Анализ клеточного цикла и апоптотической гибели в E1Aad5 иммортализованных и трансформированных фибробластах крысы после действия повреждающих агентов

Кураш, Юлия Константиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ клеточного цикла и апоптотической гибели в E1Aad5 иммортализованных и трансформированных фибробластах крысы после действия повреждающих агентов
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ клеточного цикла и апоптотической гибели в E1Aad5 иммортализованных и трансформированных фибробластах крысы после действия повреждающих агентов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи

Р Г Б ОД

КУРАШ „з

Юлия Константиновна «¡Ап

АНАЛИЗ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА И АПОПТОТИЧЕСКОЙ ГИБЕЛИ В Е1Аа(15 ИММОРТАЛИЗОВАННЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТАХ КРЫСЫ ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ПОВРЕЖДАЮЩИХ АГЕНТОВ

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, С-Петербург

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

кандидат биологических наук Т.В. Поспелова (Институт цитологии РАН, С-Петербург)

доктор биологических наук, профессор В.М. Михельсон (Институт цитологии РАН, С-Петербург),

кандидат биологических наук

М.В. Филатов

(Петербургский институт

ядерной физики

им. Б. П. Константинова РАН,

С-Петербург)

Санкт-Петербургский Государственный университет, биолого-почвенный факультет

Защита диссертации состоится Л ^ " апреля 2000 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, дом 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан "Л У " марта 2000 г.

V - "• Ь - Л <-' /

Ученый секретарь ./___.'

Диссертационного совета | . _ /

доктор биологических наук ' у,"'"' Л.Н. Писарева

а чу о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что к числу основных отличий опухолевых клеток от нормальных относится их способность к неконтролируемой пролиферации и генетическая нестабильность. Автономная пролиферация может быть связана с изменением системы проведения сигналов с клеточной поверхности в ядро, так как интегральными компонентами этого пути являются продукты клеточных протоонкогенов. Превращение протоонкогенов в онкогены в ходе канцерогенеза способно конститутивно активировать сигнальные пути в отсутствии экзогенных ростовых факторов и приводить к неконтролируемой пролиферации (Hunter, 1997.). С другой стороны, в настоящее время накоплены данные о существовании другой системы строгого контроля за клеточной пролиферацией, которая связана с функционированием тумор-супрессорных геновр53, pRb и имеет непосредственное отношение к поддержанию генетической стабильности.

В нормальных клетках повреждение ДНК приводит к остановке клеток в G1/S и G2/M фазах клеточного цикла, в так называемых точках контроля. Блоки G1/S и G2/M необходимы для полноценной репарации поврежденной ДНК, после которой клетка вступает в цикл. Если же повреждения ДНК настолько серьезны, что репарация невозможна, в клетке реализуется программа апоптотической гибели (Sherr, 1996.).

В экспериментах на мышах генотипа р53-/-, а также на клеточных линиях, полученных из них, было обнаружено, что р53 является одним из главных регуляторов генетической стабильности клетки. Его отсутствие через 3-4 пассажа культивирования эмбриональных фибробластов in vitro приводит к полиплоидизации и нарушению кариотипической стабильности (Fukasama et al., 1996) и индуцирует формирование опухолей у 100% трансгенных мышей in vivo в течение 3-6 месяцев после рождения (Donehower et al., 1992). Показано также, что в 50% опухолей человека р53 мутирован, делетирован или имеет цитоплазматическую локализацию (Moll et al., 1992).

ген bax необходим для реализации программы апоптоза (Han et al., 1996).

Ранний район аденовируса типа 5 человека - ElAad5, известный как ядерный онкоген, иммортализует первичные клетки грызунов с низкой частотой, так как вызывает в них аиоптоз (Debbas and White 1993.). Предполагают, что при комплементации ElAad5 с Е1В или cHa-ras происходит супрессия апоптоза и полная морфологическая трансформация (Rao et al., 1992; RuleyH.E., 1983.). Основное действие онкогена ElAad5 в клетке связано с его способностью инактивировать негативные регуляторы клеточной пролиферации, в частности белки семейства Rb (LaThangue, 1994.) и ингибиторы циклин-зависимых киназ (Bulavin et al., 1999.). ElAad5 не взаимодействует с белками р53, однако способен стабилизировать их и изменять трансактивационную активность (Debbas and White 1993.).

Таким образом, для успешной трансформации первичных клеток грызунов одним из необходимых этапов является инактивирование белковых продуктов тумор-супрессорных генов р53 и pRb, главной функцией которых является поддержание генетической стабильности через осуществление блоков G1/S и G2/ М. Поскольку, онкобелки Е1А не взаимодействуют с продуктами гена-супрессора р53, Е1А-экспрессирующие клетки являются адекватной моделью для изучения закономерностей функционирования р53-зависимого тумор-супрессорного Пути в трансформированных клетках.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было изучение способности ElAad5 иммортализованных и трансформированных клеточных линий, полученных из эмбриональных фибробластов крысы переносом онкогенов, осуществлять остановку в G1/S и G2/M контрольных точках и реализовать программу апоптотической гибели после повреждения ДНК в зависимости от конформационного состояния белка р53.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. С помощью антител, опознающих р53 в дикой и мутантной конформациях, изучить конформационное состояние белка р53 и его внутриклеточную локализацию в нормальных эмбриональных фибробластах крысы (REF), иммортализованных клеточных линиях, полученных из них введением полного района E1A(12S+13S), продукта его сплайсинга EIA12S, а также в трансформированных клеточных линиях Е1А+Е1В и ElA+cHa-ras, селектированных из REF котрансфекцией комплементирующих онкогенов.

2. Сравнить функциональную полноценность p53/Rb-зависимого пути в El А-иммортализованных и трансформированных 4

линиях по способности клеток останавливаться в G1/S и G2/M точках контроля после действия различных ДНК-повреждающих агентов в зависимости от статуса белка р53.

3. Провести анализ закономерностей апоптотической гибели в клетках REF, иммортализованных клеточных линиях E1A12S и E1A(12S+13S), в трансформантах Е1А+Е1В и ElA+cHa-ras после действия различных по механизму действия ДНК-повреждающих агентов в зависимости от конформационного состояния белка р53.

Научная новизна работы

Впервые показано, что присутствие одного из продуктов сплайсинга раннего района онкогена ElAad5 - E1A12S достаточно для запуска программы апоптоза после повреждения ДНК, тогда как иммортализация полным районом E1A(12S+13S) индуцирует спонтанный апоптоз при стандартных условиях культивирования.

Показано, что комплементация ElAadS с антиапоптотическим геном Е1В 19кД полностью супрессирует программу апоптоза после действия ДНК-повреждающих агентов независимо от способности клеток останавливаться в цикле и способа селекции клеточных линий.

Впервые показано, что независимо от статуса белка р53 комплементация El А с онкогеном cHa-ras не приводит к подавлению Е1А-зависимого апоптоза. Трансформанты ElA+cHa-ras теряют способность останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла независимо от конформационного состояния белка р53, тогда как уровень апоптоза после повреждения ДНК в клетках El A+cHa-ras определяется статусом белка р53. В трансформантах ElA+cHa-ras, содержащих р53 дикого типа, выявлена корреляция между плотностью культуры в момент повреждения и уровнем апоптотической гибели.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего углубленного изучения закономерностей прохождения клеток по циклу и механизмов запуска программы апоптоза в опухолевых клетках и служить теоретической основой для разработки проапопто гической стратегии в лечении опухолей.

Апробация работы

(Санкт-Петербург, 1997) и на заседании совместного научного семинара Отдела клеточных культур, Лаборатории молекулярных основ дифференцировки клеток и Лаборатории радиационной цитологии Института цитологии РАН 02 марта 2000 г.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литертуры. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста и иллюстрирована 33 рисунками и 2 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Метод получения иммортализованных и трансформированных линий из эмбриональных фибробластов крысы. Иммортализованные клеточные линии E1A12S и Е1А (12S+13S) были получены из эмбриональных фибробластов крысы (REF) котрансфекцией ядерного онкогена ElAad5(12S+13S), раннего района аденовируса типа 5 человека или продукта его сплайсинга E1A12S, с геном устойчивости к генетицину (neo) путем селекции на генетицине -G418. Трансформированные клеточные линии ElA+cHa-ras и El А+Е1В были получены из REF котрансфекцией онкогенов ElAad5 и cHa-ras или ElAad5 и Е1В 19 кД с последующей селекцией на фокусы морфологической трансформации или селекцией на G418. (Поспелова Т.В., и др., 1990.).

Метод культивирования клеток. Нормальные эмбриональные фибробласты крысы (REF) и клеточные линии, полученные из них, культивировали на среде Игла в модификации Дальбекко (DME) с 10% эмбриональной сыворотки коров (FCS). Пересев осуществляли с помощью смеси трипсингверсен (1:1) один раз в два-три дня.

Исследование состояния белка р53 методом иммунопреципитации. Клеточные экстракты получали путем лизиса клеток в буфере, содержащем 10мМТрис-НС1,рН 8.0,150MMNaCI, 1 мМ EDTA, 1% NP-40, 0.5% Тритона Х-100, 20мМ р-глицерофосфата, 1мМ ванадата натрия, 1мМ PMSF и по 10 мкг/мл леупептина, пепстатина и апротинина. Лизаты центрифугировали и надосадочную жидкость использовали для иммунопреципитации. Белок р53 дикого типа выявляли осаждением смесью антител АЬ246 и АЫ620, р53 мутантного типа - антителами АЬ240, белки обеих форм - антителами Ab421 («Oncogene Science»). Антитела с клеточными лизатами инкубировали в течение ночи, образовавшиеся комплексы осаждали протеин-А-агарозой, использовали для электрофореза в 12%-номполиакриламидном геле 6

и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Для выявления р53 использовали поликлональные антитела овцы Ab7 («Oncogene Science»), в качестве вторых антител использовали антитела против иммуноглобулинов овцы, коныогированные с пероксидазой («Jackson»), Белки выявляли методом усиленной хемолюменисценции (ECL, «Amersham») .

Гамма—облучение и УФ-облучение клеток, культивирование на бессывороточной среде. Для изучения действия ДНК-повреждагощих агентов клетки рассевали с плотностью 1х104клеток/см2. Через 1824 ч проводили у-облучение клеток на чашках Петри, не удаляя среду культивирования, на установке РУМ-17. В работе использованы дозы 2, 4, 6 Гр (мощность 2 Гр/мин). Для изучения действия УФ-облучения применяли коротковолновой ультрафиолет с максимумом длины волны 254 ммк и мощностью 0.43 Дж/сек"' в дозах 4, 8 и 12 Дж. Сывороточное голодание проводили на среде ДМЕ, содержащей 0.5% сыворотки, в течение 24 ч для линий El Al 2S, E1A(12S+13S), E1A+E1B, ElA+cHa-ras и 48 ч в случае REF.

Метод проточной цитофлуориметрии. За распределением клеток по фазам клеточного цикла после действия повреждающих агентов следили методом проточной цитофлуориметрии как было описано ранее (Розанов 10. М, 1987).

Распределение клеток по циклу методом двух-параметрической проточной цитофлуориметрии проводили, анализируя содержание ДНК и используя BrdU (5-бромдезоксиуридин). Клетки инкубировали с 40 мкМ раствором BrdU в течение 1.5 ч и снимали с чашек буфером IFA (ЮмМ HEPES, pH 7.0, 150мМ NaCI, 0.1% азида натрия, 4% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота). После центрифугирования осадок ресуспендировали в 70%-ном этаноле и инкубировали при -20°С в течение ночи. После промывки клетки инкубировали 30 мин в 2 мл 2М HCl в присутствии 0.5% (по объему) Тритона Х-100. Для нейтрализации HCl клетки отмывали в 0.1М боратиом буфере, pH 8.5. Неспецифическое связывание уменьшали инкубацией клеток в 5%-ном растворе обезжиренного молока, приготовленном на PBS+0.5%Tween 20 (PBST). Затем инкубировали с моноклональными антителами против BrdU в течение 1 чпри 37°С. После двукратной промывки в PBST клетки инкубировали с Р(аЬ)2-фрагментами козлиных антител против иммуноглобулинов мыши в растворе PBST в течение 30 мин при 37°С. Далее клетки вновь отмывали буфером IFA и инкубировали с кроличьими антителами против иммуноглобулинов козла, меченных FITC. После промывки клетки инкубировали в буфере IFA, содержащем РНКазу А (100 мкг/мл), окрашивали пропидием иодидом (0.5 мкг/мл) и анализировали

методом двух-параметрической проточной цитофлуориметрии.

Оценка апоптотической гибели клеток по фрагментации внехромосомной ДНК. Внехромосомную ДНК для электрофоретического анализа получали по модифицированному методу XHpTa(Vikhanskayaet al., 1994.). Клетки лизировали в буфере, содержащем 5мМ Трис-HCI, рН 8.0, ЮОмМ EDTA, ЮмМ EGTA, 0.5%-ный Тритон Х-100, в течение 20 мин на льду. Низкомолекулярную ДНК отделяли от высокомолекулярной центрифугированием. Надосадочную жидкость, содержащую низкомолекулярную ДНК, обрабатывали РНКазой А (100 ед/мл) в течение 1 ч при 37°С, протеиназой К (200 ед/мл) в течение 2 ч при 50°С. После фенольной депротеинизации ДНК осаждали этиловым спиртом. Электрофорез проводили в горизонтальных блоках геля 2%-ной агарозы в трис-ацетатном буфере (40мМ трис-ацетат, рН 8.0, 2мМ EDTA) при U=90B, J=150mA. В качестве маркера использовали частичный гидролизат ДНК ядер эмбриональных фибробластов, полученный после обработки микрококковой нуклеазой.

Метод количественной оценки апоптотической гибели. Гибель клеток после действия повреждающих агентов оценивали с помощью метода клоногенной выживаемости ( Kastan et al., 1991.). Для этой цели через разные промежутки времени после у-облучения и УФ-облучения (4 ч и 18 ч) или сывороточного голодания в течение 24 ч рассевали по 100-300 клеток на 30 мм чашки (три чашки на каждую точку). После того как часть клонов достигала видимых глазом размеров, среду с чашек удаляли, клоны фиксировали 2%-ным формалином, окрашивали 4%-ным раствором Гимза и подсчитывали число клонов на микроскопе.

Оценку действия экзогенного р53 дикого типа и Waf-1 в трансформантах ElA+cHa-ras определяли по подавлению числа резистентных клонов после трансфекции кальций-фосфатным преципитатом как было описано ранее (Поспелова Т.В., и др., 1990.).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Цитофлуориметрический анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла в популяции REF и Е1А-иммортализованных клеток после действия ДНК-повреждающих агентов. Так как продукт тумор-супрессорного гена р53 является одним из главных регуляторов остановки клеток в G1/S и G2/M фазах клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК, была изучена способность нормальных эмбриональных фибробластов крысы (REF) и иммортализованных клеточных линий E1A12S и 8

Е1Л(128+138) осуществлять остановку в цикле после действия у-облучения и бессывороточной среды в зависимости от статуса белка р53. Анализ статуса белка р53 методом иммунопреципитации конформационно зависимыми антителами к р53, опознающими белок в нативной (в литературе обозначаются, как АЬ246 и АЫ620) или мутантной (АЬ240) конформациях показал, что ЯЕР и Е1А128-иммортализованные клетки содержат в основном р53 дикого типа, причем его количество в этих клетках практически одинакого (рис.1 А, дорожки 1,2,5,6,9,10). Методом цитофлуориметрического

А.

