Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели T-лимфоцитов при атопической бронхиальной астме

Скибо, Юлия Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели T-лимфоцитов при атопической бронхиальной астме
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели T-лимфоцитов при атопической бронхиальной астме"

На правах рукописи

005048»»°

Скибо Юлия Валерьевна

РЕГУЛЯЦИЯ IИ II ТИПОВ ПРОГРАММИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЯНВ 2013

Казань-2013

005048896

Работа выполнена в НИЛ биохимии нуклеиновых кислот кафедры биохимии ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г. Казань.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Абрамова Зинаида Ивановна Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор Мустафин Илыпат Ганиевич

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор, ведущий научный сотрудник

лаборатории молекулярных основ патогенеза ФГБУ «Казанский институт биохимии и биофизики» КазНЦ

Ведущая организация: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Государственный научный центр Институт иммунологии» Федеральное медико-биологическое агентство России (г. Москва).

Защита состоится «21» февраля 2013 г. в 13. 00 на заседании диссертационного Совета Д 212.081.08. при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке имени Н.И.Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, д.35.

Автореферат разослан « » января 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д 212.081.08.

РАН

Чернова Ольга Александровна

д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии ГБУ ВПО "Казанский государственный медицинский университет" Бойчук Сергей Васильевич

д.б.н., профессор

З.И.Абрамова

Актуальность проблемы. Для полноценного и правильного развития и морфогенеза в многоклеточном организме существуют различные пути гибели клеток, позволяющие контролировать количество клеток и удалять инфицированные, мутированные или поврежденные клетки (Penaloza, 2006). Апоптоз, программированная смерть клетки по типу I, является звеном многих биологических процессов у многоклеточных организмов (Green, 2009). Он связан с процессом развития и старения клеток, выполняя гомеостатическую функцию удаления поврежденных клеток (Барышников, 2002; Elmore, 2007).

В ходе исследований программы апоптоза, стало ясно, что этот путь гибели клеток не уникален. Кандидатом на роль еще одного механизма смерти стала аутофагия. Аутофагия способствует удалению цитоплазматических компонентов и активируется в ответ на изменение внешних и внутренних условий, например, истощение питательных веществ (Mehrpour, 2010). Аутофагия также может быть механизмом гибели (гибели клеток по типу И) (Pua, 2007). Тем не менее, в то время как апоптоз, безусловно, является механизмом клеточной гибели в условиях стресса, определение аутофагии как механизма самоубийства клеток в ответ на стресс по-прежнему остается весьма спорным.

Взаимодействие между аутофагией и апоптозом является установленным фактом. Аутофагия может приводить к гибели клеток двумя путями. Первый из них состоит в неограниченном «переваривании» содержимого цитоплазмы вплоть до гибели клетки, второй заключается в стимулировании апоптоза. Однако механизмы, посредством, которого происходит переключение с одного процесса на другой, не до конца ясны.

Белки теплового шока представляются новой парадигмой для скоординированного, многоступенчатого регулирования программированной клеточной гибели, позволяющие обеспечить защиту от воздействия разрушительных факторов и облегчить восстановление клеток после них (Beere, 2004). Их способность разбирать, собирать и упаковывать неправильно сложенные белки помогает избегать клетке неблагоприятных последствий от разрушительных агентов (Бобкова, 2011). Эта защитная функция белков теплового шока предполагает их способность подавлять программированную клеточную гибель, в том числе апоптоз и аутофагию.

Установлено, что в формировании аллергической реакции ведущая роль принадлежит Т-лимфоцитам (Pumputiene, 2006; Вис, 2009). Пролонгацию аллергического воспаления при бронхиальной астме связывают с усилением выживаемости Т-лимфоцитов и утратой ими способности к апопгозу (Ярилин, 1999; Бойчук, 2001; Spinozzi, 2008). Недостаточность проявления апоптоза может быть связана с тем, что происходит переключение программированной клеточной гибели с апоптоза на аутофагию.

Целью настоящей работы является характеристика механизмов устойчивости Т-лимфоцитов к программированной клеточной гибели I типа у больных атопической бронхиальной астмой с разной степенью тяжести.

В связи с целью были поставлены следующие задачи:

1. Установить биохимические изменения апоптоза Т-лимфоцитов в динамике у больных легкой и тяжелой формами астмы;

2. Исследовать процесс аутофагии в Т-лимфоцитах больных легкой и тяжелой формами астмы.

3. Определить влияние дексаметазона на аутофагию в Т-лимфоцитах больных легкой и тяжелой формами астмы.

4. Провести анализ содержания белков теплового шока HSP70 и HSP90 в Т-лимфоцитах in vitro в условиях истощения питательных веществ в зависимости от тяжести астмы.

5. Показать взаимосвязь устойчивости Т-лимфоцитов больных астмой к апоптозу в зависимости от содержания белков теплового шока HSP70 и HSP90;

6. Оценить характер изменений клеточного и гуморального звеньев иммунитета у больных астмой с различной чувствительностью Т-лимфоцитов к апоптозу.

Научная новизна. В работе впервые проведено исследование процесса аутофагии в Т-лимфоцитах больных атопической бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести заболевания. Было установлено, что в Т-лимфоцитах больных легкой формой заболевания аутофагия в условиях торможения апоптоза способствует индукции программированной клеточной гибели II типа В Т-лимфоцитах больных тяжелой формой астмы установлена одновременная активация и апоптоза, и аутофагии.

Впервые получены результаты о влиянии дексаметазона, как терапевтического препарата, на процесс аутофагии в зависимости от степени тяжести заболевания. У больных с легкой формой бронхиальной астмы дексаметазон индуцирует ранние этапы апоптоза, но ингибирует аутофагию. У больных тяжелой формой заболевания дексаметазон способствует интенсивной активации аутофагии, что приводит к пролонгации функционирования Т-лимфоцитов.

Показано различное содержание белков теплового шока HSP70 и HSP90 в зависимости от степени тяжести атопической бронхиальной астмы. У больных с легкой формой заболевания установлено повышение уровня HSP90 в условиях in vitro. В группе больных с тяжелой формой астмы установлено наличие как HSP70, так и HSP90, внутриклеточное содержание которых снижалось в процессе культивирования Т-лимфоцитов в связи с их выходом во внеклеточное пространство. Секреция HSP70 и HSP90 в межклеточную среду коррелирует с активацией апоптоза и аутофагии.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты, свидетельствующие об активации аутофагии в Т-лимфоцитах больных атопической бронхиальной астмой, расширяют существующие представления о роли программированной клеточной гибели в функционировании иммунной системы. В частности, установлено, что аутофагия способствует длительному функционированию Т-лимфоцитов при тяжелой форме астмы, что приводит к персистенции заболевания. При легкой форме заболевания устойчивость Т-лимфоцитов к апоптозу (ПКГ I типа) компенсируется индукцией ПКГ II типа (т.е. гибелью клеток по типу аутофагии). Различные проявления аутофагии в Т-лимфоцитах в зависимости от тяжести бронхиальной астмы могут быть использованы для поиска новых терапевтических мишеней в лечении астмы.

Особый интерес для практического применения имеют полученные в работе данные о роли белков теплового шока HSP70 и HSP90 и их взаимосвязь с апоптозом и аутофагией, что может послужить основанием для их использования в коррекции программированной клеточной гибели. Применение терапевтических веществ, в том числе дексаметазона, снижающих накопление белка Hsp90 внутри клеток, может

способствовать повышению апоптотического процесса в Т-лимфоцитах у больных легкой и тяжелой формами АБА.

Установленная в работе активация аутофагии в Т-лимфоцитах больных бронхиальной астмой под влиянием дексаметазона расширяет спектр действия данного глюкокортикостероида и имеющиеся в настоящее время данные о его влиянии на иммунную систему и воспаление.

Положения, выносимые на защиту:

1. Устойчивость Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой и тяжелой формами астмы к I типу программированной клеточной гибели (апоптозу) сопровождается активацией аутофагии.

2. Снижение апоптотической активности и активация аутофагии в Т-лимфоцитах больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмы сопровождаются накоплением внутриклеточных белков теплового шока HSP70 и HSP90.

3. Дексаметазон является одним из экзогенных факторов, оказывающих стимулирующее влияние на аутофагию в Т-лимфоцитах больных тяжелой формой бронхиальной астмой.

2008); на IV международном съезде биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 2008); на XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (г. Москва, 2009); на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань,

2009); на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия-2009» (г. Пермь, 2009); па XIII Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2009 г.; на XIII Европейском симпозиуме студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-2009» (г. Казань, 2009); на I Всероссийской интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (г. Казань, 2010); на 4 Международной конференции для молодых ученых "Molecular biology: advances and perspectives" (Kyiv, 2011); на IV Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (г. Казань, 2012); на 7 Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г.Челябинске», 2012 г; на Международном форуме, посвященный тяжелой форме астмы ISAF-2012 (Gothenburg, Sweden); на III Международной научной онлайн-конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" (г. Казань, 2012).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 174 машинописных страницах, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и списка литературы (319 источников, из них 42 отечественных и 277 зарубежных). Диссертация содержит 3 таблицы и 46 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Объектом изучения послужили Т-лимфоциты периферической крови здоровых доноров и больных атопической бронхиальной астмой с легкой и тяжелой формами заболевания. Диагноз и степень тяжести атопической бронхиальной астмы верифицировали согласно критериям «Глобальной стратегии диагностики, профилактики и лечения астмы» (GINA, 2008).

Выделение субпопуляции Т-лимфоцитов. Лейкоцитарную фракцию выделяли по стандартной методике на градиенте плотности фиколл (р = 1,077). Для получения чистой популяции Т-лимфоцитов использовали метод иммуномагнитной сепарации с использованием антител к поверхностному рецептору Т-лимфоцитов - CD3 (Dynabeads Untouched Human Т cells, Dynal, Invitrogen).

Культивирование Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты инкубировали в С02-инкубаторе (с 5 %-ным С02) в питательной среде RPMI-1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку (10%), пенициллин/стрептомицин (5000 ед/мл/5000 мкг/мл) и L-глутамин (1%) в расчете 2><10бкл./мл. В качестве индуктора апопгоза использовали дексаметазон (10'2 М) (конечная концентрация 10"*М).

Оценка апоптоза Т-лимфоцитов. Оценку апопгоза Т-лимфоцитов проводили на 3 и 6 сутки культивирования с использованием нескольких методов, включающие:

• выявление экспрессии фосфатидилсерина на поверхности Т-лимфоцитов флуоресцентной меткой мероцианином 540 (МС540) по следующему протоколу. Раствор МС540 (концентрация 1 мг/мл) в объёме 5 мкл вносили в 1 мл клеточной суспензии, содержащей 1хЮ6 кл/мл. Клеточную суспензию перемешивали и инкубировали в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре. Регистрацию результатов осуществляли на втором детекторе FL2 цитометра. На каждый вариант опыта просчитывали не менее 10000 клеток.

• выявление фрагментации ДНК в Т-лимфоцитах с применением набора FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen). Для выявления фрагментации ДНК в Т-лимфоцитах клетки отмывали дважды холодным ФСБ, после чего ресуспендировали в IX Аннексии V связывающем буфере в концентрации 1 х 10б клеток / мл. К суспензии клеток добавляли 5 мкл аннексина V и 5 мкл пропвдий йодида (PI). Клеточную суспензию инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Затем добавляли 400 мкл IX Аннексии V связывающего буфера Образцы анализировали на первом FLIh третьем FL3 детекторах цитометра в течение 1 часа с применением программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson). На каждый вариант опыта просчитывали не менее 10000 клеток.

Регистрацию результатов осуществляли методом проточной цитофлюорометрии на приборе FACSCalibur ("Becton Dickinson").

Ультраструктурная характеристика Т-лимфоцитов. Клеточную суспензию центрифугировали в течение 10 мин 2000 грш при +18°С (Eppendorf; 5810R), супернатант удаляли, а полученный осадок из Т-лимфоцитов фиксировали в 2,5 %-ном растворе глутарового альдегида (1 - 2 ч) и в 1 %-ном растворе 0s04 (2 ч). Далее образцы дегидратировали в этаноле восходящей концентрации (30°, 40°, 50°, 60°, 70°, 96°), ацетоне и окиси пропилена. Материал заливали эпоксидной смолой Эпон - 812. Полимеризовали образцы в течение трёх суток в термостате при температуре 37, 45 и 60°С.

Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме "Ultratom III" (ЛКБ, Швеция). Срезы контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца Препараты просматривались на электронном микроскопе Hitachi -125 (Япония).

Оценка аутофагии в Т-лнмфоцнтах. Визуализацию аутофагосом проводили после 3 дней культивирования с применением первичных моноклональных антител (LC3B rabbit monoclonal antibody, Invitrogen) и вторичных меченых FITC антител (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG, Invitrogen) на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss AxioScope Al (оснащенный видеокамерой AxioCam MRc5). После окончания культивирования клетки отмывали ФСБ, добавляли 3,7% формальдегид, приготовленный на ФСБ, и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Фиксатор удаляли центрифугированием в течение 10 мин при 2000 rpm при +18°С (Eppendorf, 5815R). Затем клетки промывали три раза ФСБ. После отмывки от фиксатора к клеткам добавляли 0,2% Triton Х-100, приготовленный на ФСБ, и инкубировали их в течение 15 минут при комнатной температуре. Пермебилизирующий буфер удаляли центрифугированием в течение 10 мин при 2000 rpm при +18°С (Eppendorf, 5815R). Добавляли рабочий раствор первичных антител к клеткам и инкубировали их в течение 1 часа при комнатной температуре. По окончанию инкубации удаляли раствор первичных антител центрифугированием в течение 10 мин при 2000 rpm при +18°С (Eppendorf) 5815R) и промывали клетки три раза ФСБ. Затем инкубировали клетки со вторичными антителами в течение 1 часа в темноте при комнатной температуре. Клетки промывали ФСБ, заключали под покровное стекло и вузиализировали аутофагосомы под флуоресцентным микроскопом.

Электрофоретическое разделение клеточных белков и вестерн-блотт анализ. Для разделения клеточных белков использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфат натрия (Laemmli, 1970). Гели, содержащие 4% и 8% акриламид (концентрирующий и разделяющий гели, соответственно), готовили с использованием 30% акриламида и 0,7% раствора метиленбисакриламида. Для полимеризации гелей использовали ТЕМЕД и персульфат аммония. Электрофорез проводили в вертикальном направлении при силе тока ЗОмА/гель в электродном буфере.

По окончанию электрофореза инкубировали гель, нитроцеллюлозную мембрану, фильтровальную бумагу и спонжи в холодном Трансфер буфере в течение 15 мин. Затем собирали сэнвич, заполняли систему для переноса тем же буфером. Запускали блоггинг с постоянным током 350 мА в течение 1,30 ч для 2 гелей или 45 мин для 1 геля. После переноса белков, мембрану промывали в ФСБТ буфере и помещали в блокирующий буфер. Инкубация 1 час при комнатной температуре. Затем мембрану промывали ФСБТ буфером, добавляли первичные антитела (против HSP70, HSP90, LC3B и а-тубулина) и инкубировали в течение ночи при +4°С. Спустя 12 часов мембрану промывали в ФСБТ и добавляли вторичные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена. Инкубировали 1 час при комнатной температуре. Далее мембрану промывали ФСБТ буфером, инкубировали в течение 1 мин с люминолом на основе хемилюминисцентного субстрата (ECL) и детектировали хемилюминисценцию целевых белков с помощью хемидокументирующей системы ChemiDoc™ XRS+.

Оценка содержания внеклеточных белков теплового шока HSF70 и IISP90. После культивирования Т-лимфоцитов проводилось осаждение всех белков питательной среды, в которой находились Т-клетки в процессе роста, сульфатом аммония. Затем

проводили диализ против фосфатно-солевого буфера (pH 7,4). Для разделения внеклеточных белков использовали метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Laemmli, 1970). Содержание белков HSP70 и HSP90 оценивали методом иммуноблоттинга.

Фенотипирование лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии. Популяции лимфоцитов были проанализированы на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с применением программных обеспечений CellQuest и MultiSet (Becton Dickinson). Для исследований брали по 50 мкл цельной крови с антикоагулянтом. Окрашивание клеток проводили с использованием комбинаций двух-, четырехцветных моноклональных антител поставляемых в наборе MultiTEST IMK (Becton Dickinson): CD3+; CD8+; CD45+; CD4+ и CD3+; CD16 +; CD56+; CD45+; CD19+ в течение 15 минут в темноте в соответствии с протоколом.

Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке. Содержание иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG в сыворотке крови оценивали методом радиальной иммунодиффузии по G. Mancini (Mancini G., 1965 г.), IgE — иммуноферментным методом (ЗАО «ДИАплюс», Москва) согласно инструкции производителя.

Выделение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Выделение гигантских, крупных, средних и мелких ЦИК проводили осаждением 125 мкл сыворотки крови, разбавленной в 0,2 М боратном буфере, pH 8,6-соответственно 3, 3.5, 4 и 7% ПЭГ (6 кДа) в конечном объеме инкубационной смеси. После инкубации при 4°С в течение 1820 часов смесь центрифугировали в течение 10 минут при 3000 rpm (Eppendorf, 5415R). Полученные осадки содержали разные по размеру фракции ЦИК, условно названные гигантскими (3%), крупными (3.5%) и средними (4%). К надосадочному раствору 3.5% ПЭГ добавляли 22% раствор ПЭГ в том же буфере до конечной концентрации 7%, инкубировали при 4°С в течение 18-20 часов и осадок, содержащий мелкие ЦИК, отделяли центрифугированием. Для оценки количественного содержания ЦИК в сыворотке крови полученные осадки суспендировали в 0,1 М NaOH и измеряли плотность оптического поглащения в УФ-обласги спектра при 280 нм.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием структурных характеристик (медианы, перцентиля), а для оценки различий между отдельными выборками применяли непараметрические критерии Крускала-Уоллиса (для общей характеристик выборки) и Т-критерия Манна - Уитни (для парных сравнений различных выборок) (Акберова, 2004). Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмена-г5. Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение морфологии Т-лимфоцитов здоровых доноров и больных атопнческой

бронхиальной астмой

Методами трансмиссионной электронной (ТЭМ) и атомно-силовой микроскопий (АСМ) были получены микрофотографии Т-лимфоцитов в различных группах.

На полученных микрофотографиях Т-лимфоцитов здоровых доноров клетки имеют правильную округлую форму (рис. 1). Клеточная мембрана ровная, без инвагинаций. Ядро, как правило, расположено центрально и занимает большую часть клетки'.

