Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии гена THIC Arabidopsis thaliana с помощью тиаминпирофосфатного рибосвича

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии гена THIC Arabidopsis thaliana с помощью тиаминпирофосфатного рибосвича"

11 - 5

1652

На правах рукописи

МАЛАНИН СЕРГЕЙ ЮРЬЕВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ТН1С АЯАВЮОРБК ТНАЫАМА С ПОМОЩЬЮ ТИАМИНПИРОФОСФАТНОГО

РИБОСВИЧА

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 2011

Работа выполнена на кафедре генетики ФГАОУ ВПО «Казанского (Приволжского) федерального университета», г. Казань.

Научный руководитель

Научный консультант

- кандидат биологических наук Никифорова Виктория Юлиановна

- доктор биологических наук, профессор Барабанщиков Борис Иванович

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

Романов Георгий Александрович - доктор биологических наук, профессор Хохлова Людмила Петровна

Ведущая организация Казанский институт биохимии и биофизики

КНЦ РАН г.Казань

Защита диссертации состоится «24» ноября 2011 г. в 13.00 часов на заседании Специализированного совета Д.212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского (Приволжского) федерального университета

Автореферат разослан « К » октября 2011 г.

Ученый секретарь Специализ про ват 1 н ого совета доктор биологических наук, профессор > З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Регуляция экспрессии генов является неотъемлемой частью существования любого живого организма. При постоянно изменяющихся условиях внешней среды клетка должна своевременно реагировать специфичными изменениями метаболизма для быстрого и адекватного приспособления. Одним из механизмов подобного контроля является регуляция экспрессии генов, происходящая на всех этапах транскрипции, процессинга и трансляции мРНК. В ходе эволюции возникли разнообразные формы регуляции, где главными "рабочими молекулами" являются белки. В то же время, обнаружены и такие способы контроля работы генов, которые не требуют участия белков, отражающие, возможно, наиболее древние пути регуляции. Среди них можно выделить особый класс рибонуклеиновых регуляторов, названных рибосвичами (riboswitch).

Первоначально обнаруженные в бактериях, рибосвичи представляют собой небольшие участки молекул мРНК, находящиеся, как правило, в 5' нетранслируемой области, которые способны с высокой селективностью связывать определенные метаболиты и посредством такого связывания влиять на транскрипцию или трансляцию этих мРНК путём образования регуляторных вторичных структур (Winkler, Breaker, 2005). Рибосвич состоит из двух функционально различных доменов: отвечающая за связывание аптамеровая часть является наиболее консервативной областью и, связывая определенный метаболит, вызывает конформационные изменения во втором домене -экспрессионной платформе, что приводит к образованию терминаторов/антитерминаторов транскрипции или к блокированию последовательности Шайн-Дальгарно. Таким образом, происходит регуляция транскрипции или трансляции мРНК, содержащих рибосвичи, в зависимости от концентрации лиганда.

В настоящее время у прокариот обнаружено около 10 классов рибосвичей, способных связывать различные молекулы: ион металла (катион магния), нулеотидные основания (аденин, гуанин), аминокислоты (глицин, лизин), витамины (тиаминпирофосфат, витамин В12), коферменты (S-аденозилметионин) и другие метаболиты. Рибосвичи обнаружены в генах, кодирующих белки биосинтеза или транспорта веществ, которые являются лигандами этих риборегулятров. Каждый класс рибосвичей характеризуется высокой нуклеотидной гомологией аптамеровой части, что позволило обнаружить широкое распространение этого способа регуляции у прокариотических организмов.

Наличие полностью секвенированных геномов некоторых эукариот сделало возможным обнаружение одного класса рибосвичей в генах грибов и растений: тиаминпирофосфатный рибосвич (ТПФ рибосвич) - единственный риборегулятор, найденный до настоящего времени в эукариотической клетке (Sudarsan* et al, 2003). Следует отметить, что этот тип рибосвичей является

наиболее распространенным среди бактерий и первоначально был обнаружен в опероне thiCOGE бактерии Rhizobium etli, кодирующем белки биосинтеза тиаминпирофосфата (ТПФ, витамин В|). В царстве растений ТПФ рибосвич найден в геноме арабидопсиса (Arabidopsis lhaliana), риса (Oryza saliva) и мятлика (Роа secunda).

В модельном растении арабидопсиса этот рибосвич находится в 3' нетранслируемой части гена ТШС (At2g29630), который кодирует фермент, катализирующий синтез пиримидиновой части витамина В[. Пре-мРНК данного гена подвергается альтернативному сплайсингу, происходящему в 3' нетранслируемой части гена. Механизм действия ТПФ рибосвича в регуляции экспрессии гена THIC оставался неизвестным, но его расположение в пре-мРНК и наличие двух изоформ позволяло предположить, что он действует через регулирование альтернативного сплайсинга и/или стабильности образуемых сплайсинг вариантов.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось определение роли тиаминпирофосфатного рибосвича в регуляции экспрессии гена ТШС Arabidopsis thaliana, а также установление возможности использования ДНК-тайлинг чипов для поиска новых классов рибосвичей и идентификации генов, регуляция которых может осуществляться с их помощью.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

1. Определить изменение экспрессии гена THIC при повышении эндогенной концентрации тиаминпирофосфата.

2. Выяснить функциональную значимость тиаминпирофосфатного рибосвича в регуляции экспрессии гена ТШС.

3. Установить механизм контроля экспрессии гена ТШС при регулируемом альтернативном сплайсинге.

4. Определить возможность идентификации тиаминпирофосфатного рибосвича с помощью ДНК-тайлинг чипов.

5. Осуществить поиск новых классов рибосвичей у Arabidopsis thaliana с использованием S-аденозилметионина как лиганда.

Научная новизна работы. В данной работе исследована регуляция гена THIC арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) с помощью ТПФ рибосвича, единственного известного до настоящего времени у эукариот. Впервые установлена связь между ТПФ рибосвичем и нонсенс-опосредованным разруше1[ием мРНК (nonsense mediated decay, NMD) в регуляции экспрессии исследуемого гена. Показано, что NMD участвует в деградации нестабильной изоформы, образующейся в результате альтернативного сплайсинга.

Впервые показана возможность использования ДНК-тайлинг чипов в идентификации ТПФ рибосвича в геноме арабидопсиса и определены гены-кандидаты, регуляция которых может осуществляться с помощью S-аденозилметионинового рибосвича.

Научно-практическая значимость работы.

Изученный механизм регуляции экспрессии гена THIC открывает возможность использования рибосвичей в конструировании искусственных систем у эукариот с контролируемой работой генов, которые найдут применение в научных исследованиях и биотехнологии.

Показана возможность использования технологии ДНК-тайлинг чипов для изучения регуляции альтернативного сплайсинга у растений.

Положении, выносимые на защиту:

1. Регуляция экспрессии гена THIC Arabidopsis thaliana происходит в результате контроля альтернативного сплайсинга ТГТФ рибосвичем и образования нестабильной изоформы.

2. Нестабильная изоформа мРНК гена THIC подвергается быстрому разрушению посредством процесса нонсенс-опосредованного разрушения мРНК.

3. С помощью ДНК-тайлинг чипов возможно определение регуляции экспрессии гена 77//С ТГТФ рибосвичем. Этот метод может быть использован для поиска новых классов рибосвичей у растений.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на VI Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2009), 13-ой международной путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), 5-ой Московской международной конференции «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development» (Moscow, 2009), Всероссийской конференции «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем» (Уфа, 2009), конференции «Современные проблемы генетики» (Казань, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК: «Физиология растений» и «Ученые записки Казанского государственного университета».

Место выполнения работы и благодарности. Работа выполнена на кафедре генетики Казанского (Приволжского) федерального университета. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н. В.Ю. Никифоровой за внимательное отношение к работе и обсуждение полученных результатов; д.б.н., профессору Б.И. Барабанщикову за консультации и обсуждение результатов. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории «System Intégration» Института молекулярной физиологии растений Общества Макса Планка (г. Гольм, Германия) за предоставление возможности выполнения части экспериментов, за помощь и доброжелательную рабочую атмосферу

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части - описания материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, включает 17 рисунков и 11

таблиц. Список литературы включает 138 источников, из которых 134 -зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлось растение арабидопсис (Arabidopsis thaliana) экотипа Columbia-0. Растения выращивали в стандартных условиях теплицы при длинном дне (16 часовой фотопериод). Для изучения NMD были использованы инсерционные мутанты арабидопсиса, содержащие Т-ДНК вставку в гене upfî (At5g4701û). Семена мутантных растений (SALK_112922) были заказаны в банке семян Nottingham Arabidopsis Stock Centre (Великобритания). В работе использовали только гомозиготные линии. Суспензионная клеточная культура арабидопсиса (экотип Columbia-0) была любезно предоставлена профессором М. Паули (Институт Молекулярной физиологии растений им. Макса Планка) и выращивалась в среде JPL (Jouanneau, Peaud-Lenoel, 1967) при еженедельном пассировании при температуре 20°С и постоянном освещении.

Манипуляции с нуклеиновыми кислотами. Выделение геномной ДНК из растений осуществляли с помощью СТАВ буфера (Doyle, Doyle, 1987). Тотальную фракцию РНК получали с использованием реагента TRIZOL (Invitrogen, Германия). Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью AccuScript транскриптазы (Promega, США) согласно рекомендациям производителя.

Для клонирования использовали систему Gateway (Invitrogen, Германия). Однонуклеотидная мутация в рибосвиче была получена с использованием набора QuickChange П Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, США). Дизайн праймеров проводили на сайте Stratagene с помощью программы QuickChange Primer Design Program (www.stratagen.com), реакции амплификации и деградации изначальной немутированной плазмиды проводили согласно рекомендациям производителя. Полученный вектор был просеквенирован для проверки наличия однонуклеотидной замены.

Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli (DH5a) проводили с использованием набора для выделения плазмид («Plasmid isolation kit», Macherey Nagel, Германия).

ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени выполняли в 384 луночной плашке с помощью прибора 7900НТ Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Великобритания), используя SYBR Green для мониторинга синтеза ДНК. Анализ данных проводили с помощью программы SDS 2.0 Software (Applied Biosystems). Для нормализации полученных данных использовали значение экспрессии гена убиквитина (At4g05320). Уровень экспрессии измеряемых транскриптов оценивали с помощью формулы: 40-dCt, где dCt - это нормализованное количество транскрипта (dCt=Cto6p!Ue4 -

Трансформация растений. Для трансформации растений арабидопсиса использовали бактерии Agrobacterium tumefaciens штамма GV3101 (коллекция

микроорганизмов Института молекулярной физиологии растений им. Макса Планка, Германия). Трансформацию проводили методом floral dip (Clough, Bent, 1998).

Обработка растений тиамином. Для обработки использовали 4-х недельные растения арабидопсиса дикого типа и инсерционного мутанта (с Т-ДНК вставкой в гене At5g47010). Растения обрабатывали с помощью опрыскивания либо 1 мМ раствором тиамина (Sigma-Aldrich, Германия), либо водой в качестве контроля в течение 72 часов, после чего растительный материал (листья) замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С до последующего использования.

Обработка суспензионной клеточной культуры метионином. В 3-х дневную клеточную культуру арабидопсиса добавляли раствор метионина в конечной концентрации 1мМ, либо вода в качестве контроля. После 24 часовой инкубации клеточную культуру фильтровали и замораживали в жидком азоте.

Обработка ингибиторами транскрипции и трансляции. 5-и дневную суспензионную клеточную культуру арабидопсиса обрабатывали либо кордицепином (Sigma-Aldrich, Германия) в конечной концентрации 150 мкг/мл, либо смесью кордицепина и циклогексимида (Calbiochem, США) в конечной концентрации последнего 10 мкг/мл. По прошествии 1 и 3 часов после обработок растительный материал фиксировали в жидком азоте для последующего выделения РНК.

Измерение ТПФ с помощью ВЭЖХ. Экстракцию ТПФ из растительного материала проводили 0.1 М НС1 при температуре Ю0сС в течение 15 минут. Для окисления витамина Bi до флуорисцирующего тиохрома использовали 30 мМ K3Fe(CN)6 (Sigma-Aldrich, Германия). Хроматографию проводили с помощью колонки Reprosil-Pur 120 NH2 (Dr.Maisch HPLC GmbH, Германия). Измерения были выполнены с использованием хроматографической системы Dionex (Германия). Жидкой фазой служила смесь метанола и 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.5) в соотношении 1.5 к 1. В качестве стандарта проводили измерения тиаминпирофосфата (Sigma-Aldrich, Германия) в концентрациях 0, 0.1, 0.5, 1, 2, 4 мкМ. Анализ полученных данных проводили с помощью Chromeleon software (Dionex).

Выделение полисомальной РНК. Выделение полисом из 4-х недельных растений проводили с помощью ультрацентрифугирования растительных экстрактов в сахарозном градиенте (Jakson, Larkins, 1976; Barkan, 1993; Barkan, 1998).

Синтез кДИК и дцДНК, фрагментирование и биотинилирование дцДНК для гибридизации с тайлинг чипами, анализ данных. Для синтеза кДНК и дцДНК из РНК использовали набор GeneChip Tiling WT Double-Stranded DNA Synthesis Kit (Affymetrix, США). Очистку синтезированной дцДНК проводили с помощью GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для фрагментирования дцДНК и её мечения (биотинилирование) использовали GeneChip WT Double-Stranded

DNA Terminal Labeling Kit (Affymetrix). Проверку эффективности фрагментирования проводили с помощью 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США).

Гибридизация биотинилированной дцДНК с тайлинг чипами GeneChip Arabidopsis Tiling 1.0R Array (Affymetrix) и сканирование выполнялось в компании Atlas Biolabs (Германия). Нормализацию данных проводили с помощью пакета «normalize.quantiles {affy}» языка программирования R (www.r-project.org). Определение значений экспрессии генов и уникальных участков изоформ, а также вычисление статистики (Манна-Уитни U-тест) выполняли с помощью программ, написанных на языке Perl (www.perl.org).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Регуляция экспрессии гена THIC происходит с помощью ТПФ

рибосвича

Согласно базе данных TAIR (www.arabidopsis.com) ген арабидопсиса THIC (At2g29630) имеет две аннотированные изоформы (THIC-11 и THIC-Ш), образующиеся в результате альтернативного сплайсинга в 3' нетранслируемой части транскрипта. Таким образом, не различаясь в кодирующей области, они обладают различными 3' нетранслируемыми участками (Рис.1). Следует отметить, что ТПФ рибосвич находится в изоформе THIC-Ш в 3' нетранслируемой области.

^..........-Uli.»!.......LI. m-.- _ГН/СП

Рис.1. Две изоформы гена THIC: THIC-ll и THIC-Ш Светлыми и темными прямоугольниками показаны нстранслируемые и кодирующие последовательности транскриптов соответственно, интроны изображены линиями. Рисунок взят из TAIR (www.arabidopsis.org).

Для определения уровня экспрессии данных изоформ в растениях, выращенных в стандартных условиях, был выполнен ПЦР в реальном времени. Анализ полученных данных показал, что в растительной клетке присутствуют обе изоформы, причем количество транскрипта THIC-U больше в 2 раза (Рис.2) (что соответствует одному циклу ПЦР). Присутствие обеих сплайсинг-изоформ свидетельствует о наличии альтернативного сплайсинга пре-мРНК гена THIC, причём соотношение образуемых изоформ различно, что говорит о наличии какого-то фактора, определяющего неодинаковый уровень образования двух транскриптов.

Следующим этапом в определении экспрессии двух сплайсинг-изоформ явился анализ трансляции изучаемых мРНК, для чего было выполнено выделение полисом из растений. Показателем эффективности трансляции служило наличие мРНК в полисомных фракциях. Детекция транскриптов THIC-

II и ТН1С-III в этих фракциях (Рис. 3) позволяет заключить, что обе изоформы активно транслируются в растительной клетке. Полученные данные свидетельствуют, что, во-первых, ген ТН1С подвергается альтернативному сплайсингу, причём соотношение образуемых изоформ различно; во-вторых, обе изоформы активно транслируются, но основной вклад в синтез белка вносит, безусловно, изоформа ТН1С-П.

л я

я С

& 39,5 т —.....

39

38,5

& & ° С

К §

38

37,5 4-

37

■ ТН1С-П

т ттс- ш

□ ТН1С

Рис.2. Экспрессия гена ТН1С и двух его изоформ (ТН1С-11 и ТН1С-Ш) Представлены средние значения трех измерений количества транскриптов, нормализованных к экспрессии гена убиквитина, и стандартное отклонение.

_ ..........

Рис.3 .Распределение двух изоформ в полисомных фракциях М - маркер, 1-5 - моносомные фракции, 6-10 - полисомные фракшш, А и Б изображают ТН1С-II и ТН1С-Ш изоформы соответственно.

Следующая задача - определение изменения экспрессии двух изоформ при повышении концентрации тиаминпирофосфата (ТПФ) в растении.

Для исследования влияния повышения концентрации ТПФ на экспрессию гена ТН1С были проведены опыты по обработке растений 1 мМ раствором тиамина. Первой задачей было установление увеличения эндогенной концентрации фосфорилированной формы тиамина (ТПФ) после обработки, для чего проводили измерения количества витамина В] с помощью ВЭЖХ. Результаты показывают, что после обработки растений раствором тиамина в течение 72 часов происходит увеличение эндогенной концентрации ТПФ (Рис.4). Таким образом, тиамин поступает в растительные клетки, где он

фосфорилируется до тиаминпирофосфата - лиганда, связывающегося с рибосвичем.

Следующей задачей был мониторинг экспрессии гена ТН1С (его кодирующей части) и двух изоформ при повышенной концентрации ТПФ в клетке. Для этого после обработок растений в течение 72 часов 1 мМ раствором тиамина и водой (в качестве контроля) была выполнена ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными для каждой сплайсинг изоформы и для кодирующей части гена, которая является общей для двух образующихся транскриптов и отражает количество мРНК, участвующих в трансляции. Анализ данных показывает, что увеличение эндогенной концентрации ТПФ в растении вызывает уменьшение экспрессии гена ТН1С (Рис.5).

Рис.4. Количество ТПФ в контрольных и обработанных тиамином растениях Показано среднее значение четырех измерений со стандартным отклонением.

Полученные данные показывают, что в растении существует такой механизм регуляции гена ТН1С, при котором увеличение количества фосфорилированной формы витамина В| вызывает снижение количества транскрипта, кодирующего фермент синтеза ТПФ. Кроме того, анализ данных ПЦР показывает, что обработка растений тиамином имеет различный эффект на экспрессию двух изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга пре-МРНК гена ТН1С (Рис.5). При увеличении концентрации ТПФ количество транскрипта ТН1С-П снижается в 2 раза. В то же время, увеличение концентрации ТПФ не оказывает такого влияния на транскрипт ТН1С-Ш: напротив, наблюдается даже незначительное увеличение количества этой изоформы. Таким образом, повышение концентрации витамина в растении приводит, во-первых, к уменьшению экспрессии всего гена ТН1С (кодирующей области), во-вторых, к уменьшению количества изоформы ТН1С-II, в-третьих, к незначительному увеличению экспрессии изоформы ТН1С-Ш.

Суммируя полученные данные, можно утверждать, что экспрессия гена ТН1С в растительной клетке зависит от концентрации ТПФ - конечного продукта метаболического пути, в котором один из ферментов кодируется этим

О

■ 0 мМ тиамина 1 мМ тиамина

геном. Кроме того, повышение количества данного витамина по-разному влияет на экспрессию двух изоформ, что указывает на связь альтернативного сплайсинга с концентрацией ТПФ.

Следующим этапом работы являлось определение роли ТПФ рибосвича, находящегося в 3' нетранслируемой области изоформы ТН1С-П1, в регуляции экспрессии гена ТН1С при изменении концентрации витамина Вь Дня доказательства участия ТПФ рибосвича в регуляции работы гена ТН1С были получены векторы, которые позволяли оценить роль изучаемого рибосвича в контроле экспрессии. Векторы содержали маркерный ген (СЯР), соединённый с геномной последовательностью 3' нетранслируемой области гена ТН1С, содержащей ТПФ рибосвич. Растения, содержащие трансформированные конструкции, были обработаны раствором тиамина, и экспрессия вРР оценивалась методом ПЦР. Анализ полученных данных показывает, что обработка ведёт к уменьшению количества транскрипта маркерного гена (Рис.6). Таким образом, можно утверждать, что 3' нетранслируемая область мРНК определяет регуляцию экспрессии гена ТН1С при изменяющейся концентрации витамина В).

Г: ТН1С ТН1С-II тн/с-ш

Рис. 5. Экспрессия гена ТН1С и двух его изоформ после 72 часовой обработки растений 1мМ раствором тиамина Измерения количества транскриптов проводили с помощью ПЦР в реальном времени. Показано среднее значение трёх измерений и стандартное отклонение.

Как было сказано ранее, эта область содержит рибосвич, который, возможно, участвует в регуляции экспрессии. Для проверки этого предположения была получена конструкция, содержащая тот же участок геномной ДНК гена ТН1С, но с мутированным рибосвичем: аденин, участвующий в образовании третичной структуры этого риборегулятора (ТЬоге е1 а1., 2006), был заменён на тимин. Такая замена приводила к тому, что рибосвич лишался возможности формировать пространственную структуру, способную проявлять свои регуляторные функции. Растения, содержащие маркерный ген с изменённым рибосвичем, также были обработаны 1 мМ раствором тиамина, и экспрессию гена ОРР оценивали с помощью ПЦР в

реальном времени. Результаты показывают (Рис.7), что однонуклеотидная замена в рибосвиче приводит к полной потере регуляции маркерного гена, из-за невозможности образовывать риборегулятором функциональную пространственную структуру, необходимую для регуляции экспрессии гена при изменяющемся уровне ТПФ в клетке. Таким образом, регуляция гена ТШС при флуктуации концентрации витамина В! происходит с помощью ТПФ рибосвича, находящемся в З'нетранслируемой части гена.

а,

и С

« _

и и

О с

>£ 3

0 мМ тиамина

1 мМ тиамина

36 г

1

Рис. 6. Экспрессия маркерного гена вРР, соединенного с 3' нетранслируемой областью гена ТШС, в контрольных и обработанных растениях На рисунке представлены измерения экспрессии в трех независимых линия? трансформированных растений.

Суммируя полученные данные, можно утверждать, что увеличение эндогенной концентрации ТПФ вызывает уменьшение экспрессии гена ТШС, причём эта регуляция происходит с помощью рибосвича, который находится в 3' нетранслируемой части. Кроме того, расположение ТПФ рибосвича в пре-мРНК на границе интрон/экзон указывает на его возможное участие в регулировании альтернативного сплайсинга (Рис.8).

Из пре-мРНК гена ТШС в ходе процессинга образуются две сплайсинг-изоформы: первая изоформа (ТН1С-П) имеет более короткую нуклеотидную последовательность 3' нетранслируемой области и содержит консервативный полиА-сигнал (Рис.8), тогда как изоформа ТШС-П1 обладает более длинной 3' нетранслируемой частью, где полиА-сигнал вырезается вместе с интроном (интрон 2 на рис.8). Необходимо также отметить расположение ТПФ рибосвича на молекуле пре-мРНК: находясь частично на границе интрона 2 и экзона, этот риборегулятор имеет возможность влиять на процессинг этого интрона, блокируя один из сайтов сплайсинга. Основываясь на этих фактах, можно представить следующий механизм регуляции экспрессии гена ТШС при участии ТПФ рибосвича.

Рис.7. Экспрессия маркерного г ена ОРР, имеющего 3' нетранслируемую область гена ТШС с мутацией, препятствующей функционированию рибосвича,

в контрольных и обработанных растениях На рисунке представлены измерения экспрессии в трех независимых линиях трансформированных растений.

@ 0 мМ тнамииа ■ 1 иМ тиамина

Связывание рибосвича с лигандом в зависимости от концентрации последнего может приводить к образованию альтернативной вторичной структуры, которая влияет на эффективность сплайсинга интрона 2, являющегося основным сайтом в определении образования той или иной изоформы из-за присутствия консервативного полиА-сигнапа. Полученные данные об увеличении количества транскрипта ТШС-II при уменьшении концентрации ТПФ (Рис.5) указывают на возможность того, что сплайсинг интрона 2 блокирован и полиА-сигнап остается в транскрипте, образуя изоформу ТШС-И. При увеличении же концентрации витамина В, наблюдается уменьшение количества ТШС-И, что объясняется прохождением сплайсинга интрона 2, вырезанием полиА-сигнала с образованием более длинной ТШС-III. Но, как показано на рис. 5, уменьшение количества ТШС-II не сопровождается пропорциональным увеличением количества ТН1С-Ш, как следовало бы ожидать из приведенной выше схемы. К тому же, если бы наблюдалось подобное увеличение, то регуляция гена ТШС не происходила бы при изменении концентрации ТПФ. Для объяснения этого противоречия можно предположить следующую схему: при переключении альтернативного сплайсинга на формирование изоформы ТН1С-Ш (что происходит при увеличении концентрации ТПФ) этот транскрипт подвергается быстрой деградации, при которой не наблюдается увеличение его количества и происходит уменьшение экспрессии всего гена ТШС. Для экспериментальной проверки этого предположения следующим шагом было изучение стабильности сплайсинг-изоформ ТШС гена.

Таким образом, при увеличении эндогенной концентрации ТПФ в растении наблюдается уменьшение экспрессии гена ТН1С и снижение количества транскрипта TH1C-W, тогда как количество изоформы ТН1С-Ш существенно не изменяется. Регуляция экспрессии изучаемого гена при изменении концентрации ТПФ полностью определяется 3' нетранслируемой областью гена, которая содержит ТПФ рибосвич. Полученные результаты полностью соответствуют опубликованным ранее данным по регуляции экспрессии гена THIC при изменяющейся концентрации лиганда ТПФ рибосвича (Wächter et al., 2007; Bocobza et al., 2007).

THIC-H

Рис. 8. Схематическое изображение 3' нетранслируемой части гена ТН1С Черным прямоугольником показана 3' часть кодирующей области гена. Белыми прямоугольниками изображены интроны (интрон 1 и интрон 2). Серыми прямоугольниками - экзоны 3' нетранслируемой части. Треугольником показан полиА-сигнал, стрелкой - ТПФ рибосвич. Интрон 1 вырезается в процессе сплайсинга в обоих изоформах, тогда как интрон 2 в ТН1С-П остается в транскрипте, а в ТН1С-III изоформе удаляется.

2. Нонсенс-опосредованное разрушение мРНК (NMD) участвует в деградации ТН1С-Ш изоформы Согласно предложенной схеме регуляции экспрессии гена THIC одна из его изоформ (THIC-Ш) должна подвергаться быстрому разрушению. Для проверки этого предположения необходимо остановить транскрипцию и оценить число молекул изучаемых мРНК через несколько часов после блокирования синтеза новых транскриптов. В опыте использовалась суспензионная клеточная культура арабидопсиса и ингибитор транскрипции -кордицепин. Клеточная культура обрабатывалась данным ингибитором, и после 1 и 3 часов количество двух изоформ измерялось методом ПЦР в реальном времени. Результаты эксперимента показывают (Рис.9), что остановка транскрипции кордицепином не оказывает существенного влияния на число молекул изоформы THIC-U, тогда как количество THIC-IU уменьшается на 3 цикла ПЦР (что соответствует уменьшению в 8 раз) уже после 1 часа инкубации. Таким образом, резкое падение концентрации изоформы ТН1С-Ш свидетельствует о низкой стабильности данного транскрипта в растительной клетке.

Из этого следует, что при увеличении концентрации ТПФ в растении и переключении альтернативного сплайсинга на формирование транскрипта 77//С-Ш (что означает пропорциональное уменьшение количества 77//С-П) происходит его быстрая деградация, обуславливающая уменьшение экспрессии гена ТН1С. Следующим этапом исследования стало определение механизма разрушения изоформы Ш/С-Ш.

Для определения возможного механизма деградации мРНК необходимо рассмотреть такие характеристики транскрипта ТШС-Ш, которые отличают его от ТН1С-И. Все различия двух изоформ между собой заключаются в 3' нетранслируемой области гена, то есть в том месте, где происходит альтернативный сплайсинг. Не затрагивая возможные регуляторные элементы, которые могут находиться в разных нуклеотидных последовательностях, можно выделить две характерные черты изоформы Ш/С-Ш: длина 3'нетранслируемой области и наличие в ней второго интрона.

36т-------

THIC-U THIC-III

Рис. 9. Стабильность двух изоформ гена ТН1С На рисунке показаны измерения количества изучаемых транскриптов после 1 и 3 часов обработки ингибитором транскрипции суспензионной клеточной культуры арабидопсиса. Представлены средние значения трех измерений для каждой точки.

Нонсенс-опосредованное разрушение мРНК (NMD) в эукариотической клетке служит для удаления транскриптов, обладающих нонсенс стоп-кодоном (или преждевременным стоп-кодоном, ПСК), который узнаётся как нонсенс в клетках млекопитающих, если после него до сплайсинга следовал интрон на расстоянии более 55 нуклеотидов (Singh et al., 2003). Изоформа THIC-1П, в отличие от другой сплайсинг изоформы, имеет интрон, находящийся от стоп-кодона на расстоянии 83 нуклеотида. Таким образом, нормальный стоп кодон может быть узнан как ПСК, и эта РНК потенциально является мишенью для механизма контроля качества транскриптов посредством NMD. Было показано, что длинная нуклеотидная последовательность 3' нетранслируемой части гена может вызывать нонсенс-опосредованное разрушение мРНК у растений

(Kertesz el ai, 2006). Длина этой последовательности у THIC-III составляет 408 нуклеотидов, тогда как у TIJJC-U - 188 нуклеогидов. Из этого следует, что, обладая такой особенностью, изоформа ТШС-Ш может быть объектом для этого механизма разрушения мРНК. Таким образом, транскрипт 77-//C-UI обладает двумя элементами, способными инициировать процесс деградации этой молекулы РНК нонсенс-опосредованным механизмом разрушения: длинной 3' нетранслирусмой последовательностью и ПСК.

Для экспериментального подтверждения этой гипотезы использовали растения, содержащие мутацию в ключевом гене NMD-механизма, и ингибитор трансляции, который также полностью блокирует и NMD.

В процессе NMD узнавание транскрипта-мишени, содержащей ПСК, происходит во время трансляции. Используя этот факт, ингибиторы биосинтеза белков часто применяются в изучении этого деградационного процесса: обработка ингибиторами трансляции ведет к остановке разрушения мРНК, имеющей нонсенс стоп-кодон. Для определения механизма деградации изоформы THIC-IU была использована жидкая клеточная культура арабидопсиса и ингибитор трансляции циклогексимид. Клетки обрабатывали или кордицепином в качестве контроля, или циклогексимидом с кордицепином для определения скорости деградации изучаемого транскрипта в условиях, когда трансляция в клетке блокирована. После I и 3 часов инкубации растительный материал был собран, и количество изоформы ТШС-Ш была измерена методом ПЦР в реальном времени.

Результаты показывают (Рис. 10), что остановка трансляции действительно блокирует деградацию изоформы ТШС-Ш. Таким образом, разрушение этого транскрипта происходит во время биосинтеза белка и может быть связано с нонсенс-опосредованным разрушением мРНК.

Одним из основных белков NMD является UPF1 (up-frameshift protein 1) (Arciga-Reyes et al., 2006). Т-ДНК вставка в гене, кодирующем этот белок, приводит к уменьшению его экспрессии в 32 раза (Рис.11), что в свою очередь должно вести к уменьшению эффективности этого процесса в клетке. Мутантные растения, содержащие Т-ДНК вставку в гене upfl, были обработаны 1мМ раствором тиамина, контрольные растения обрабатывали водой. После 72 часов была измерена экспрессия всего гена ТН1С (его кодирующей части) и двух его изоформ.

Полученные данные показывают (Рис. 12), что ингибирование процесса нонсенс-опосредованного разрушения мРНК мутацией никак не затрагивает уменьшение количества изоформы ТШС-U при увеличении концентрации ТПФ, тогда как количество транскрипта ТШС-Ш значительно увеличивается по сравнению с растениями дикого типа (Рис. 5). Из этого следует, что при переключении альтернативного сплайсинга на образование изоформы ТШС-Ш, её деградация приостановлена в условиях пониженной эффективности работы механизма нонсенс-опосредованного разрушения мРНК.

о. ч й

Э о

М.Ё.

° с

29-

■сордицепин

кордицеиин/ никлогекснмид

28

Рис. 10. Стабильность изоформы ТН1С-Ш при обработке суспензионной клеточной культуры арабидопсиса ингибиторами транскрипции и трансляции Показано среднее значите трех измерений и стандартное отклонение.

Таким образом, в условиях замедления деградации изоформы Ш7С-ГП должна быть нарушена и регуляция всего гена. Измерения экспрессии всего гена ТН1С (Рис. 12) демонстрируют такое нарушение в регуляции гена при изменении эндогенной концентрации ТПФ.

си = С

о ~

ж аз

О о о. ч >. И

5 э

3 О

§ о

X о

36 | 34;

32,

30 ;

28

Д11КШ1 ТИН

-ЩШШ

1)РР мутант

Рис. 11. Уровень экспрессии гена ир/1 в растениях дикого типа и в мутантных растениях, содержащих Т-ДНК вставку

Таким образом, установлено, что изоформа ТН1С- Ш является нестабильным транскриптом. Характерные особенности данного транскрипта указывают на возможность его деградации с помощью нонсенс-опосредованного разрушения мРНК. Ингибирование трансляции ведёт к остановке деградации изоформы ТН1С-III. В растениях-мутантах по нонсенс-опосредованному разрушению мРНК нарушена регуляция гена ТН1С и деградация изоформы 77//С-Ш.

о. л Л

I с

2L:

Д о

38 Г 37,5 ■ 37. 36,5 —j

36 35,5

35

ТН1С-Ч

0 мМ тиамина

1 мМ тиамина

THIC

Рис. 12. Изменение экспрессии гена THIC и двух его изоформ в растении-мутанте по NMD при увеличении концентрации тиамина Показало среднее значение трех измерений.

пре-мРНК гена недостаток ТПФ / \ избыток ТПФ

Рибосвич блокирует сплайсинг интрона 2

Образование изоформы THIC-U и суммарное увеличение экспрессии гена THIC

Интрон 2 вырезается из пре-мРНК

Образование изоформы THIC-III, её быстрая деградция с помощью NMD и суммарное уменьшение экспрессии гена THIC

Рис. 13. Схема регуляции экспрессии гена THIC ТПФ рибосвичем и NMD

Суммируя полученные результаты, можно утверждать, что регуляция экспрессии гена THIC происходит с помощью функционирования ТПФ рибосвича и деградации изоформы THIC- Ш процессом нонсенс-опосредованного разрушения мРНК (Рис. 13).

3. Поиск новых классов рибосвичей в геноме растений арабидопсиса с помощью ДНК-тайлинг чипов

Согласно базе данных TAIR8 (www.arabidopsis.org) арабидопсис содержит в ядерном геноме 33003 гена, из которых 4330 гена подвергаются

альтернативному сплайсингу. Данный механизм затрагивает различные участки пре-мРНК (5' и 3' нетранслируемые области, кодирующие участки) и ответственен за образование 2 и более изоформ мРНК (генных моделей) у каждого гена. Различные изоформы одного гена характеризуются наличием уникальных нуклеотидных последовательностей, которые могут использоваться для мониторинга экспрессии каждой изоформы. В данной работе были использованы ДНК-тайлинг чипы (GeneChip Arabidopsis Tiling 1.0R Array (Affymetrix)), содержащие 3,2 миллиона проб длиной в 25 нуклеотидов и расстоянием между соседними пробами в 10 нуклеотидов. Такой дизайн ДНК чипа дает возможность оценить экспрессию гена на всей её протяженности, специфично определяя, где это возможно, ввиду длины специфического участка, количество сплайсинг изоформ.

Для поиска генов, экспрессия которых может регулироваться за счет активности рибосвича при изменении внутриклеточной концентрации его лиганда, были использованы два метаболита: известный регулятор гена THIC -тиаминпирофосфат, а также S-аденозилметионин (SAM). Обработка растений тиамином и последующее изучение активности генов с помощью тайлинг чипов позволяет оценить возможность использования этого метода в поиске генов, экспрессия которых регулируется посредством изменения количественного соотношения изоформ вследствие функционирования рибосвича. В свою очередь SAM играет важную роль в метаболизме серы в растении и является лигандом для многочисленных SAM-рибосвичей у бактерий (Wang et al., 2008).

В данной работе было показано, что регуляция экспрессии THIC гена при изменении внутриклеточной концентрации ТГ1Ф происходит с помощью рибосвича, ответственного за контроль альтернативного сплайсинга в данном гене. Посредством ПЦР в реальном времени установлено, что при увеличении концентрации лиганда ТТ1Ф рибосвича наблюдается уменьшение образования короткой изоформы (77//С-П), тогда как количество длинной изоформы существенно не изменяется. Таким образом, изученный механизм регуляции гена THIC позволяет оценить возможность использования ДНК-тайлинг чипов в поиске генов, активность которых определяется тем же механизмом.

Для определения эффекта увеличения концентрации ТПФ на экспрессию гена THIC с помощью ДНК-тайлинг чипов рассматривались две характеристики: изменение количества мРНК двух изоформ после обработки растений лигандом ТПФ рибосвича, измеренное с учетом всех проб тайлинг чипа, комплементарных исследуемым нуклеотиднь[М последовательностям и с учетом только тех проб, которые находятся в границах уникальных участков изоформ. Полученные результаты по гену THIC представлены в таблице 1.

Таблица 1

Изменение экспрессии гена ТН1С, определенное с помощью _ДНК-тайлинг чипов_

изоформы изоформа Уникальная последовательность изоформы

экспрессия Р экспрессия Р количество проб

ТН1С- и 0.5551 0.0102 3.6842 1 2

ТН1С- Ш 0.8195 0.0747 2.7235 0.6813 9

экспрессия - соотношение значений экспрессий (интенсивности проб) в обработанных и контрольных растениях, р - уровень значимости, вычисленное с помощью Манна-Уитни и-теста

Как видно из результатов, представленных в таблице 1, обработка растений тиамином ведет к уменьшению экспрессии изоформы ТН1С-II в 1.8 раз (соотношение количества мРНК в обработанных и контрольных растениях равно 0,5551). Тогда как менее выраженное уменьшение количества изоформы ТН1С-Ш статистически незначимо. Таким образом, определение эффекта увеличения концентрации ТПФ на экспрессию двух изоформ гена ТЫС, измеренное с учетом всех проб тайлинг чипа, которые находятся в границах изучаемых транскриптов, соответствует данным, полученными для изоформ с помощью метода ПЦР в реальном времени. Анализ же результатов, полученных при использовании проб, специфичных только для уникальных последовательностей изоформ, показывает большую зависимость результатов от количества проб: на изоформу ТН1С-Н приходится 2 уникальные пробы, что делает невозможным установление статистически значимых значений. Расчет экспрессии по 9 уникальным для изоформы ТН1С-Ш пробам демонстрирует статистически незначимое увеличение количества исследуемого транскрипта, что соответствует данным ПЦР в реальном времени: обработка растений тиамином не вызывает существенного изменения экспрессии изоформы ТН1С-III. Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что одним из методов определения изменения количества изоформ является использование всех проб, комплементарных к изучаемым транскриптам, тогда как вычисление экспрессии по уникальным участкам возможно только при наличии либо большого количества проб, специфичных для данных регионов мРНК, либо четкого сигнала с тайлинг чипа.

Результаты анализа изменения экспрессии гена ТН1С, определенной с помощью ДНК-тайлинг чипов, позволяют предложить следующую схему поиска генов-кандидатов: 1. Выделение генов, в которых изменение экспрессии, рассчитанное с использованием всех проб, находящихся в границах транскриптов, затрагивает только одну изоформу.

2. Идентификация генов, в которых только одна изоформа изменяет экспрессию, определенную с помощью проб, комплементарных уникальным последовательностям транскриптов.

3. Определение изоформ, в которых экспрессии, высчитанные с учетом уникальных проб и проб, находящихся в границах всего гена, различаются.

4. Поиск генов, изоформы которых имеют относительно длинную уникальную нуклеотидную последовательность, но не обладающие значимыми изменениями количества, тогда как сами гены характеризуются статистически значимыми повышением или уменьшением экспрессии.

В результате использования нескольких способов идентификации генов, в которых наблюдается различная экспрессия изоформ при увеличении внутриклеточной концентрации лигандов, было идентифицировано несколько десятков кандидатов: обработка тиамином - 33 гена, метионином - 42 гена. Для подтверждения выявленных изменений в различной экспрессии изоформ необходимо проведение ПЦР в реальном времени. После доказательства полученных данных необходимы исследования для выявления специфичности наблюдаемых изменений, поскольку регуляция альтернативного сплайсинга может быть и не связана с функцией рибосвича.

ВЫВОДЫ

1. Процессинг пре-мРНК гена ТШС сопровождается альтернативным сплайсингом с образованием различных количеств изоформ 7ШС-П и ТН1С-III.

2. Обработка растений тиамином, приводящая к увеличению эндогенной концентрации тиаминпирофосфата, вызывает уменьшение экспрессии гена ТШС

3. Повышение эндогенной концентрации тиаминпирофосфата сопровождается уменьшением количества изоформы ТН1С-11, тогда как содержание изоформы ТН1С-Ш существенно не изменяется.

4. Тиаминпирофосфатный рибосвич принимает непосредственное участие в регуляции экспрессии гена ТШС при увеличении концентрации своего лиганда.

5. Установлено, что изоформа ТШС-III является нестабильным транскригттом и быстро деградирует с помощью нонсенс-опосредованного разрушения мРНК.

6. Показана возможность обнаружения тиаминпирофосфатного рибосвича с помощью ДНК-тайлинг чипов.

7. Идентифицированы гены-кандидаты, у которых регуляция альтернативного сплайсинга может осуществляться посредством функционирования 8-аденозилметионинового рибосвича.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Маланин С.Ю. Связь альтернативного сплайсинга и нонсенс-опосредованного разрушения мРНК (NMD) в регуляции экспрессии гена Т№С у арабидопсиса / Маланин С.Ю., Никифорова В.Ю. // Физиология растений. -2010. - Т.57, кн.2. - С.: 280-286.

2. Маланин С.Ю. Рибосвичи - новый класс регуляторов генной активности / Маланин С.Ю., Барабанщиков Б.И. // Учен. зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2011. - Т. 153, кн. 2. - С.: 73-88.

3. Маланин С.Ю. Особенности регуляции экспрессии гена биосинтеза тиамина у Arabidopsis thaliana / Маланин С.Ю., Барабанщиков Б.И. // Труды Всероссийской конференции «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем». - Уфа, 2009. - С: 94-100.

4. Маланин С.Ю. Процесс нонсенс-опосредованного разрушения мРНК в арабидопсисе осуществлятся посредством декэппирования транскриптов / Маланин С.Ю., Никифорова В.Ю. // Материалы VI Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». - Минск, 2009. - С.: 57-58.

5. Маланин С.Ю. Роль активной трансляции в нонсенс-опосредованном разрушении мРНК у растений / Маланин С.Ю., Никифорова

B.Ю. // Сборник тезисов 13-ой международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2009. -

C.: 27-28.

6. Malanin S.J. Tiling arrays in search for the new regulation modes of eukaryotic gene expression / Malanin S.J., Childs L., Walther D., Nikiforova V.l. // The Fifth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development". - Moscow, 2009. - C.: 68-69.

7. Маланин С.Ю. Регуляция экспрессии гена THIC в арабидопсисе: взаимодействие ТПФ рибосвича и процесса нонсенс-опосредованного разрушения мРНК / Маланин С.Ю., Никифорова В.Ю. // Сборник материалов научной конференции «Современные проблемы генетики». - Казань, 2011. - С.: 31-33.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПСК - преждевременный стоп-кодон

ТПФ - тиаминпирофосфат

GFP - зелёный флуоресцентный белок

NMD - нонсенс-опосредованное разрушение мРНК

SAM - S-аденозилметионин

Отзывы на автореферат просим высылать по адресу: 420008. г. Казань, ул. Кремлевская, 18, отдел службы аттестации, ученому секретарю Диссертационного совета Д.212.081.08. Абрамовой Зинаиде Ивановне и по факсу: (843)238-76-01.

Отпечатано в типографии «Деловая полиграфия» 420111, г. Казань, ул. М. Межлаука, 6 т/ф (843) 292-08-43 e-mail: minitipografia@list.ru

Подписано в печать 20.10.2011 г. Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ № 169/2011

1 1 - 1 9 9 3 2

2010013158

2010013158

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маланин, Сергей Юрьевич

Список сокращений

Введение 4 Обзор литературы

1. Рибосвичи - риборегуляторы генной экспрессии

2. Открытие и методы изучения рибосвичей

3. Классы рибосвичей

4. Механизмы контроля экспрессии генов рибосвичами

5. Практическое применение рибосвичей 36 Заключение по обзору литературы 40 Экспериментальная часть

Материалы и методы исследования 42 Результаты и обсуждение

1. Регуляция экспрессии гена THIC происходит с помощью

ТПФ рибосвича

2. Нонсенс-опосредованное разрушение мРНК (NMD) участвует в деградации ТН1С-Ш изоформы

3. Поиск новых классов рибосвичей в геноме растений арабидопсиса с помощью ДНК-тайлинг чипов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экспрессии гена THIC Arabidopsis thaliana с помощью тиаминпирофосфатного рибосвича"

Регуляция экспрессии генов является неотъемлемой частью существования любого живого организма. При постоянно изменяющихся условиях внешней среды клетка должна своевременно реагировать специфичными изменениями метаболизма для быстрого и адекватного приспособления. Одним из механизмов подобного контроля является регуляция экспрессии генов, происходящая на всех этапах транскрипции, процессинга и трансляции мРНК. В ходе эволюции возникли разнообразные формы регуляции, где главными "рабочими молекулами" являются белки. В* то же время, обнаружены и такие способы контроля» работы генов, которые не требуют участия белков, отражающие, возможно, наиболее древние методы регуляции. Среди них можно выделить особый класс рибонуклеиновых регуляторов, названных рибосвичами' (riboswitch).

Первоначально обнаруженные в бактериях, рибосвичи представляют собой небольшие участки молекул. мРНК, находящиеся, как правило,, в 5' некодирующей области и способные с высокой селективностью связывать определенные метаболиты и посредством такого связывания? влиять на транскрипцию или-трансляцию этих мРНК путём образования регуляторных вторичных структур (Winkler, Breaker, 2005). Рибосвич состоит из двух функционально различных доменов: отвечающая за связывание аптамеровая часть является наиболее консервативной областью и, связывая определенный метаболит, вызывает конформационные изменения, во втором домене -экспрессионной платформе, что приводит к образованию терминаторов/антитерминаторов транскрипции или к блокированию последовательности Шайн-Дальгарно. Таким образом, происходит регуляция транскрипции или трансляции мРНК, содержащих рибосвичи, в зависимости от концентрации лиганда.

В настоящее время у прокариот обнаружено около 10 классов рибосвичей, способных связывать различные молекулы: ион металла (катион магния), нулеотидные основания (аденин, гуанин), аминокислоты (глицин, лизин), витамины (тиаминпирофосфат, витамин Bi2), коферменты (S-аденозилметионин) и другие метаболиты. Рибосвичи обнаружены в генах, кодирующих белки биосинтеза или транспорта веществ, которые являются лигандами этих риборегулятров. Каждый класс рибосвичей характеризуется высокой нуклеотидной гомологией аптамеровой части, что позволило обнаружить широкое распространение этого способа регуляции у прокариотических организмов'.

Наличие полностью секвенированных геномов-, некоторых эукариот сделало возможным обнаружение одного класса рибосвичей в генах грибов и растений: тиаминпирофосфатный рибосвич (ТПФ рибосвич) — единственный риборегулятор, найденный* до- настоящего времени в эукариотической клетке (Sudarsana et al., 2003). Следует отметить, что1 этот тип рибосвичей является наиболее распространенным среди бактерий и первоначально был обнаружен в опероне THICOGE бактерии Rhizobium- etli, кодирующем белки биосинтеза тиаминпирофосфата (ТПФ, витамин Bj). В царстве растений ТПФ рибосвич найден в геноме арабидопсиса (Arabidopsis thaliana), риса (Oryza sativa) и мятлика (Роа secunda).

В модельном растении арабидопсиса этот рибосвич находится в 3' некодирующей части гена THIC (At2g29630), который кодирует фермент, катализирующий синтез пиримидиновой части витамина В\. Этот ген имеет две изоформы, образующиеся в результате* альтернативного сплайсинга, происходящего также в 3' нетранслируемой части гена. Механизм действия ТПФ рибосвича в регуляции экспрессии гена THIC оставался неизвестным, но его расположение в пре-мРНК и наличие двух изоформ позволяло предположить, что он действует через регулирование альтернативного сплайсинга и/или стабильности образуемых сплайсинг вариантов.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось определение роли тиаминпирофосфатного рибосвича в регуляции экспрессии гена THIC Arabidopsis thaliana, а также установление возможности использования ДНК-тайлинг чипов для поиска новых классов рибосвичей и идентификации генов, регуляция которых может осуществляться с их помощью.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

1. Определить изменение экспрессии гена THIC при повышении эндогенной концентрации тиаминпирофосфата.

2. Выяснить функциональную значимость тиаминпирофосфатного рибосвича в регуляции экспрессии гена THIC.

3. Установить механизм контроля экспрессии гена THIC, при регулируемом альтернативном сплайсинге.

4. Определить возможность идентификации тиаминпирофосфатного рибосвича с помощью ДНК-тайлинг чипов.

5. Осуществить поиск новых классов рибосвичей у Arabidopsis thaliana с использованием S-аденозилметионина как.лиганда.

Научная новизна работы.

В данной работе исследована регуляция гена THIC арабидопсиса {Arabidopsis thaliana) с помощью ТПФ рибосвича, единственного известного до настоящего времени у эукариот. Впервые установлена связь между ТПФ рибосвичем и нонсенс-опосредованным разрушением мРНК (nonsense mediated decay, NMD) в регуляции экспрессии исследуемого гена. Показано, что NM0D участвует в деградации нестабильной изоформы, образующейся в результате альтернативного сплайсинга.

Впервые показана возможность использования ДНК-тайлинг чипов в идентификации ТПФ рибосвича в геноме арабидопсиса. Кроме того, в работе 6 были определены гены-кандидаты, регуляция которых может осуществляться с помощью S-аденозилметионинового рибосвича.

Научно-практическая значимость работы.

Изученный механизм регуляции экспрессии гена THIC открывает возможность использования рибосвичей в конструировании искусственных систем у эукариот с контролируемой работой генов, которые найдут применение в научных исследованиях и биотехнологии.

Показана возможность использования технологии ДНК-тайлинг чипов для изучения регуляции альтернативного сплайсинга у растений.

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены, на VI Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2009), 13-ой международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), 5-ой Московской международной конференции «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development» (Moscow, 2009), Всероссийской конференции «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем» (Уфа, 2009), конференции.«Современные проблемы генетики» (Казань, 2011).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК: «Физиология растений» и «Ученые записки Казанского;государственного университета».

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Маланин, Сергей Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Процессинг пре-мРНК гена ТН1С сопровождается альтернативным сплайсингом с образованием различных количеств изоформ ТН1С-11 и ТШС-Ш.

2. Обработка растений тиамином, приводящая к увеличению эндогенной концентрации тиаминпирофосфата, вызывает уменьшение экспрессии гена ТН1С.

3. Повышение эндогенной концентрации тиаминпирофосфата сопровождается уменьшением количества изоформы ТН1С-11, тогда как содержание изоформы ТН1С-Ш существенно не изменяется.

4. Тиаминпирофосфатный рибосвич принимает непосредственное участие в регуляции экспрессии гена ТН1С при увеличении концентрации своего лиганда.

5. Установлено, что изоформа ТН1С-Ш является нестабильным транскриптом и быстро деградирует с помощью нонсенс-опосредованного разрушения мРНК.

6. Показана возможность обнаружения тиаминпирофосфатного рибосвича с помощью ДНК-тайлинг чипов.

7. Идентифицированы гены-кандидаты, у которых регуляция альтернативного сплайсинга может осуществляться посредством функционирования 8-аденозилметионинового рибосвича.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маланин, Сергей Юрьевич, Казань

1. Еремина и др. Мутационный анализ лидерной области гена RIBB ESCHERICHIA COLI / Еремина С.Ю., Золотухина М.А., Эрраис Лопес Л., Миронов А.С. // Биотехнология. — 2008. — № 2. — С. 16-30.

2. Лобанов и др. Мутации, приводящие к изменению специфичности сенсорной РНК, кодируемой геном PBJJE BACILLUS SUBTILIS / Лобанов К. В., Королькова Н.В., Еремина С.Ю., Эррайс Лопес Л., Прошкин С.А., Миронов

3. A.С. // Генетика. 2007. - Т. 43, № 6. - С. 712-716.

4. Лобанов и др. Мутационный анализ лидерной области пуринового оперона BACILLUS SUBTILIS / Лобанов К.В., Королькова Н.В., Еремина С.Ю., Эрраис Лопес Л., Миронов А.С. // Генетика. 2011. - Т. 47, № 7. - С. 890-899.

5. Arciga-Reyes et al. UPF1 is required for nonsense-mediated mRNA decay (NMD) and RNAi in Arabidopsis / Arciga-Reyes L., Wootton L., Kieffer M., Davies

6. B. // Plant J. 2006. - V. 47. - P. 480-489.

7. Auger et al. The metIC operon involved in methionine biosynthesis in Bacillus subtilis is controlled by transcription antitermination / Auger S., Yuen W.H., Danchin A., Martin-Verstraete I. // Microbiology. 2002. - V. 148. - P. 507-518.

8. Babitzke. Regulation of transcription attenuation and translation initiation by allosteric control of an RNA-binding protein: the Bacillus subtilis TRAP protein / Babitzke P. // Curr. Opin. Microbiol. 2004. - V. 7. - P. 132-139.

9. Barkan. Nuclear mutants of maize with defects in chloroplast polysome assembly have altered chloroplast RNA metabolism / Barkan A. // Plant Cell. 1993. -V. 5.-P. 389-402.

10. Barkan. Approaches to investigating nuclear genes that function in chloroplast biogenesis in land plants / Barkan A. // Methods in Enzymology. — 1998. —V. 297. — P. 38-56.

11. Batey et al. Structure of a natural guanine-responsive riboswitch complexed with the metabolite hypoxanthine / Batey R.T., Gilbert S.D., Montange R.K. // Nature.-2004.-V. 432. -P. 411-415.

12. Bocobza et al. Riboswitch-dependent gene regulation and its evolution in the plant kingdom / Bocobza A., Adato A., Mandel T., Shapira M., Nudler E., Aharoni A. // Genes & Dev. 2007. - V. 21. - P. 2874-2879.

13. Breaker. Engineered allosteric ribozymes as biosensor components / Breaker R.R. // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - V. 13. - P. 31-39.

14. Butler et al. Structural basis of cooperative ligand binding by the glycine riboswitch / Butler E.B., Xiong Y., Wang J., Strobel S.A. // Chem. Biol. 2011. - V. 18.-P. 293-298.

15. Chang. The nonsense/mediated decay RNA surveillance pathway / Chang Y.F., Saadi Imam J., Wilkinson F. // Annu. Rev. Biochem. 2007. - V. 76. - P. 51-74.

16. Cheah et al. Control of alternative RNA splicing and gene expression by eukaryotic riboswitches / Cheah M.T., Wachter A., Sudarsan N., Breaker R.R. // Nature. 2007. - V. 447. - P. 497-501.

17. Chowdhury et al. Temperature-controlled structural alterations of an RNA thermometer / Chowdhury S., Ragaz C., Kreuger E., Narberhaus F. // J. Biol. Chem. 2003. -V. 278. - P. 47915-47921.

18. Clark et al. Genomewide analysis of mRNA processing in yeast using splicing-specific microarrayds I I Clark T.A., Sugnet C.W., Ares M.Jr. // Science. 2002. — V. 296.-P. 907-910.

19. Clough et al. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana I Clough S.J., Bent A.F. // Plant J. 1998. — V. 16.-P. 735-743.

20. Cochrane et al. Structural investigation of the GlmS ribozyme bound to its catalytic cofactor / Cochrane J.C., Lipchock S.V., Strobel S.A. // Chem. Biol. 2007. -V. 14.-P. 97-105.

21. Colby et al. Mix-and-match riboswitches / Colby D., Batey R.T. // ACS Chem. Biol. 2006. - V. 1. - P. 751 -754.

22. Couttet et al. Messenger RNA deadenylation precedes decapping in mammalian cells / Couttet P., Fromont-Racine M., Steel D., Pictet R., Grange T. // PNAS. 1997. - V. 94. - P. 5628-5633.

23. Croft et al. Thiamine biosynthesis in algae is regulated by riboswitches / Croft M.T., Moulin M., Webb M.E., Smith A.G. // PNAS. 2007. - V. 104. - P. 2077020775.

24. Cromie et al. An RNA sensor for intracellular Mg2+ / Cromie M.J., Shi Y., Latifi T., Groisman E.A. // Cell. 2006. -V. 125. - P. 71-84.

25. Curtis et al. A Gateway TM cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in plants / Curtis M., Grossniklaus U. // Plant Physiology. 2003. -V. 133.-P. 462-469.

26. Desai et al. Genetic screens and selections for small molecules based on a synthetic riboswitch that activates protein translation / Desai S.K., Gallivan J.P. // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126. - P. 13247-13254.

27. Doyle et al. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue / Doyle J. J., Doyle J. L. // Phytochemical Bulletin. 1987. - V. 19. - P. 11-15.

28. Draper et al. Ions and RNA folding / Draper D.E., Grilley D., Soto A.M. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. -2005. -V. 34. P. 221-243.

29. Ellington et al. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands / Ellington A.D., Szostak J.W. // Nature. 1990. - V. 346. - P. 818-822.

30. Epshtein et al. The riboswitch-mediated control of sulphur metabolism in bacteria / Epshtein V., Mironov A.S., Nudler E. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -2003.-V. 100.-P. 5052-5056.

31. Franklund et al. Multiple transcribed elements control expression of the Escherichia coli btuB gene / Franklund C.V., Kadner R.J. // J. Bacteriol. 1997. - V. 179.-P. 4039-4042.

32. Fuchs et al. S-adenosylmethionine directly inhibits binding of 30S ribosomal subunits to the SMk box translation riboswitch RNA / Fuchs R.T., Grundy F.J., Henkin T.M. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007. - V. 104. - P. 4876-4880.

33. Gelfand et al. A conserved RNA structure element involved in the regulation of bacterial riboflavin synthesis genes / Gelfand M.S., Mironov A.A., Jomantas J., Kozlov Y.I., Perumov D.A. // Trends Genet. 1999. - V. 15. - P. 439^142.

34. Gilbert et al. Thermodynamic and kinetic characterization of ligand binding to the purine riboswitch aptamer domain / Gilbert S.D., Stoddard C.D., Wise S.J., Batey R.T. // J. Mol.Biol. 2006. - V. 359. - P. 754-768.

35. Gonzalez et al. Cobalamin-independent methionine synthase from Escherichia coli: a zinc metalloenzyme / Gonzalez J.C., Peariso K., Penner-Hahn J.E., Matthews R.G. // Biochemistry. 1996. -V. 35. - P. 12228-12234.

36. Grate et al. Inducible regulation of the S. cerevisiae cell cycle mediated by an RNA aptamer-ligand complex / Grate D., Wilson C. // Bioorg. Med. Chem. 2001. -V. 9.-P. 2565-2570.

37. Grilley et al. Mg -RNA interaction free energies and their relationship to the folding of RNA tertiary structures / Grilley D., Soto A.M., Draper D.E. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2006. - V. 103. - P. 14003-14008.

38. Groisman. The pleiotropic two-component regulatory system PhoP-PhoQ / GroismanE.A.//J. Bacteriol.-2001. V. 183.-P. 1835-1842.

39. Grundy et al. The S box regulon: a new global transcription termination control system for methionine and cysteine biosynthesis genes in gram-positive bacteria / Grundy F.J., Henkin T.M. // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 737-749.

40. Grundy et al. The T box and S box transcription termination control systems / Grundy F.J., Henkin T.M. // Front Biosci. 2003. - V. 8. - P. d20-d31.

41. Grundy et al. The L box regulaon: lysine sensing by leader RNAs of bacterial lysine biosynthesis genes / Grundy F.J., Lehman S.C., Henkin T.M. // PNAS. 2003. -V. 100.-P. 12057-12062.

42. Gusarov et al. The mechanism of intrinsic transcription termination / Gusarov I., Nudler E. // Mol. Cell. 1999. - V. 3. - P. 495-504.

43. Hartz et al. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes / Hartz D., McPheeters D.S., Traut R., Gold L. // Methods Enzymol. 1988. - V. 164. -P. 419-425.

44. He et al. Upflp, Nmd2p, and-Upßp regulate the decapping and exonucleolytic degradation of both nonsense-containing mRNAs and wild-type mRNAs / He F., Jacobson A. // Mol. Cell Biol. 2001. - V. 21. - P. 1515-1530.

45. Henkin et al. Regulation by transcription attenuation in bacteria: how RNA provides instructions for transcription termination/antitermination decisions / Hartz D., McPheeters D.S., Traut R., Gold L. // Bioessays. 2002. - V. 24. - P. 700-707.

46. Hesselberth et al. Simultaneous detection of diverse analytes with an aptazyme ligase arrays / Hesselberth J.R., Robertson P., Knudsen S.M., Ellington A:D. // Anal. Biochem. -2003. V. 312.-P. 106-112.

47. Jacob et al. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins / Jacob F., Monod J. // J. Mol. Biol. 1961. - V. 3. - P. 318-356.

48. Jakson et al. Influence of ionic strength, pH and chelation of divalent metals on isolation of polyribosomes from tobacco leaves / Jakson A.O., Larkins B.A. // Plant Physiol. 1976. - V. 57. - P. 5-10.

49. Jouanneau et al. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco / Jouanneau J.P., Peaud-Lenoel C. // Physiologia Plantarum. 1967. - V. 20. - P.834-850.

50. Kertesz et al. Both introns and long 3'-UTRs operate as cis-acting elements to trigger nonsense-mediated decay in plants / Kertesz S., Kerenyi Z., Merai Z., Bartos I., Palfy T., Barta E., Silhavy D. // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34. - P. 6147 -6157.

51. Kim et al. Guanine riboswitch variants from Mesoplasma florum selectively recognize 2'-deoxyguanosine / Kim J.N., Roth A., Breaker R.R. // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.-2007.-V. 104.-P. 16092-16097.

52. Klein et al. Structural basis of glmS ribozyme activation by glucosamine-6-phosphate / Klein D.J., Ferre-D'Amare A.R. // Science. 2006. - V. 313. - P. 17521756.

53. Knudsen et al. Ribozyme-mediated signal augmentation on a mass-sensitive biosensor / Knudsen S.M, Lee J., Ellington A.D., Savran C.A. // J. Am. Chem. Soc. — 2006.-V. 128.-P. 15936-15937.

54. Kochhar et al. Lysine-induced premature transcription termination in the lysC operon of Bacillus subtilis / Kochhar S., Paulus H. // Microbiology. 1996. - V. 142. -P. 1635-1639.

55. Kolberg et al. Structure, function, and mechanism of ribonucleotide reductases / Kolberg M., Strand K.R., Graff P., Andersson K.K. // Biochim. Biophys. Acta. -2004.-V. 1699.-P. 1-34.

56. Kornblihtt. Promoter usage and alternative splicing / Kornblihtt A.R. // Curr. Opin. Cell Biol. 2005. - V. 17. - P. 262-268.

57. Mandai et al. Riboswitches control fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis and other bacteria / Mandai M., Boese B., Barrick J.E., Winkler W.C. Breaker R.R. // Cell. 2003. - V. 113. - P.577-586.

58. Mandal et al. Adenine riboswitches and gene activation by disruption of a transcription terminator / Mandal M., Breaker R.R. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. -V. 11.-P. 29-35.

59. Mandal et al. A glycine-dependent riboswitch that uses cooperative binding to control gene expression / Mandal M., Lee M., Barrick J.E., Weinberg Z., Emilsson G.M., Ruzzo W.L., Breaker R.R. // Science. 2004. - V. 306. - P. 275-279.

60. Maquat. Nonsense-mediated mRNA decay: splicing, translation and mRNP dynamics / Maquat L.E. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. - V. 5. - P. 89-99.

61. Martens et al. Microbial production of vitamine B12 / Martens J.H., Barg H., Warren M.J., Jahn D. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 58. - P. 275-285.

62. McCarthy et al. Ligand requirements for glmS ribozyme self-cleavage / McCarthy T.J., Plog M.A., Floy S.A., Jansen J.A., Soukup J.K., Soukup G.A. // Chem. Biol.-2005.-V. 12.-P. 1221-1226.

63. McDaniel et al. Transcription termination control of the S box system: direct measurement of S-adenosylmethionine by the leader RNA / McDaniel B.A.M., Grundy F.J., Artsimovitch I., Henkin T.M. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. -V. 100.-P. 3083-3088.

64. Meyer et al. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes / Meyer S., Temme C., Wahle E. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2004. - V. 39. -P. 197-216.

65. Milewski. Glucosamine-6-phosphate synthase: the multi-facets enzyme / Milewski S. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. - V. 1597. - P. 173-192.

66. Miranda-Rios et al. A conserved RNA structure (thi box) is involved in regulation of thiamine biosynthetic gene expression in bacteria / Miranda-Rios J.,

67. Navarro M., Soberon M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 97369741.

68. Mironov Qt al. Sensing small molecules by nascent RNA: a mechanism to control transcription in bacteria / Mironov A.S., Gusarov I., Rafikov R., Lopez L.E., Shatalin K., Kreneva R.A., Perumov D.A., Nudler E. // Cell. 2002. - V. 111. - P. 747-756.

69. Montagne ei al. Characterization of the catalytic activities of the PhoQ histidine protein kinase of Salmonella enterica serovar Typhimurium / Montagne M., Martel A., LeMoual H. // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 1787-1791.

70. Montange et al. Structure of the S-adenosylmethionine riboswitch regulatory mRNA element / Montange R.K., Batey R.T. // Nature. 2006. - V. 441. - P. 11721175.

71. Miiller Qt al. Sensors made of RNA: tailored ribozymes for detection of small organic molecules, metals, nucleic acids and proteins / Miiller S., Strohbach D., Wolf J. // IEE Proc. Nanobiotechnol. 2006. - V. 153. - P. 31-40.

72. Nagy. A rule for termination-codon position within intron-containing genes: when nonsense affects RNA abundance / Hagy E., Maquat L.E. // Trends Biochem. Sci. 1998. - V. 23. - P. 198-199:

73. Nahvi Qt al. Genetic control by a metabolite binding mRNA / Nahvi A., Sudarsan N., Ebert M.S., Zou X., Brown K.L., Breaker R.R. // Chem. Biol. 2002. -V. 9.-P. 1043-1049.

74. Nahvi Qt al. Coenzyme B12 riboswitches are widespread genetic control elements in prokaryotes / Nahvi A., Barrick J.E., Breaker R.R. // Nucleic Acids Research. 2004. - V. 32. - P. 143-150.

75. Nou Qt al. Coupled changes in translation and transcription during cobalamin-dependent regulation of btuB expression in Escherichia coli / Nou X., Kadner RJ. // J. Bacteriol. 1998. -V. 180. -P. 6719-6728.

76. Nou Qt al. Adenosylcobalamin inhibits ribosome binding to btuB RNA / Nou X., Kadner R.J. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 7190-7195.

77. Patte et al. The leader sequence of the Escherichia coli lysC gene is involved in the regulation LysC synthesis / Patte J-C., Akrim M., Mejean V. // FEMS Microbiol. Lett.-1998.-V. 169.-P. 165-170.

78. Pejchal et al. Cobalamin-independent methionine synthase (MetE): a face-to-face double barrel that evolved by gene duplication / Pejchal R., Ludwig M.L. // PLoS Biol. 2005. - V. 3. - P. e31.

79. Raschke et al. Vitamin B1 biosynthesis in plants requires the essential iron-sulfur cluster protein, THIC / Raschke M., Bürkle L., Müller N., Nunes-Nesi A., Fernie A.R., Arigoni D., Amrhein N., Fitzpatrick T.B. // PNAS. 2007. - V. 104. -P. 19637-19642.

80. Ravnum et al. Vitamin B12 repression of the btuB gene in Salmonella typhimurium is mediated via a translational control which requires leader and coding sequences / Ravnum S., Andersson D.I. // Mol. Microbiol. 1997. - V. 23. - P. 3542.

81. Ravnum et al. An asenosyl-cobalamin (coenzyme-bl2)-repressed translation enchancer in the cob mRNA of Salmonella typhimurium / Ravnum S., Andersson D.I. // Mol. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 1585-1594.

82. Richter-Dahlfors et al. Cobalamin (vitamin B12) repression of the cob operon in Salmonella typhimurium: Translation control of the cbiA gene / Richter-Dahlfors A.A., Andersson D.I. // Mol. Microbiol. 1992. - V. 13. - P. 541-553.

83. Rieder et al. Folding of a transcriptionally acting PreQi riboswitch / Rieder U., Kreutz C., Micura R. // PNAS. 2010. - V. 107. - P. 10804-10809.

84. Robertson et al. In vitro selection of ribozymes dependent on peptides for activity / Robertson M.P., Knudsen S.M., Ellington A.D. // RNA. 2004. - V. 10. -P. 114-127.

85. Rodionov et al. Comparative genomics of the methionine metabolism in grampositive bacteria: a variety of regulatory systems / Rodionov D.A., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 3340-3353.

86. Rosner. Control of lysine biosynthesis in Bacillus subtilis: inhibition of diaminopimelate decarboxylase by lysine / Rosner A. // J. Bacteriol. — 1975. V. 121.-P. 20-28.

87. Roth et al. Selection in vitro of allosteric ribozymes / Roth A., Breaker R.R. // Methods Mol. Biol. 2004. - V. 252. - P. 145-164.

88. Rueda et al. Fluorescent energy transfer readout of an aptazyme-based biosensor / Rueda D., Walter N.G. // Methods Mol. Biol. 2006. - V. 335. - P. 289310.

89. Sapsford et al. Demonstration of four immunoassay formats using the array biosensor / Sapsford K.E., Charles P.T., Patterson C.H. Jr., Ligler F.S. // Anal. Chem. — 2002. — V. 74.-P. 1061-1068.

90. Scheller Qt al. Research and development in biosensors / Scheller F.W., Wollenberger U., Warsinke A., Lisdat F // Curr. Opin. Biotechnol. 2001. - V. 12. -P. 35-40.

91. Schendel et al. Cloning and nucleotide sequence of the gene coding for aspartokinase II from a thermophilic methylotrophic Bacillus sp. / Schendel F. J., Flickinger M.C. // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 2806-2814.

92. Schwartz et al. Stability of plant mRNAs depends on the length of the 3'-untranslated region / Schwartz A.M., Komarova T.V., Skulachev M.V., Zvereva A.S., Dorokhov Iu. L., Atabekov J.G. // Biochemistry (Mosc.). 2006. - V. 71. - P. 1377-1384.

93. Seetharaman et al. Immobilized RNA switches for the analysis of complex chemical and biological mixtures / Seetharaman S., Zivarts M., Sudarsan N., Breaker R.R. //Nat. Biotechnol. 2001. -V. 19. - P. 336-341.

94. Sekella ei al. A biosensor for theophylline based on fluorescence detection of ligand-induced hammerhead ribozyme cleavage / Sekella P.T., Rueda D., Walter N.G. // RNA. 2002. - V. 8. - P. 1242-1252.

95. Serganov et al. Structural basis for gene regulation by a thiamine pyrophosphate-sensing riboswitch / Serganov A., Polonskaia A., Phan A.T., Breaker R.R., Patel DJ. // Nature. 2006. - V. 441. - P. 1167-1171.

96. Singh et al. New insights into the formation of active nonsense-mediated decay complex / Singh G., Lykke-Andersen J. // Trends Biochem. 2003. - V. 28. - P. 464 -466.

97. Soukup et al. Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of RNA / Soukup G.A., Breaker R.R. // RNA. 1999. - V. 5. - P. 13081325.

98. Storz et al. Controlling mRNA stability and .translation with small, noncoding RNAs / Storz G., Opdyke J.A., Zhang A. // Curr Opin Microbiol. 2004. - V. 7. - P. 140-144.

99. Sudarsana et al. Metabolite-binding RNA domains are present in the genes of eukaryotes / Sudarsan3 N., Barrick J.E., Breaker R.R. // RNA. 2003. - V. 9. - P. 644-647.

100. Sudarsanb et al. An mRNA structure in bacteria that controls gene expression by binding lysine / Sudarsanb N., Wickiser J.K., Nakamura S., Ebert M.S., Breaker R.R. // Genes Dev. 2003. - V. 17. - P. 2688-2697.

101. Sudarsan et al. Thiamine pyrophosphate riboswitches are targets for the antimicrobial compound pyrithiamine / Sudarsan N., Cohen-Chalamish S., Nakamura S., Emilsson G.M., Breaker R.R. // Chem. Biol. 2005. - V. 12. - P. 1325-1335.

102. Sudarsan et al. Tandem riboswitch architectures exhibit complex gene control functions / Sudarsan N., Hammond M.C., Block K.F., Welz R., Barrick J.E., Roth A., Breaker R.R. // Science. 2006. - V. 314. - P. 300-304.

103. Thompson et al. Group I aptazymes as genetic regulatory switches / Thompson K.M., Syrett H.A., Knudsen S.M., Ellington A.D. // BMC Biotechnology. -2002.-V. 2.-P: 21.

104. Thore et al. Structure of the eukaryotic thiamine pyrophosphate riboswitch with its regulatory ligand / Thore S., Leibundgut M., Ban N. // Science. 2006. — V. 312.-P. 1208-1211.

105. Vitreschak et al. Regulation of the vitamin B12 metabolism and; transport in bacteria by a conserved RNA structural: element / Vitreschak A.G., Rodionov D.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. // RNA. 2003. - V. 9. - P. 1084-1097.

106. Vitreschak et al, Riboswitches: the oldest mechanism for the regulation of gene expression? / Vitreschak A.G., Rodionov D.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. // Trends Genet. 2004. - V, 20. - P. 44-50.

107. Wächter ^ et al. Riboswitch Control of Gene Expression in Plants by Splicing and Alternative 3' End Processing of mRNAs / Wächter A., Tunc-Ozdemir M., Grove B:C., Green P.J., Shintani D.K., Breaker R.R. // The Plant Cell. 2007. - V. 19. - P. 3437-3450.

108. Wang et al. Genomewide comparative analysis of alternative splicing in plants / Wang B.B., Brendel V. // PNAS. 2006. -V. 103. - P. 7175-7180.

109. Wang et al. Riboswithes that sense S-adenosylmethionine and S-adenosylhomocysteine. / Wang J.X., Breaker R.R. // Biochem. Cell Biol. — 2008. V. 86.-P. 157-168.

110. Webb et al. Characterization of thiL, encoding thiamin-monophosphate kinase in Salmonella typhimurium / Webb E., Downs D. // J. Biol. Chem. — 1997. — V. 272. -P. 15702-15707.

111. Weinberg et al. The aptamer core of SAM-IV riboswitches mimics the ligand-binding site of SAM-I riboswitches / Weinberg Z., Regulski E.E., Hammond M.C., Barrick J.E., Yao Z., Ruzzo W.L., Breaker R.R. // RNA. 2008. - V. 14. - P. 822828.

112. Winkler3 et al. An mRNA structure that controls gene expression by binding FMN / Winklera W.C., Cohen-Chalamish S., Breaker R.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2002.-V. 99.-P. 15908-15913.

113. Winklerb et al. Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression / Winklerb W., Nahvi A., Breaker R.R. // Nature. 2002. -V. 419. -P. 952-956.

114. Winkler et al. Genetic control by metabolite-binding riboswitches / Winkler W.C., Breaker R.R. // Chembiochem. 2003. V. 4. - P. 1024-1032.

115. Winkler et al. An mRNA structure that controls gene expression by binding S-adenosylmethionine / Winkler W.C., Nahvi A., Sudarsan N., Barrick J.E., Breaker R.R. //Nat. Struct. Biol. 2003. - V. 10. - P. 701-707.

116. Winkler et al. Control of gene expression by a natural metabolite-responsive ribozyme / Winkler W.C., Nahvi A., Roth A., Collins J.A., Breaker R.R. // Nature. -2004.-V. 428.-P. 281-286.

117. Winkler et al. Regulation of bacterial gene expression by riboswitches / Winkler W.C., Breaker R.R. // Annu. Rev. Microbiol. 2005. - V. 59. - P. 487-517.

118. Woodson. Metal ions and RNA folding: a highly charged topic with a dynamic future / Woodson S.A. // Curr. Opi. Chem. Biol. 2005. - V. 9. - P. 104-109.

119. Wu et al. (1992) Role of the MetR regulatory system in vitamin B12-mediated repression of the Salmonella typhimurium metE gene / Wu W.F., Urbanowski M.L., Stauffer G.V. // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 4833-4837.

120. Yamauchi et al. Roles of Mg in TPP-dependent riboswitch / Yamauchi T., Miyoshi D., Kubodera T., Nishimura A., Nakai S., Sugimoto N. // FEBS Lett. 2005. -V. 579.-P. 2583-2588.

121. Yarnell et al. Mechanism of intrinsic transcription termination and antitermination / Yarnell W.S., Roberts J.W. // Science. 1999. - V. 284. - P. 611615.

122. Yen et al. Exogenous control of mammalian gene expression through modulation of RNA self-cleavage / Yen L., Svendsen J., Lee J.S., Gray J.T., Magnier M, Baba T., D'Amato R.J., Mulligan R.C. // Nature. 2004. - V. 431. - P. 471-476.

123. Yoine et al. Arabidopsis UPF1 helicase for nonsense-mediated mRNA decay is involved in seed size control and essential for growth / Yoine M., Nishii T., Nakamura K. // Plant Cell Physiol. 2006. - V. 47. - P. 572-580.

124. Zilberman et al. Genome-wide analysis of Arabidopsis thaliana DANN methylation uncovers an interdependence between methylation and transcription // Nat. Genet. 2007. - V. 39. - P. 61-69.