В.

а. ПЕР Е1А125

18 ч С1.Т1'.ч

Е1А125

18 <1 01-»» »4

г -

в.

а. Е1А(125+135),р53т1

6. Е1А(123+Ш), р53пй

01-«1Ч пьз-г п

Е1А(12Э+135)М

Е1А(125+Ш),р53м

Рис. 1. А. Статус белка р53 в клетках ПЕК, Е1АШ, Е1А(128+138) и Е1 Л+сНа-Ках. Клеточные лизаты иммунопреципитировали конформационно-зависимыми антителами, специфичными к дикому типу р53 - рАЬ24б к рАЫ620 (дорожки 1-4), к мутантному белку - рАЬ240 (58) или опознающими оба типа р53 - рАЬ421 (9-12). 1, 5, 9 - клетки Т!КГ; 2, 6, 10 - клетки Е1А125; 3, 7, И - клетки К1А(125+138); 4, 8, 12 - клетки Е1А+сНа-гач (клон 10). Справа обозначено положение одного из белковых маркеров молекулярной массы (кДа). Б, В. Цитоф-луориметрический анализ распределения по фазам клеточного цикла в популяции клеток эмбриональных фибробластов (У?К.К), Е1А128 и Е1 Л( 124 +138) после у-облучения в дозе 6 Гр (а) и после сывороточного голодания (б). По оси абсцисс - количество ДНК в условных единицах, по оси ординат - число клеток, (а): В левом верхнем углу каждого графика указано время после облучения, (б): В левом верхнем углу каждого графика указана концентрация сыворотки вереде культивнрования (0.5% или 10%).

о:

5- 1ЬЗЧ

анализа было показано, что после у-облучения REF и E1A12S-иммортализованные клетки останавливаются в G1/S и G2/M фазах клеточного цикла (рис. 1Б), после 48-часового культивирования на бессывороточной среде REF и E1A12S способны выходить в G1/S фазе (рис. 1Б). Иммортализация эмбриональных фибробластов крысы полным районом E1A(12S+13S) лишает их способности останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла в ответ на повреждения ДНК независимо от того, какой тип белка р53 они содержат (рис. 1В).

Анализ апоптотической гибели в REF и Е1А-иммортализованных клетках после действия ДНК-повреждающих агентов. Анализ апоптотической гибели в Е1А-экспрессирующих клетках, различающихся по способности останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла в ответ на повреждения ДНК, проводили методом клоногенной выживаемости и электрофоретичсским методом внехромосомной ДНК по выявлению картин нуклеосомного повтора. В эмбриональных фибробластах (REF) после у-облучения в диапазоне исследованных доз 2-6 Гр, которые вызывают остановку клеток в G1/S и G2/M фазах клеточного цикла, апоптоз, тестируемый по нуклеосомной фрагментации ДНК, не

1 2 3 4 5

Рис. 2. Электрофоретичсский анализ фрагментации ДНК в клетках REF, E1A12S, E1A(12S+I3S) н ElA+cHa-ras в нормальных условиях культивирования и после действия ДНК-повреждающих агентов, (а) - Клетки REF (1), E1A12S (2), E1A(12S+13S) (3) и ElA+cHa-ras (4) в отсутствии ДНК-повреждающих воздействий, (б) - Клетки REF: 1 - контроль; 2 и 3-у-облучение в дозах 2 и 6 Гр; 4 и 5 - УФ-облучение в дозах 4 и 12 Дж. (в) - Клетки ElAX2S: 1 -контроль; 2 и 3 - т-облучение в дозах 2 и 6 Гр; 4 и 5 - УФ-облучение в дозах 4 и 12 Дж. (г) -Клетки REE (1), E1A12S (2), E1A(12S+13S) (3), культивируемые в условиях сывороточного голодания (0.5% FCS, 48 ч). (д) - клетки E1A(12S+13S) в отсутствии ДНК-повреждающих воздействий: I - E1A(12S+13S) с преобладающим содержанием р53 дикого типа, 2 -E1A(12S+13S) с преобладающим содержанием р53 в мутаптной конформации, 3- частичный гидролизат ДНК ядер REF.

обнаружен (рис.2б). Фрагментация ДНК не выявляется в REF после 48-часового культивирования на бессывороточной среде, которые вызывают задержку клеток в G1/S фазе клеточного цикла (рис.2г).

Е1Л128-иммортализованные клетки способны, как эмбриональные фибробласты, останавливаться в G1/S и G2/M фазах клеточного цикла после действия ДНК-повреждающих агентов, однако присутствие онкобелков E1A12S качественно сказывается на характере их гибели. Нуклеосомная фрагментация ДНК в El Al 2S-иммортализованных клетках выявляется после действия у-облучения в дозе 6 Гр (рис.2в), а также после суточного культивирования клеток на среде с низким содержанием сыворотки (рис.2г). Электрофоретический анализ внехромосомной ДНК из клеток, иммортализованных полным районом E1A(12S+ 13S), выявил картину нуклеосомной фрагментации ДНК даже в контрольных клетках, неподвергавшихся повреждающему действию использованных в работе агентов (рис.2а, д).

Таким образом, нормальные эмбриональные фибробласты крысы, экспрессирующие р53 в нативной конформации, останавливаются в G1/S и G2/M фазах клеточного цикла после действия ДНК-повреждающих агентов и, по-видимому, способны полноценно репарировать повреждения ДНК, так как апоптоз в них отсутствует. Клетки, иммортализованные E1A12S-районом, также содержат р53 дикого типа и сохраняют способность останавливаться в G1/S и G2/M фазах клегочного цикла в ответ на повреждения ДНК. Однако, в отличие от нормальных фибробластов, после действия использованных в работе повреждающих агентов E1A12S-иммортализованные клетки гибнут апоптозом. Иммортализация эмбриональных фибробластов крысы полным районом E1A(12S+13S) вызывает спонтанный апоптоз в отсутствие повреждающих воздействий и подавляет способность реализовать блоки G1/S и G2I М после повреждения ДНК независимо от статуса белка р53.

Согласно данным по клоногенной выживаемости E1A12S-иммортализованные клетки, которые сохраняют способность останавливаться в G1/S и G2/M фазах клеточного цикла после действия ДНК-повреждающих агентов, оказались достаточно устойчивыми к повреждающему действию у-облучения и среды с низким содержанием ростовых факторов сыворотки. Клоногенная выживаемость их составляет 71 ±3 % после действия у-облучения (доза 6 Гр) и 62,7±2 % последействия бессывороточной среды, тогда как клоногенная выживаемость E1A(12S+13S) составляет 16,5±1,7 % после действия у-облучения (доза 6 Гр), а после культивирования на среде с низким содержанием сыворотки падает до 5,5±1,3 %. Прослеживается .отчетливая зависимость гибели клеток обеих линий от дозы повреждения.

Е1А-индуцированный апоптоз в ряде клеточных линий относится к числу зависимых от функционирования белка р53 дикого

типа (Lowe and Ruley, 1993.). Однако не исключено, что он может быть р53-независимым, так как показано, что онкобелки продукта сплайсинга E1A13S способны вызывать апоптотическую гибель в эмбриональных фибробластахр53-/- генотипа (Teodoro et al., 1995.). По-видимому, в ElA(12S + 13S)-HMM0pTajiH30BaHHbix линиях основная роль в осуществлении спонтанного апоптоза принадлежит продукту El A13S, который обладает свойством транс-активировать клеточные проапоптотические гены через CR3-pañoH, который отсутствует в продукте El A12S.

Анализ клеточного цикла и апоптотической гибели в транформированных клеточных линиях Е1А+Е1В после действия ДНК-повреждающих агентов. Известно, что комплементация Е1А района аденовируса типа 5 человека {ElAad5) с продуктом гена El В 19 кДа, являющегося вирусным аналогом антиапоптотического клеточного гена bcl-2, супрессирует клеточную гибель и приводит к полной трансформации первичных клеток (Rao et al., 1992.). В связи с этим был проведен анализ супрессии Е1А-индуцированного апоптоза по тесту фрагментации внехромосомной ДНК в трансформированных клеточных линиях Е1А+Е1В, полученных из эмбриональных фибробластов крысы (REF) при введение комплементирующих онкогенов Е1А и Е1В в разных векторах с последующей селекцией на фокусы морфологической трансформации - El А+Е1В(р21) или при введение одной плазмиды, содержащей геномный участок (Hind IIIG) аденовируса типа 5 человека, кодирующий Е1А+Е1В 19 кД с последующей селекцией на генетицине - El А+Е1В(р19).

Электрофоретический анализ внехромосомной ДНК из клсггок, экспрессирующих онкогены Е1А и Е1В, показал, что в них отсутствует апоптотическая гибель при стандартных условиях культивирования независимо от способа получения клеточных линий (рис.За).

Согласно данным иммунопреципитации конформационно зависимыми антителами к р53 в трансформантах Е1А+Е1В(р21), полученных из REF через фокусы морфологической трансформации, тумор-супрессорный белок р53 обнаруживается в обеих конформациях и его содержание выше, чем в REF, тогда как в линии Е1А+Е1В(р19) белок р53 выявляется в основном в нативной конформации и его количество сравнимо с REF. Таким образом, супрессия El А-индуцированного апоптоза в клетках Е1А+Е1В при стандартных условиях культивирования не зависит от статуса белка р53 и способа селекции клеточных линий.

Однако, были обнаружены существенные различия у трансформантов Е1А+Е1В останавливаться в цикле после действия 12

б.

12 3 4

Рис. 3. Электрофоретнческий анализ фрагментации ДНК в клетках Е1А + Е1В(р19) и Е1А+Е1В(р21) в нормальных условиях культивирования и после действия ДНК-поврсждающих агентов. а - Клетки Е1А + Е1 В(р21) (1, 2), Е1А+Е1В(р19) (3) и REF (4) в отсутствии ДНК-повреждающих агентов. б - Клетки Е1А + Е1В(р21), в - Клетки Е1А+Е1В(р19): 1 - ко!ггроль; 2-у-облучение в дозе 6 Гр; 3 - культивирование клеток в бессывороточной среде (0.5% FCS).

ДНК-повреждающих агентов в зависимости от способа получения клеточных линий. Так, клеточная линия ElА+Е1В(р 19), полученная из REF при введении геномного участка Ad5, способна останавливаться в G1/S и G2/M контрольных точках клеточного цикла в ответ на повреждения ДНК, тогда как трансформанты Е1А+Е1В(р21), селектированные через фокусы морфологической трансформации, способность останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла теряют (рис.4).

В трансформантах Е1А+Е1В после у-облучения (доза 6 Гр) и 24-часового культивирования на бессывороточной среде апоптоз, тестируемый по нуклеосомной фрагментации ДНК, не обнаружен

а. Е1А+Е1В(р19)

Е1А+Е1В(р21)

О] - 4S to**

S -

G2-t? 54%

gi^S t.;

СЛЛЛ - О 49

б. Е1А+Е1В(р19)

CO.-M J 43 I

ElA+ElB(p21)

Cl -<.0*3".

s -

02- n t«

(IIS - 3 39 Clw- 1 25

10%

1 И

—"Д***

Рис. 4 . Цитофлуориметричсский анализ распределения по фазам клеточного цикла в популяции клеток Е1А+Е1П(р21)н Е1А+Е1В(р19) последействия ДНК-повреждающих агентов. По оси абсцисс - количество ДНК в условных единицах, по оси ординат - число клеток, (а) - В левом верхнем углу каждого графика указано время после у-облучения (ч.). (б) - В левом верхнем углу каждого графика указана концентрация сыворотки в среде культивирования (0.5% или 10%).

независимо от типа селекции и способности клеток останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла (рис.3).

Кооперация El А с онкогеном cHa-ras при трансформации не подавляет El А-индуцированный апоптоз. Активированная форма гена cHa-ras с мутациями в 12 или 61 положениях высоко онкогенна и способна комплементировать с Е1А районом, позволяя получать трансформированные варианты (Ruley, 1983.). Однако, роль сНа-ras онкогена как супрессора апоптотической гибели в случае ElA+cHa-ras трансформации до конца неясна. С одной стороны, высокий уровень экспрессии Е1А индуцирует как р53-зависимый, так и р53-независимый апоптоз (Teodoro et al., 1995.). С другой стороны, высокий уровень экспрессии Ras вызывает в клетках старение и остановку в G1/S фазе клеточного цикла (Serrano et al., 1997.). Однако неясно, какая из программ будет доминантна при комплементации онкогенов Е1А и cHa-ras. Трансформированные клеточные линии ElA+cHa-ras были получены из нормальных клеток REF котрансфекцией комплементирующих онкогенов El А и cHa-ras через фокусы морфологической трансформации. Во всех

л. п

Ras

«м- •«»* щт* — —— t1А

1 2 3 4 5 6 7

Б.

12 3 4

t 2 3 4 5 -6 7 8 9 Ю

Рис. 5. А: Экспрессия белков ElA-и Ras в клонах трансформантов ElA+cHa-ras. Клеточные белки разделяли электрофорезом в 12% полиакриламилном геле и после переноса на мембрану выявляли антителами к белкам El А (Mab 73) и Ras (Pan-Ras, "Oncogene Science" ). На дорожках 1-7 расположены по порядку клоны: 6, 8,11,12,13,10, реклонированный 10 клон. Б: Статус белка р53 в клонах 6, 8, И, 12, 13 ElA+cHa-ras трансформантов. Клеточные лиза-T1.I иммунопреципитировали конформационно-завнеимымн антителами, специфичными к дикому типу р53 - рАЬ246 и рАЫ620 (все нечетные дорожки), к мутантному белку - рАЬ240 (все четные дорожки). 1-2 - клоп 6 ElA+cHa-ras; 3-4 - клон 8 ElA+cIIa-ras; 5-6 - клон 11 ElA+cHa-ras; 7-8 - клон 12 ElA+cHa-ras; 9-10 - клон 13 ElA+cHa-ras. Справа обозначено положение одною из белковых маркеров молекулярной массы (кДа). В: Электрофорстичес-кин анализ апоптотической гибели, тестируемой по фрагментации внехромосомной ДНК в трансформантах ElA+cHa-ras в нормальных условиях культивирования. На дорожках 1 — 4 представлены клоны 6, 8,11, 13 ElA+cHa-ras траисформантов.

случайно выбранных клонах Е1А+ сНа-гаэ уровень экспресии Е1А белков и Кав-белка достаточно высок и слабо варьирует (рис.5а). Методом иммунопреципитации конформационно зависимыми антителами, опознающими р53 в нативной и мутантной конформациях, обнаружено, что в исследованных клонах трансформантов уровень белка р53 выше, чем в 11ЕР, и он присутствует как в дикой, так и мутантной конформациях (рис.5б). Однако, соотношение разных конформационных форм существенно различается. Электрофоретический анализ внехромосомной ДНК показал, что в трансформированных клеточных линиях Е1А+сНа-гаБ выявляется спонтанная апоптотическая гибель, характерная для Е1А-содержащих клеток, которая не супрессируется онкогеном сНа-газ и не зависит от того, какой тип белка р53 они преимущественно экспрессируют (рис.5в).