локализация хроматина периферическая, кариоплазма электронно-светлая. Все мембранные структуры целостны и хорошо прорисованы - митохондрии правильной формы с хорошо дифференцированными кристами. Чаще всего, скопления митохондрий наблюдаются медиально, недалеко от ядра. В цитоплазме различимы рибосомы, аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум. Наличие микроворсинок на поверхности плазматической мембраны свидетельствует об их функционально активном состоянии. Результаты ТЭМ подтверждались данными АСМ (рис. 1,6).

Среди структурно-функциональных систем клетки важную роль играет плазматическая мембрана, обеспечивающая барьер клетки, ионный транспорт, внутриклеточную передачу информации и т.д. Важнейшими компонентами плазматической мембраны являются белки. Они определяют морфологические и механические свойства клетки, нарушение которых может приводить к изменению ее жизнедеятельности или даже гибели.

Атомно-силовая микроскопия позволяет получать информацию о поверхности клеток. Мы установили, что на плазматической мембране Т-лимфоцитов четко выявляются глобулы, предположительно, являющиеся частью мембранных интегральных и полуинтегральных белков, а также фрагментов гликокаликса (рис. 1, в). Размер глобул составляет 50±7,5 нм, р<0,05. Плазматическая мембрана контрольных лимфоцитов отличается диффузионным, упорядоченным рельефом.

Рис. 1. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, (а) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью электронной микроскопии. Шкала - 500 нм, увеличение 12000 раз; (б) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии; в) Изображение поверхности Т-лимфоцита здорового донора Я - ядро, ХР - хроматин, М - митохондрия, АГ - Аппарат Гольджи, ЭПР -эндоплазматический ретикулум. Стрелками показаны микроворсинки и псевдоподии.

Большая часть Т-лимфоцитов больных легкой формой астмы обладает характерными морфологическими признаками Т-клеток, однако часть лимфоцитов имеет не значительные морфологические отличия по сравнению с контрольной группой (рис. 2, а). Для всех Т-лимфоцитов данной группы характерно наличие правильной овальной формы. Однако плазматическая мембрана, в отличие от контрольной группы, образует инвагинации. Ядра лимфоцитов, как и сами клетки, имеют овальную форму, ярко выраженный лопастной вид. Хроматин ядра - конденсированный и расположен по его периферии. В цитоплазме различимы клеточные компоненты.

На АСМ-изображениях Т-лимфоциты данной группы больных, также как и на ТЭМ-микроснимках, имеют правильную округлую форму с достаточно крупным ядром, которое занимает почти весь объем клетки (рис. 2, б). Ядро имеет овальную форму и расположено эксцентрично. В сравнении с лимфоцитами контрольной группы, у Т-клеток

больных легкой формой астмы отсутствуют клеточные микроворсинки, но сама клеточная мембрана формирует различные инвагинации. На поверхности плазматической мембраны глобулярная структура выявляется более отчетливо, чем в контрольной группе. Количество глобул увеличивается, но размер их уменьшается (20,5±5,5 нм; р<0,05) (рис. 2, в).

Рис. 2. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой формой атопической бронхиальной астмой, а) Микрофотография типичного Т-лимфоцита больного легкой формой АБА, полученная с помощью электронной микроскопии. Шкала - 1 мкм, увеличение 12000 раз; б) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии; в) Изображение поверхности Т-лимфоцита больного легкой формой астмы. Я - ядро, ХР - хроматин, М- митохондрия.

Мы можем предположить, что подобная структура связана с появлением различных белков на поверхности клеток, например, маркеров активации CD4+ лимфоцитов или белков-адгезии (L-селектинов), экспрессия которых увеличивается при бронхиальной астме (Simon, 2010).

В группе больных тяжелой формой астмы наряду с нормальными клетками, встречаются Т-лимфоциты с морфологическими изменениями (рис. 3, а). Обнаруживаются глубокие инвагинации ядерных мембран, изменения цитолеммы и поверхностных структур клетки, отсутствие микроворсинок и десмосом. Клеточная поверхность формирует многочисленные выросты, выявляются блеббинги. Отмечено наличие везикул с электронно-светлым содержимым, мультиламеллярных телец, а также аутофагосом с содержимым средней электронной плотности. Целостность мембран Т-лимфоцитов не нарушена.

Рис. 3. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови больных тяжелой формой атопической бронхиальной астмой, а) Микрофотография типичного Т-лимфоцита больного тяжелой формой астмы, полученная с помощью электронной микроскопии. Шкала - 500 нм, увеличение 12000 раз; б) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии; в) Изображение поверхности Т-лимфоцита больного тяжелой формой астмы. Я - ядро, ХР - хроматин, М - митохондрия, АГ - Аппарат Гольджи, АФ -аутофагосома, БЛ - блеббинг.

АСМ-исследованне Т-лимфоцитов больных тяжелой формой астмы показало, что эта группа характеризуется наличием как нормальных клеток с типичной сферической

формой, так и с выраженными морфологическими изменениями (рис. 3, б). Клеточная мембрана образует многочисленные глубокие инвагинации, микроворсинки и псевдоподии отсутствуют. Ядро также формирует инвагинации.

Сканирование поверхности Т-лимфоцитов больных тяжелой формой астмы показало, что, также как и в группе с легкой формой, имеется большое количество глобулярных структур, но они большего размера (47,1±11,3 нм; р<0,05). В то время как у измененных клеток глобулы становятся трудноразличимыми, диффузионными, а их количество уменьшается (рис. 3, в).

Топографические и наноструктурные изменения Т-лимфоцитов в группе с тяжелой формой астмы могут быть связаны с перестройкой цитоскелета и / или более массовой активацией Т-клеток, чем у больных с легкой формой заболевания.

Для взаимодействия клеточных и гуморальных компонентов между собой необходимо участие молекул адгезии. При воспалении происходит повышенная экспрессия молекул адгезии в очаге воспаления, что приводит к аккумуляции и задержке лимфоцитов в бронхах.

С помощью метода атомно-силовой микроскопии была определена сила адгезии на поверхности Т-лимфоцитов у больных с разной степенью тяжести астмы. Считая линейной зависимость силы от смещения кантилевера относительно поверхности клетки, сила адгезии F (измеряемая в наноньютонах, нН) определяется согласно закону Гука:

F = к*dH

dH - величина изгиба кантилевера, к ~ силовая постоянная кантилевера.

Изменение силы адгезии Fh» поверхности Т-лимфоцитов

250 т--------------------

. К 200 .......................................................................................

3;!0

П 100

...........ЕП....................

контроль

форма АБА форма АБА

Рис. 4. Изменегае силы адгезии на поверхности Т-лимфоцитов в

зависимости от степени тяжести бронхиальной астмы.

При исследовании Т-лимфоцитов в различных группах нами были получены значения силы адгезии на поверхности Т-клеток и выявлена прямая корреляционная зависимость между значением силы адгезии Г и степенью тяжести заболевания (рис. 4). Было установлено, что с увеличением тяжести астмы происходит увеличение силы адгезии на поверхности Т-лимфоцитов. Таким образом, можно предположить, что повышенная аккумуляция Т-лимфоцитов на стенках бронхов может быть обусловлена молекулами адгезии и межмолекулярным взаимодействием и, как показано в проведенном эксперименте. Полученные результаты исследований могут быть полезны для дальнейшего понимания взаимосвязи между топофафией клеток (механическими свойствами плазматической мембраны) и функцией Т-лимфоцитов в иммунном ответе.

С целью выяснения характера нарушений программированной гибели Т-лимфоцитов при бронхиальной астме и влияния на данный процесс синтетического глюкокортикоида -дексаметазона - на следующем этапе работы было проведено исследование выраженности спонтанного и индуцированного апоптоза в Т-лимфоцитах пациентов после 3 и 6 дней культивирования in vitro.

Оценка апоптоза Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой

Для изучения биохимических параметров апоптоза, инициация которого происходит в процессе длительного культивирования клеток, было необходимо оценить, во-первых, динамику роста Т-лимфоцитов на 3 и 6 сутки культивирования. И, во-вторых, исследовать влияние дексаметазона (индуктора апоптоза) на рост клеток в культуре.

Сравнительный анализ показал, что в группе с легкой формой астмы динамика роста Т-лимфоцитов в целом совпадает с группой контроля (рис. 5). Однако мы установили, что, несмотря на добавление в питательную среду дексаметазона, клетки больных легкой формой астмы проявляли устойчивость к апоптозу, что выражалось в незначительном снижении количества Т-лимфоцитов под влиянием глюкокортикоида на 3 сутки культивирования (рис. 5, а). На 6 сутки культивирования содержание Т-клеток в группе с легкой формой астмы было достоверно выше по сравнению с группой контроля. Падение содержания Т-лимфоцитов на 6 сутки культивирования связано со снижением содержания питательных веществ в среде, вследствие чего в клетках происходит активация программы гибели (рис. 5, б). Таким образом, изменение содержания Т-лимфоцитов в группе с легкой формой заболевания относительно контрольной группы на 6 сутки культивирования может быть связано с подавлением апоптоза, что согласуется с литературными данными (Бойчук, 2001; вртоги, 2008). Однако установленные изменения могут бьггь проявлением активации другого физиологического процесса -аутофагии. которая способствует выживанию клеток в условиях снижения питательных веществ.

Изменение динамики пролиферативной активности было также выявлено в группе с тяжелой формой астмы (рис. 5). В отличие от здоровых доноров и больных легкой формой астмы, у больных с тяжелой формой содержание Т-лимфоцитов относительно 0 суток практически не менялось как на 3, так и на 6 сутки культивирования (рис. 5, а, б). Незначительное повышение количества Т-клеток к 3 суткам говорит о снижение пролиферативной активности клеток. А слабое падение содержания Т-лимфоцитов на 6 сутки, так же как и в группе с легкой формой заболевания, может быть связано с устойчивостью клеток к апоптозу, либо с активацией аутофагии.

Изменение содержания Т-лимфоцитов на 3 сутхи культивирования по отношению к 0 суткам Изменение содержания Т-лимфоцитов на 6 сутки культивирования по отношению к 0 суткам

3":

52,$. 1л |-Н р.

т. ш

К 2 К гГ 1 1 0,5

7.1Д 1 0,5 и -1-1 ::: Ы:

а 0 к к+д 0 л Т+5 0 т т+д б 0 К к+д 0 Л Л+Д 0 т т+д

Рис. 5. Изменение содержания Т-лимфоцитов в группах контроля (К) и больных бронхиальной астмой с легкой (Л) и тяжелой (Т) формами астмы в присутствии и отсутствии в питательной среде дексаметазона (Д) (Ю^М) на 3 (а) и 6 сутки (б) культивирования.

Изменение динамики пролиферативной активности в зависимости от тяжести заболевания может быть обусловлено активацией апоптотического процесса. Спонтанную

инициацию апоптоза можно наблюдать уже в первые дни культивирования, однако, она не значительна. Поэтому мы провели исследование биохимических параметров апоптоза Т-лимфоцитов до их культивирования (рис. 6). Результаты показали, что содержание апоптотических клеток во всех исследуемых группах не превышает 2% от общего количества лимфоцитов.

: 1

Рис. 6. Содержание Т-лимфоцитов с ранними (а) и поздними (б) признаками апоптоза в группах больных легкой (Л) и тяжелой (Т) формами атопической бронхиальной астмы, а также в группе контроля (К) до культивирования в присутствии и отсутствии дексаметазона (Д) (Ю4М).

Длительное культивирование лимфоцитов в питательной среде сопровождается истощением ростовых факторов, вследствие чего запускается апоптоз. Исследование основных биохимических параметров апоптоза (экспрессия фосфатидилсерина на плазматической мембране и фрагментация ДНК) проводилось на 3 и 6 сутки культивирования.

Оценка экспрессии фосфатидилсерина (ФС) на поверхности клеток на 3 сутки культивирования показала, что содержание Т-лимфоцитов с ранними признаками апоптоза достоверно ниже (р<0,05) у больных астмой (рис. 7, а). Инкубация с дексаметазоном индуцировала транслокацию фосфатидилсерина с внутренней стороны плазматической мембраны на внешнюю, инициируя, таким образом, ранние этапы апоптотического процесса, однако динамика существенно различалась между лимфоцитами различных групп (рис. 7, а). Наиболее высокое содержание апоптотических клеток отмечено в группе контроля. Индуцирующее влияние дексаметазона на апоптоз также отмечено в группе с легкой формой астмы. В группе с тяжелой формой под влиянием дексаметазона содержание клеток с ранними признаками апоптоза оказалось наименьшим.

Продолжение культивирования Т-лимфоцитов в питательной среде в течение 6 суток показало относительную резистентность к развитию апоптоза в группах с легкой и тяжелой формой заболевания, в то время как в контрольной группе отмечено достоверное повышение содержания апоптотических клеток (рис. 7, б). Культивирование клеток с дексаметазоном привело к увеличению содержания апоптотических клеток во всех исследуемых группах (рис. 7, б).

Содержание Т-лимфоцитов, находящихся на поздней стадии апоптоза, после 3 суток культивирования было не значительным во всех исследуемых группах (рис. 8, а). Добавление дексаметазона стимулировало апоптоз в Т-лимфоцитах, за исключением группы больных тяжелой формой астмы, в которой клетки проявляли слабую чувствительность к индуцированному апоптозу.

Количество Т-лимфоцитов с признаками раннего % апоптоза на 0 сутки культивирования

4 .

2 Г^П йм

К к+д л л+д т т+д

Количество Т-лимфоцитов с признаками позднего е/0 апоптоза на 0 сутки культивирования

к к+д Л Л+Д т Т+Д

Количество Т-лимфоцитов с признаками раннего % апоптоза посла 3 дней культивирования

пН

кк+д

Л л-л

Т т+д

Количество Т-лимфоцитов с признаками раннего % апоптоза после б дней культивирования 80

70 60 50 40 30 20 10 0

П1

к к+д

л л+д

иг

ЩЩШШ

вшш

|Т т+д I

Рис. 7. Изменение содержания Т-лимфоцитов с ранними признаками апоптоза в группах больных легкой (Л) и тяжелой (Т) формами атопической бронхиальной астмой, а также в группе контроля (К) в процессе культивирования в присутствии и отсутствии в питательной среде дексаметазона (Д) (10"4М). а) Содержание Т-лимфоцитов после 3 дней культивирования; б) Содержание Т-лимфоцитов после 6 дней культивирования.

Количество Т-лимфоцитов с признаками позднего 0,0 апоптоза после 3 дней культивирования 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

1............................._.............._..... ................. .......

1................4 т.......................-4-........................................-

г I ш ГТ ' ¿У...... ]......рш Г •

К к+д

л л+д

тт+д

Количество Т-лимфоцитов с признаками позднего и апоптоза после 6 дней культивирования

45 т---------------------------------

35 4-зо ;

25 +20

15 + 10 5 0

к к+д

Рис. 8. Изменение содержания Т-лимфоцитов с поздними признаками апоптоза в группах больных легкой (Л) и тяжелой (Т) формами атопической бронхиальной астмой, а также в группе контроля (К) в процессе культивирования в присутствии и отсутствии в питательной среде дексаметазона (Д) (Ю^М). а) Содержание апоптотических Т-лимфоцитов после 3 дней культивирования; б) Содержаше апоптотических Т-лимфоцитэв после 6 дней культивирования.

На 6 сутки культивирования установлено повышение содержания клеток с поздними признаками апоптоза в контрольной группе (рис. 8, б). В группах с легкой и тяжелой формами астмы содержание апоптотических клеток оказалось достоверно ниже (р<0,05). Культивирование Т-лимфоцитов больных астмой с дексаметазоном в течение 6 суток оказало слабую стимуляцию апоптоза (рис. 8, б).

Поскольку были получены противоречивые данные относительно динамики пролиферативной активности Т-лимфоцитов и установлено угнетение апоптотического процесса у больных АБА, на следующем этапе работы мы провели изучение другого типа ПКГ - аутофагии.

Оценка аутофагии в Т-лимфоцитах больных бронхиальной астмой.

Мы провели морфологический анализ микрофотографий Т-лимфоцитов всех исследуемых групп (полученных с помощью метода электронной микроскопии) на 3 сутки культивирования. Поскольку в настоящее время отсутствует информация о влиянии дексаметазона на процесс аутофагии, мы исследовали его влияние на процесс аутофагии.

В результате экспериментальных работ мы установили, что большая часть Т-лимфоцитов здоровых доноров обладает морфологией, соответствующей апоптотическим изменениям на ранней стадии процесса, однако аутофагосомы не были выявлены (рис. 9, а). Культивирование с дексаметазоном привело к стимуляции поздних этапов апоптоза, что согласовывалось с результатами цитометрии (рис. 9, б). Активация аутофагии (наличие аутофагосом в клетках) под влиянием дексаметазона не была установлена.

Рис. 9. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови здорового донора после 3 дней культивирования.

а) Культивирование без дексаметазона;

б) Культивирование с дексаметазоном (КҐ'М).

Шкала- 500 нм, увеличение ХІ2000.

Я - ядро, ХР - хроматин, М -митохондрия, АГ — аппарат Гольджи, Л - лизосома. Стрелками показаны бяеббинги.

Анализ микрофотографий Т-лимфоцитов больных легкой формой АБА показал, что большая часть клеток сохраняет типичную морфологию пролиферирующих клеток (рис. 10, а). Но при этом обнаружены крупные аутофагасомы, внутри которых достаточно хорошо детерминированы различные клеточные компоненты (рис. 10, а, б). Инициация аутофагии в клетках вызвана истощением питательных веществ в среде в процессе культивирования. Можно предположить, что в отличие от контрольной группы, где стресс индуцирует апоптоз, в группе с легкой формой астмы Т-лимфоциты продолжают функционировать, получая необходимые соединения за счет «переваривания» собственных компонентов.

V .Лл.

Рис. 10. Микрофотографии Т-лимфоцитов больных легкой формой астмы после 3 дней культивирования. Культивирование без дексаметазона (а). Аутофагосома с различными клеточными компонентами внутри (б), увеличение Х72000; Фрагменты Т-лимфоцитов, образовавшиеся путем запуска ПКГ по типу II (в). Культивирование с дексаметазоном (Ю^М) (г), а, г-шкала 500нм, увеличение х12000. в - шкала 1 мкм,увеличение х12000. Я - ядро, ХР - хроматин, М - митохондрия. Стрелками показаны аутофагосомы

Помимо лимфоцитов с вышеописанными морфологическими изменениями были обнаружены фрагменты погибших клеток, в которых большая часть содержимого представлена аутофагосомами (рис, 10, в). Это может свидетельствовать о том, что гибель

клеток была опосредована запуском ПКГ по типу II или аутофагической гибели, а не апоптотической. Таким образом, в условиях снижения апоптотической активности в Т-клетках больных легкой формой астмы инициируется программа аутофагии, способствующая гибели клеток и поддержанию клеточного гомеостаза в целом.

Культивирование Т-лимфоцитов больных легкой формой заболевания с дексаметазоном сказывалось на стимулировании ранних этапов апоптоза и ингибировании аутофагии (рис. 10, г).

У больных тяжелой формой астмы наряду с характерными признаками ранних и поздних этапов апоптоза было отмечено повышенное содержание вакуолей и аутофагосом (рис. 11, а, б). То есть в Т-клетках возникает парадоксальная ситуация: с одной стороны инициируется программа гибели клетки - апоптоза, с другой стороны происходит активация аутофагии, способствующая выживанию Т-лимфоцитов. Вероятно, в данном случае аутофагия является необходимым стимулом апоптоза. Культивирование клеток данной группы больных с дексаметазоном способствовало интенсивной активации аутофагии: отмечено значительное увеличение количества и размера аутофагосом в клетках (рис. 11, в, г). При этом апоптотические проявления оказываются незначительными.

Рис. 11. Микрофотографии Т-лимфоцитов больных тяжелой формой астмой после 3 дней культивирования. Культивирование без дексаметазона (а); Культивирование с дексаметазоном (ЮМ) (в), а, в - шкала- 500 нм, увеличение х12000.

(в, г) Аутофагасомы, сформированные вокруг клеточного материала. Увеличение х 72000. Я - ядро, ХР - хроматин, М- митохондрия, Л -лизосома, МТ - мультивезикулярное тело, ЭПР -эндоплазмагический ретикулум. Стрелками показаны аутофагосомы

Оценка аутофагии в Т-лимфоцитах по уровню экспрессии 1X3 белка

В результате проведенных исследований мы установили, что в Т-лимфоцитах здоровых доноров экспрессия ЬСЗВ белка отсутствует (рис. 12, а). У больных как с легкой (рис. 12, б), так и с тяжелой формой АБА (рис. 12, в), выявлено наличие аутофагосом в Т-клетках, однако их количество и интенсивность экспрессии белка выше в группе больных с тяжелой формой астмой.

Аналогичные результаты были получены и на проточном цитофлуориметре, с помощью которого возможно количественно оценить интенсивность флуоресценции (рис. 13, а). Статистический анализ показал, что экспрессия ЬСЗВ белка достоверно выше (рП0,05) в группе с тяжелой формой астмы (рис. 13, б).

Рис. 12. Микрофотографии Т-лимфоицтов здорового донора и больных легкой и тяжелой формами бронхиальной астмы после 3 дней культивирования, (а) Установлено отсутствие экспрессии ЬСЗВ белка в Т-лимфоцитах здорового донора; (б) Экспрессия ЬСЗВ белка на аутофагасомах в Т-лимфоцитах больных легкой формой астмы; (в) Экспрессия ЬСЗВ белка на аутофагасомах в Т-лимфоцитах больных тяжелой формой АБА. Увеличение микрофотографий х100. Стрелками показаны аутофагосомы, экспрессируюгцие ЬСЗВ белок.

Рис. 13. Количественная оценка и интенсивность экспрессии ЬСЗВ белка в Т-лимфоцитах больных легкой (1) и тяжелой (2) формами астмы. Клетки окрашены антителами к ЬСЗВ белку, коньюгированные с ИТС. В каждом образце было собрано и проанализировано 10000 событий.

Для переваривания клеточных компонентов, подлежащих удалению, необходимо слияние аутофагосом с лизосомами, содержащие гидролазы, в результате чего образуются аутофаголизосомы (МеИгроиг, 2010). Поэтому количество аутофагосом в клетках должно коррелировать с количеством лизосом.

В результате проведенных исследований мы установили наличие лизосом в Т-клетках больных как легкой, так и тяжелой формами астмы (рис. 14, б, в). Их количество и интенсивность экспрессии была выше в группе больных с тяжелой формой АБА (рис. 14, в).

ЬСЗ белок (микротубилин-связанный белок легкой цепи 3) присутствует в цитозоле большинства типов клеток и существует в трех изоформах (А, В и С). При запуске аутофагии под воздействием цистеиновой протеазы А1§4 он протеолитически разрушается, образуя ЬСЗ-1 форму (КаЬеуа, 2000). Отщепленный ЬСЗ-1 белок затем активируется с помощью Е1 -подобного фермента и переносится к белку до его

конъюгации с фосфатидилэтаноламином и образования 1ХЗ-П формы (КНопэку, 2003). 1ХЗ-П белок вовлекается в растущую фагофору и распологается на внутренней и внешней мембране аутофагосомы. Преобразование ЬСЗ-1 (18 кДа) в ЬСЗ-П (16 кДа) может быть использована для мониторинга аутофагии.

Рис. 14. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови здорового донора и больных с различными формами атопической бронхиальной астмой в процессе культивирования (72 часа). Показана активация лизосом в Т-лимфоцитах: а) отсутствие лизосом в Т-лимфоцитах здорового донора; б) активация лизосом в Т-лимфоцитах больных легкой формой астмы; в) активация лизосом в Т-лимфоцитах больных тяжелой формой астмы. Увеличение микрофотографий: хЮО. Клетки окрашены акридиновым сранжевым. Стрелками показаны лизосомы (оранжевый цвет).

Для детекции 1X3-11 белка Т-лимфоциты культивировали в течение 3 суток. Поскольку дексаметазон является индуктором апоптоза, мы также использовали этот глюкокортикоид для изучения его влияния на процесс аутофагии.

Результаты иммуноблоттинга согласовывались с результатами электронной и флуоресцентной микроскопий. Мы установили, что у здоровых доноров маркерный белок аутофагии присутствует в общей (ЬСЗ-1) форме, которая находится в цитоплазме и не связана с мембраной аутофагосом. При этом дексаметазон не оказывал влияния на образование ЬСЗ-П формы (рис. 15, лунки 2,3).

Рис. 15. Экспрессия ЬСЗВ белка в двух изоформах (I и II) в Т-лимфоцитах после 3 дней:

М - белковый маркер 2,3 - здоровый донэр 4,5 - легкая форма АБА 6,7 -тяжелая форма АБА (+) -культивирования с

дексаметазоном (-) - культивирования без дексаметаэона.

1 м 2 3 - + 4 5 - + 6 7 +

кДа 220 ттг

120 100 80

6В 50 щш ig—1 — а-Тубулин

20 15 щ — —' - LC3-I Ф LC3-II

В группе с легкой формой астмы ЬСЗ белок представлен только I формой, и не обнаружено II формы белка, связанного с аутофагосомой (рис. 15, лунка 4). Можно предположить, что содержание 1.СЗ-П белка в клетках незначительно, что повлияло на его детекцию. Однако учитывая данные литературы о том, что запуск аутофагии связан с протеолитическим разрушением 1X3 белка с образованием 1X3-1 формы (КаЬеуа, 2000), можно предположить, что процесс аутофагии в Т-клетках больных легкой формой астмы находится на стадии инициации.

Результаты исследования влияния дексаметазона на преобразование форм 1X3 белка показали, что глюкокортикоид не отвечает за образование 1X3-II белка, т.е. проявляет резистентность по отношению к формированию аутофагосом (рис. 15, лунка 5). Дополнительным подтверждением полученным результатам являются данные электронно-микроскопического изучения Т-лимфоцитов больных легкой формой заболевания, которые показали, что дексаметазон способствует интенсивной активации апоптоза клеток, но не аутофагии (рис. 10, г).

В лизатах клеток больных тяжелой формой астмы 1X3 белок присутствовал и в форме I, и в форме II (рис. 15, лунка 6). Причем под воздействием дексаметазона большая часть 1X3 белка преобразована во II форму (рис. 15, лунка 7).

Подводя итог по полученным результатам можно сказать, что стрессовые условия влияют на активацию аутофагии в Т-лимфоцитах больных астмой в отличие от здоровых доноров. Но проявления аутофагии были различными в зависимости от тяжести астмы.

Мы предполагаем, что в группе с легкой формой астмы изначально в Т-клетках активируется аутофагия и затем переходит в ПКГ II типа (аутофагическую гибель), компенсируя, таким образом, недостаточное проявление апоптоза.

В группе с тяжелой формой астмы интенсивная активация аутофагии на фоне снижения апоптотической активности является причиной длительного функционирования клеток и персистенции бронхиальной астмы.

Поэтому на следующем этапе исследований была поставлена задача провести анализ содержания белков теплового шока Шр70 и №р90, которые могут выступать в качестве регуляторов программированной клеточной гибели в Т-лимфоцитах больных бронхиальной астмой.

Оценка экспрессии белков теплового шока 118Р70 и Н8Р90 в процессе культивирования Т-лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой

В результате проведенных исследований мы показали, что культивирование Т-лимфоцитов больных легкой формой астмой в течение 3 дней инициирует повышение внутриклеточного белка теплового шока №р90, в отличие от другого белка - Шр70 (рис. 16, лунка 4). Схожая картина была отмечена и в клетках, которые культивировались с дексаметазоном (рис. 16, лунка 5).

В Т-лимфоцитах больных тяжелой формой астмой установлено повышение содержания как белка НБр90, так и Шр70 (рис. 16, лунка 6). Учитывая цитопротекторное свойство БТШ и результаты морфо-биохимических исследований Т-клеток можно предположить, что экспрессия Нзр90 и №р70 у больных тяжелой формой АБА приводит к торможению апоптоза и одновременной активации аутофагии. Дексаметазон снижал содержание обоих белков теплового шока в клетках (рис. 16, лунка 7), что сопровождалось повышением уровня апоптоза (рис. 7, 8).

Рис. 16. Содержание внутриклеточных белков теплового шока ЖР70 и Н8Р90 после 3 дней ^льтивирования: М - маркер 2,3 - здоровый донор 4,5 - легкая форма АБА 6, 7 - тяжелая форма АБА «+»- культивирование с дексаметазоном. «-» - культивирование без дексаметаэона

Мы также проанализировали содержание белков теплового шока во всех исследуемых группах на 6 сутки культивирования (рис. 17). Сравнительный анализ белкового состава (Н8Р70 и Н8Р90) показал наличие белка теплового шока 90 в Т-лимфоцитах больных астмой с разной степенью тяжести заболевания. Установлено появление белка ЩР70 только в Т-лимфоцитах больных тяжелой формой астмой (рис. 17, лунка 6).

Культивирование Т-лимфоцитов с дексаметазоном в течение 6 суток снижало содержание БТШ у здоровых доноров и больных тяжелой формой астмой (рис. 17, лунки 3,7). В Т-лимфоцитах больных легкой формой астмой отмечено незначительное снижение экспрессии ШР90 (рис. 17, лунка 5). При этом содержание НЭР70 не было установлено в Т-клетках, которые культивировались с дексаметазоном.

Рис. 17. Содержание внутриклеточных белков теплового шока Н8Р70 и Н8Р90 после 6 дней культивирования: М - маркер 2,3 - здоровый донор 4,5 - легкая форма АБА 6,7 - тяжелая форма АБА «+»- культивирование с дексаметазоном «-»- культивирование без дексамегазона

Ранее считалось, что белки теплового шока являются внутриклеточными белками, однако в последнее время доказано их существование во внеклеточной среде - в тканевых жидкостях человека и животных и кондиционной среде культур клеток (Евдонин, 2009).

Поскольку в клеточных лизатах белки ШР70 и ЩР90 были установлены не во всех исследуемых группах, либо их содержание было не значительным, мы предположили, что это может быть связано с их выходом во внеклеточное пространство. С целью выяснения содержания внеклеточных белков теплового шока мы исследовали содержание культуральной среды, в которой находились Т-лимфоциты. Исследование проводилось на 3 и 6 сутки культивирования.

Проведенный анализ показал секрецию белка теплового шока 70 из Т-лимфоцитов во внеклеточную среду на 3 сутки культивирования в группе больных тяжелой формой астмой (рис. 18, лунка 6). Аналогичные результаты получены при культивировании клеток с дексаметазоном (рис. 18, лунка 6). Анализ культуральной среды, в которой

1 2 3 М - + 4 5 6 7 - + - +

кДа

220 —

120 100 80 ,•<» «Н> #* •»<«•* 35Р90 * § Н8Р70

60 * а-Тубулин

1 2 3 4 5 6 7

М - + - + - +

кДа

220

120 100 80 ....Ш ** ГОР90

60 ** ШШ Н8Р70

50 —. лтшь, о-Тубулин

находились Т-лимфоциты здоровых доноров и больных легкой формой астмой, показал отсутствие внеклеточных белков у этих групп (рис. 18, лунки 2,3,4,5).

На 6 сутки культивирования Т-лимфоцитов больных тяжелой формой астмы выход Н8Р70 во внеклеточную среду сопровождался выходом другого шаперона - ШР90 (рис. 19, лунка 6). Присутствие дексаметазона в культуральной среде сказывалось на снижении внутриклеточного белка ШР90 и не влияло на содержание НЭР70 (рис. 19, лунка 7). Результаты исследований двух других групп (здоровых доноров и больных легкой формой астмы) на 6 сутки культивирования совпадали с результатами, полученными на 3 сутки (рис. 19, лунки 2,3,4,5).

Рис. 18. Содержание внеклеточных белков теплового шока ШР70 и ШР90 в культуральной среде после 3 дней культивирования: М - маркер 2,3 - здоровый донор 4,5 - легкая форма АБА 6, 7 - тяжелая форма АБА «+»- культивирование с дексаметазоном «-» - культивирование без дексаметазона

Рис. 19. Содержание внеклеточных белков теплового inoKaHSP70 и HSP90 в культуральной среде после 6 дней культивирования: М - маркер 2,3 - здоровый донор 4, 5 - легкая форма АБА 6,7- тяжелая форма АБА «+» - культивирование с дексаметазоном «-» - культивирование без дексаметазона

В настоящее время в литературе накапливаются сведения о том, что внеклеточный Hsp70 обладает множественными функциями (Евдонин, 2009). Показано, что растворимый рекомбинантный белок Hsp70 способен стимулировать пролиферацию NK-клеток, увеличивать их миграцию к опухолевым клеткам и цитолитическую активность против этих клеток (Multoff, 1999).

Опираясь на эти результаты можно предположить, что в случае периферической крови больных тяжелой формой астмы внеклеточный Hsp70 способен активировать NK-клетки и стимулировать их миграцию в зону воспаления, что приводит к уменьшению их содержания в периферической крови, в отличие от больных легкой формой АБА.

В отношении Hsp90 имеются данные относительно его роли в активации комплекса прекалликреин-кининоген на поверхности эндотелиальных клеток сосудов человека, который, как считается, участвует в развитии гиперреактивности бронхов при астме (Joseph, 2002).

Полученные результаты о содержании Hsp90 во внеклеточном простанстве больных тяжелой формой АБА в условиях in vitro, могут послужить основой более глубокого и детального изучения данного белка теплового шока in vivo.

1 2 3 4 5 6 7 М - + - + - +

SmSí щШШк щШЯт HSP90 ' " * HSP70

ШшщШШ ¡¡j¡¡IB

— . [ ЩШІІ^Ш;Щ

—• нні Ц

1 2 3 4 5 6 7

м - + - + - +

кДа

XxU 100 1Z 80 —1 60 ** 50 П. 40 ■и -и - HSP90 ' - HSP70

Характеристика клеточного и гуморального звеньев иммунитета

На первом этапе исследования, мы определили содержание Т-клеток в периферической крови больных астмой и здоровых доноров. Результаты показали, что суммарное количество СОЗ позитивных Т-лимфоцитов во всех исследуемых группах

£ 100 5 соз

« 80 я ; «о т гі- п

и | 40 1

| 20 ] 1 л !

контроль лета» тяжела* формі АБА форма АБА

Рис. 20. Содержание СШ+ Т-лимфоцитов в периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой (АБА) и у здоровых доноров. Достоверных отличий между исследуемыми группами не было выявлено.

В случае клеточно-опосредованного иммунного ответа главная роль принадлежит СЭ8+ Т-лимфоцитам и натуральным киллерам (Ж) (Ройт, 2007). Изменения в содержании этих клеток в группе с легкой формой АБА были незначительными и находились на уровне контроля (рис. 21). Однако необходимо отметить большой разброс индивидуальных показателей в содержании натуральных киллеров (рис. 21, б). При легкой форме АБА патологические изменения, лежащие в основе заболевания, выражены незначительно, реакция иммунной системы на антиген не носит постоянного характера, воспалительные явления минимальны. Именно этим может быть объяснен широкий разброс индивидуальных показателей и разнонаправленные изменения.

У больных с тяжелой формой АБА установлено достоверное снижение количества цитотоксических Т-лимфоцитов и К1К клеток по сравнению с группами контроля и легкой формой астмы (рис. 21), что подтверждает участие клеточного звена иммунитета в патогенезе больных тяжелой формой АБА. Уменьшение количества натуральных киллеров даже до 4-5% менее чем в половине случаев сопровождается угнетением функциональной (цитотоксической) активности этих клеток. Снижение количества обоих типов цитотоксических клеток — как СБ8+Т-лимфоцитов, так и СВ16+/56+ ТЖ.-клеток при тяжелой форме атопической бронхиальной астмы связано с заболеванием и носит устойчивый характер.

В развитие бронхиальной астмы могут быть вовлечены различные иммунопатогенетические механизмы и клетки иммунной системы (\Vills-Karp, 2004), одними из которых являются ЫКТ-лимфоциты. ЖТ-клетки - уникальная популяция Т-лимфоцитов, характеризующаяся коэкспрессией рецепторов Т-клеток и различных рецепторов №С-клеток (Игт^и, 2010).

Мы установили, что в периферической крови всех исследуемых групп, присутствует популяция Т-лимфоцитов, коэкспрессирующая маркеры ИК-клеток (рис. 22). Их содержание было значительно выше у больных тяжелой формой заболевания по сравнению с другими группами. В группе легкой формы астмы содержание ЫКТ-клеток практически не отличалось от контроля. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что Ж.Т-клеткам принадлежит одна из ключевых ролей в патогенезе тяжелой формы заболевания.

В развитии воспаления дыхательных путей при бронхиальной астме важная роль принадлежит С04+ Т-лимфоцитам (¿оБку, 2009). Установлено, что большую часть СБ4+ Т-клеток в очаге аллергического воспаления составляют ТЬ2-лимфоциты (Со1ауйа, 2000), которые продуцируют 1Ь-4,1Ь-5,1Ь-10,1Ь-13 и участвуют в формировании гуморального иммунного ответа (Колхир, 2010). Они имеют прямое отношение к феноменам, наблюдаемым при аллергии и бронхиальной астме.

С016+56

Рис. 21. Содержание (а) цитотоксических Т-лимфоцитов (С08+) и (б) натуральных киллеров (С016+56+) в периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой (АБА) и здоровых доноров.

* достоверные отличия между группой больных тяжелой АБА и нормой (р<0,05); ** достоверные отличия между группой больных тяжелой АБА по сравнению с двумя другими группами (р<0,05);

*** достоверные отличия между группами с легкой и тяжелой АБА (р<0,05).

СОЗ+16+56+

Рис. 22. Содержание ЫКТ-клеток (СОЗ+СЭ16+56+) в периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмы (АБА) и здоровых доноров.

* достоверные отличия между группой больных тяжелой формой АБА и двумя другими группами (р<0,05)

В нашей работе было проведено исследование содержания СБ4+ Т-лимфоцитов в зависимости от степени тяжести астмы (рис. 23). Подсчет относительного числа СБ4+ Т-лимфоцитов показал отсутствие изменений в численности данной субпопуляции у больных с легкой формой астмы по отношению к контрольной группе. Количество СВ4+ клеток коррелировало с уровнем В-лимфоцитов, которое соответствовало норме, а содержание 1§Е, А, М и в в группе практически не отличалось от контроля (рис. 24). Несмотря на то, что активация гуморального иммунитета в группе с легкой формой заболевания выражена незначительно, имеется тенденция к повышению количества сывороточных иммуноглобулинов, на что указывает однонаправленный разброс значений, схожий с группой больных тяжелой формой АБА (рис. 24).

Увеличение количества СБ4+ Т-лимфоцитов в группе с тяжелой формой АБА свидетельствует о значительной напряженности гуморального иммунитета (рис. 23). В сравнительном анализе иммуноглобулинов сыворотки крови больных тяжелой формой АБА установлено увеличение всех классов иммуноглобулинов, в частности 1§Е (рис. 24),

что связано с высоким уровнем С04+ Т-клеток, стимулирующие синтез специфических ^Е-антител В-лимфоцитами.

Результаты проведенных иммунологических исследований свидетельствует об изменении функционального статуса Т-клеток у больных с тяжелой формой астмы. Особенность иммунологической реактивности при тяжелой форме АБА, в отличие от группы контроля и легкой формы, связана со снижением активности клеточно-опосредованного иммунного ответа с участием цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров. Снижение уровня СБ8+ Т-лимфоцитов сопровождается повышением другой субпопуляции Т-клеток - CD4+. Увеличение содержания СЭ4+ Т-лимфоцитов коррелирует с повышением уровня В-лимфоцитов и иммуноглобулинов класса Е.

£ 40

р- ■ТО

е 20

Сй4

СЭ19

¡.20

715 т

Но

І I

легкая форма АБА

Рис. 23. Содержание СВ4+ Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов (СР19+) в периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмы (АБА) и здоровых доноров.

* достоверные отличия по отношению к норме (р<0,05).

|дм

Я 0.40 о

И 0,20

контроль легкая тяжелая форма АБА форма АБА

іба

4.50 І?М0

З з.»

а З.Ю

I 1,58

и мв

0,50 О.ОО

контроль легкая тяжели форма АБА форма АБА

К. 16,00

Е" 12,00 |

^ 4.00 0.00

контроль легкая тяжелая форма АБА форма АБА

йя» | дао ?зоо

¡20«

И 100 о

да.........и

ьовтроль легкая тяжелая _формі АЕА форма АЕА

Рис. 24. Содержание иммуноглобулинов классов А, М, О я Е в сыворотке крови

больных легкой и тяжелой формами

атопической

бронхиальной астмой (АБА) и здоровых доноров.

Большое значение в оценке состояния иммунной системы имеет соотношение С04+ и СБ8+ Т-лимфоцитов (величина иммунорегуляторного индекса (ИРИ)) (Симонова, 2001). В литературе имеется много данных относительно изменения ИРИ при астме. Однако они очень противоречивы.

В нашем исследовании показатель ИРИ значительнее менялся у больных с тяжелой формой АБА (рис. 25). Величина индекса у больных с легкой формой находилась на уровне контроля. Однако необходимо отметить больший разброс значений индивидуальных показателей, чем в контроле, что, видимо, свидетельствует об отсутствии однозначного ответа иммунной системы на антигенную стимуляцию.

Поскольку Т-клетки играют важную роль в иммунной реактивности, локус Т-клеточного рецептора уже давно считается важным кандидатом, восприимчивый к таким заболеваниям иммунной системы, как астма, атопия и аутоиммунные заболевания (ДоИет, 2003). Концепция аутоиммунитета как одной из составляющих в развитии бронхиальной астмы признается не всеми авторами. Однако имеется ряд работ, подтверждающие участие аутоиммунных процессов в патогенезе данного заболевания (Мельницкая, 1973*; Иойет, 2003; Уе, 2006).

Рис. 25. Изменение соотношения С04+/аЭ8+ Т-лимфоцитов в периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмы (АБА) и здоровых доноров.

** - достоверные отличия между группой больных тяжелой АБА по сравнению с двумя другими группами (р<0,01)

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что в сыворотке крови больных как легкой, так и тяжелой формой АБА наблюдается достоверное (р<0,05) по сравнению с контролем повышение уровня ДИК. В частности наблюдалось повышение мелких и средних иммунных комплексов, которые играют важную роль в патологических процессах (рис. 26).

Рис. 26. Концентрация циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК)

гигантских, крупных,

средних и мелких размеров в сыворотке крови здоровых доноров и больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой (АБА).

♦Достоверные отличия по отношению к норме (р<0,05).

При исследовании содержания ЦИК во всех группах, было установлено, что соотношение концентраций ЦИК (коэффициент аутоиммунизации (КА)) в сыворотке

4 С04/С08

І 3'5 I

I 3 :

контроль легкая тяжелая

форма АБА форма АБА

її

і к

• £

Гигантские ЦИК (3%)

контроль легка 53 тяжелая __форма АБА форма АБА

Средние ЦИК (4%)

=Г 0,6 £ 1° |од

контроль легкая тяжелая

форма АБА форма .ЛБА

Т 0.8

а §«.« Ї

= 0,4 І

I ОД 5 о

|м

Ё од

Крупные ЦИК (3,5%)

контроль легкжя тяжела» форма АБА форма АБА

Мелкие ЦИК (7%)

контроль легкая тяжелая форма АБА форма АБА

больных АБА по отношению к здоровым донорам возрастало (по медиане) линейно с уменьшением размера ЦИК.

При легком течении АБА: коэффициент КА гигантских ЦИК (3%) увеличивался в 0,96 раз; крупных ЦИК (3,5%) - в 1,6 раз; КА средних ЦИК (4%) - в 1,51 раз; КА мелких ЦИК (7%)-в 1,86 раз.

При тяжелом течении АБА: коэффициент КА гигантских ЦИК (3%) увеличивался в 1,06 раз; КА крупных ЦИК (3,5%) - в 2 раза; КА средних ЦИК (4%) - в 2,03 раза; КА мелких ЦИК (7%) - в 2,30 раза.

Если коэффициент КА выше 1,5, то наличие аутоиммунного компонента становится достоверным. Таким образом, у больных с легкой и тяжелой формами АБА установлено участие иммунопатологических реакций в патогенезе заболевания.

При оценке патогенности ЦИК мы установили, что коэффициент патогенности достоверно (р<0,05) повышается у больных АБА по отношение к контрольной группе (рис. 27). Выявленное повышение уровня ЦИК мелких и средних размеров в сыворотке больных АБА, а также повышение иммунорегуляторного индекса у больных тяжелой формой АБА до 2,5 может быть показателем предрасположенности этой категории больных к развитию аутоиммунных реакций.

Рис. 27. Содержание патогенных субфракций в популяции ЦИК в группе контроля и больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой (АБА).

'Достоверные отличия по отношению к норме (р<0,05).

Концепция относительно роли программированной клеточной гибели в патогенезе атопической бронхиальной астмы, несмотря на обширные данные литературы, оставалась не до конца изученной и противоречивой. Повышенный в последние годы интерес к процессу аутофагии при различных физиологических и патологических состояниях стал основой для ее изучения в представленной работе. Полученные результаты позволяют говорить, что процесс ПКГ Т-лимфоцитов при развитии бронхиальной астмы не так однозначен, как считалось ранее. Помимо апоптоза, свой вклад в патологическое развитие астмы может вносить аутофагия. А в качестве регуляторов переключения с одной программы гибели на другую могут выступать белки теплового шока Hsp70 и Hsp90.

ВЫВОДЫ

1. Установлено слабое проявление биохимических признаков спонтанной апоптотической активности Т-лимфоцитов у больных атопической бронхиальной астмой in vitro. Чувствительность Т-клеток к индуцированному апоптозу снижалась с увеличением тяжести заболевания;

2. В Т-лимфоцитах больных атопической бронхиальной астмой показана активация аутофагии: в группе с легкой формой заболевания аутофагия приводит к гибели Т-лимфоцитов по пути программированной клеточной гибели II типа. В группе с тяжелой формой астмы аутофагия способствует устойчивости клеток к гибели и их длительному функционированию;

Коэффициент патогенности ЦИК (4% / 3%)

1,4 1Д I 0,8 0,6 0,4 0,2 -

5,3095

0,8435

.........

контроль легкая тяжелая форма АБА форма АБА

3. У больных легкой формой астмы дексаметазон ингибирует аутофагию в Т-лимфоцитах, а у больных с тяжелой формой заболевания способствует интенсивной активации процесса;

4. Установлено повышение содержания внутриклеточного белка Hsp90 в Т-лимфоцитах больных легкой формой астмы в процессе культивирования. В Т-лимфоцитах больных тяжелой формой бронхиальной астмы экспрессия внутриклеточного Hsp90, сопровождалась экспрессией Hsp70;

5. Показано, что устойчивость Т-лимфоцитов к апоптозу совпадает с повышением содержания внутриклеточного белка HSP90 в Т-лимфоцитах больных легкой формой АБА;

6. Ингибирование апоптоза (ПКГ I типа) Т-лимфоцитов в условиях стресса (истощение питательных веществ) у больных тяжелой формой астмы сопровождается повышением содержания внутриклеточных белков теплового шока (HSP70 и HSP90) и их секрецией во внеклеточное пространство;

7. Установлено изменение субпопуляционного состава лимфоцитов у больных тяжелой формой астмы: при торможении апоптоза, ведущего к накоплению Т-лимфоцитов, происходит увеличение содержания CD4+ Т-клеток, что приводит к активации гуморального звена иммунитета. Повышение уровня ЦИК мелких и средних размеров является показателем предрасположенности этой категории больных к развитию аутоиммунного ответа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Скибо Ю.В. Индукция аутофагии в Т - лимфоцитах периферической крови больных атопической бронхиальной астмой / Ю.В. Скибо, А.А. Пономарева, И.Д. Решетникова, З.И. Абрамова// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2012. - Т.VII. - №3. - С.146 -150. (перечень ВАК), автор - 0,3пл.

2. Скибо Ю.В. Особенности апоптоза лимфоцитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой / Ю.В. Скибо, Н.1П. Курмаева // Практическая медицина. - 2012. - № 6(61). - С. 62-68. (перечень ВАК), автор - 0,3 пл.

3. Скибо Ю.В. Структура основных популяций лимфоцитов у больных атопической бронхиальной астмой разной степени тяжести / Ю.В. Скибо, Н.Ш. Курмаева, В.Н. Цибулькина,

3.И. Абрамова // Практическая медицина. - 2012. - №9(65). - С. 170-177. (перечень ВАК), автор -0,25 пл.

4. Скибо Ю.В. Содержание NKT клеток в периферической крови больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой / Ю.В. Скибо, Н.Ш. Курмаева, В.Н. Цибулькина, З.И. Абрамова // Российский иммунологический журнал. - 2012. - № 6(14). - №3(1). - С. 135-136.(перечень ВАК), автор - 0,18 пл.

5. Skibo Y.V. Adhesion force of T-lymphocytes in the pathogenesis of patients with light and severe bronchial and atopic asthma / Y.V. Skibo, C.J.A. Vodounon, M.V. Morozov, B.M. Lamine, Z.I. Abramova et al. // Int J Biol Med Res. - 2012. - V. 3(3). - P: 2138-2146.

6. Vodounon A.C. Morphological and biochemical characteristics of apoptosis lymphocytes of peripheral blood in the pathogenesis of bronchial and atopic asthma of light and serious severity /

A.C.Vodounon, Y.V.Ckibo, Z.I.Abramova [et al.]// Research and Reviews in Biosciences. - 2012. - V. 6 -1.8. - P.210-220.

7. Vodounon C.J.A. The implication of morphological characteristics in the etiology of allergic asthma disease and in determining the degree of severity of atopic and bronchial asthma / C. J.A.Vodounon,

B.M. Lamine, Y.V. Pynthyk, S. Alphonse, Z.I. Abramova//Asian Journal of cell biology. -2011.-V. 6(2).-P: 65-80.

8. Пинчук Ю.В. Особенности программируемой клеточной гибели лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой / Ю.В. Пинчук, A.C. Водунон, И.Г. Мустафин, З.И. Абрамова // Российский аллергологический журнал. - 2010. - №4. - 32-39.(перечень ВАК), автор - 0,2 пл.

9. Пинчук Ю.В. Биохимические и морфологические изменения лимфоцитов при апоптозе у больных атопической бронхиальной астмой / Ю.В. Пинчук, A.C. Водунон, М.МД. Нсангу, И.Г. Мустафин, АА. Пономарева, З.И. Абрамова // Вестник Оренбургского Государственного Университета - 2008. — №11. - С. 159 -166. (перечень ВАК), автор-0,3 пл.

10. Пинчук Ю.В. Апопгоз лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой. Его морфологические и биохимические изменения / Ю.В. Пинчук, A.C. Водунон, И.Г. Мустафин, A.A. Пономарева, З.И. Абрамова //Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». - Казань. - 2008. - № 4,А. - С. 420 - 431.

11. Абрамова, З.И. Патогенез и программируемая гибель клетки: особенности апоптоза лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой / З.И Абрамова, Ю.В. Скибо. // Избранные главы фундаментальной и трансляционной медицины,- Казань: Изд-во Казанского университета, 2012,- С. 390-405.

12. Скибо Ю.В. Бронхиальная астма. Иммунологические аспекты заболевания. Патологическое нарушение в развитии лимфоцитов больных Атопической Бронхиальной Астмой / Ю.В. Скибо, З.И. Абрамова, С.А.Д. Водунон // LAP Lambert Academic Publishing GmbH & Co.KG. -Saarsbrucken Germany, 2011.-104 стр.

13. Скибо Ю.В. Аугофагия лимфоцитов при развитии атопической бронхиальной астмы / Ю.В. Скибо З.И.Абрамова // Здоровье человека в XXI веке: Сб. научных статей под ред.Ксембаева С.С. -Казань, 2012,-С.741-746.

14. Kurmaeva, N.The content of natural killer T cells in the peripheral blood of patients with mild and severe atopic asthma/N.Kurmaeva, Yu.Skibo, V.Tsybulkina, Z.Abramova, A.Luntsov //International Severe AsthmaForum (ISAF). - Sweden, 2012.-P.22.

15. Скибо Ю.В. Характеристика апоптоза и аутофагии Т-лимфоцитов в зависимости от степени тяжести бронхиальной астмы/ Ю.В. Скибо З.И.Абрамова // Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий: Сб. трудов III Международной Интернет-конференции - Казань, 2012. — С. 260-262.

16. Skibo Y.V. Dynamic adhesion of T-lymphocytes from patients with bronchial asthma revealed by atomic force microscopy/Y.Y.Skibo, Z.I.Abramova//The 4th Int. IMBG conference for young scientists "Molecular biology: Advances and perspectives". -Ukraine, 201L-P.163.

17. Скибо Ю.В. Особенности программируемой клеточной гибели лимфоцитов при развитии бронхиальной астмы/ Ю.В. Скибо З.ИАбрамова // Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии: Сб.трудов I Всерос. интернет-конференции. - Казань, 2010. - С. 143-147.

18. Пинчук Ю.В. Морфологические нарушения апоптоза лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой / Ю.В. Пинчук, A.C. Водунон, З.И. Абрамова // Постгеномная эра в биолопш и проблемы биотехнологии: Материалы II Международной научно-практической конференции. - Казань, 2008.-С.104-105.

19. Пинчук Ю.В. Морфологические изменения лимфоцитов периферической крови больных атопической бронхиальной астмой/ Ю.В. Пинчук, З.И. Абрамова // Дни иммунологии в Санкт-Петербурге: Сб. материалов ХШ Всероссийского форума с международным участием им. академика В.И.Иоффе. - Санкт-Петербург, 2009. - С. 245-246.

20. Пинчук Ю.В. Анализ апоптоза лимфоцитов больных бронхиальной астмой /Ю.В. Пинчук, З.И. Абрамова// Симбиоз Россия 2009: материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. - Пермь, 2009.-С. 312-314 с.

21. Пинчук Ю.В. Нарушение программируемой клеточной гибели при развитии бронхиальной астмы/ Ю.В. Пинчук, З.И. Абрамова // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармаюлогии: Сб. материалов X международного конгресса. — Казань, 2009. - С. 78-79.

22. Пинчук Ю.В. Патологическое нарушение в развитии и удалении лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой/Ю.В. Пинчук, З.И. Абрамова//Сб.материаж>в XVI Международной конференции студентов,аспирантов и молодых учёных.-Москва,2009,- С.29-30.

23. Пинчук Ю.В. Особенности биохимических и морфологических показателей лимфоцитов при апоптозе у больных атопической бронхиальной астмой / Ю.В. Пинчук, A.C. Водунон, З.И. Абрамова // Сборник трудов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биолошв. - Новосибирск, 2008 - С.775.

24. Пинчук Ю.В. Морфологические нарушения апоптоза лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой / Ю.В. Пинчук, A.C. Водунон, З.И. Абрамова // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии. Материалы научно-практической конференции. Казань, 15-16 сентября 2008 г.,Казань, 2008,- С. 104-105.

25. Пинчук Ю.В. Биохимические и морфологические изменения лимфоцитов при апоптозе у больных атопической бронхиальной астмой / Ю.В. Пинчук, A.C. Водунон, З.И. Абрамова // Санкт-Петербургские научные чтения - 2007: Сб. материалов II Международного молодежного медицинского конгресса. - Санкт-Петербург, 2007. -17- 18.

26. Водунон A.C. Влияние дексаметазона на степень деградации ДНК лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой/ A.C. Водунон, Ю.В. Пинчук, З.И. Абрамова //Санкт-Петербургские научные чтения - 2007: Сб. материалов II Международного молодежного медицинского конгресса. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 18-19.

27. Скибо Ю.В. Методы исследования программируемой клеточной гибели: учебно-методическое пособие для магистров по курсу "Теория апоптоза"/ Рекомендовано УМО РАЕ по классическому университетскому и техническому образованию в качестве учебника для студентов ВУЗов, обучающихся по направлению подготовки: 020200.68-"Биология" (Магистратура)ЛО. В. Скибо, З.И. Абрамова,- Казань: ФГАОУВПОКФУ, 2011.-56C.

Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу:

420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание КФУ, к 104В, отдел аттестации, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.081.08 д.б.н., проф. Абрамовой З.И., факс: (843)238-76-01. E-mail: ziabramova@mail.ra

Напечатано с готового оригинал - макета

Ответственный за выпуск А.Г. Залялова Техническое обеспечение Д.3. Ахметова

Подписано в печать 16.01.2013. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,5. Договор № 1 от 16.01.2013. Тираж 100.

Лаборатория оперативной печати Казанского педагогического колледжа 420087, г. Казань, ул. Даурская, дом 30, ком. 49 а. 420036, г. Казань, ул. Побежимова, 47а, тел. 571-14-29.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Скибо, Юлия Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Программированная клеточная смерть и иммунная система

1.1.1. Биохимические проявления апоптоза

1.1.2. Морфологические проявления апоптоза

1.1.3. Механизм апоптотической клеточной гибели

1.2. Физиологическая роль аутофагии

1.2.1. Классификация аутофагии

1.2.2. Молекулярные механизмы аутофагии

1.2.3. Аутофагия как механизм клеточной смерти

1.3. Белки теплового шока: разнообразие, структура и функции

1.3.1. Физиологическая роль белка теплового шока Н8Р

1.3.2. Физиологическая роль белка теплового шока НБР

1.4. Функциональное взаимодействие между программированной клеточной гибелью и белками теплового шока

1.4.1. Анти-апоптотическая роль белков теплового шока

1.4.2. Влияние апоптоза на индукцию белков теплового шока

1.4.3.Взаимодействие между аутофагией и белками теплового шока

1.5. Основные клеточные популяции иммунного ответа

1.5.1. Иммунорегуляторные субпопуляции Т-лимфоцитов

1.6. Механизмы развития атопической бронхиальной астмы

1.6.1. Роль программированной клеточной гибели в развитии воспаления при бронхиальной астме

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели T-лимфоцитов при атопической бронхиальной астме"

Основным принципом функционирования физиологических систем является поддержание биологической целостности организма. На клеточном уровне данный процесс реализуется за счет регуляторного влияния эфферентных сигналов, которые поддерживают сложное состояние равновесия между интегративными физиологическими процессами: пролиферацией, дифференцированием и программируемой клеточной гибелью (ПКГ). ПКГ привлекает к себе внимание по двум причинам. Апоптоз или программированная смерть клетки по типу I является звеном многих биологических процессов у многоклеточных организмов (Ярилин, 1999; Green, 2009). Он связан с процессом развития и старения клеток, выполняя гомеостатическую функцию удаления поврежденных клеток (Барышников, 2002). Нарушение в регуляции гибели клеток связано с развитием таких заболеваний как рак, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, ишемия, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона и может способствовать обострению хронических заболеваний (Elmore, 2007; Rubinsztein, 2008).

В ходе исследований, которые привели к разгадке тайны апоптоза, стало ясно, что этот путь самоуничтожения клеток не уникален, и кандидатом на роль еще одного механизма гибели стала система аутофагии. Аутофагия является механизмом, способствующий выживанию клеток в период отсутствия питательных компонентов, за счет переваривания собственных соединений (различных белков и органелл), обеспечивая альтернативный источник энергии.

Аутофагосомы помогают клетке избавляться от продуктов неправильного соединения обычных белков или белков, выработавших свой ресурс. Такие белки либо перестают функционировать, либо функционируют неправильно. Непрерывно работающая система аутофагии поддерживает концентрацию подобных белков на безопасном уровне. Аутофагосомы работают постоянно независимо от того, голодает клетка или нет. Но дефицит питательных веществ, кислорода или факторов роста стимулирует процесс сборки аутофагосом. Они захватывают из цитоплазмы белки и органеллы, которые используются как источник питательных веществ и энергии, необходимых клетке (Levine, 2004).

Аутофагосомы не только удаляют аномальные белки, но и отыскивают и изолируют поврежденные органеллы. Так, митохондрии, в норме обеспечивающие клетку энергией, могут посылать ей несвоевременные сигналы к запрограммированной гибели — апоптозу. Один из побочных продуктов деятельности митохондрии — высокореакционноспособные кислородсодержащие молекулы (оксиданты), способствующие утечке в цитоплазму содержимого митохондрии, в частности сигнальных белков, запускающих апоптоз. Аутофагия — надежный предохранитель от таких роковых сбоев. Аутофагосомы изолируют поврежденную митохондрию или другую органеллу и создают условия для ее деградации лизосомными ферментами, прежде чем она успевает послать клетке сигнал гибели или дезорганизовать всю ее работу.

Как ни парадоксально, но аутофагия может служить как защитой для клеток, так и способствовать их повреждению. При развитии опухолевых заболеваний она действует как супрессор опухолей. В этом случае аутофагия в раковых клетках является II типом ПКГ и может ограничить увеличение клеток или способствовать удалению поврежденных органелл, которые могут генерировать свободные радикалы и увеличивать мутации.

Белки теплового шока или стресс-белки представляются новой парадигмой для скоординированного, многоступенчатого регулирования программированной клеточной гибели, позволяющие обеспечить защиту от воздействия разрушительных факторов и облегчить восстановление клеток после них (Beere,

2001; 2001; 2004). Их способность разбирать, собирать и упаковывать 7 1 неправильно сложенные белки помогает избегать клетке неблагоприятных последствий от разрушительных агентов (Parsell,1993; Nollen, 2002). Эта защитная функция белков теплового шока предполагает их способность подавлять программированную клеточную гибель, в том числе апоптоз и аутофагию.

Бронхиальная астма (БА) занимает одно из ведущих мест в структуре хронической патологии органов дыхания и является важнейшей проблемой мирового здравоохранения, что в первую очередь, обусловлено ростом распространенности болезни во всех возрастных группах, увеличением числа тяжелых и резистентных к терапии форм болезни (Намазова-Баранова, 2009). В настоящее время БА рассматривается, как хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, сопровождающееся гиперреактивностыо бронхов, респираторными симптомами и вариабельной бронхиальной обструкцией (Чучалин, 2008 ;Вис, 2009). Большинство исследователей относит Б А к аллергическим заболеваниям, в основе которых лежат иммунологические механизмы (Гущин, 1998; Чернушенко, 2002). Установлено, что в формировании аллергической реакции ведущая роль принадлежит лимфоцитам (Bentley, 1992; Pumputiene, 2006). Пролонгацию аллергического воспаления при БА связывают с усилением выживаемости Т-лимфоцитов и утратой ими способности к апоптозу (Косарев, 2000; Spinozzi, 2008). Устойчивость Т-лимфоцитов к программированной клеточной гибели I типа может быть связана с тем, что происходит переключение с апоптоза на аутофагию.

В связи с целью были поставлены следующие задачи:

2. Исследовать процесс аутофагии в Т-лимфоцитах больных легкой и тяжелой формами астмы.

3. Определить влияние дексаметазона на аутофагию в Т-лимфоцитах больных легкой и тяжелой формами астмы.

Научная новизна. В работе впервые проведено исследование процесса аутофагии в Т-лимфоцитах больных атопической бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести заболевания. Было установлено, что в Т-лимфоцитах больных легкой формой заболевания аутофагия в условиях торможения апоптоза способствует индукции программированной клеточной гибели II типа. В Т-лимфоцитах больных тяжелой формой астмы установлена одновременная активация и апоптоза, и аутофагии.

Показано различное содержание белков теплового шока HSP70 и HSP90 в зависимости от степени тяжести атопической бронхиальной астмы. У больных с легкой формой заболевания установлено повышение уровня HSP90 в условиях in vitro. В группе больных с тяжелой формой астмы установлено наличие как HSP70, так и HSP90, внутриклеточное содержание которых снижалось в процессе культивирования Т-лимфоцитов в связи с их выходом во внеклеточное пространство. Секреция ШР70 и ШР90 в межклеточную среду коррелирует с активацией апоптоза и аутофагии.

Особый интерес для практического применения имеют полученные в работе данные о роли белков теплового шока Н8Р70 и Н8Р90 и их взаимосвязь с апоптозом и аутофагией, что может послужить основанием для их использования в коррекции программированной клеточной гибели. Применение терапевтических веществ, в том числе дексаметазона, снижающих накопление белка Нэр90 внутри клеток, может способствовать повышению апоптотического процесса в Т-лимфоцитах у больных легкой и тяжелой формами АБА.

Положения, выносимые на защиту:

1. Устойчивость Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой и тяжелой формами астмы к I типу программированной клеточной гибели апоптозу) сопровождается активацией аутофагии.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на II Международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения" (г. Санкт-Петербург, 2007); на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г.Казань, 2008); на IV международном съезде биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 2008); на XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (г. Москва, 2009); на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009); на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия-2009» (г. Пермь, 2009); на XIII Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2009 г.; на I Всероссийской интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (г. Казань, 2010); на 4 Международной конференции для молодых ученых "Molecular biology: advances and perspectives" (Kyiv, 2011); на IV Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (г. Казань, 2012); на 7 Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г.Челябинске», 2012 г; на Международном форуме, посвященный тяжелой форме астмы ISAF-2012 (Gothenburg, Sweden); на III Международной научной онлайн-конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" (г. Казань, 2012).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Скибо, Юлия Валерьевна

выводы

2. В Т-лимфоцитах больных атопической бронхиальной астмой показана активация аутофагии: в группе с легкой формой заболевания аутофагия приводит к гибели Т-лимфоцитов по пути программированной клеточной гибели II тина. В группе с тяжелой формой астмы аутофагия способствует устойчивости клеток к гибели и их длительному функционированию;

145

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скибо, Юлия Валерьевна, Казань

1. Акберова, Н.И. Сравнение данных. II Непараметрические критерии значимости / Н.И. Акберова. Казань: Издательство КГУ, 2004. - 50с.

2. Барышников, А.Ю. Иммунологические проблемы апоптоза/ АЛО. Барышников, Ю.В. Шишкин. М: Эдиториал УРСС, 2002. 320с.

3. Бережков, Н.В. Апоптоз — управляемая смерть клетки / Н.В. Бережков// Арх. анат., гистол. и эмбриол. 1990. - Т. 99. - № 12. - С. 68—75.

4. Бобкова, И.Н. Защитное действие белков теплового шока при заболеваниях почек / И.Н. Бобкова, Н.В. Чеботарева, Л.В. Козловская, Н.В. Непринцева // Инновации в нефрологию 2011. - Т. 6. - С: 59-66.

5. Бойчук, C.B. Механизмы апоптоза лимфоцитов периферической крови больных атопической бронхиальной астмой / C.B. Бойчук, И.Г. Мустафин, P.C. Фассахов // Аллергология. 2001. № 1. - С. 3 - 9.

6. Гущин, И.С. Аллергическое воспаление и его фармакологический контроль. М.: Фармарус, 1998. - 250 с.

7. Гущина, Ю.Ю. Исследование различий морфологических параметров клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии / Ю.Ю. Гущина // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2005. - №1. - С: 48-53.

8. Джербашьян, А.Р. Апоптоз и деградация ДНК: теория отражения физиологического состояния организма в деградированности ДНК / А.Р Джербашьян, P.A. Захарян, П.А. Казарян, С.Н. Симонян, К.Г. Карагезян. // ДНАН Армении. -2002. -Т. 100. -N1. -С.60-63.

9. Дранник, Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. Одесса: Астропринт, 1999. 603 с.

10. Драпкина, О.М. Роль шаперонов в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний и кардиопротекции / О.М. Драпкина, Я.И. Ашихмин, В.Т. Ивашкин // Российские медицинские вести. 2008. - Т. 13. - № 1. - С: 56-69.

11. Евдонин, А.Л. Внеклеточный белок теплового шока 70 и его функции / А.Л.

12. Евдонин, Медведева Н.Д. // Цитология. 2009. - Т.51. - № 2. - С: 130 - 137.146

13. Ивашкин, В.Т., Драпкина О.М. Клиническое значение оксида азота и белков теплового шока. М.: «ГЕОТАР-Медиа». 2011.

14. Ковальчук JI.B., Ганковская JI.B., Мешкова Р.Я. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. М.: «ГЭОТАР-Медиа». 2011.

15. Колхир, П.В. Доказательная аллергология иммунология. - М.: Практическая медицина, 2010. - 528 с.

16. Константинова H.A. Иммунные комплексы и повреждение тканей. М: Медицина, 1996.

17. Косарев, В.В. Ингаляционные кортикостероиды в терапии бронхиальной астмы / В.В. Косарев, B.C. Лотков, A.C. Куклин // Терапевт, арх. 2000. - № 8.-С. 59-61.

18. Мамонтова, Т.В. Состояние CD95, MIICI и MHCII опосредованного апоптоза у больных атопической бронхиальной астмой / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев // Иммунология. 2004. - № 4. - С. 198 -201.

19. Мамонтова, Т.В. Новые аспекты апоптоза мононуклеарных клеток в патогенезе атопической бронхиальной астмы / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев // Аллергология. 2005. - № 4. - С: 15-23.

20. Манских, В.Н. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза / В.Н. Манских // Бюллетень сибирской медицины. 2004. -№ 1.-С. 63-70.

21. Матвеева, Н.Ю. Апоптоз: морфологические особенности и молекулярные механизмы // Тихоокеанский медицинский журнал. 2003. - № 4. - С: 12 -16.

22. Мельницкая, С.Н. Аутоиммунные механизмы в патогенезе бронхиальной астмы и хронической пневмонии / С.Н. Мельницкая, Г.Б. Федосеев, Н.М. Сосенкова, К.Н. Крякунов // Клин. мед. 1973. Т.51-№2.-С. 21-25.

23. Милевская, С.Г. Характеристика иммунных комплексов у больных псориазом / С.Г. Милевская, Г.В. Потапова // Вестн дерматол и венерол 1998. -Т. 5.-С: 35-37.

24. Мюльберг A.A. Фолдинг белка. Изд-во С.-Петерб. унив., 2004. 155 с.147

25. Намазова-Баранова, JI.C. Распространенность астмаподобных симптомов и диагностированной астмы в популяции подростков / J1.C. Намазова-Баранова, JI.M. Огородова, А.Ю. Томилова и др. // Педиатрическая фармакология. 2009. - Т.6. - №3. - С. 59-65.

26. Невзорова, В.А. Апоптоз и воспаление при бронхиальной астме / В.А. Невзорова, Т.Н. Суровенко, E.H. Коновалова // Терапевт, арх. 2001. -№ 12.-С. 92-96.

27. Никонова, М.Ф. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т лимфоцитов иа стимуляцию / М.Ф. Никонова, М.М. Литвина, М.И. Варфоломеева // Иммунология. 1999. - № 2. - С. 20-23.

28. Онищенко, Г.Е. Варианты программированной гибели клеток / Г.Е. Онищенко, Е. Александрова. // Доклады РАН. 2004. -С.399:507-509.

29. Проскуряков, С. Я. Некроз-активная, управляемая форма программируемой клеточной гибели / С. Я. Проскуряков, В. Л. Габай, А. Г. Конопляников. // Биохимия. -2002. -Т.67. -№4. -С.467-491.

30. Ройт, А. Иммунология/ А. Ройт, Дж. Бростофор, Д. Мейл, Д.Б. Рот. М.: Логосфера, 2007.

31. Рудык, Б.И. Сравнительная оценка изучения содержания иммунных комплексов при инфаркте миокарда, бронхиальной астме и ревматоидном артрите / Б.И. Рудык, П.В. Барановский // Тер. арх. -1984.-№10.-С. 17-19.

32. Свиридова, B.C. Иммунорегуляторные субпопуляции Т-клеток при опухолевом росте и аллергических заболеваниях / B.C. Свиридова, В.В. Климов, A.A. Денисов и др. // Сибирский онкологический журнал. 2010. -№3(39).-С: 38-47.

33. Симбирцев, A.C. Цитокины: классификация и биологические функции / A.C. Симбирцев // Цитокины и воспаление,- 2004. Т. 3. - № 2. - С: 16-22.

34. Симонова, А.В. Фенотип лимфоцитов крови при воспалительных заболеваниях человека / А.В. Симонова. М.: ИНТО, 2001.

35. Стручков, П.В. Скрининг-тест для оценки патогенных свойств циркулирующих иммунных комплексов / П.В. Стручков, Н.А. Константинова, В.В. Лаврентьев, А.Г. Чучалин // Лаб дело. 1985. - Т. 7. - С: 410-412.

36. Фрейдлин, И.С. Регуляторные Т-клетки: происхождение и функции/ И.С. Фрейдлин // Медицинская иммунология. -2005. -Т. 7.- № 4. С: 347-354.

37. Хаитов, P.M. Иммунология / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. -М.: Медицина, 2000.

38. Чернушенко, Е.Ф. Актуальные вопросы иммунокорригирующей терапии при аллергических заболеваниях//Астма и аллергия. 2002. - № 1. - С. 37-41.

39. Чернушенко, Е.Ф. Иммунология бронхиальной астмы/ Е.Ф. Чернушенко // Украинский пульмонологический журнал. 2000. - № 2, доп. - С: 19-21.

40. Чучалин, А. Г. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы. Пер с англ. Под ред. А. Г. Чучалина. М.: Атмосфера, 2008. -108 С.

41. Ярилин, А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме / А.А. Ярилин // Патол.физиол.эксп. терап. 1998. - № 2. - С: 38-48.

42. Ярилин, А.А. Основы иммунологии / А.А. Ярилин М.: Медицина, 1999. -608 с.

43. Abdulamir, A.S. Changing survival, memory cell compartment, and T-helper balance of lymphocytes between severe and mild asthma /A.S. Abdulamir, R.R. Hafidh, F. Abubakar, K.A. Abbas. //BMC Immunology. 2008. - V. 9(73). - P: 110.

44. Agrawal, A. ERK1-/- mice exhibit Thlcell polarization and increased susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis / A. Agrawal, S. Dillon, T.L. Denning, and B. Pulendran // J. Immunol. 2006. -V.176. - P: 5788-5796.

45. Agarraberes, F.A. A molecular chaperone complex at the lysosomal membrane is required for protein translocation / F.A. Agarraberes, J.F. Dice // J Cell Sci. -2001.-V. 114.-P: 2491-2499.

46. Ahn J.H. Suppression of ceramide-mediated apoptosis by HSP70 // Mol. Cell. -1999.-V. 9.-P: 200-206.

47. Akdis, M. Cytokine network and dysregulated apoptosis in atopic dermatitis / M. Akdis, A. Trautmann, S. Klunker, K. Blaser, C.A. Akdis // Acta Odontol Scand.2001.-V. 59(3). -P: 178-182.

48. Amolins M.W. Natural Product Inhibitors of Hsp90: Potential Leads for Drug Discovery / M. W. Amolins and B. S. J. Blagg // Mini Rev Med Chem. 2009. -V. 9(2). P: 140-152.

49. Anderson, G.P. The immunobiology of early asthma/ G.P. Anderson // MJA.2002. -V. 177(6). P: 47-49.

50. Anderton, S.M. Activation of T cells recognizing self 60-kDa heat shock protein can protect against experimental arthritis / S.M. Anderton, R. van der Zee, B. Prakken et al. // J. Exp. Med. 1995. - V. 181. - P: 943-952.

51. Arur, S. Annexin I is an endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment/ S. Arur, U. E. Uche, K. Rezaul et al. // Dev Cell. 2003. - V. 4. - P: 587-598.

52. Ashe, P.C. Apoptotic signaling cascades / P.C. Ashe and M.D. Berry // Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry. 2003. - V. 27(2). - P: 199-214.

53. Ashkenazi, A. Death receptors: signaling and modulation/ A. Ashkenazi, V.M. Dixit//Science. -1998.-V. 281.-P: 1305-1308.

54. Bakunts, G. Antigen composition of circulating immune complexes in the blood of patients with hemorrhagic strokes / G. Bakunts, A. Arakelyan, A. Boyajyan, A. Poghosyan // Westnik IAELPS. 2001. - V.6 (42). - P: 97-99.

55. Barkla, D. H. The fate of epithelial cells in the human large intestine / D. H. Barkla, P. R. Gibson // Pathology. 1999. - V. 31. - P: 230-238.

56. Beck F-X. Molecular chaperones in the kidney: distribution, putative roles and regulation / F-X. Beck, W. Neuhofer, E. Muller // Am. J. Physiol, Renal. Physiol. 2000. - V. 279. - P: 203-215.

57. Beere H.M. Stressed to death: regulation of apoptotic signaling pathways by theheat shock proteins. Sci. STKE. doi:10.1126/stke.2001.93.rel.150

58. Beere H.M. Stress management: heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis / H.M. Beere and D.R. Green // Trends Cell Biol. 2001. - V.l 1. - P: 610.

59. Beere H.M. "The stress of dying": the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis // J. Cell Sci. 2004. - V.l 17. - P: 2641-2651.

60. Beere H.M. Death versus survival: functional interaction between the apoptotic and stress-inducible heat shock protein pathways // J Clin Invest. 2005. - V. 115(10).-P: 2633-2639.

61. Bellinghausen, I. Human CD4CD25 T cells derived from the majority of atopic donors are able to suppress TH1 and TH2 cytokine production / I. Bellinghausen, B. Klostermann, J. Knop et al. // J. Allergy Clin. Immunol. -2003. -V. 111. -P. 862-868.

62. Bellinghausen, I. Regulatory activity of human CD4 CD25 T cells depends on allergen concentration, type of allergen and atopy status of the donor /1. Bellinghausen, B. Konig, I. Bottcher et al. // Immunology. -2005. -V. 116.- P. 103111.

63. Bijur, G.N. Opposing actions of phosphatidylinositol 3-kinase and glycogen synthase kinase-3beta in the regulation of HSF-1 activity / G.N. Bijur, R. S. Jope // J Neurochem. 2000. - V. 75. - P: 2401- 2408.

64. Binnig, G. Atomic force microscope / G. Binnig, C.F. Quate, C. Gerber // Physics Review Letters. -1986. V.56. - P: 930-933.

65. Borges, T.J. The anti-inflammatory mechanisms of Hsp70 / T.J. Borges, L. Wieten, M. J.C. van Herwijnen et al // Front Immunol. 2012. - V. 3. - P: 1-12.

66. Bortner, C.D. The role of DNA fragmentation in apoptosis / C.D. Bortner, N.B. Oldenburg, J.A.Cidlowski // Trends Cell Biol. 1995. - V. 5(1). - P: 21-26.

67. Bras, M. Programmed cell death via mitochondria: Different modes of dying / M. Bras, B. Queenan, S.A. Susiin // Biochemistry. 2005. - V.70.- P: 231-239.

68. Bratke, K. Invariant natural killer T cells in obstructive pulmonary diseases / K. Bratke, P. Julius, J.C. Virchow // N Engl J Med. 2007. - V. 357(194). - P: 194195.

69. Bresnick, E.H. Evidence that the 90-kDa heat shock protein is necessary for the steroid binding conformation of the L cell glucocorticoid receptor / E.H. Bresnick, F.C. Dalman, E.R. Sanchez, W.B. Pratt // J Biol Chem. 1989. - V.264. - P: 4992-4997.

70. Broemer, M. Requirement of Hsp90 activity for IkappaB kinase (IKK) biosynthesis and for constitutive and inducible IKK and NF-kappaB activation / M. Broemer, D. Krappmann, C. Scheidereit // Oncogene. 2004. - V. 23. - V: 53785386.

71. Bruce, S. B. Mast cells, basophils, and eosinophils: distinct but overlapping pathways for recruitment/ S. B. Bruce, R.P. Schleimer// Immunological Reviews.-2001,-V. 179.-I.-1.-P. 5-15.

72. Brunner, T. Fas (CD95/Apo-l) ligand regulation in T cell homeostasis, cellmediated cytotoxicity and immune pathology/ T.Brunner, C. Wasem, R. Torgler et al. // Semin Immunol. 2003. - V. 15. - P: 167-176.

73. Buc, M. Immunophathogenesis of bronchial asthma / M. Buc, M. Dzurilla, M. Bucova //Arch Immunol Ther Exp. 2009. - V. 57. - P: 331-344.

74. Burel C. Mammalian heat shock protein families. Expression and functions / C. Burel, V. Mezger, M. Pinto et al. // Cellular and Molecular Life Sciences. 1992. -V.48 (7).-P: 629-634.

75. Bursch, W. The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death / W. Bursch // Cell Death Differ. 2001. - V. 8(6). - P: 569-581.

76. Bursch W, Ellinger A, Gerner C, Schulte-Hermann R. Autophagocytosis and programmed cell death. In: Klionsky DJ, editor. Autophagy. Georgetown, TX: Landes Bioscience; 2004. P: 287-303.

77. Caruso J.A. Role of HSP90 in mediating cross-talk between the estrogen receptor and the Ah receptor signal transduction pathways / J. A. Caruso, D. W. Laird, G. Batist // Biochemical pharmacology. 1999. - V. 58(9). - P: 1395-1403.

78. Cengic, M. Importance of determination of circulating immune complexes in systemic lupus erythematosus / M.Cengic, S.Rasic // Med Arch. 2002. - V. 56. -P: 267-270.

79. Chae, S.C.The exon 4 variations of Tim-1 gene are associated with rheumatoid arthritis in a Korean population / S.C. Chae, J.H. Song, S.C. Shim, K.S. Yoon, H.T. Chung // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - V. 315. - P: 971-975.

80. Chamond, R. R. Apoptosis and disease / R. R. Chamond, J. C. Anon, C. Aguilar, F. G.Pasadas // Alergol Inmunol Clin. 1999. - V. 14(6). - P: 367-374.

81. Chen, M. Initiator caspases in apoptosis signaling pathways. /Chen M, Wang J.// Apoptosis. 2002. - 7. - P. 313-319.

82. Chen, G. TNF-induced recruitment and activation of the IKK complex require Cdc37 and Hsp90 / G.Chen, P. Cao, D.V. Goeddel // Mol Cell. 2002. - V. 9. - P: 401-410.

83. Chen, Z.H. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease / Z.H. Chen, H.P. Kim, F.C. Sciurba et al. // PLoS One. -2008.-V.3.- :e3316.

84. Ciepiela, O. Sublingual immunotherapy in asthma does not influence lymphocyte sensitivity to Fas stimulation / O. Ciepiela, A. Zawadzka-Krajewska, I. Kotula, M. Wasik, U. Demkow // Eur J Med Res. 2010. - V. 4(15). - P: 17-20.

85. Ciechanover, A. Ubiquitin-mediated proteolysis: biological regulation via destruction / A. Ciechanover, A. Orian, A.L. Schwartz // Bioessays. 2000. -V.22. - P: 442-451.

86. Clarke, P. G. Developmental cell death: morphological diversity and multiple mechanisms // Anat. Embryol. 1990.-V. 181.-P: 195-213.

87. Colavita A.M. Contributing factors to the pathobiology of asthma/ A. M. Colavita, A. J. Reinach, S. P. Peters// Clinics in Chest Medicine.- 2000.-V. 21.-1. 2,- P. 263277.

88. Comhair, S. A.A. Redox Control of Asthma: Molecular Mechanisms and Therapeutic Opportunities AS. A.A. Comhair, S. C. Erzurum // Antioxid. Redox Signal. 2010. - V. 12 (1). - P: 93-124.

89. Constant, S.L. Resident lung antigen-presenting cells have the capacity to promote Th2 T cell differentiation in situ/ S.L. Constant, J.L. Brogdon, D.A. Piggott et al. // J. Clin. Invest.-2002.-V. 110. P: 1441-1448.

90. Conrad, D.H. Regulation of the IgE response / D.H. Conrad, D.R. Gibb, J. Sturgill //Biol Reports.-2010. -2:14.

91. Corrigan, C.J. Role of T-lymphocytes and lymphokines / C.J. Corrigan, A.B. Kay // Br Med Bull. 1992. - V. 48. - P: 72-84.

92. Corthay A. How do Regulatory T Cells Work? // Scand. J. Immunol.- 2009. V. 70 (4). -P: 326-336.

93. Cory, S. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch/ S.Cory and J.M. Adams // Nat Rev Cancer. 2002. - V. 2. - P: 647-656.

94. Csermely, P. The 90 kDa molecular chaperone family: structure, function andclinical applications. A comprehensive review / P. Csermely, T. Schnaider, Cs.154

95. Soti, Z. Prohaszka and G. Nardai // Pharmacology and Therapeutics. 1998. -V.79.-P: 129-168.

96. Cuervo, A. M. A Receptor for the Selective Uptake and Degradation of Proteins by Lysosomes / A. M. Cuervo and J. F. Dice // Science. 1996. - V. 273 (5274). - P: 501-503.

97. Dai, C. HSP90: a rising star on the horizon of anticancer targets / C. Dai and L. Whitesell // Future Oncol. 2005. - V.l. - P: 529-540.

98. De Duve, C. Functions of lysosomes / C.de Duve and R. Wattiaux // Annu. Rev. Physiol. 1966. - V.28. - P: 435-492.

99. De Jong, E.C. Microbial compounds selectively induce Thl cell-promoting or Th2 cell-promoting dendritic cells in vitro with diverse th cell-polarizing signals/ E.C. De Jong, P.L. Vieira, P. Kalinski et al. // J. Immunol. 2002. - V. 168. - P: 17041709.

100. Degterev, A. Expansion and evolution of cell death programmes / A. Degterev, J. Yuan // Nature reviews. Molecular cell biology. 2008. - V. 9. - P: 378-390.

101. Deretic, V. Autophagosome and phagosome // Methods Mol Biol. 2008. - V. 445. -P: 1-10.

102. Devadas, S. Granzyme B is critical for T cell receptor-induced cell death of type 2 helper T cells/ S.Devadas, J.Das, C.Liu et al. //Immunity. 2006. - V. 25. - P: 237-247.

103. Djavaheri-Mergny, M. Autophagy joins the game to regulate NF-kappaB signaling pathways / M. Djavaheri-Mergny and P. Codogno // Cell Res. 2007. -V. 17. - P: 576-577.

104. Dunn WA, Jr. Studies on the mechanisms of autophagy: formation of the autophagic vacuole / Jr. Dunn WA // J Cell Biol. 1990. - V. 110. - P: 1923-1933.

105. Edinger, A.L. Defective autophagy leads to cancer / A.L. Edinger, C.B. Thompson 11 Cancer Cell. 2003. - V.4. - P: 442-424.

106. Edinger, A.Z. Death by design: apoptosis, necrosis, and autophagy Curr. Opin / A.Z Edinger., C. Thompson . // Cell Biol.-2004.-T.16.-C.663-669.

107. Egwuagu, C.E. Suppressors of cytokine signaling proteins are differentially expressed in Thl and Th2 cells: implications for Th cell lineage commitment and maintenance/ C.E. Egwuagu, C.R. Yu, M. Zhang et al.J // Immunol. -2002. -V. 168. -P: 3181-3187.

108. Elmore, E. Apoptosis: a review of programmed cell death / E. Elmore // Toxicol Pathol. 2007. - V. 35. - P: 495-516.

109. Enari, M. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD/ M.Enari, H.Sakahira, H.Yokoyama et al. //Nature. -1998. V. 391. -P: 43-50.

110. Fabian, T. K. Potential immunological functions of salivary IIsp70 in mucosal and periodontal defense mechanisms / P. Fejerdy, M. T. Nguyen, C. Soti, P.Csermely // Arch. Immunol. Ther. Exp. 2007. - V. 55. - P: 1-8.

111. Fajac, I. Bronchial y5 T-lymphocytes and expression of heat shock proteins in mild asthma /1. Fajac, G.L. Roisman, J. Lacronique, B.S. Polla, D.J. Dusser // Eur Respir J. 1997. -V. 10. P: 633-638.

112. Fan, Z. Tumor suppressor NM23-H1 is a granzyme A-activated DNase during CTLmediated apoptosis, and the nucleosome assembly protein SET is its inhibitor/ Z.Fan, P.J. Beresford, D.Y. Oh et al. //Cell. 2003. - V. 112. - P: 659-672.

113. Feng, H. Stressed apoptotic tumor cells stimulate dendritic cells and induce specific cytotoxic T cells / H. Feng, Y. Zeng, M.W. Graner, E. Katsanis // Blood. -2002.-V. 100.-P: 4108-4115.

114. Ferraro, E. Autophagic and apoptotic response to stress signals in mammalian cells / E. Ferraro, F. Cecconi // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2007. - V. 462.-P: 210-219.

115. Fiers W. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage / Fiers W, Beyaert R, Declercq W, Vandenabeele P. Oncogene. 1999. -V. 18(54).-P: 7719-30.

116. Freeman, G.J. TIM genes: a family of cell surface phosphatidylserine receptors that regulate innate and adaptive immunity / G.J. Freeman, J.M. Casasnovas, D.T. Umetsu, R.H. DeKruyff// Immunol. Rev. 2010. - V. 235. - P: 172-189.

117. Gardai, S. J. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte / S. J. Gardai, K. A. McPhillips, S.C. Frasch et al. // Cell. 2005. - V.123. - P: 321-334.

118. George, M.D. Apg5p functions in the sequestration step in the cytoplasm-to-vacuole targeting and macroautophagy pathways / M.D. George, M. Baba, S.V. Scott et al. // Mol Biol Cell. 2000. - V. 11. - P: 969-82.

119. Georgopoulos C. Heat shock protein in multiple sclerosis and other autoimmune diseases / C.Georgopoulos, H. McFarland // Immunol. Today. 1993. - V. 14(8). -P: 373-375.

120. Goldsbury, C.S. Introduction to Atomic Force Microscopy (AFM) in Biology / C.S. Goldsbury, S. Scheuring, L. Kreplak // Current Protocols in Protein Science. -2009. -V. 17(7). -P: 1-19.

121. Golstein P. Cell death by necrosis: towards a molecular definition / P. Golstein, G.

122. Kroemer // Trends Biochem Sci. 2007. - V. 32. - P: 37-43.157

123. Goping, I.S. Granzyme B-induced apoptosis requires both direct caspase activation and relief of caspase inhibition/ I.S. Goping, M. Barry, P. Liston et al. //Immunity. -2003,-V. 18.-P: 355-365.

124. Gould, H. J. The biology of IgE and the basis of allergic disease / H. J. Gould, J. Brian et al. // Annual Review of Immunology. 2003. - V. 21. - P: 579-628.

125. Green, D. R. Immunogenic and tolerogenic cell death / D. R. Green, T. Ferguson, L. Zitvogel, G. Kroemer // Nat Rev Immunol. 2009. - V. 9. - P: 353-363.

126. Guevin, C. Autophagy protein ATG5 interacts transiently with the hepatitis C virus RNA polymerase (NS5B) early during infection / C. Guevin, D. Manna, C. Belanger et al. // Virology. 2010. - V. 405. - P: 1-7.

127. Ha, J.H. Structure and mechanism of FIsp70 proteins. In: Molecular Chaperones and Folding Catalysts. Regulation, Cellular Function and Mechanism / J.H. Ha, E. R. Johnson, D. B. McKay et al. // Harwood Academic Publishers. 1999. - P: 573-607.

128. Haendeler, J. Regulation of telomerase activity and anti-apoptotic function by protein-protein interaction and phosphorylation / J. Haendeler, J. Hoffmann, S. Rahman, A.M. Zeiher, S. Dimmeler // FEBS Lett. 2003. - V. 536. - P: 180- 186.

129. Hanada, T. The Atgl2-Atg5 conjugate has a novel E3-like activity for protein lipidation in autophagy / T. Hanada, N.N. Noda, Y. Satomi // J Biol Chem. 2007. -V. 282. -P: 37298-37302.

130. Hill, M.M. Analysis of the composition, assembly kinetics and activity of native Apaf-1 apoptosomes/ M.M. Hill, C. Adrain, P.J. Duriez, E.M. Creagh, S.J. Martin // Embo J. 2004. - V. 23. -P: 2134-2145.

131. Hitoshi,Y. Toso, a cell surface, specific regulator of Fas-induced apoptosis in T cells/ Y.Hitoshi, Lorens, J., Kitada, S. I., et al.// Immunity. 1998. - V. 8. - P: 461-471.

132. Holt, S. E. Functional requirement of p23 and Hsp90 in telomerase complexes / S. E. Holt, D.L. Aisner, J. Baur et al. // Genes Dev. 1999. - V. 13. - P: 817-826.

133. Hoshino, T. Redox-regulated mechanisms in asthma / T. Hoshino, M. Okamoto, S. Takei et al. // Antioxid Redox Signal. 2008. - V. 10. - P: 769-783.

134. Hotchkiss, R. S. Cell death / R. S. Hotchkiss, A. Strasser, J. E. McDunn, P. E. Swanson//N Engl J Med. 2009 . - V. 361.-P: 1570-1583.

135. Hou, W. Autophagic degradation of active caspase-8: a crosstalk mechanism between autophagy and apoptosis/ W. Hou, J. Han, C. Lu, L.A. Goldstein, H. Rabinowich //Autophagy. 2010. - V. 6. - P: 891-900.

136. Humbles, A.A. A Critical Role for Eosinophils in Allergic Airways Remodeling/ A. A. Humbles, C. M. Lloyd, S. J. McMillan et al.// Science.- 2004.-V. 305.-N. 5691.-P. 1776-1779.

137. Ichimura, Y. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation / Y. Ichimura, T. Kirisako, T. Takao et al. // Nature. 2000. - V. 408. - P: 488-92.

138. Ichimura, Y. In vivo and in vitro reconstitution of Atg8 conjugation essential for autophagy / Y. Ichimura, Y. Imamura, K. Emoto et al. // J. Biol. Chem. 2004. -V. 279. - P: 40584-40592.

139. Igney, F. H. Death and anti-death: tumour resistance to apoptosis / F.H. Igney, P.H. Krammer // Nat Rev Cancer. 2002. - V. 2. - P: 277-288.

140. Jarjour, N.N. Enhanced production of oxygen radicals in asthma / N.N.Jarjour, W.J.Calhoun//J Lab Clin Med. 1994. - V. 123. - P: 131-136.

141. Jarnicki, A.G.T helper type-2 cytokine responses: potential therapeutic targets/ A.G. Jarnicki, P.G. Fallon // Curr. Opin. Pharmacol.- 2003.- V. 3(4).- P: 449-455.

142. Joseph, K. Heat shock protein 90 catalyzes activation of the prekallikreinkininogen complex in the absence of factor XII / K. Joseph, B.G. Tholanikunnel,

143. A.P. Kaplan // Proc Natl Acad Sci USA.- 2002. V. 99(2). - P: 896-900.159

144. Jounai, N.The Atg5 Atgl2 conjugate associates with innate antiviral immune responses / N. Jounai, F. Takeshita, K. Kobiyama et al. J // Proc Natl Acad Sci U S A. 2007. - V. 104. - P: 14050-14055.

145. Joza, N. Essential role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor in programmed cell death/ N.Joza, S.A. Susin, E. Daugas et al.// Nature. 2001. - V. 410.-P: 549-554.

146. Ju, S. Fas (CD95)/Fasl interaction required for programmed cell death after T-cell activation/ S. Ju, D. J. Panka, G. Cui et al. // Nature. 1995. - V. 373. - P: 444448.

147. Jaattela, M. Hsp70 exerts its anti-apoptotic function downstream of caspase-3-like proteases / M. Jaattela, D. Wissing, K. Kokholm, T. Kallunki and M. Egeblad // EMBOJ. 1998.-V. 17. P: 6124-6134.

148. Jaattela, M. Escaping cell death: survival proteins in cancer // Exp. Cell. Res. -1999. V.248. - P: 30-43.

149. Kabeya, Y. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing / Y. Kabeya, N. Mizushima, T. Ueno et al. // EMBO. J. 2000. - V. 19. - P: 5720-5728.

150. Kang, S. J. Distinct downstream pathways of caspase-11 in regulating apoptosis and cytokine maturation during septic shock response/ S.J. Kang, S.Wang, K. Kuida, J.Yuan // Cell Death Differ. 2002. - V. 9. - P: 1115-1125.

151. Karin, M. Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression/ M. Karin // Nature.- 2006. V.441. - P: 431-436.

152. Kaushik, S. Chaperone-mediated autophagy / S. Kaushik, A.M. Cuervo //Methods Mol Biol. 2008. - V. 445. - P: 227-244.

153. Kerr, J. F. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics / J. F. Kerr, A. H. Wyllie, A. R. Currie // Br J Cancer. 1972. - V. 26. -P: 239-257.

154. Kim, E. K. Effect of Chronic Hypoxia on Proliferation, Apoptosis, and HSP70 Expression in Mouse Bronchiolar Epithelial Cells / E-K. Kim, J.D. Park, S-Y. Shim //Physiol. Res. 2006. - V.55.- P: 405-411.

155. Kianga, J.G. Heat Shock Protein 70 kDa: Molecular Biology, Biochemistry and Physiology / J. G. Kianga, G. C. Tsokos // Pharmacology and Therapeutics. -1998.-V. 80(2).-P: 183-201.

156. Kirisako, T. Formation process of autophagosome is traced with Apg8/Aut7p in yeast / T. Kirisako, M. Baba, N. Ishihara et al. // J Cell Biol. 1999. - V. 147. -P: 435^16.

157. Kischkel, F.C. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor/ F.C. Kischkel, S. Hellbardt, I. Behrmann et al. // Embo J. 1995. - V.14. - P: 5579-88.

158. Klein, L.Autophagy-mediated antigen processing in CD4+ T cell tolerance and immunity / L. Klein, C. Munz, J. D. Lunemann //FEBS Letters. 2010. - V. 584. -P: 1405-1410.

159. Klionsky, D. J. Autophagy as a Regulated Pathway of Cellular Degradation / D. J. Klionsky, S. D. Emr // Science. 2000. - V. 290(5497). - P: 1717-1721.

160. Klionsky, D.J. A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes / D.J. Klionsky, J.M. Cregg, W.A. Dunn et al. // Dev. Cell. 2003. - V. 5. - P: 539-545.

161. Klionsky, D. J. The molecular machinery of autophagy: unanswered questions // Journal of Cell Science. 2005. - V. 118.-P: 7-18.

162. Kondo, Y. The role of autophagy in cancer development and response to therapy/ Y.Kondo, T. Kanzawa, R. Sawaya, S .Kondo // Nat Rev Cancer. 2005. -V. 5. -P: 726-734.

163. Kroemer, G. Lysosomes and autophagy in cell death control / G. Kroemer, M. Jaattela // Nat. Rev. Cancer. 2005. - V. 5. - P: 886-897.

164. Kroemer, G. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009/ G. Kroemer, L. Galluzzi, P. Vandenabeele // Cell Death Differ. 2009. - V. 16(1). - P: 3-11.

165. Kuma, A. The role of autophagy during the early neonatal starvation period / A. Kuma, M. Hatano, M. Matsui et al.// Nature. 2004. -V. 432. - P: 1032-1036.

166. Kuznetsova, T.G. Atomic force microscopy probing of cell elasticity / T.G. Kuznetsova, M.N. Starodubtseva, N.I. Yegorenkov, S.A. Chizhik, R.I. Zhdanov // Micron. 2007. - V. 38(8). - P: 824-33.

167. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P: 680 - 685.

168. Lan, R.Y. Regulatory T cells: development, function and role in autoimmunity / R.Y. Lan, A.A. Ansarib, L. Zhe-Xiong, M.E. Gershwina // Autoimm. Rev.- 2005. -V. 4(6).-P: 351-363.

169. Lee, M.W. The protective role of Hsp90 against 3-hydroxykynurenine-induced neuronal apoptosis / M.W. Lee, S.C. Park, ITS. Chae // Biochem Biophys Res Commun. 2001. -V. 284. -P: 261-267.

170. Lee, S.Y. Distribution and cytokine production of CD4 and CD8 T-lymphocyte subsets in patients with acute asthma attacks / S.Y. Lee, S.J. Kim, S.S. Kwon et al. //Annals of Allergy, Asthma and Immunology. 2001. - V. 86.(6).- P: 659-664.

171. Lee, H.K. In vivo requirement for Atg5 in antigen presentation by dendritic cells / H.K. Lee, L.M. Mattei, B.E. Steinberg et al. // Immunity. 2010. - V. 32. - P: 227-239.

172. Lee, H.H. Apoptotic cells activate NKT cells through T cell Ig-like mucin-like-1 resulting in airway hiperreactivity / H.H. Lee, E. PI. Meyer, S. Goya // J Immunol. -2010.-V.185.-P: 5225-5235.

173. Lele, Z. Disruption of zebrafish somite development by pharmacologic inhibition of Hsp90 / Z. Lele, S.D. Hartson, C.C. Martin et al. // Dev. Biol. 1999. - V. 210(1).-P: 56-70.

174. Leist, M. Four deaths and a funeral: from caspases to alternative mechanisms / M. Leist, M. Jaattela // Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. - V. 2(8). - P: 589-598.

175. Levine, B. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy / B. Levine, D. J. Klionsky // Dev Cell. 2004. - V.6. - P: 463-477.

176. Levine, B. Autophagy in cell death: an innocent convict? / B. Levine, J. Yuan // J Clin Invest. 2005. - V. 115. - P: 2679-2688.

177. Li, L.Y. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria/ L.Y. Li, X. Luo, X.Wang // Nature. 2001. - V. 412. - P: 95-109.

178. Li, C. Autophagy Is Induced in CD4+ T Cells and Important for the Growth Factor-Withdrawal Cell Death/ C. Li, E. Capan, Y. Zhao et al.// The Journal of Immunology. 2006. - V. 177 (8). - P. 5163-5168.

179. Lindquist, S. The heat-shock proteins/ S. Lindquist, Craig E.A. // Ann. Rev. Genet. 1998,- V. 22.-P: 631-677.

180. Liossis, S.N. Overexpression of the heat shock protein 70 enhances the TCR/CD3-and Fas/Apo-l/CD95-mediated apoptotic cell death in Jurkat T cells / S.N. Liossis, X. Z. Ding, J.G. Kiang, G.C. Tsokos // J Immunol. 1997. - V. 158. - P: 56685675.

181. Lleo, A. Autophagy: highlighting a novel player in the autoimmunity scenario / A. Lleo, P. Invernizzi, C. Selmi et al. //J Autoimmun. 2007. - V. 29(2-3). - P: 6168.

182. Lockshin, R.A. Apoptosis, autophagy and more / R.A. Lockshin, Z. Zakeri // Int J

183. Biochem Cell B. 2004. - V. 36(12). - P: 2405-2419.163

184. Lombardi, V. Dendritic cell modulation as a new interventional approach for the treatment of asthma // Drug News Perspect.- 2009. -V. 22 (8). -P. 445-451.

185. Lum, J.J., Growth factor regulation of autophagy and cell survival in the absence of autophagy / J.J. Lum et al. // Cell. 2005. - V. 120. - P: 237-248.

186. Mackay, I.R. Autoimmunity: Thoughts for the millennium / I.R. Mackay, J.V.Water, M.E. Gershwin // Clin Rev Allergy Immunol. 2000. - V.18 (1). - P: 87-117.

187. Mailhos, C. Heat shock protects neuronal cells from programmed cell death by apoptosis / C.Mailhos, M.K. Howard and D.S. Latchman // Neuroscience. 1993. — V. 55. -P: 621-627.

188. Majeski, A.E. Mechanisms of chaperone-mediated autophagy/ A.E. Majeski and J.F. Dice // Int J Biochem Cell. 2004. - V.36. - P: 2435-2444.

189. Mancini, G. Carbonara A.O., Heremans J.F. // Immunochemistry. 1965. - V. 2 (3). - P: 235—254.

190. Martin, L.J. Functional Variant in the Autophagy-Related 5 Gene Promotor is Associated with Childhood Asthma / L.J. Martin, J. Gupta, S.S.S.K. Jyothula // PLoS One. 2012. - V. 7(4). - : e33454.

191. Martinvalet, D. Granzyme A induces caspaseindependent mitochondrial damage, a required first step for apoptosis/ D. Martinvalet, P. Zhu, J.Lieberman // Immunity. -2005.-V. 22.-P: 355-370.

192. Massey, A. Chaperone-mediated autophagy in aging and disease / A. Massey, C. Zhang, A. // Cuervo Curr. Top. Dev. Biol. 2006. - V. 73. - P: 205-235.

193. Matangkasombut, P. Natural killer T cells and the regulation of asthma / P. Matangkasombut, M. Pichavant, R.H. Dekruyff, D.T.Umetsu // Mucosal Immunol. -2009,-V. 2. -P: 383-392.

194. Mayer, M. P. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism / M. P. Mayer and B. Bukau // Cell. Mol. Life Sci. 2005. - V.62. - P: 670-684.

195. Mclntire, J.J. Identification of Tapr (an airway hyperreactivity regulatory locus) and the linked Tim gene family / J.J. Mclntire, S.E. Umetsu, O. Akbari et al. // Nat. Immunol. 2001. - V. 2: 1109-1116.

196. Mclntire, J.J. Immunology: hepatitis A virus link to atopic disease / J.J. Mclntire, S.E. Umetsu, C. Macaubas et al. // Nature. 2003. - V. 425. - P: 576.

197. Mehrpour, M. Overview of macroautophagy regulation in mammalian cells / M. Mehrpour, A. Esclatine, I. Beau, P. Codogno // Cell Res. 2010. - V. 20(7). - P: 748-762.

198. Melendez, A. Autophagy genes are essential for dauer development and life-span extension in C elegans / A. Melendez, Z. Talloczy, M. Seaman, et al. // Science. -2003.-V. 301. -P: 1387-91.

199. Melino, G. The Sirens' song/ G. Melino // Nature. 2001. - V. 412. - P: 23.

200. Melsom, R.D. Demonstration of an unidentified 48 kD polypeptide in circulating immune complexes in rheumatoid arthritis / R.D. Melsom, P.R.Smith, R.N. Maini // Ann Rheum Dis. 1987. - V. 46(2). - P: 104-108.

201. Menendez-Benito, V. Autophagy in MHC class II presentation: sampling from within / Menendez-Benito V, Neefjes J. // Immunity. 2007. - V. 26. - P: 1-3.

202. Mizushima, N. A protein conjugation system essential for autophagy / N. Mizushima, T. Noda, T. Yoshimori et al. // Nature. 1998. - V. 395. - P: 395398.

203. Mizushima, N. Apgl6p is required for the function of the Apgl2p-Apg5p conjugate in the yeast autophagy pathway / N. Mizushima, T. Noda, Y. Ohsumi // EMBO J 1999; 18: 3888-96.

204. Mizushima, N. Autophagosome formation in mammalian cells / N. Mizushima, Y. Ohsumi, T.Yoshimori // Cell Struct Funct. 2002. - V. 27. - P: 421-429.

205. Mizushima, N. Mouse Apgl6L, a novel WD-repeat protein, targets to theautophagic isolation membrane with the Apgl2-Apg5 conjugate / N. Mizushima,

206. A. Kuma, Y. Kobayashi et al. // J Cell Sci. 2003. - V. 116. - P: 1679-1688.165

207. Mizushima, N. The pleiotropie role of autophagy: from protein metabolism to bactericide // Cell Death Differ. 2005. -V. 12. - P: 1535-1541.

208. Moore, C. Elevated levels of soluble HLA class I (sHLA-I) in children with atopic dermatitis / C. Moore, M. Ehlayel, J. Inostroza et al. // Ann. Allergy Asthma Immunol. 1997. - V. 79(2). - P: 113-138.

209. Moriyasu, Y. Autophagy in tobacco suspension-cultured cells in response to sucrose starvation / Y. Moriyasu, Y. Ohsumi // Plant Physiol. 1996. - V.l 11. - P: 1233-1241.

210. Mortimore, G.E. Intracellular protein catabolism and its control during nutrient deprivation and supply / G.E. Mortimore, A.R. Poso // Annu. Rev. Nutr. 1987. -V.7. - P: 539-564.

211. Mosser, D.D. The chaperone function of IIsp70 is required for protection against stressinduced apoptosis // Mol. Cell. Biol. 2000. - V. 20. - P: 7146-7159.

212. Mozafari, M.R. A review of scanning probe microscopy investigations of liposome-DNA complexes / M.R. Mozafari, C.J. Reed, C. Rostron, V. Hasirci // J. Liposome Res. 2005. - V.15. - P: 93-107.

213. Multhoff, G. A stress- inducible-72-kDa heat-shock protein (HSP72) is expressed on the surface of human tumor cells, but not on normal cells / G. Multhoff, C. Botzler, M. Wiesnet et al. // Int. J. Cancer. 1995. -V. 61. -P: 272-279.

214. Multhoff, G. Heat shock protein 70 (hsp70) stimulates proliferation and cytolytic activity of natural killer cells / G. Multhoff, L. Mizzen, C.C. Winchester et al. // Exp. Hematol. 1999. -V. 27. - P: 1627-1636.

215. Mutalithas, K. Bronchoalveolar lavage invariant natural killer T cells are not increased in asthma / K. Mutalithas, J. Croudace, C. Guillen et al. // J Allergy Clin Immunol. 2007. - V. 119. - P: 1274-1276.

216. Nangaku, M. Mechanisms of immune-deposit formation and the mediation of immune renal injury / M. Nangaku, W.G. Couser // Clinical and experimental nephrology.-2005.-V. 9. -P: 183-191.

217. Nedelsky, N.B. Autophagy and the ubiquitin-proteasome system: collaborators in neuroprotection / N.B. Nedelsky, P.K. Todd, J.P. Taylor // Biochim Biophys Acta. 2008. - V. 1782(12). - P: 691-699.

218. Nedjic, J. Macroautophagy, endogenous MHC II loading and T cell selection: the benefits of breaking the rules. J. Nedjic, M. Aichinger, N. Mizushima, L. Klein // Curr. Opin. Immunol. 2009. - V. 21. - P: 92-97.

219. Nemes, Z. Expression and activation of tissue transglutaminase in apoptotic cells of involuting rodent mammary tissue/ Z. Nemes, Jr. Friis, R. R. Aeschlimann et al. // Eur J Cell Biol. 1996. - V. 70. - P: 125-133.

220. Nezlin, R. A quantitative approach to the determination of antigen in immune complexes / R. Nezlin // J Immunol Methods. 2000. - V. 237. - P: 1-16.

221. Nivon, M. Autophagy activation by NFkappaB is essential for cell survival after heat shock / M. Nivon, E. Richet, P. Codogno, A.P. Arrigo and C. Kretz-Remy// Autophagy. 2009. - V. 5. - P: 766-783.

222. Nollen, E.A.A. Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing 'heat shock' proteins / E.A.A. Nollen and R.I. J. Morimoto // Cell Sci. -2002. V. 115. - P: 2809-2816.

223. Oda, M. Effects of antibody affinity and antigen valence on molecular forms of immune complexes / M. Oda, S. Uchiyama, M. Noda et al. // Mol Immunol. -2009. -V. 47(2-3). P: 357-64.

224. Ogier, D.E. Authophagy: a barrier or an adaptive response to cancer. / D. E Ogier, P. Codogno //Biochem. Biophys Acta.-2003.-T.1603.-C.l 13-128.

225. Orvedahl, A. Autophagy protects against Sindbis virus infection of the central nervous system / A. Orvedahl, S. MacPherson, R. Sumpter et al. // Cell Host Microbe. 2010. - V. 7. - P: 115-127.

226. Pardo, J. Apoptotic pathways are selectively activated by granzyme A and/or granzyme B in CTL-mediated target cell lysis / J. Pardo, A. Bosque, R. Brehm et al. // JCB. 2004. - V. 167(3). - P: 457-468.

227. Parsell, D.A. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins / D.A. Parsell and S. Lindquist // Annu. Rev. Genet. 1993. - V. 27. - P: 437-496.

228. Pearl, L. H. The Hsp90 molecular chaperone: an open and shut case for treatment / L. H. Pearl, C. Prodromou and P. Workman // Biochem. J. 2008. - V. 410. - P: 439-453.

229. Penaloza, C. Cell death in development: shaping the embryo / C. Penaloza, L. Lin, R. A. Lockshin, Z. Zakeri // Histochem Cell Biol. 2006. - V. 126. - P: 149-158.

230. Petiot, A. Distinct classes of phosphatidylinositol 3'-kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT-29 cells / A. Petiot, E. Ogier-Denis, E.F. Blommaart, et al. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P: 992998.

231. Picard, D. Heat-shock protein 90, a chaperone for folding and regulation/ D.Picard // Cell. Mol. Life Sci. 2002. - V. 59 (10). - P: 1640-1648.

232. Pohlers, D. Constitutive upregulation of the transforming growth factor-^ pathway in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts / D. Pohlers, A. Beyer, D. Koczan et al. // Arthritis. Res. Ther. 2007. - V. 9 (3). - P: 59-65.

233. Poon, A. H. Genetic and histologic evidence for autophagy in asthma pathogenesis / A.H. Poon, F. Chouiali, S.M. Tse et al. // J Allergy Clin Immunol. 2012. - V. 129.-P: 569-571.

234. Poon, A. H. ATG5, autophagy and lung function in asthma / A. IT. Poon, D.H. Eidelman, C. Laprise, Q. Hamid // Autophagy. 2012. - V. 8(4). - P: 694 - 695.

235. Pua, H.H. A critical role for the autophagy gene Atg5 in T cell survival and proliferation/ H.H. Pua, I. Dzhagalov, M. Chuck, N. Mizushima, Y. W. He // J Exp Med. 2007. -V. 204(1). - P: 25-31.

236. Pua, H.H. Maintaining T lymphocyte homeostasis: another duty of autophagy/ H.H. Pua, Y.W. He// Autophagy. 2007. - V. 3(3). - P: 266-267.

237. Pua, H.H. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes/ H.H. Pua, J. Guo, M. Komatsu, Y.W. He// J Immunol. 2009. -V. 182(7). -P: 4046-4055.

238. Pua, H.H. Mitophagy in the little lymphocytes: an essential role for autophagy in mitochondrial clearance in T lymphocytes/ H.H. Pua, Y.W. He// Autophagy. -2009. -V. 5(5). P: 745-746.

239. Pumputiene, I. T cell and eosinophil activation in mild and moderate atopic and nonatopic children's asthma in remission / I. Pumputiene, R. Emuzyte, R. Dubakiene et al. // Clin Allergy. 2006. - V. 61(1). - P: 43-48.

240. Qing, G. Hsp90 inhibition results in autophagy-mediated proteasome-independent degradation of IkB kinase (IKK) / G. Qing, P. Yan, G. Xiao // Cell Research. -2006.-V.16.-P: 895-901.

241. Rai, N. K. Apoptosis: a basic physiologic process in wound healing / N. K. Rai, K.Tripathi, D.Sharma, V. K. Shukla // Int J Low Extrem Wounds. 2005. - V. 4. -P: 138-44.

242. Rathmell, J. C. The central effectors of cell death in the immune system / J. C. Rathmell, C.B. Thompson // Annu Rev Immunol. 1999. - V. 17. - P: 781- 828.

243. Reggiori, F. Autophagosomes: biogenesis from scratch? / F. Reggiori, D.J. Klionsky // Curr Opin Cell Biol. 2005. - V.17. - P: 415-422.

244. Richter K. Hsp90: chaperoning signal transduction / K. Richter, J. Büchner // J Cell Physiol.-2001.-V. 188(3). P: 281-290.

245. Roach H. I. Physiological cell death of chondrocytes in vivo is not confined to apoptosis. New observations on the mammalian growth plate / II. I. Roach, N. M. Clarke // J Bone Joint Surg Br. 2000. - V. 82. - P: 601-613.

246. Röhn, T.T. Depletion of Beclin-1 due to proteolytic cleavage by caspases in the Alzheimer's disease brain/ T.T. Röhn, E. Wirawan, R.J. Brown et al. //Neurobiol Dis. -2011.- V.43.-P: 68-78.

247. Rothe M. TRAF2-mediated activation of NF-kappa B by TNF receptor 2 and CD40 / M. Rothe, V. Sarma, V.M. Dixit, D.V. Goeddel // Science. 1995. - V. 269.-P: 1424-1427.

248. Rottem, M. Asthma as a paradigm for autoimmune disease / M. Rottem, Y. Shoenfeld // Int Arch Allergy Immunol. 2003. - V. 132(3). - P: 210-214.

249. Rubio-Moscardo, F. Characterization of 8p21.3 chromosomal deletions in B-cell lymphoma: TRAIL-R1 and TRAIL-R2 as candidate dosage-dependent tumor suppressor genes/ F. Rubio-Moscardo, D. Blesa, C. Mestre et al. // Blood. 2005. -V.106.-P: 3214-3222.

250. Rubinsztein, D.C. Novel targets for Huntington's disease in an mTOR-independent autophagy pathway / D.C. Rubinsztein, A. Williams, S. Sarkar, et al. // Nat Chem Biol. 2008. - V. 4(5). - P: 295-305.

251. Russell, J.H. Lymphocyte-mediated cytotoxicity / Russell, J.H. and T.J. Ley //Annu Rev Immunol. 2002. - V. 20. - P: 323-370.

252. Saelens, X. Toxic proteins released from mitochondria in cell death/ X.Saelens, N. Festjens, L.Vande Walle et al. //Oncogene. 2004. - V. 23. - P: 2861-2874.

253. Sakahira, H. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis/ H.Sakahira, M.Enari, S.Nagata // Nature. 1998. - V. 391. - P: 96-99.

254. Samali A. Heat shock proteins: regulators of stress response and apoptosis / A. Samali, S. Orrenius // Cell Stress Chaperones. 1998. - V. 3. - P: 228-236.

255. Sapozhnikov A. M. Translocation of cytoplasmic IISP70 onto the surface of EL-4 cells during apoptosis / A. M. Sapozhnikov, G. A. Gusarova, E. D. Ponomarev, W. G. Telford // Cell Prolif. 2002. - V. 35. - P: 193- 206.

256. Scaffidi, C. The role of c-FLIP in modulation of CD95-induced apoptosis/ C. Scaffidi, I. Schmitz, P.H. Krammerand, M.E. Peter // J Biol Chem. 1999. -V.274.-P: 1541-1548.

257. Schett G. Activation of Fas inhibits heat-induced activation of HSF1 and up-regulation of hsp70 / G. Schett, C.W. Steiner, M. Groger // FASEB J. 1999. - V. 13.-P: 833-842.

258. Sharp S. Inhibitors of the HSP90 molecular chaperone: current status / S. Sharp and P. Workman // Adv Cancer Res. 2006. - V.95. - P: 323-348.

259. Shintani T. Autophagy in health and disease: a double-edged sword / T. Shintani and D.J. Klionsky // Science. 2004. V. 306. - P: 990-995.

260. Schmid, D. Antigen-loading compartments for major histocompatibility complex class II molecules continuously receive input from autophagosomes // D. Schmid, M. Pypaert, C. Munz // Immunity. 2007. - V. 26. - P: 79-92.

261. Schmitt, E.Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy /, M. Gehrmann, M. Brunei, G. Multhoff, C. Garrido // Journal of Leukocyte Biology. 2007. - V. 81. - P: 15-27.

262. Schuler, M. Mechanisms of p53-dependent apoptosis/ M. Schuler and D.R. Green // Biochem Soc Trans. 2001. - V. 29. - P: 684-688.

263. Simon M.M. Heat shock protein 70 over expression affects the response to ultraviolet light in murine fibroblasts. Evidence for increased cell viability and suppression of cytokine release // J. Clin. Invest. 1995. - V.95. - P: 926-933.

264. Simon, G.R. The contribution of L-selectin to airway hyperresponsiveness in chronic allergic airways disease / G.R. Simon, L. Melissa, M.L.K. Tang // Journal of Asthma and Allergy. 2010. - V. 3. -P: 9-17.

265. Solarewicz-Madejek, K. T cells and eosinophils in bronchial smooth muscle cell death in asthma / K. Solarewicz-Madejek, T.M. Basinski, R. Crameri, M. Akdis // Clinical and Experimental Allergy. 2009. -V. 39: P. 845-855.

266. Spinozzi, F. Apoptosis, airway inflammation and anti-asthma therapy: from immunobiology to clinical application / F. Spinozzi, D. de Benedictis, F.M. de Benedictis // Pediatr Allergy Immunol. 2008. - V. 19(4). - P: 287-295.

267. Sreedhar A.S. Hsp90 isoforms: functions, expression and clinical importance / A. S. Sreedhar, E. Kalmar, P. Csermely, Yu-Fei Shen // FEBS Letters. 2004. -V.562.-P: 11-15.

268. Sreedhar A.S. Heat shock proteins in the regulation of apoptosis. A comprehensive review /A.S. Sreedhar and P. Csermely // Pharmacology and Therapeutics. 2004. -V. 101(3): 227-257.

269. Strawbridge, A.B. Autophagy in MHC class II antigen processing / A.B. Strawbridge, J.S. Blum // Curr Opin Immunol. 2007. - V. 19. - P: 87-92.

270. Susin, S.A. Two distinct pathways leading to nuclear apoptosis/ S.A. Susin, E. Daugas, L. Ravagnan et al. //J Exp Med. 2000. - V. 192. - P: 571-580.

271. Suzuki, K. The pre-autophagosomal structure organized by concerted functions of APG genes is essential for autophagosome formation / K. Suzuki, T. Kirisako, Y. Kamada et al. // EMBO J. 2001. -V. 20(21). - P: 5971-5981.

272. Szczeklik, A. Autoimmune phenomena in bronchial asthma with special reference to aspirin intolerance / A. Szczeklik, E. Nizankowska, A. Serafín, et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995,-V. 152.-P: 1753-1756.

273. Szumiel, I. Autophagy, reactive oxygen species and the fate of mammalian cells / I. Szumiel // Free Radie Res. 2011. - V. 45. - P: 253-265.

274. Takeshige K. Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction / K.Takeshige, M. Baba, S. Tsuboi, T. Noda, , Y. Ohsumi // J. Cell Biol. 1992. - V. 119. - P: 301-311.

275. Thomas, S.Y. Invariant natural killer T cells in bronchial asthma / S.Y. Thomas, C.M. Lilly, A.D.Luster // N Engl J Med. 2006. - V. 354. - P: 2613-2616.

276. Trapani, J. A. Functional significance of the perforin/ granzyme cell death pathway/ J.A. Trapani and M.J. Smyth // Nat Rev Immunol. 2002. - V. 2. - P: 735-747.

277. Umetsu, S.E. TIM-1 induces T cell activation and inhibits the development of peripheral tolerance / S.E. Umetsu, W.L. Lee, J.J. Mclntire et al. // Nat. Immunol. 2005. - V. 6:447-454.

278. Umetsu, D.T. Natural killer T cells are important in the pathogenesis of asthma: The many pathways to asthma / D.T. Umetsu, R.H. DeKruyff // The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2010. - V. 125(5). - P: 975-979.

279. Uttenweiler A. Microautophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae / A.Uttenweiler, A. Mayer // Methods in molecular biology. 2008. - V. 445. - P: 245-259.

280. Vanden Berghe T. Disruption of Hsp90 function reverts tumor necrosis factorinduced necrosis to apoptosis / T. vanden Berghe, M. Kalai, G. van Loo, W. Declercq, P. Vandenabeele // J Biol Chem. 2003. - V. 278. - P: 5622- 5629.

281. Vaux D. L. Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells / D. L. Vaux, S. Cory, J. M. Adams // Nature. -1988.-V. 335,-P: 440-442.

282. Vignola A.M. Increased expression of heat shock protein 70 on airway cells in asthma and chronic bronchitis / A.M. Vignola, P. Chanez, B.S. Polla et al. // AmJ Respir Cell Mol Biol. 1995. - V. 13. - P: 683-691.

283. Vijayanand, P. Invariant natural killer T cells in asthma and chronic obstructive pulmonary disease / P. Vijayanand, G. Seumois, C. Pickard et al.J // N Engl J Med. 2007. - V. 356. - P: 1410-1422.

284. Voskuyl, A.E. Diagnostic strategy for the assessment of rheumatoid vasculitis/ A.E. Voskuyl, J.M.Hazes, A.H.Zwinderman et al. // Ann Rheum Dis. 2003. -V. 62(5). -P: 407-413.

285. Wajant, H. The Fas signaling pathway: more than a paradigm/ H.Wajant // Science. 2002. - V. 296. - P: 1635-1636.

286. Warrick J.M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70 // Nat. Genet. 1999. - V. 23. - P: 425-428.

287. Waza M. 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, ameliorates polyglutamine-mediated motor neuron degeneration. M.Waza, H. Adachi, M. Katsuno et al. // Nat Med. 2005. -V.ll. -P: 1088-1095.

288. Waza M. Alleviating neurodegeneration by an anticancer agent: an Hsp90 inhibitor (17-AAG)/ M. Waza, H. Adachi, M. Katsuno // Ann N Y Acad Sei . -2006. -V.1086.-P: 21-34.

289. Weiner, H.L. Induction and mechanism of action of transforming growth factor-beta-secreting Th3 regulatory cells / H.L. Weiner // Immunol. Rev. 2001. - V. 182.-P: 207-214.

290. Wiederkehr, F. Analysis of circulating immune complexes isolated from plasma, cerebrospinal fluid and urine / F. Wiederkehr, M.R. Bueler, D.J. Vonderschmitt // Electrophoresis. 1991. -V. 12. - P: 478-486.

291. Wills-Karp, M. Chitin checking—novel insights into asthma / M. Wills-Karp, C.L. Karp // The New England Journal of Medicine. 2004. - V. 351(14). - P: 14551457.

292. Wu Y.P. Involvement of human heat shock protein 90 alpha in nicotine-induced apoptosis / Y.P. Wu, K. Kita, N. Suzuki // Int J Cancer. 2002. -V. 100(1). - P: 37-42.

293. Xia, W. Sensitization of tumor cells to fas killing through overexpression of heat-shock transcription factor 1 / W. Xia, R. Voellmy, N.L. Spector//J. Cell physiol. -2000.-V.183. -P: 425-431.

294. Xiao G. Alternative pathways of NF-kappaB activation: a double-edged sword in health and disease / G. Xiao, A. Rabson, W. Young, G. Qing, Z. Qu // Cytokine Growth Factor . 2006. - V. 17. - P: 281-293.

295. Xiao G. Autophagy and NF-kappaB: fight for fate // Cytokine Growth Factor Rev. 2007. - V. 18.-P: 233-243.

296. Xue, L. Inhibition of mitochondrial permeability transition and release of cytochrome c by anti-apoptotic nucleoside analogues / L. Xue, V. Borutaite, A.M. Tolkovsky // Biochem. Pharmacol. 2002. - V. 64. - P: 441-449.

297. Yamada T. Function of 90-kDa heat shock protein in cellular differentiation of human embryonal carcinoma cells / T. Yamada, A. LIashiguchi, S. Fukushima et al. // In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2000. - V. 36(2). P: 139-146.

298. Yang, Y.P. Molecular mechanism and regulation of autophagy / Y.P. Yang, Z.Q. Liang, Z.L. Gu, Z.H. Qin // Acta Pharmacologica Sinica. 2005. - V. 26 (12). - P: 1421-1434.

299. Ye, Y.M. Circulating Autoantibodies in Patients with Aspirin-intolerant Asthma: An Epiphenomenon Related to Airway Inflammation / Y.M. Ye, D.H. Nahm, S.H. Kim et al. // J Korean Med Sci. 2006. - V. 21. - P: 412-417.

300. Yousefi, S. Calpain-mediated cleavage of Atg5 switches autophagy to apoptosis / S. Yousefi, R. Perozzo, I. Schmid et al. // Nat Cell Biol. 2006. - V. 8. - P: 1124-1132.

301. Yoshimoto K. Processing of ATG8s, ubiquitin-like proteins, and their deconjugation by ATG4s are essential for plant autophagy / K. Yoshimoto, H. Hanaoka, S. Sato, et al.// Plant Cell. 2004. - V.16. - P: 2967-2983.

302. Yu, L. Regulation of an ATG7-beclin 1 program of autophagic cell death by caspase-8 / L. Yu, A. Alva, H. Su, et al. // Science. 2004. - V. 304(5676). - P: 1500-1502.

303. Yu L. Autophagic programmed cell death by selective catalase degradation / L. Yu, F. Wan, S. Dutta et al.// Proc Natl Acad Sci USA. 2006. - V. 103. - P: 49524957.

304. Zanin-Zhorov A. Heat shock protein 60 enhanced CD4+CD25+regulatory T cell function via innate TLR2 signaling / A. Zanin-Zhorov, L. Cahalon, G. Tal et al. // J. Clin. Invest. 2006. - V. 116. - P: 2022-2032.

305. Zhang M. Proteolysis of heat shock transcription factor is associated with apoptosis in rat Nb2 lymphoma cells / M. Zhang, M. J. Blake, P.W. Gout, D.J. Buckley, A.R. Buckley // Cell Growth Differ. 1999. - V. 10. - P: 759-767.

306. Zhang H. Targeting multiple signal transduction pathways through inhibition of

307. Hsp90 / H. Zhang and F. Burrows// J Mol Med. 2004. - V. 82. - P: 488-499.175

308. Zong W. X. Necrotic death as a cell fate / W. X. Zong, C. B. Thompson // Genes Dev. 2006. - V. 20.-P: 1-15.

309. Zosky, G.R. Airway hyperresponsiveness is associated with activated CD4+ T cells in the airways / G.R. Zosky, A.N. Larcombe, O.J. White et al. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009. - V. 297(2). - P: 373-379.

Информация о работе

Скибо, Юлия Валерьевна
кандидата биологических наук
Казань, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели T-лимфоцитов при атопической бронхиальной астме - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы