Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в зародышах куколя

Рагулин, Виталий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в зародышах куколя
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в зародышах куколя"

На правах рукописи

РАГУ ЛИН Виталий Викторович

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НИТРАТРЕДУКТАЗЫ В ЗАРОДЫШАХ КУКОЛЯ

03.00.12 - «физиология и биохимия растений»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных и физиологических механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Кузнецов Владимир Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кондратьев Михаил Николаевич

Ведущее учреждение: Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН.

Защита состоится 31 мая 2005 г. в 11 ч. на заседании Диссертационного совета К 002.210.01 в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (095)977 8018, e-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан 29 апреля 2005 года

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

Кузнецов Виктор Васильевич

доктор биологических наук

Носов Александр Владимирович

кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

£QCGzS-

WbW^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В качестве основного источника азота растения используют нитрат. Нитратредуктаза (HP) является ключевым ферментом процесса ассимиляции нитрата, ее активность определяет скорость восстановления растением неорганического азота и оказывает существенное влияние на весь азотный метаболизм.

В настоящее время в значительной степени остается открытым вопрос о механизмах регуляции экспрессии генов HP у растений. Как известно, нитрат является не только субстратом для HP, но и сигнальной молекулой, регулирующей экспрессию ее генов (Crawford 1995). Помимо нитрата, экспрессия данных генов регулируется сигналами гормональной природы, прежде всего цитокининами, которые синтезируются главным образом в корнях.

Условия обитания растений существенно влияют на процесс усвоения азота. Во многом это определяется чрезвычайной лабильностью HP. Особенно сильно активность HP подавляется в условиях экстремальных температур, жесткого водного дефицита, засоления и ряда факторов антропогенного происхождения. Предполагается, что падение активности HP в ответ на то или иное повреждающее действие является адаптивной реакцией растений, направленной на экономию энергетических и структурных ресурсов, а также на предотвращение возможного "аммиачного отравления". Механизмы "отключения" процесса ассимиляции неорганического азота при стрессе в настоящее время изучены недостаточно. Еще меньше исследованы механизмы регуляции экспрессии генов HP в стрессорных условиях (Кузнецов и др. 19916).

Изучение субстратной и гормональной регуляции экспрессии генов HP в нормальных условиях и при стрессе позволит не только понять механизмы ассимиляции нитратного азота у растений, но и выяснить взаимодействие различных систем регуляции клеточного метаболизма, что имеет важное общебиологическое значение.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы являлось изучение субстратной, гормональной и стрессорной регуляции экспрессии генов НР.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить регуляцию активности НР в зародышах куколя в оптимальных условиях и на фоне действия различных стрессорных факторов.

2. Исследовать гормональную и субстратную регуляцию экспрессии различных генов НР на уровне мРНК в норме и при стрессе.

3. Создать генно-инженерную конструкцию для бактериального синтеза фрагмента белка НР куколя.

Научная новизна. Впервые разработан методический подход для изучения экспрессии индивидуальных генов НР зародышей куколя с помощью подбора системы праймеров и последующего использования метода обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на данном объекте, а также на других растительных системах для решения смежных научных проблем.

Впервые изучена регуляция экспрессии индивидуальных генов НР куколя на уровне мРНК. Продемонстрирована дифференциальная экспрессия трех различных генов НР под действием индукторов гормональной и субстратной природы, а также стрессорных факторов.

Создана генно-инженерная конструкция для бактериального синтеза фрагмента белка НР куколя. Наработан необходимый объем данного фрагмента и осуществлена его очистка методом аффинной хроматографии с целью получения специфических антител против НР куколя, необходимых в последствии для изучения экспрессии генов НР на уровне белка.

Практическая значимость. Приведенные в работе данные о регуляции экспрессии генов НР в нормальных и стрессорных условиях имеют большое значение для изучения механизмов ассимиляции растениями нитрата и могут служить основой для создания трансгенных растений, обладающих способностью к более эффективному использованию почвенного азота. Полученные .экспериментальные данные и сделанные на их основе

теоретические обобщения могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических вузов.

Апробация работы. Результаты исследований представлялись на семинарах Лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (2001, 2003, 2004), на семинаре Института биохимии растений (Галле, Германия, 2002), на международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на межлабораторном семинаре Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и приложений. Работа изложена на 146 страницах машинного текста, включает 12 таблиц, 14 рисунков; библиография содержит 166 названия, в т.ч. 151 на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования регуляции экспрессии генов HP были использованы изолированные зародыши куколя (Agrostemma githago L.). Этот выбор объясняется следующими причинами:

1. Изолированные зародыши куколя - хорошо изученная растительная система, в которой HP активность индуцируется как субстратом (нитратом), так и фитогормоном (цитокинином) (Borriss et. al., 1967; Kende et. al., 1972; Hirschberg et al., 1972; Кулаева и др., 1976; Кузнецов В.В. и др., 1979; Кузнецов Вл.В. и др., 1991).

2. Показано, что индукция HP нитратом и цитокинином в данном объекте осуществляется за счет синтеза ферментного белка de novo (Borriss et. al., 1967; Kende et. al., 1972; Hirschberg et al., 1972)

3. Зародыши куколя обладают очень высокой чувствительностью к экзогенным нитрату и цитокинину и, в ответ на их действие, способны быстро индуцировать активность HP (Borriss et. al., 1967; Kende et. al., 1972).

4. HP - крайне лабильный фермент. Тепловой шок вызывает быструю ответную реакцию зародышей куколя, которая выражается, в частности, в резком падении HP активности (Кузнецов Вл.В. и др., 1991).

5. Нитрат и цитокинин индуцируют новообразование HP в этиолированных зародышах куколя в темноте, что позволяет изучать регуляцию экспрессии генов HP в условиях, исключающих влияние на этот процесс света (Borriss et. al., 1967; Kende et. al., 1972; Hirschberg et al., 1972). Все перечисленные выше обстоятельства делают изолированные зародыши

куколя очень удобной моделью для изучения механизмов субстратной, гормональной и стрессорной регуляции экспрессии генов HP.

Работа выполнена на семенах куколя расы Гатерслебен, любезно предоставленных проф. К. Конрадом (Грайфсвальдский университет, Германия).

В качестве индукторов использовали синтетический аналог природного цитокинина - 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 10'5 М и KNOj в концентрации 10 мМ.

Определение активности HP in vitro осуществляли по методу Ивенсона и Нейсона с модификациями Пейве Я.В. и др. (1968). Эксперименты проводили с тремя биологическими и тремя аналитическими повторностями для каждой из них. Полученные результаты обрабатывали статистически.

Выделение тотальной РНК и Нозерн-гибридизацию проводили как описано в статье Westhoff Р. et. al. (1981). Очистку тотальной РНК от примесей ДНК, обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию осуществляли с использованием ферментов и реактивов фирмы «Fermentas» по методам данной фирмы. Для оценки результатов ПЦР проводили электрофорез нуклеиновых кислот в 1,3% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Выделение ДНК осуществляли по методу Fulton Т.М. et. al. (1995).

Для получения плазмиды pQE30 со встроенным в нее фрагментом гена HP использовали метод, описание которого прилагалось к системе экспрессии QIAexpress pQE Vectors (продукция фирмы DIAGEN GmbH, Германия).

Электрофорез белка проводили в 12% полиакриламидном геле. Белки окрашивали с помощью кумаси по методу O'Farrell Р.Н. (1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Индукция активности HP под действием нитрата и цитокинина

Прежде чем начать изучение индукции экспрессии генов HP на уровне мРНК, мы исследовали полученную партию семян куколя на предмет выявления их способности отвечать на действие нитрата и цитокинина индукцией активности HP. Было также важно сравнить ход временных кривых развития HP активности с изменением интенсивности экспрессии генов HP на уровне мРНК.

С этой целью мы изучали динамику изменения активности HP в зародышах куколя в отсутствие индукторов (контроль) и в их присутствии (цитокинин и нитрат) через различные промежутки времени от начала инкубации. Результаты одного из типичных экспериментов представлены на рис. 1.

Полученные нами данные показали, что зародыши куколя отвечали на действие БАП и NO3" индукцией активности HP. Анализ представленных на рис. 1 результатов свидетельствует о том, что в случае индукции цитокинином кривая активности HP имела лаг-период продолжительностью от 3 до 6 часов. Затем активность фермента быстро возрастала, достигая максимума к 24 часам, далее наблюдалось ее падение. При изучении действия нитрата мы не обнаружили наличия лаг-периода, однако, ранее проведенные исследования показали, что лаг-период имеет место, но его длительность не превышает 45 минут (Кузнецов В.В. и др., 1979). Активность HP в случае индукции ее нитратом также достигала максимума к 24 часам, а затем падала. Наличие активности HP в контрольных зародышах могло быть обусловлено

присутствием в них эндогенных индукторов и онтогенетической регуляцией экспрессии генов НР.

БАП -»- ККО;

н2о

ащ^ - — О 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 Время действия, ч

Рис. 1 Временные кривые индукции активности НР нитратом и цитокинином.

Таким образом, временные кривые изменения активности НР в присутствии, как субстрата, так и гормона, имели типичный для индукционных процессов характер. Результаты данного эксперимента находятся в полном соответствии с ранее полученными данными (Кулаева О.Н. и др., 1976; Кузнецов В.В. и др, 1979). Это позволяет сравнить полученные нами результаты с накопленными в литературе данными по регуляции НР.

