Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РЕГУЛЯЦИЯ И СВОЙСТВА ВИТРОГЕНАЗНОЙ СИСТЕМЫ RODOBACTER CAPSULATUS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "РЕГУЛЯЦИЯ И СВОЙСТВА ВИТРОГЕНАЗНОЙ СИСТЕМЫ RODOBACTER CAPSULATUS"

■ АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ШКРШШОГИИ

1 На правах рукопгси

ЯКУНИН Александр Федорович

УДК 576.609,53

БЯтаЯЦИЯ И СЕОЙСТВА ШТРОГШАЗЕОЙ систим ввоповютет слрзталтиз 4 . ■

(03,СВ.(17 — мифобюытогия)

Автореферат

дисоертаад ва соискание ученоа. стетенж кандидата йгологическах каук *

Москва - 1986

Райота выполнена в лаборатории метаболизма фототрофншс микроорганизмов ^Института лочвоведеняя а фотосинтеза АН СССР.

Научный руководитель; доктор биологически* наук .,"

Офйцядлъныв. ошюкекты;':, доктор баааогетемш: наук 'В.М.Горяензс'

'' - кандидат дпсгтесстп яаук .

Ю.В.Родиоков

■ Ведущее учреждение: л Няститут биохшхи Ш.А.Н.Еаха .

АЛ ОХР ; . ( ..

Защита даосертещи* состоится ■' 1986 г.

в " часов на заседании спецкаяиэирсваяного совета -Д.002.64.01 при Институте ышфовиологш АН СССР поадресу: 117Э12, Москва, В-312(111роспект 60-д8ТИя ОктяЗря. д. 7, корп.2, Институт мшфобшлогии АН СССР*

С диссертацией иозаго огнагтитьсяв бЕ&шотеке Института кикробаологЕЯ ЛН СССР.

Автореферат разослан _■ "'■ ■■ 1983 г. ,

Ученый се!фет0рь специализированного совета кандаша» бпшюгвгеески! наук

Л.Н.Йоекаленш

ВВЕДЕНИЕ- -■-'.>

Т^уууаль^ость проблемы .' Многие представители фогосинтези-рушизс црскариот осуществляют два гдобйльтд процесса, обеспе— чивагщкг жззнь ка Земле — фотосинтез ж азотфивсащда. > Проблема дефшхита азота/.существувщая внастоящеевремяв' сельском хо-шйхтав,тор1Юзитувеличеше"пр^ продуркии. Онаиожет

(ж должна)-' решаться, путем расширения вклада , биологической &эот-фнксацнв; томты^цр^ к

яятря^рицру! пуру«яги{йа г.рады1 и требует больших энергетических затрат на га производство, у —

' : К числунаиболее активных азотфшссаторов относятся пурпур-яые бажтерил; которые о высокоИ скоростью образугг таетв ыоле-^аофныйводород¿ рассматриваемые как однвизперспектнвных источниковэнергии. Способность этих '"бактерий использовать для восстановления н2 v я выделения Щ световую энергию.создает воз!Южность:ддя'го»ыш^

ной радиации и создешкя Еа данной основесистец ее биоконверсии с далью получения рядасоеданений: J itH^*» некоторых ферментов и других практически важных' продухтов, >

л Центральным ферментом; биологической фиксации ыолекулярно-го азотаявляется ндтрогеназа, для функциошфоваадш которой не ' обходимо создание анаэробного о!фу11ения/ обеспечение исгочнн-кш 8вергжя (А1Ф) и ннзкопотенциальшш донором электронов* Нит-рогеназдкаталиэирует1ютолъио восстановление до шхгония, boí'ж"рад- других реахций.втшчисдв анергозависимое образование молекулярного водорода. Отличительная особенность этого ■ фермента у пурпурных бактерий заключается 8 величия слозпюй системы регуляции , включагщей образование активной в иеахтив-ной форш нитрогенази ( вз-белха) ( аютткрупцего нятрогеназу фермента. а таше способность быстро я обратиш ингибировагъся асдожкем , ln vito ' (вф!ект вшашчения нзтрогеназы). Однако, до сих пор невыяснено'конкретное -действие;этих регуляторшх иек-ханизмов, а таикв их роль в метабодлзмоклетки. ЫЬдо изучена у пурпурных бактерий взаимосвязь ыевду- нитроганазой п нитрат. радуктазной снстешй» . . ; ' " '•"•*. •

Л Дал» я задачи работц. - Цель» данной работы бнло. гзучеызе свойств в регуляция нитрогецазной сдстены пурпурной еесерной 6ffKTepira Rhodobeot«r : oap«uj.atue i нтаым BIO. В связи о этим

шля поставленыследаюцнеаадачих "

" ......' ..

" *"' ЦЕНТРАЛЬНАЯ

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сальскох* j. академии им. К, А.

Инп ;

1. Проверить влюшив условий роста культур данной фото-трофвой бактерин на синтез, соотношение двухфор* нитрогеиазы ( ?е-белха) я наллчи» эффекта' ее виклгчения шмонаем..

2. Выделит^ и изучить свойства ферредоксинов лак воздавшие доноров электронов дяя штрогепазы. "". '1 ^..;**;

3. Изучить свойства шпратредужтазной системы а ее вз&яш-: связь с нитрогеваэоА. ''■" VY'

Научная новизна. Установдено.что соотнотеяивакгданой и . неактивной форм ннтрогелазы ( ?е-белка) у Е. capsulatxn зависит от .обеспеченности югето* азотои, чей ж объясняется завися- ^ 1ЮСТЬ <л«ояШ1Я этого фермента от1[рирсда источника азота. СЬ-дерханлеагтнвной $optm нитрогеназн увеличивается хфвговдаения азотного дефицита моток. Показано , что неактнвная форыа ге-'белка нитрогеиазы не требует хфедварительной активации особы« (акпширугодем) фердотод до

электронов ферредоксина. Установлено, что переход нитрогеназв ( ре-<5елха) в неактивную íojuy не являетСяпркчиной ее выключения аммонием в клетках R. capaulatue. ^ Обнаружено, что в еавн-слыосткот условий роста R.cnpeulatua сштеэируат даа ферре-.-доксина, различающихся го свош свойствам. Лучшлм донором »дек-тронов дхя нитрогеназн является ферредоксин I,синтеэирушнй азотфзассиругаими клетками только ври росте на свету. В хемо-тро$ных условиях роста 'дешорш электронов для нитрогевазыяв-дяется ферредоксин П. '.-'■..■■>■ ^ ' •• ,■■'/:.;.

Показаяо. что клетки R.capsulfttue, выросшие в присутствии нитрата в качестве источника азота, наряду с нитрогеназой синтезируют нитратредуктазу дисснмиляторного типа. При этом шггро-геказаучаствуетвршдализацин н2» образуемого врезультате : деяитрификапия. Установлено, что значительную роль в внактвва- -ции нитрогеназн н ферредоксина X молекулярным кислородом играют продукты его восстановления <Н202 и 0£). ¡.-.,■ • ■v.;-

практическая ценность работа. Подобраны условия 1^льти-верования R.capeulatus, позволяющие получать биомассу клеток ' z различным соотношением актввяоЗ и неактивной ферм нитрогеназн ( X1 е-белка), а также ферредоксготов. Определена основные ^тори, влиялцие на активность в продолжительность функциони-poiííwk.? иитрогеказа в клетках K.cüpaulatvu, и la vitro, что гложет.быть использовано для увеличения времени жизни этого фер-;.:')кта при разработке' биотехнологических систем получения ¡мол^-

кулярвого водорода s кшзака на основе биоконверсии солнечной энергии С. ПОМОЩЬЮ ^OTOTpCnJßMX МШфООргаЮЗШВ*

Апообадия работы. Материалы диссвртшхии доложены sa У1 и УП Всесоюзных Беосовских коллоквиума! по азотфиксации (Чернигов, 1980; Тбилиси» 1983) .наИСВсесоюзноЙ конферешот по- проблемам микроэлементов в 0ш^1^-(Кшп1нев,1981), на1и П конференциях "моложе тчашаЧШЗ М СХХР ^Пущиао, 1382, 1984), на 17 в 7 Ыедщн^юднт сшшозиумах во фотосднтезирупцлм врокариотш ( БощЪштва, 1982; Grlndelwald, 1Э35),наЫе*ДунарОДВСМ симпозиуме ФМО"Регудяиия микробного метаболизма факторами внешней среда"-(Цущинй, 1983) I на Всесоюзной конференции "Фотокаталити-чесюоепреобразованнесоднечвоа энергшвЧВ01юс1й1фсв, .1983) » на~ юонференщт молода ^

пдно,1983),ва Рабочей совел1анин ',Биокянети£а" (Кйев, 1984), на Всесоюзной конференции молодых ученщ ; "(Ъчршенвыв проблемы бюззшиа и фиэшю-хтшческой биологии"- (Звенигород,"1985) я на Всесоюзной йояферюшго "Ъэавиосвяэ» ветааосвЬм^ ^ а нзо-

та цри фотосЕНтеээМПукияо,, 1985).

• ' Дтблккашои' По'материалам диссертация опубликована Я) ра. бот. ;■;■■ : .' ' ^ ■■'.■-■.■■■

; ÇTPTHrypa и объем работа. Дяссерташя состоит из введения, четырех глав дастереятрыого обзора, экспериментальной части, состоящей из пяти глав, обсуждения результатов » выводов и сшо— яа цитяруийоа литературы, который вюшчает 184 работы. Работа излохена на 157 страницах машинописного текста, включав 23 та^-■ лнцнж 29 рисуемое*-. , >

рбъёктн и методы исследований. Объектом исследований еду жида пурпурная несерная бактерия Hioârtaeter o&pmiwtua (>Rho-dopamOenonaa «apeuiata ) пгтаил BIO, полученная вз коллегащи чистых культур кафедры микробиологии Московского гооуЕнвврси-тета.-Для сравнения некоторые опыты проводила о хеыогрозной бактерией. leotobaotee- Trinelendil шташ ОР, полученной из лаборатории щроф. Г.ИДлхтенштейна (ОШ ЛН ООСР, Черноголовка) .

Непрерывное- культивирование бактерий проводили на установках, собранных в нашей лаборатория, н. ойрfttue ■ выращивали на среде Ормеруда (Ormerod «t ai.,i§61) с лакгатом (20-40 vii) цри интенсивности света 100-200 втДг.рН 7,0 и Источниками азота служили: (nh4>2S(V' (i-ю iii), глутадат (10-50 Ш) нитрат ( 4 й1) ш »2 (IÛ-ICCS; 200ms/mhhÏ. Ера вырвщивакпи

B.««p'suiAtaa * темноте в среду добааяяш 2 Ш (№4)2 SO4, а необходимое значение pOg поддерживала автоматически путем добавлении0% варгон ОДгаююв к-зф./ОД

режиме üiet^o лактата в среду добавляли 30 глюкозы х 60 idl • лшегЕяеульфоксидаи А.т1п»1апа11рырзщивали на среде 1Ьрка ' (Strandburg, wiieqn, 1969) в режиме «урбгдостата (ЗОРс? pH 7,0 : в тфасутствии я2 ; и при-разных значениях рО^ (0,001-0,18 аш) • :

КЛпешш кх сзгспензиЯ ультразвуком к центрифугирования (20000Ä, 30 квн . V 4°С) . Для очистки нитрогеназы и ферредркскноввкстракт клеток подвергали анаэробной а|»махо1рафии наВЗАЭ^елотдозе (элщия 90 ш KgCl^ в 50 мУ трно-адетатноыбуфере; pU 7,5). апвируемая первсй 'с колонки нитроГеназа имела удельную активность около 100 июнь С2н4,мш~*<,мг~1 белка и не _ еодерааяэ фер-редокеттв.ОэбранвнЗотделшопре^ анаэробной хроматографии ва колонках с сефадексом Q -50 а даАЭ-цвллглоэой. Препарата нкрогеназы н ферредрксннов хранила в.хндкомазоте, Активирующий нитрогенаэу федоёот (AHB) latoe получали в анаэробныхуёловиях,; пропуская экстракт кле-. гок через колонку сДЗАЭ-целлюлозой. Дня очистки нитратредуя-тазы R.cap^ruIatuB получали ацетоновый порошок клеток (Оеребря-кова, Гоготов, J98I) и экстрагировали аз вето фермент в течение ночи (4°С; 25 »Й-цло-НСХ; jH 7.5). После аентрифугированяя <15000 er 60 шн.; 4°0 -акстракг подвергали хрсматохрафвя на колонках с ДОАЭ-цедлплоэой н сефедексемл -75 и О -200« Дм выделения ферредоксина,; гидрогенаяы и пируват-фосфорокластичео-кой систеш. Cloairldlum; butyrlcum.: использовали модифицированную методов 'Carter at ai, (1900), Ферредэксдн I и.ферре-доксин П из лпсгьев АтоЗДа pinnate - ввдездш как описало в работе (Якунин и сЬавт., 1985); а ферредоксин A,rlneleadii -согласно методу (*och, Amon 1972), Хлоропласта из листьев ♦ гороха выделяли по методу ( Woat,,WiechiQh, I960), Супероксид-дисмутаэа к 11Щв)В-дегядрогеназы'н. capsulata», а тагасе биомасса с, butyricun V бшш предоставлены со1рудаиквми лаборатории метаболизма фототро$пых микроорганизмов. /• : 5'' . ''..' А"

' Нитрогеназчую * активность клеток * в^ар euiaWe и А, т1пвИш-dii , а также их экстрактов измеряли методомгазогой хроматографии до реакщлм водо

ланал Dg. Соотношение даух фохм га^геиаоы (грелка) ^«»р«*-

©1федвляди то староста реакции в отсутствие (НГд^н присутствии (НГА+НГр> 0,3 Ш НхГ+.в АН» (1мг по белку) в реаио*-онной смеси сдодушего состава; 60 »И -нерез-к буфер (рН 7,5); 30 »феахй^сфгаа; 0,2 кр 1фвахякфосфокяназы; 5 ШАГ»; 5 *й и^сх • и'ю им датионита.'При использовании в качестве донора ' 'адек^нов^дая яятрогеназн ферредоксина, б реакционную смесь' , шесто датионита добавляли 13 ыМ аскорбата, На> 0,3 »Й 2Л-дв-хлорфенолиндофенола;; хлоропласта 'гороха. (О,3ш\толорофиллу) ' ; и ферредоксин (5-7 мкМ) ; Шкубацию проводили на свету (50 вт/Ю= Активность гидрогеиазы измеряли по выделению Н^ методом газово Й : Схроыатографяи и ш; гогВздешшНз -спектрофот^ тов'и Ннвратреяуятаану» активность препаратов в.

еарапЗА'кив < ощ>оделяш по во^тшовяекЕо'.нОз^ до. Ы02~ мода-фицироваиннм методой Кеннеди. (Татарова и др/,1Э76) Активность ферредоксинов как перевосчиков эдектронов игмёряли в системах, в таторй от восотшавлтались освацешпаш хлоропластеднгоро-ха иди пируват^-фсюфорокластотеской системой С.Ъи*уг1с«я, а акцепторами электронов слукилн ттроге^а в.саряи1аЪ1а» гадро-^ тепаза. с. Ъи*ут1сил, ¿ируват»; или а-кетоглутврат^сгитазн к. сер- * виХагив, ферредокспв-НАДф-редуктаза гороха (висЬапап .«¿"«1,1967; с^его*а1., 1^) .0 содерхагаш ферредоксинов в препаратах в.оефШ11аЦв судидитанхакттансс^

тронов от июропластов гороха к китрогеяазе той жа бактерии. Дял определения разных форм ферредоксина препараты подвергала диск-влектрофэрезу в. 15? ШАГ, во окончании которого на неокра-шейных; гелях были хорошо видны коричневые полоски' ферредоксинов ■ : < 0,88 для Фд I и 0,76 для П). V •;

спектрофотометрах " ЗрвоогЛ ОТ ТПЗ" (ГДР)' и " ШЛаоШ. 35ва (Япония), а .' спектры ШР - на радиоспектрометре РЭ-13СЙ ^ (СССР) . Аминокислот; состав федоедок^ Д-500" (СИА). (Удержание в них железа, а также молибдена в культуральной жидкости огфеделяш методом атощю-^бсорЛщон-! ной спектрофотометрии, а кислотолабвльную серу — <УПт-фенпден-: даамшок;(?око» 1949У; Рёдако-штенциад ферредокси-

нсшиш*еруотпотешшоме^ичесмштитрованиш(Эсфднндр., 1984) . Относительную 1^0кулярнуи иаосу белков определяли ме-.тодомгел

о -75 и о -200 (Детермац,' 1370). Аналитический дисл-электро-

форез:проводЕШтв ПААГХМаурер, 1371)г;Содеркаяиэ аммония{¡; -в культурадьной жидкости^ определяли помо14ью ионоселективного , ' влектрода (Киселев и др. ^ 1982)', а образование • я20 клетками , >1иоартд1агив ;ч ~ методом газовой хроматографии." Котоентрацио,;р"*; :: ^июрофииа нзМеряли,методом Арнона (Агпоп , 1949), белок-■ та" Лоури {; «аV ? ¿1960 ¿'

.' РЕЗУЗСЬТАТЫ-И ИХ ОВ2ШБ0ИЕ;.,г;-.:V-. ;:;;;;^■ .

■ •. ' Регуляция синтеза и активности нитрогенаэы .^ :

^ : Клетки а. «¡»радами» проявляли шлрогеназную активность' :". , при росте в.присутствии , >' глутшата, нитрата и лкштирур- Д'--тх концентраций (таЛл* I)'«; Независимого* црарода но- '' ••'

- 'V пользуемого .иеточнюсаазота," клетки ¿ '-'выросшие в непрерывных- : - - \

условиях^ обладали более высокой нятрогенаэяой активностью, .-.у ;, чем .клетки из . периодически! куль17р. Наксималъная нитрогенаэ- у-..

■ - кая : активность ' няДлщалась'у клеток, : выросших в - регщш 'хемо-';;' <- "

стата ¿ри лшштировагош' Щ*Х, р0,03 г 0,04 .<*). Выросшие -а ^ в периодических условиях дри лимитировании аштонием культуры - : ■ других пурпурных бактер^Диюаоряуцаоо&пв» раШвгНа, ньоДо- V-.-ор1гИ1ил> гиЪпм^тагасе имели в весколг-ко раэ более высокую'ак-: . .• тпвяость^нятрогепази, чём'клетки, выросшие'в присутствии!^',' ; 1903)« В отличие от А.т1лв1аа411, нитрогеяаэ-, • 1шя активность которого существенно.пс зависит.от рС^У клетки '•'. ■ * г 1фояэляли актдвнос^^ пятрогеназы при р02 «ень- .

- ве 0,021 ахм (табл. 2). Оптимальная концентрация Оз"в газовой м^е реакдаонного сюсудика пги измерении нитрогеназной актиэ-; вости таких клеток в текноте составляла тогда как для :

.изменялась;ог; 255& до43^ / в зависимостиот рО^ ^,\ во время ростер Еитрогеназная активность II. сврви!в^ив, ' иэме- '"; ренная на свету в анаэробных условиях; была примерно в 20 раз . 'выше' активности этих «о клеток в темноте в цриаутствии • ' • Ц-, - (табл^ 2). Нитрогенаэная и нвтратредуктазная активности яачи-;

■ ."вали уменьшаться при концентрации; молибдена около;;4 - мгМ при - ;'7 " • • росте |^гльтур я. сартааг»1в в црисутствии яо^ ! в качестве * '

' ' источника" азота.. Па средах иг или Ери лимитировании роста <• : 'культур , нитрогеназн сникалась при концея- ч -

., ;•• 1рации молибдена менее I Это указывает' яа ?о; что при : -' .V иетгользовеняи но ~; й.сараи1й*иа ' имеет более висо*зп> потроб-^ 1 ;

' -•• -----ш4+ •

у-!-Í Влияние,скорости,протока ( D); ka нитрорснаэную активность, ; ^ v- выключения-нитрогеказы аммонием {% ингпйировгния) ' _ -

."I4*.1 ' J' Г J", *J>WMI» m ни Л Iii* ' < m виани» -f t| _ AmmviiI k^na^V' TSOftWfTÜT "

s содержание HT¿ в клетках u.c«pevü»tttaрастуцкх в •

¿V • •Г1'" ' 'у Ml. ' • ■ ' ••• * "" "-. 4 ' ^ * ' • *t . — -, ., , ,„ . . „ s i' , ' , •

*; .0елка (во.всех тавлвда* в рисунках».\ :

'¿'.если не указано) ; н.о.=-' не определи» (во всех таблицах).

Таким odpasfOMi г дня полной экспрессия вятрогонаэы и витратре- '•

■'"■■■t'%"^ ТППРТЯ nVietkfiT'Sâ^ fíltnaulntllfl i*'--"- —-J_'__j'__" J. ' '

иенее. 2-4 ыкМ МоО^2"". Это значение i лежит в диапазоне юондентра-ИИй МсЮ4~Г; (0,2-10 шЫ) V необходимых для' биосинтеза китрогена-^

• <

А,лг1пв1ал<111 ^ (тюль- р выросши ■ - приразннх аяотевнях:

W¿>' I • R.oapeulatua .....) " А.т1пв1алД11

Свет V • - I Темнота • ' -? у j ;-чдТемнота

. 0,001 200-" 'v -- -;;;/S' П5 У р*•'.:

; 0.006 ■ *:22.; ' •• " ......

o.cei '' *'' """ 0,060^

0,073 о ■■ : ■• /-о ■■'• ••••• * •: : 1зо;

одео., о 'М?:

■ y-'JwMomiA вызывал; обратимое' ингибгфованиеннтрогеиазноЯ ак-. тиввосги клеток н. capeulfttue^ (вффектвшошчения шп^югееазн),! длительность'' которого "зависела- от количества добавленного 5 ' BHj .л^Тнилючение" шщюгеназы вызывай такжеглутамин ,*: аспа-рагиы? и. иичевива.'. Наргтае --эффекта выкдвчения шпрогевазы 'в; клетках е. capmil atas* аммонием не ; зависит отпрврода источника азота, скорости протока, интенсивности светаи ■ концентра^-дии молибдена во время роста культур» но завиоит от стационарной концентрации клеток в ферменте во время роста Bcapguiá^-tus в режиме хемостата при. дпехитировании ® H^t (рио. I) ♦ . ; , ■ Этим, :по-видаго1^' и объясняется противоречивость данных отно^ . сительпо: наличия »того. эффекта" у tfH^ - лимитированных куль^ «доЧЮигиЬгии, ,а также:его зависимость от возраста периодических культур .Rps«P®^uotria- .H\it.«apeulatu8.: ' ( Alelv at:al,»' 1981; Sweet, Burrla , 1902, 1983). "Выключение" нитрогеназы •' * аиионием наблюдалось-, также у клетокoapaulatue, выросших вV-. темноте в мшфоаэробных условиях с. лимитированием н Н4+, щи измере!юи активности этого фермента как в темното в присутствия 02, так и на свету в анаэробных условиях. Инкубация кле^ ток R. capaulatue в атмосфере 02 (1ч) ие влияла на проявление ; э$фекта выключения питрогеназн аглюниём.' Это свддительствует г ; о различных. механизмах, ингибировашл активности штрогеназа ; у-'

ъч.-

ЮС

60

,£20

. ; 0,4:\ ■• . 0,8

■ • РИС.ГЛ/• .г"; РаО.2

■Еис^ -I. ;Степень гигибированкя штрогевазы аммонием в клетка» • ^ -Ш"еарва1а*«а в' зависимости. от плотности культуры, ■ ■ растущей в режиме' хемосгата при лимитировании ни.*

Рис. 2. НвтрогёнаэнаЯ активность клеток 1Цсарви1»*иа (I) и содержание в них НГ»(2) цри переходе культуры, • вырос-

данной бактерии:; н Н4+ иО^. ■

. Л/Изменеоте »ус-

ловиях лимитирования ашонлем оказывало значительное влияли» ; на соотношение " активной и неантивной форм ' Ептрогеваза (У е-белка) в клетках; зтой бактерии (табд.I). Цри росте К.еарвц1а-Чиа ;.. в присутствии ; М д или-глутдаата состояние нитрогеназы также изменялось в зависимости от скорости тфотока; но в - более узком диапазоне. Следовательно, состояние нитрогеназы вклет-ках и.сврви1а*ио.. зависит не от природы источника азота,' а степени лимитнрованияроста кулыуры Гзтимсубстратсм.увели-: чоние которой приводит к повышению содержания НГд. Максимальная говрогеназная активность нaЛщдajшa : y «их 80-100£ НГД (табл. I), Цри переходе Я.варви1в^е, выроо-

-, - ТП Г ' i -О'-;- ? i vi -i: *-li.'.-.^ií:i'.'!« -'■4 - : , ■ «,-

> : b^C l^vwí'V-y;-'^^

вей л усжс^яг цри ssiäüiitt^HB^^ ^резким' :

. ^ стата о 'лшмитврованвеи' аммонием ( M' ( ИН^ЗД^У у> . V

• V '■■>'■ в жяетках происходит дереирессия- синтеза нвтрогеназы вследствие *• ; '

' ■ недостатка -азота ¿.в' ходе; которой ' изменяется : такга " соотношение^;-:

двух форы нвтрогеназы (рис.: 2) ♦ .Такие изменения состояния этого V • .

¿.У®*™4®?116" сггепе1Ш-'лимитщ>^^% , : ванияроста ail саряи1^«;_«шонЕём во ; вредя перегода хушьтурв .. -.'» новые условия. В толзу «того/сввдетелъств^ ; ■ тояние еттрогеяазы не"изменялось; (IDüjC НГА) ^пря еэтсвнтезе ;. : шел»'добавления МоО^-к клеткам ' я» У; ;

~ .. n&TTuA vmaWta«« ттглг тииитHimufltfHH'•*- WHпа', ямяк rie* тгпЛлгетгА-^' ■'—

_______11фи - лииитщювании' * на. среда,без добавке-. 5

лтоянкой^ в; (о ,02ч~*)£ Цри росте ; xjxbTjp 'ъ

; режиме хемостата . . ВХЯ ЦоОдтГ и постоянной ;-«а« турбидостата в ^¿сутст^ ' *2 с 1 уменьшением интенсивное^-;,/.. Гти сшета найдодалось ;сня*евие;с1®ростж роста культур и увели^й ' :чеиие',содерааоия°^ V ^меняет««" и: пдо^ клеток / вцросшиг в усжишяхГ'ли^:-^

чГштаюваши^(^г ТОСЙ НГд) ; г ■. . ; ; на ; светит в; присутоетнн алитлугаыгта.1 Наиболее : у/ '

. ^ бкетрай переход ет^' в НГр^фор^у; 10 наДлрдалсягпрл i. ,

^Д'ннкубаддИ'клетск;'с.:б мМвн4С1-и.более мадленшй;*^;'11^кш"^.; . : глутаматом Тт/г'Г' &-12 ч) .^При ктубации клеток H. o^eiilatua ^¿'»v; -•в атмосфере-OCIOOS газовой фазы) состояше нитрогеназы н«4 • .-"меншюсь и $ер<еет оставался \

■ ;:-vv>;Taira-o6p^où,'ni^ '

l/ют об отсултвии взахмосвязи;между вффеет«4 вшишчения'яитро^^'- г: ;.

' ' " • 1МПЙ111 ЫЩЛЧчИч 'я MAWulWtel HBiAfM 'ЖйНИМ*. wtfliwa* V L MiMMb. -

.т.'J-7 • - i- /А —

1 ; внгибирование; нитроганазн , шмонкш в ккеткех щрпзрннх баю«- ' ^• Р®®• _переходомГвтого^фе^ывята ^в^Шргфор—^• '.

i i^^ KSÄ STo ^считается многими -автораш "(Ьивйвш;: Burriia, :1Э7в i V f . ^^Certthere «* I979)V.'H^ вероятным мехашомси í 4

. мючения* юпрогеназы 'шионием, :т,вашему ыяени»,' етляется ; Л -, -p HHraiÍHpoBame/cHCTeíái ^транспорта >лемронов,' обешвчивавдей^йЬ- ■ v ; - ^1шдони^ьаняе гатого : фермента^ №ыенеш1е -соотвстеши 'даук : - .С ' фори нитрогенает JUoW«»iatua Гпрж цацятфовании роста азот-■ -О-.' Л ■'$*тоирутаих1культур' светом:или'при';инкус5ацви^кяеток';с.источ-f';.'Vr'; униками азота тм«е гаяэаво,-ио-вв^имому, с нэменёнкем обеспе-^ченнооти^жультури'азозда» ; Таким образом^ состояние нитрогена-' .'

. • Для проявления активности НГр R.cap«ol&tue ta Tiró при : Еспользовакии в качестве донора электронов восстановленного ; ; ферредоксина I этой же бактериине требуется активации фермен- -• та в присутствие М» и'АЯФ (табл. 3)« Следовательно) переход ' - v нптрогеназы а той 'бактерия , в НГр-Ф>рму на является инактивацией фсдаента как таковой* так как он остается шшостыа актшшым,:;

f У'.;"• j- &;;Таблица'3Ч^'У,/

. • • - v Активность двух" форм нитрогеназы B.eepsuiatue , ври . •

'Тиспользовайш в качестве доаора влеетронов дйтионита \ :■ ¿Уиферредоксина (Фд!) »той « баатерш : л ; ; '..'

//ВроНРВ V: ГС**» Щ Г ■

; -;4д1^' --у*, л'"'" >" Не г, -'''¿'-о - ; Ту- У .' 85. •. ■ •

: У г:'при' использовании ферредоксввав качестве донора' влектронов.; ■

. как.правило, -при улучшении обеспеченности клеток азотом.и яв* ляется дошютрувдей ь условиях,, близких к репрессии фериента, то иожно вредполояить";^чтообразованиа КГр представляет собой начальную, стедхэо деградации нитрогеназы в условиях наботкА^;'.

азота..; v • л' •:.".'*•,.••' >.'-У '.....

л * Г - 2, -Свойства ж регуляция синтеза ферредоксина . . " >' '

?■ -"'■'.í- v-r*;v«^pentlAtoe 'S'')^¿'У-У^"Й-'У■'''*■ v .'ü'' ••.•/•'*'.''.

У tИз;азотфиксиругащсметокV-,R.oepeuí atra». *выросшихва.све- \ ■ ту в анаэробных условиях, получены адектрофоретйческп; гоноген- . У' нне препараты двух ферредокашов (табл. 4). Особенность 'предло-. женного метода наделения ферредоксинов заключается в проведении ^ ; всех этапов очистки в анаэробных условиях¿ что связано с ниэ- > -'У кой устойчивдотъюФд 1,в'; отношения Ферреагоксинк R.cep»ul*- .. / tu» различаются между собой по f{язико-химлчесиам свойством • '

*; > (табл..-.5); ипаломявэют ссютвегствутще ферредокспии Hh.rttbroai -(Shanmugen • t el., 1972).'фд I.R.oepeuletuo более активен, ; ■

12. ■ . ■■■..'■ ЙчЩЛ

'■■'■■* '„'-,' Таблица 4

Очистка ферредоксиков Е.оаряиЛе^ив ' :.•'.'.

- —

Стадии очистки

Объем,! Белок," ! Общая актива !Удельная актив- -: ил : I < мг, ~ < !вость, ед*. . {иость, ■ ед.мг"1 ^

; . ■■{ 1 ■ - ■ < белка ■ •■•-■;

Экстракт кльтрк • ;700 •'.;.•. 32200 12800>

■ Хроматография ■''■

деАЭ-целдтатовз д:^- 1

"ТО 280 109200 390.,

Гель-фильтрация - Л-^ЛУ^^ '"¡-у;''-'-'-'

на сефадексе . ■. • .-.-"-'■. ■ ■>.■"-.4 '

•••«&Г 120 102 - >82072 - 805

, «я П'-1 ■ ■ 126' « ' • .13320 - ' зю; \ ■■■ -л. ■

наЛЭАЭ-кедлмово ■■,■ ■■■ ■

(эдация лшнеИнкм . ■■■ ■■■..■.■■'.;■'.■,.■■.'■

ГрадиентшваС!):

«д " 17 V 33 66311 2009

; -■ . ' '. Од П ■ в И. 8658 5 787 / /

* Активность ферредоксшов определяли по" скорости йёреноса электронов от хлоровластов . гороха к нитрогсназе. За I ед. • принимали образование I. ¿доля С^Нд/мин. -.V ,

. геназе »той же бактерии и гидрогенаэе с.ъ^утАом», тогда как ■ Фи П'былболееаффекгивен 'В реакщяхфгооотоии 002 экстрактами Е.сврваЗА1^»,',- фотовосстановленяя НАДЬ хдоропластами гороха и выделенняН^/^^аяиаируемого гидрогеназой с.Ъи-^г1вит/в" присутствиипирува^сфэрокластичесшй систвщ. В отличивот фер-редоксияов кь.гаь*«т..; ( т©еь,4 Атоа,Т975) ферредоксины «и1а*иа,' как И ферредоксин Ш1к>Ъ1ия|■]ароп1сшп (';СахЧаг а!. 1980), более Цфективш как донорц ¿яектронов для китрогснаэы, чем'дитиопит и ферредоксдац иэ других источников (табл. 6).. В.! отлзгшеот ш». гиЪгш».' {сьаггаиеаот ¿1. , 1972) ^ синтеэферр>едок-синов у к.адрв^а^в '-вавксшт не только от наличиясвета.но и обеспеченности клеток4«зотом и органическим соединением-- (табл. . 7). Необ^дшыш уадоваями ^синтеза у в.сарадХ^ивявлл-. . ется наличие /света и -'лва^^рованиё ¿«^ ■

.. ловяяг'1^яьгив1довэнм^1«ет^\втоЯ бактерии' содержат холм» ' • ЗД П (тайя» *?)♦ Это'сввдртеяьотвует о 'том, что Фд 1 фуищиони-рует в' реакциях светозависимого транспорта влектронов к витро-

„ Таблица 5 Свойства ферредоясшю® в» espeaiatu*

V " Свойства- .-■ ■.■■;•";•■ : . I 6д I t ' Од П .

М* ' 12000 * 1000 18000 *1000

Содержание, иодьЛюль бедка: ■*•••'

Ре ■ 8,0±0,6 4,0*0,5

S2" 8,5 * 0,6 4,6 4 0,5

Цнстеин . ■■■ • :: 4 ■. ." , Спектрншглкцещдя:

максшуыы(ны) 280, 380 280, 380

-:[ V. ЭЮ (плечо) ' КоэЙициент вксяшяди, ,. .■ ■ '*.

ш «таг1» ^гесг38 ^гасг22*3 ' ■ ' . «380*» - СЭ80-12'3

A38(/A280 O^Öl 0,03 0,52 i 0,03 ЭПРг^пекфа, s-фекторн: " . : ■ ' * ."; • -

окисленный ■ 2,0X3 2,015

восстановлеяный , * 1,90; 1,96; 2,02 нетситналов

E¿ (pH 7,5) , мВ -270 * 50* -419 * 10

в-кошеваяаышокисдота ; алаша треонин

Активность как переносчика ' ' ; - ' * : электронов.« яитрогеназе ■.:...• .. ■ . ■■.

R.capsulatue.KiKUib'MKH-^'Mr"1

белка: •••- •••:•• . ■ • ■ ■ .

восстановление CgBg у 2100* 100 .:-. ■ 8101 100

вндоление Hg 3000 i Х00 1830* 100

Ваход,!мг/250 г сырой биомасса • • 25^30 •: * -£>7

геназе.. Фд П ыояет заменять фд I в этой системе, а также служит донором электронов дащ вктрогеназы при росте азотфихсирую-шей культуры R.oapeuietue в темноте, так как в этих условиях прошходит значительное увеличение его содержания (табл.7) В^юме 'азсгфиксадли Фд П участвует» по-вганмоыу, ж в других процессах,1 частности в асстшляцвя/R;oap|rolatae Ottj,

■ ■'■, .( ■. . ' Таблица 6 Активность нятрогеназы R.o«peulbtue в грисутствая . раэнЬос доноров электронов

Донор «ектродов - М Образование СдВд

йа2 32°4 (К 1ЙЛ)Ж 34 ферредоксина * R*oapaula«n* -

4д I (S миМ) 122

«д П (5 aodiO 60

вд-I (2>5 мЙЙ + вд П (2,5 НйО v . 98

«д I (5 шй!) + вд-П (S ioei) - 190

вефредоксив &*-г1и»1ш011 (в ИЙЙ 38 '

верредакеик. Sptrwllaa -

. pl«t*n»la (15 МяЮ ' .49.

ввррвдоксннтороха (22 кШ> ,; ' 30

Ферредоксив шшната- (30 шЮ 21*

11 В темноте, остальное варианта - на свету.

Тайаща 7

Содержание (отн. ед.)я в формы ферредоксиновв клетках KiOepmaatw*, выросших в раэнш; условиях

Условия роста клеток - , ! Избыток : ДН^*1"- 1Дицитироваяае иц4+

196 (фд I + фд а 160 (фд Ю- ' 380 (фд Ш ■

В.о.

* I отв. ед. составляет I яшль Сдй^**тн"^*кг~^белка препарата ферредоксина, полученного из 50 г. клеточной иаети. ;

. Э, Нвтратредуктвгиая система и ее взаимосвязь , о нятрогеназов R.c*p«a»tue *

¡Доведенные исследования доказали, что нитратредуктаза синтезируется клетками й.елрвиЗл-Ьи только ври наличии в среде. НО3- (табл. 8). Павы аммо&ан частично подавляли синтез нятрагредуктаэы Н. cepsulatu« , тогда как вприсутствин Og син-

Анаэробные, на свету 4 (фд д)

Мккроаэробпне, в темноте ; 20 (фд ГО

Анаэробное, в темноте - 70 (фд Ф

Анаэробные, на свету» • ■ •

лиштированив дактатом 390 (Щд ID

*" ТаЛяица Ö

Влияние условий инкубации на синтез нитратред^стазн ■ длетжааи ü.o»peui»tue, выросшая при иэбвткв кн*' : Условия игаубяшг *'. ®ви®~

* Свет, анаэробные, без Н03~ О

Свет, анаэробные, 10 «¿J MOg" 60

Свет, аваэробные;'10 iM '■ '■■• V

хлорамфеншюл (30 мкт/ил) , * 0

е :: ^ : : ■

5 Ш ;;; 20 ■ Твиюта,;а»р0бные,-10 Ш ■ ■ 0

Темнота, анаэробные, 10 мМ .«Од™ .. 2

8 Продолжительность ишцгбщцш24.часа. : .■ :.'■" ^ ~

тез атого 'фермента репрессировался полностью. При росте s,e*p».. eulatue в условиях лшитировеиия ЖО^" происходят его ассимиляция, поскольку такие клетки вкделярт яВ^+ при их инкубации на свету в присутствии 10 Ш V0£*: а I Ш* метионипсульфоксши-на. Хлетки отой бактерШ Баделжщ таяяе s¿Q при ихинкубации на свету в присутствии 10ыМ НО3" к ICSÍ После разрушения клеток н. capsulatum - * ужьтразвуюш осяовная часть (да 9CSÍ) гаггратредуктазной активности обнаруживалась вмембранкой фракции • Молекулярная масса фермента, солюбалиэированного путем обработки мембран тритоном Х-100 и ацетоном, составляет 210000t ¿ 10000. Наиболее эффективными донорашэдектроновкакдля йембранпой.' так н состйшгацрованной нитратредуктаз íu«ap•^^-lвtwa . являлиаь восстановленные датионигом метал- и бензилвио -логен. В отличие от содюбилизированного фермента, мембрадсвязанная нятратредуктаза R.capeulatua способна использовать в качестве донора электронов НАШ," суищнат, лактат и Hg. Антн-кицин А н теноалтрифгорацетат ингибпровали сукцанат- н 1WH-эависимыо активности мембрансвяэашой нитратредуктазы в.оар-eulatus. тогда как аэад а циаяид подавляли активность обоих формфермента.-Такямобразом,нитратредуктаза R.сараи!atas BIO по всем данным является ферментом диссимияяторного типа;

активность которого связана с. $уннционпроваш1ш электронтрано-порткой цепи. При росте на среде С НО3* Н.«арлаа*иа, по-видимому, восстанавливает егодо ; котощй. затеи превращается • китрогеназой в КЯ4+. Налгаие подобного пути ассимиляции > н 03"" предполагается и дая неноторвх штаммов нр»; ри1и»-кг1»(К1вшу« . аЗ.,, 1980), а тагаш 1иврЪа«го1<1е« Гогта <1«п1*г1Г1еашз (Они- г

4, Стабильность нитрогеназн и вд I н.

* Как а нитрогенавы других микроорганизмов (Кондратьева, Гоготов,1981), «'тот'фермент та Е.сарви1аШа' является лабял^-'4 им ^«.жипц! бнмра внактцйируидтюя в ■ присутствии в принаг-- ревании, 4д ' I л. оареиХаЪив^также проявляет низкую устойчивость в отношении 8тих факторов и относитсяпо-видимому ?.к числу наиболее лабильных ферредрксинов^изученнкх к настоящему времени» Существенную роль в инактивации тгтрогеназы и Фд I и, сарви1»- ; «оя ' я присутствии щюдуктн 'его 'восстановления- (В^

в 0^). В делнх кмтках л^сарвЩа^ив ¿китрогеназа'имеет более высокую устойчивЬсть к действию Енактивиуущих факторов, чем 1л тздго<. Наибольшее время хизнн нитрогенази в клетках и. вец-чи1<Лш» О**7,5

синтеза белка (пуромицинэ)-; и в отсутствии источников азотаУ; ( глутадата) .придобавлении когорта яитрогеяаэяая

■ активное» культур уменьшалась значительно быстрее (Т1/2~ : : 1-Й дня). • -

/ швощ ' .*

I. Наиболее высокой гоггрогеназной активность» обладают клеттас а.с«рви1в»и», растущие в непрерывной анаэробной культуре в релиме хеиэстата прилкмитировании всточншсоы азота. Зна-чвтельное влияние на уровень нитрогеназной активности ока'шва^ ют также обеспеченность клеток тлябденои и рОз« •• • ,: Ооотнош^ ак^^ * трогенааы н^сврвиалЫа оцредеддатсв обеспеченностью культуры

азотш,приумеЕЬщенхи.которойувелзгчивается*^ ■■ ной формы втого фе^ыевта. ' : ' ^ < / • ' ■

. 3. Нали^'эффетаа^ юшелючеиия 'нитрогеназы / аммонием в кдет-" вах , не аависит от црироди источника азота, во-

1юль8уеыотево;вре^роста^льтуринесвязшооеосто

■ этого фер*ента." Следователыго^ переосод натрогеназы из актквной

в неактивную форыу на гожет батьпркчзкоЗ ."зымкгззнигя" фе;меята la vivo.

4. Переход'нитрогевазн S.caprtilet»e : из активной в кзак- , тивнуц форму не является инактивацией этого фермента; поскольку он сохраняет активность la vivo н t1îk> при использовании ' -ферредоксина в качестве донора здекгроаэво ; - : ;

5. В зависимости от условий роста синтезирует два ферредохюша» различающихся «езду совой по роду .'свойств.-Синтез ферредаксина ! характерен дел аээтфиксируадиг / клеток, выросших в анаэробных , условиях ка сзету, а содерканиа ферредоксина П значительно увеличивается при лп&датфоэанпя фо- . тотрофной культуры'лактатом и при росте азот^иксзгрутанх клеток , в темноте,:";- -'-V •.-,'. ■■ V4:- '.■■ '-■''■■'■ ■ ■'>'"'''

Ферредоксш I Ricapralatae участвует в свэтозависвюи транспорте электронов к ндтрогевазе, а ферредоксшн Л осущест-' вляет ату функцию при росте в хемотрофаых условиях.. Ферредок- . син II значительно активнее ферредсксиза I как донор электронов црв ассимиляции 00^. ■1

i 7. При росте на.средах с низким содержанием клетки• a.oapeul»iue проявляют нитратредуктазнуп и нитрогеназную ак— . тивности. Нитратредуктаза R.eapeulata» являетсяферментомдио-симяляторного типа, ■....':* ■

8, Нитрогеназа и ферредоксин I K,oaparalatua являются более лабильными белками, чем нитратредуктаза и ферреяоксин Я, ' в отношении внактивирупаего действия 02и температуры. Значительную роль в инактивации аи^рогеназы и ферредоксина I . кулярншкнслородоы играют продукт!!'его восстановления (НчО? и о^. - 1 ■■ ■;■ Л 1 . ■ ■

Сокрадетгц .: .*■■■■

. АШ — активирующий нитрогенаэу: фермент г АТЗ - акйшзЕн-б-трк- , фосфат»'ДЗАЭ - дагатшшшшоэтзи^ НАД(0)Н - шгкотинашздаденишш-v куклеотид (фосфат) окисленный (восстановленный) ; HT^pj**- а»-тивпая (неактивная) форва нитрогеааза; ШАГ - полказфштмидныа гель; Фд- ферредоксин; нвгаз -Я —2 .- оксютилштеразин -S— 2 этансульфошвая'юниота; - - ' . ^

По материалам диссертации опубликованы следугвде работы:

1. Кулакова С.М., Якунин А.О., ГЬготов Й.Н. Устойчивость гидро-геказы л нитрогеяазы пурпурных бактерий к действию кислорода и продуктов его восстановления. - Йрккя. бшхш. шкробиол.,

1982, т.18, R 3, С.324-330,

2. Gogotov l.lt., Zorlc.N.A«, Tniunia Л.Епиутявв and electron carriers, participating in H^uetatollera in non-eulfur bacteria. - Abetr. IV In t «mat ional BTrcpoalum о a photo«jnthe-tic procaryotes, ВоиЪапа»» (Укшое), 1962, B2>.

3. Якунин А.Ф., Гоготов И.Н., Свойства двух Форм ферредоксина ■■

.. KbodopaeudoBonae capeulat».- Шохшая, 1983, У.48, Jt 5, '

C.aii-8I7. > .

4. Цыганков,А,А., Якунин А.Ф., Гоготов И.Н.Вдиявде рОэ на рост, гпдрогеназнуп и китрогенааную вктивкоота клетокЮкзоорвеиЛо-monaa cepculata - и Aeetobeoter rlnelaadli.—Микробиология.

1983, т.52, Л 4, С.543-547.

5. Ttatomin А.P., Go go tо* I.В. Properties andregulation of Bjrt-thesia of two ferrodoxlna from Hbodopaeudomonaa oarculata. - -Biooblm. Blophya. Acta, 1S8J, t.725, H 2, p.29&-30a. . .

в. ietamla A.P., Cogotor I.В. The eotlvity of two forma of

nltrogenaae from Rhodopaeudonorme oapsulata In the presence oi different electron donore.- SIMS Hieroblol. Lett. ,1984, ▼.23, H 2/3, p. 217-220. .

7. Якунин А.Ф., Хбанр Т., Гоготов И.Н. Очистка и свойства двух ферредоксинов кэ водного папоротника ¿colla plnnate.-Вюхимия, 1985, т.50, »3, с.513-518.

в. Якунин А.Ф., Цыганков .А.А., Гоготов И.Н. Соотношение двух форм штрогеназа и эффект ее выключения в клетках Hhodop-Mudomonas oapaulata* выросших В условиях лимитирования по 8МШКШ. - дркл. АН СССРГ1985, .т.281, * 2 , 0.4825485.

9* Gogotor Х.8.,Твдошког A.A., Xatoinia A.T. Regulation of

hydrogenajse, altrogen&ae and lerredoila eyntheela In Rhodop-eeudomotiae capsulata,- Xnt Enrlro*unent«l regulation of microbial metadollan (Kulaer X.3. *t al.,»da), 1985, Academlo Pre ев j London, p. 221-230.' , ч,

10. YaJoinln A.?., xeyganlcov A.A., GogotoT I.S. Sitrate reduc-, taao of purple no л ¡та 1 fur bacterium Rbodobaoter capsulatua BIO.- Abstr. T International eympoaiuni on photoeyirtbatlo procurotee, 196$, Grlndelvald (Switzerland), p.236.

i

T-I0IS7 23,04.8вг. 3ak.7l58P, Тнр.125экз, Уч.-изд.л.— 1,2

Отпечатано на-ротапринте в ШТИ НЦШ АН СССР