Анализ клеточного цикла и апоптотической гибели в транформантах Е1 А+сНа-га-ч после действия ДНК-повреждающих агентов. Для изучения способности трансформантов Е1А+сНа-газ останавливаться в цикле и запускать программу апоптоза после действия ДНК-повреждающих агентов были выбраны клоны - 8 и 10, экспрессирующие белок р53 преимущественно в нативной конформации, и клон 11, который содержит в основном

а. ElA+cHa-ras(iaioH 8)

ElA+cIIa-ras(iuTOH 11)

б. Е1 A+cHa-ras(iaiOH 8)

ElA+cHa-ras(iaiOH 11)

ftli. ,

0,1* |

mtsL.

Рис. 6. Цитофлуоримстрнческий анализ распределения по фазам клеточного никла в популяции клеток El A+cHa-ras (клоны 8 и 11) после у-облучения в дозе б Гр (а) н после сывороточного голодания (0.5% FCS) (5). По оси абсцисс - количество ДНК в условных единицах, по оси ординат - число клеток, а: В левом верхнем углу каждого графика указано время после облучения, б: В левом верхнем углу каждого 1рафика указана концентрация сыворотки в среде культивирования (0.5% или 10%).

конформационно мутантный р53. Обнаружено, что проанализированные клоны теряют способность останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла после действия у-облучения и культивирования на среде с низким содержанием ростовых факторов

сыворотки независимо от статуса белка р53 (рис.6). Однако, задержка в G2/M после действия у-облучения выражена у них достаточно отчетливо.

Методом клоногенной выживаемости было показано, что в трансформированной клеточной линии ElA+cHa-ras (клон 8), содержащей р53 дикого типа, клоногенная выживаемость ниже (33± 1 % клонов, доза 6 Гр) после действия у-облучения, чем в клеточной линии Е1 A+cHa-ras (клон 11) с мутантным р53 (67±2 % клонов, доза 6 Гр). Следовательно, программированная клеточная гибель, индуцированная ДНК-повреждающими агентами, в трансформантах Е1 A+cHa-ras, по-видимому, зависит от статуса р53.

Таким образом, мы обнаружили, что трансформанты ElA+cHa-ras, обладающие высокой проапоптотической чувствительностью к действию ДНК-повреждающих агентов, реализуют только программу апоптоза и неспособны останавливаться в точках контроля G1/S и G2/M. Для того, чтобы проверить, можно ли активировать программу остановки в трансформантах ElA+cHa-ras, экспрессирующих р53 дикого типа, мы вводили экзогенный ген р53 дикого типа и экзогенный ген Waf-1 кальций-фосфатным методом. Оказалось, что введение экзогенного р53 дикого типа приводит к уменьшению эффективности клонирования трансформантов ElA+cHa-ras в 5 раз. Анализ антииролиферативного действия экзогенного Waf-1 в клетках ElA+cHa-ras выявил еще более существенное падение эффективности клонирования клеток El A+cHa-ras (в 20 раз). Таким образом, подавление эффективности клонирования трансформантов El A+cHa-ras после введения экзогенного р53 дикого типа и Waf-1 может свидетельствовать о принципиальной возможности функционирования тумор-супрессорного p53/Rb/Waf-l-nyTH в клетках El A+cHa-ras, содержащих р53 в нативной конформации, в ответ на повреждение ДНК. Учитывая результаты цитофлуориметрического анализа и результаты по эффективности клонирования клеток ElA+cHa-ras с трансфицированным геномр53 и Waf-1, можно предполагать, что в трансформантах ElA+cHa-ras экспрессия эндогенного p21/Waf-l недостаточна для подавления активности циклин-ассоциированных киназ Gl-фазы, тогда как его высокая экспрессия, по-видимому, способна приводить к остановке.

Процесс полиплоидизации в трансформантах ElA+cHa-ras после действия у-облучения зависит от статуса р53. Отсутствие полноценной остановки в G2/M фазе клеточного цикла после действия генотоксических агентов в клетках с мутантным или инактивированным р53 может быть причиной нарушения митотической сегрегации хромосом, приводящей к появлению 16

полиплоидных клеток (Cross et al., 1995.). В связи с этим был проведен анализ содержания ДНК методом проточной цитофлуориметрии после действия повреждающих агентов в клеточных линиях El A+cIIa-ras, экспрессирующих р53 преимущественно в дикой или мутантной конформациях. Было показано, что после у-облучения происходит накопление тетраплоидных и октаплоидных клеток только в трансформантах ElA+ctla-ras, которые в основном содержат р53 в нативной конформации (рис.7). Через 48 ч после действия ДНК-повреждающих агентов, в трансформантах Е1 А+сНа-

Рис. 7. Цктофлуорн.четрический анализ количества ДНК в 8 клоне ElA+cIIa-ras в стандартных условиях культивирования (а) и через 10 дней культивнровния после у-облучения (б). По оси абсцисс - количество ДНК в условных единицах, по оси ординат - число клеток.

ras, экспрессирующих р53 дикого типа, по результатам протока число тетраплоидных клеток уменьшается и обнаруживается большой гиподиилоидный пик, свидетельствующий о массовой гибели клеток (Bulavin et al., 1999). Таким образом, в ответ на повреждения ДНК в клетках El A+cHa-ras, содержащих р53 дикого типа, задержка в G2/M приводит, по-видимому, к неправильной эндоредугтликации ДНК, согласно данным Вогельпггейна (Waldman ct al., 1997) зависит не только от состояния р53, но и от p21/Waf-l и приводит к образованию нежизнеспособных полиплоидов, которые гибнут апоптозом.

Процесс полиплоидизаиии при стандартных условиях культивирования в трансформантах ElA+cIIa-ras. содержащих р53 дикого типа, супрессирует Е1А-индуцированный апоптоз. Все исследованные трансформированные клеточные линии El А+сНа-ras сразу после селекции их из REF имеют околодиплоидное содержание ДНК (2п) (рис.8А). В процессе культивирования (через 4 пассажа) в клонах El A+cHa-ras с преобладающим содержанием р53 дикого типа (клон 8, 10) структура популяции меняется и появляются клетки с удвоенным содержанием ДНК - 4п, которые также пролиферируют. В клеточных линиях El A+cIia-ras, которые в основном содержат р53 в мутантной конформации (клон 11), процесс полиплоидизации не идет. Однако, процесс

а,

А.

а.

б.

Б.

Рнс. 8. Л. - Цитофлуориметрический анализ количества ДНК в 10 клоне El A+cHa-ras в стандартных условиях культивирования после выделения из фокусов морфологической трансформации (а) и после серии последовательных ре клонировании (б). lio оси абсцисс - количество ДНК в условных единицах, по оси ординат - число клеток. Б. - Электрофоре-тическин анализ фрагментации ДНК в клетках ElA+cHa-ras после серии последовательных реклонировании в нормальных условиях культивирования. 1 - родительская линия ElA+cHa-ras; 2, 3, 4 - реклоны ElA+cHa-ras.

полиплоидизации в клетках ElA+cHa-ras, содержащих р53 дикого типа, после действия ДНК-повреждающих агентов и в стандартных условиях культивирования имеют принципиально разные последствия. В ответ на повреждения ДНК трансформанты ElA+cHa-ras погибают после полиплоидизации апоптозом. Напротив, в стандартных условиях культивирования в полиплоидных клетках ElA+cHa-ras супрессируется программа спонтанной апоптотической гибели. В результате последовательных реклонирований трансформантов ElA+cHa-ras, экспрессирующих р53 дикого типа, мы отселектировали тетраплоидную популяцию клеток, в которой исчезает спонтанная апоптотическая гибель (рис.8А, Б). Однако, р53 и Ha-ras, по-видимому, не участвуют в подавлении программы апоптоза в клетках ElA+cHa-ras в стандартных условиях культивирования, поскольку уровень экспрессии их в реклонах не меняется по сравнению с родительской линией. Возможно, отсутствие нуклеосомной фрагментации в реклонах ElA+cHa-ras может быть связано с инактивацией OGA-фактора (oncogene generated activity), который продуцируется в El А-экспрессирующих клетках, в том числе в Е1А+Е1В, где апоптоз in vivo полностью супрессирован. Однако, in vitro экстракты из El А-экспрессирующих клеток способны индуцировать фрагментацию ДНК в изолированных ядрах нормальных клеток (Fearnhead et al., 1997.).

Апоптотическая гибель клеток ElA+cHa-ras. содержащих р53 дикого типа, зависит от плотности клеточной культуры в момент повреждения. Антипролиферативное действие экзогенного р53 18

дикого типа в клетках El A+cHa-ras, экспрессирующих р53 в нативиой конформации, зависит от плотности культуры. Так, введение экзогенного р53 в клетки El A+cHa-ras с высокой плотностью не приводит к подавлению эффективности клонирования, напротив эффективность клонирования плотной культуры El A+cHa-ras с трансфицированнымр53 дикого типа выше по сравнению с контролем в 1.7 раза. В связи с этим мы провели анализ апоптотической гибели последействия ДНК-повреждающих агентов методом клоногенной выживаемости в клетках Е1А+сНа-ras в зависимости от плотности культуры. Было обнаружено, что после у-облучения клоногенная выживаемость клеток El A+cHa-ras выше в плотной культуре, тогда как после культивирования на среде с низким содержанием сыворотки клоногенная выживаемость напротив вышев редкой культуре. По-видимому, супрессия апоптоза в плотной культуре трансформантов El A+cHa-ras после у-облучения может быть связана с подавлением функций р53 дикого типа (например, инактивирование его клеточными белками), который, как известно, является одним из главных регуляторов программы апоптоза в ответ на повреждения ДНК. Отсутствие супрессии апоптотической гибели в плотной культуре ElA+cHa-ras после культивирования на бессывороточной среде, по-видимому, в первую очередь, связано не с подавлением функции р53, а с дефицитом ростовых факторов и факторов выживания. Следовательно, в трансформантах El A+cHa-ras, содержащих в основном р53 дикого типа, программа апоптотической гибели является доминантной, и повреждающее воздействие у-облучения и культивирования на бессывороточной среде способны лишь усилить её, но не переключить на программу остановки в G1/S фазе клеточного цикла.

Таким образом, введение в нормальные эмбриональные фибробласты крысы онкогена ElAadS приводит к дерегуляции событий клеточного цикла и активации проапоптотической программы. Е1А-иммортализованные клетки не способны после повреждения останавливаться в контрольных точках G1/S и G2/M после действия ДНК-повреждающих агентов и удаления ростовых факторов сыворотки независимо от статуса белка р53. Комплементация ElAad5 с онкогеном cHa-ras приводит к полной морфологической трансформации клеток без подавления апоптотической программы также независимо от статуса р53. Однако, комплементация ElAadS с антиапоптотическим геном El В 19 кД супрессирует апоптоз и одновременно восстанавливает их способность регулировать остановку в G1/S и G2/M точках контроля в линиях, экспрессирующих р53 дикого типа. Следовательно, лроапоптотическая активность ElAad5 и его способность

дерегулировать прохождение клеток по циклу могут модулироваться при трансформации типом комплементирующего онкогена. Это позволяет использовать полученную нами панель Е1А-иммортализованных и трансформированных линий для изучения клеточных мишений, ответственных за регуляцию клеточной пролиферации и апоптоз, с целью разработки новых подходов к уничтожению опухолевых клеток.

ВЫВОДЫ

1. В иммортализованных линиях, полученных переносом в клетки REF онкогена ElAad5( 12S+13S) и продукта его сплайсинга Е1А12S, тумор-супрессорный белок р53 присутствует как в дикой (p53wt), так и в мутантной (p53mt) конформациях и локализован во всех линиях в ядре.

2. Клетки, иммортализованные EIA12S, сохраняют способность останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла после действия ДНК-повреждающих агентов, тогда как введение полного района Е1А( 12S+13S) лишает их способности останавливаться в цикле после повреждения ДНК. Для запуска программы апоптоза ДНК-повреждающими агентами в Е1А-иммортализованных клетках достаточно присутствия только E1A12S онкобелков и апоптоз в иммортализованных клетках не зависит от статуса белка р53.

3. Трансформанты Е1А+Е1В, полученные комплементацией онкогена ElAad5 с геном Е1В 19 кД, аналогом клеточного антиапоптотического гена bcl-2, обладают устойчивостью к действию ДНК-повреждающих агентов независимо от конфориационного состояния белка р53 и не гибнут апоптозом в диапозоне исследованных доз после у-облучения.

4. Клеточная линия Е1А+Е1В, полученная через фокусы морфологической трансформации, теряет способность останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла последействия ДНК-повреждающих агентов, тогда как трансформанты Е1А+Е1В, полученные селекцией на генетицине, останавливаются в G1/S после действия ДНК-повреждающих агентов.

5. Трансформанты ElA+cHa-ras, полученные селекцией через фокусы морфологической трансформации, экспрессируют р53 как в нативной, так и в мутантной конформациях и не способны к полноценной остановке в G1/S и G2/M точках контроля после повреждения ДНК. Клетки ElA+cHa-ras, содержащие р53 дикого типа, обладают повышенной чувствительностью ко всем исследованным ДНК-повреждающим агентам (у-облучение, бессывороточная среда).

6. Апоптотическая гибель трансформантов ElA+cHa-ras,

содержащих р53 дикого типа, зависит от плотности культуры в момент повреждения. Уровень апоптоза выше в редких культурах (1 х 105 клеток/ см2) после у-облучения, тогда как после удаления ростовых факторов сыворотки он выше в плотных культурах (7x105 клеток/см2).

7. В ответ на повреждения ДНК трансформанты ElA+cHa-ras, экспрессирующие р53 в нативной конформации, погибают апоптозом через процесс тетраплоидизации, тогда как в стандартных условиях культивирования в тетраплоидных клетках Е1 A+cHa-ras, содержащих р53 дикого типа, программа спонтанной апоптотической гибели супрессируется.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kurash Yu.K., Svetlikova S.B., Pospelova T.V., Pospelov V.A. Density-dependent inhibition of apoptosis induced in ElA+Ha-Ras transformed cells by serum deprivation and UV-irradiation. Abstracts of Joint. Symposium "Eleventh Annual Meeting on Oncogenes", Frederick, 1995. P. 82.

2. Pospelova T.V., Kurash Yu.K, Savel'ev A.K., Pospelov V.A. DNA-binding activity and intracellular localization of transcription factors regulated through Ras-dependent and Ras-independent pathways in REF cell transformed with ElA+Ha-Ras oncogenes. Abstracts of Joint Symposium "Cancer and the Cell Cycle", Switzerland, 1996. P. 46.

3. Кураш Ю.К., Осипов К.А., Петрова B.O., Поспелова Т.В., Поспелов В.А. Функционирование тумор-супрессорного р53-зависимого пути в фибробластах крысы, иммортализованных Е1А и трансформированных онкогенами ElA+Ha-Ras. IV Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", 1996. С.85. Санкт-Петербург, Россия.