Продемонстрированное различие хода кривых индукции активности НР возможно является следствием дифференциальной регуляции экспрессии различных генов НР под действием цитокинина и нитрата. В качестве первого шага в изучении этого вопроса необходимо было исследовать экспрессию индивидуальных генов № на уровне мРНК. Исследования проводили с

использованием двух методов, позволяющих оценить уровень мРНК - метода Нозерн-гибридизации и метода ОТ-ПЦР.

Влияние цитокинина и нитрата на уровень мРНК НР

Для оценки действия субстрата и цитокинина на общий уровень транскриптов генов НР мы использовали метод Нозерн-гибридизации. При этом в качестве зонда был использован фрагмент кДНК гена НР куколя, синтезированный в процессе ПЦР и меченный изотопом фосфора (32Р) методом случайной затравки.

Постановка эксперимента по изучению действия БАП и нитрата на уровень мРНК НР аналогична постановке предыдущего опыта.

12 3456 789 10

Рис.2 Влияние цитокинина и нитрата на уровень мРНК НР.

3 - БАП 3 ч 7 - Ы03: 3 ч

1-Н203ч 4-БАП 12ч 8-N03'12ч

2-Н20 12ч 5-БАП 18ч 9-КГО3'18ч

6-БАП24 ч 10-Ш3"24ч

Полученные экспериментальные данные (Рис. 2) показали, что при инкубации зародышей куколя на дистиллированной воде, уровень мРНК НР был довольно низким. Как цитокинин, так и нитрат вызывали значительное увеличение уровня мРНК НР уже через 3 часа после начала их действия. При этом в обоих случаях максимальный уровень мРНК НР имел место через 12 часов от начала обработки, затем содержание матриц заметно падало.

Следует отметить, что уровни мРНК НР через 3 часа после начала действия нитрата и цитокинина были практически одинаковы. Это свидетельствует о том, что различия между индукционным действием нитрата и цитокинина, наблюдаемые на уровне активности НР, не могут быть объяснены

интенсивностью синтеза (или деградации) мРНК НР в рассматриваемых вариантах, а, очевидно, являются следствием различной регуляции на последующих уровнях экспрессии генов НР.

На первом этапе индукционного процесса (0-12 час) наблюдалась прямая зависимость между уровнем мРНК НР и активностью НР. Это можно рассматривать как один из аргументов в пользу того, что на данном этапе индукции скорость-лимитирующим событием в увеличении активности НР являлось новообразование соответствующих мРНК.

На последнем этапе индукции имело место падение как ферментативной активности НР, так и уровня аккумуляции транскриптов. Очевидно, на завершающем этапе индукционного процесса снижение уровня мРНК является одной из причин падения активности НР. Этот факт хорошо согласуется с ранее полученными данными, свидетельствующими об увеличении активности РНКаз в зародышах куколя в период "затухания" субстратной и гормональной индукции НР (Кузнецов Вл.В., 1979). Важно отметить, что любой индукционный процесс, включая индукцию НР, носит транзиторный характер, то есть он "появляется" в ответ на действие индуктора, после чего последствия индукционного ответа должны быть элиминированы. В противном случае клетка не сможет адекватно реагировать на вновь поступивший сигнал той же самой природы.

Таким образом, цитокинин и нитрат индуцируют активность НР, значительно увеличивая уровень ее мРНК. Это делает вполне вероятным предположение, что, по крайней мере, на начальном этапе индукции имела место транскрипционная регуляция экспрессии генов НР.

Одна из причин различного действия гормона и субстрата при индукции НР может заключаться в том, что два индуктора независимо друг от друга "активируют" разные гены НР. Сравнительно недавно стало известно, что в геноме куколя имеется не один или два, как у большинства растений, а три гена НР. Об этом свидетельствовало секвенирование трех различных кДНК, кодирующих НР куколя.

Экспрессия индивидуальных генов НР на уровне мРНК под действием нитрата и цитокиннна

Изучение экспрессии индивидуальных генов НР с помощью Нозерн-гибридизации не представлялось возможным из-за высокой степени их гомологичности и близости молекулярных масс транскриптов. Для решения данной задачи нам удалось адаптировать недавно разработанный метод определения уровня траскриптов индивидуальных генов, получивший название ОТ-ПЦР.

Последовательности кДНК трех генов НР куколя характеризуются высокой степенью гомологии (центральные участки кДНК генов Agnrl и AgnrЗ гомологичны на 93,9%; генов А%пг1 и А^г2 - на 82,4%, генов Agnr2 и AgnrЗ -на 82,1%). В связи с этим, подбор праймеров для проведения ПЦР с целью определения уровня мРНК индивидуальных генов был осложнен. Несмотря на трудности, нам удалось их подобрать, при этом для двух наиболее близких генов {А2пг1 и А$пгЗ) была использована одна пара праймеров. Разделение продуктов ПЦР двух указанных генов осуществляли с помощью рестриктазы Крп1, которая разрезала на две части (близких по молекулярной массе) молекулы кДНК гена AgnrЗ, но не гена Agnrl.

Используя разработанную нами методику определения аккумуляции мРНК индивидуальных генов НР, были получены следующие результаты (рис.3).

На рисунке видно, что в зародышах, выделенных из семян после 12 часовой инкубации на воде (Н20, 0 час), обнаруживается определенный уровень мРНК первого гена НР (AgnrI). На этом основании можно допустить, что экспрессия данного гена индуцировалась в процессе набухания семян. При инкубации изолированных зародышей на дистиллированной воде экспрессия гена Agnrl увеличивалась, уровень мРНК достигал максимума через 12 часов после выделения зародышей из семян, далее наблюдалось его снижение.

При помещении зародышей на раствор БАП интенсивность экспрессии гена Agnrl значительно возрастала, многократно превышая уровни мРНК НР в

соответствующих временных точках "водного" варианта. Уровень мРНК гена достигал наибольшего значения в 12 часовой точке, затем он несколько падал, оставаясь, тем не менее, довольно высоким.

а%пг!

• ш* •» т ФШ фЦ тт - '

agnr2

ацпгЗ

Ш т * *

асИп

^ ^ВИ^ ^йИЬ вИ^ ^ввР штшшятт

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17

Рис.3 Влияние цитокинина и нитрата на уровень мРНК генов НР.

1-Н2ООч 6-БАЛ 1ч 12-ЫОз" 1ч

2 - Н20 6 ч 7-БАП6ч 13-ИОз 6 ч

3 - Н20 12 ч 8 - БАП 12 ч 14-Ш3"12ч

4 - Н20 18 ч 9-БАЛ 18 ч 15-Ш3"18ч

5 - Н20 36 ч 10-БАЛ 24 ч 16-Ш3"24ч

11-БАЛ 36ч 17 -N03*36 ч

На обработку нитратом зародыши отвечали более быстрой, но менее значительной аккумуляцией мРНК гена Agnrl. Однако, как и в случае действия цитокинина, во всех изученных временных точках интенсивность субстратной экспрессии гена А%пг1 значительно превышала интенсивность экспрессии данного гена в контрольном варианте. Уровень мРНК НР также достигал максимума в 12 часовой точке.

Экспрессия третьего гена НР (AgnrЗ), как и экспрессия первого гена (^лг/), имела место уже в процессе набухания семян, достигая максимального значения к моменту изоляции зародышей. Уровень мРНК НР гена А^гЗ в зародышах, извлеченных из набухших семян, был значительно выше, чем уровень мРНК тънъА§пг1. Он имел и другую временную динамику:

если уровень мРНК гена Agnrl значительно возрастал при инкубации на воде после изоляции зародышей из семян, то уровень мРНК гена AgnrЗ достигал максимального значения к моменту изоляции зародышей и стабильно падал в течение последующих 36 часов инкубации на воде.

При инкубации зародышей на растворе БАП интенсивность экспрессии данного гена сначала незначительно увеличивалась, однако в дальнейшем падала, и, начиная с 12 часов эксперимента, уровень мРНК НР гена AgnrЗ был значительно ниже уровня мРНК гена Agnrl. Такая же картина наблюдалась и в варианте с МОГ, хотя увеличение нитратом экспрессии гена AgnrЗ было несколько более интенсивным.

Экспрессия второго гена НР (Agnr2) в процессе набухания семян, также как и в ходе последующей инкубации зародышей на воде, практически отсутствовала. Важно отметить, что и на действие цитокинина зародыши не отвечали индукцией экспрессии данного гена. Только нитрат оказался эффективным индуктором экспрессии гена Agnr2. Уровень мРНК указанного гена достигал максимума к 12 часам инкубации на растворе субстрата, после чего постепенно снижался.

Существенно, что обнаруженные нами закономерности дифференциальной регуляции экспрессии различных генов НР носят специфический (избирательный) характер, о чем свидетельствует одинаковый уровень аккумуляции мРНК гена актина во всех вариантах опыта. Таким образом, в данной работе впервые продемонстрирована дифференциальная экспрессия различных генов НР в растениях куколя.

Известно, что НР является своего рода мишенью действия стрессорных факторов. Ее инактивация приводит к прекращению ассимиляции растением нитрата. По этой причине исследование регуляции НР в экстремальных условиях является очень важным не только в теоретическом, но и в практическом отношении.

К началу данной работы не было известно, действуют ли стресс-факторы только на активность НР, инактивируя ее, или же одновременно имеет место

изменение экспрессии генов НР на уровне их мРНК. В случае если неблагоприятные факторы оказывают влияние на экспрессию генов НР на уровне мРНК, возникает следующий вопрос - в равной степени или избирательно действуют указанные факторы на уровень мРНК различных генов НР. Для ответа на эти вопросы была проведена серия экспериментов по изучению действия высоких концентраций №С1, СёСЬ и теплового шока на "работу" различных генов НР. Использование стрессоров различной природы позволило нам изучить общие закономерности ответа зародышей куколя на действие повреждающих факторов.

