуса сульфагидрильных групп мембранных белков в нервоной системе моллюска"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМШ НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ Ф13ЮЛОГН 1М. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

р Г 6 од

2 О

Цивкш Володимир Мнколайович

УДК 577.3 +576.3

ЗАЛЕЖШСТЬ СПРЯЖЕНИЯ РЕЦЕПТОР1В ДОФАМ1НУ 3 С-Б1ЛКАМИ В1Д РЕДОКС СТАТУСУ СУЛЬФПДРИЛЬНИХ ГРУП МЕМБРАННИХ Б1ЛК1В В НЕРВОВ1Й СИСТЕМ1 МОЛЮСКА

03.00.02 -Бюф1зика

Автореферат дисертацп на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

Кшв-2000

Дисертащею е рукопис.

Роботу виконано у вщдип нейрох1мй 1нституту ф^зюлогн iM. О.О. Богомольця HAH Украши.

Науковий KepißHHK: Доктор бюлопчних наук Малишева Маргарита Костянтишвна, завщувач вщдшу нейрох1ми 1нституту ф1зюлоги im. О.О. Богомольця HAH Украши.

Офщшт опоненти:

Доктор бюлопчних наук, академш HAH Украши Кришталь Олег Олександрович, завщувач вщдшу ф1зико-х1кпчно'1 бюлогй ыптинних мембран 1нституту ф1зюлогп iM. О.О. Богомольця HAH Украши.

Доктор бюлопчних наук Костерш Серий Олексшович, заступник директора з науково! роботе, завщувач вщдшу 6ioxiMi'i м'язгв 1нститугу öioxiMii iM. О.В. Палладша HAH Украши.

Провщна установа:

1нститут молекулярно! бюлогц та генетики HAH Украши, м. Кшв.

Захист вщбудеться "40 " JLit^u /\JL 2001 р. о годиш на засщанш спещал1зовано1 вчено! ради Д 26.198.01 при 1нституп фiзioлoгií iM. О.О. Богомольця HAH Украши за адресою: 01024, м. Кшв, вул. Богомольця 4.

3 дисертащею можна ознайомитись у бiблioтeцi 1нституту фiзioлorií iM. О.О. Богомольця HAH Украши за адресою: 01024, м. Ки1в, вул. Богомольця 4.

Автореферат розклано "/j " грудня 2000 р.

Вчений секретар спещатзовано! вчено! ради доктор бюлопчних наук

Сороюна-Марша З.О.

J

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнкть теми. Сприймання зовншшього середовшца жив им и оргашзмами та обробка шформацп в нервовш систем! вщбуваються за безпосередньо! учасп велико! родини бигав-рецептор1в, що взаемодають з регуляторними бшками, яю зв'язують ryaHÍHOBÍ нуклеотиди (G-бшками). В оргашзмах eyKapioT взаемодая кттин та IX об'еднання у едине цше здшснюеться завдяки багаточисельним нейромедоаторам та гормонам. Зв'язування цих Л1гандов з спещн}цчними до них рецепторами акгивуе певш G-бшки, яю викликають клгганну вцщовда шляхом змши активносп ферментов та юнних канашв (сигнальна трансдукщя) (Gilman, 1987; Bimbaumer et al., 1990).

Незважаючи на значний прогрес у p03yMÍHHÍ функцш peneirropiB та G-бшюв багато аспекта функцюнування niel системи залишаються нез'ясованими. Зокрема, маловивченою е залежшсть процесу сигнально! трансдукцп вщ стану сульфпдрильних груп penenTopiB та G-бшюв. Бтышсть дослщжень у цш raiiy3Í проведено з використанням тюл-вщновлюючих реагента, а вщновлений стан сульфпдрильних груп не завжда вщповщае ix дшсному стану in vivo. Вважаеться, що оксиданти, таю як окис азоту, супероксид, перекис водню i т.д. (акгивш форми кисшо) можуть бути сигнальними молекулами. Активш форми кисню можуть взаемодаяти з тюл/дисульфщними центрами рецептор1В та G-бшав, що призводить до функщональних 3míh у npoueci сигнально! трансдукцп (Van der Vliet and Bast, 1992; Finkel, 1998).

Молюск Lymnaea stagnalis - модельний оргашзм у нейробюлопчних дослщженнях. Bwomí клпинш мехашзми, яга лежать в ochobí центрально! нервово! регуляцй деяких фгзюлопчних процеЫв i поведшкових акта uiei тварини. Деяю з цих MexaHÍ3MÍB поряд з шшими нейромед1аторами регулюються дофамгном та окисом азоту (Moroz and Winlow, 1993; Moghadam et al., 1995; Elphick et al., 1995). У зв'язку з цим становить штерес дослщження залежнош процесу сигнально! трансдукцп через дофамшов1 рецептори нервово! системи молюска В1Д редокс статусу сульфпдрильних груп бшюв, яю приймають участь у трансмембраннш cигнaлiзaцii.

Робота проводилась зпдно з планами науково! робота вщцшу HeñpoxiMÜ у рамках фундаментальних дослщжень 1нституту фiзioлoгií ím. О.О. Богомольця за темою «Молекулярш мехашзми iüiíthhho! сигнагпзацп та шляхи корекцп Н порушень».

Мета та заедания дослгдження. Мета робота полягала у встановленш залежностг функцюнальних властивостей дофамшових peqenropiB та пов'язаних

з ними О-бшгав вщ редокс статусу сульфгщрильних груп бшюв в очшцених

плазматичних мембранах нервово! системы молюска.

Для досягнення вказано! мети буяи сформульоваш наступи! завдання:

1. Розробити метод видшення плазматичних мембран з нервово1 тканини молюска, в яких зберй-аеться спряжения дофамшових рецептор1в з О-бшками.

2. Визначити середнш р1вень концентр ацп ¡ошв магнда в нейронах молюска, як одного з ключових регулятор1в акггивносп О-бшав, з наступним врахуванням одержаного значения у дослщженнях.

3. Дослщита вплив вщновлення сульфгщрильних груп мембранних бшав на рецептори дофамшу за допомогою радюлйандного ана!пзу.

4. Вивчити вплив вщновлення сульфгщрильних груп мембранних бшюв на функцюнальну . актившсть спряжених з рецепторами дофамшу С-бшмв, використовуючи зв'язування гуаншових нуклеотщцв та пдрол!з ГТФ як показ ник активное™ О-бшюв.

5. Дослщити вшшв донору нйрозо-груп (штрозильований aльбyмiн) на особливосп спряжения дофамшових peцeптopiв та О-бшгав за реципрокним впливом дофамшу та ГДФ на зв'язування один одного.

Наукова новизна одержаних результатов. Встановлено, що у плазматичних мембранах нервово! сисгеми молюска шпбування С-бшав, що спряжет з дофамшовими рецепторами, вщбуваеться завдяки збшыпенню спорщненосп О-бшюв до ГДФ. Вперше було продемонстровано, що характер спряжения рецепторов з С-бшками, в результат! якого вщбуваеться шпбування або активаци осташпх, залежить вщ стану сульфгщрильних груп мембранних бшав. Вщновлення цих груп пщешпое шпбуючу дно дофамшових рецептор1в на спряжеш з ними в-биши, а штрозилювання призводить до блокування 1х функцюнально! взаемоди.

Практичне значения одержаних результате. Одержат дат вказують на можливий мехашзм маловивченого феномену регуляци активности О-бшав, пов'язаний з IX шпбуванням, який був виявлений ранше у дослщженнях хребетних тварин. Кр1м того стають зрозумшими шляхи впливу активних форм кисню на сигнальш процеси. Гкдабш эволюцшно-пор^вняльт досл1дження дозволять наблизитись до poзyмiння фундаментальних принцип 1в оргашзацй мехашзму сигнально! транедукцн в кланах тварин.

Особистий внесок здобувача. Дослщження проводились епшьно з науковим сшвроб^тником вщдту нейрох1мц 1нстшугу фшологн ¿м. О.О. Богомольця к.б.н. Прудшковим 1.М., з яким автор мае сшльш публнеацн. Наведет в рукопиа результата були отримаш здобувачем особисто або за безпосередньо! учасп при

виконанш експеримента. Здобувач приймав активну участь у плануванш експеримента, обговоренш отриманих результата [ формулювант висновюв. Апробацш роботы. Основш положения робота дошшдались та обговорювались на мшгалузевш конференцй' молодих вчених «Актуальш проблеми фундаментально! та прикладно! бioxiмií-2000» (Кшв, травень 2000 р.) I на семшарах 1нституту ф1зюлогп ¡м. О.О. Богомольця. ПублтацИ За матер1'алами дисертацн опублшовано 3 наукових статп. Об'ем та структура дисертацИ Дисертащя складаеться з вступу, огляду лператури, матер1ал!в та методав доатдження, результата досл!дження, обговорення результата, висновив та списку використаних джерел з 165 найменувань. Робота викладена на 125 сторшках, шострована 26 рисунками та мютить 4 таблищ.

МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛВДЖЕНЬ

Об'ект дослгджень. Досладження проводили на дорослих особинах Ьутпаеа Ма^аШ, Навкологлотков1 нервов! кшьця молюсюв вир1зали шсля охолодження тварин на льоду та помещали перед гомогешзащею у розчин слщуючого складу (у ммоль/л): НЕРЕБ - 10 (рН 7,2), Са2+ -4, 2, 55, К+- 2, СГ- 72. Фращюнування гомогенату нервовоI системы молюска. Плазматичш мембрани з нервовоГ системи Ьутпаеа хш^аШ видшяли за допомогою центрифугування у градоенп щшъносп Перколу. Haвкoлoглoткoвi кшьця молюсгав (30-60 на експеримент) гомогешзували в тефлон-скляному гомогетзатор! Даунса у 2 мл охолодженого на льоду буферного розчину, який м1стив 20 ммоль/л трис-НС1 (рН 7,3), 0,25 моль/л сахарози, 1 ммоль/л ЕДТА, сумш шпбп"ор1в протеаз, 1 ммоль/л дтотрешту (ДТТ) або без нього. Гомогенат фшьтрували через нейлоновий фшьтр (дааметр пор 40 мкм), центрифухували 10 хв. при ЮООхд. Супернатант наносили на сумнп 30% (у/у) розчину Перколу з 0,25 моль/л сахарози та центрифугували 30 хв. при 84.000xg у ротор! з фксованим кутом 6ОТ1 (Весктпап, США). Положения плазматичних мембран у товтщ градаенту Перколу було встановлено у попередшх дослщах по зв'язуванню м1чених лн-андав рецептор1в у р{зних мембранних фракциях, як описано нижче. Фракццо плазматичних мембран, вщбрану з грашенту Перколу, використовували в експерименгах теля попередньог шкубацп на льоду на протяз1 1 години з сапоншом у концентраци 10 мкг/мл (для пермеабшзацп мембранних везикул) та ДТТ у концентраци 2 ммоль/л (або без нього - у контрол!) з наступним

переосадженням у 20 ммоль/л трис-HCl буфер! (рН 7,3) з 100 ммоль/л КС1 центрифугуванням (при 105.000xg 30 хв. при 4 °С).

Кшыасть бшка визначали за мoдифiкoвaним методом Бредфорда, використовуючи у якосп стандарту БСА (Splittgerber and Sold, 1989). Визначення активности аденглатциклази. Адешлатциклазну актившсть визначали по накопиченню в реакщйнш сумшп [а32Р]-цАМФ з використанням у якосп субстрату [а32Р]-АТФ («1зотоп», Роая) за методом (Salomon, et al., 1974). Визначення концентрацй втьних ionie магнт в нейронах молюска. Концентращю Mg2* визначали у св1жевидшених нейронах (Prudnikov and Tsyvkin, 1998) з використанням двох флуоресдентних 1ндикатор1в - Mag-fura-2 та Mag-fura-red («Molecular Probes», CILLA), втпрюючи штенсившсть флуоресценци KOMroieKcÍB цих барвниюв з Mg2* за допомогою флуоресцентного спектрофотометра Hitachi-4000 («Hitachi», Япон1я) за методами (Raju, et al., 1989; Garcia-Martin, et al., 1995). Нейрони шкубували 45 хв. при 20 °С у ф1зюлопчному p034hhí, який mícthb 10 мкмоль/л Mag-fura-2AM або 20 мкмоль/л Mag-fura-rcdAM. Псшм клтши abÍ4Í вццмивали центрифугуванням протягом 4 хв. при 500xg у фiзioлoгiчнoмy розчиш без Са2+ i вщразу використовували для визначення [Mg2*]. Внутршптинну концентращю Mg2* визначали з кал!брувальних графшв, одержаних у незалежних експериментах. Для цього при BHKopHCTaHHi Mag-fura-2 будували залежшсть Q*(R-Rmin)/(R-Rmax) вад [Mg2'1'], де R - вадношення штенсивностей флуоресценци при довжшп хвшп емки 510 нм з довжинами хвиль екстинцп 340 нм та 370 нм (F340/F370); Rmín та Rmax - вщношення штенсивностей флуоресценци (F340/F370) у вадсутносп Mg2* та у присутносп насичуючо1 концентр аци Mg2* (50 ммоль/л), вщповадно; Q - вадношення мiж piвнями флуоресценци при довжиш хвшп eMiciï 510 нм з довжиною хвшп екстинцц 370 нм у присутносп та у вадсутносп насичуючо! концентрацш Mg2*. При використанш Mag-íura-red будували залежшсть (Fmin-F)/(F-Fmax) вщ [Mg2*], де F - iHTeHCHBHÍCTb флуоресценци при довжиш хвил1 eMiciï 630 нм з довжиною хвши екстинцп 470 нм; Fmin та Fmax - штенсившсть флуоресценци у вадсутносп Mg2* та у присутносп насичуючо1' концентрацш Mg2* (50 ммоль/л), вщповадно. ДоЫдження зв'язування личених лиандк з мембранами. При вивченш зв'язування [3Н]-дофамшу («Amersham», Великобриташя) мембрани шкубували в темнотт на протяз1 40 хв. при 22 °С у 50 мкл шкубацшного розчину з р1зними концентр ащями mí4ehoro ли-анду. 1нкубацшний розчин mícthb 20 ммоль/л трис-HCl (рН 7,3), 1 ммоль/л ЕДТА, 100 ммоль/л КС1 (KpiM експерименпв по вивченню ioHHOï залежносп), 0,1 мг/мл БСА, сапонш 10 мкг/мл, по 50 мкмоль/л AppNHp и АррСНр, 10-15 мкг мембранного бшка на пробу. В окремих

• .

експериментах додавали 0,25 мг/мл штрозильованого БСА, а також ryaHiHOBi нуклеотиди й ацетат малою, як вказано у "Результатах та i'x 06r0B0peHHi". Час встановлення р!вноваги при зв'язувашп [3Н]-дофамшу з мембранами становить 20 ± 3 хв., як було визначено у попередшх дослщах. Експеримент по зв'язуванню [3Н]-дофамшу зупиняли додаванням в шкубацшний розчин 2 мл охолодженого на льоду буферного розчину (20 ммоль/л трис-HCl (pH 7,3) з 100 ммоль/л KCl), який MicniB 1% шшетиленглколя (Мг= 6000 Да) та фшьтращею зразюв через скляно-волоконш фшьтри GF/C за допомогою вакуумного насосу. Фшьтри промивали 2 мл того ж розчину, висушували при 60 °С, помпцали у флакони з 5 мл сцинтиляцшно! рщини ЖС-8 та втпрювали радюактившсть у сцинтиляцшному л1чилышку Rackbetta LKB-4000 («LKB», Швещя).

За величину специф1чного зв'язування приймали р1зницю М1Ж величинами загального та неспециф1чного зв'язування. Неспецифтоте зв'язування [3Н]-дофамшу визначали у присутносп 10 мкмоль/л холодного дофамшу.

Вивчення зв'язування [3Н]-ГДФ («Amersham», Великобританш) з мембранами проводили у 50 мкл ¡нкубащйного розчину того ж складу та при тих температурних та часових параметрах, що i при дослщженш зв'язування [3Н]-дофамшу. Як показали попередн1 експерименти, час встановлення р1вноваги при зв'язуванш [3Н]-ГДФ з мембранами становить 15 ± 3 хв. Зупинка peaiaui, а також умови фшьтрацй" та промивки не вшр1знялись вщ тих, що наведеш витдс для експерименпв по зв'язуванню [3Н]-дофам1ну.

Визначення мембранноТ ГТФазноТ активности ГТФазну актившсть в мембранах вивчали по накопиченню в реакцшнш сумшн радаоактивного неоргашчного фосфату (3JPj) при використашп у якосп субстрату [у32Р]-ГТФ («Amersham», Великобритагпя). Кшыасть 32Р; визначали за методом (Cassel and Seiinger, 1976) з деякими модифжащями. Реаквдйна сумйп об'емом 50 мкл MicT&na 20 ммоль/л трис-HCl (pH 7,3), 1 ммоль/л ЕДТА, 100 ммоль/л KCl (кр1М експерименпв по вивченню ioHHoi залежносп), 2,4 ммоль/л ацетату магнш (кр1м експерименпв по вивченню залежносп), 0,1 мг/мл БСА, 10 мкг/мл

сапошна, по 50 мкмоль/л AppNHp та АррСНр (окрim експеримишв по вивченню субстратноГ специф1чносгп ГТФази), 200.000-300.000 ¡мп/хв [у32Р]-ГТФ та 0,1-50 мкмоль/л нем1ченого ГТФ, 7-10 мкг мембранного бшка на пробу. В окремих експериментах попередньо проводили АДФ-рибозилювання мембранних бшгав коклюшним токсином («Sigma», США), як описано ранше (Codina, et al., 1991). Реакцю починали додаванням мембран до реакщйно! cyMimi, ¡нкубували 15 хв. при 20 °С, зупиняли додаванням 0,95 мл 8% охолоджено! на льоду суспензн

активованого деревного вугшля у 40 ммоль/л фосфатному буфер1 (рН 7,3) та помнцали на л!д на 1 годину. Вугшьну суспензио осаджували центрифугуванням (10 хв., 12.000xg при 4 °С), вщбирали 400 мкл супернатанту, змшували з 5 мл сцшпиляцшно! рщини ЫАС8104 («АшегзЬат», Великобриташя) та вюмирювали радюактившсть у сцинтиляцшному л1чильнику.

Одержання нтрозильованого бичачого сироваткового альбумта (БСА). Нирозильований БСА одержували в результат! реакцп цього бшка з ипритом натрно у присутносп НС1 за методом (81аш1ег, е1 а1, 1992). Одержаний препарат штрозильованого БСА м1стив 3,8 моль Б-штрозотшлових груп на 1 моль бшка.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

Видшення плазматичних мембран, ят мктять дофамтовг рецептора, що спряжет з О-бтками, з гомогенату нереово? системы молюска. Тестування мембранних фракцш, що роздшилися у градаенп щшьносп Перколу, по зв'язуванню м!чених л1гандав рецеггщпв показало 12-кратну стушнь очищения плазматичних мембран в одшй ¡з фракцш (фракщя I). Щшьшсть мембран ще! фракци (1,038-1,042 г/см3) близька до щшьносп плазматичних мембран хребетних тварин. Пор1вняльне вивчення зв'язування [3Н]-дофамшу у мембранних фракщях продемонструвало наявшсть высокоафшних рецептор1в тшьки у фракци I, з використанням яко! були проведет подалыш експерименти.

Характер випснення [3Н]-дофамшу нем1ченим дофамшом у р1вноважних умовах передбачае юнування у мембранах, по менппй М1'р1, двох титв мкць зв'язування: з високою та низькою спорщнешстю (Рис. 1). [3Н]-дофамш дозо-залежним чином витюняеться антагошстами Д( и Дг рецептора дофамшу ссавщв (Рис. 1). Це узгоджусться з даними елекгрофшолопчних дослцркень нейрошв молюска (ёе У^ег, е1 а1., 1986).

Досладжували актившсть мембранно! аденшатциклази, яка е одним з ефектор1в С-бшав. Вплив дофамшу залежить вщ концентрацй ГТФ: при концентраци 10 мкмоль/л спостертаеться стимулюючий ефекг, при 25 мкмоль/л - б1фазний (стимулящя при низьких та шпбування при бшьш високих концентрациях дофамшу), а при 100 мкмоль/л - тшьки инпбування (Рис. 2). Така залежшсть вад ГТФ свщчить про протилежно направлену регуляцпо активности аденшатциклази р1зними в-бшсами, що зв'язаш з р1зними тдтипами рецептор1в дофамшу. результата також демонструють, що в очищених плазматичних мембранах зберц-аеться функцюнальне спряжения рецептор1в дофамшу з О-бшками.

Illlllll| I I III1IIJ-1 .......

10-' 10-« 10-5 10-< 10-3 Нешчений лшшд, моль/л

Рис. 1 1нпбування зв'язування [3Н]-дофамту з мембранами разними нешченими шгандами: дофамшом -(И), 5(-)сультридом - (О),

(±)SKF83566 - ( А ) та флуфеназином -

Зв'язування [3Н]-дофам1ну (10 нмоль/л) представлено у процентах вщносно зв'язування у вщсутносп нем1ченого Л1ганду (100%).

10-5

[Дофамш], моль/л

Рис. 2 Залежюсть активносп адешлатциклази у мембранах вщ концентрацп дофамшу при рвних концентрации ГТФ: 10 мкмоль/л - ( О), 25 мкмоль/л - (®), 100 мкмоль/л - (П).

Buympimiimumia концентрацЫ вшьних ionie магшю в нейронах молюска. Осюльки ¡они магшю с регуляторами активносп G-бшав (Gilman, 1987; Casey, et al., 1990), значения ix внутр1клттно! концентрацн - сутгевий фактор, який необхщно враховувати у дослщженнях мехагазму сигнально! трансдукцп за участю цих бшав. В зв'язку з цим був визначений середшй piBCHb концентрацн в нейронах молюска. Для бшыпо! досжшрносгп значень використовували два шдикатора концентрauii вшьних юшв магшю (Mag-fura-2 и Mag-fura-red) у незалежних визначеннях. Були одержан! слщуюч1 значения [Mg2^]: 1,16 ± 0,19 та

1,49 ± 0,08 ммоль/л з використанням Mag-fura-2 та Mag-fura-red, вщповщно. Значения [Mg2+] в нейронах молюска знаходягься у д1алазош стал их значень Kj комплекав ¡ндикатор1В з Mg2+, про що свщчить лнййшсть кагпбрувальних графшв (Рис. 3). Таким чином, визначення внутршнтинно! концентраци Mg2+ було проведено в оптимальных умовах. Ц1 величини знаходяться у межах значень концентрадШ Mg2"1" в нейронах р1зних тварин (Romani and Scarpa, 1992).

ммоль/л [М82+], ммоль/л

Рис. 3 Визначення внутр1клгтинно1 концентраци у нейронах молюска. А - калбрувальний граф1к для Ма§-&га-2. Б - кал1брувальний графш для Маз-йдга-геё. Обидва граф1ка побудоваш по результатах шести незалежних вишрювань. Нормальна стандартна похибка при уах концентр ащях не перевищувала 5%.

ГТФазна активнкть в нейрональних плазматичних мембранах молюска. ГТФазна актившсть G-6miciB, яка стимулюеться агон^ами рецепторов, е штегральним показником функцюнального стану G-6imcib. PieeHb ix ГТФазно! активности характеризуе швидасть циклу G-6LmciB та вщображае стушнь i'x актив адй (Gilman, 1987). 1они магнпо стимулюють високоафшну ГТФазну актившсть в мембранах. Однак з'ясувалось, що дофамш, у залежносп вщ концентраци, чинить протилежш ефекти на ГТФазну актившсть, стимульовану Mg24 . В концентраци 10 мкмоль/л дофамш активуе ГТФазну актившсть, а в концентраци 1 ммоль/л инпбуе П. Вказаш ефекти проявляються при концентрациях Mg2+ вшце 3 мкмоль/л, що близько до вщомо! мннмально! концентраци цнх ioHiB, необхщно! для проявления агошст-залежно! активносп G-бшав (Gilman, 1987).

120

■ib

Рис. 4 Дозо-залежний вплив дофамшу на мембранну ГТФазну актившсть: у контрош - (О) та гасля обробки ДГТ -(•). Значения активносп представлен! у процентах по вщношенню до активносп у вщсутносп дофамшу, яка прийнята за 100% у контрол1 та теля обробки ДТТ i становила 6,29 ± 0,05 та 1,98 ± 0,06 нмоль/ хв/ мг мембранного бшка, вщповщно.

у/ п1п1ц ппиц iiiin^ 111п1ц пицц 11и1щ

10-» 10-! 10-7 ю-6 10-5 10-* 10-3 [Дофамгн], моль/л

Обробка мембран коклюшним токсином призводить до пщсилення инпбуючого эфекту дофамшу на мембранну ГТФазну актившсть. Дофамш у нрисутносп антагошста рецепторов дофамшу ссавщв JJ¿ гадтипу дозо-залежним чином стимулюе мембранну ГТФазну актившсть. Можна припустити, що активацш рецептор1в дофамшу призводить до зменшення ГТФазно1 активносп внаслвдок инпбування частини пулу G-бшав, нечутливих до коклюшного токсину, яю спряжет з одним Í3 пдаитв цих рецептор1в.

Феномен шпбування G-6okíb р1зними рецепторами вщомий шд назвою «шверсний aroH¡3M». У цьому випадку ряд синтетичних лц-андав peneirropiB, так званих шверсних aroHicrie, призводять до шпбування G-6úikíb за рахунок стабиизацп спонтанно активних рецеш-opÍB у неактивному сташ (Leurus, et. al., 1999). Спонтанна активащя peneirropia у значшй Mipi визначаеться р1внем íx конформацшно! лабшьносп. Одним ¡з суттевих фактор1в, яга впливають на третанну й четвертинну структуру peqenropiB, е стан сульфпдрильних груп цих бшюв (дисульфщш звязки, пальмпилювання) (Gether and Kobilka, 1998). У G-бшюв також e декшька критичних сульфпдрилышх груп, вщ стану яких може залежати актившсть цих бшюв (Giman, 1987), але як саме це вщбуваеться, точно невщомо. Для того, щоб з'ясувати значения редокс статусу тюлових груп бшюв у явили инпбування G-бшюв, яке було нами виявлено, вивчали вплив вщновника сульфпдрилышх груп (ДТТ) на цей процес.

Дофамш у контрол1 дозо-залежним чином стимулюе, а шсля обробки мембран ДТТ инпбуе мембранну ГТФазну актившсть (Рис. 4). Вплив дофамшу виявляеться тшьки при мнсромолярних - субмжромолярних концентрашях

медаатора. Така залежшсть може свщчити про протилежно направлений вплив рецептора дофамшу на р1зш О-бшки. Отже результат експерименту, що спостерцаеться, е сумащею стимулюючого та шпбуючого эфекпв з р1зною чутливетю до дофамшу. Протилежно направлена регулящя активносп С-бишв була виявлена рашше у дослщженнях рецептор1в простагландину Е бика (Ие^эЫ, й а!., 1993) та ошатних рецептор1в з мозку морськоГ свинки (иеёа, е1 а!., 1996).

Зв'язування (Щ-дофалину з нейрональними плазматичнгши мембранами молюска. Змша спорщненосп рецептор]ш до агошспв шд впливом гуашнових нуклеотидов е критер1ем IX спряжения з С-бшками. Ми дослщжували вплив ГДФ на зв'язування [3Н]-дофамшу у залежносп вщ ступеню вщновлення сульфгщрильних грун мембранних бшав для того, щоб виявити змши у спряженш О-бшав з рецепторами дофамшу (Табл. 1). ГДФ у присутносп ¿ошв магнш призводить до зникнення специф1чного високоафшного зв'язування [3Н]-дофамшу. Як вщомо, у бтыиосп рецептор1в в присутносп ГТФ або ГДФ

Таблиця 1 Параметри високоафшного зв'язування [3Н]-дофам1ну у присутносп та вщсутносл Мд2ЧаГДФ.

Оброблеш та необроблеш ДТТ мембрани шкубували з [3Н]-дофамшом (3-32 нммоль/л), з або без (1,4 ммоль/л) та ГДФ (10 мкмоль/л). Параметри зв'язування (В [пах — К1ЛЬК1СТЬ М1СДЬ зв'язування, К<| - константа дисощацн) визначали за допомогою радкшгавдного аналиу зв'язування, з графшв Скетчарда (М ± т, п = 4).

Параметри зв'язування -дат + ДТТ

Мй3++ГДФ МЙ2++ГДФ

Вшах, пмоль/мг бшка 3,36 ± 1,10 не визначаеться 1,13 ±0,22 0,15 + 0,03

К& нмоль/л 16,6 ± 4,3 не визначаеться 27,8 ± 4,7 3,7 ± 1,3

вщбуваеться зменшення афшносп до агошспв (СШпап, 1987). Шсля обробки мембран ДТТ кшыасть мкць зв'язування та афшшсть рецепторов дофамшу помггао зменшуетъся. Це також узгоджуегься з багаточисельними даними про значения дисульфщних зв'язюв у молекулах рецептор1в для зв'язування л1гандав (РегЬпап, е1 а1., 1995). Однак, шсля ди ДТТ модулюючий ефект ГДФ та юшв магшю на зв'язування [3Н]-дофамшу змшюсться на протилежний. На фош зменшення кшькосп м1сць зв'язування виявляеться популящя рецептор1в з! значно бшьшою афшшстью до [3Н]-дофамшу, шж у контрол1 (Табл. 1). Тобто, вщновлення тюлових груп призводить до змши характеру спряжения С-бшав з

не бшып шж 5% рецепторЛв дофам1ну незвичайним для бшыпосп рецептор1в чином. Ця змша напевно не пов'язана з олагомеризащею або мономеризагцею peцeптopiв, осюльки вщсутшсть кооператившсп у зв'язуванш [3Н]-дофамшу (кoeфiцieнт Хшла близько 1) як у контроле так 1 шсля обробки мембран ДТТ, вказуе на шнування тшьки мономерно! форми у всш популяди дофамшових peцeптopiв.

У присутноеп донора штрозо труп - штрозильованого БСА ГДФ не впливае на зв'язування [3Н]-дофам1ну, що може свщчити про порушення взa€мoдiií м1ж рецепторами й О-бмками (Рис. 5).

Рис. 5 Вплив ГДФ на зв'язування [3Н]-дофамшу з мембранами: у контрош -(О) та шсля обробки штрозильованим БСА - (•).

—ц 1и1иц 1111111^ м||ш{ i 111111^ пп11ц 111111^' 10' 10-8 10-7 10-6 10-5 10-» 10-'

[ГДФ], моль/л

Зв'язування /3Н/-ГДФ с нейрональними плазматичтши мембранами. Для

з'ясування причини шпбування О-бипав дocлiджyвaли зв'язування [3Н]-ГДФ як функцюнальний показник !х активность Неактивш С-бшки при активацп звшьнюють ГДФ 1 зв'язують ГТФ. Тому по змнп зв'язування ГДФ пщ впливом аготстчв рецептор1в можна судити про функцюнальний стан О-бшав. Обробка мембран ДТТ призводить до збшьшення стимулюючого впливу дофамшу на зв'язування [3Н]-ГДФ (Рис. 6). Це вказуе на залежну в1д рецепторш стабшзацга С-битв в неактившй формь Пoдiбний мехашзм птбувания О-бшав був запропонований ранте при дослщжешп рецептор1в простагландина Е (Ке^Ы, е1 а!., 1993), однак його залежшсть вщ редокс статусу тюлових груп бшав не вивчалася. Д1Я штрозильованого БСА полягае у блокуванш ефекту дофамшу незалежно вщ попередньо! обробки мембран ДТТ (Рис. 6).

10« 10-» 10-' 10' 10-5 10-4 10-3 [Дофамш], моль/л

Рис. 6 Вплив дофамну на зв'язування [3Н]-ГДФ з мембранами при концентраци ', р1вно"11,4 ммоль/л: у контрол1 - (О), теля обробки ДГТ -(•), у контрол! ШСЛЯ обробки нпрозильованим БСА — (□), теля обробки ДГТ та нпрозильованим БСА -(М). Зв'язування у вщсутноеп дофамшу становило 50,0 ± 3,2; 80,0 ± 5,5; 56,2 ± 7,2 та 84,4 ± 5,9 пмоль/мг мембранного бшка, в1дповщно. Значения зв'язування представлен! в процентах по вщношенню до зв'язування без дофамшу, прийнятого за 100% в кожному випадку.

Вщомо, що ¡они магшю при концентрациях вище декшькох десяткш мкромолей шлбують деяи G-бшки хребетних тварин за рахунок пригшчення обмшу ГДФ на ГГФ (Casey, et al., 1990). Тому, у цш робот! дослщжували вплив дофамшу на зв'язування ГДФ при меншш концентрauii Mg2+, шж визначена нами ранше ж внутршптинна (Рис. 7). Залежне вщ дофамшу зменшення зв'язування ГДФ у контрол! свщчить про активацио G-6imciB. Це вказуе на присутшсть у молюска G-бшав, яга под1бш до G-бшав хребетних тварин, що шпбуються при мшмолярних концентращях Mg2*. Шсля обробки мембран ДТТ зам1сть активаци G-бшав вщбувалось ix ¡нпбування пщ впливом дофамшу. Можна припустити, що шпбування G-бипав в результат! вщновлення сульфгщрилышх груп не залежить ввд концентрат! Mg24 Дш нпрозо-альбумша призводшъ до зникнення ефектш дофамшу, як i при бмып високш концентрат! Mg2+ (Рис. 7). Разом с даними про вплив штрозильованого БСА на залежшсть зв'язування [3Н]-дофамшу вщ ГДФ (Рис. 5) щ результата свщчать про функцюнальне роз'еднання peuenropiB дофамшу з G-бшками внаслщок нпрозилювання мембранних бшюв. Рашше було показано, що подабним чином штрозилиювання впливае на адренерпчш рецептори людини (Adam et al., 1999).