4. Kurash Yu.K., Osipov К.А., Petrova V.O., Pospelova T.V., Pospelov V.A. Functioning the p53-Waf/Cip tumor suppressor pathway in rat embryo fibroblasts immortalizing by E1A oncogene and transformed by ElA+Ha-Ras oncogenes. Abstracts of Joint. Symposium "Cancer Genetics & Tumor Suppressor Genes", Cold Spring Harbor, 1996. P. 162.

5. Bulavin D.V., Kurash Yu.K., Pospelova T.V., Pospelov V.A. Control of G2 arrest and apoptotic death in REF cells transformed with ElA+Ha-Ras oncogenes. Abstracts of Joint. Symposium, S-Petersburg, 1997.

6. Кураш Ю.К., Розанов Ю.М., Булавин Д.В., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 1998. Анализ структуры клеточного цикла и апоптоза ElAad5-HMM0pTann30BaHHbix клеток крысы после действия ДНК-повреждающих агентов. Молекуляр. биология. Т. 32. № 2: 349-357.

7. Кураш Ю.К., Булавин Д.М., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 1998. Е1 А-индуцированный апоптоз в эмбриональных фибробластах крысы не супрессируется введением онкогена cHa-ras. Молекул.

биология. Т. 32. № 5: 1034-1035.

8. Булавин Д.В., Кураш Ю.К., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., ПоспеловаТ.В. 1998. Функционированиер53/р11Ь-зависимого пути после действия повреждающих агентов ДНК в клетках эмбриональных фибробластов крысы, трансформированных онкогенами E1A+Ha-Ras. Молекуляр. биология. Т. 32. №4:703-711.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Поспелова Т.В., Кислякова Т.В., Медведев А.В., Светликова С.Б., Поспелов В.А. . 1990. Особенности трансформированного фенотипа и экспрессия индикаторных CAT-плазмид в эмбриональных фибробластах крысы, иммортализованных Е1Аас15-онкогеном и трансформированных ElA+cHa-ras онкогенами. Цитология. Т. 32. С. 148 - 155.

2. Розанов Ю.М. Проточная цитометрия. Методы культивирования клеток.: Наука, 1987. С. 136-146.

3. Bulavin D.V., Tararova N.D., Aksenov N.D., Pospelov V.A., Pospelova Т.V. 1999. Deregulation of p53/p21Cipl/Wan pathway contributes to polyploidy and apoptosis of ElA+cHa-ras transformed cells after y-irradiation. Oncogene. 18: 5611-5619.

4. Cross S.M., Sanchez C.A., Morgan C.A., Schimkc M.K., Ramel S., Idzera R.L., Raskind W.H., and Read B.J. 1995 A p53-dependent mouse spindle checkpoint. Science. 267 .1353-1356.

5. Debbas M., and White E. 1993. Wilde-type p53 mediates apoptosis by El A, which is inhibited by E1B. Genes & Dev. 7 : 546-554.

6. Donehower L.A., Godley L.A., Aldaz C.M., Pyle R., Shi Y.-P., Pinnkel D., Gray J., Bradley A., Demina D and Varmus H.E. 1995. Deficiency of p53 accelerates mamaiy tumorigenesis in Wnt-1 transgenic mice and promotes chromosomal instability. Genes Dev. 9. 882-895.

7. El-Deiry W.S., Tokino Т., Velculescu V.E., Levy D.B., Parsons R., Trent J.M , Lin D„ Mercer W. E., Kinzler K.W. & Vogelstein B. 1993. WAF1 a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell. 75: 817825.

8. Feamiiead H. O., McCurrach M. E., O'Neill J. Lowe S.W., and Lazebnik. 1997. Oncogene-depen-dent apoptosis in extracts from drug-resistant cells. Genes & Dev. 11: 1266-1276.

9. Fukasama K., Choi Т., Kuriama R., Rulong S., and Vande Woude G.F. 1996. Abnormal centrosome amplification in the absence of p53. Science. 271: 1744-1747.

10. Han J., Sabbatini P., Perez D, Rao L., Mohda D., and White E. 1996.TheElB 19K. protein blocks apoptosis by interacting with and inhibiting the p53-inducible and death-promoting Bax protein. Genes & Dev. 10 : 461-477.

11. Hansen R. and Oren M. 1997. P53: from inductive signal to cellular effect. Curr. Opin. Gen. Dev. 7:46-51.

12. Hunter T. 1997. Oncoprotein networks. Cell. 88: 333-346

13. Kastan M.B., Onyekwere 0., Sidransky D., VogelsteinB., and Craig R. 1991. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res. 51 : 630- 631.

14. La Thangue N. B. 1994. DRTF/E2F : an expanding family of heterodimeric transcription factors amlicated in cell-cycle control. Trends. Biochem. Sci. 19 : 108-114.

15. Lowe S., and Ruley H.E. 1993. Stabilization of the p53 tumor suppressor is induced by adenovirus-5 El A and accompanies apoptosis. Genes &. Dev. 7 : 535-545.

16. Moll U.M., Riou G., and Levine A.J. 1992. Two distinct mechanisms alter p53 in breast cancer: Mutation and nuclear exclusion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 7262-7266.

17. Rao L., Debbas M., Sabbatini P., Hockenbery D., Korsmeyer S., and White E 1992. The adenovirus E1A proteins induce apoptosis which is inhibited by E1B19 К and Bcl-2 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 89:7742-7746.

18. Ruley H.E. 1983. Adenovirus early region 1A enables viral and cellular transforming genes to transform primary cell in culture. Nature. 304 : 602-606.

19. Serrano M., Lin A.W., McCurrach M.E., Beach D., and Lowe S.W. 1997. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a. Cell. 88 : 593-602.

20. Sherr C.J. 1996. Cancer cell cycles. Science. 274 : 1672-1677.

21. Teodoro J., Gordon C., Shore G., and Branton P. 1995. Adenovirus E1A proteins induce apoptosis by both p53-dependcnt and p53-independent mechanisms. Oncogene. 11 : 467-474.

22. Vikhanskaya F.. Erha E.. D'incalci M., and Broggini M. 1994. Introducion of wilde-type p53 in a human ovarian cancer cell line not expressing endogenous p53. Nucleic Acids Res. 22 : 1012-1017.

23. Waldman Т., Lengauer C., Kinzler R.W. & Vogelstein B. 1996. Uncoupling of S phase and mitosis induced by anticancer agents in cells lacking p21. Nature. 381 : 713-716.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кураш, Юлия Константиновна

ВВЕДЕНИЕ.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Теоретическое и практическое значение работы.

Апробация работы.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Функции ElAad5 района в процессе иммортализации и трансформации первичных клеток грызунов.

1.2. Роль El А в активации программы апоптотической гибели.

1.3. Роль Е1В 19 кДа в супрессии ElА-индуцированного апоптоза и трансформации.:.,. t.

1.4. Роль Ras онкогена в супрессии апоптотической гибели.

1.5. Роль тумор-супрессорных белков р53 и pRb в трансформации клеток.

1.6. Роль р53 в осуществлении блоков G1/S и G2/M.

1.7. Роль р53 в реализации программы апоптотической гибели.

1.8. Регуляция транскрипционной активности р53 тумор-супрессорными белками семейства ARF.

1.9. Кооперация онкогенов необходима для трансформации первичных эмбриональных фибробластов грызунов.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1.Метод получения иммортализованных и трансформированных линий из эмбриональных фибробластов крысы.

2.2.Метод культивирования клеток.

2.3. Оценка антипролиферативного действия р53 дикого типа и Waf-1 в трансформантах ElA+cHa-ras.

2.4. Получение последовательных реклонов.

2.5. Гамма—облучение клеток и облучение клеток УФ.

2.6. Метод проточной цитофлуориметрии и двух-параметрической проточной цитофлуориметрии с использованием ВгсШ.

2.7. Метод выделения внехромосомной ДНК.

2.8. Электрофоретическое исследование внехромосомной ДНК.

2.9. Метод приготовления частичного гидролизата ядер ЯЕБ с помощью микрококковой нуклеазы.

2.10. Методы количественной оценки апоптотической гибели.

2.11. Исследование состояния белка р53 методом имму нопреципитации.

2.12. Исследование связывания белков семейства Шэ с онкобелками Е1А в трансформантах Е1 А+сНа-гаБ после действия ДНК-повреждающих агентов методом иммунопреципитации.

2.13. Иммунофлуоресценция.

Глава 3. Результаты.

3.1 .Анализ структуры клеточного цикла и апоптотической гибели в нормальных и Е1А-иммортализованных фибробластов крысы после действия ДНК-повреждающих агентов.

3.1.1.Анализ статуса белка р53 в ЙЕТ и Е1А-иммортализованных клетках.

3.1.2. Цитофлуориметрический анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла в популяции КЕБ и Е1А-иммортализованных клеток после действия ДНК-повреждающих агентов.

3.1.3. Электрофоретический анализ апоптотической гибели в ЛЕГ и Е1 А-иммортализованных клетках после действия ДНК-повреждающих агентов.

3.1.4. Количественная оценка гибели Е1 А-иммортализованных клеток после действия у-облучения, облучения УФ и культивирования на среде с низким содержанием ростовых факторов сыворотки.

3.1.5. Отсутствие 01/8 блока в Е1А(128+138)-иммортализованных клетках после действия ДНК-повреждающих агентов не зависит от статуса белка р53.

3.1.6. Е1А-индуцированный апоптоз в клетках Е1А(128+138) не зависит от статуса белка р53.

3.2. Анализ структуры клеточного цикла и апоптотической гибели в трансформированных клеточных линиях Е1А+Е1В(19 кДа) после действия ДНК-повреждающих агентов.

3.2.1. Комплементация Е1А с продуктом гена Е1В (19 кДа) су дрессирует Е1А-опосредованный апоптоз.

3.2.2. Анализ статуса белка р53 в трансформантах Е1А+Е1В(р19) и Е1А+Е1В(р21).

3.2.3. Анализ структуры клеточного цикла в трансформированных клеточных линиях Е1А+Е1В(р21) и Е1А+Е1В(р19) после действия ДНК-повреждающих агентов.

3.2.4. Продукт гена Е1В(19 кДа) супрессирует апоптотическую гибель трансформированных клеток после у-облучения и культивирования на бессывороточной среде.

3.3. Анализ структуры клеточного цикла и апоптотической гибели в транформированных клеточных линиях Е1А+сНа-га8 после действия ДНК-повреждающих агентов.

3.3.1. Кооперация Е1А с онкогеном сНа-гаБ не подавляет апоптоз, характерный для Е1А-иммортализованных клеток.

3.3.2. Спонтанный апоптоз, тестируемый по фрагментации внехромосомной ДНК в Е1А+сНа-газ трансформантах, не зависит от статуса белка р53.

3.3.3. Апоптоз, индуцируемый ДНК-повреждающими агентами, в трансформантах ElA+cHa-ras зависит от статуса белка р53.

3.3.4. Остановка ElA+cHa-ras-трасформированных клеток в G1/S фазе клеточного цикла после у-облучения и культивирования на бессывороточной среде не зависет от статуса белка р53.

3.3.5. Процесс тетраплоидизации в трансформантах ElA+cHa-ras зависит от статуса р53.

3.3.6. Изучение связывания белков семейства pRb с онкобелками Е1А в трансформантах Е1А+ cHa-ras после действия ДНКповреждающих агентов.

3.4. Анализ структуры клеточного цикла и апоптотической гибели в трансформированной клеточной линии ElA+cHa-ras (клон 10), экспрессирующей р53 дикого типа, после действия ДНК-повреждающих агентов.

3.4.1. Оверэкспрессия экзогенногор53 дикого типа и оверэкспрессия экзогенного Waf-1 подавляют эффективность клонирования в трасформантах ElA+cHa-ras (клон 10).

3.4.2. Цитофлуориметрический анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла в трансформантах ElA+cHa-ras (клон 10) после действия различных повреждающих воздействий.

3.4.3. Количественная оценка гибели клеток ElA+cHa-ras (клон 10) в зависимости от плотности клеточной культуры.

3.4.4. Серия последоваельных реклонирований трансформанта ElA+cHa-ras (клон 10) супрессирует Е1А-индуцированный, но не р53-зависимый апоптоз.

Глава 4. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ клеточного цикла и апоптотической гибели в E1Aad5 иммортализованных и трансформированных фибробластах крысы после действия повреждающих агентов"

Известно, что к числу основных отличий опухолевых клеток от нормальных относится их способность к неконтролируемой пролиферации и генетическая нестабильность. Это может быть связано с изменением системы проведения сигналов с клеточной поверхности в ядро, так как в настоящее время показано, что основные компоненты этого пути являются продуктами клеточных протоонкогенов (Ha-ras, ту с, fas и другие), превращение которых в онкогены в ходе канцерогенеза конститутивно активирует сигнальные пути в отсутствии ростовых факторов (Hunter, 1997.). В нормальных клетках активация Ras-Raf-MAP-киназного пути зависит от добавления и удаления ростовых факторов. В отсутствие внешних сигналов нормальные клетки останавливаются в Gl /GO, в так называемой точке рестрикции (restriction point) (Sherr, 1996.). Стимуляция покоящихся клеток ростовыми факторами приводит к временной индукции Ras-Raf-MAP-киназного пути и клетка вступает в цикл.

С другой стороны, в настоящее время накоплены данные о существовании другой системы строгого контроля за клеточной пролиферацией, которая связана с функционированием тумор-супрессорных генов р53 и pRb. Белки р53 и pRb не регулируют в норме прохождение клеток по циклу, а функционируют в основном после повреждения генетического материала клетки.

В нормальных клетках повреждение ДНК приводит к остановке клеток в G1/S и G2/M фазах клеточного цикла, в так называемых точках контроля (check points). Блоки Gl/S и G2/M необходимы для полноценной репарации поврежденной ДНК, после которых клетка вступает в цикл. Если же повреждения, нанесенные ДНК, настолько серьезны, что репарация невозможна, то в клетке реализуется программа апоптотической гибели.

В экспериментах на мышах генотипа р53-/~, а также на клеточных линиях, полученных из них, было обнаружено, что р53 является одним из главных регуляторов генетической стабильности клетки. Его отсутствие через 3-4 пассажа культивирования эмбриональных фибробластов in vitro приводит к полиплоидизации и нарушению кариотипической стабильности (Fukasama et al., 1996), а также индуцирует формирование опухолей у 100% трансгенных мышей in vivo в течение 3-6 месяцев после рождения (Done-hower et al., 1992). Показано, что в 50% опухолей человека р53 мутирован, делетирован или имеет цитоплазматическую локализацию (Moll et al., 1992). Как предполагают, появление генетически дефектных клеток в первую очередь связано с неполноценной репарацией поврежденной ДНК в отсутствие функционально активного р53.

В нормальных клетках тумор-супрессорный белок р53, обладающий свойствами транскрипционного фактора, активируется после повреждения ДНК и индуцирует на уровне транскрипции ряд генов, главными из которых являются p21/Waf-l и Ьах. Продукт гена p21/Waf-l является универсальным ингибитором G1-фазных циклин-зависимых киназ (El-Deiry et al., 1993.), который индуцирует остановку клеток в G1/S фазе клеточного цикла, тогда как проапоптотический ген Ьах необходим для реализации программы апоптоза (Han et al., 1996). Было показано, что р53-дефицитные клетки и клетки с мутантным р53 становятся устойчивыми к ДНК-повреждающим агентам и теряют способность реализовать программу апоптотической гибели клеток в ответ на повреждения ДНК. В связи с этим представляет огромную важность изучение функционирования р53зависимого тумор-супрессорного пути в опухолевых клетках, экспрессирующих р53 дикого типа.

Ранний район аденовируса типа 5 человека - ElAad5, известный как ядерный онкоген, иммортализует первичные клетки грызунов с низкой частотой, так как вызывает в них апоптоз (Debbas and White 1993.). Предполагают, что при комплементации ElAad5 с Е1В или cHa-ras происходит супрессия апоптоза и полная морфологическая трансформация (Rao et al., 1992; Ruley H.E., 1983.). В основе иммортализующего и трансформирующего действия онкогена ElAad5 лежит его способность связывать клеточные белки, негативно участвующие в регуляции клеточной пролиферации, в частности белки семейства Rb: р105, р107, pi30. Вследствие этого взаимодействия происходит высвобождение транскрипционных факторов семейства E2F, которые необходимы для активации генов, определяющих вступление и прохождение клеток по S-фазе клеточного цикла (La Thangue, 1994.).

Продукт гена-супрессора р53 не является непосредственной мишенью действия онкогена El А, в связи с чем можно предполагать, что он сохраняет свои функции в клетках, иммортализованных и трансформированных аденовирусными онкогенами. Однако, El А способен стабилизировать р53 и изменять его трансактивационную активность (Debbas and White 1993.). Повышенная экспрессия белка р53 приводит к реализации программы апоптотической гибели при иммортализации клеток El А, но во всех случаях экспрессия гена Е1В супрессирует апоптоз в El А-содержащих клетках за счет определенных свойств белковых продуктов Е1В. Вирусный белок Е1В55кДа инактивирует белок р53 дикого типа и тем самым спасает клетки от апоптотической гибели при трансформации их онкогеном El А. Другой сплайс-продукт вирусного гена El В 19 кДа, является вирусным аналогом клеточного антиапоптотического гена bel-2 и также приводит к подавлению апоптотической программы при трансформации клеток El A (Rao et al., 1992.).

Таким образом, для успешной трансформации первичных клеток грызунов одним из необходимых этапов является инактивирование белковых продуктов тумор-супрессорных генов р53 и pRb, главной функцией которых является поддержание генетической стабильности через осуществление блоков G1/S и G2/M и запуск апоптоза. Поскольку, онкобелки El А не взаимодействуют с продуктами гена-супрессора р53, Е1А-экспрессирующие клетки являются адекватной моделью для изучения закономерностей функционирования р53-зависимого тумор-супрессорного пути в трансформированных клетках.

Цели и задачи исследования.

Ь,елью данной работы было изучение способности ElAad5~ иммортализованных и трансформированных клеточных линий, полученных из эмбриональных фибробластов крысы переносом онкогенов, осуществлять остановку в G1/S и G2/M контрольных точках и реализовать программу апоптотической гибели после повреждения ДНК в зависимости от конформационного состояния белка р53.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

Е1А+Е1В и ElA+cHa-ras, селектированных из REF котрансфекцией комплементирующих онкогенов.

2. Сравнить функциональную полноценность р53/Шэ-зависимого пути в Е1А-иммортализованных и трансформированных линиях по способности клеток останавливаться в G1/S и G2/M точках контроля после действия различных ДНК-повреждающих агентов в зависимости от статуса белка р53.

3. Провести анализ закономерностей апоптотической гибели в клетках REF, иммортализованных клеточных линиях E1A12S и El A(12S+13S), в трансформантах Е1А+Е1В и ElA+cHa-ras после действия различных по механизму действия ДНК-повреждающих агентов в зависимости от конформационного состояния белка р53.

Научная новизна работы.

Показано, что комплементация ElAad5 с антиапоптотическим геном El В 19кД полностью супрессирует программу апоптоза после действия ДНК-повреждающих агентов независимо от способности клеток останавливаться в цикле и способа селекции клеточных линий.

Впервые показано, что независимо от статуса белка р53 комплементация El А с онкогеном cHa-ras не приводит к подавлению El А-зависимого апоптоза. Трансформанты ElA+cHa-ras теряют способность останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла независимо от конформационного состояния белка р53, тогда как уровень апоптоза после повреждения ДНК в клетках ElA+cHa-ras определяется статусом белка р53. В трансформантах ElA+cHa-ras, содержащих р53 дикого типа, выявлена корреляция между плотностью культуры в момент повреждения и уровнем апоптотической гибели.

Теоретическое и практическое значение работы.

Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего углубленного изучения закономерностей прохождения клеток по циклу и механизмов запуска программы апоптоза в опухолевых клетках и служить теоретической основой для разработки проапоптотической стратегии в лечении опухолей.

Материалы работы могут быть использованы в курсе лекций по клеточной биологии и канцерогенезу в высших учебных заведениях с биологической и медицинской специализацией.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Основные положения работы доложены и обсуждены на симпозиумах "Eleventh Annual Meeting on Oncogenes"(Frederick, 1995), "Cancer and the Cell Cycle" (Switzerland, 1996), IV Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 1996), "Cancer Genetics & Tumor Suppressor Genes" (Cold Spring Harbor, 1996), IX Международном симпозиуме физиологов (Санкт-Петербург, 1997) и на заседании совместного научного семинара Отдела клеточных культур, Лаборатории молекулярных основ дифференцировки клеток и Лаборатории радиационной цитологии Института цитологии РАН 02 марта 2000 г.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Кураш, Юлия Константиновна

Выводы.

1. В иммортализованных линиях, полученных переносом в клетки REF онкогена ElAad5(12S+13S) и продукта его сплайсинга E1A12S, тумор-супрессорный белок р53 присутствует как в дикой (p53wt), так и в мутантной (p53mt) конформациях и локализован во всех линиях в ядре.

2. Клетки, иммортализованные E1A12S, сохраняют способность останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла после действия ДНК-повреждающих агентов, тогда как введение полного района E1A(12S+13S) лишает их способности останавливаться в цикле после повреждения ДНК. Для запуска программы апоптоза ДНК-повреждающими агентами в Е1А-иммортализованных клетках достаточно присутствия только E1A12S онкобелков и апоптоз в иммортализованных клетках не зависит от статуса белка р53.

3. Трансформанты Е1А+Е1В, полученные комплементацией онкогена ElAad5 с геном El В 19 кД, аналогом клеточного антиапопто-тического гена bcl-2, обладают устойчивостью к действию ДНК-повреждающих агентов независимо от конформационного состояния белка р53 и не гибнут апоптозом в диапозоне исследованных доз после у-облучения.

4. Клеточная линия Е1А+Е1В, полученная через фокусы морфологической трансформации, теряет способность останавливаться в G1/S фазе клеточного цикла после действия ДНК-повреждающих агентов, тогда как трансформанты Е1А+Е1В, полученные селекцией на генетицине, останавливаются в G1/S после действия ДНК-повреждающих агентов.

138

5. Трансформанты ElA+cHa-ras, полученные селекцией через фокусы морфологической трансформации, экспрессируют р53 как в нативной, так и в мутантной конформациях и не способны к полноценной остановке в G1/S и G2/M точках контроля после повреждения ДНК. Клетки El A+cHa-ras, содержащие р53 дикого типа, обладают повышенной чувствительностью ко всем исследованным ДНК-повреждающим агентам (у-облучение, бессывороточная среда).

6. Апоптотическая гибель трансформантов El A+cHa-ras, содержащих р53 дикого типа, зависит от плотности культуры в момент повреждения. Уровень апоптоза выше в редких культурах (1x105 клеток/см ) после у-облучения, тогда как после удаления ростовых факторов сыворотки он выше в плотных культурах (7x105 клеток/см2).

7. В ответ на повреждения ДНК трансформанты El A+cHa-ras, экспрессирующие р53 в нативной конформации, погибают апоптозом через процесс тетраплоидизации, тогда как в стандартных условиях культивирования в тетраплоидных клетках El A+cHa-ras, содержащих р53 дикого типа, программа спонтанной апоптотической гибели су-прессируется.

139

В заключение хочу выразить признательность и благодарность своему научному руководителю к.б.н. Татьяне Викторовне Поспеловой, которая помогала мне все эти годы и оказывала всестороннею поддержку. Хочу также выразить свою признательность заведующему Отделом клеточных культур д.б.н., профессору Георгию Петровичу Пинаеву, заведующему Лаборатории молекулярных основ дифферен-цировки клеток д.б.н., профессору Валерию Анатольевичу Поспелову и всем сотрудникам Отдела клеточных культур и Лаборатории молекулярных основ дифференцировки клеток. Хочу также выразить свою признательность Николаю Аксенову и Юрию Михайловичу Розанову, которые оказали мне огромную помощь в выполнении этой работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кураш, Юлия Константиновна, Санкт-Петербург

1. Кураш Ю.К., Розанов Ю.М., Булавин Д.В., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 1998. Анализ структуры клеточного цикла и апоптоз Е1 Аас15-иммортализованных клеток крысы после действия ДНК-повреждающих агентовю Молекуляр. биология. 32. № 2 : 349-357.

2. Кураш Ю.К., Булавин Д.М., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 1998. Е1А-индуцировнный апоптоз в эмбриональных фиброблстх крысы не супрессируется введением онкогена cHa-ras. Молекул, биология. 32. № 5: 1034-1035.

3. Kurash Yu.K., Svetlikova S.B., Pospelova T.V., Pospelov V.A. Density-dependent inhibition of apoptosis induced in ElA+Ha-Ras transformed cells by serum deprivation and UV-irradiation. . Abstracts of Joint. Symposium Frederick, 1995. P. 82.

4. Bulavin D.V., Kurash Yu.K., Pospelova T.V., Pospelov V.A. Control of G2 arrest and apoptotic death in REF cells transformed with ElA+Ha-Ras oncogenes. Abstracts of Joint. Symposium, S-Petersburg, 1997.

5. Agarwal М., Agarwal A. Taylor W. Stark G. 1995. Р53 controls both the G2/M and the G1 cell cycle checkpoints and mediates reversible growth arrest in human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 8493-8497.

6. Aladjem M.I., Spike B.T., Rodewald I.W., Hope T.J., Klemm M., Jae-nisch R., and Wahl G.M. 1998. Curr. Biol. 8: 145-155.

7. Angel P., and Karin M. 1991 The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation. Biochem. Biophys. Acta. 1072 : 129-157.

8. Arany Z., Sellers W.R., Livingston D.M., & Eckner R. 1994. E1A associated p300 and CREB-associated CBP belong to a concerved family of coactivators. Cell. 77 : 799-800.

9. Arany Z., Newsome D., Oldread E., Livingston D.M., & Eckner R. 1995. A amily of transcriptional adaptor proteins targeted by El A oncoprotein. Nature. 374 : 81-84.

10. Arends M.J., Morris R.G., Wyllie A.H. 1990.Apoptosis : The role of en-donuclease. Am. J. Pathol. 136 : 593-608.

11. Attardi L., Lowe S., Brugarolas J., and Jacks T. 1996. Transcriptional activation by p53, but not induction of the p21 gene, is essential or onco-gene-mediated apoptosis. EMBO J. 15 : 3693-3701.

12. Avantaggiati M.L., Ogryzko V., Gardner K., Giordano A., Levine A.S., and Kelly K. 1997. Recruitment of p300/CBP in p53-dependent signal pathways. Cell. 89 :1175-1184.

13. Barak Y., Juven T., Haffner R., and Oren M. 1993. Mdm2 expression is indused by wild type p53 activity. EMBO J. 12 : 461-468.

14. Barbeau D., Charbonneau R., Wahlen G., Bayley T., and Branton P.E. 1994. Functional interactions within adenovirus El A protein complexes. Oncogene. 9 : 359-373.

15. Barret C.B., Schroetke R.M., van der Hoorn F.A., Nordeen S.K., and Mailer J.L. 1990. Ha-Ras (Val-12, Thr-59) activates S6 kinase and p34

16. CDC2) kinase in Xenopes oocytes : Evidence or c-Mos (Xe)-dependent and independent pathways. Mol. Cell. Biol. 10 : 310-315.

17. Baudier J., Delphin C. Grunwald D., Khochbin S., and Lawrence J.J. 1992. Characterization of tumor suppressor protein p53 as a protein kinase C substrate and a SlOOb-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 11627-11631.

18. Beijersbergen R.L., Carlee L., Kerkhoven R. M., and Bernards R. 1995. Regulation of the retinoblastoma protein-related pi07 by G1 cyclin complexes. Genes Dev. 9 : 1340-1353.

19. Beaudry G.A., Bertelsen A.H., and Sherman M.I. 1996. Curr. Opin. Bio-technol. 7: 592-600.

20. Bos J.L. 1989. Ras oncogenes in human cancer; a review. Cancer Res. 49: 4682-4689.

21. Bounlanger P.A., and Blair G.E. 1991. Expression and interactions of human adenovirus oncoproteins. Biochem. J. 275 : 281-299.

22. Branton P. E., Bayley S. T., Graham F. L. 1985. Transformation by human adenoviruses. Biochim. Biophys. Acta. 780 : 67-94.

23. Branton P.E., Bayley S.T., and Graham F.L. 1986. Transformation by human adenoviruses. Cancer Surv. 780 : 67-94.

24. Bulavin D.V., Tararova N.D., Aksenov N.D., Pospelov V.A., Pospelova T.V. 1999. Deregulation of p53/p21Cipl/Wafl pathway contributes to polyploidy and apoptosis of ElA+cHa-ras transformed cells after y-irradiation. Oncogene. 18: 5611-5619.

25. Buckbinder L., Talbott R., Valesco-Miguel S., Takenaka I., Faha B., Seizinger B.R., and Kley N. 1995. Induction of growth inhibitor IGF-binding protein 3 by p53. Nature. 377: 646-649.

26. Castedo M., Hirsch T., Susin S.A., Zamzani N., Marchetti P., Macho A., Kroemer G. 1996. Sequential acquisition of mitochondrial and plasma membrfne alterations during early lymphocyte apoptosis. J. Immunol. 157 : 512-521.

27. Catchpool D.R., and Stewart B.W. 1993. Etoposide-induced cytotoxicity in two human T-cell leukemic line : Delayed loss of membrane permeability rather than DNA fragmentation as an indicator of programmed cell death. Cancer Res. 53 : 4287-4296.

28. Cavenee W.K., Dryja T.P., Phillips R.A., Benedict W.F., Godbout R., Gallie B.L., Murphree A.L., Strong L.C., and White R.L. 1983. Expression of recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastoma. Nature. 305 : 779-784.

29. Chen C-Y. and Faller D.V. 1996. Phosphorylation of Bcl-2 protein and association with p21ras in ras-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 271: 23762379.

30. Chen C.J., Oliner J.D., Zhan Q., Fornace A.J., Vogelstein B., and Kastan M.B. 1994. Interaction between p53 and MDM2 in mammalian cell cycle checkpoint pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91 : 2684-2688.

31. Chen X., Ko L.J., Jayraman L., Prives C. 1996. P53 levels, functional domains, and DNA damage determine the extent of the apoptotic response of tumor cells. Genes Dev. 10 : 2438-2451

32. Chiou S.K., Tseng C.C., Rao R„ and White E. 1994. Functional complementation of adenovirus E1B 19K protein with Bcl-2 in the inhibition of apoptosis in inected cells. J. Virol. 68: 6553-6566.