Влияние №С1 на активность НР и на уровень транскриптов кодирующих ее генов

Прежде всего нами был исследован эффект различных концентраций ИаС1 на гормон-индуцированную активность НР в зародышах куколя. С этой целью семена куколя помещали в чашки Петри с дистиллированной водой, через 12 часов из семян извлекали зародыши, которые в течение следующих 12 часов инкубировали на растворе БАП для индукции НР активности. Затем часть зародышей переносили либо на свежий раствор цитокинина (контроль), либо на растворы цитокинина и различных концентраций ШС1. Активность НР измеряли через 2, 4 и 6 часов после того, как зародыши были перенесены на растворы КаС1.

Как показано на рис.4, в зародышах, помещенных на 85 мМ раствор №С1, рост активности НР, вызванный действием БАП, прекращался. Соль в концентрациях 170 и 255 мМ вызывала небольшое падение ферментативной активности. Активность НР в зародышах значительно падала в присутствии 340 мМ ЫаС1. В последнем случае наиболее интенсивное падение активности НР наблюдалось в течение первых двух часов действия соли. Однако, поскольку в данных экспериментах нами не были исследованы более ранние временные интервалы воздействия ИаС1, нельзя исключать, что падение активности НР имеет место не через 2 часа, а значительно раньше.

' 4,5

- - БАП

—■—БАП+85мМ NaCI —БАП+170мМ NaCI

—*—БАП+255ММ NaCI —БАП+340мМ NaCI

О -О

Время действия, ч

Рис.4 Влияние различных концентраций NaCI на активность HP, индуцированную БАП.

Для выяснения влияния NaCI на экспрессию различных генов HP на уровне мРНК были проведены специальные опыты. Методика отличалась от указанных выше экспериментов тем, что уровень экспрессии генов HP измеряли через 12 часов после перенесения зародышей на растворы NaCI. Более длительный период действия соли был выбран нами исходя из предположения, что NaCI влияет на HP главным образом на уровне активности фермента, вызывая его инактивацию, и лишь на более позднем этапе оказывает воздействие на уровень мРНК. Как демонстрируют полученные нами данные, уровень мРНК HP генов Agnrl и Agnr3 не изменялся в ответ на действие 42, 85 и 170 мМ NaCI. В более высоких концентрациях (255 и 340 мМ) NaCI существенно подавлял аккумуляцию мРНК гена Agnrl (рис. 5). При этом уровень мРНК гена Agnr3 изменялся значительно слабее.

ШЛ,

асйп

1 2 3 4 5 6

Рис.5 Влияние различных концентраций ХаС1 на уровень мРНК НР.

1 -БАП 12 ч

4-БАП12ч+170м!УШаС1

2 - БАП 12 ч + 42мМ ЫаС1 5 - БАП 12 ч + 255мМ №С1

3 - БАП 12 ч + 85мМ ИаС1 6 - БАП 12 ч + 340мМ ЫаС1

Как было показано нами в предыдущем эксперименте (рис. 3), экспрессия гена А^гЗ на уровне мРНК существенно не изменялась ни под действием нитрата, ни под действием БАП и активировалась лишь в процессе набухания семян. Таким образом, ЫаС1 подавлял аккумуляцию мРНК НР, кодируемую геном Agnrl, экспрессия которого интенсивно индуцировалась цитокинином, и слабо влиял на синтез мРНК НР гена А§пгЗ, который практически не регулировался ни субстратом, ни гормоном.

Полученные данные не позволяют пока однозначно ответить на вопрос, ингибировал ли №С1 синтез мРНК НР или ускорял ее распад. Однако, принимая во внимание кратковременность эксперимента, наиболее вероятной представляется первая из двух высказанных возможностей.

Для изучения действия Сй2+ на активность НР был проведен эксперимент, аналогичный предыдущему, за исключением того, что зародыши помещали не на растворы ЫаС1, а на растворы СёСЬ-

Влияние СсЮ2 на активность НР

и на уровень транскриптов кодирующих ее генов

4,5

3,5

- ■ бап

—■—бап +10 4м сж"12 —♦—БАП+2,5 104МСаС12 * бап +5' ю "м сась

<8. -БАП +7,5 104мсась -—» - БАП+Ю'мсась

л е о

0,5

Время инкубации, ч

Рис.6 Влияние различных концентраций С<Ю2 на активность НР.

Полученные данные (рис.6) показывают, что в зародышах, инкубированных на растворе Ю-4 М СёСЬ, рост активности НР прекращался уже через 2 часа. Более высокие концентрации СсЮ2 вызывали не только остановку дальнейшего роста НР активности, но и значительное (примерно на 50%) ее падение.

Исследование влияния СёСЬ на экспрессию двух генов НР (Agnrl и А^гЗ) куколя позволило обнаружить, что ни одна из использованных концентраций С<12+ не влияла на аккумуляцию мРНК гена А^гЗ, тогда как высокие концентрации СсЗС12 (7,5 ' 10"4 М и 10"3М) значительно снижали уровень мРНК НР гена Agnrl (рис. 7).

Полученные данные позволяют сделать заключение о наличии дифференциальной стрессорной регуляции аккумуляции мРНК НР, кодируемой различными генами.

Ацпг!

AgnrЗ

асйп

1 2 3 4 5

Рие.7 Влияние различных концентраций СсЮ2 на уровень мРНК НР.

1 -БАП 12 ч

4 - БАП 12 ч + 5 10"4МСаС1;

2-БАП 12 ч+ 10"4МСёС12 5-БАП 12 ч+ 7,5 10"4МС(1С12

3-БАП 12 ч + 2,5 10"4М С<1С12 6-БАП 12 ч+ 10"3МСс1С12

Влияние теплового шока на активность НР и на уровень транскриптов кодирующих ее генов

Для изучения влияния теплового шока (ТШ) на активность НР изолированные зародыши помещали на раствор БАП. Через 12 час (30°С) инкубации чашки Петри с зародышами помещали в термостат (44°С) на различные периоды времени Контрольные зародыши оставались при 30°С. Активность НР измеряли через 2, 4 и 6 часов после того, как зародыши были перенесены в условия высокой температуры (рис. 8).

Представленные на рисунке данные показывают, что на повышение температуры зародыши реагировали резким падением активности НР уже через 2 часа после начала действия стрессора. Более длительная гипертермия приводила к 80% (4 час) и 100% (6 час) ингибированию НР активности.

Полученные данные по влиянию ТШ (44°С) на уровень мРНК НР (рис. 9) свидетельствуют о том, что 2-х часовое воздействие гипертермии не вызывало снижения интенсивности экспрессии гена Agnrl по сравнению с контролем (БАП 12 час, 30°С), хотя приводило к падению НР активности.

- ■€

—бап + 44с

- - бап

-0 5

Время инкубации, ч

Рис.8 Влияние теплового шока на активность НР, индуцированную цитокинином.

Через 4 часа после начала действия ТШ, интенсивность экспрессии гена Agnrl значительно снижалась, а 12 часовое воздействие гипертермии приводило к падению мРНК НР до уровня экспрессии гена, соответствующего контролю (24 часа, НгО, 30°С). В отличие от гена А%пг1 интенсивность экспрессии гена AgnrЗ была низкой и в ответ на действие высокой температуры практически не изменялась.

лёпп ♦ т т ** т . -1-« ш#

ас^н ^ИЯ®^ ^вЙИЙ^ ^ММЙ^ ^(вий^ 4мнр

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.9 Действие гипертермии на уровень мРНК НР.

3 - БАП 30°С 12 ч + 44°С 2 ч

1 -Н2О 30°С 12 ч 4 - БАП 30°С 12 ч + 44°С 4 ч 7-Н20 30°С24ч

2 - БАП 30°С 12 ч 5 - БАП 30°С 12 ч + 44°С 6 ч 8-БАП30°С24ч

6 - БАП 30°С 12 ч + 44°С 12 ч

При сопоставлении результатов экспериментов по влиянию высокой температуры на активность фермента и на уровень мРНК HP можно сделать вывод о том, что в течение первых часов ТШ уровень активности HP падал за счет инактивации HP. Тогда как к 4 часам гипертермии, помимо инактивации фермента, наблюдалось ингибирование транскрипции гена HP или разрушение уже синтезированной мРНК. Совокупность этих механизмов и определяет столь интенсивное падение HP активности при ТШ.

Таким образом, нами было продемонстрировано дифференциальное воздействие различных стрессорных факторов на экспрессию индивидуальных генов HP. Показано, что гипертермия, а также относительно высокие концентрации NaCl и CdCl2 вызывали падение уровня транскриптов гена Agnrl, но практически не влили на экспрессию гена Agnr3.

Создание конструкции для синтеза фрагмента белка HP куколя в E.coli и очистка этого белка

Для дальнейшего изучения регуляции экспрессии генов HP на уровне белка необходимо было создать систему для бактериального синтеза HP куколя и разработать метод ее очистки с целью получения специфических антител.

Система экспрессии QIAexpress pQE Vectors (продукция фирмы DIAGEN GmbH, Германия) позволяет получить фрагмент белка при наличии фрагмента ДНК, который кодирует данный полипептид. Фрагмент ДНК вставляется в плазмиду pQE, далее этой плазмидой трансформируется специальный штамм E.coli Ml5. В клетках бактерий осуществляется синтез полипептида, аминокислотная последовательность которого соответствует нуклеотидной последовательности используемого фрагмента ДНК.

В результате ряда генноинженерных манипуляций мы получили плазмиду pQE30 со встроенным в нее фрагментом кДНК гена Agnr2 длиной 539 пар нуклеотидов (рис. 10).