Можна припустита, що шпбування G-6iniciB рецепторами, як i ix стимуляцм е еволющйно-консервативним процесом трансмембранно! сигнаш'зацп в клтшах тварин. KpiM того, одержан! результата дають пщстави вважати, що змша редокс статусу тюлових груп може буш одним з ключових механтпв регуляци процесу сигнально! трансдукцн.

[Дофамш], моль/л

Рис. 7 Вплив дофамину на зв'язування [ЭН]-ГДФ з мембранами при концентрацн М^, р1вно! 80 мкмоль/л: у контрол1 - (О), шсля обробки. ДТТ -(•), в контрол1 теля обробки штрозильованим БСА - (О), - шсля обробки ДТТ та штрозильованим БСА -(И). Зв'язування у вщсутносп дофам1ну становило 40,1 ± 2,8; 41,4 ±3,3; 43,0 ± 2,7 та 36,7 + 2,5 пмоль/мг мембранного бшка, в1дпов1Дно. Значения зв'язування представлен! у процентах по вщношенню до зв'язування без дофамшу, прийнятого за 100% у кожному випадку.

На основ1 в ¡дом их даних про участь дофашну в центральнш нервовш регуляцп дихання Ьутпаеа ¿¡а^аШ можна запропонувати ¡мов1рну функщональну роль виявлено! у цьому дocлiджeннi редокс залежносп дофамшово! сигнатзацн. Змша концентр ацп активних форм кисню напевно е ушверсальним мехашзмом детектування р!вню кисню кланами р1зних оргатзм1в (Бешепга, 1999). Через зворотне окисления сульфпдрильних груп дофамшових рецептор1в/С-бш1ав активними формами кисню може вщбуватися переключения сигнально! трансдукцн в нейронах молюска. Iмoвipнo, що редокс регулящя дофамшово! сигнал!зацп лежить в основ1 киснево! чутливосп генератора дихального ритму 1 таким чином мае вщношепня до контролю ресшраторно! поведшки Ьутпаеа я/а^аНя.

висновки

1. Визначено середне значения внутршитинно! концентрацй вшьних юшв магнио у нейронах молюска Ьутпаеа хЮ^паНу. 1,16 ± 0,19 та 1,49 ± 0,08 ммоль/л з використанням двох флуоресцентних зощцв - та Мая-&га-гес1, вщповщно.

2. 3 нервово! системи молюска видшена фракщя плазматичних мембран, яка м1стила, по-меншш М1р1, два гадтипи дофамшових рецептор1в, що спряжет з в-биками.

3. Функцюнальна взаемодш peneirropiB дофамшу з G-бшками пов'язана як ¡з стимулюванням, так i з пригшченням ïx активности

4. Гнпбування G-бшгав вщбуваеться за рахунок CTa6ini3auiï ïx у неактивнш форм!, завдяки збшыненню спорщненосп до ГДФ.

5. Вщновлення сульфпдрильних груп мембранних бшгав призводить до зменшення здатносгп рецепторЬ зв'язувати дофамш, а також змшюе характер алостеричного впливу в-бшав на частину популяцп рецептор1в дофамшу.

6. Вщновлення сульфпдрильних груп мембранних бшгав шдсилюе шг1буючу дао дофамшових рецептор1в на спряжеш з ними G-бшси.

7. Нирозилювання мембранних бшгав призводить до блокування функц10нальн01 взаемодп дофамшових рецеп-ropiB з G-бшками.

СПИСОК ОПУБЛ1КОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦП

1. Прудников И.М., Осипенко О.Н., Кастрикина Т.Ф., Цывкин В.Н. Влияние дофамина на ионную проводимость и активность аденилатциклазы в центральной нервной системе прудовика // Нейрофизиология. - 1992. - Т. 24, №4.-С. 437-450.

2. Prudnikov I.M., Tswlcin V.N. Membranes with dopamine receptors coupled to G proteins: purification from the Lymnaea central nervous system // Neurophysiology/Neirofiziologiya. - 1998. - T. 30, № 1. - C. 4148.

3. Prudnikov I.M., Tswkin V.N. Agonist dependent attenuation of GTPase activity of G proteins coupled to dopamine receptors in the molluscan nervous system // Neurophysiology/Neirofiziologiya. - 1998. - T. 30, № 2. - C.104-112.

4. Цивкш B.M. Залежшсть процесу сигнально! трансдукцц вад стану сульфпдрильних груп мембранних бшгав // Тези доповадей м1жгалузево1 конференцп молодих вчених "Актуальш проблема фундаментально! та прикладно! 6ioxiMiï-2000" (м. Ки'ш), Укр. 6ioxiM. журнал. - 2000. - Т. 72, № 6. (у ДРУКУ).

• •

АНОТАЦН

Цившн В.М. Залежшсть спряжения рецептор1в дофамшу з G-бшками вщ редокс статусу сульфгщрилышх труп мембранних б1пк1в в нервовШ систем! молюска. - Рукопис.

Дисертащя на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук за спещальшспо 03.00.02 - бюф1зика. 1нститут ф1зюлоги ш. О.О. Богомольця HAH Украши, Кшв, 2000.

Дослщження проводили на очищених плазматичних мембранах нервовоТ системи молюска Lymnaea stagnalis. Радюл1гандний анал1з зв'язування [3Н]-ГДФ та [3Н]-дофамшу з мембранами, а також дослщження мембранно! ГТФазно! акгивносп показали, що функцюнальна взаемод1я рецептор1в дофамшу з G-бшками пов'язана як з стимулящею, так i з пригшченням ix активносп. 1нпбування G-бшюв вщбуваеться за рахунок стабшзацп ix у неактивнш фор-vn внаслщок збшыпення спорщненосп до ГДФ. Вперше продемонстровано, що напрямок дн peuenTopiB на G-бшки залежить вщ стану тюлових груп мембранних бшив. Ix вщновлення пщсилюе шпбуючу даю рецепторЬ дофамшу на спряжеш з ними G-бшси, а штрозилювання призводаггь до блокування ix функцюнально1 взаемоди. Отримаш результата дають пщстави вважати, що змша редокс статусу сульфгщрилышх груп мембранних бшюв може бути одним з ключових мехашзм1в регуляци процесу сигнально! трансдукци.

Клн>чов1 слова: Молюски, нервова система, рецептори, G-бшки, сульфгщрильш групи, штрозшповання.

Цывкин В.Н. Зависимость сопряжения рецепторов дофамина с G-белкамн от редокс статуса су ль ф ги д р иль н ы х групп мембранных белков в нервной системе моллюска. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. Институт физиологии им. A.A. Богомольца HAH Украины, Киев, 2000.

Исследования проводили на плазматических мембранах нервной системы моллюска Lymnaea stagnalis, очищенных в градиенте плотности Перколла. Характер вытеснения [3Н]-дофамина немеченым дофамином в равновесных условиях предполагает существование в мембранах, по крайней мере, двух типов мест связывания: с высоким и низким сродством. [3Н]-дофамин дозо-зависимым образом вытесняется антагонистами Д1 и Дг рецепторов дофамина млекопитающих. В очищенных плазматических мембранах сохраняется

сопряжение дофаминовых рецепторов с в-белками, которые оказывают как ингибирующие, так и стимулирующее влияние на активность аденилатциклазы.

Поскольку концентрация ионов магния является существенным фактором, влияющим на активность в-белков, был определен средний уровень концентрации в нейронах нервной системы моллюска с последующим учетом установленного значения в исследованиях. Получено среднее значение внутриклеточной концентрации свободных ионов магния в нейронах моллюска Ьутпаеа 1,16 ± ОД 9 и 1,49 ± 0,08 ммоль/л с использованием двух

флуоресцентных зондов - Мад-1ига-2 и Мад-Шга-гес1, соответственно.

Обнаружено, что восстановление сульфгидрильных групп мембранных белков дитиотреитолом приводит к уменьшению количества мест связывания и их сродства к [3Н]-дофамину. Кроме того, у части дофаминовых рецепторов изменяется чувствительность высокоаффинного связывания [3Н]-дофамнна к ГДФ. После действия дитиотреитола ГДФ не уменьшает аффинность, как для большинства рецепторов, а увеличивает ее у не более, чем 5% популяции рецепторов.

Радиолигандный анализ связывания [3Н]-ГДФ с мембранами, а также исследование мембранной ГТФазной активности показали, что функциональное взаимодействие рецепторов дофамина с О-белками связано и со стимуляцией, и с угнетением их активности. Ингибирование в-белков происходит за счет стабилизации их в неактивной форме вследствие увеличения сродства к ГДФ. Восстановление тиоловых групп мембранных белков потенцирует ингибирующее действие дофаминовых рецепторов на в-белки, так как при этом связывание [3Н]-ГДФ стимулируется, а ГТФазная активность угнетается дофамином дозо-зависимым образом. Обнаружено, что независимо от предварительной обработки мембран дитиотреитолом нитрозилирование мембранных белков приводит к исчезновению влияния дофамина на связывание [3Н]-ГДФ.

Таким образом, в настоящей работе впервые было продемонстрировано, что направленность действия рецепторов на О-белки находится в зависимости от состояния сульфгидрильных групп мембранных белков. Их восстановление усиливает ингибирующее действие рецепторов дофамина на сопряженные с ними О-белки, а нитрозилирование приводит к блокированию их функционального взаимодействия. Полученные результаты дают основание предполагать, что изменение редокс статуса сульфгидрильных групп может быть одним из ключевых механизмов регуляции процесса сигнальной трансдукции.

Ключевые слова: Моллюски, нервная система, рецепторы, О-белки, сульфгидрилыше группы, нитрозилирование.

Tsyvkin V.N. Dependence of the coupling of dopamine receptors to G-proteins on the redox state of sulfhydryl groups of the membrane proteins in the molluscan nervous system. - Manuscript.

Thesis for candidate's degree by speciality 03.00.02 - biophysics. Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

Investigations were carried out on the purified plasma membranes from the nervous system of mollusc Lymnaea stagnalis. Radioligand binding analysis of [3H]-GDP and [3H]-dopamine with the membranes and examination of the membrane GTPase activity have shown, that functional interaction of dopamine receptors with G-proteins is coupled both with stimulation, and attenuation of G-proteins' activity. Inhibition of G-proteins occurs as result of their stabilization in an inactive form, due to enhancement of the affinity to GDP. For the first time it was demonstrated, that direction of action of the receptors on G-proteins is in dependence on the state of sulfhydryl groups of membrane proteins. Reduction enhances the inhibitory action of dopamine receptors on coupled to them G-proteins and nitrosylation led to their uncoupling. Results obtained suggest that changing of redox state of thiol groups may be a key mechanism of regulation of the process of the signal transduction.

Key words: Mollusca, nervous system, receptors, G-proteins, sulfhydryl groups, nitrosylation.