33. Chiou S.K., and White E. 1997. P300 binding by E1A cosegregates with p53 induction but is dispensable for apoptosis. J. Virol. 71: 3515-3525.

34. Chiou S.K., and White E. 1998. Inhibition of ICE-like proteases inhibits apoptosis and increases virus production during adenovirus infection. Virology. 244:108-118.

35. Cho Y., Gorina S., Jeffrey P.D., and Pavletich N.P.1994. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: undestanding tumorigenic mutations. Science. 265: 346-355.

36. Chomczynski P., Sacchi N. // Analyt. Biochem. 1987. V. 162. P. 156159.

37. Cohen G.M., Su X-M., Snowden R.T., Dinsdale D., and Skilleter D.N. 1992. Key morphological features of apoptosis may occur in the abcence of internucleosomal DNA ragmentation. Biochem. J. 286 : 331-334.

38. Cobrinik D., Whyte P., Peeper D.S., Jacks T., and Weinberg R.A. 1993. Cell cycle-specific associstion of E2F with pi30 ElA-binding protein. Genes Dev. 7 : 2392-2404.

39. Compton M.M. 1992. A biochemical hallmark of apoptosis : Internu-cleosomal degradation of the genome. Cancer Metast. Rev. 11 : 105-119.

40. Cox L.S., Midgley C.A., and Lane D.P. 1994. Xenopus p53 is biochemically similar to the human tumor supressor protein p53 and is induced upon DNA damage in somatic cells. Oncogene. 9 : 2951-2959.

41. Cross M., and Dexter T.M. 1991. Growth factors in development, transformation, snd tumorigenesis. Cell. 64.

42. Debbas M., and White E. 1993. Wilde-type p53 mediates apoptosis by El A, which is inhibited by E1B. Genes & Dev. 7 : 546-554.

43. Del Peso L., Gonzalez-Garcia M., Page C., Herrera R., and Nunez G. 1997. Interleukin-3-induced phosphorylation of BAD through the protein kinase Act. Science. 278: 687-689.

44. Demers G.W., Foster S.A., Halbert C.L., and Galloway D.A. 1994. Growth arrest by induction o p53 in DNA damaged keratinocytes is bypassed by human papillomavirus 16 E7. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 : 4382-4386.

45. Deng C., Zhang P., Harper W., Elledge S.J., Leder P. 1995. Mice lacking p21CIP/WAFl undergo normal development, but are defective in G1 checkpoint control. Cell. 82.: 675-684.

46. Derijard B., Hibi M., Wu L.-H., Barret B., Su B., Deng T., Karin M., and Davis R.J. 1994 JNK1 : A protein kinase stimulated by UV light and Ha-Ras that binds and phosphorylates the c-Jun activation domain. Cell. 76 : 1-20.

47. Diaz-Meco M.T., Municio M.M., Frutos S., Sanchez P., Lozano J., Sanz L., and Moscat J. 1996. The product of par-4, a gene induced during apopto-sis, interacts selectively with the atypical isoforms of protein kinase C. Cell. 86: 777-786.

48. Dulic V., Kaufmann W.K., Wilson S.J., Tlsty T.D., Lees E., Harper J.W., Elledge S.J., and Reed S.I. 1994. P53-dependent ingibition of cyclin-dependent kinase activities in human fibroblasts during radiation-induced G1 arrest. Cell. 76 : 1013-1023.

49. Dyson N., Guida P., Munger K., and Harlow E. 1992. Homologous sequences in adenovirus El A and human papillomavirus E7 proteins mediate interaction with the same set of cellular proteins. J. Virol. 66 : 6893-6902.

50. Dyson N., and Harlow E. 1992. Adenovirus E1A tagets key regulators of cell proliferation. Cancer Surv. 12:161-195.

51. Egan C., Yee S.-P., Ferguson B., Rosenberg M., and Branton P.E. 1987. Binding of cellular polypeptides to human adenovirus type 5 El A proteins in Escherichia coli. Virology. 160 : 292-296.

52. E1-Deiry W.S., Tokino T., Velculescu V.E., Levy D.B., Parsons R., Trent J.M., Lin D., Mercer W. E., Kinzler K.W. & Vogelstein B. 1993. WAF1 a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell. 75: 817-825.

53. Endersen P.C., Prytz P.C., and Aarbakke J. 1995. A new flpow cytometric method for discrimination of apoptosis cells and detection of their cell cvycle specificity through staining of F-actin and DNA. Cytometry. 20 : 162-171.

54. Enari M., Hase A. and Nagata S. 1995. Apoptosis by a cytosolic extract from Fas-activated cells. EMBO J. 14: 5201-5208.

55. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A. and Nagata S. 1998. A caspase-activated Dnase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391: 43-50.

56. Ewen M.E., Wing Y., Lawrence J.B., & Livingston D.M. 1991. Molecular cloning, chromosomal mapping, and expression of the DNA or pi 07, a retinoblastoma gene product-related protein. Cell. 66 : 1155-1164.

57. Fadok V.A., Voelker D.R., Cammpbell P.A., Cochen J.J. Bratton D.L., and Henson P.M. 1992. Exposure of phosphatidylscrine on the surfase of apoptotic lymphocytes triggers spesific recognition and removal by macrophages. J. Immunol. 148 : 2207-2216.

58. Faha B., Harlow E., & Lees E. 1993. The adenovirus ElA-associated kinase consists o cyclin E-p33cdk2 and cyclin A-p33cdk2. J. Virol. 67 : 24562465.

59. Farrow S.N., White J.H.M., Martinou I., Raven T., Pun K-T., Grinham C.J., Martinou J.-C., and Brown R. 1995. Cloning of bcl-2 homologue by interaction with adenovirus E1B 19K. Nature. 374 : 731-733.

60. Fearnhead H. O., McCurrach M. E., O'Neill J. Lowe S.W., and Lazebnik. 1997. Oncogene-dependent apoptosis in extracts from drug-resistant cells. Genes & Dev. 11: 1266-1276.

61. Feid L.A., Urano T., Cantor S. 1996. Evidence for a ras/rel signaling cascade. Trend Biochem Sci. 21: 438-441.

62. Fukasama K., Choi T., Kuriama R., Rulong S., and Vande Woude G.F. 1996. Abnormal centrosome amplification in the absence of p53. Science. 271: 1744-1747.

63. Fukasawa K., and Vande Woude G.F. 1997. Synergy between the mos/mitogen-activated protein kinase pathway and loss of p53 function in transformation and chromosome instability. Mol. Cell Biol. 17: 506-518.

64. Fukasawa K., Rulong S., Resau J., Pinto da Silva P. And Woude G.F. 1995. Overexpression of mos oncogene product in Swiss 3T3 cells induces apoptosis preferentially during S-phase. Oncogene. 10: 1-8.

65. Fynlay C.A., Hids P.W., and Levin A.J. 1989. The p53 protooncogene can act as a supressor of transformation. Cell. 57 : 1083-1093.

66. Gannon J.V. and Lane D.P. 1991. Nature. 349: 802-806.

67. Geisberg J.V., Lee W.S., Berk A.J., and Ricciardi R.P. 1004. The zinc finger region of adenovirus El A transactivating domain complexes with the TATA box binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 : 2488-2492.

68. Giorgano A., McCall C., Whyte P., and Franza B.RJr. 1991. Human cy-clin A and the retinoblastoma protein interact with similar but distinguishable sequences in the adenovirus El A gene product. Oncogene. 6 : 481-485.

69. Goodrich D.W., Wang N.P., Qian Y.W., Lee E.Y.H.P., and Lee W.H. 1991. The retinoblastoma gene product regulates progression through the G1 phase of the cell cycle. Cell. 67 : 293-302.

70. Gorina and Pavletich. 1996. Science. 274: 1001-1005.

71. Gottleib T., and Oren M. 1995. P53 in growth control and neoplasia. Biochem. Biophys. Acta. 1287 : 77-102.

72. Graham F.L, van der Eb A. J., and Heijneker H. L.1974. Size and location of the transforming region of human adenovirus DNA. Nature. 251 : 687-691.

73. Grossman S.R., Perez M., Kung A.L., Joseph M., Mansur C., Ziao Z.X., Kumar S., Howley P.M., and Livingstone D.M. 1998. Mol. Cell. 2: 405415.

74. Gu W., and Roeder R.G. 1997. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell. 90 : 595-606.

75. Gualberto A., Aldape K., Kozakiewicz K., and Tlsty T.D. 1998. An oncogenic fform of p53 conffers a dominant, gain-of-function phenotype that disrupts spindle checkpoint control. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 : 51665171.

76. Gupta S., Barret T., Whitmarsh J., Cavanadh J., Sluss H.K., Derijard B., and Davis R.J. 1996. Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with transcription factors. EMBO J. 15 : 2760-2770.

77. Haapajarvi T., Kivinen L., Pitkanen K., Laiho M. 1995 Cell cycle dependent efects of UV-radiation on p53 expression and retinoblastoma protein phosphorylation. Oncogene. 11 :151-159.

78. Haapajarvi T., Pitkanen K., Tsubari M., and Laiho M. 1997. P53 transac-tivation and protein accumulation are independently regulated by UV light in different phases of the cell cycle. Mol. Cell. Biol. 17 : 3074-3080.

79. Han J., Sabbatini P., Perez D., Rao L., Mohda D., and White E. 1996. The E1B 19K protein blocks apoptosis by interacting with and inhibiting the p53-inducible and death-promoting Bax protein. Genes & Dev. 10 : 461477.

80. Hannon G., Demetrick D., & Beach D. 1993. Isolation of the Rb-related pi30 through its interaction with CDK2 and cyclins. Genes & Dev. 7 23782391.

81. Hannon G., and Beach D. 1994. P15INK4B is potential effector of TGF-beta-indued cell cycle arrest. Nature. 371: 257-261.

82. Hansen R. and Oren M. 1997. P53: from inductive signal to cellular effect. Curr. Opin. Gen. Dev. 7: 46-51.

83. Harper J.W., Adami G.R., Wei N., Keyomarsi K„ & Elledge S.J. 1993. The p21 Cdk-interaeting protein Cipl is potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 : 805-816.

84. Harper J.W., Elledge S.J., Keyomarsi K., B Dynlacht, L.H. Tsai, Zhang P., Dobrowolski S., Bai C., Connell C.L., E. Swindell, Fox M.P., and N. Wei. 1995. Inhibition o cyclin-dependent kinases by p21. Mol. Biol. Cell. 6: 387-400.

85. Han J., Sabbatini P., Perez D., Rao L., Modha D., and White E. 1996. The E1B19K protein bloks apoptosis by interacting with and inhibiting the p53-inducible and death-promoting Bax protein. Genes & Dev. 10: 461-477.

86. Hartwell L.H. and Weinert T. A.// Science. 1989. V.246. p.629-634.

87. Haupt Y., Maya R., Kazaz A., and Oren M. 1997. Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature. 387 : 296-299.

88. Hengst L., Gopert U., Lashuel H.A., Reed S.I. 1998. Complete inhibition of cdk/cyclin by one molecule ofp21cipl. Genes & Dev. 12: 3882-3888.

89. Hengst L., and Reed S.I. 1996. Translational control of p27Klpl accumulation during the cell cycle.Science. 271:1861-1864.

90. Hermeking H., and Eick D.1994. Mediation of c-Myc-induced apoptosis by p53. Science. 265 : 2091-2093.

91. Hermeking H., Lengauer C., Polyac K., He T-C., Zhang L., Thiagal-ingam S., Kinzler K.W., and Vogelstein B. 1997. 14-3-3/g is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression. Mol. Cell.Biol. 1:3-11.

92. Herrera R., Sah V., Williams B. et al. // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 2402-2407.

93. Hiebert S.W., Lipp M., and Nevins J.R. 1989. El A-dependent trans-activation of the human MYC promoter is mediated by the E2F factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 : 3594-3598.

94. Hiebert S.W., Blake M., Azizkhan J., andNevins J.R. 1991. Role of E2F transcription factor in ElA-mediated trans activation of cellular genes. J. Virol. 65 : 3547-3552.

95. Hibi M., Lin T., Smeal T., Minden A., and Karin M. 1993. Indentifi-cation of an oncoprotein- and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. Genes Dev. 7 : 2135-2148.

96. Hockenberry D.L. 1995. Bcl-2 in cancer, development and apoptosis. J. Cell Sci. 18 : 51-55.

97. Howe J. A., and Bayley S. T. 1992. Effects of Ad5 E1A mutant viruses on the cell cucle in relation to the binding of cellular proteins including the retinoblastoma protein and cyclin A. Virology. 186 : 15-24.

98. Howe J. A., Mymryk J. S., Egan C., Branton P. E., and Bayley S. T. 1990. Retinoblastoma growth suppressor and a 300-kDa protein appear to regulate cellular DNA synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 : 58835887.

99. Huang D.C.S., Cory S., Strasser A. 1997. Bcl-2, Bcl-xL and adenovirus protein ElB19kD are functionally equivalent in their ability to inhibit cell death. Oncogene. 14 : 405-414.

100. Hunter T. 1991. Cooperation between oncogenes. Cell. 64 : 249-270.

101. Hunter T. 1997. Oncoprotein networks. Cell. 88: 333-346.

102. Iton T., Kaibuchi K., Matsuda T., Yamamoto T., Matsuura Y., Maeda A., Shimizu K., and Takai Y. 1993. A protein factor for ras-dependent activation of MAP kinase through MAP kinase kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 : 975-979.

103. Jackson P., Ridgway P., Rayner J., Noble J., and Braithwaite A. 1994. Transcriptional regulation of the PCNA promoter by p53. Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 203 : 133-140.

104. Jayaraman L., Murthy K.G., Manley J.L.,Zhu C., Curran T., Xanthoudakis S., and Prives C. 1997. Indentification of redox/repair protein Ref-1 as a potent activator of p53. Genes & Dev. 11 : 558-570.

105. Jayaraman L., Moorthy N.C., Murthy K.G., Manley J.L., Bustin M., and Prives C. 1998. High mobility group protein-1 (HMG-1) is a unique activator of p53. Genes & Dev. 12 : 462-472.

106. Jelsma T. N., Ridgway P., Rayner J., Noble J., Braithwaite A.// Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 203. P. 133-140.

107. Jenlins J.R., Rudge K., Chumakov P., and Currie G.A. 1985. Nature. 317: 816-818.

108. Kamijo T., Zyndy F., Roussel M.F., Quelle D.E., Downing R.A., Ashmun R.A., Grosveld G., and Sherr C.J. 1997. Tumor suppression at the mouse INK4a locus mediated by the alternative reding frame product pl9ARP. Cell. 91 : 649-659.

109. Kamijo T., Weber J.D., Zambetti G., Zindy F., Roussel M.F., and Sherr C.J. 1998. Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 : 8292-8297.

110. Kapoor M., and Lozano G. 1998. Functional activation of p53 via phosphorylation following DNA damage by UV but not gamma radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 2834-2837.

111. Kastan M.B., Zhan Q., El-Deiry W.S., Carrier F., Jacks T., Walsh W.V., Plunkett B.S., Vogelstein B., and Fornace .Jr. 1992. A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telengiectasia. Cell. 71 : 587-597.

112. Kastan M.B., Onyekwere 0., Sidransky D., VogelsteinB., and Craig R. 1991. Participation nf p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res. 51 : 630- 631.

113. Kauffman-Zeh A., Rodriguez-Viciana P., Ulrich E., Gilbert C., Coffer P., Downward J. and Evan G. 1997. Suppression of c-myc-induced apoptosis by Ras signaling throuth PI(3)K and PKB. Nature, 385: 544-548.

114. Keblusek P., Dorsman J. C., Teunisse A. . A. S., Tenissen H., van der Eb A.J., and Zantema A. 1999. The adenoviral El A oncoproteins interfere with the growth-inhibiting effect of the cdk-inhibitor p21CIP1/WAF1. J. General. Viorology. 80 : 381-390.

115. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., and Curie A.R. 1972. Apoptosis : A basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. Br. J. Cancer. 26 : 239-257.

116. Kimelman D., Miller J.S., Porter D., and Roberts B.E. 1985. E1A region of the human adenoviruses and of the highly oncogenic simian adenovirus 7 are closely related. J. Virol. 53 : 399-409.

117. Khanna K.K., and Lavin M.F. ' 1993. Ionizing radiation and UV induction of p53 protein by diffrent pathways in ataxia telangiectasia cells. Oncogene. 8 : 3307-3312.

118. Khwaja A., Rodriguez-Viciana P., Wennstrom S., Warne P.H., and Downward J. Matrix adhesion and Ras transformation both activate a phos-phoinositide 3-OH kinase and protein kinase B/Act cellular survival pathway. EMBO J. 16: 2783-2793.

119. Kley N., Chung R.Y., Fay S., Loufler J.P., and Seizinger B.R. 1992. Repression of the basal c-fos promoter by wild-type p53. Nucl. Acids Res. 20 : 4083-4087.

120. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., and Newmeyer D.D. 1997. The release of cytochrome c from mitochondria: A primary site for Bcl2 regulation of apoptosis. Science. 275: 1132-1136.

121. Ko L.J., and Prives C. 1996. P53: Puzzle and paradigm. Genes & Dev. 10: 1054-1072.

122. Korsmeyer S.J.// Blood. 1992. V. 80 . p. 879-886.

123. Kowalik T.F., DeGregori J., SchwarzJ.K., and Nevins J.R. 1995. E21 overexpression in quiescent fibroblasts leads to introduction of cellular DNA synthesis and apoptosis. J. Virol. 69: 2491-2500.

124. Krajewski S., Krajewska M., Shabaik A., Miyashita T., Wang H.G., Reed J.C.// Am. J. Pathol. 1994. V. 145. P. 1323-1336.

125. Kraiss S., Quaiser A., Oren M., and Montenarh M. 1988. J. Virol. 62: 4737-4744.

126. Kubbutat M.H., Jones S.N., and Vousden K.N. 1997. Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature. 387 : 299-303.

127. Kuerbitz S., Plunkett B., Walsh W., and Kastan M. 1992. Wild-type p53 is a cell cycle checkpoint determinant following irradiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 : 7491-7495.

128. Kyriakis J.M., App H., Zhang X.F., Banerjee P., Brautigan D.L., Rapp U.R., and Auruch I. 1992. Raf-1 activates MAP kinase-kinase. Nature. 358 : 417-421.

129. Land H., Parada L.F., and Weinberg R.A. 1983. Tumoriginic conversion o primary embryo fibroblasts requires at least two cooperating oncogenes. Nature. 304 : 596-602.

130. La Thangue N. B. 1994. DRTF/E2F : an expanding family of getero-dimeric transcription factors imlicated in cell-cycle control. Trends. Bio-chem. Sci. 19 : 108-114.

131. Lazebnik Y.A., Kaufmann S.H., Desnoyers S., Poirier G.G., and Earnshaw W.C. 1994. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 371: 346-347.

132. Lee S., Elenbaas B., Levine A.J., Griffith J. 1995. P53 and its 14 rDa C-terminal domain recognize primary DNA damage in the orm of insertion/deletion mismatches. Cell. 81: 1013-1020.

133. Levine A.J. 1997. P53 , the cellular gatekeeper or growth and division. Cell. 88 :323-331.

134. Li P., Nijihawan D., Budihardjo I., Srinivasula S.M., Ahmad M., Al-nermi E.S., and Wang X. 1997. Cytochrom c and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91: 479-489.

135. Lieberman D., Hoffman B., and Steinman R. 1995. Molecular controls of growth arrest and apoptosis : p53-dependent and p53-indepandent pathways. Oncogene. 11 : 199-210.

136. Lill N.L., Tevethia M.J., Eckner R., Livingston D.M., and Modjta-hedi N. 1997. P300 family members associate with the carboxyl terminus of simian virus 40 large tumor antigen. J. Virol. 71 : 129-137.

137. Lin H.J., Eviner V., Prendergast G.C., and White E. 1995. Activated H-ras recues ElA-induced apoptosis and cooperates with El A to overcome p53-dependent growth arrest. Mol. Cell Biol. 15: 4536-4544.

138. Lin J., Wu X., Chen J., Chang A., and Levine A.J. 1995. Functions of the p53 protein in growth regulation and tumor suppression. Gold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology LIX, 215-223.

139. Liu F., and Green M.R. 1994. Promoter targeting by adenovirus Ela through interaction with diffrent cellular DNA-binding domains. Nature. 368 : 520-525.

140. Livingstone L.R., White A., Sprouse J., Livanos E., Jacks T., and Tlsty T.D. 1992. Altered cell cycle arrest and gene amplification potential accompany loss of wild-type p53. Cell. 70 : 923-935.

141. Lowe S., Schmitt E.M., Smith S.W., Osborne B.A., and Jacks T. 1993. P53 is required for radiation induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature. 362: 847-849.

142. Lowe S., Jacks T., Housman D., and Rulley H. 1994. Abrogation of oncogene-associsted apoptosis allows transormation of p53-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 : 2026-2030.

143. Lowe S., Ruley H., Jacks T., and Housman D. 1993. P-53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents. Cell. 74 : 957967.

144. Lowe S., and Ruley H.E. 1993. Stabilization of the p53 tumor suppressor is induced by adenovirus-5 El A and accompanies apoptosis. Genes & Dev. 7 : 535-545.

145. Lu X., and Lane D.P. 1993. Differential induction of transcriptionally active p53 following UV or ionizing radiation : defects in chromosome instability syndromes. Cell. 75 : 765-778.

146. Lu H., and Levine A.J. 1995. Human TAF-31 is transcriptional coac-tivator of the p53 protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:5154-5158.

147. Luo Y., Hurwitz J., & Massagu J.J. 1995. Cell-cycle inhibition by independent CDK and PCNA binding domains in p21Cipl. Nature. 375 : 159161.

148. Macleod K.F., Sherry N., Hannon G., Beach D., Tokino T., Kenneth K., Vogelstein B., and Jacks T. 1995. P53-dependent and independent expression of p21 during cell growth, diferentiation, and DNA damage. Genes & Dev. 9: 935-944.

149. Majno G., and Joris I. 1995. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J. Pathol. 146 : 3-16.

150. Mayo M.W., Wang C-Y., Congswell P.C., Rogers-Graham K.S., Lowe S.W., Der C.J., and Baldwin A.S. 1997. Requirement of NF-kB activation to suppress p53-independent apoptosis induced by oncogenic Ras. Science. 278: 1812-1815.

151. Maki C.G., Huibregtse J.M., and Howley P.M. 1996. In vivo ubiquiti-nation and proteasome-mediated degradation of p53 (1). Cancer Res. 56 : 2649-2654.

152. Maki C.G., and Howley P.M. 1997. Ubiquitination of p53 and p21 is differentially affected by ionizing radiation and UV radiation. Mol. Cell Biol. 17 :355-363

153. Mai A., Piotrkowski A., and Harter L. 1996. Ciclin-dependent kinases phosphorylate the adenovirus El A protein, enhancing its ability to bind pRb and disrupt pRb-E2F complexes. J. Viorol. 70 : 2911-2921.

154. Maltzman W., and Cryzyk L. 1993. UV irradiation stimulates levels of p53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells. Mol. Cell Biol. 13 : 4197-4202.

155. Marshall C.J. 1996. Ras effectors. Curr. Opin. Cell Biol. 8: 197-204.

156. Marte B.M. and Downward J. 1997. PKB/Act: connecting PI3-kinase to cell survival and beyond. Trends Biochem Sci. 22: 355-358.

157. Martin S.J. & Green D. 1995. Protease activation during apoptosis death by a thousand cuts. Cell. 82: 349-352.

158. Mayer B.J., and Hanafusa H. 1990. Association of the v-crk oncogene product with phosphotyrosine-containing proteins and protein kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 : 2638-2642.

159. Mayo L.D., Turchi J.J., and Berberich S.J. 1997. Mdm-2 phosphorylation by DNA-dependent protein kinase prevents interaction with p53. Cancer Res. 57: 5013-5016.

160. McCormick F. 1993. Signal transdaction: how receptors turn Ras on. Nature. 363: 15-16.

161. McCurrach M.E., Connor T.M.F., Knudson C.M., Korsmeyer S.J., and Lowe S.W. 1997. Bax-deiciency promotes drug resistence and oncogenic transformation by attenuating p53-dependent apoptosis. Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 94: 2345-2349.

162. McKenna W., Bernhard E., Markiewicz D., Rudoltz M., Maity A., Muschel R. // Oncogene. 1996. V. 12. P. 237-245.

163. Metcalfe S., Weeds A., Okorokov A.L., Milner J., Cockman M., and PopeB. 1999. Oncogene. 18: 2351-2355.

164. Midgley C.A., and Lane D.P. 1997. P53 protein stability in tumor cells is not determined by mutation but is dependent on Mdm2 binding. Oncogene. 15 : 1179-1189.

165. Milne D.M., Palmer R.H., Campbell D.G., and Meek D.W. 1992. Phosphorylation of the p53 tumor-suppressor protein at three N-terminal sites by a novel casein kinase I-like enzyme. Oncogene. 7: 1361-1369.

166. Minden A., Lin A., Claret F.-X., Abo A., and Karin M. 1995. Selective activation of the JNK signaling cascade and c-Jun transcriptional activity by the small GTPases Rac and Cdc42Hs. Cell. 81 : 1147-1157.

167. Miyashita T., Krajewski S., Kraiwska M. et al. 1994. Tumor supressor p53 is a regulator of bcl-2 and bax geneexpression in vitro and in vivo. Oncogene. 9 : 1799-1805.

168. Miyashita T., and Reed J.C. 1995. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell. 80: 293-299.

169. Moll U.M., Riou G., and Levine A.J. 1992. Two distinct mechanisms alter p53 in breast cancer: Mutation and nuclear exclusion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 7262-7266.

170. Momand J., Zambetti G.P., Olson D.C., Geoge D.L., and Levin A.J. 1992. The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell. 69 : 1237-1245.

171. Montes de Oca Luna R., Wagner D.S., and Lozano G. 1995. Recue of early embrionic lethality in mdm2-deficient mice by deletion of p53. Nature. 378: 206-208.

172. Moran E. 1993. DNA tumor virus transforming proteins and the cell cycle. Cur. Opin. Gen. Dev. 3 : 63-70.

173. Morgan D.O. 1995. Principles of CDK regulation. Nature. 374 : 131134.

174. Muslin A.J., MacNicol A.M., and Williams L.T. 1993. Raf-1 protein kinase is important for progesterone-induced Xenopus oocyte maturation and acts downstream of Mos. Mol. Cell Biol. 13 : 4197-4202.

175. Mymryk J.S., Shire K., and Bayley S.T. 1994. Induction of apoptosis by adenovirus 5 El A in rat cells requres a proliferation block. Oncogene. 9 : 1187-1193.

176. Nevins J.R. 1992. E2F : a link between the Rb tumor suppressor protein and viral oncoproteins. Science. 258 : 424-429.

177. Oltvai Z.N., and Korsmeyer S.J. 1994. Checkpoints of dueling dimers foil death wishes. Cell. 79 : 189-192.

178. Oltvai Z.N., Milliman C.L., and Korsmeyer S.J. 1993. Bcl2 hetrodi-merizes in vivo with a conserved homolog, bax, that accelerates programmed cell death. Cell. 74: 609-619.

179. Oren M.// Seminars in Cancer Biology. 1994. V. 5. P. 221-227.

180. Orth K., Chinnaiyan A.M., Garg M., Frolich C.J., and Dixit V.M. 1996. The CED-3/ICE-like protease Mch2 is activated during apoptosis and cleaves the death substrate lamin A. J. Biol. Chem. 271: 16443-16446.

181. Pardee A.B. 1989. Science. 246: 603-608.

182. Peeper D.S., & Zantema A. 1993. Adenovirus-EIA proteins transform cell by sequestering regulatory proteins. Mol. Biol. Res. 17 : 197-207.

183. Peeper D.S., van der Eb A.J., and Zantema A. 1994 The Gl/S cell-cycle checkpoint in eukaryotic cells. Biochim. Biopis. Acta. 1198 : 215-230.

184. Philipp A., Schneider A., Varsrik I., Finke K., Xiong Y., Beach D., Alitalo K., Eilers MM Mol. Cell Biol. 1994. V. 14. P. 4032-4043.

185. Piaccentini M., Fesus I., Farrace M.G., Ghibelli L., Piredda L., and Meline G. 1994. The expression of "tissue" transglutaminase in tow human cancer cell lines is related to with the programmed cell death (apoptosis). Eur. J. Cell Biol. 54 : 246-254.

186. Pines J. 1995. Cyclins and cyclin-dependent kinases : a biochemical view. Biochem J. 308: 697-711.

187. Polyak K., Waldman T., He T. et al. // Genes & Dev. 1996. V. 10. P. 1945-1952.

188. Price B.D., Hughes-Davies L., and Park S.J. 1995. Cdk2 kinase phos-phorylates serine 315 of human p53 in vitro. Oncogene. 11 : 73-80.

189. Pulvever B.J., Kyriakis J.M., Avruch J., Nikolakaki E., and Woodgett J.R. 1991. Phosphorylation of c-Jun mediated by MAP kinases. Nature. 353670.674.

190. Quelle D.E., Zindy F., Ashmun R.A., and Sherr C.J. 1995. Alternative reding frames o the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest. Cell. 83 : 993-1000.

191. Querido E., Teodoro J.G., and Branton P.E. 1997. Accumulation of p53 induced by the adenovirus E1A protein requires regions involved in the stimulation of DNA synthesis. J. Virol. 71 : 3526-3533.

192. Raff V.C. 1992. Social controls on cell survival and cell death. Nature. 356 : 397-400

193. Rao L., Perez D., White EM J. Cell. Biol. 1996. V. 135. P. 1441-1445.

194. Rao L., Debbas M., Sabbatini P., Hockenbery D., Korsmeyer S., and White E 1992. The adenovirus El A proteins induce apoptosis which is inhibited by E1B 19 K and Bcl-2 proteins. Proc. Natl. Acad. Sei. 89 : 77427746.

195. Rao L., Modha D., and White E. 1997. The E1B 19K protein associates with lamins in vivo and its proper localization is required for inhibition of apoptosis. Oncogene. 15 : 1587-1597.

196. Reed J.C. 1994. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J. Cell Biol. 124 : 1-6.

197. Reed J.C., Haldar S., Croce C.M., and Cuddy M.P. 1990. Comlemen-tation by BCL2 and c-Ha-RAS oncogenes in malignant transformation of rat embryo fibroblasts, Mol. Cell Biol. 10 : 4370-4374.

198. Ruas M., and Peters G. 1998. The pl6INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives. Biochim. Biophis. Acta Rev. Cancer.

199. Rudd C. E., Trevillyan J.M., Dasgupta J.D., Wong L.L., and Schlossman S.F. 1988. The CD4 receptor is complexed in detergent lysates to a protein-tyrosine kinase (p58) rom human lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85 : 5190-5194.

200. Ruley H.E. 1983. Adenovirus early region 1A enables viral and cellular transorming genes to transorm primary cell in culture. Nature. 304 : 602-606.

201. Ruley H.E. 1990. Transforming collaboration between ras and nuclear oncogenes. Cancer Cell. 2 : 258-268.

202. Ruppert J.M., Volgelstein B., and Kinzler K.W. 1991. The zinc finger protein GLI transforms primary cells in cooperation with adenovirus El A. Mol. Cell Biol. 11.

203. Sabbatini P., Lin J., Levine A., and White E. 1995. Essential role or p53-mediated transcription in ElA-induced apoptosis. Genes & Dev. 9: 2184-2192.

204. Sabbatini P., Chiou S-K., Rao L., and White E. 1995. Modulation of p53-mediated transcriptional repression and apoptosis by the adenovirus E1B 19K protein. Mol. Cell. Biol. 15 : 1060-1070.

205. Sakaguchi K., Sakamoto H., Lewis M.S., Anderson C.W. Erickson J.W., Apella E., and Xie D. 1997. Phosphorylation of serine 392 stabilizes the tetramer formation of tumor suppressoir protein p53. Biochemistry . 36 : 10117-10124.

206. Sakaguchi k., Herrera J.E., Saito S., Miki T., Bustin M., Vassilev A., Anderson C.W., and Appella E. 1998. Genes and Dev. 12: 2831-2841.

207. Sakahira H., Enari M. and Nagata S. 1998. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature. 391: 9699.

208. Sakamuro D., Sabbatini P., White E., and Prendergast G.C. 1997. Oncogene. 15: 887-898.

209. Salvesen G.S., and Dixit V.M., 1997. Caspases: Intracellular signaling by proteolisis. Cell. 91: 443-446.

210. Samuelson A.V., and Lowe S.W. 1997. Selective induction of breaks in mammalian cells after exposure to intercalationg agents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 : 12094-12099.

211. Sarnow P., Ho Y.S., Williams J.,and Levine A. 1982. Adenovirus Elb-58kd tumor antigen and SV40 large tumor antigen are phisically associated with the same 54 kd cellular protein in transformed cells. Cell. 28 : 387-394.

212. Scheffner M., Huibregtse J.M., Viestra R.D., and Howley P.M. 1993. Cell. 75: 495-505.

213. Schmitt R. C., Fahnestock M.L., and Lewis J.B. 1987. Differential nuclear localization of the major adenovirus type 2 El A proteins. J. Virol. 61 : 247-255.

214. Schwartz D., Goldfmger N., and Rotter V. 1993. Expression of p53 protein in spermatogenesis is confined to the tetraploid pachytene primary spermatocytes. Oncogene. 8 : 1487-1494.

215. See R.H., and Shi Y. 1998. Adenovirus E1B 19,000-molecular-weight protein activates c-Jun N-terminal kinase and c-Jun-mediated transcription. Mol. Cell. Biol. 18 : 4012-4022.

216. Selvakumaran M., Reed J.C., Liebermann D., Hoffman B. // Blood. 1994. y. 84. P. 1036-1042.

217. Serrano M., Hannon G. J., & Beach D. 1993. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of the cyclin D/cdk4. Nature. 366 : 704-707.

218. Serrano M., Lin A.W., McCurrach M.E., Beach D., and Lowe S.W. 1997. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 mdp\6mK4a. Cell. 88 : 593-602.

219. Serrano M., Lee H., Chin L., Cordon-Cardo C., Beach D. and De-Pinho R.A. 1996. Role of the INK4a locus in tumor suppression and cell mortality. Cell. 85 : 27-37.

220. Shan B., and Lee W-H. 1994. Deregulated expression of E2F-1 induces S-phase entry and leads to apoptosis. Mol. Cell Biol. 14 : 8166-8173.

221. Sherr C.J. 1998. Tumor surveillance via the ARF-p53 pathway. Genes & Dev. 12 : 2984-2991.

222. Sherr C.J. 1996. Cancer cell cycles. Science. 274 : 1672-1677.

223. Sherr C.J., and Roberts J.M. 1995. Inhibitors of mammalian G1 cy-clin-dependent kinases. Genes Dev. 9: 1149-1163.

224. Shim J., Lee H., Park J., Kim H., & Choi E.J. 1996. A non-enzymatic p21 protein inhibitor of stress-activated protein kinases. Nature. 381 : 804806.

225. Shieh S.Y., Ikeda M., Taya Y., and Prives C. 1997. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 : 325-334.

226. Shi L., Nishoka W.K., Th ng J., Bradbury E.M., Litchfield D.W., and Greenberg A.H. 1994. Premature p34cdc2 activation required for apoptosis. Science. 263 : 1143-1145.

227. Siliciano J.D., Camman C.E., Taya Y., Sakaguchi K., Appella E., and Kastan M.B. 1997. DNA damage induces phosphorylation of the amino terminus of p53. Genes & Dev. 11 : 3471-3481.

228. Smith M. et al. 1994. Interaction of the p53-regulated protein GADD45 with proliferating cell nuclear antigen. Science. 226 : 1376-1379.

229. Spindler K. and R., Berk A.J. 1984. Rapid intracellular turnover of adenovirus 5 early region 1A proteins. J. Virol. 52 : 706-710.

230. Steegenga W.T., van Laar T., Riteco N., Manarino A., Shvarts A., van der Eb A. J., & Jochemsem A.G. 1996. Adenovirus El A proteins inhibit activation of transcription by p53. Mol. And Cell Biol. 16 : 2101-2109.

231. Stephens C., and Harlow D. 1987. Differential splicing yields novel adenoviruse 5 El A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. EMBO J. 6 : 2027-2035.

232. Stewart N., Hicks G.G., Paraskevas F., Mowat M. 1995. Evidence for a second cell cycle block at G2/M by p53. Oncogene. 10 : 109-115.

233. Strasser A. Harris A.W., Huang DCS., Krammer P.H., Cory S.// J.EMBO. 1995. V. 14. P. 6136-6147.

234. Svensson C., Bondesson M., Nyberg E., Linder S., Jones N., and Akusjarvi G. 1991. Independent transformation activity by adenovirus 5 ElA-concerved regions 1 or 2 mutants. Virology. 182 : 553-561.

235. Susin S.A., Zamzami N., Castedo M., Hirsch T., Marcetti A., Macho A., Daugas E., Geuskens M., and Kroemer G. 1996. Bcl2 inhibits the mitochondrial release of an apoptotic protease. J. Exp. Med. 184: 1331-1341.

236. Tarunina M., Grimaldi M., Ruaro E., Pavlenko M., Schneider C., and Jenkins J.R. 1996. Oncogene. 13: 589-598.

237. Teodoro J., Gordon C., Shore G., and Branton P. 1995. Adenovirus El A proteins induce apoptosis by both p53-dependent and p53-independent mechanisms. Oncogene. 11 : 467-474.

238. Thomas G. 1992. MAP kinase by any other name smells just as sweet. Cell. 68 : 3-6.

239. Thomas G. and Laimins L.A. 1998. Human papillomavirus oncoproteins E6 and E7 independently abrogate the mitotic spindle checkpoint. J. Virology.72 : 1131-1137.

240. Thomas A., and White E., 1998. Suppression of the p300-dependent mdm2 negative-feedback loop induced the p53 apoptotic function. Genes & Dev.

241. Thut C.J., Goodrrich J.A., and Tijan R. 1997. Repression of p53-mediated transcription by MDM2 : A dual mechanism. Genes & Dev. 11 : 1974-1986.

242. Thut C.J., Chen J.L., Klemin R., and Tjian R. 1995. P53 transcriptional activation mediated by coactivators TATII40 and TAFII60. Science. 267: 100-104.

243. Tremblay M. L., Dumont D. J., and Branton P. E. 1989. Analysis of phosphorilation sites in the exon 1 region of El A proteins of human adenovirus type 5. Virology. 169 :397-407.

244. Vikhanskaya F. Erha E. D'incalci M., and Broggini M.1994. Introdu cion of wilde-type p53 in a human ovarian cancer cell line not expressing endogenous p53. Nucleic Acids Res. 22 : 1012-1017

245. Waga S., Hannon G., Beach D., & Stillman B. 1994. The p21 inhibitor off cyclin dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA. Nature. 369 : 574-578.

246. Waldman T., Lengauer C., Kinzler K.W., and Vogelstein B. 1996. Uncoupling of S phase and mitosis induced by anticancer agents in cells lacking p21. Nature. 381: 713-716.

247. Walker K.K., and Levine A.J. 1996.Identification of a novel p53 functional domain which is necessary for efficient growth suppresion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 15335-15340.

248. Wang H.G., Miyashita T., Takayama S., Sato T., Torigoe T., Krajew-ski S., Tanaka S., Hovey L., Troppmair J., and Rapp U.R. 1994. Apoptosis regulation by interaction of Bcl-2 protein find Raf-1 kinase. Oncogene. 9: 2751-2756.

249. Wang X.W., Forrester K., Yeh H., Feitelson M.A., Gu J.R., and Harris C.C. 1994. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 91: 2230-2234.

250. Waterman M.J.F., Stavridi E.S., Waterman J.L. F., and Halazonetis T.D. 1998. ATM-dependent activation of p53 involves dephosphorylation and association with 14-3-3 proteins. Nature Genet. 19 : 175-178.

251. Weaver V.M., Lach B., Walker P.R., and Sikorska M. 1993. Role of proteolisis in apoptosis: Involvement of serine proteases in internucleosomal DNA ragmentation in immature lymphocytes. Biochem. Cell Biol. 71 : 7-12.

252. Weinberg R.A., & Harlow E. 1988. Association between an oncogene and an anti-oncogene : the adenovirus El A proteins bind to the retinoblastoma gene product. Nature. 334 : 124-129.

253. Weinberg R. 1995. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 : 323-330.

254. Weinberg R.A. 1989. Oncogenes, anti-oncogenes, and the molecular bases of multistep cancinogenesis. Cancer Res. 49 : 3713-3721.

255. Weinberg R.A. 1985. The action of oncogenes in the cytoplasm and the nucleus. Science. 230 : 770-776.

256. White E., and Cipriani R. 1989. Speciic disruption of intermediate ilaments and the vuclear lamina by the 19-kDa product of the adenovirus E1B oncogene. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 86 : 9886-9890.

257. White E.//Nature. 1994. V. 371. P.21-22.

258. White E. 1996. Life, death. And the pursuit of apoptosis. Genes & Dev. 10 : 1-15.

259. White E., and Stillman B. 1987. Expression of adenovirus E1B mutant phenotypes is dependent on the host cell and on synthesis of El A proteins. J.Virol. 61 : 426-435.

260. White E., Blose S.H., and Stillman B. 1984. Nuclear envelope localization o an adenovirus tumor antigen maintains the integrity of cellular DNA. Mol. Cell. Biol. 4: 2865-2875.

261. White E., and Cipriani R. 1990. Role of adenovirus E1B proteins is transformation : altered organization of intermediate filaments is transformed cells that express the 19-kilodalton protein. Mol. Cell. Biol. 10 : 120130.

262. White E., Cipriani R., Sabbatini P., and Denton A. 1991. The adenonovirus E1B 19-kilodalton protein overcomes the cytotoxicity of El A proteins. J. Virol. 65: 2968-2978.

263. Whyte P.,Buchkovich K., Horowitz M., Friend S.H., Raybuck M., Weinberg R.A., and Harlow E. 1988. Associstion between an oncogene and antioncogene : The adenovirus El A proteins bind to the retinoblastoma gene product. Nature. 334 : 12-129.

264. Whyte P.,Williamson N.M.,and Harlow E. 1989. Cellula targets for transformation by adenovirus El A proteins. Cell. 56 : 67-75.

265. Williams G.T. 1991. Programmed cell death : apoptosis and oncogenesis. Cell. 65 : 1097-1098.

266. Wu X., and Levine A.J. 1994. P53 and E2F-1 cooperate to mediate apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 91 : 3602-3606.

267. Xiong Y., Zhang H., and Beach D 1992. D-type cyclins associated with multiple protein kinases and the DNA replication and repair factor PCNA. Cell. 71 : 504-514.

268. Yew P.R., and Berk A.J. 1992. Inhibition of p53 transactivation required for transformation by adenovirus early IB protein. Nature. 357: 8285.

269. Yin C., Knudson C.M., Korsmeyer S.J., and Van Dyke T. 1997 Bax suppresses tumorigenesis and stimulates apoptosis in vivo. Nature. 385: 637640.

270. Yonish-Rouach E., Resnitzky D., Lotem J., Sachs L., Kimchi A., and Oren M. 1991. Wild-type p53 induced apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukin-6. Nature. 352: 345-347.

271. Yoshida K., Venkatesh L., Kuppuswamy M., Ghinnadurai G. 1987. Adenovirus transforming 19-kD antigene has an enhancer-dependent transactivation function and relieves enhancer repression mediated by viral and cellular genes. Genes & Dev. 1 : 645-658.

272. Zantema A., Fransen J.A., Davis-Olivier A., Ramaekers F.C., Vooijs G.P., DeLeys B., and Van der Eb A.J. 1985. Virology. 142: 44-58.

273. Zhang H., Fisk H., Yaffe M., Mahajan N., Herman B., Read J.// Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 6494-6508.

274. Zhang H., Hannon G.J., and Beach D. 1994 . p21-containing cyclin kinases exist in both active and inactive states. Genes & Dev. 8 : 1750-1758.

275. Zhang Y., Xiong Y., and Yarbrough W.G. 1998. ARF promotes MDM2 degradation and stabilizes p53 : ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor suppressor pathways. Cell. 92 : 725-734.

276. Zerler B., Roberts R. J., Mathews M. B. and , Moran E. 1987. Different functional domains of the adenovirus El A gene are involved in regulation of host cell cycle products, Mol. Cell Biol. 7 : 821-829.

277. Zindy F., Eischen C.M., Randle D., Kamijo T., Cleveland J.L., Sherr C.J., and Roussel M. 1998. Myc signaling via the ARF tumor suppressor regulates p53-dependent apoptpsis and immortalization. Genes & Dev. 12 : 2424-2434.

Информация о работе

Кураш, Юлия Константиновна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.25

Диссертация

Анализ клеточного цикла и апоптотической гибели в E1Aad5 иммортализованных и трансформированных фибробластах крысы после действия повреждающих агентов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы