Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция гомеостаза микротелец дрожжей рода Candida

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция гомеостаза микротелец дрожжей рода Candida"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут біології клітини

Русин Ірина Богданівна

УДК 556.31 + 57: 012.4 + 017.7 + 052 + 086.3 + 577.121

РЕГУЛЯЦІЯ ГОМЕОСТАЗУ МІКРОТІЛЕЦЬ ДРІЖДЖІВ РОДУ CANDIDA

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Львів - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, професор Гудзь Степан

Петрович, Львівський Національний Університет імені Івана Франка, завідувач кафедри мікробіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Сологуб Леонід Ілліч, Інститут біології тварин НАН України, завідувач лабораторії обміну речовин;

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра мікробіології та загальної імунології

Захист відбудеться ”11” червня 2004 р. о 16® годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.246.01 по захисту кандидатських дисертацій при Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розіслано травня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Бабіч Тетяна Вікторівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, молодший науковий співробітник відділу фізіології промислових організмів

доктор біологічних наук

Федорович Д.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення індукції біогенезу мікротілець, катаболітної репресії їх утворення, а також, деградації пероксисом під час утилізації різних вуглецевих сполук дріжджами має як прикладну, так і наукову цінність. Згадані процеси є недостатньо дослідженими. Дослідження регуляції гомеостазу мікротілець у дріжджів має важливе значення для ряду біотехнологічних і медичних розробок. Оскільки пероксисоми присутні практично у всіх еукаріотичних клітинах, дріжджеві пероксисоми використовують як зручну модель для вивчення функціонування пероксисом людини, що важливо для подолання багатьох важких захворювань, пов’язаних з пошкодженням гомеостазу пероксисом, зокрема, синдрома Зельвегера [Van den Bosch et al., 1992].

Дослідження гомеостазу пероксисом, які є місцем локалізації багатьох ферментних систем, і ферментативний вміст яких регулюється у відповідь до змін оточуючого середовища, вивчення засвоєння різних вуглецевих субстратів дріжджами відіграє важливу роль для отримання препаратів ферментів. Вивчення гомеостазу пероксисом дріжджів має також важливе практичне значення для розробки способів підвищення нагромадження етанолу в аеробних умовах при утилізації лактози, що є промисловим відходом, лактозозасвоючими Кребтрі-позитивними дріжджами С. kefir. При використанні мутантів з пошкодженими біогенезом і деградацією пероксисом для збродження лактози можна отримати підвищений вихід етанолу.

Оскільки функціонування пероксисом забезпечує здатність дріжджевнх клітин утилізувати багато різних субстратів, у тому числі сполук, забруднюючих довкілля, вивчення утилізації різних вуглецевих джерел живлення і процесів регуляції гомеостазу мікротілець дріжджами під час засвоєння цих сполук має важливе значення для розробки біологічних методів очищення навколишнього середовища. Важливою проблемою сучасності є пошук ефективних способів очищення довкілля від різноманітних полютантів, а зокрема, нафтозабруднень, які характеризуються токсичністю, тривалим розкладом і займають одне з основних місць серед усіх забруднень [Миронов, 1985; Изразль и соавт., 1986; Фединяк і співавт., 2001; Смирнова-Ефстифеева и соавт., 2002]. Ефективними методами очищення навколишнього середовища від токсичних сполук є біологічні, які базуються на використанні біодеструктивної здатності мікроорганізмів. Багато робіт останніх років присв’ячено пошуку активних мікроорганізмів-деструкторів вуглеводневих компонентів нафти для очищення забрудненого довкілля серед бактерій. Зокрема, це роботи по розробці систем очищення довкілля з використанням клітин бактерій Bacillus megaterium 1BD, Pseudomonas fluorescens 1-D біовар II, Basilius subtilis 2-D і ін. [Думанська, 1995; Стабникова и соавт., 1995]. Утилізація дріжджами вуглеводневих складників нафти, і зокрема неочищеної нафти, є недостатньо вивченою. Тому пошук дріжджевих штамів-десгрукторів представляє значний інтерес. Застосування дріжджів є перспективним у розв’язанні даної проблеми завдяки їх біодеструкгивній здатності і, зокрема, пероксисомальному розщепленні вуглеводнів нафти. Пероксисоми дріжджів, окрім участі в розщепленні багатьох вуглеводневих складників нафти і нафтопродуктів, беруть участь у катаболізмі також інших вуглецевих і азотних сполук-полютантів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною комплексно-тематичних досліджень кафедри мікробіології і лабораторії електронної мікроскопії біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка: Бг-12 Б „Розробка способів утилізації молочної сироватки - відходу молочної промисловості -рекомбінантними штамами пекарських дріжджів з метою отримання етилового спирту та білково-вітамінних препаратів”, 1NTAS 99-00788 ’’Principles of peroxisome biogenesis and degradation in yeast”.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідити утворення мікротілець і деякі інші регуляторні механізми їх гомеостазу під час утилізації різних джерел вуглецевого живлення дріжджами С. kefir ВКМ У-209, а також вивчити біодеструкторний потенціал дріжджів роду Candida, що базується на основі пероксисомного розщеплення вуглеводнів неочищеної нафти, обрати активні штами-деструктори нафти, що можуть бути застосовані для очищення навколишнього середовища.

Завдання дослідження були наступні.

1) Дослідити засвоєння дріжджами С. kefir ВКМ У-209 різних джерел вуглецевого живлення: від традиційних етанолу і лактози до таких невластивих як для лактозозасвоюючих дріжджів субстратів: етиламіну, олеату і вуглеводнів неочищеної нафти.

2) Продемонструвати формування пероксисом і деякі інші регуляторні механізми їх гомеостазу під час утилізації різних вуглецевих джерел у дріжджів С. kefir ВКМ У-209.

3) Вивчити утилізацію вуглеводнів неочищеної нафти дріжджами роду Candida

4) Показати участь пероксисом в процесах біодеструкції вуглеводнів нафти дріжджами роду Candida.

5) Обрати активні штами-деструктори вуглеводнів неочищеної нафти серед дріжджів роду Candida за ознаками росту в нафтовому середовищі, ступенем деструкції вуглеводневих складників нафти і шириною спектру їх утилізації.

Об’єктом дослідження в дисертаційній роботі були: мікротільця клітин дріжджів роду Candida.

Предметом дослідження в дисертаційній роботі були: процеси біогенезу, функціонування і деградації мікротілець при утилізації різних вуглецевих джерел дріжджами роду Candida.

Методи дослідження. Для досягнення мети роботи використовувались мікробіологічні, біохімічні, спектрофотометричні, електронномікроскопічні методи досліджень, а також проводилась статистична обробка результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано утилізацію дріжджами С. kefir ВКМ У-209 таких невластивих субстратів для лактозозасвоюючих дріжджів як етиламіну, олеату, вуглеводнів неочищеної нафти. Вперше підібрано оптимальні умови для засвоєння цих сполук дріжджами С. kefir ВКМ У-209. Висловлено припущення про причину слабкого засвоєння олеату а, можливо, також інших ненасичених жирних кислот як єдиного джерела вуглецю

з

дріжджами С. kefir ВКМ У-209. З’ясовано шлях катаболізму етанолу, утвореного під час утилізації лактози, в цих дріжджів.

Вперше показано індукцію біогенезу мікротілець під час росту у середовищі з лактозою, етанолом, етиламіном, олеатом та вуглеводнями неочищеної нафти у дріжджів С. kefir ВКМ У-209. Вперше продемонстровано наявність неповної глюкозної катаболітної репресії біогенезу пероксисом у дріжджів С. kefir ВКМ У-209 під час утилізації лактози. За умов дефіциту кисню під час утилізації лактози і етанолу як окремих субстратів живлення вперше показано неселективну автофагійну деградацію мікротілець у дріжджів С. kefir ВКМ У-209.

Показано здатність різних видів і штамів дріжджів роду Candida використовувати вуглеводні неочищеної нафти як єдине джерело вуглецю. Досліджено особливості утилізації природнього комплексу ароматичних, циклічних, інших вуглеводневих складників неочищеної нафти цими дріжджами. Висловлено припущення про можливі причини впливу високих концентрацій нафти на зниження росту різних штамів дріжджів.

В результаті досліджень біодеструктивної здатності дріжджів роду Candida відібрано 4 активних штами-деструктори вуглеводнів неочищеної нафти: С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917. Вперше запропоновано використати комплекс чотирьох активних штамів-деструкторів вуглеводнів неочищеної нафти дріжджів С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917, С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, що характеризуються взаємодоповнюючою деструкцією вуглеводнів нафти, для очищення довкілля від нафтозабруднень.

Вперше показано участь пероксисом в процесі біодеструкції вуглеводнів нафти штамів С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917. Отриманими результатами ультраструктурного аналізу ілюстровано і підтверджено запропоновану в літературі можливу схему транспорту н-алканів в клітину (пори, канали - ендоплазматичний ретикулум), і транспортування продуктів їх первинного окислення в клітині. Висловлено припущення про такий же шлях поступлення в клітину ароматичних вуглеводнів (фенілалканів і деяких ароматичних вуглеводнів з кількома бензольними кільцями), а також, міграції продуктів окислення фенілалканів в клітині. Висловлено ряд причин різної деструктивної здатності досліджених штамів роду Candida.

Практичне значення отриманих результатів. Дослідження процесів утилізації різних субстратів, регуляції гомеостазу пероксисом під час засвоєння різних вуглецевих джерел живлення дріжджами має важливе значення для розробки біологічних методів очищення навколишнього середовища, що базуються на основі пероксисомного розщеплення забруднюючих його сполук.

Відібрані 4 активні штами-деструктори вуглеводнів неочищеної нафти: С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917 є перспективними у використанні з метою очищення довкілля від забруднень нафтою і нафтопродуктів. Штами-деструктори відзначаються підвищеним виходом біомаси в середовищі з нафтою, високим ступенем руйнування сукупності всіх розглянутих вуглеводнів нафти загалом, а також, широким спектром утилізації окремих вуглеводневих складників нафти, в тому числі таких, які важко

руйнуються мікроорганізмами. Штами С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, характеризуються активним руйнуванням ароматичних вуглеводнів, штам С. gropengiesseri ВКМ У-737 відзначається інтенсивною деструкцією метано-нафтенових вуглеводнів, штам С. lipolytica ВКМ У-917 характеризується високим ступенем деструкції н-алканів. Штами-деструктори можна іммобілізувати з метою створення біотехнологічної системи для очищення навколишнього середовища від забруднень нафтою і нафтопродуктами. Завдяки взаємодоповнюючим нафто-деструкторним властивостям чотирьох штамів вперше запропоновано використовувати їх в комплексі.

Застосування біотехнологічної системи, створеної на основі комплексу іммобілізованих клітин обраних активних штамів-деструкторів дріжджів роду Candida: С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917, С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, що здійснюють біодеструкцію забруднюючих довкілля нафтових токсикогенних сполук є перспективним у вирішенні проблеми нафтозабруднень. Використання цих клітин дріжджів, здатних до біодеструкції компонентів нафти, серед яких є канцерогенні сполуки, дозволить знизити токсичний вплив нафтозабрудненого довкілля на людину і живі організми в цілому.

Особистий внесок здобувача. Дисертант є безпосереднім виконавцем всієї екпериментальної частини дисертаційної роботи. Здобувачем самостійно опрацьовано значну кількість вітчизняної і іноземної літератури по темі виконуваних досліджень. Автором самостійно обрано методи досліджень, проведено експерименти та отримано експериментальні дані. Електронно-мікроскопічні дослідження ультраструктури клітин проведено у співпраці з к.б.н., с.н.с. О.Р. Кулачковським. Визначення спектру і ступеню утилізації вуглеводнів нафти проведено у співвпраці із співробітниками Українського державного геологорозвідувального інституту і працівниками кафедри органічної хімії хімічного факультету Львівського Національного університету імені Івана Франка. Планування дослідів, представлених в 3.1 і 3.2 пунктах результатів, розбробку деяких робочих гіпотез, інтерпретацію частини результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником к.б.н., проф. С.П. Гудзем і к.б.н., м.н.с. О.М. Мороз.

Апробація результатів дисертації. Апробація роботи відбулась на засіданні міжкафедрального семінару кафедр мікробіології, фізіології людини і тварин та біофізики біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка 27 червня 2003 р. Результати досліжень дисертаційної роботи, апробовані на таких конференціях і семінарах: 3rd INTAS Interdisciplinary Symposium “General Biochemistry, Biotechnology and Enviroment” (Moscow, 14-17 December 2000); Звітна наукова конференція співробітників біологічного факультету Львівського Національного університету за 2000-2001 р. (Львів, лютий 2001); Семінар кафедри мікробіології Львівського Національного університету (Львів, 7 листопада 2001р.); Звітна наукова конференція співробітників біологічного факультету Львівського Національного університету за 2001-2002 р. (Львів, лютий 2002); Міжнародна наукова конференція студентів та молодих вчених “Політ” (Київ, 11-12 квітня 2002 р.); Биология - наука XXI века: 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2 0-24 мая 2002г.); 4-th Pamas С onference “Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes”

(Wroclaw (Poland), 15-17 September 2002); Звітна наукова конференція співробітників біологічного факультету Львівського Національного університету за 2002-2003 р. (Львів, лютий 2003); II Міжнародна науково-практична конференція „Ресурси природних вод Карпатського регіону /Проблеми охорони та раціонального використання/” (Львів, 15-16 травня 2003); Intemetional Weigl Conference “Microorganisms in pathogenesis and drug resitance” (Lviv, 11-14 September 2003).

Публікації. Результати досліжень викладені в 11 друкованих працях: в 6 статтях наукових журналів і в 5 тезах конференцій.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, розділу з описом м атеріалів і методів досліджень, розділу з викладом результатів експериментальних досліджень і їх обговоренням, висновків і списку використаної літератури, що складається з 148 найменувань. Повний обсяг дисертаційної роботи складає 135 сторінок. Робота ілюстрована 5 таблицями і 39 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Наведено дані про систематичне положення і загальну характеристику видів дріжджів роду Candida. Охарактеризовано метаболізм ряду вуглецевих сполук у дріжджів: метаболізм лактози, етанолу, етиламіну, олеату, вуглеводнів, зокрема, н-алканів, ароматичних сполук, нафтенів. Проаналізовано і систематизовано наукові дані про регуляцію метаболізму вуглецевих сполук у дріжджів: індукцію і репресію синтезу ферментів, катаболітну регуляцію, зокрема, глюкозну катаболітну репресію, ефект амонію і катаболітну інактивацію. Висвітлено дані про участь мікротілець дріжджів в метаболізмі вуглецевих сполук, регуляцію їх гомеостазу: біогенез пероксисом, глюкозну катаболітну репресію утворення мікротілець, деградацію пероксисом. Проаналізовано дані про роль дріжджів роду Candida в процесах біодеструкції н-алканів, ароматичних і циклічних вуглеводнів нафти, актуальність проблеми нафтових забруднень, пошук штамів-деструкторів компонентів нафти.

Матеріали і методи. Описано об’єкт дослідження, середовища культивування та умови вирощування дріжджів, ряд методів, використаних в експериментах для досягнення мети роботи.

Умови вирощування дріжджів і склад середовищ відрізнялись в експериментах. Під час дослідження біогенезу, деградації і катаболітної репресії утворення мікротілець під час росту у середовищі з лактозою, біогенезу і деградації пероксисом під час засвоєння етанолу дріжджі С. kefir ВКМ У-209 вирощували у середовищі Беркгольдера з додаванням 2% лактози чи 1% етанолу. Для створення аеробних умов культуру вирощували в 150 мл середовища в колбах Ерленмеєра об’ємом 500 мл і аерували на качалці (200 об./хв) при 30°С. Для досягнення умов дефіциту кисню клітини вирощували в майже повністю заповнених середовищем колбах і не аерували.

В дослідах по вивченні здатності утилізації етиламіну дріжджами С. kefir ВКМ У-209 і утворення мікротілець під час засвоєння цього субстрату середовище культивування не містило джерел азоту (сульфату амонію, дріжджового екстракту). До середовища додавали 1% глюкозу або не вносили її зовсім. Стерильний етиламін вносили після автоклавування середовища в діапазоні концентрацій від 0 до 3%.

В експериментах по вивченні утилізації олеату і біогенезу пероксисом при засвоєнні цієї сполуки клітини вирощували у середовищі Беркгольдера, до якого додавали 0,1% глюкозу або не вносили її зовсім. Після автоклавування до середовища додавали стерильний олеат в діапазоні концентрацій від 0 до 3%. Стерилізація олеату здійснювалась через бактеріальний фільтр.

Для визначення активності амінооксидази інкубованих клітин з етиламіном, отримували добовий інокулят після культивування клітин в рідкому середовищі YEPD при 30°С на круговій качалці. Клітини двічі стерильно відмивали дистильованою водою, осаджували центрифугуванням при 3000 об./хв протягом 10 хв, переносили в середовище Беркгольдера з етиламіном із глюкозою чи без глюкози та інкубували протягом 18 год при 30°С на круговій качалці.

В дослідах по вивченні біодеструкції вуглеводнів нафти, а також біогенезу пероксисом під час утилізації цього субстрату клітини дріжджів вирощували у середовищі Беркгольдера, після стерилізації якого додавали неочищену нафту із Старосамбірської свердловини № 8 Страшевицького родовища в діапазоні концентрацій від 0 до 20%. В якості емульгатора використовували Твін 80 у співвідношенні до нафти 1:12.

Клітини культивували в умовах аерації на круговій качалці (200 об./хв) при 30°С, крім зазначених дослідів, які проводили в умовах низького забезпечення клітин киснем.

Біомасу клітин визначали фотоелектроколориметричним і ваговим методом (під час визначення росту дріжджів у середовищі з нафтою). Для визначення проценту виживання клітини під час утилізації лактози відбирали через певні проміжки часу і висівали з розрахунку 100 колоній на чашку на середовище з лактозою. Електронномікроскопічні дослідження клітини дріжджів проводились як описано [Reynolds, 1963]. Перегляд і фотографування зразків проводили на електронному трансмісійному мікроскопі ПЕМ - 100 при прискорюючій напрузі 75 kV.

Вміст лактози в середовищі культивування визначали за методом Шомоді-Нельсона [Захарова и соавт., 1982]. Вміст етанолу визначали алкогольоксидазним методом з використанням набору “Алкотест” [Гончар і співавт., 1991]. Ефективність утворення етанолу з лактози визначали, враховуючи молярне співвідношення лактози і етанолу.

Активності (3-галактозидази [Guerente, 1985], ізоцитратліази [Reeves et al., 1971], амінооксидази [Zwart et al., 1983;] визначали в безклітинних екстрактах і виражали в нмоль/(хв • мг білка), а каталази [Liick, 1963] в ммоль/(хв • мг білка). Концентрацію білка в безклітинних екстрактах визначали за методом Лоурі [Lowry et al., 1951].

Визначення ступіню деструкції і спектру утилізації вуглеводнів нафти проводили з допомогою хіміко-бітумінологічного методу [Успенский и соавт., 1966]. Спектр утилізації вуглеводнів нафти визначали також 14-спектрофотометричним методом [Gruenfeld, 1973; Наканиси, 1965; Семенов, 1977].

Результати досліджень та їх обговорення.

Утилізація лактози дріжджами С. kefir ВКМ У-209. Утворення мікротілець і деякі інші регуляторні механізми їх гомеостазу під час росту у середовищі з етанолом і лактозою.

Досліджено засвоєння лактози і утворюваного з неї етанолу в умовах різного доступу кисню дріжджами С. kefir ВКМ У-209. Інтенсивний ріст і повне виживання клітин (рис.1, 2) за умов високого забезпечення киснем під час утилізації лактози вказує на проходження процесів дихання в результаті катаболізму етанолу до молекул ацетил-КоА і в результаті перетвореня глюкози до пірувату і ацетил-КоА, що поступають в ЦТК. Цикл Кребса, як відомо, супроводжується синтезом АТФ в результаті переносу електронів в дихальному ланцюзі, що забезпечує оптимальні умови для життя клітин, в тому числі інтенсифікацію біосинтетичних процесів, внаслідок чого і спостерігаються високі показники росту і виживання клітин. Отримані результати вказують на відсутність строгої глюкозної катаболітної репресії засвоєння етанолу і процесів дихання, яка могла мати місце у дріжджів С. kefir ВКМ У-209, оскільки вони є Кребтрі позитивними.

Для дріжджів С. kefir ВКМ У-209 характерна швидка індукція лактозою синтезу р-галактозидази в умовах як достатньої, так і недостатньої аерації (рис. 3). Після 24 год активність фермента знижується, що вказує на вичерпання з середовища лактози як індукторної сполуки. Утилізація лактози клітинами С. kefir ВКМ У-209 в результаті її гідролізу Р-галактозидазою на 24 год становить близько 75% і є майже повною за ЗО годин росту (рис. 4). Після 48 год вміст лактози в культуральному середовищі практично вичерпується.

Факт наявності меншої концентрації етанолу в середовищі при культивуванні клітин за аеробних умов до ЗО год росту, ніж це спостерігається при низькому забезпеченні клітин киснем, може бути виявом використання етанолу клітинами в присутності глюкози в середовищі, а також менш інтенсивним його утворенням, завдяки поступленню лактози через піруват і ацетил-КоА у ЦТК (рис. 5). Це є ще одним доказом неповної глюкозної катаболітної репресії ферментів катаболізму етанолу, які охоплюють ферментні системи дихання. Ще до повного вичерпання глюкози поряд із бродінням відбувається дихання (поступлення етанолу через ацетил-КоА і глюкози через піруват і ацетил-КоА у ЦТК). А значно нижча концентрація етанолу на ЗО год росту і зниження його кількості після ЗО год культивування, ніж в цей проміжок часу за умов дефіциту кисню, вказує на ще більш ефективне засвоєння етанолу після повної дерепресії всіх генів його катаболізму після майже цілковитого вичерпання глюкози із середовища. Після вичерпання лактози, глюкози або галактози в середовищі, клітини утилізують утворений етанол як єдине джерело вуглецю і енергії. За умов дефіциту кисню утилізація етанолу незначна і клітини дріжджів С. kefir ВКМ У-209 перебувають в стані вуглецевого голодування.

При вивченні кінетики індукції синтезу ізоцитратліази у клітин С. kefir ВКМ У-209, вирощених у середовищі з лактозою, активність фермента виявлено вже через 0,5 год росту (рис. 6), що є ще одним доказом неповної глюкозної катаболітної репресії ферментів дихання і, зокрема ізоцитратліази. За умов стресу голодування

ß-галактозидаза, hmo.W(xb * мг білка)

при низькому забезпеченні клітин киснем спостерігається інактивація ізоцитратліази в результаті неселективної автофагійної деградації мікротілець.

Час, год

Рис 1 Нагромадженні біомаси дріжджами С. kefir БКМ У-209 прн утилізації лактози за аеробних умов і умов дефіциту кисню

120

100

X go

£

5 60

2

А 40

20

0

hДефІЦИТ

кисню

0 10 20 ЗО 40 SO 60

Час, год

Рис. 2 Виживанні клітин дріжджів C. kefi г ВКМ У-209 прн утилізації лактози за аеробних умов і умов дефіциту кисню

Час, год

Рис. З Активність р-галакгозидази дріждюв С. kefir ВКМ У-209 під час росту в середовищі З лактозою за аеробних умов і умов дефіциту кисню

a 8 Й І?

Час, год

Рис.4 Утилізація лактози клітинами дріжджів C.kefir ВКМ У-209 за аеробних умов і умов дефіциту кисню

-аерація

дефіцит

Час, год

Рис.5 Концентрація етанолу в середовищі при утиліздшП дріжджами С. kefir ВКМ У- 209 лактози за аеробних умов і умов дефіциту кисню

Час, год

Рис.6 Активність ізоцитратліази дріядаів С.ке/іг ВКМ У* 209 при рості у середовищі з лактозою за аеробних умов і умов дефіциту кисню

Досліджено ультраструктуру клітин дріжджів С. kefir ВКМ У-209 під час утилізації етанолу як єдиного джерела вуглецю і енергії для (рис. 7) і лактози (рис. 8) за аеробних умов (А) і умов дефіциту кисню (Б) на 12, 24, 48 години росту.

Рис. 7 Ультраструктура клітин дріжджів С. kefir ВКМ У-209 при утилізацій етанолу за аеробних умов (А) і умов дефіциту кисню (Б) на 48 годину росту, (я — ядро; в - вакуоля; г - гліоксисома (мікротільце); м - мітохондрія; ер -ендоплазматичний ретикулум; жв - жирове включення)

Під час росту у середовищі з лактозою і етанолом як окремими субстратами живлення за аеробних умов в усіх фазах росту в клітинах цих дріжджів формуються мікротільця. За умов стресу голодування при низькому забезпеченні клітин киснем спостерігається різке сповільнення біогенезу мікротілець, відбувається активізація деградативних процесів, інактивація ізоцитратліази в результаті неселективної автофагійної деградації мікротілець.

Отже, результати ряду досліжень по визначенню біомаси і виживання клітин, концентрації етанолу і синтезу ізоцитратліази, електронно-мікроскопічні дослідження (динаміка утворення і кількість мікротілець, число і розвиток мітохондрій) показують існування у цих дріжджів неповної глюкозної катаболітної репресії біогенезу мікротілець і ферментних систем дихання і, зокрема, ферменту ізоцитратліази. Показано індукцію біогенезу мікротілець і неселективну автофагійну їх деградацію під час росту у середовищі з лактозою і етанолом як окремими субстратами живлення для клітин за умов аерації і дефіциту кисню, відповідно.

А)

тттдл

Рис.8 Ультраструктура клітин дріжджів С. кс/іг ВКМ У-209 при утилізації лактози за аеробних умов на 12 годину росту (А) і умов дефіциту кисню на 48 годину росту (Б) (я - ядро; в — вакуоля; г - гліоксисома (мікротільце); м -мітохондрія; ер - ендоплазматичний ретикулум; жв - жирове включення).

Утилізація етшаміну і олеату дріжджами С. kefir ВКМ У-209. Утворення мікротілець під час засвоєння етиламіну і олеату

Дріжджі С. kefir ВКМ У-209 здатні утилізувати такий невластивий субстрат для лактозозасвоюючих дріжджів як етильований амін. Дріжджі цього виду здатні засвоювати етиламін як джерело азоту, а не вуглецю. Утилізації етиламіну як джерела вуглецевого живлення запобігає репресуючий “ефект амонію” і тому дріжджі потребують додаткового внесення в середовище культивування джерела вуглецю - глюкози. Оптимальні концентрації етиламіну для вирощування клітин є 1% без додавання глюкози і 0,5% з 1% глюкозою (рис. 9, 10). Високі концентрації етиламіну є токсичними для клітин.

2,5 -

-»-0.5% ч 2S

-0-1% г 1,5 -

—п—1.5% U

-а-2% 1 1- О

—•—2.5% w 0,5 -

-0-3%

-0-0% 0 -

Час, год

Рис. 9 Ріст клітин дріжджів С. kefir ВКМ У-209 у середовищі з етиламіному діапазонах концентрацій від 0 до 3%

А) '• Б)

«0,5%

-1%

-1,5%

-2%

-2,5%

-3%

-0%

Час, год

Рис. 10 Ріст клітин дріжджів С. ке/іг ВКМ У-209 у середовищі з 1% глюкозою та егиламіном у діапазонах концентрацій: від 0 до 3%

Рис. II Ультраструктура клітин дріжджів С. kefir ВКМ У-209 при утилізацій 0.5% етиламіну і 1% глюкози: (А) х6369, (Б) х6730; (п- пероксисома).

В клітинах дріжджів С. kefir ВКМ У-209 під час утилізації етиламіну спостерігається індукція біогенезу пероксисом, що беруть участь в процесі катаболізму цього субстрату (рис. 11). Під час культивування клітин у середовищі з етиламіном як єдиним джерелом живлення, в клітинах дріжджів виявлена активність амінооксидази (табл. 1).

Таблиця I.

Активність амінооксидази, визначена в безклітинних екстрактах клітин С. kefir ВКМ У-209, вирощених у середовищі з етиламіном і з глюкозою чи без глюкози

Індукція синтезу фермента Джерело азоту, % Джерело вуглецю (глюкоза), % Амінооксидаза, нмоль/(хвмг білка)

вирощування Етиламін, 0,5 І 25,7± 1,2

Етиламін, 1 — 16,8 ± !,1

Сульфат амонію, 0,35 1 0,0

Дріжджі С. kefir ВКМ У-209 здатні засвоювати ще одне невластиве для них джерело вуглецевого живлення - олеат. Дріжджі цього виду здатні утилізувати олеат при лімітованому вмісті глюкози в середовищі. Оптимальна концентрація для росту клітин є 0,5 і 1 % олеату в присутності 0,1% глюкози. Засвоєння олеату, а, можливо, також інших ненасичених жирних кислот як єдиного джерела вуглецю, відбувається слабо, що, можливо, зумовлено особливостями регуляції синтезу специфічних пероксисомальних ферментів їх катаболізму в присутності глюкози. Під час засвоєння олеату як єдиного джерела вуглецю, і в присутності глюкози, в клітинах індукується біогенез мікротілець, які беруть участь в катаболізмі олеату (рис. 12).

Б)

Рис. 12 Ультраструктура клітин дріжджів С. ке/Іг ВКМ У-209 при утилізацій' 0,5% олеату: без глюкози (А) х6038 і з 0,1 % глюкозою (Б) х2583

Отже, було показано здатність дріжджів С. kefir ВКМ У-209 засвоювати лактозу, етанол, етиламін, олеат. В утилізації всіх цих різних субстратів, катаболізм яких значно відрізняється, беруть участь мікротільця. Досліджено деякі регуляторні механізми гомеостазу пероксисом під час утилізації різних вуглецевих джерел живлення дріжджами С. kefir ВКМ У-209.

Утилізація вуглеводнів нафти і формування мікротілець дріжджами С. kefir ВКМ У-209 під час росту в нафтовому середовищі

Дріжджі С. kefir ВКМ У-209 здатні утилізувати такий нетрадиційний вуглецевий субстрат як вуглеводні неочищеної нафти в якості єдиного джерела вуглецю. Під час росту у нафтовому середовищі в клітинах дріждів цього виду спостерігається незначний біогенез пероксисом.

Біодеструкція вуглеводнів нафти дріжджами роду Candida Проведено вибір активних штамів-деструкторів вуглеводнів неочищеної нафти серед дріжджів роду Candida. Визначено ріст 20 штамів у середовищі з

вуглеводнями неочищеної нафти у діапазоні концентрацій 0; 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 15; 20% протягом 3 діб. Досліджені штами дріжджів роду Candida здатні використовувати вуглеводні неочищеної нафти як єдине джерело вуглецю (рис. 13 ). Ріст штамів у середовищі з емульгатором як єдиним джерелом вуглецю є незначним. Дріжджі виявились здатними утилізувати нафту, що міститься в середовищі в широкому діапазоні концентрацій і, навіть, у високих концентраціях - 15-20%. Максимальний ріст вісьмох штамів спостерігався при концентрації нафти 15%, трьох штамів - при 12% нафти, ще чотирьох - при 10% і п’яти штамів - при 8% нафти у середовищі. Нафта у високих концентраціях виявляє інгібуючий вплив на ріст штамів. Висловлено припущення про можливі причини впливу високих концентрацій нафти на зниження росту різних штамів дріжджів. Такою причиною може бути накопичення токсичних катаболітів вуглеводнів в більшій кількості, ніж це відбувається при нижчих концентраціях нафти у середовищі. Крім цього, зниження росту клітин може пояснюватись зниженням надходження в клітину вуглеводнів внаслідок недостатнього аерування і перемішування, а також, внаслідок, слабко виражених емульгуючої здатності дріжджів і розвитку деяких ультраструктур (пор, каналів клітинної стінки), що беруть участь в імпорті вуглеводнів. Зниження росту штамів при різних концентраціях нафти може пояснюватись різною чутливістю дріжджів до рівня токсичних речовин, різною транспортною активністю внаслідок різної емульгуючої здатності, а також різних

4.5 4

3.5 З

2.5 2

1.5

1

0,5

С? ^ Z' / ,^s Jї У J' J1 ^

9 J ^ J J ¿ .// ¿V .</ y ^

4^ A» ^ J? ¿f

v л y /X ^ /X ^ ^ ^ ~v ^ ^

*

. .<P .ve

«// * * -

^ Штами

C-

o* cf o* J? jr ^

Рис. 13 Нагромадження біомаси дріжджами роду Candida у середовищі з нафтою в оптимальній концентрацій для росту кожного штаму

ультраструктурних особливостей клітини. Серед 20 штамів чотири штами: С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917, С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093 відзначались підвищеним продукуванням біомаси середовищі з нафтою. Відібрані деструкторні мікроорганізми характеризувались у 2,3 - 3,3 р. інтенсивнішим ростом порівняно зі штамом С. pulcherrima ВКМ У-95 (Р>0,999), у

якого спостерігався найслабший ріст при оптимальній концентрації нафти в середовищі.

Обрані чотири штами-деструктори характеризуються високим, майже однаковим, ступенем руйнування сукупності всіх розглянутих вуглеводнів нафти загалом. За чотири доби штамами зруйновано майже половину розглянутих вуглеводневих компонентів нафти (рис. 14).

Рис. 14 Ступінь деструкції вуглеводневих компонентів нафти дріжджами за чотири доби

Дріжджі С. rhagii ВКМ У-1520 і С. robusta ВКМ У-1093 відзначались дещо вищим ступенем деструкції вуглеводнів нафти, який складав 47,5 і 46,6% відповідно, порівняно з С. gropengiesseri ВКМ У-737 і С. lipolytica ВКМ У-917(Р<0,95).

Розглянуті штами відзначаються широким спектром утилізації окремих вуглеводневих складників нафти, в тому числі таких, які важко руйнуються мікроорганізмами (табл. 2). С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, характеризуються активним руйнуванням ароматичних вуглеводнів (37,5% і 35,7%, відповідно). Штам С. gropengiesseri ВКМ У-737 відзначається інтенсивною деструкцією метано-нафтенових вуглеводнів (38,7%), а С. lipolytica ВКМ У-917 характеризуються високим ступенем деструкції н-алканів (99,9%). Завдяки цим взаємодоповнюючим властивостям всі чотири штами є перспективними у використанні з метою очищення довкілля від забруднень нафтою. Продовженням роботи планується іммобілізація штамів-деструкторів з метою створення біотехнологічної системи для очищення навколишнього середовища від забруднень нафтою і нафтопродуктів.

Участь пероксисом в біодеструюіії вуглеводнів неочищеної нафти

Показано участь пероксисом в процесі біодеструкції вуглеводнів нафти. В клітинах дріжджів штамів-деструкторів виявлені високі концентрації ізоцитратліази (рис. 15) і каталази (рис. 16), ферментів, які є спільними для катаболізму різних вуглеводнів нафти і беруть участь в пероксисомному окисленні як н-алканів, так і алкільованих, гідроксильованих ароматичних вуглеводнів з одним бензольним кільцем. У деструкторних штамів спостерігалась у 7,8 - 3,2 р. вища активність

100

^ 80 в4*

З бо--

а 40 • Г*-

So CQ m ^ Штам

каталази, ніж в контрольного штаму (Р>0,999). Активність ізоцитратліази дріжджів-деструкторів була вищою у 17,4- 9,5 р., ніж в штаму С. риІсИеггіта ВКМ У-95 (Р>0,999). Значно вищими значеннями активностей ферментів відзначався штам С. гИа^іі ВКМ У-1590, порівняно з іншими штамами, окрім штаму С. Ііроіуйса ВКМ У-917. Активність ізоцитратліази вказує на те, що метаболізм нафтових вуглеводнів відбувається через гліоксилатний шунт.

Таблиця 2.

Спектр утилізації вуглеводневих компонентів нафти дріжджами

Штам Компонент нафти ^**4. С. gropengiesseri ВКМ У-737 С. rhagii ВКМ У-1520 С, robusta ВКМ У-1093 С. lipolytica ВКМ У-917

Ступінь деструкції, %

Легкі вуглеводні з Іио1.<200’С 67,7 + 2,7 80,1 + 3,3 76,3 + 3,0 99,9 + 0,1

Метано-нафтенові вуглеводні, з І*т>200‘С 33,7+1,5 24,8+1,0 27,8 ± ІД 6,6 ± 0,3

Ароматичні сполуки 17,3 ±0,7 37,5+1,4 35,7+1,5 18,0 ±0,6

X Ч *

5:

V

.V * *1

<

*< —1 1 , СІ

*7

о кі ■<: >*

с г-

os

о ш

•S >*

з Р;

•22 г~~

£ >.

& 5 с *5 з ь*

1*1 и2

Ьо СО П ^

о

Штам

Рис. 15 Активність ізоцитратліази дріжджів, вирощених у середовищі з нафтою протягом чотирьох діб

0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05 -

J *

а £

^ O'

Is

5 о

■с >»

' s

Б

IS

ё.5

и

и | и® ¡-^

® ЬС о

О

Штам

Рис. 16 Активність каталази дріжджів, вирощених у середовищі з нафтою протягом чотирьох діб

о

Обрані штами-деструктори відзначаються присутністю в їх клітинах значної кількості пероксисом. В той час, як у дріжджів С. pulcherrima ВКМ У-95 і С. kefir ВКМ У-209, штамів, які характеризуються невисоким нагромадженням біомаси в

нафтовому середовищі і взяті як контрольні, спостерігається незначна кількість (1-2) пероксисом в клітинах (рис. 17).

Для нафтовирощених клітин штамів-деструкторів характерний сильно розвинутий ендоплазматичний ретикулум, що є ознакою високого рівня його метаболічної активності. Розташування інтенсивно розвинутого комплексу ендоплазматичного ретикулуму із пероксисомами довкола клітинної стінки у обраних штамів-деструкторів і відсутність такого комплексу у штамів з низькими ростовими показниками у середовиші з нафтою, відображає різний рівень розвитку у штамів пор і каналів. Отриманими результатами ілюстровано і підтверджено запропоновану в літературі можливу схему імпорту н-алканів в клітину (пори, канали - ендоплазматичний ретикулум), і транспортування продуктів їх первинного окислення в клітині. Таким чином, можливо, здійснюється поступлення в клітину ароматичних вуглеводнів (фенілалканів і деяких ароматичних вуглеводнів з кількома бензольними кільцями), а також, міграція продуктів окислення фенілалканів в клітині. Висловлено ряд причин різної деструктивної здатності досліджених штамів, в тому числі пов’язаних з ультраструктурними особливостями

Рис. 17 Ультраструктура клітин дріждасів роду Candida при утилізації вуглеводнів нафти (п - пероксисома; ер - ендоплазматичний ретикулум)

1) С. rhagii ВКМ У-1520 (Збільшення 5223)

2) С. robusta ВКМ У-1093 (Збільшення 7025)

3), 4) С lipolytica ВКМ У-917 (Збільшення 5600, 7220)

5) С. gropengiesseri ВКМ У-737 (Збільшення 5828)

6) С. pulcherrima ВКМ У- 95 (Збільшення 4969)

висновки

В дисертації приведене теоретичне узагальнення і нове розв’язання науково-практичної проблеми регуляції гомеостазу мікротілець під час утилізації різних джерел вуглецевого живлення дріжджами С. kefir ВКМ У-209, а також, біодеструкторного потенціалу дріжджів роду Candida, базованого на основі пероксисомного розщеплення вуглеводнів неочищеної нафти, що виявляється у дослідженні регуляції гомеостазу мікротілець під час засвоєння лактози, етанолу, етиламіну, олеату, вуглеводнів неочищеної нафти у дріжджів С. kefir ВКМ У-209 і відборі активних штамів-деструкторів нафти, що є перспективними у застосованні для очищення навколишнього середовища від нафтозабруднень. Для відібраних штамів характерні підвищений вихід біомаси в середовищі з нафтою, високий ступінь руйнування (44,2% за 4 доби) сукупності всіх розглянутих вуглеводнів нафти загалом, а також, широкий спектр утилізації окремих вуглеводневих складників нафти, в тому числі таких, які важко руйнуються мікроорганізмами.

1. Вперше показано утилізацію дріжджами С. kefir ВКМ У-209 таких невластивих субстратів для лактозозасвоюючих дріжджів як етиламіну, олеату, вуглеводнів неочищеної нафти.

2. Вперше показано індукцію біогенезу мікротілець під час росту у середовищі з лактозою, етанолом, етиламіном, олеатом, вуглеводнями неочищеної нафти у дріжджів С. kefir ВКМ У-209. Вперше продемонстровано наявність неповної глюкозної катаболітної репресії біогенезу пероксисом у дріжджів С. kefir ВКМ У-209 під час утилізації лактози.

3. Виявлено здатність 20 недосліджених в цьому відношенні штамів дріжджів роду Candida використовувати вуглеводні неочищеної нафти як єдине джерело вуглецю. В результаті досліджень біодеструктивної здатності дріжджів роду Candida відібрано 4 активних штамів-деструкторів вуглеводнів неочищеної нафти: С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917, які є перспективними у використанні з метою очищення довкілля від забруднень нафтою і нафтопродуктів.

4. Вперше показано індукцію біогенезу пероксисом під час росту у середовищі з вуглеводнями нафти у дріжджів С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917.

5. Показано, що штами С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, характеризуються активним руйнуванням ароматичних вуглеводнів (37,5% і 35,7%, відповідно), штам С. gropengiesseri ВКМ У-737 відзначається інтенсивною деструкцією метано-нафтенових вуглеводнів (38,7%), штам С. lipolytica ВКМ У-917 характеризується високим ступенем деструкції н-алканів (99,9%).

6. Завдяки взаємодоповнюючим деструкторним властивостям чотирьох штамів вперше запропоновано використовувати їх в комплексі для вирішення проблеми нафтозабруднень.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гудзь С.П., Гнатуш С.О., Русин І.Б., Кулачковський O.P., Мороз О.М. Морфофункціональні зміни клітин дріжджів Candida pseudotropicalis за різних умов культивування // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2001. -№ 27. -С. 183- 193.

2. Русин І.Б., Мороз О.М., Гудзь С.П., Гнатуш С.О., Кулачковський O.P. Індукція біогенезу пероксисом у дріжджів Candida pseudotropicalis за умов утилізації олеату й етиламіну // Вісник Львівського університету. - 2002. - №28. - С. 261-270.

3. Мороз О.М., Гудзь С.П., Кулачковський O.P., Русин І.Б., Перетятко Т.Б., Паляниця Б.Ю., Кутько І.О. Роль кодованої геном РЕХ1 АТФази, задіяної в біогенезі пероксисом метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha, у селективній автофагійній деградативній інактивації основних ферментів пероксисомного матриксу // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2003. - №32. - С. 37-55.

4. Русин І.Б, Карабин В.В., Мороз О.М., Гудзь С.П., Безноско Г.Я. Новий підхід до очищення стічних вод від вуглеводнів нафти // Ресурси природних вод Карпатського регіону (Проблеми охорони та раціонального використання) ІІ-Міжнародна науково-практична конференція (Львів 15-16 травня 2003р.): Збірник наукових статтей. - Львів, 2003.-С. 217-221.

5. Мороз О.М., Кулачковський O.P., Русин І.Б., Гнатуш С.О., Степанюк О.М., Венчак У.В., Перетятко Т.Б., Паляниця Б.Ю. Вплив генетично детермінованих пошкоджень механізмів біогенезу пероксисом та генерації сигналу глюкозної репресії на інактивацію алкогольоксидази в процесі макропексофагії у мутантів Hansenula polymorpha И Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2003-№34.-С. 114-127.

6. Русин І.Б., Мороз О.М., Карабин В.В., Кулачковський O.P., Гудзь С.П. Біодеградація вуглеводнів нафти дріжджами роду Candida II Мікробіологічний журнал. - 2003. - 65, №6. - С. 36-42.

7. Nazarko T.Y., Moroz О.М., Rusyn І.В., Stasyk O.Y., Kulachkovsky A.R., Gudz S.P., Sibimy A.A. Regulation of peroxisome homeostasis in methanol- and alkane-utilizing yeasts. INTAS 99-00788 // Proc. of the 3-rd INTAS Interdisciplinary Symposium on General Biochemistry, Biotechnology and Environment (Grant Monitoring Conference). -Moscow (Russian). - 2000. - P. 62-63.

8. Русин І.Б., Мороз O.M., Кулачковський O.P., Гудзь С.П. Пероксисоми дріжджів, їх функціонування і роль у біодеструкції вуглеводнів нафти, забруднюючих довкілля // Матеріали Міжнародної наукової конференції студентів та молодих учених “Політ-2002” (Київ 10-11 квітня 2002 p.). - Київ, 2002. - С. 172.

9. Русын И.Б., Гудзь С.П., Мороз О.М., Кулачковский O.P. Образование и функционирование микротелец у дрожжей Candida pseudotropicalis П Биология -наука XXI века: 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино 2024 мая 2002г.): Сборник тезисов. - Тула, 2002.-Т. З.-С. 55.

10. Rusyn I., Moroz О., Kulachkovsky О., Gudz S. Induction of peroxisome biogenesis in Candida pseudotropicalis II 4-th Pamas Conference “Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes” (Wroclaw (Poland), 15-17 September 2002). - Wroclaw, 2002. - P. 121

11. Rusyn I., Kulachkovsky O., Moroz O., Gudz S. Biodestruction of the oil hydrocarbons by Candida yeasts // Interactional Weigl Conference “Microorganisms in pathogenesis and drug resitance” (Lviv, 11-14 September 2003) ): Programe and abstract. - Львів, 2003.-С. 51.

АНОТАЦІЇ

Русин І.Б. Регуляція гомеостазу мікротілець дріжджів роду Candida — Рукопис. -Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2004.

Дисертація присвячена дослідженню біогенезу мікротілець і деяких інших регуляторних механізмів їх гомеостазу під час утилізації різних джерел вуглецевого живлення дріжджами С. kefir ВКМ У-209, а також вивченню біодеструкторного потенціалу дріжджів роду Candida, який базується на основі пероксисомного розщеплення вуглеводнів неочищеної нафти, і вибору штамів-деструкторів нафти, перспективних для застосовання з метою очищення навколишнього середовища від нафтозабруднень.

Вперше показано утилізацію дріжджами С. kefir ВКМ У-209 етиламіну, олеату, вуглеводнів неочищеної нафти. Вперше показано індукцію біогенезу мікротілець під час росту у середовищі з лактозою, етанолом, етиламіном, олеатом, вуглеводнями неочищеної нафти у дріжджів цього виду. Вперше продемонстровано наявність неповної глюкозної катаболітної репресії біогенезу пероксисом у дріжджів С. kefir ВКМ У-209 під час утилізації лактози. За умов дефіциіу кисню під час росту у середовищі з лактозою і етанолом як окремими субстратами живлення вперше показано неселективну автофагійну деградацію мікротілець у дріжджів С. kefir ВКМ У-209. В результаті досліджень біодеструктивної здатності дріжджів роду Candida відібрано 4 активних штами-деструктори вуглеводнів неочищеної нафти: С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917. Штами-деструктори відзначаються підвищеним виходом біомаси в середовищі з нафтою, високим ступенем руйнування сукупності всіх розглянутих вуглеводнів нафти загалом, а також, широким спектром утилізації окремих вуглеводневих складників нафти. Завдяки взаємодоповнюючим деструкторним властивостям чотирьох штамів вперше запропоновано використовувати їх в комплексі для вирішення проблеми нафтозабруднень. Штами-деструктори пропонується іммобілізувати з метою створення біотехнологічної системи для очищення навколишнього середовища від забруднень нафтою і нафтопродуктів.

Ключові слова', мікротільця (пероксисоми), дріжджі, утилізація, регуляція гомеостазу пероксисом, біогенез мікротілець, катаболітна репресія, нафтозабруднення, деструктори вуглеводнів нафти.

Русын И.Б. Регуляция гомеостаза микротелец дрожжей рода Candida -Рукопись. - Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2004.

Диссертация посвящена исследованию биогенеза микротелец и некоторых других регуляторных механизмов их гомеостаза во время утилизации разных источников углеродного питания дрожжами С. kefir ВКМ У-209, а также изучению биодеструкторного потенциала дрожжей рода Candida, который базируется на основе пероксисомного расщепления углеводородов неочищеной нефти, и выбору штаммов-деструкторов нефти, перспективных для применения с целью очищения окружающей среды от нефтезагрязнений.

Выявлена способность дрожжей С. kefir ВКМ У-209 усваивать различные углеродные соединения от дву- до многоуглеродных. Впервые показана утилизация дрожжами С. kefir ВКМ У-209 таких несвойственных субстратов для лактозоусваивающих дрожжей как этиламина, олеата, углеводородов неочищеной нефти. Дрожжи С. kefir ВКМ У-209 способны усваивать этиламин как источник азота, а не углерода. Утилизацию этиламина как источника углеродного питания предотвращает репресирующий “эффект аммония” и поэтому дрожжи требуют дополнительного внесения в среду культивирования источника углерода - глюкозы. Дрожжи этого вида способны утилизировать олеат при лимитированом содержании глюкозы в среде. Выявлена способность дрожжей С. kefir ВКМ У-209 использовать углеводороды неочищеной нефти как единственный источник углерода.

Исследованы некоторые регуляторные механизмы гомеостаза пероксисом во время утилизации разных субстратов углеродного питания у дрожжей С. kefir ВКМ У-209. Впервые показана индукция биогенеза микротелец во время утилизации лактозы (продукта сбраживания лактозы - этанола), этанола, этиламина, олеата, углеводородов неочищеной нефти у дрожжей С. kefir ВКМ У-209. Впервые продемонстрировано наличие неполной глюкозной катаболитной репрессии биогенеза пероксисом у дрожжей С. kefir ВКМ У-209 во время утилизации лактозы. Результаты ряда исследований по определению биомассы роста и выживания клеток, концентрации етанола и синтеза изоцитратлиазы, электронномикроскопические исследования (динамика образования и количество пероксисом, число и развитие митохондрий) показывают существование у этих дрожжей неполной глюкозной катаболитной репрессии биогенеза микротелец и ферментов дыхания, и, в частности, фермента изоцитратлиазы. Выявление у Кребтри-позитивных дрожжей С. kefir ВКМ У-209 интенсивного роста и полного виживания клеток во время утилизации лактозы в условиях аерации, выявление уже в первых стадиях роста активности изоцитратлиазы и биогенеза микротелец, а также более эффективна ассимиляция этанола, чем в условиях дефицита кислорода, указывают на существование у этих дрожжей неполной глюкозной катаболитной репрессии биогенеза микротелец и ферментов катаболизма этанола, которые охватывают ферментные системы дыхания. В условиях дефицита кислорода утилизация этанола очень незначительна и клетки дрожжей С. kefir ВКМ У-209 находятся в состоянии углеродного голодования. В условиях стресса питательного лимитирования наблюдается инактивация изоцитратлиазы в результате неселективной автофагической деградации микротелец. В условиях низкого обеспечения клеток кислородом во время роста в среде с лактозой и этанолом как отдельных субстратов

питания впервые показана неселективная автофагическая деградация микротелец у дрожжей С. kefir ВКМ У-209.

Выявлена способность 20 неисследованых в этом отношеннии штаммов дрожжей рода Candida использовать углеводороды неочищеной нефти как единственный источник углерода. Дрожжи оказались способными утилизировать нефть, которая содержится в среде в широком диапазоне концентраций и, даже, в высоких концентрациях - 15-20%. Максимальный рост восьми штаммов наблюдался при концентрации нефти 15%, трёх штаммов - при 12% нефти, ещё четырёх - при 10% и пяти штаммов - при 8% нефти в среде. Четыре штамма: С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917 характеризовались в 2,3 - 3,3 р. интенсивнешим ростом по сравнению со штаммом С. pulcherrima ВКМ У-95, у которого наблюдался самый слабый рост при оптимальной концентрации нефти в среде.

Впервые показано участие пероксисом в процессе биодеструкции углеводородов нефти штаммов С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917. В клетках штаммов этих дрожжей выявлены высокие концентрации изоцитратлиазы и каталазы, ферментов, которые являются общими для катаболизма разных углеводородов нефти и принимают участие в пероксисомном окислении как н-алканов, так и алкалированных, гидроксилированных ароматических углеводородов с одним бензольным кольцом. Штаммы, для которых характерно высокое нагромождение биомассы в нефтевой среде, отличаются присутствием в их клетках интенсивно развитого комплекса эндоплазматического ретикулума с пероксисомами вокруг клеточной стенки, в отличии от штаммов, которым свойственный слабый рост в данных условиях. Расположение пероксисомо-эндоплазматического ретикулярного комплекса вокруг клеточной стенки отображает разный уровень развития у штаммов пор и каналов. Полученными результатами иллюстрировано и подтвержено предложенную в литературе возможную схему импорта н-алканов в клетку (поры, каналы - ендоплазматический ретикулум), и транспортирование продуктов их первичного окисления в клетке. Таким образом, возможно, совершается поступление в клетку ароматических углеводородов (фенилалканов и некоторых ароматических углеводородов с несколькими бензольными кольцами), а также, миграция продуктов окисления фенилалканов в клетке.

В результате исследований биодеструктивной способности дрожжей роду Candida отобрано 4 активных штаммов-деструкторов углеводородов неочищеной нефти: С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917, которые являються перспективными в использовании с целью очистки среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Штаммы-деструкторы отличаються повышеным выходом биомассы в среде с нефтью, высокой степенью разрушения совокупности всех рассмотреных углеводородов нефти в общем, а также, широким спектром утилизации отдельных углеводородных компонентов нефти, в том числе таких, которые трудно разрушаются микроорганизмами.

Штаммы С. rhagii ВКМ У-1520, С. robusta ВКМ У-1093, характеризуруются активним разрушением ароматических углеводородов, штамм С. gropengiesseri

ВКМ У-737 отличается интенсивной деструкцией метано-нафтеновых углеводородов, штамм С. lipolytica ВКМ У-917 характеризуются высокой ступенью деструкции н-алканов.

Благодаря взаимодополнительным деструкторным способностям четырех штаммов впервые предложено использовать их в комплексе для решения проблемы нафтозагрязнений. Штаммы-деструкторы предложено иммобилизировать с целью создания биотехнологической системы для очиски окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Ключевые слова: микротельца (пероксисомы), дрожжи, утилизация, регуляция гомеостаза пероксисом, биогенез микротелец, катаболитна репресия, нефтезагрязнения, деструкторы углеводородов нефти.

Rusyn I.B. Regulation of microbody homeostasis in Candida yeasts. - Manuscript. -The Candidate Thesis for Ph. D. Degree, the Speciality 03.00.07. - Microbiology. -Institute of Cell Biology, Ukrainian National Academy of Science, Lviv, 2004.

Disertation is divoted to investigation of microbody biogenesis and some other regulatory mechanisms of their homeostasis during utilization of different carbone compounds in C. kefir ВКМ У-209. Disertation is divoted also to study of biodestructional potential in Candida yeasts that based on peroxisomal spliting of oil hydrocarbons and is divoted to choice of strains-destructors of oil, perspective for using with aim of cleaning of enviroment from oil pollutions.

Utilization of ethylamine, oleate and oil hydrocarbons by C. kefir ВКМ У-209 was showed first. Induction of microbody biogenesis during growth on lactose, ethanol, ethylamine, oleate and oil hydrocarbons in this yeast was showed first. Noncomplete glucose catabolite repression of peroxisome biogenesis during lactose utilization in C. kefir ВКМ У-209 was demonstrated first. Nonselective autophagic degradation of microbodies in C. kefir ВКМ У-209 during growth on lactose and also ethanol, as sole carbon source, under deficient maintenance of culture with oxygen was showed first. Four active strains-destructors of oil hydrocarbons C. rhagii ВКМ У-1520, C. robusta ВКМ У-1093, С. gropengiesseri ВКМ У-737, С. lipolytica ВКМ У-917 was chose after investigations of biodestructional capability of Candida yeasts. High biomass production during cultivation in presence of oil, high level of oil hydrocarbons destruction and also utilization of wide spectrum of oil hydrocarbons was revealed in strains-destructors. Four strains-destructors was suggested first to use in complex thanks to their intersupllementary biodestructional capabilities for solution of oil pollution problem. Strains-destructors was suggested to immobilize with aim of formation of biotechnological system for cleaning of enviroment from oil pollutions.

Key words: microbodies (peroxisomes), yeasts, utilization, regulation of peroxisome homeostasis, microbody biogenesis, catabolite repression, oil pollutions, distructors of oil hydrocarbons.