Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция активности транскрипционных факторов семейства REL в эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных парой комплементирующих онкогенов EIA+cHA-RAS

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности транскрипционных факторов семейства REL в эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных парой комплементирующих онкогенов EIA+cHA-RAS"

На правах рукописи

РГБ ОД

дариева 1 8 янп 2000

Зульфия Абдурашитовпа

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ СЕМЕЙСТВА ИНГ. В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТАХ КРЫСЫ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ПАРОЙ КОМПЛЕМЕНТИРУЮЩИХ ОНКОГЕНОВ Е1 А+сНА-ЙАЗ

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1999

Гибста выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Т.8. Поспелова Институт цитологии РАН Сан кт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

с.н.с. А.П. Перевозчиков НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук Т.В. Кислякова Институт цитологии РАН Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Государственный

университет, биолого-почвенный факультет

Защита состоится "14" января 2000 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан "14" декабря 1999 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук ___- Л.Н. Писарева

РЧЧ?Г,Ч г>

С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Стремительный прогресс в изучении молекулярных механизмов канцеро-1 енеза в последние десятилетия связан с открытием большой группы генов, которые были объединены под общим названием протоонкогенов. Было показано, что в нормальных клетках они участвуют в регуляции клеточной пролиферации на всех уровнях передачи митогенпых сигналов: от рецепторов и сигнальных белков внутриклеточных сигнальных каскадов (протеинкиназы sre, raf, mos, erb-B) до ядерных транскрипционных факторов (reí, fos, jun). Мутации в иротонкогенах превращают их в онкогены, что, как правило, нарушает строгую регуляцию передата митогенпых сигналов. Именно это свойство лежит в основе автономной пролиферации опухолевых клеток.

Открытие метода переноса генов в клетки эукариот позволило получить ряд новых данных о молекулярных механизмах канцерогенеза и идентифицировать клеточные мишени, поражение которых необходимо для трансформации клеток. В частности было показано, что введение ядерного онкогена Е1А аденовируса 5 типа нарушает строгий контроль за прохождением клеток по циклу путем инактивации продуктов генов опухолевых супрессоров (Weinberg, 1991) и изменения активности ряда транскрипционных факторов (АР-1, ATF-2), регулирующих продвижение клетки по клеточному циклу (Hagmeyer, 1993). Для полной клеточной трансформации необходимо введение комплементирующего онкогена, например Ras (Ruley, 1983). Один из наиболее часто мутирующих в человеческих опухолях генов - протоонкоген cHa-ras активирует МАР-киназные каскады, имитируя действие ростовых факторов (Campbell, 1998). Единичные аминокислотные замены в 12, 13 и 61 положениях приводят к появлению постоянно активированных онкогенных форм Ras белков. Экспрессия такой формы Ras ведет к конститутивной активации митогенных каскадов независимо от экзогенных ростовых факторов, что, по-видимому, лежит в основе неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток. Конечной целью сигнальных путей являются транскрипционные факторы, участвующие в регуляции клеточной пролиферации, например, с-Jun, Elk-I, р53, ATF-2 и др. (Garrington and Johnson, 1999).

Недавно появились данные, демонстрирующие участие протоонкогенов семейства Reí, кодирующих транскрипционный фактор NF-кВ, в регуляции клеточной пролиферации, апоптоза, а также их роль в неопластической трансформации клеток in vitro и in vivo (Sonenshein, 1997; Gilmore et al, 1996).

Например, транслокация и амплификация генов, кодирующих Rel/NF-кВ и их ингибиторов, наблюдается в 20-25% случаев лимфоидных опухолей человека. Также было показано, что активация NF-кВ является необходимым условием клеточной трансформации мышиных эмбриональных фибробластов NIH3T3 онкогеном сНа-Ras (Baltimore, 1997). В связи с этим, детальное исследование закономерностей регуляции транскрипционных факторов семейства Reí в нормальных и трансформированных клетках представляется весьма актуальным для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе клеточной трансформации и 1и~ьцерогенеза.

Цели и задачи исследования.

Основной целью данной работы было исследование регуляции активности транскрипционных факторов семейства Rel/NF-кВ в эмбриональных фибробластах крысы (REF), трансформированных парой комплементирующих онкогенов F.lA+cHa-ras.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ ДНК-связывающей и транс-акгивирующей активности NF-кВ, а также состава комплексов NF-кВ и их внутриклеточной локализации в нормальных фибробластах и трансформантах.

2. Исследовать различные уровни регуляции активности NF-icB/Rel в трансформантах El A+cHa-ras.

3. Исследовать изменения активности основных сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию NF-кВ, происходящих при трансформации нормальных фибробластов онкогенами El A+cHa-ras.

Научная новизна полученных результатов.

Работа содержит ряд новых данных о регуляции активности транскрипционного комплекса NF-кВ в клетках REF, трансформированнных парой комплементирующих онкогенов El A+cHa-ras. Впервые показано, что трансформация нарушает негативную авторегуляцию NF-кВ, что приводит к конститутивно-высокой ДНК-связывающей активности NF-кВ и его постоянной --ериой локализации. Несмотря на это, ростовые факторы сыворотки способны

регулировать транс-активирующий потенциал p65/NF-kb. Впервые проведен сравнительный анализ активности основных МЛР-киназных путей п нормальных и трансформированных онокогенами ElA+cHa-ras фибробластах. Базальный уровень активности МАР-киназных каскадов, тестируемый по трансактивации факторов Elk-1 и Juri, значительно выше в трансформантах ElA+cHa-ras даже в условиях сывороточного голодания.

Теоретическое и практическое значение работы.

Получены новые данные о регуляции активности и внутриклеточной локализации транскрипционного фактора NF-KB/Rel при трансформации клеток RBF, которые углубляют представления о молекулярных механизмах процесса превращения нормальных клеток в опухолевые.

Новые экспериментальные данные, полученные в работе, могут быть основой для дальнейших экспериментов по выяснению причинно-следственных отношений между поведением основных МАР-киназных путей, регуляцией активности NF-кВ и процессом трансформации клетки.

Материалы работы могут быть использованы в курсе лекций по клеточной биологии и канцерогенезу в высших учебных заведениях с биологической и медицинской специализацией.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 4 работы. Материалы диссертации были представлены на IV Международной конференции "Life and Death of the Cell" (1996, Эдинбург), на Всероссийской Конференции "Биология клетки в культуре" (1999, Сглшт-Пстербург), а также на научных семинарах Отдела клеточных культур и лаборатории Молекулярных основ дифференцировки клеток Института цитологии PAIL

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 157 публикации. Диссертация иллюстрирована рисунками.

Материалы н методы исследования Клеточные линии.

В работе использовали эмбриональные фибробласты крысы (REF) второго пассажа и клеточные линии, полученные из них путем трансформации их парой комплементирующих онкогенов ElA+cHa-ras. Свойства их трансформированного фенотипа были охарактеризованы ранее (Поспелова и др., 1990). Клетки культивировали на среде Игла в модификации Дальбско (DMEM) с добавлением 10% феталыюй сыворотки коров (FCS). Голодание клеток проводили культивированием на среде, содержащей 0.5% сыворотки в течение 24-48 ч, стимуляцию - добавлением 10% сыворотки или форболового эфира (РМА) в концентрации 50нг/мл.

Плазмиды н перенос генов.

Плазмида ЗХкВ-Luc была получена путем клонирования трех копий кВ элемента (5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC - 3') перед минимальным промотором плазмиды PG12- Luc (Promega), кодирующей люциферазу. Система тестерных плазмид Gal4-Elk, Gal4-Jun, Gal4-dbd и Gal4-Luc ("PathDetect System", Stralagene) бьша использована для определения активности основных МАР-киназных сигнальных каскадов. Плазмиды, экспрессирующие доминантно-негативные формы Ras (Ras-Asnl7) и Raf (Raf 301) были любезно предоставлены Dr. J. Cooper. Трансфекции проводили с помощью липофектамина (Lipofcctamine, Gibco) согласно протоколу фирмы. Через 24 ч культивирования на среде с 0.5% сыворотки проводили стимуляцию клеток сывороткой или форболовым эфиром (РМА) в концентрации 50 нг/мл в течение 6 ч. Затем клетки лизировали, пробы уравнивали по белку и оценивали в них люциферазную активность, используя в качестве субстрата люциферин (Luciferase Assay kit, Promega). Полученные результаты корректировали в соответствие с эффективностью переноса, которую оценивали по экспрессии репортерной плазмиды CMV-pGal, кодирующей ген бета-галактидазы. Все трансфекции повторяли три или четыре раза, достоверность различий оценивали при помощи критерия Стьюдента.

Ядерные экстракты выделяли по методу Дигнама (Dignam et al.,1983). Клетки трижды промывали охлажденным буфером PBS (2.7 шМ КС1, 1.5 mM КН2РО4, 137 тМ NaCl, 8.1 mM Na2HPO,t, рН 7.1) переносили в эппендорфовскую пробирку и

центрифугировали в микроцентрифуге 10 сек. Осадок клеток ресуспендировали в 400-800 мкл гипотонического буфера (10 mM HEPES, pH 7.9; 10 mM KCl; 0.1 шМ EDTA; 0.1 mM EGT А; 1 тМ ДТТ, 0.5 mM PMSF). Затем суспензию на 20 мин помещали в лед и, добавив 25-40 мкл 10% раствора неионного детергента NP-40, интенсивно встряхивали на мешалке в течение 10 сек. Ядра осаждали центрифугированием 30 сек на микроцентрифуге, ресуспендировали в 50 - ВО мкл гипертонического буфера (20 mM HEPES, pH 7.9; 0.4 М NaCl; 1 mM EGTA; 1 mM ДДТ; 1 шМ PMSF) и 15 мин энергично встряхивали при +4°С на мешалке. Ядерные мембраны и обломки осаждали центрифугированием в течение 10 мин на микроцентрифуге при +4°С. Ядерные экстракты хранили при -70° С.

Анализ ДНК-связывающен активности NF-кВ в ядерных экстрактах.

Ядерные экстракты (5-10мкг) инкубировали в буфере, содержащем 10 шМ HEPES, pH 7.9; 1 mM DDT; 15% глицерина; 1 mM EDTA; 2 - 8 mM MgCl2 и 0.1 мкг/мкл polyA-polyU, в течение 15 мин при +4С°. Затем в реакционную смесь добавляли меченые олнгонуклеотиды (0,5 нг с удельной активностью 3.0 - 6.0 х 104 имп/нг) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего смесь ::акосили на 4% полиакриламидный гель и подвергали электрофорезу в 20 mM трис-боратном буфере (pH 8.0) при 150 - 200 V. Гель переносили на бумагу W3 и высушивали под вакуумом. Результаты фиксировали авторадиографией. Анализ состава комплексов проводили с применением антител против белков р65 и р50 в реакции задержки олигонуклеотидоп в геле.

Антитела. В работе использованы кроличьи антитела против белков семейства Rel/NF-кВ: р65 (1226, 1207), р50 (1157, 1263), р105С (1140), а также против ингибиторного белка 1кВ-а, были любезно предоставлены Dr. N. Rice (США); антитела против белков раннего района Е1А аденовируса типа 5 были получены из гибридомы, полученной Э.Харлоу и любезно предоставленной Dr. А. Van der Eb (Нидерланды).

Электрофорез и иммупоблоттинг. Электрофоретическое разделение белков проводили в 10% полиакриламидном геле в присутствии доденилсульфата натрия в модификации Лэмли (Laemmli. 1970). Концентрацию белка в пробах определяли методом Брэдфорда. Электрофоретический перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм осуществляли полусухим способом в 50 mM

натрий-фосфатном буфере (Na2HPC>4 + NalOPO^, рН 7.2) при напряжении 20 V в течение 1 часа. После переноса мембраны блокировали в течение часа в 5% растворе обезжиренного молока, приготовленном на PBS + 0.1% Tween 20 (PBST). Затем ггккубировали с первыми специфическими антителами (1:1000) в течение 1 часа. После двукратной отмывки в PBST, блот помещали во вторые антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена (Pierce) (1: 5000) на 30 мин. Далее мембрану вновь отмывали и белки, связавшиеся с антителами, выявляли методом хемилюминесценции (ECL, Amersham).

Иммунофлуоресценция. Для анализа внутриклеточного распределения NF-kB посеянные па покровные стекла клетки фиксировали 20 мин в 4% параформальдегиде, приготовленном на буфере PBS (2.7 mM KCI, 2.9 тМ КНгРО,), 137 nM Na2HP04, 1 тМ СаС12, 0.5 тМ MgCl2, рН 7.4). Далее клетки дважды промывали и пермеабилизовали в 0.1% Triton Х-100 в течение 20 мин. Во избежание неспецифичного связывания антител с антигеном препараты блокировали 40 мин в буфере 1% BSA/0.01% Tween 20/PBS, и затем инкубировали в первых антителах (1:250) при 37°С в течение 1 часа. Дважды промыв клетки, наносили вторые антитела, меченные флюорохромом Fluorolink™CyTM3 (Amersham) (1:1000). Далее покровные стела с окрашенными клетками трижды промывали и помещали на предметные стекла в капле глицерина. Для разведения антител и промывок использовали блокирующий буфер 1% BSA/0.01% Tween 20/PBS. В качестве отрицательного контроля использовали препараты, окрашенные только вторыми антителами. Иммунофлюоресценцию наблюдали и проводили фотосъемку на флюоресцентном микроскопе фирмы Цейсс (Zeiss Axioskope).

Иммунопрсшшитация. Клетки отмывали фосфатным буфером PBS, и лизировали в 200 мкл буфера ИРА ( 50 mM Tris-HCl, рН 6.8; 150 тМ NaCl; 1% NP-40; 1 тМ 3GTA; 1 тМ PMSF; 10 тМ NaF; 1 тМ Na3V04 ). Концентрацию белка в пробах определяли по методу Брэдфорда. После предварительной очистки преиммунной сызороткой, в лизаты добавляли первые антитела и инкубировали на льду в течение 2 часов. Для адсорбции комплекса антиген-антитело в пробы добавляли сефарозу с ковалентно пришитым белком A (Protein A Sepharose, "Pharmacia") и инкубировали еще 1 час. Все инкубации проводили при плавном перемешивании на качалке. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 1000g, полученный осадок трижды промывали

буфером RIPA, ресуспендировали в двухкратном буфере Лэмли для электрофорезных проб и кипятили 5 мин (Laemmli, 1970).

Регуляция активности прогеинкиназы С в исследуемых линиях оценивалась по степени фосфорилирования клеточного белка с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе 80К (Rozengurt et al., 1983). Клеточные культуры после 48 ч сывороточного голодания инкубировали в среде DMEM, содержащей 20 МБ/мл 32Р-ортофосфорной кислоты, при 37°С в течение 3,5 ч. Стимуляцию сывороткой и РМЛ проводили в той же среде. По окончании инкубации реакцию останавливали, помещая клетки на лед и отмывая от свободного радиоактивного фосфата ледяным М-2-гидроксиэтилпиперазин-К-2-эгансульфонат буфером HEPES (20 гпМ, pH 7.5) Клеточные лизаты готовили стандартным методом и фосфобелки разделяли электрофорезом в 4.0-22.5%-ном градиентном PAAG-SDS (Lemmli, 1970). После электрофореза гели окрашивали 0.01%-ным раствором Кумасси R-250 (Sigma), высушивали и получали радиоавтографы.

Способность сывороточных факторов роста стимулировать пролиферацию

исследуемых клеточных линии определяли методом проточной цитофлуоримстрии и по включению 3Н-тимидина как было описано ранее ( Благосклонный и др. 1991).

Основные результаты и обсуждение.

Транскрипционный комплекс Rel/NF-кВ может быть представлен гомо- или -етеродимерами белков р50, р52, р65 (RelA), RelB, и c-Rel, имеющих в N-терминальном конце консервативный домен Reí (300 ам.к.), необходимый для димеризации, ДНК-связывания, и ядерной локализации этих белков. Способность различных димеров узнавать слабо различающиеся NF-кВ-сайты в составе разных промоторов может в принципе обеспечивать дифференциальную регуляцию экспрессии генов-мишеней. Три субъединицы транскрипционного комплекса NF-кВ - c-Rel, RelB и р65 (RelA) содержат трансактивирующие домены в С-терминальном конце, активность которых зависит от степени их фосфорилирования. В качестве трансактивирующего фактора NF-кВ наиболее распространен гетеродимер р50/р65, тогда как гомодимер р50/р50 способен лишь поддерживать транскрипцию на базальном уровне, а в некоторых случаях репрессировать ее. В

большинстве типов клеток, КР-кВ комплекс неактивен и секвестрирован в цитоплазме ингибиторными белками семейства 1кВ, маскирующими сигнал ядерной локализации Ке1-белков. Широкий спектр стимулов, включая сыворотку и форболовый эфир, приводит к фосфорилированию 1кВ-а по остаткам серина в 32 и 36 положениях, его убиквитинизации с последующей протеосомной деградацией (ВаеиеНе, 1994). В результате, освобожденный №-кВ транслоцируется в ядро и активирует гены-мишени. Таким образом, активность транскрипционного комплекса Х'Г-кВ зависит от ядерной локализации, состава димеров и степени фосфорилирования траисактивирующих субъедипиц.

Сравнительный анализ содержания белков ИР-кВ в клеточных экстрактах экспоненциально растущих нормальных и трансформированных фибробластов показал, что содержание трансактивирующей субъединицы р65 в тотальных лизатах и ядерных экстрактах трансформантов значительно выше, чем в исходных клетках Я ЕР (рис.1,1, а и б). По содержанию ЫР-кВ/р50 и его предшественника р 105

Рис.11 Иммуноблот тотальных лизатов экспоненциально растущих нормальных и трансформированных клеток с анти-рб5 /Яе1А и р 105/р50 антителами (а). Иммуноблот ядерных экстрактов тех же клеток, голодавших в течение 48 ч (0.5%) и стимулированных сывороткой (+Б) или форболовым эфиром (+РМА) в течение 30 мин. II Иммунофлуоресцентный анализ внутриклеточной локализации трансактивирующей субъединицы р65Жс!А транскрипционного комплекса №-кВ а) в нормальных фибробластах КЕЬ и б) трансформантах Е1А ( сНа-Каз в экспоненциально пролиферирующих клетках(ДМЕМ+10% сыворотки), через 48 ч голодания (ДМЕМ+0,5% сыворотки) и через 30 мин после стимуляции голодающих клеток сывороткой (+Б) об.ЮОх, ок. 10х

нормальные и трансформированные клетки существенно не различаются (рис.1,1, а). В ядерных экстрактах трансформированных клеток, в отличие от нормальных, р65Же1А обнаруживается в ядре независимо от удаления сыворотки или стимуляции голодающих клеток сывороткой или форболовым эфиром. Постоянная ядерная локализация р65/Яе1А в трансформантах была подтверждена данными им.мунофлюоресцентного анализа (рис 1, II, а и б).

ДНК-сиязывающую активность №-кВ и состав димеров исследовали методом гель-ретардации - задержки в геле электрофоретической подвижности Рн-меченого кВ-элемента З'-АОТТОАССООАСТПСССАООС-У. В нормальных фибробластах отсутствие ростовых факторов уже через 24 ч приводит к резкому ослаблению ДНК-связывающей активности №г-кВ, тогда как в трансформантах она остается неизменно высокой (рис.2,1 а, б). При этом анализ состава комплексов

10%

0.5%

— р65 р50 — р65р50

0.5%

■ р50рб5

- -1 "Йт*

Г--.' Ь

; . ; ; ■ * ' -

- !■ • | а г шт

-

ИЕР

Е1А+сНА-гая

II

350 300 250 200 ¡50 100 50 0

и 0.5% и +5 П+РМА

.¿Ил

Ш<Р

ли

г

уМ

Е1А+сНа-газ

I

Рис.2 Регуляция активности в нормальных и трансформированных фибробластах

сывороткой (+Б) и форболовым эфиром (1-РМА). 1а) Клетки культивировали в бессывороточной среде (0.5%) в течение 48ч, затем стимулировали 30 мин 10% сыворотки или 50иг/мл РМА и анализировали ДНК-связывающуто активность КИ-кВ в ядерных экстрактах, б) Специфичность ИР-кВ-связывания при конкуренции со 100-кратным избытком немеченного олигонуклеотида кВ в ядерных экстрактах трансформированных клеток в) состав ЛТ-кВ-комплексов в нормальных и трансформированных фибробластах определяли с помощью антител к р65 и р50 субъединицам №-кВ П. ОТ-кВ-зависимую экспрессию гена люциферазы оценивали в лизатах голодающих и стимулированных клеток, временно трансфецированных репортерной плазмидой ЗХкВ-Ьис. За единицу принят базальный уровень люциферазной активности в клетках ЯЕР в условиях сывороточного голодания.

NF-кВ в в голодающих клетках с помощью соответствующих антител показал, что нормальных фибробластах основным компонентом является NF-kb/p50, а в трансформантах - трансактивирующая субъединица p65/RelA (рис.2, I, в). Стимуляция голодающих клеток сывороткой или форболовым эфиром в течение 30 мин заметно повышает NF-кВ-связывающую активность в нормальных клетках, а в трансформированных - почти не вызывает изменений. Таким образом, мы заключили, что трансформация онкогенами ElAfcIIa-ras приводит к конститутивной ядерной локализации транскрипционного комплекса NF-кВ р65/р50, а также к его нерегулируемой высокой ДНК-связывающей активности. Активность транскрипционного фактора NF-кВ также зависит от степени фосфорилирования тралсактииирующих субъединиц, в нашем случае - р65. Для анализа транс-"с-нвирующего потенциала этого фактора, т.е. способности регулировать экспрессию NF-кВ-зависимых генов, нами была сконструирована индикаторная плазмида ЗХкВ-Luc, где экспрессия гена люциферазы находится под контролем трех NF-кВ-элементов, которые были использованы в экспериментах по оценке ДНК-связывающей активности. Эксперименты по временной трансфекции репортерной плазмиды показали, что ее базальная активность -активность ЗХкВ-Luc через 24ч сывороточного голодания - значительно выше в клетках, трансформированных онкогенами ElA+cHa-ras , чем в нормальных REF. Так, базальный уровень активности ЗХкВ- Luc плазмиды в трансформантах превосходил таковой в нормальных фибробластах в 100 раз. Стимуляция сывороткой и форболовым эфиром вызывала активацию люциферазного репортера в обеих клеточных линиях, однако в нормальных фибробластах эта индукция была гораздо более выражена ( в25 раз для REF, по сравнению с 2-2.5 раза для клеток ElA+cHa-ras (рис. 2, II ). Важно отметить, что основной негативный регулятор NF-кВ - 1кВ-а, секвестрирующий его в цитоплазме, одинаково быстро деградирует после стимуляции клеток сывороткой как в нормальных, так и трансформированных клетках (рис.3, а), а его количество в тотальных лизатах исследуемых линий примерно одинаково. Данные иммунофлюоресцентного анализа подтвердили сходное поведение ингибиторного белка в обеих линиях: 1кВ-а постоянно находится в цитоплазме и заметно деградирует после стимуляции сывороткой. Одной из особенностей регуляции активности NF-кВ является прямая активация транскрипции гена 1кВ-а самим транскрипционным фактором NF-кВ. Повышенная экспрессия ингибиторного белка приводит к секвестрированию NF-кВ в цитоплазме,

и, более того, к экспорту субъединицы р65 из ядра. По всей видимости, в трансформантах этот механизм негативной авторегуляции активности NF-kB гхруцген - высокая конститутивная активность NF-kB не приводит к повышенному содержанию 1кВ-а в клетках ElA+cHa-ras и ускоренному экспорту р65 из ядра в цитоплазму. Временная трансфекция в клетки доминантно-негативной формы 1кВ-а (с мутациями по позициям фосфорилирования Ser32,36/Ala32,36), неспособной разрушаться через убиквитин-протеасомную систему, блокировала ДНК-связывающую активность NF-kB и его трансактивирующую способность (рис.3, б и в). Эти результаты предполагают несколько возможных путей нарушения негативного контроля активности NF-kB в трапсформантах: либо это происходит на уровне регуляции транскрипции гена кВ-а, либо - вследствие укороченного периода жизни ингибиторных молекул 1кВ-а, как это происходит в В-клетках, для которых характерна высокая конститутивная активность NF-kB: постоянно транслирующийся ингибиторный белок немедленно фосфорилируется и подвергается деградации (Miyamoto et al., 1994).

350

зоо;

250 200, 150'

1

looj

50'

ЕЭ sw И S

□ PMA

REF 0,5% +S

ElA+cHa-ras 0,5% +S

п

HfL.

I- -r l'.-Ш

Eras

1кВ-а б

NF-KB~

'■'•^mii^iTi

Eras Eras/lKBdn

0.5% +S 0.5% +S

Ега.чЛкВс1п

Рис.3 а) Содержание ингибиторного белка 1кВа в тотальных клеточных лизатах нормальных и трансформированных фибробластов при сывороточном голодании в течении 48ч и сывороточной стимуляции в течении 30 мин. б) блокирование ДНК-связывающей активности NF-kB и в) кВ-зависимой экспрессии репортерпой плазмиды ЗХкВ ингибитором 1кВа. Клетки ElA+cHa-ras (Eras) временно ко-трансфецировали репортером ЗХкВ-Luc и плазмидой, экспрессирующей доминантно-негативную форму 1кВа S32A/S36A, культивировали в условиях сывороточного голодания (0.5% 24 ч) и стимулировали 30 мин 10% сыворотки (б), или 10% сы-зсротки и 50 нг/млРМА в течение 6 ч (в).В экспериментах использовали ядерные экстракты для определения NF-кВ-евязывающей активности или тотальные лизаты для оценки люциферазной активности.

Высокая активность NF-кВ в фибробластах, трансформированных парой онкогенов ElA+cHa-ras, возможно, объясняется совместным действием этих онкогенов. Ядерный онкоген El А способен инактивировать тумор-супрессорные белки (например, pRb) и активировать ряд транскрипционных факторов, способствующих продвижению клетки по клеточному циклу путем прямого взаимодействия с белками-мишенями. Мы предположили, что одной из таких клеточных мишеней может быть сам NF-кВ. Результаты иммунопреципитаций, проведенных на тотальных лизатах нормальных и трансформированных клеток показали, что белки El А действительно взаимодействуют с трансактивирующей субъсдиницей NF-кВ комплекса p65/RelA (рис.4, А). Так как онкобелки Е1А имеют ядерную локализацию, возможно, один из способов активации р65 может быть связан с фосфорилированием его транс-активирующих доменов ElA-ассоциирован-ными киназами.

Так как в трансформантах экспрессируется онкогенная форма Ras, способного активировать многие МАР-киназные каскады, приводящие к фосфорилированию ингибитора 1кВ-а и р65, была исследована его роль в активации комплекса NF-кВ. Временная котрансфекция ЗХкВ-Luc-penopTepa и плазмиды, окспрессирующей доминантно-негативную форму Ras, приводит к резкому падению ~":-с-активирующей и ДНК-связывающей активности NF-кВ в трапсформантах (рис.4, б и в). Основной мишенью онкогена Ras является сигнальный каскад Raf/MEK/ERK. Для определения роли Raf в активации NF-кВ, трансформанты временно трансфецировалн плазмидой, экспрессирующей доминантно-негативный мутантный Raf, блокирующий его сигнальный путь (рис.4, б и в). Результаты этих экспериментов позволили сделать вывод о том, что активность транскрипционного комплекса NF-кВ в трансформантах ElA+cHa-ras является Ras/Raf-зависимой. В работе Noris and Baldwin (1999) было показано, что активация NF-кВ в Ras-трансформированных клетках NIH3T3 может быть Raf-независимой. Эти расхождения, возможно, объясняются экспрессией онкобелков Е1А в исследуемых нами трансформантах.

Известно, что цитозольный комплекс NF-кВДкВ является мишенью для различных сигнальных каскадов, в том числе - MAP киназпых путей ERK, JNK и р38. Для определения их активности и роли в активации NF-кВ использовали систему плазмид, экспрессирующих слитые белки Gal4-Elk и Gal4-Jun, где ДНК-связывающий домен дрожжевого транскрипционного фактора Gal4 слит с

REP Eras

RËF Eras

300

200

100

0.5%10%0.5%10%

0.5%10%0.5% 10%

El sw □ PMA

В

NF-кВ—

Eras Eras/Rasdn Eras/Rafdn

0.5% +S + PMA 0.5% -+S +PMA 0.5% +S +PMA

í*1--i í:1 ¡'>,'Ф » ч»1 -

m

Eras

Eras/Rasdn

Eras/Rafdn

?ис. 4. А) Физическое взаимодействие онкобелков Е1А с трансакшвирующей субъединицей комплекса NF-кВ в трансформа]гтах El A+cHa-ras (Eras). Клеточные лизаты иммунопрецили-тировали анти-р65 антителами, р65-ассоииированные белки разделяли электрофорезом и выявляли антителами к Е1А (тц - тяжелые цепи иммуноглобулинов). Блокирование Ras/Raf сигнального пути имгибирует ДНК-связывающую активность NF-kB и кВ-завиеимую экспрессию люциферазы в трансформантах. Клетки временно котрансфеци-ровали плазмидами, экспрессирующими репортер ЗХкВ-Luc и доминантно-негативные формы Ras и Raf, культивировали в среде с 0.5% сыворотки в течение 24ч и стимулировали 10% сывороткой или РМА (50 нг/мл). Б) Люциферазную активность в клеточных лизатах определяли через 6 ч после стимуляции (за единицу принята базальная активность кВ-зависимой экспрессии в голодающих нормальных фи5робластах). В) В ядерных экстрактах, полученных через 30 мин после стимуляции, определяли уровеньДНК-связывающей активности Р32-мечен-ного кВ-элемешга в ядерных экстрактах трансформантов после введения доминантно-негативных мутантов Ras и Raf.

трансактивирующими доменами клеточных транскрипционных факторов Elk или Jun. В фосфорилировании и активации фактора Elk участвует преимущественно каскад Raf/MEK/ERK, однако по последним данным JNK- и р38-киназные каскады также могут использовать Elk в качестве субстрата (Yang, 1998).

Транскрипционный фактор c-Jun является мишенью JNK- и р38-МАР киназных путей передачи сигнала. Во временных котрансфекциях использовали оепортерную плазмиду Gal4-Luc, где экспрессия люциферазы находится под

контролем промотора, содержащего 4 йа14 ДНК-связывающих сайта. Результаты этих трансфекций показали, что базальная активность этих транскрипционных факторов после 24 ч сывороточного голодания, а следовательно и соответствующих МАР-киназных путей, в трансформантах в десятки раз выше, чем в нормальных фибробластах (рис. 5). Однако, относительный уровень стимуляции киназ сывороточными ростовыми факторами и форболовым эфиром был гораздо выше в нормальных клетках. Таким образом, трансформация онкогенами Е1А+сНа-газ приводит к высокой конститутивной активности МАР-киназных путей и их относительно слабой регуляции.

REF Е1 A+cHa-ras

120

100

80 60

40

20 0

Sw

S

РМА

J ЦП

0,5% S РМА

REF

Eras

р80

REF El A+cHa-ras

Рис.5 Регуляция сигнальных МАР-киназных каскадов ростовыми факторами сыворотки в нормальных и трансформированных фибробластах. Клетки были котрансфецированы плазмидами, экспрессирующими слитые белки a) Gal4-Elk, б) Gal4-Jun (0,2 мкг) и репортером Gal4-Luc (1 мкг), хульт^вировали в среде с 0.5% сыворотки в течение 48 ч и стимулировали 10% сывороткой в течение 6 ч. Оценку люциферазной активности проводили, как описано в Методах. в)Влияние сыворотки и форболового эфира на активность РКС в клетках REF и El A+clla-ras (Eras) оценивали по степени фосфорилирования субстратного белка 80 кД, коррелирующей с активностью протеинкиназы С (Rozengurt et al., 1983)

Эти данные согласуются с подученными ранее результатами экспериментов по регуляции активности протеинкиназы С (РКС) в нормальных и трансформированных фибробластах. РКС участвует в процессах внутриклеточной передачи сигнала и является мишенью для различных биологически активных веществ, в том числе форболовых эфиров. Трансформация клеток газ-онкогеном приводит к повышению уровня диацилглицерола и активации РКС (Ьаса! е1 а1.,

1987). Нами было показано, что в трансформантах ElA+cHa-ras этот сигнальный путь сохраняет способность к регуляции ростовыми факторами сыворотки и РМА в такой же степени, как и в нормальных клетках, хотя базальный уровень фосфорилирования белка 80 кД, являющегося субстратом для протеинкиназы С, в голодающих трансформированных клетках заметно выше (рис.5, в).

Участие р38-МАР-киназиого пути в активации NF-кВ определяли с помощью специфичного ингибитора р38-киназы SB203580, которым обрабатывали клетки ElA+cIIa-ras, временно трансфецированным репортерной плазмидой ЗХкВ-Luc (рис.6). Оказалось, что блокирование р38-МАР-киназного пути не влияло на ДНК-связывающую активность NP-кВ, однако существенно снижало его трансактивирующую способность. Вероятно, этот сигнальный каскад участвует в фосфорилировании трансактивирующих доменов p65/ReI, но не в активации 1кВ-киназ ( 1КК-а и 1КК-р).

pi

J

ill

Eras

И 0.5% п S

□ РМА

ш

Eras/SB

NF-кВ

0.5% +S +РМА 0.5% +S +PMA конкур

О-» "У—» «••■»«Мч

j^j Р j- ;> м ■ >,■■- - ; < ï ' S < - «»

-îsss i'Sîwi bfcm КЙЕ*§

Рис.6 Действие специфичного ингибитора киназы р38 SB203580 на транс-активирующую и ДНК-связывающую активность NF-кВ в трансформированных онкогенами El A+Ha-ras крысиных фибробластах. Клетки временно трапсфецировали репортером ЗХкВ-Luc, культивирновали в бессывороточной среде (0.5%), обрабатывали ингибитором SB203580 (10 мкМ ) или его растворителем диметилсульфоксид DMSO (контроль) за 1 ч до стимуляции сывороткой или РМА. Стимуляции проводили в течение 30 мин в экспериментах по ДНК-связывающсй активности NF-кВ; в течении 6ч- для оценки кВ-зависимой экспрессии репортерной нлазмиды ЗХкВ-Luc, где за единицу принята люциферазная активность трансформаптов в условиях сывороточного голодания. На рис.б представлены данные одного из 3 аналогичных экспериментов.

Постоянная активность сигнальных каскадов, сопряженная с конститутивной активностью транскрипционных факторов, регулирующих активность генов-регуляторов клеточного цикла, приводит к нарушению регуляции клеточной пролиферации в трансформированных клетках. Способность сывороточных факторов роста стимулировать пролиферацию трансформантов Е1А+сНа-газ определяли методом проточной цитофлуориметрии и по включению 3Н-тимидина. Для тестирования использования различные плотности посева клеток. После пребывания культур на среде, содержащей 0.5% сыворотки, конечная клеточная плотность особегаю выраженно возрастала в культуре с наибольшей исходной тотностью, что говорит об автостимуляции трансформантов. В нормальных фибробластах в условиях сывороточного голодания включение 3Н-тимидина прекращалось, независимо от плотности посева. На стимуляцию сывороткой обе сравниваемые линии отвечали существенным приростом включения метки. Однако данные проточной цитофлюорометрии показали отсутствие изменений в распределении трансформированных клеток по фазам клеточного цикла. Это позволяет считать, что при сывороточном голодании эти клетки не останавливаются з какой-либо точке клеточного цикла, а стимуляция сывороткой лишь ускоряет продвижение по всем фазам клеточного цикла (рис.7).

10% 0.5%

о 8

Рис. 7. Распределение нормальных (REF) и трансформированных онкогенами El A+cHa-ras (Eras) крысиных фибробласто по фазам клеточного цикла. Методом проточной цитофлюорометрии анализировали экспоненциально растущие (10%) или голодающие в течение 48 ч (0.5%) клетки. Процент клеток, находящихся в фазе синтеза (tSp) указаны на графиках.

ВЫВОДЫ

Трансформация первичных клеток эмбриональных фибробластов крысы комплемен-

тирующими онкогенами ElA+cIIa-ras вызывает значительные изменения в

регуляции транскрипционного комплекса NF-kB:

1. Транс-активирующая субъединица транскрипционного фактора NF-кВ p65/RelA постоянно локализована в ядре трансформированных клеток, в отличие от нормальных клеток REF, где внутриклеточная локализация регулируется ростовыми факторами сыворотки.

2. Ядерная локализация p65/RelA является следствием нарушения системы негативного контроля активности NF-кВ ингибиторными белками 1кВ-а.

3. ДНК-связывшощая активность NF-кВ в трансформантах конститутивно высока и :-:е регулируется ростовыми факторами и форболовым эфиром. Тем не менее, комплекс NF-кВ сохраняет способность к регуляции трапс-активирующей активности при стимуляции сывороткой.

4. Установлено, что ядерные онкобелки El А находятся п физической ассоциации с

субъединицей NF-кВ- комплекса p65/RelA, что, возможно, определяет его постоянную ядерную локализацию и высокий трансактивиругощий потенциал.

5. Базальная активность МАР-киназных каскадов в трансформантах ElA+cHa-ras значительно выше, чем в нормальных фибробластах. Однако, относительный уровень активации сигнальных путей сывороткой ниже в трансформированных клетках по сравнению с нормальными фибробластами

6. Введение в клегки ElA+cHa-ras векторов, экспрессирующих доминантно-негативные мутанты Ras и Raf, показало, что высокая ДНК-связывающая и транс-активирующая активность NF-кВ в трансформантах регулируется через Ras/Raf- зависимый сигнальный путь. В регуляции трансактивирующей способности p65/RelA субъедшшцы NF-кВ также участвует другой МАР-киназный каскад - р38 киназы.

Публикации по теме диссертации.

1. Благосклонный М.В., Дариева З.А, Поспелова Т.В. Особенности регуляции ;сд£Т0чн0й пролиферации эмбриональных фибробластов крысы, трансформированных ElA+cHa-ras. 1991. Вопросы онкологии, т.37 (3): 303-310

2. Схоль-Энгбертс А.Д., Соколова Е.Н., Дариева З.А., Попов Ю.Г., Поспелова Т.В., Гуревич B.C. Регуляция активности протеинкиназы С в нормальных , иммортализованных и трансформированных фибробластах крысы. 1992. Цитология, т.34 (5): 110-118

3. Дариева З.А., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Транскрипционный фактор NF-KB/RelA конститутивно активирован и локализован в ядре клеток трансформантов ElA+cHa-ras. 1999. Цитология, т. 41 (7): 622 - 627

4. Darieva D.Z., Pospelova T.V. Physical association between p65 subunit of NF-kB transcription factor and El A oncogene proteins. 1996, July. Transactions Biochem.

список литературы

1. Поспелова Т.В., Кислякова Т.В., Медведев А.В., Светликова С.Б., Поспелов В.А. Особенности трансформированного фенотипа и экспрессия индикаторных САТ-плазмид в эмбриональных фибробластах крысы, иммортализованных ElAad5-онкогеном и трансформированных ElA+cHa-ras-онкогенами. 1990. Цитология.

32 (1): 148-155

2. Baeuerle Р.А., Henkel Т. Function and activation of NF-кВ in the immune system. 1994. Annu. Rev. Immunol. 12: 141-179

3. Campbell S.I,., Khosravi-Far R., Rossman K., Clark G.J., Der C.J. Increasing complexity of Ras signalling (review). 1998. Oncogene. 17:1395-1413

4. Dignam J.D., Lebowitz R.M., Roeder R.G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.1983. Nucleic Acids Res. 11:1475-1489

5. Finco T.S., Westwick J., Norris J.L., Beg A., Der C.J., Baldwin A.S. Oncogenic Ha-Ras-induced signalling activates NF-кВ transcriptional activity, which is required for cellular transformation. 1997. J.Biol. Chem. 272:24113-24116

6. Garrington T.P., Johnson G.L. Organization and regulation of mitogen-activated protein kinase signaling pathways. 1999. Curr. Opin. Cell Biol. 11: 211-218

7. Gilmore T.D., ICoedood M., Piffat K.A., White D.W. RcI/NF-kB/IkB proteins r.r.d cancer. 1996. Oncogene. 13: 1367-1378

8. Hagmeyer B.M., Konig H., Herr I., Offringa R., Zantema A., Van der Eb A.J., Angel P. Adenovirus E1A negatively and positively modulates transcription of AP-1 dependent genes by dimer-specific regulation of the DNA binding and transactivation activities of Jun. 1993.EMBO.T. 12:3559-3572

9. Lacal J.C., Moscat J., Aaronson S.A. Novel source of 1,2-diacylglycerol elevated in cells transformed by Ha-ras oncogene. 1997. Nature. 330:269-272

10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophageT4. 1970. Nature . 227: 680-685

11. Miyamoto S., Chiao P.J., Verma I.M. Enchanced IkBa degradation is ""sponsible for the constitutive NF-kB activity in murine B-cell lines. 1994. Mol. Cell. Biol. 14:3276-3282

12. Norris J.L. and A.S. Baldwin. Oncogenic Ras enhances NF-kB transcriptional activity through Raf-dependent and Raf-independent mitogen-activated protein kinase signaling pathways. 1999. J. Biol. Chem. 274: 13841-13846

13. Rozengurt E., Rodriguez-Pena M., Smith K. Phorbol esters, phospholipase C, and growth factors rapidly stimulate the phosphorylation of a Mr 80.000 protein in intact quiescent 3T3 cells. 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:7244-7344

14. Ruley H.E. Adenovirus early region 1A enables viral and cellular transforming genes to transform primary cells in culture. 1983. Nature. 304:602-606

15. Sonenshein G.E. Rel/NF-KB transcription factors and the control of apoptosis. 1997. Seminars in Cancer Biol. 8: 113-119

16. Weinberg R.A. Tumor suppressor genes. 1991. Science. 254: 1138-1146

17. Yang S.-H., Whitmarsh A., Davis R.J., Sharrocks A.D. Differential targeting of MAP kinases to the ETS-domain transcription factor Elk-1.1998. EMBO J. 17: 1740-1749

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дариева, Зульфия Абдурашитовна

Глава 1. Введение.

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Цель и задачи исследования.

1.3 Научная новизна полученных результатов.

1.4 Теоретическое и практическое значение работы.

1.5 Апробация работы.

Глава 2. Обзор литературы.

2.1. Общая характеристика фенотипа трансформированных клеток.

2.2 Онкобелки раннего района аденовирусов человека.

2.3 Молекулярные механизмы иммортализующего и трансформирующего действия онкопродуктов раннего района в клетках грызунов. 1Ó

2.4 Особенности комплементации El А с онкогенами cHa-ras и Е1В.

2.5 Функции Ras белка в проведении сигнала и трансформации клеток.—

2.6 Пути передачи сигнала с клеточной поверхности в ядро.

2.7 Свободные радикалы и их роль в передаче сигнала.

2.8 Регуляция активности протеин киназных каскадов дефосфорилированием.

2.9 Организация транскрипционного комплекса NF-кВ и его внутриклеточная локализация.

2.10 Регуляция активности транскрипционного комплекса NF-KB.

2.11 Сигнальные каскады, вовлеченные в активацию NF-КВ.

Глава 3. Материал и методы.

3.1 Клеточные линии.

3.2 Плазмиды и перенос генов.

3.3 Ядерные экстракты.

3.4 Анализ ДНК-связывающей активности ЫБ-кВ в ядерных экстрактах.

3.5 Антитела.

3.6 Электрофорез и иммуноблоттинг.

3.7 Иммунофлуоресценция.

3.8 Иммунопреципитация.

3.9 Регуляция активности протеинкиназы.

3.10 Способность факторов роста сыворотки стимулировать пролиферацию.

Глава 4. Результаты.

4.1 Ядерная аккумуляция КР-кВЛЫА в Е1 А+сНа-гаБ трансформантах.

4.2 ДНК-связывающая и трансактивирующая активность №"-кВ в нормальных и Е1 А+сНа-гаэ трансформированных клетках.

4.3 Е1А белки физически взаимодействуют с трансактивирующей субъединицей р65/Яе1А транскрипционного комплекса КБ-кВ.

4.4 УчастиеКаБ-индуцированных сигнальных каскадов в регуляции активности ИР-кВ.I.

4.5 Особенности регуляции сигнальных каскадов в клетках Е1А+сНа-газ.

4.6 Особенности регуляции клеточной пролиферации нормальных фибробластов и трансформантов Е1 А+сНа-гаБ.

Глава 5. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция активности транскрипционных факторов семейства REL в эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных парой комплементирующих онкогенов EIA+cHA-RAS"

1.1 Актуальность проблемы.

Стремительный прогресс в изучении молекулярных механизмов канцерогенеза в последние десятилетия связан с открытием большой группы генов, которые были объединены под общим названием протоонкогенов. Было показано, что в нормальных клетках они участвуют в регуляции клеточной пролиферации на всех уровнях передачи митогенных сигналов: от рецепторов и сигнальных белков сигнальных каскадов (протеинкиназы sarc, raf, mos, erb-B) до ядерных транскрипционных факторов (reí, fos, jun). Мутации в протонкогенах превращают их в онкогены, что, как правило, нарушает строгую регуляцию передачи митогенных сигналов. Именно это свойство лежит в основе автономной пролиферации опухолевых клеток.

Открытие метода переноса генов в клетки эукариот позволило получить ряд новых данных о молекулярных механизмах канцерогенеза и идентифицировать клеточные мишени, поражение которых необходимо для трансформации клеток. В частности, было показано, что введение ядерного онкогена El А аденовируса 5 типа нарушает строгий контроль за прохождением клеток по циклу путем инактивации продуктов генов - опухолевых супрессоров (Weinberg, 1991) и изменения активности ряда транскрипционных факторов (АР-1, NF-kB, ATF-2, ), регулирующих продвижение клетки по клеточному циклу (Hagmeyer, 1993). Для полной клеточной трансформации необходимо введение комплементирующего онкогена, например Ras (Ruley, 1983). Один из наиболее часто мутирующих в человеческих опухолях генов - протоонкоген cHa-ras активирует МАР-киназные каскады, имитируя действие ростовых факторов (Campbell, 1998). Единичные аминокислотные замены в 12, 13 и 61 положениях приводят к появлению постоянно активированных форм Ras белков. Экспрессия такой формы Ras ведет к конститутивной активации митогенных каскадов независимо от экзогенных ростовых факторов, что, по-видимому, лежит в основе неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток. Конечной целью сигнальных путей являются транскрипционные факторы, участвующие в регуляции клеточной пролиферации, такие как: c-Jun, Elk-1, р53, ATF-2 и др. (Garrington and Johnson, 1999). Поэтому изучение активности различных МАР-киназных каскадов в связи с поведением транскрипционных факторов может пролить свет на молекулярные механизмы канцерогенеза.

Недавно появились данные, демонстрирующие участие протоонкогенов семейства Reí, кодирующих транскрипционный фактор NF-кВ, в регуляции клеточной пролиферации, апоптоза, а также в неопластической трансформации клеток in vitro и in vivo (Sonenshein, 1997; Gilmore et al, 1996). Например, транслокация и амплификация генов, кодирующих Rel/NF-кВ и их ингибиторов 1кВ, наблюдается в 20-25% случаев лимфоидных опухолей человека. Также было обнаружено, что активация NF-кВ является необходимым условием клеточной трансформации мышиных эмбриональных фибробластов NIH3T3 онкогеном cHa-Ras (Baltimore, 1997). В связи с этим, детальное исследование закономерностей регуляции транскрипционных факторов семейства Reí в нормальных и трансформированных клетках представляется весьма актуальным для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе превращения нормальных клеток в опухолевые.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Дариева, Зульфия Абдурашитовна

ВЫВОДЫ.

1. Трансформация первичных клеток эмбриональных фибробластов крысы комплементирующими онкогенами Е1А+сНа-газ вызывает значительные изменения в регуляции транскрипционного комплекса МмсВ:

2. Трансактивирующая субъединица транскрипционного фактора кВ р65/Яе1А постоянно локализована в ядре трансформированных клеток, в отличие от нормальных клеток КЕБ, где внутриклеточная локализация регулируется ростовыми факторами сыворотки.

3. Ядерная локализация р65/Яе1А является следствием нарушения системы негативного контроля активности М^-кВ ингибиторными белками 1кВ-а.

4. ДНК-связывающая активность ЫР-кВ в трансформантах конститутивно высока и не регулируется ростовыми факторами и форболовым эфиром. Тем не менее, комплекс №"-кВ сохраняет способность к регуляции транс-активирующей активности при стимуляции сывороткой.

5. Установлено, что ядерные онкобелки Е1А находятся в физической ассоциации с субъединицей КБ-кВ- комплекса р65/Яе1А, что, возможно, определяет его постоянную ядерную локализацию и высокий трансактивирующий потенциал.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дариева, Зульфия Абдурашитовна, Санкт-Петербург

1. Благосклонный М.В., Дариева З.А, Поспелова Т.В. Особенности регуляции клеточной пролиферации эмбриональных фибробластов крысы, трансформированных El A+cHa-ras. Вопросы онкологии.1991, т.37 (3): 303-310

2. Дариева З.А., В.А.Поспелов,

3. Т.В.Поспелова. 1999.Транскрипционный фактор NF-kB конститутивно активирован и локализован в ядре клеток-трансформантов El A+cHa-ras. Цитология, т. 41: 622-627.

4. Поспелов В.А., Т.В. Поспелова, А.К. Савельев. 1996. Транскрипционный фактор p91/Statl конститутивно активирован и локализуется в ядре эмбриональных фибробластов крысы, трансформированных онкогенами El A+cHa-ras. Доклады Академии наук, т. 348: 261-264.

5. Поспелова Т.В., А.Н. Кукушкин, A.B. Медведев, А.К. Савельев, В.А. Поспелов. 1996. Активность и состав транскрипционного фактора АР-1 в эмбриональных клетках крысы, трансформированных онкогенами ElA+cHa-ras. Молек. Биология, т. 30: 662-672.

6. Поспелова Т.В., A.JI. Евдонин, Н.Д. Медведева, В.А. Поспелов. 1998. Транскипционные факторы Statl и Stat3 локализованы в разных компартментах эмбриональных фибробластов крысы, трансформированных онкогенами ElA+cHa-ras. Цитология, т. 40: 1074-1079.

7. Схоль-Энгбертс А.Д., Соколова E.H., Дариева З.А., Попов Ю.Г., Поспелова Т.В., Гуревич B.C. Регуляция активности протеинкиназы С в нормальных , иммортализованных и трансформированных фибробластах крысы. Цитология. 1992, т.34 (5): 110-118

8. Adelson, М., М. Baggish, D. Seifer, S. Cassell, M. Thompson. 1988. Cytoreduction of ovarian cancer with the Cavitron ultrasonic surgical aspirator. Obstet Gynecol 72: 140-143

9. Akusjarvi, G. 1993. Proteins with transcription regulatory properties encoded by human adenoviruses. Trends Microbiol. 163:163-170.

10. Alessi, D.R., Y. Saito, D.G. Campbell, P. Cohen, G. Sithanandam, U. Rapp, A. Ashworth, C.J. Marshall, S. Cowely.1994. Identification of the sites in MAP kinase kinase-1 phosphorylated by p74raf-l . EMBO J. 13: 1610-1619.

11. Ammerer, G. 1994. Sex, stress, and integrity: the importance of MAP kinases in yeast. Curr. Opin. Genet.

12. Bagchi, S., P. Raychaudhuri, and J. R. Nevins. 1990. Adenovirus E1A proteins can dissociate heteromeric complexes involving E2F transcription factor: a novel mechanism for El A trans-activation. Cell. 62:659-669.

13. Baldwin, A., J. Azizkhan, D. Jensen, A. Beg, and L. Coodly. 1991. Induction of NF-kappa B DNA-binding activity during the GO-to-Gl transition in mouse fibroblasts. Mol. Cell. Biol. 11:4943-4951.

14. Bannister, A., T. Oehler, D. Wilhelm, P. Angel, and T. Kouzarides. 1995. Stimulation of c-Jun activity by CBP: c-Jun residues Ser67/73 are required for CBP induced stimulation in vivo and CBP binding in vitro. Oncogene. 11:2509-2514.

15. Bauerle, P.A., and T.Henkel. 1994. Function and activation of NF-kB in the immune system. Annu. Rev. Immunol. 12:141-179.

16. Bayley, S., and J. Mymryk. 1994. Adenovirus E1A proteins and transformation (review). Int. J. One. 5:425-444.

17. Beg, A.A., and A.S. Baldwin. 1993. The IkB proteins : multifunctional regulators of Rel/NF-kB transcription factors. Genes Dev. 7:2064-2070.

18. Bender, K., M. Gottlicher, S. Whiteside, H. J. Rahmsdorf and P. Herrlich. 1998. Sequential DNA damage-independent and -dependent activation of NF-kappaB by UV. EMBO J. 17:5170-5181.

19. Beraud, C., W.J. Henzel, and P.A. Baeuerle. 1999. Involvement of regulatory and catalytic subunits of phosphoinositide 3-kinase in NF-kappaB activation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96:429-434.

20. Berkenstam, A., M. Del Mar Vivanco Ruiz, D. Barettino, M. Horikoshi, and H.G. Stunnenberg. 1992. Cooperativity in transactivation between retinoic acid receptor and TFIID requires an activity analogous to El A. Cell. 69:401-412.

21. Boguski, M.S., and F. MacCormick. 1993. Proteins regulating Ras and its relatives. Nature 366:643- 654.

22. Bourne, H.R., D.A. Sanders, and F. MacCormick. The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell functions. 1990. Nature. 349:117-126.

23. Boyd, J.M., S. Malstrom, T. Subramanian, L. Venkatesh, U. Schaeper, B. Elangovan, C. Eipper, and G. Chinnadurai. 1994. Adenovirus

24. E1B 19kDa and bcI-2 proteins interact with a common set of cellular roteins. Cell 79:341-351.

25. Bulavin, D., N. Tararova, N. Aksenov, V. Pospelov, T. Pospelova.1998. Apoptotic cell death in rat embryo fibroblasts transformed by elA+cHa-ras oncogenes after gamma irradiation. Tsitologiia 40:10171024.

26. Bulavin, D., N. Tararova, N. Aksenov, V. Pospelov, T. Pospelova.1999. Deregulation of p53/p21/WAF pathway contribute to polyploidy and apoptosis of ElA+cHa-ras transformed cells after gammairradiation. Oncogene 18:5611-5619

27. Campbel, S.L., R. Khosravi-Far, K. L. Rossman, G.J. Clark, C.J. Der. 1998. Increasing complexity of Ras signaling. Oncogene. 17: 13951413.

28. Chen, E., and C.-C. Li.1998. Association of Cdk2/cyclin E and NF-kB complexes at Gl/S phase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 249:728734.

29. Chen, Y.R., C.F. Meyer, and T.-H. Tan. 1996. Persistent activation of c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1) in gamma radiation-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 271:631-634.

30. Chen, Z., L. Parent, and T. Maniatis. 1996. Site-specific phosphorylation of IkB-a by a novel ubiquitin-dependent kinase activity. Cell. 84: 853-863.

31. Chin, L., A. Tam, J. Pomerantz, M. Wong, J. Holash, N. Bardeesy, Q. Shen, R. O'Hagan, J. Pantginis, H. Zhou , J. W. Horner, C. Cordon

32. Cardo, G. D. Yancopoulos, R. A. DePinho. 1999. Essential role for oncogenic Ras in tumour maintenance. Nature. 400:6743-6772.

33. Clark, G.J., J.K. Westwick, and CJ. Der. 1997. pl20 GAP modulates Ras activation of Jun kinases and transformation. J. Biol. Chem. 272:1677-1681.

34. Clark, G.J., L.A. Quilliam, M.M. Hisaka, and C.J. Der. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:4887-4891.

35. Cobrinik, D., P. Whyte, D. S. Peeper, T. Jacks, and R.A. Weinberg. 1993. Cell cycle specific association of E2F with the 130 ElA-binding protein. Genes Dev. 7:2392-2404.

36. Cowley, S., H. Paterson, P. Kemp, and C.J. Marshall. 1994. Activation of MAP kinase kinase is necessary and sufficient for PC 12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells. Cell 77:841852.

37. Crews, C.M., A. Alessandrini, and R. Erikson. 1992. Erks: their fifteen minutes has arrived. Cell Growth and Diff. 3:135-142.

38. Daub, H., F.U. Weiss, C. Wallasch, A. Ullrich. 1996. Role of transactivation of the EGF receptor in signalling by G-protein-coupled receptors. Nature. 379:557-560.

39. Debbas, M., and E. White. 1993. Wild-type p53 mediates apoptosis by el A which is inhibited by E1B. Genes Dev. 7:546-554.

40. Delhase, M., M. Hayakawa , Y. Chen, M. Karin. 1999. Positive and negative regulation of IkappaB kinase activity through IKKbeta subunit phosphorylation. Science. 284:309-313.

41. Deng, J., W. Xia, and M.-C. Hung. 1998. Adenovirus 5 ElA-mediated tumor suppression associated with ElA-mediated apoptosis. Oncogene. 17:2167-2175.

42. Derijard, B., M. Hibi, I-H. Wu, T. Barrett, B. Su, T. Deng, M. Karin, and R.J. Davis. 1994. JNK1: a protein kinase stimulated by UV light and Ha-Ras that binds and phosphorylates the c-Jun activation domain. Cell. 76:1025-1037.

43. Dhanasekaran N. 1998. Cell signalling: an overview. Oncogene. 17:1329-1330.

44. Dickson, B., F. Sprenger, D. Morrison, E. Hafen . 1992. Raf functions downstream of Rasl in the Sevenless signal transduction pathway. Nature. 360: 600-603.

45. DiDonato, J.A., M. Hayakawa, D.M. Rothwarf, E. Zandi, and M. Karin. 1997. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature.388:548-554.

46. Dignam J.D., Lebowitz R.M., Roeder R.G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. 1983. Nucleic Acids Res. 11:1475-1489

47. Egan, S.E., and R.A. Weinberg. 1993. The pathway to signal achievement news. Nature. 365:781-783.

48. Evan, G.I., A. N. Wyllie, C.S. Gilbert, T.D. Littlewood, H. Land, M. Brooks, C. M. Walters, L.Z. Penn, and Hancock D.C. 1992. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein. Cell. 69:119-128.

49. Farrow, S.N., J. White, I. Martinou, T. Raven, K.-T. Pun, C. Grinham, J. Martinou, and R. Brown. 1995. Cloning of a bcl-2 homologue by interaction with adenovirus E1B 19K. Nature. 374:731-733.

50. Feig, L.A., G.M. Cooper. 1988. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Mol Cell Biol 8:3235-3243

51. Feinman, R., J. Koury, M. Thames, B. Barlogie, J. Epstein, D. Siegel. 1999. Role of NF-kappaB in the rescue of multiple myeloma cells from glucocorticoid-induced apoptosis by bcl-2. Blood 93: 3044-3052

52. Finco, T., J. Westwick, J.L. Norris, A. Beg, C.J. Der, and A.S. Baldwin. 1997. Oncogenic Ha-Ras-induced signalling activates NF-kB transcriptional activity, which is required for cellular transformation. J. Biol. Chem. 272: 24113-24116.

53. Frost, J.A., H. Steen, P. Shapiro, T. Lewis, N. Ahn, P.E. Shaw, and M.H. Cobb. 1997. Cross-cascade activation of ERKs and ternary complex factors by Rho family proteins. EMBO J. 16:6426-6438.

54. Garrington T.P., Johnson G.L. Organization and regulation of mitogen-activated protein kinase signaling pathways. 1999. Curr. Opin. Cell Biol. 11:211-218

55. Gauthier-Rouviere, C., A. Fernandez, N. J. Lamb. 1990. Ras-induced c-fos expression and proliferation in living fibroblsts involves C-kinase activation and the serum response element pathway. EMBO J. 9:171180.

56. Gilmore, T.D., Koedood M., K.A. Piffat, and D.W. White. 1996. Rel/Nf-kB/IkB proteins and cancer. Oncogene 13:1367-1378.

57. Giri, D.K., B.B. Aggarwal. 1998. Constitutive activation of NF-kappaB causes resistance to apoptosis in human cutaneous T cell lymphoma HuT-78 cells. Autocrine role of tumor necrosis factor and reactive oxygen intermediates. J Biol Chem 273:14008-14014

58. Granger-Schnarr, M., E. Bentisiglio, M. Schnarr, and P. Sassone-Corsi. 1992. Transformation and transactivation suppressor activity of the c-Jun leucine zipper fused to a bacterial repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4236-4239.

59. Gupta, S., D. Campbell, B. Derijard, and R.J. Davis. 1995. Transcription factor ATF-2 regulation by the JNK signal transduction pathway. Science. 267:389-393.

60. Han, J., J.D. Lee, L. Beebs, and R.J. Ulvetich. 1994. A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells. Science. 265:808-811.

61. Harlow, E., P. Whyte, B. R. Franza, and C. Schley. 1986. Association of adenovirus early-region 1A proteins with cellular polypeptides. Mol.Cell.Biol. 6:1579-1589.

62. Hausladen, A., C. Privalle, T. Keng, J. DeAngelo, and J.S. Stamler.1996. Nitrosative stress; activation of the transcription factor OxyR. Cell 86:719-729.

63. Herber, B., M.Truss, M.Beato, and R. Muller. 1994. Inducible regulatory elements in the human cyclin D1 promoter. Oncogene 9:1295- 1304.

64. Hibi, M., A. Lin, T.Smeal, A. Minden, and M. Karin. 1993. Identification of an oncoprotein and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. Genes Dev. 7:2135-2141.

65. Hill, C.S., R. Marais, S. John, J. Wynne, S. Dalton, and R. Treisman. 1993. Functional analysis of a growth factor-responsive transcription factor complex. Cell. 73:395-406.

66. Hinds, P.W., S. Mittnacht, V. Dulic, A. Arnold, S.I. Reed, and R.A. Weinberg. 1992. Regulation of retinoblastoma protein functions by ectopic expression of human cyclins. Cell 70:993-1006.

67. Hinds, P.W., S.F. Dowdy, E.N. Eaton, A. Arnold, and R.A. Weinberg. 1994. Function of a human cyclin gene as an oncogene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:709-713.

68. Hirsch, D.D., and P.J. Storck. 1997. Mitogen-activated protein kinase phosphatases inactivate stress-activated protein kinase pathways in vivo. J. Biol. Chem. 272:4568-4575.

69. Hoeffer, W. K., R. Kovelman, and Roeder. 1988. Activation of transcription factor 3C by the adenovirus El A protein. Cell. 53:907920.

70. Holt, J.T. 1993. Antisense rescue defines specialized and generalized functional domains for c-Fos protein. Mol. Cell. Biol. 13:3821-3830.

71. Ho we, J. A., and S.T. Bayley. 1992. Effects of Ad 5 El A mutant viruses on the cell cycle in relation to the binding of cellular proteins including the retinoblastoma protein and cyclin A.Virology 186:15-24.

72. Howe, J.A., J.S. Mymiyk, C. Egan, P.E. Branton, and S.T. Bayley. 1990. Retinoblastoma growth suppressor and a 300-kDz protein appear to regulate cellular DNA synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5883-5887.

73. Janknecht, R., and T. Hunter. 1997. Activation of SAP-la transcription factor by the c-Jun N-terminal kinase (JNK) mitogen-activated protein kinase. J. Biol. Chem. 272:4219-4224.

74. Janknecht, R., and T. Hunter. 1997. Convergence of MAP kinase pathways on the ternary complex factor SAP-la. EMBO J. 16:16201627.

75. Janknecht, R., M. A. Cahill and A. Nordheim. 1995. Signal integration at the c-fos promoter. Carcinogenesis. 16:443-450.

76. Jimenez, B., M.Arends, P. Esteve, R. Perona, R. Sanches, S. Ramon, A.Wyllie, J.C. Lacal. 1995. Induction of apoptosis in NIH3T3 cells after serum deprivation by overexpression of rho-p21, a GTPase protein of the ras superfamily. Oncogene. 10:811-816.

77. Karin, M. 1995. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 270:16483-16486.

78. Karin, M. 1999. How NF-kB is activated: the role of the IkB kinase (IKK) complex. Oncogene. 18:6867-6874.

79. Keblusek, P., J.C. Dorsman, A. Tenissen, A.J. Van der Eb, and A. Zantema. 1999. The adenoviral El A oncoproteins interfere with the growth-inhibiting effect of the cdk-inhibitor p21 Cipl/Wafl. J. General Virol. 80:381-390.

80. Kerkhoff, E., and U. R. Rapp. 1998. High-intensity Raf signals convert mitotic cell cycling into cellular growth. Cancer Res. 58:1636-1640.

81. Keyse, S.M. Protein phosphatases and the regulation of MAP kinase activity. 1998. Semin. Cell Dev. Biol. 9:143-152.

82. Khosravi-Far, R., P.A. Solski, G.J. Clark, M.S. Kinch, and C.J. Der.1995. Activation of Racl, RhoA, and mitogen-activated protein kinases is required for Ras transformation. Mol. Cell. Biol. 15:6443-6453.

83. Krappmann, D., F. Emmerich, U. Kordes, E. Scharschmidt, B. Dorken, and C.Scheidereit. 1999. Molecular mechanisms of constitutive NF-kappaB/Rel activation in Hodgkin/Reed-Sternberg cells.Oncogene. 18:943-953.

84. Kyriakis, J.M., A. Haimovitz-Friedman, Z. Fuks, and R.N. Kolesnick.1996. Requirement for ceramide-initiated SAPK/JNK signalling in stress-induced apoptosis. Nature. 380:75-79.

85. Kyriakis, J.M., P. Banrjee, C. Nikolakaki, T. Dai, E. A. Rubie, M.F. Ahmad, J. Ayruch, and J. R. Woodgett. 1994. The stress-activated protein-kinase subfamily of c-Jun kinases. Nature. 369:156-160.

86. Lacal J.C., Moscat J., Aaronson S.A. novel source of 1,2-diacylglycerol elevated in cells transformed by Ha-ras oncogene. 19987. Nature. 330:269-272

87. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophageT4. 1970. Nature . 227: 680-685

88. Lander, H.M., A.T. Jacovina, R.J. Davis, and J.M. Tauras.1996. Differential activation of MAP kinases by nitric oxyde-related species. J. Biol. Chem. 271:19705-19709.

89. Lander, H.M., J.S. Ogiste, K.K. Teng, and A. Novogrodsky. 1995. p21Ras as a common signalling target of reactive free radicals and cellular redox stress. J. Biol. Chem. 270:21195-21198.

90. Lau, L.F., and Nathans D. 1985. Identification of a set of genes expressed during the Go/Gl transition of cultured mouse cells. EMBO J., 4:3145-3151.

91. Lee, J.C., and P.R. Young. 1996. Role of CBP/p38/RK stress response kinase in LPS and cytokine signalling mechanisms. J. Leukoc. Biol. 59:152-157.

92. Leevers, S.J., H.F. Paterson, CJ. Marshall. 1994.Requirement for Ras in Raf activation is overcome by targeting Raf to the plazma membrane. Nature. 369: 411-414.

93. Lin, H.J., V. Eviner, G.C. Prendergast, E. White. 1995. Activated H-ras rescues ElA-induced apoptosisand cooperates with El A to overcome p53-dependent growth arrest. Mol. Cell Biol. 15:4536-4544.

94. Ling, L., Z. Cao, D.V. Goeddel. 1998. NF-kB-inducing kinase activates IKKa by phosphorylation of Ser 176. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3792-3797.

95. Lo, Y.Y., and T.F. Cruz. 1995. Involvement of reactive oxygen species in cytokine and growth factor induction of c-fos expression in chondrocytes. J. Biol. Chem. 270:11727-11730.

96. Lundblad, J.R., R.P. Kwok, M. E. Laurance , M.L. Harter, and R. H. Goodman. 1995. Adenoviral ElA-associated protein p300 as a functional homologue of the transcriptional co-activator CBP. Nature (London) 374: 85-88.

97. Mansour, S.J., W.T. Matten, A.S. Hermann, J.M. Candia, S. Rong, K. Fukasawa, G.F. Vande Woude, N.G.Ahn. 1994. Transformation of mammalian cells by constitutively active MAP kinase kinase. Science.265: 966-970.

98. Marais R., J.Wynne , R. Treisman. 1993. The SRF accessory protein Elk-1 contains a growth factor-regulated transcriptional activation domain. Cell. 73: 381-393.

99. Mayo, M. W., C.-Y. Wang, P. Cogswell, K. S. Rogers-Graham, S. Lowe, C. J. Der, A. S. Baldwin. 1997. Requirement of NF-kB activation to supress p53-independent apoptosis induced by oncogenic Ras. Science 278:1812-1815.

100. Meijer, I., J.M. Boot, G. Mahibir, A. Zantema, and A.J. Van der Eb. 1992. Reduced binding activity of transcription factor NF-kB accounts for MHC class 1 repression in adenovirus type 12 El-transformed cells. Cell. Immunol. 145:56-65.

101. Mercurio, F., H. Zhu, B.W. Murray, A. Shevchenko, B. L. Bennet, J. Li, D.B. Young, M. Barbosa, M. Mann, A. Manning and A. Rao. 1997. IKK-1 and IKK-2: cytokine-activated IkappaB kinases essential for NF-kappaB activation. Science 278:860-866.

102. Meyer, M., R. Schreck, and P.A. Baeuerle. 1993. H202 and antioxidants have opposite effects on activation of NF-kB and AP-1 in intact cells: AP-1 as secondary antioxidant-responsive factor. EMBO J. 12: 2005-2011.

103. Miller, M.J., L. Rioux, G.V. Prendergast, S. Cannon, M.A. White, and Meinkoth J.L. 1998. Differential effects of protein kinase A on Ras effector proteins. Mol. Cell Biol. 18:3718-3726.

104. Miyamoto S., Chiao P.J., Verma I.M. Enchanced IkBa degradation is responsible for the constitutive NF-kB activity in murine B-cell lines. 1994. Mol. Cell. Biol. 14:3276-3282

105. Moodie, S.A., B.M. Willumsen, M.J. Weber, A. Wolfman. 1993. Complexes of Ras.GTP with Raf-1 and mitogen-activated protein kinase kinase. Science. 260:1658-1661.

106. Moran, E. 1988. A region of SV40 large antigen can substitute for a transforming domain of the adenovirus El A products. Nature 334:168170.

107. Moran, E., 1994. Cell growth control mechanisms reflected through protein interactions with the adenovirus El A gene products.Semin.Virol. 5:327-340.

108. Morrison, D.K., R.E. Cutler. 1997. The complexity of Raf-1 regulation. Curr Opin Cell Biol 9:174-9

109. Mulcahy, L. S., M. R. Smith and D. W. Stacey. 1985. Requirement for ras proto-oncogene function during serum-stimulated growth of NIH3T3 cells. Nature. 313:241-24.

110. Mymryk, J.S., K. Shire, and S.T. Bayley. 1994. Induction of apoptosis by adenovirus 5 El A in rat cells requires a proliferation block. Oncogene. 9: 1187-1193.

111. Nakajima, T., M. Yageta, K. Shiotsu, K. Morita, M. Suzuki, Y. Tomooka, K. Oda. 1998. Suppression of adenovirus ElA-induced apoptosis by mutated p53 is overcome by coexpression with Id proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 10590-10595

112. Nakano, H., M. Shindo, S. Sakon, S. Nishinaka, M. Mishara, H.Yagita, K. Okumura. Differential regulation of IkB kinase a and b bytwo upstream kinases and mitogen-activated protein kinase/ERK kinase-kinase 1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3537-3542.

113. Nebreda. 1994. A novel kinase cascade triggered by stress and heat shock that stimulates MAPKAP kinase-2 and phosphorylation of the small heat shock proteins. Cell. 78:1027-1037.

114. Norris J.L. and A.S. Baldwin. Oncogenic Ras enhances NF-kB transcriptional activity through Raf-dependent and Raf-independent mitogen-activated protein kinase signaling pathways. 1999. J. Biol. Chem. 274: 13841-13846

115. Oldham, S.M., G.J. Clark, L.M. Gangarosa, R.G. Coffey, and C.J. Der. 1996. Activation of the Raf-l/MAP kinase cascade is not sufficient for Ras transformation of RIE-1 epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6924-6928.

116. Ozes, O.N., L.D. Mayo, J. A. Gustin, S.R. Pfeffer, L.M. Pfeffer, and D.B. Donner. 1999. NF-kappaB activation by tumour necrosis factor requires the Akt serine-threonine kinase. Nature. 401:82-85.

117. Perkins, N.D., L.K. Felzien, J.C. Betts, K. Leung, D.H. Beach, and G.J. Nabel. 1997. Regulation of NF-kappaB by cyclin dependent kinases associated with the p300 coactivator. Science. 275:523-527.

118. Perone, M., S. Windeatt, M. Castro. Intracellular trafficking of prohormones and proneuropeptides: cell type-specific sorting and targeting.1. Exp Physiol 82: 609-628

119. Pines, J., and T. Hunter. 1990. Human cyclin A is the E1A-associated protein p60 and behaves differently from cyclin B. Nature (London) 346:760-763.

120. Qiu, R.-G., Chen J., D. Kirn, F. McCormick, and M. Symons. 1995. An essential role for Rac in Ras transformation.Nature.374:457-459.

121. Raff, M.C. 1992. Social controls on cell survival and cell death. Nature. 356: 397-400.

122. Rao, L., M. Debbas, P. Sabbatini, D. Hockenberry, ,S. Korsmeyer, and E. White. 1992. The adenovirus El A proteins induce apoptosis, which is inhibited by E1B 19-kDa and bcl-2 proteins. Proc. Nacl. Acad. Sci. USA 89:7742-7746.

123. Raychaudhuri, P., S. Bagchi, and J. R. Nevins. 1989. DNA-binding activity of the adenovirus-induced E4F transcription factor is regulated by phosphorylation. Genes Dev. 3:620-627.

124. Reed, J.C. 1998. Bcl-2 family proteins. Oncogene. 17:3225-3236.

125. Regnier, C.H., H.Y. Song, X. Gao, D.V. Goeddel, Z. Cao, and M. Rothe. 1997. Identification and characterization of an IkappaB kinase. Cell. 90:373-383.

126. Reuther, J., G. Reuther, D. Cortez, A. Pendergast, A.S. Baldwin. 1998. A requirement for NF-kappaB activation in Bcr-Abl-mediated transformation. Genes Dev 12: 968-981

127. Riabowol, K. T., R. J. Bosatka, E. B. Ziff, N. Lamb, and J. R. Feramisco. 1988. Microinjection of Fos specific antibodies blocks DNA synthesis in fibroblast cells. Mol. Cell. Biol. 8:1670-1677.

128. Romashkova, J.A. and S. S. Makarov. 1999. NF-kappaB is a target of AKT in anti-apoptotic PDGF signalling. Nature. 401:86-90.

129. Rozengurt E., Rodriguez-Pena M., Smith K. Phorbol esters, phospholipase C, and growth factors rapidly stimulate the phosphorylation of a Mr 80.000 protein in intact quiescent 3T3 cells. 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:7244-7344

130. Ruley, H.E. 1983. Adenovirus early region 1A enables viral and cellular transforming genes to transform primary cells in culture. Nature. 304:602-606.

131. Ruley, H.E. 1983. Adenovirus early region 1A enables viral and cellular transforming genes to transform primary cells in culture. Nature. 304: 602-606.

132. Russell, M., F. Lange-Carter, G.L. Johnson . 1995. Direct interaction between Ras and the kinase domain of mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MEKK1). J Biol Chem. 270: 11757-1160.

133. Sabbatini, P., S.-K. Chiou, L. Rao, and E. White. 1995. Modulation of p53-mediated transcriptional repression and apoptosis by the adenovirus EIB 19K protein. Mol. Cell. Biol. 15:1060-1070.

134. Sanchez, I., R. T. Hughes, J. Mayer, K. Yee, J.R. Woodgett, J. Avruch, J.M. Kyriakis, and L.I. Zon. 1994. Role of SAPK/ERK kinase-1 in the stress-activating pathway regulating transcription factor c-Jun. Nature. 372:794-798.

135. Schmitz, M., A. Indorf, F. Limbourg, H. Stadtler, E. Traenckner, P.A. Baeuerle. 1996. The dual effect of adenovirus type 5 E1A 13S protein on NF-kappaB activation is antagonized by E1B 19K. Mol Cell Biol 16: 4052-4063

136. Schmitz, M., M.S. Silva, and P. Baeuerle. 1995. Transctivation domain 2 (TA2) of p65 NF-kB. J. Biol. Chem. 270:15576-15584.

137. Schulze-Osthoff, K., D. Ferrari, K. Riehemann , and S. Wesselborg. 1997. Regulation of NF-kB activation by MAP kinase cascades. Immunobiol. 198:35-49.

138. Schwartz, M.A., and V. Baron. 1999. Interactions between mitogenic stimuli, or, a thousand and one connections. Curr. Opinion Cell Biol. 11:197-202.

139. See, R.H., and Y. Shi. 1998. Adenovirus E1B 19000-molecular-weight protein activates c-Jun N-terminal kinase and c-Jun-mediated transcription. Mol. Cell Biol. 18:4012-4022.

140. Sen, R., D. Baltimore. 1986. Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein NF-kappa B by a posttranslational mechanism. Cell 1986 47: 921-928

141. Shaw, P. E., H. Schroter, and A. Nordheim. 1989. The ability of a ternary complex to form over the serum response element correlates with serum inducibility of the human c-fos promoter. Cell. 56:563-572.

142. Sheppard, K. A., D. W. Rose, Z. K. Haque, R. Kurokawa, E. Mclnerney, S. Westin, D. Thanos, M. G. Rosenfeld, C. K. Glass, T. Collins. 1999. Transcriptional activation by NF-kappaB requires multiple coactivators. Mol. Cell Biol. 19:6367-6378.

143. Sherr, C. J. 1993. Mammalian G1 cyclins. Cell. 73:1059-1065.

144. Sherr, C. J. 1996. Cancer and cell cycle. Science. 274:1672-1677.

145. Sherwin, S.A., U.R. Rapp, R.E. Benveniste, A. Sen, G.J. Todaro, 1987. Rescue of endogenous 30S retroviral sequences from mouse cells by baboon type C virus. J. Virol. 26: 257-64.

146. Shikama, N., I. Izuno, M. Oguchi, K. Gomi, S. Sone, K. Takei, S. Sasaki, T. Wako, N. Itou, K. Ishii. 1997. Clinical stage IE primarylymphoma of the nasal cavity: radiation therapy and chemotherapy. Radiology 1997 204: 467-470

147. Shurman, L., R. Sen, Y. Bergman. 1989. Adenovirus E1A products activate the Ig k-chain enhancer in fibroblasts. A possible involvement of the NF-kB binding site. J Immunol 143: 3806-3812

148. Singh, R.A., A. Sodhi. Expression and activation of RAS and mitogen-activated protein kinases in macrophages treated in vitro with cisplatin: regulation by kinases, phosphatases and Ca2+/calmodulin. Immunol Cell Biol. 77:356-363

149. Singh, R.P., P. Dhawan, C. Golden, G.S. Kapoor, and K. Mehta. 1999. One-way cross-talk between p38MAPK and p42/44 MAPK. J. Biol. Chem. 274:19593-19600.

150. Sonenshein G.E. 1997. Rel/NF-kB transcription factors and the control of apoptosis. Semin. Cancer Biol. 8:113-119.

151. Sprenger, F., M. Trosclair, D.K. Morrison. 1993. Biochemical analysis of torso and D-raf during Drosophila embryogenesis: implications for terminal signal transduction. Mol Cell Biol 13:11631172

152. Stokoe, D., S.G. Macdonald, K. Cadwallader, M. Symons, J.F.Hancock. 1994. Activation of Raf as a result of recruitment to the plasma membrane. Science. 266(5192): 1792-1793.

153. Sumitomo, M., M.Tachibana, Nakashima J., M. Murai, A. Miyajima, F. Kimura, M. Hayakawa, H. Nakamura. 1999. An essential role fornuclear factor kappa B in preventing TNF-alpha-induced cell death in prostate cancer cells. J Urol 161: 674-679

154. Sundaresan, M., Z-X. Yu, V. Ferrans, K. Irani, and T. Finkel. 1995. Requirement for generation of H202 for platelet-derived growth factor signal transduction. Scince. 270:296-299.

155. Thompson, T.A., K. Kim, M. N. Gould. 1998. Harvey ras results in a higher frequency of mammaiy carcinomas than Kirsten ras after direct retroviral transfer into the rat mammary gland. Cancer Res. 58:22 50975104.

156. Treisman, R. 1994. Ternary complex factors : growth factor regulated transcriptional activators. Curr. Opin. Genet. Dev. 4:96-694701.

157. Treisman, R., R. Marais, and J. Wynne. 1992. Spatial flexibility in ternary complexes between SRF and its accessory proteins. EMBO J. 11:4631-4640.

158. Wang, D., A.S. Baldwin. 1998. Activation of NF-kB -dependent transcription factor by tumor-necrosis factor-alpha is mediated through phosphorylation of RelA/p65 on serine 529. J. Biol. Chem. 273: 2941129416.

159. Wang, W., J. Abbruzzese, D. Evans, L. Larry, K. Cleary, P. Chiao. 1999. The nuclear factor-kappa B RelA transcription factor is constitutively activated in human pancreatic adenocarcinoma cells. Clin/ Cancer Res. 5: 119-127.

160. Weinberg R.A. Tumor suppressor genes. 1991. Science. 254: 11381146

161. Weinberg, R.A. 1995. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81:323-330.

162. Whitmarsh, A.J., S-H. Yang, M. Su, A. D. Sharrocks, and R.J. Davis. 1997. Role of p38 and JNK mitogen-activated protein kinases in the activation of ternary complex factors. Mol. Cell. Biol. 17:23602371.

163. Whyte, P., N.M. Williamson, and E. Harlow. 1989. Cellular targetsfor transformation by the adenovirus El A proteins. Cell 56:67-75.

164. Williams, N.G., T. Roberts, P. Li. 1992. Both p21ras and pp60v-src are required, but neither alone is sufficient, to activate the Raf-1 kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 2922-2926

165. Woronicz, J.D., X. Gao, Z. Cao, M. Rothe, and D.V.Goeddel. 1997. IkappaB kinase-beta: NF-kappaB activation and complex formation with IkappaB kinase-alpha and NIK. Science. 278:866-869.

166. Yang, J., E. Chang, A.M. Cherry, C.D. Bangs, Y. Oei, A. Bodnar, A. Bronstein, C.P. Chiu, G.S. Herron. 1999. Human endothelial cell life extension by telomerase expression. J. Biol. Chem. 274:26141-26148.

167. Yang, S-H., A. J. Whitmarsh, R. J. Davis, and A. D. Sharrocks. 1998. Differential targeting of MAP kinases to the ETS-domain transcription factor Elk-1. EMBO J. 17:1740-1749.

168. Zerler, B., R.J. Roberts, M.B. Mathews, and E. Moran. 1987. Different functional domains of the adenovirus El A gene are involved in regulation of host cell cycle products. Mol. Cell Biol. 7:821-829.

169. Zhong H, Voll RE, Ghosh S.1998. Phosphorylation of NF-kappa B p65 by PKA stimulates transcriptional activity by promoting a novel bivalent interaction with the coactivator CBP/p300. Mol. Cell Biol. 1:661-671.