Затем указанной плазмидой был трансформирован штамм Ecoli Ml5. Далее мы проводили скрининг колоний, полученных на твердой питательной среде в присутствии необходимых антибиотиков. Для этого из индивидуальных

колоний получали небольшие объемы бактериальной культуры, индуцировали в них синтез фрагмента белка НР куколя, получали лизат бактерий и анализировали его путем проведения электрофореза белков в полиакриламидном геле. Таким образом, мы получали возможность выявить колонии, в которых осуществляется синтез рекомбинантного белка.

н.шШ1 ^ЖЗГ"

Продукт ГТЦР фрагмент гена Agnr2 длиной 8% п н

BamHl SphI Sacl Kpn] Smal Sali Pyl Hndlll Пол клинкер

■IHllKHL КОНЦЫ BamHl Hindlll

AmpR

Рис.10 Схема получения плазмиды pQE30 со вставкой фрагмента гена HP.

О наличии синтеза фрагмента белка HP свидетельствует появление на геле нового полипептида с молекулярной массой около 20 kDa, что хорошо видно при сравнении первой и второй дорожек окрашенного ПА А геля (рис.11).

Для очистки полученного фрагмента белка HP куколя от других белков E.coli использовали метод аффинной хроматографии. Плазмида pQE30 сконструирована таким образом, что полипептид, синтезирующийся с использованием данной системы экспрессии, содержит в себе 6 гистидиновых остатков. При пропускании бактериального лизата через специальную смолу, обладающую высоким сродством к данной аминокислоте, с ней связывается только рекомбинантный полипептид (в нашем случае - фрагмент HP), содержащий последовательность из остатков гистидинов. При этом обычные белки E.coli не способны связываться со смолой, что позволяет легко избавиться от них в результате промывки смолы соответствующими буферами

94 kDa __^ * - 'Ж

67 kDa --**' jtfc * »

43 kDa _ * '

30 kDa -

20,1 kDa -

14,4 kDa - __

Шт. Ль,

* "Щ

>й»> „ЙК1

1 2 3 4 5 6

Рис.11 Результат очистки фрагмента белка HP куколя, выделенного из E.coli.

1, 2 - бактериальный лизат, полученный из бактерий, выращенных с

добавлением (1) или без добавления индуктора (2)

3, 4, 5, 6 - фрагмент белка HP куколя после его очистки от белков E.coli

После очистки смолы от примесей элюировали прикрепленный к ней рекомбинантный полипептид. Это достигалось за счет увеличения кислотности буфера. При увеличении кислотности связи, удерживавшие полипептид на смоле, ослабевали, и он легко эллюировался. Затем полученный белок осаждали, растворяли в специальном буфере и проводили его электрофорез в полиакриламидном геле. Результаты электрофореза (рис. 11) свидетельствуют о высокой степени очистки синтезированного в клетках E.coli фрагмента белка HP куколя.

Итак, путем бактериального синтеза нами получен полипептид - фрагмент белка HP куколя, который будет использован в дальнейшей работе для получения специфических антител против HP куколя с целью исследования регуляции экспрессии генов данного фермента на уровне белка.

Таким образом, в данной работе была впервые убедительно продемонстрирована дифференциальная экспрессия различных генов HP на уровне мРНК в нормальных и стрессорных условиях. Показано, что экспрессия генов HP находится под гормональным, субстратным, онтогенетическим и

стрессорным контролем. Это свидетельствует о наличии в растениях сложной системы регуляции процесса ассимиляции неорганического азота, скорость-лимитирующим ферментом которого является НР.

Дифференциальная регуляция экспрессии различных генов НР позволяет объяснить обнаруженные ранее закономерности взаимодействия нитрата и цитокинина в зародышах куколя при индукции НР. Так, аддитивный эффект при совместном действии гормона и субстрата в процессе индукции НР (Кузнецов В.В. и др. 1979) является, очевидно, следствием независимой "активации" нитратом и цитокинином различных генов. В соответствии с полученными данными, добавление к зародышам нитрата вызывает индукцию экспрессии гена Agnr2 и усиление экспрессии гена Agnrl, тогда как добавление цитокинина приводит к значительному увеличению экспрессии гена Agnrl, но не вызывает индукцию экспрессии гена Agnr2.

Дифференциальная регуляция экспрессии различных генов НР как под действием индукторов НР, так и под действием стрессорных факторов хорошо согласуется с ключевой ролью НР в процессе восстановления нитрата и в азотном обмене растений в целом.

Особенности экспрессии генов НР, обнаруженные в данной работе, ставят новые вопросы, касающиеся механизмов посттрансляционной регуляции экспрессии генов НР, вклад которых в поддержание ферментативной активности, вероятно, весьма значителен, особенно в условиях повреждающего действия стрессорных факторов. Решению этих вопросов будет в значительной степени способствовать предложенный нами путь бактериального синтеза белка НР куколя.

ВЫВОДЫ

1. Динамика индукции активности НР в зародышах куколя в присутствии цитокинина и нитрата существенно различается. При действии цитокинина, в отличие от нитрата, имеет место продолжительный лаг-период в развитии активности фермента, несмотря на присутствие в среде индуктора. Обнаруженное различие, очевидно, реализуется на постранскрипционном уровне регуляции экспрессии генов НР.

2 Использование метода Нозерн-гибридизации позволило показать, что как гормон (цитокинин), так и субстрат (нитрат) регулируют экспрессию генов НР куколя на уровне аккумуляции мРНК.

3. Разработан методический подход для изучения экспрессии индивидуальных генов НР с помощью подбора системы праймеров и последующего использования метода обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Впервые продемонстрирована дифференциальная экспрессия различных генов НР. Установлено, что экспрессия гена Agnrl находится под онтогенетическим, гормональным и, в меньшей степени, под субстратным контролем. Экспрессия гена Agnr2 индуцируется нитратом, но не цитокинином. Ген AgnrЗ регулируется онтогенетически, хотя находится и под ослабленным субстратным и гормональным контролем.

4. Различные стрессоры, такие как засоление (ЫаС1), тяжелые металлы (СсЮг) и высокая температура в разной степени подавляют активность НР в зародышах куколя. Они оказывают дифференциальное воздействие на экспрессию индивидуальных генов НР, снижая уровень транскриптов гена Agnrl и практически не влияя на экспрессию гена AgnrЗ.

5. Сравнительный анализ влияния теплового шока на активность НР и на уровень ее мРНК показал, что стрессорное воздействие, прежде всего инактивирует фермент и лишь затем снижает уровень его мРНК. Это означает, что падение активности НР в первые часы действия стрессора обусловлено преимущественно инактивацией существующего фермента, тогда как при более длительном воздействии стрессора инактивация фермента

сопровождается одновременным ингибированием синтеза мРНК HP или ускорением ее распада.

6. Создана генноинженерная конструкция (экспрессирующий вектор) для бактериального синтеза фрагмента белка HP куколя; наработан необходимый объем рекомбинантного белка и осуществлена его очистка методом аффинной хроматографии. Данный фрагмент будет использован для выработки специфических антител и для изучения экспрессии генов HP на уровне белка с помощью Вестерн-гибридизации.

7. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что три различных гена HP куколя находятся под дифференциальным онтогенетическим, гормональным, субстратным и стрессорным контролем. Это обеспечивает тонкую регуляцию уровня мРНК HP в нормальных и стрессорных условиях и позволяет объяснить аддитивный характер взаимодействия гормона и субстрата при индукции активности HP.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. VI.V. Kuznetsov, A.G. Kruglova, O.I. Molodyuk, V.V. Karyagm, A.B. Mesheryakov, V.V. Ragulm, V.Yu. Rakitin, V.P. Kholodova. (2002) Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture. Edited by I.Machackova and G.A.Romanov. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London. P.195-203.

2. Рагулин B.B., Кузнецов Вл.В. (2003) Дифференциальная регуляция экспрессии генов нитратредуктазы нитратом и цитокинином. Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза. С.326.

3. Соболева А.Е., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2003) Аккумуляция мРНК пирролин-5-карбоксилат-синтетазы в процессе онтогенетического и стрессиндуцируемого накопления пролина в растениях. Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза С.336.

4. Соболева А.Е., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2003) Активизируется ли ген фосфоенол-пируват-карбоксилазы на ранних стадиях онтогенеза растений хрустальной травки при засолении? Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии», Пенза. С.337.

5. Холодова В.П., Грачева С.Н., Моркина Ю.С., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2003) Сохраняется ли стресс-индуцированный САМ у растений хрустальной травки после прекращения экстремального воздействия? Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза. С.350.

6. Холодова В.П., Грачева С.Н., Моркина Ю.С., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2004) Обратимость стресс-индуцированного формирования САМ-типа фотосинтеза у растений. Доклады академии наук. Т.395, №3, С.133-135.

7. Шорина М.В., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. (2005) Вовлекаются ли кадаверин и этилен в индукцию САМ-типа фотосинтеза у растений хрустальной травки? Доклады академии наук. Т.400. №1. С.139-141.

8. Рагулин В.В., Кузнецов В.В., Кузнецов Вл.В. (2005) Дифференциальная регуляция цитокинином и нитратом экспрессии генов нитратредуктазы куколя. Доклады академии наук. Т.402. (в печати)

Принято к исполнению 27/04/2005 Исполнено 28/04/2005

Заказ № 802 Тираж: 100 экз..

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www autoreferat.ru

- 7 7 3 Ъ

PH Б Русский фонд

2006z4 5994

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рагулин, Виталий Викторович

Оглавление.

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Нитратредуктаза, ее структура и функции.

1.2. Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в растениях.

1.2.1. Регуляция нитратредуктазы нитратом.

1.2.2. Регуляция цитокинином.

1.2.3. Регуляция HP светом.

1.2.3.1. Участие фитохрома в регуляции HP.

1.2.3.2. Влияние фотоассимилятов на активность HP.

1.2.3.3. Регуляция HP на посттрансляционном уровне.

1.2.4. Регуляция HP продуктами ассимиляции нитрата.

1.3. Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам среды.

1.3.1. Действие избыточного засоления на процесс восстановления нитрата

1.3.2. Действие Cd на процесс восстановления нитрата.

1.3.3 Действие теплового шока на активность HP.

Глава 2. Объект и методы исследования.

2.1 Объект исследования.

2.2. Методика постановки экспериментов.

2.3. Определение активности HP в зародышах куколя.

2.4. Выделение тотальной РНК.

2.5. Оценка относительного уровня мРНК HP методом Нозерн-гибридизации.

2.5.1. Денатурация РНК.

2.5.2. Электрофорез денатурированной тотальной РНК.

2.5.3. Перенос РНК с агарозного геля на мембрану.

2.5.4. Получение 32Р-меченого ДНК-зонда.

2.5.5. Подготовка нейлоновой мембраны с РНК.

2.6. Оценка относительного уровня мРНК HP методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

2.6.1 Очистка тотальной РНК от примесей ДНК.

2.6.2. Получение кДНК.Г.

2.6.3. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.6.4. Оценка результатов ПЦР.

2.7. Создание конструкции для оверэкспрессии фрагмента гена HP в E.coli и очистка этого белка.

2.7.1. Выделение тотальной ДНК из зародышей куколя.

2.7.2. Получение фрагмента гена Agnr2.

2.7.3. Получение плазмиды pQE30. со встроенным в нее фрагментом гена Agnr2.

2.7.4. Лигирование плазмиды pQE30 с фрагментом гена Agnr2.

2.7.5. Приготовление компетентных клеток штамма E.coli Ml 5.

2.7.6. Трансформация бактерий E.coli. плазмидой pQE30 с фрагментом гена HP куколя.

2.7.7. Проверка экспрессии фрагмента гена Agnr2 куколя и синтеза кодируемого им белка в E.coli.

2.7.8. Очистка рекомбинантного белка HP от других белков E.coli.

2.7.9. Перенос белка из полиакриламидного геля. на нитроцеллюлозную мембрану.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Индукция активности HP нитратом и цитокинином.

3.2 Влияние цитокинина и нитрата на уровень мРНК HP.

3.3. Экспрессия индивидуальных генов HP зародышей куколя в ответ на действие нитрата и цитокинина.

3.3.1. Основы метода ОТ-ПЦР, используемого для оценки. транскриптов индивидуальных генов.

3.3.2 Подбор праймеров для ОТ-ПЦР.

3.3.2.1 Подбор праймеров для индивидуальных генов HP.

3.3.2.2. Подбор праймеров для контрольного гена.

3.3.3. Экспрессия индивидуальных генов HP.

3.4. Влияние NaCl на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов.

3.5. Влияние CdC^ на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов.

3.6. Влияние теплового шока на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов.

3.7 Создание конструкции для синтеза фрагмента белка HP куколя в E.coli и очистка этого белка.

Выводы.

Список используемой литературы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в зародышах куколя"

Азот - один из важнейших химических элементов, входящих в состав растительного организма. Несимбиотические растения получают азот из почвы, главным образом в виде его неорганических форм. При этом основной формой неорганического азота в большинстве почв и, следовательно, основным источником азота для растений является нитрат. Нитратредуктаза (HP) - ключевой фермент процесса восстановления нитрата. Ее активность определяет скорость ассимиляции растением неорганического азота и оказывает значительное влияние на весь азотный метаболизм.

В настоящее время в значительной степени остается открытым вопрос о механизмах регуляции экспрессии генов HP у растений. Как известно, нитрат является не только субстратом, но и сигнальной молекулой, регулирующей экспрессию генов HP (Crawford 1995). На добавление нитрата растения, испытывающие недостаток азота, отвечают индукцией активности HP. В отсутствие нитрата активность данного фермента, как правило, поддерживается на крайне низком (стационарном) уровне. Помимо нитрата экспрессия генов HP регулируется еще и сигналами гормональной природы, прежде всего цитокининами, которые синтезируются главным образом в корнях растений.

Регуляция активности HP нитратом и цитокининами позволяет говорить о функционировании в растениях субстратной и гормональной регуляции экспрессии генов нитратредуктазы (Campbell 1999). Характер взаимодействия цитокинина и нитрата в системе индукции HP является аддитивным (Кузнецов В.В. и др., 19796). Исходя из этого, можно сделать предположение, что гормон и субстрат независимо регулируют работу одних и тех же или различных генов, кодирующих HP. В ряде растений обнаружено два и даже три гена, кодирующие апобелок HP (Caboche et al., 1992; Sueyoshi etal., 1995; Yuetal., 1998).

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы являлось изучение субстратной, гормональной и стрессорной регуляции экспрессии генов HP.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить индукцию активности HP в зародышах куколя в оптимальных условиях и на фоне действия различных стрессорных факторов.

2. Исследовать гормональную и субстратную регуляцию экспрессии различных генов HP на уровне мРНК в норме и при стрессе.

3. Создать генно-инженерную конструкцию для бактериального синтеза фрагмента белка HP куколя.

Научная новизна. Впервые разработан методический подход для изучения экспрессии индивидуальных генов HP зародышей куколя с помощью подбора системы праймеров и последующего использования метода обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на данном объекте, а также на других растительных системах для решения смежных научных проблем.

Впервые изучена регуляция экспрессии индивидуальных генов HP куколя на уровне мРНК. Продемонстрирована дифференциальная экспрессия трех различных генов HP под действием индукторов гормональной и субстратной природы, а также стрессорных факторов. Показано, что экспрессия гена Agnrl находится под онтогенетическим, гормональным и, в меньшей степени, под субстратным контролем. Экспрессия гена Agnr2 индуцируется нитратом, но не цитокинином. Ген Agnr3 регулируется онтогенетически, хотя находится и под ослабленным субстратным и гормональным контролем.

Получено экспериментальное подтверждение высказанной гипотезы, согласно которой в основе аддитивного эффекта совместного действия субстрата и гормона при индукции HP, а также способности одного индуктора вызывать увеличение активности фермента даже в период «затухания» активности HP, индуцированной другим индуктором, лежит способность нитрата и цитокинина независимо друг от друга активировать экспрессию различных генов, кодирующих HP.

Показано дифференциальное действие стрессорных факторов на экспрессию различных генов HP. Обнаружено, что экспрессия гена Agnrl значительно в большей степени подавляется высокими концентрациями NaCl и CdCb, а также тепловым шоком, чем экспрессия гена Agnr3.

На примере теплового шока продемонстрировано, что падение активности HP в первые часы действия стрессора обусловлено преимущественно инактивацией существующего фермента, тогда как при более длительном воздействии инактивация фермента сопровождается подавлением экспрессии генов HP на уровне мРНК.

Создана генно-инженерная конструкция для бактериального синтеза фрагмента белка HP куколя. Наработан необходимый объем данного фрагмента и осуществлена его очистка методом аффинной хроматографии с целью использования его для выработки специфических антител, необходимых в последствии для изучения экспрессии генов HP на уровне белка.

Практическая значимость. Полученные в работе данные о регуляции экспрессии генов HP в нормальных и стрессорных условиях имеют большое значение для изучения механизмов ассимиляции растениями нитрата и могут служить основой для создания трансгенных растений, обладающих способностью к более эффективному использованию почвенного азота. Полученные экспериментальные данные и сделанные на их основе теоретические обобщения могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических вузов.

Основные публикации:

1. VI.V. Kuznetsov, A.G. Kruglova, O.I. Molodyuk, V.V. Karyagin, A.B. Mesheryakov, V.V. Ragulin, V.Yu. Rakitin, V.P. Kholodova. (2002) Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture. Edited by I.Machackova and G.A.Romanov. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London. P.l 95-203.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и приложений. Работа изложена на 146 страницах машинного текста, включает 12 таблиц, 14 рисунков; библиография содержит 166 названия, в т.ч. 151 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Рагулин, Виталий Викторович

Выводы

1. Динамика индукции активности HP в зародышах куколя в присутствии цитокинина и нитрата существенно различается. При действии цитокинина, в отличие от нитрата, имеет место продолжительный лаг-период в развитии активности фермента, несмотря на присутствие в среде индуктора. Обнаруженное различие, очевидно, реализуется на постранскрипционном уровне регуляции экспрессии генов HP.

2. Использование метода Нозерн-гибридизации позволило показать, что как гормон (цитокинин), так и субстрат (нитрат) регулируют экспрессию генов HP куколя на уровне аккумуляции мРНК.

3. Разработан методический подход для изучения экспрессии индивидуальных генов HP с помощью подбора системы праймеров и последующего использования метода обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Впервые продемонстрирована дифференциальная экспрессия различных генов HP. Установлено, что экспрессия гена Agnrl находится под онтогенетическим, гормональным и, в меньшей степени, под субстратным контролем. Экспрессия гена Agnr2 индуцируется нитратом, но не цитокинином. Ген Agnr3 регулируется онтогенетически, хотя находится и под ослабленным субстратным и гормональным контролем.

4. Различные стрессоры, такие как засоление (NaCl), тяжелые металлы (CdCl2) и высокая температура в разной степени подавляют активность HP в зародышах куколя. Они оказывают дифференциальное воздействие на экспрессию индивидуальных генов HP, снижая уровень транскриптов гена Agnrl и практически не влияя на экспрессию гена Agnr3.

5. Сравнительный анализ влияния теплового шока на активность HP и на уровень ее мРНК показал, что стрессорное воздействие прежде всего инактивирует фермент и лишь затем снижает уровень его мРНК. Это означает, что падение активности HP в первые часы действия стрессора обусловлено преимущественно инактивацией существующего фермента, тогда как при более длительном воздействии стрессора инактивация фермента сопровождается одновременным ингибированием синтеза мРНК HP или ускорением ее распада.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рагулин, Виталий Викторович, Москва

1. Кузнецов В.В., Кузнецов Вл.В., Кулаева О.Н. (1977) Влияние нитрата и цитокинина на стабильность нитратредуктазы в изолированных зародышах куколя. Докл. акад. наук. Т.237. С.245-248

2. Кузнецов В.В. (1979а) Изолированные зародыши Agrostemma githago как система для изучения гормональной и субстратной индукции ферментов у растений. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. Москва, 1979.

3. Кузнецов В.В., Кузнецов Вл.В., Кулаева О.Н. (19796) Влияние нитрата и цитокинина на активность нитратредуктазы в изолированных зародышах куколя. Биохимия Т.44. вып.4. С.684-692.

4. Кузнецов Вл.В. (1979а) Гормональная регуляция синтеза нитратредуктазы в изолированных зародышах куколя. Физиол. растений. Т.26. вып.1. С.82-88.

5. Кузнецов Вл.В., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. (19796) Влияние цитокинина и нитрата на синтез РНК и нитратредуктазную активность в изолированных зародышах куколя. Физиол. растений. Т.26. Вып.2. С.309-317.

6. Кузнецов Вл.В., Овчаренко Г.А., Борисова Н.Н., Баскакова С.Ю., Измайлов С.Ф. (19916) Нитратредуктаза как мишень теплового шока. Докл. АН СССР. Т.321. №3. С.635-638.

7. Кузнецов Вл.В., Рощупкин Б.В., Борисова Н.Н., Яценко И.А. (1991а) Участвуют ли белки теплового шока в регуляции экспрессии гена нитратредуктазы Agrostemma githago L. при внезапном повышении температуры? Физиол. растений. Т.38. Вып.5. С.970-979.

8. Кузнецов Вл.В. (1992) Индуцибельные системы и их роль при адаптации растений к стрессорным факторам. Диссертация на соискание степени докт.биол.наук в форме научного доклада. Кишинев.

9. Кузнецов Вл.В., Рощупкин Б.В., Орлов О.П., Борисова Н.Н. (1991в) Гормональная регуляция экспрессии гена нитратредуктазы в зародышах куколя при тепловом шоке. ДАН СССР. Т.318. №1. С.252-255

10. Кулаева О.Н. (1973) Цитокинины, их структура и функции. М., "Наука", 264 с.

11. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В., Кузнецов В.В. (1976) Индукция цитокинином активности нитратредуктазы в изолированных зародышах Agrostemmagithago. Физиол. растений. Т.23. №6. С.1255-1263.

12. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. (2004) Новейшие достижения и перспективы изучения механизма действия фитогормонов и их участия в сигнальных системах целого растения. Вестник РФФИ. №2(36). С.12-36.

13. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Мир, 1984.

14. Пейве Я.В., Иванова Н.Н., Ширинская М.Г., Дуброво П.Н. (1968) Микроэлементы в сельском хозяйстве и медицине. Улан-Уде. С.417.

15. Серегин И.В., Иванов В.Б. (2001) Физиологические аспекты токсического действия кадмия и свинца на высшие растения. Физиол. растений. Т.48. Вып.4. С.283-300.

16. Abd-El Baki G.K., Siefritz F., Man H.M., Weiner H., Kaldenhoff R., Kaiser W.M. (2000) Nitrate reductase in Zea mays L. under salinity. Plant, Cell and Environment V.23. P.515-521.

17. Appenroth K.-J., Meco R., Jourdan V., Lillo C. (2000) Phytochrome and post-translational regulation of nitrate reductase in higher plants. Plant Sci. V.159 P.51-56.

18. Aslam M., Travis R.L., Huffaker R.C. (1994) Stimulation of nitrate and nitrite efflux by ammonium in barley (Hordeum vulgare L.) seedlings. Plant Physiol. V.106. P.1293-1301.

19. Aslam M., Huffaker R.C., Rains D.W. (1984) Early effects of salinity on nitrate assimilation in barley seedlings. Plant Physiol. V.76. P.321-325.

20. Aslam M., Travis R.L., Huffaker R.C. (1992) Comparative kinetics and reciprocal inhibition of nitrate and nitrite uptake in roots of uninduced and induced barley seedlings. Plant Physiol. V.99. P.l 124-1133.

21. Barcelo J., Poschenrieder C. (1990) Plant water relations as affected by heavy metal stress: a review. J. Plant Nutr. V.13. P.1-37.

22. Behl R., Tischner R., Raschke K. (1988) Induction of a high capacity nitrate uptake mechanism in barley roots prompted by nitrate uptake through a constitutive low capacity mechanism. Planta. V.176. P.235-240.

23. Binns A.N. (1994) Cytokinin accumulation and action: biochemical, genetic and molecular approaches. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V.45. P.173-196.

24. Borriss H., Wiss Z. (1967) Untersuchungen uder die Steuerung der Enzymaktivitat in pflanzlichen Embryonen Cytokinine. Univ. Rostock. Math-naurwiss. V.16. №4. P.629-639.

25. Boston R.S.; Viitanen P.V.; Vierling E. (1996) Molecular chaperones and protein folding in plants. Plant Mol. Biol. V.32. P. 191-222.

26. Botrel A., Magne C., Kaiser W.M. (1996) Nitrate reduction, nitrine reduction and ammonium assimilation in barley roots in response to anoxia. Plant Physiol. Biochem. V.34. P.645-652.

27. Brandstater I., Kieber J.J. (1998) Two genes with similiarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis. Plant Cell. V.10. P.1009-1019.

28. Brugnoli E., Bjorkman O. (1992) Growth of cotton under continuous salinity stress: influence on allocation pattern, stomatal and nonstomatal components of photosynthesis and dissipation of excess light energy. Planta. V.187. P.335-347.

29. Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. (2000) Biochemistry and molecular biology of plants. American society of plant physiologists. Rockville, Maryland.

30. Caboche M., Rouze P. (1992) Nitrate reductase: a target for molecular and cellular studes in Nicotiana plumbaginifolia. Trends Genet. V.6. P. 187-196.

31. Callaci J.J., Smarrelli J.J. (1991) Regulation of the inducible nitrate reductase isoform from soybeans. Biochim. Biophys. Acta. V.1088. P. 127-130.

32. Campbell W.H. (1999) Nitrate reductase structure, function and regulation: Bridging the gap between biochemistry and physiology. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V.50. P.277-303.

33. Chang C., Stewart R.C. (1998) The two-component system: regulation of diverse signalling pathways in prokaryotes and eukaryotes. Plant Physiol. V.l 17. P.723-731.

34. Cheeseman J.M. (1988) Mechanisms of salinity tolerance in plants. Plant Physiol. V.87. P.547-550.

35. Cheng C., Dewdney J., Kleinhofs A., Goodman H.M. (1986) Cloning and nitrate induction of nitrate reductase mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.83. P.6825-6828.

36. Cheng C.-L., Acedo G.N., Cristinsin M., Conkling M.A. (1992) Sucrose mimics the light induction of Arabidopsis nitrate reductase gene transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.89. P.l861-1864.

37. Clement C.R., Hopper M.J., Jones L.H., Leafe E.L. (1978) The uptake of nitrate by Lolium perenne from flowing nutrient solution. J. Exp. Bot. V.29. P.l 173-1178.

38. Coud K.V., Sharma R. (1994) Retention of photoinduction of cytosolic enzymes in aurea mutant of tomato {Lycopersicon esculentum). Plant Physiol. V.105. P.643-650.

39. Couia H., Chorbal M.H., Touraine B. (1994) Effects of NaCl on flows of N and mineral ions and on NO3' reduction rate within whole plants of salt-sensitive bean and salt-tolerant cotton. Plant Physiol. V.105. P.1409-1418.

40. Crawford N.M. (1995) Nitrate: nutrient and signal for plant growth. Plant Cell. V.7. P.859-868.

41. Crawford N.M., Arst H.N. (1993). The molecular genetics of nitrate assimilation in fungi and plants. Annu. Rev. Genet. V.27. P.l 15-146.

42. Crawford N.M., Campbell W.H., Davis R.W. (1986) Nitrate reductase from squash: cDNA cloning and nitrate regulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.83. P.8073-8076.

43. Crawford N.M., Glass A.D.M. (1998) Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants. Trends Plant Sci. V.3 P.389-395.

44. Crawford N.M., Smith M., Bellissimo D., Davis R.W. (1988) Sequence and nitrate regulation of the Arabidopsis thaliana mRNA encoding nitrate reductase, a metalloflavoprotein with three functional domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.85. P.5006-5010.

45. D'Agrostino В., Deruere Y., Kieber Y.Y. (2000) Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiol. V.124. P.1706-1717.

46. De Cires A., De la Torre A., Delgado В., Lara C. (1993) Role of light and CO2 fixation in the control of nitrate reductase activity in barley leaves. Planta. V.190. P.277-283.

47. Deruure Y., Kieber J. (2002) Molecular mechanisms of cytokinin signaling. J. Growth Regul. V.21. P.32-39.

48. Faure J-D., Jullien M., Caboche M. (1994) Zea3: a pleiotropic mutation affecting cotyledon development, cytokinin resistance and carbon-nitrogen metabolism. Plant J. V.5. №4. P.481-491.

49. Forde B.G., Clarkson D.T. (1999) Nitrate and ammonium nutrition of plants: physiological and molecular perspec-tives. Adv. Bot. Res. V.30. P. 1-90.

50. Forreiter C., Kirschner M., Nover L. (1997) Stable transformation of an Arabidopsis cell suspension culture with firefly luciferase providing a cellular system for analysis of chaperone activity in vivo. Plant Cell. V.9. P.2171-2181.

51. Fukuoka H., Ogawa Т., Minam H., Yano H., Ohkawa Y. (1996) Developmental stage-specific and nitrate-independent regulation of nitrate reductase gene expression in rapeseed. Plant Physiol. V.l 1. №1. P.39-47.

52. Fulton T.M., Chunwongse J., Tanksley S.D. (1995) Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants. Plant Mol. Biol. Rep. V.13. №3. P.207-209.

53. Glaab J., Kaiser W.M. (1993) Rapid modulation of nitrate reductase in pea roots. Planta V. 191. P. 173-179.

54. Glass A.D., Shaff J.E., Kochian L.V. (1992) Studies of the uptake of nitrate in barley. IV. Electrophysiology. Plant Physiol. V.99. P.456-463.

55. Glass A.D.M., Britto D.T., Kaiser B.N., Kinghorn J.R., Kronzucker H.J., Kumar A., Okamoto M., Rawat S., Siddiqi M.Y., Unkles S.E., Vidmar J.J. (2002) The regulation of nitrate and ammonium transport system in plants. J.Exp.Bot. V.53.NO.370. P. 855-864.

56. Gowri G., Campbell W.H. (1989) cDNA clones for corn leaf NADH:nitrate reductase and chloroplast NAD(P)+:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Plant Physiol. V.90. P.792-798.

57. Gowri G., Kenis J.D., Ingemarsson В., Redinbaugh G., Campbell W.H. (1992) Nitrate reductase transcript is expressed in the primary response of maize to environmental nitrate. Plant Mol.Biol. V.18. P.55-64.

58. Guyer D., Patton D., Ward E. (1995) Evidence for cross-pathway regulation of metabolic gene expression in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.92. P.4997-5000.

59. Haberer G., Kieber J.J. (2002) Cytokinins: new insights into classic phytohormone. Plant Physiol. V.128. P.359-362.

60. Hamat H.B., Kleinhofs A., Warner R.L. (1989) Nitrate reductase induction and molecular characterization in rice {Oryza sativa L.). Mol. Gen. Genet. V.218. P.93-98.

61. Hare P.D., Staden J. (1997) The molecular basis of cytokinin action. Plant Growth Regul. V.23. P.41-78.

62. Hernandez L.E., Carpenaruiz R., Garate A. (1996) Alternations in the mineral nutrition of pea seedlings exposed to cadmium. J. Plant Nutr. V.19. P.l 581-1598.

63. Hernandez L.E., Garate A., Carpenaruiz R. (1997) Effect of cadmium on the uptake, distribution and assimilation of nitrate in Pisum sativum. Plant Soil. V.189. P.97-106.

64. Hirschberg К., Huebner G., Borris H. (1972) Cytokinin-induced de novo synthesis of nitrate reductase in isolated embryos of Agrostemma githago. Planta. V.108. P.333.

65. Hoarau J., Barthes L., Bousser A., Deleens E., Prioul J.-L. (1996) Effect of nitrate on water transfer across roots of nitrogen prestarved maize seedlings. Planta V.200. P.405-415.

66. Hodges M. (2002) Enzime redundancy and the importance of 2-oxoglutarate in plant ammonium assimilation. J.Exp.Bot. V.53. №370. P.905-916.

67. Hollenbach В., Schreiber L., Hartung W., Dietz K.-J. (1997) Cadmium leads to stimulated expression of the lipid transfer protein genes in barley: implications for the involvement of lipid transfer proteins in wax assembly. Planta V.203 P.9-19.

68. Huber S.C., Huber J.L., Campbell W.H., Redinbaugh M.G. (1992) Comparative studies of the light modulation of nitrate reductase and sucrose-phosphate synthase activities in spinach leaves. Plant Physiol. V.100. P.706-712.

69. Hwang C.-F., Lin Y., D'Souza Т., Cheng C.-L. (1997) Sequences necessary for nitrate-dependent transcription of arabidopsis nitrate reductase genes. Plant Physiol. V.l 1. №3. P.853-862.

70. Jang J.-C., Sheen J. (1997) Sugar sensing in higher plants. Trends Plant Science. V.2. P.208-214.

71. Kaiser W.M. Huber S.C. (1994) Modulation of nitrate reductase in vivoл Iand in vitro: effects of phosphoprotein phosphatase inhibitors, free Mg and 5'-AMP. Planta. V.193 P.358-364.

72. Kaiser W.M. Huber S.C. (2001) Post-translational regulation of nitrate reductase: mechanism, physiological relevance and environmental triggers. J. Exp. Bot. V.52 №363 P.1981-1989.

73. Kaiser W.M., Brendle-Behnisch E. (1991) Rapid modulation of spinach leaf nitrate reductase activity by photosynthesis. I. Modulation in vivo by C02, availability. Plant Physiol. V.96. P.363-367.

74. Kaiser W.M., Forster J. (1989) Low C02, prevents nitrate reduction in leaves. Plant Physiol. V.91. P.970-974.

75. Kaiser W.M., Kandlbinder A., Stoimenova M., Glaab J. (2000) Discrepancy between nitrate reduction rates in intact leaves and nitrate reductase activity in leaf extracts: what limits nitrate reduction in situ? Planta. V.210. P.801-807.

76. Kaiser W.M., Weiner H., Kandlbinder A., Tsai C-B., Rockel P., Sonoda M., Planchet E. (2002) Modulation of nitrate reductase: some new insights, an unusual case and a potentially important side reaction. J. Exp. Bot. V.53. №370. P.875-882.

77. Kakimoto T. (1998) Cytokinin signalling. Curr. Opin. Plant Biol. V.l. P.399-403.

78. Kakimoto T. (2003) Perception and signal transduction of cytokinins. Annu. Rev. Plant Biol. V.54. P.605-627.

79. Kende H., Shen T.C. (1972) Nitrate reductase in Agrostemma githago. Comparison of the inductive effects of nitrate and cytokinin. Biochim. Biophys. Acta. V.286. P. 118-125.

80. Klobus G., Ward M.R., Huffaker R.C. (1988) Characteristics of injury and recovery of net NO3' transport of barley seedlings from treatments of NaCI. Plant Physiol. V.87. P.878-882.

81. Koch K.E. (1996) Carbohydrate modulated gene expression in plants. Annu. Rev. Plant Physiol., Plant Mol. Biol. V.47. P.509-540.

82. Kronzucker H.J., Glass A.D.M., Siddiqi M.Y. (1999) Inhibition of nitrate uptake by ammonium in barley. Analysis of component fluxes. Plant Physiol. V.120. P.283-291.

83. Man H.M., Abd-El Baki G.K., Stegmann P., Weiner H., Kaiser W.M. (1999) The activation state of nitrate reductase is not always correlated with total nitrate reductase activity in leaves. Planta. V. 209. P.462-468.

84. Meharg A.A., Blatt M.R. (1995) N03 transport across the plasma membrane of Arabidopsis thaliana root hairs: kinetic control by pH and membrane voltage. J. Membr. Biol. V.l45. P.49-66.

85. Melzer J.M., Kleinhofs A., Warner R.L. (1989) Nitrate reductase regulation: effects of nitrate and light on nitrate reductase messenger RNA accumulation. Mol. Gen. Genet. V.217. P.341-346.

86. Miller A.J., Smith S.J. (1996) Nitrate transport and compartmentation in cereal root cells. J. Exp. Bot. V.47 P.843-854.

87. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. (2004) Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate. Plant J. V.37. №1. P.128-38.

88. Мок D.W., Мок M.C. (2001) Cytokinin metabolism and action. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V.89. P.89-118.

89. Muller В., Touraine B. (1992) Inhibition of N03" uptake by various phloem-translocated amino acids in soybean seedlings. J Exp. Bot. V.43. P.617-623.

90. Oka A., Sakai H., Iwakoshi S. (2002) His-Asp phosphorelay signal transduction in higher plants: receptors and response regulators for cytokinin signaling in Arabidopsis thaliana. Genes Genet. Syst. V.77. P.383-391.

91. Orsel M., Filleur S., Fraiser V., Daniel-Vedele F. (2002) Nitrate transport in plants: which gene and which control? J.Exp.Bot. Vol. 53. №370. P.825-833.

92. Orsel M., Krapp A., Daniel-Vedele F (2002); Analysis of the NRT2 nitrate transporter family in Arabidopsis. Structure and gene expression. Plant Physiol. V.129. P.886-896.

93. Ouariti O., Gouia H., Ghobal M.H. (1997) Responses of bean and tomato plants to cadmium growth, minerel nutrition, and nitrate reduction. Plant Physiol. Biochem. V.35 P.347-354.

94. O'Farrell (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of plants. J. Biol. Chem. V.250. №10. P.4007-4021.

95. Panchuk I., Volkov R., Schoffl F. (2002) Heat stress- and heat shock transcription factor-dependent expression and activity of ascorbate peroxidase in Arabidopsis. Plant Physiol. V.129. P.838-853.

96. Petuke A.D., Jeschke W.D. (1999) The characterization of inhibition of net nitrate uptake by salt in salt-tolerant barley. J. Exp. Bot. V.50. №337. P.1365-1372.

97. Raab Т.К., Terry N. (1994) Nitrogen Source Regulation of Growth and hotosynthesis in Beta vulgaris L. Plant Physiol. V.105. P.l 159-1166.

98. Rashotte A.M., Carson S.D.B., To J.P.C., Kieber J.J. (2003) Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis. Plant Physiol. V.132 P. 1998-2011.

99. Redinbaugh M.G., Campbell W.H. (1993) Glutamine synthetase and ferredoxin-dependent glutamate synthase expression in the maize (Zea mays) root primary response to nitrate. Plant Physiol. V.101. P.1249-1255.

100. Rizhsky L., Liang H., Mittler R. (2002) The combined effect of drought stress and heat shock on gene expression in tobacco. Plant Physiol. V.130. P.l143-1151.

101. Sakai H., Honma Т., Aoyama Т., Sato S., Kato Т., Tabata S., Oka A. (2001) ARR1, a transcription factor for genes immediately responsive to cytokinins. Science. V.294. P. 1519-1521.

102. Sakakibara H. (2003) Nitrate-specific and cytokinin-mediated nitrogen signaling pathways in plants. J. Plant Res. V.l 16. P.253-257.

103. Sakakibara H., Suzuki M., Takei K., Deji A., Taniguchi M., Sugiyama T. (1998) A response-regulator homologue possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize. Plant J. V.14 №3. P.337-344.

104. Sakakibara H., Taniguchi M., Sugiyama, T. (2000) His-Asp phosphorelay signaling: a communication avenue between plants and their environment. Plant Mol. Biol. V.42 P.273-278.

105. Samuelson M.E., Larsson C.-M. (1993) Nitrate regulation of zeatin riboside levels in barley root: effects of inhibitors of N assimilation and comparison with ammonium. Plant Sci. V.93. P.77-84.

106. Scheible W.-R., Lauerer M., Schulze E.-D., Caboche M., Stitt M. (1997) Nitrate acts as a signal to Induce organic acid metabolism and repress starch metabolism in tobacco. The Plant Cell. V. 9. P.783-798.

107. Schmulling Т., Schafer S., Romanov G. (1997) Cytokinins as regulator of gene expression. Physiol. Plant. V.l00. P.505-519.

108. Schoffl F., Prandl R., Reindl A. (1998) Regulation of the heat-shock response. Plant Physiol. V.l 17 P.l 135-1141.

109. Sherameti I., Sopory S.K., Trebicka A. et al. (2002) Photosynthetic electron transport determines nitrate reductase gene expression and activity in higher plants. J. Biol. Chem. V. 277. P. 46594-46600.

110. Siddiqi M.Y. (1990) Studies of the uptake of nitrate in barley. Plant Physiol., 93:1426-1432.

111. Sivasankar S., Oaks A. (1995) Regulation of Nitrate Reductase during Early Seedling Growth. Plant Physiol. V.107. P. 1225-1231.

112. Sivasankar S., Rothstein S., Oaks A. (1997) Regulation of the accumulation and reduction of nitrate by nitrogen and carbon metabolites in maize seedlings. Plant Physiol. V.l 14. P.583-589.

113. Solomonson L.P., Barber M.J. (1990) Assimilatory nitrate reductase: Functional properties and regulation. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V.41. P.225-253.

114. Soni R., Carmichael J.P., Shah Z.H., Murray J.A.H. (1995) A family of cyclin D homologs from plants differentially controlled by growth regulators and containing the conserved retinoblastoma protein interaction motif. Plant Cell. V.7. P.85-103.

115. Srivastava H.S. (1980) Regulation of nitrate reductase activity in higher plants. Phytohemistry. V.l9. P. 725-733.

116. Staswick P.E., Huang J.-F., Rhee Y. (1991) Nitrogen and methyl jasmonate induction of soybean vegetative storage protein genes. Plant Physiol. V.96. P.130-136.

117. Stitt M. (1999) Nitrate regulation of metabolism and growth. Curr. Opin. Plant Biol. V.2. P. 178-186.

118. Stitt M., Muller C., Matt P., Gibon Y., Carillo P., Morcuende R., Scheible W.-R., Krapp A. (2002) Step towards an integrated view of nitrogen metabolism. J. Exp. Bot. V.53 №370. P.959-970.

119. Sueyoshi K., Kleinhofs A., Warner R. (1995) Expression of NADH-specific and NAD(P)H-bispecific nitrate reductase genes in response to nitrate in barley. Plant Physiol. V.l07. P.1303-1311.

120. Sugiharto В., Sugiyama T. (1992) Effect of nitrate and ammonium on gene expression of phosphoenolpyruvate carboxylase and nitrogen metabolism in maize leaf tissue during recovery from nitrogen stress. Plant Physiol. V.98. P. 1403-1408.

121. Suzuki, I., Cretin, C., Omata, Т., Sugiyama, T. (1994) Transcriptional and posttranscriptional regulation of nitrogen-responding expression of phosphoenolpyruvate carboxylase gene in maize. Plant Physiol. V.105. P. 12231229.

122. Suzuku Т., Miwa K., Ishikawa K., Yamada H., Aiba H., Mizuno T. (2001) The Arabidopsis sensor His-kinase, AHK, can respond to cytokinins. Plant Cell Physiol. V.42. P.107-113.

123. Takei K., Takahashi Т., Sugiyama Т., Yamaya T. (2002) Multiple routes communicating nitrogen availability from roots to shoots: a signal transduction pathway mediated by cytokinin. J.Exp.Bot. Vol. 53. №370. P.971-977.

124. Ueguchi C., Koizumi H., Suzuki Т., Mizuno T. (2001) Novel family of sensor histidine kinase genes in Arabidopsis thaliana. Nature V.42. P.231-235.

125. Vassilev A., Yordanov I., Tsonev T. (1997) Effect of Cd2+ on the physiological state and photosynthetic activity of young barley plants. Photosynthetica. V.34. P.293-302.

126. Vencentz M., Moureaux Т., Leydecker M-T., Vaucheret H., Caboche M. (1993) Regulation of nitrate and nitrite reductase expression in Nicotianaplumbaginifolia leaves by nitrogen and carbon metabolites. Plant J. V.3. V.315-324.

127. Vidmar J.J., Zhuo D., Siddiqi M.Y., Schjoerring J.K., Touraine В., Glass A.D. (2000) Regulation of high-affinity nitrate transporter genes and high-affinity nitrate influx by nitrogen pools in roots ofbarley. Plant Physiol. V.123. P.307-318.

128. Vincentz M., Caboche M. (1991) Constitutive expression of nitrate reductase allows normal growth and development of Nicotiana plumbqinifolia plants. EMBO J. V.10. №5. 1027-1035

129. Walch-Liu P., Neumann G., Bangerth F., Engels C. (2000) Repid effects of nitrogen form on leaf morphogenesis in tobacco. J. Exp.Bot. V.51 №343 P.227-237.

130. Wang M.Y., Glass A., Shaff J.E., Kochian L.V. (1994) Ammonium uptake by rice roots. Electrophysiology. Plant Physiol. V.104. P.899-906.

131. Wang R., Guegler K., LaBrie S.T., Crawford N.M. (2000) Genomic analysis of a nutrient response in Arabidopsis reveals diverse expression patterns and novel metabolic and potential regulatory genes induced by nitrate. The Plant Cell. V.12. P.1491-1509.

132. Weiner H., Kaiser W.M. (1999) 14-3-3 proteins control proteolysis of nitrate reductase in spinach leaves. FEBS Letters. V.455 P.75-78.

133. Weiner H., McMichael R.W., Huber S.C. (1992) Identification of the factors regulating the phosphorylation status of sucrose-phosphate synthase in vivo. Plant Physiol. V.99. V.1435-1442.

134. Westhoff P., Nelson N., Bunemann H., Herrmann R.C. (1981). Curr. Genet. V.4. P.109-120.

135. Wiren N., Gazzarrinni S., Frommer W.B. (1997) Regulation of mineral nitrogen uptake in plants. Plant Soil. V.196. P.191-199.

136. Yang X., Baligar V.C., Martens D.C., Clark R.B. (1996) Cadmium effect on influx and transport of mineral nutrients in plant species. J. Plant Nutr. V.l9. P.643-656.

137. Yu X., Sukumaran S., Marton L. (1998) Differential expression of the Arabidopsis Nial and Nia2 genes. Cytokinin-induced nitrate reductase activity is correlated with increased Nial transcription and mRNA levels. Plant Physiol. V.l 16. P.1091-1096.

138. Zhang H., Forde B.G. (1998) An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture. Science V.279. P.407-409.

139. Zhao J., Williams C.C., Last R.L. (1998) Induction of Arabidopsis tryptophan pathway enzymes and camalexin by amino acid starvation, oxidative stress, and an abiotic elicitor. The Plant Cell. V.10. P.359-370.

140. Zhuo D., Okamoto M., Vidmar J.J., Glass ADM. (1999) Regulation of putative high-affinity nitrate transporter (NRT2;lAt) in roots of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. V.l7. P.563-568.

141. Zielke H.R., Fliner P. (1971) Sinthesis and turnover of nitrate reductase induced by nitrate in cultured tobacco cells. J.Biol.Cem. V.246 P. 1772-1779.

Информация о работе

Рагулин, Виталий Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.12

Диссертация

Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в зародышах куколя - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы