Регуляция активности глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени крыс и действии веществ - протекторов

Шульгин, Константин Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция активности глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени крыс и действии веществ - протекторов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени крыс и действии веществ - протекторов"

На правах рукописи

Шульгин Константин Константинович

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ КРЫС И ДЕЙСТВИИ ВЕЩЕСТВ - ПРОТЕКТОРОВ

03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2008

003454101

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Попова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ершова Антонина Николаевна,

кандидат биологических наук, Лущик Марина Валерьевна

Ведущая организация Институт биохимии им А.Н.Баха РАН

Защита состоится 5 декабря 2008 года в час. на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 390006, Воронеж, Университетская пл., 1, биолого-почвенный факультет, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомится в 'зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета

Автореферат разослан £ ноября 2008 года

Ученый секретарь Грабович М.Ю.

диссертационного совета /

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время важнейшим направлением современной биохимии является исследование функционирования отдельных звеньев клеточного метаболизма при патологических состояниях, что способствует выяснению молекулярных основ патогенеза многих заболеваний. Согласно современным представлениям, интенсификация свободнорадикальных процессов является одним из ведущих механизмов клеточной патологии, включая сердечно -сосудистые заболевания, аутоиммунные болезни, хронические воспаления, нейродегенеративные заболевания и другие (Бурлакова Е.Б., 1980; Владимиров Ю.А., 1972). В основе развития ряда заболеваний печени также лежит нарушение баланса между интенсивностью процессов свободнорадикального окисления (СРО) и активностью антиоксидантной системы организма (АОС) (Ланкин В.З., 1984; Stadtman E.R., 2000). Активные формы кислорода (АФК) выполняют важную роль в жизнедеятельности, однако при интенсификации их образования происходит усиление процессов СРО, что сопровождается нарушениями в свойствах биомембран, функционирования клеточного метаболизма и приводит к гибели клеток (Федорова Н.Ю., 1999; Владимиров Ю А., 1991).

Защита от разрушающего действия свободных радикалов осуществляется неферментативным и ферментативным звеньями АОС, важное место в которой отводится глутатионредуктазной/глутатионпероксидазной (ГР/ГП) системе Глутатионпероксидаза (ГП; К.Ф. 1:11.1.9) катализирует реакцию детоксикации органических и неорганических пероксидов без образования свободных радикалов, используя в качестве донора водорода восстановленный глутатион (TSH) (Кулинский В.И., 1990). Активность ГП существенно зависит от концентрации данного субстрата, а следовательно от активности глутатионредуктазы (ГР) и уровня НАДФН в клетке (Pangili Е., 1991). ГП находит широкое применение в научно-исследовательской практике, являясь удобным объектом изучения механизмов компенсации дезадаптационных сдвигов на уровне отдельных антиоксидантных ферментов, что представляет как самостоятельный научный интерес, так и служит ключом к пониманию роли происходящих метаболических изменений при интенсификации СРО (Каминный А.И., 2000; Пашков А.Н , 2005). К настоящему времени изучены физико-химические свойства ГП, выделенной из ряда организмов, в норме (Esnjrthy R.S, 1991, Hill T.D., 1989). Однако, такой аспект, как особенности функционирования фермента при патологии, в частности, при заболеваниях печени и действии веществ - протекторов остается не изученным. Вместе с тем, существенный интерес представляет поиск средств, способных воздействовать на компоненты АОС и повышать резистентность организма к повреждающему действию свободных радикалов в патологическом состоянии. Перспективными в этом отношении являются тиоктовая кислота (ТК) и восстановленный глутатион (FSH), но их влияние на регуляцию активности ферментов АОС, и в частности ГП, остаются не исследованными. Антиоксидантный эффект ТК обусловлен наличием двух тиоловых групп в молекуле, а также способностью связывать радикалы и ионы металлов, предотвращая их участие в СРО. Антиоксидантный эффект TSH заключается в обезвреживании перекисей и гидроксильных радикалов. Являясь одним из важнейших компонентов системы антиоксидантной защиты клетки, FSH не только напрямую реагирует с радикалами в неэнзиматических реакциях, но и служит донором электронов при восстановлении клеточных пероксидов.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование каталитических свойств и регуляции активности ГП из печени крыс в норме, при токсическом гепатите и введении веществ — протекторов ТК и TSH, при патологии. В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Определение активности и субклеточной локализации ГП из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и действии веществ - протекторов: ТК и TSH.

2. Получение гомогенных ферментных препаратов ГП из печени контрольных животных, крыс, подвергнутых токсическому гепатиту, и животных, которым при патологии вводили вещества - протекторы.

3. Сравнительная характеристика кинетических параметров каталитического действия ГП из печени крыс в норме, в условиях развития оксидативного стресса, вызванного введением ССЦ, и действия веществ - протекторов при патологии.

4. Изучение участия ионов металлов и нуклеотидфосфатов в регуляции активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении ТК и TSH

5. Исследование регуляции активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении веществ - протекторов под действием метаболитов цикла Кребса.

6. Изучение участия интермедиатов пентозофосфатного пути (ПФП) в регуляции активности ГП из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении ТК и TSH при патологии.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование особенностей регуляции активности ГП в условиях развития токсического гепатита у экспериментальных животных, а также при действии веществ - протекторов в патологическом состоянии. Разработаны способы очистки и получены гомогенные препараты ГП из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс, а также животных, которым при развитии патологии вводили вещества - протекторы Впервые дана сравнительная характеристика каталитических и регуляторных свойств ГП в норме, при токсическом поражении печени и действии ТК и TSH Полученные данные свидетельствуют, что контроль образования АФК может осуществляться за счет изменения активности ГП, взаимосвязанного с модификацией кинетических свойств и регуляции активности фермента под действием ионов металлов (Fe2+, Fe3+, Са2+, Cu2+), интермедиатов цикла Кребса, пентозофосфатного пути, нуклеотидфосфатов. Полученные данные способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений о регуляции генерирования АФК с помощью ключевого фермента антиоксидантной системы в условиях развития токсического гепатита и действия веществ - протекторов.

Практическая значимость. Изучение метаболитной регуляции ГП в условиях экспериментального токсического гепатита и действия веществ - протекторов может играть существенную роль в понимании развития патологического процесса и поиске путей его коррекции в медицинской практике. Разработанные способы получения гомогенной ГП могут применяться для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Гомогенная ГП может быть использована для решения актуальных проблем молекулярной биологии в области разработки методов многопараметрического анализа (биочипов), направленных, кроме диагностики различных заболеваний человека, на выявление токсических компонентов в окружающей среде, а также для прерывания процессов самоокисления и стабилизации мембран липосом (Cheng W.H., 2003; Варфоломеев С.Д., 1997).

Материалы работы используются в учебном процессе на бнолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», «Медицинская биохимия», а также спецкурсов по аналитической биохимии и энзимологии Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ

Результаты работы использованы при выполнении исследований по ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы» (РНП. 2.1.1.4429).

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на I Всероссийской молодежной медицинской конференции студентов и молодых ученых «Экстремальные и терминальные состояния» (Омск, 2006), на научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» (Ростов-на-Дону, 2006), на 20-м съезде физиологического общества им. И.П. Павлова РАН (Москва, 2007), на 3-ей Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ (Воронеж, 2007), на международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Н.П. Огарева, (Саранск, 2008), на научно-практической конференции «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболевай человека» Российской академии естествознания, 2008.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 8 публикациях - в 3 статьях и 5 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Активность ГП в печени крыс, возрастающая при ЭТГ, изменяется в сторону нормы при введении животным веществ - протекторов (ТК и Г8Н), что не сопряжено с модификацией таких характеристик фермента как молекулярная масса, субъединичная структура, электрофоретическая подвижность, субклеточная локализация

2 С использованием гомогенных ферментных препаратов ГП показано, что в условиях патологии и действия веществ - протекторов изменяются кинетические параметры каталитического действия фермента (Км, температурный и рН-оптимумы, энергия активации). Введение ТК и ГЭП животным приводит к приближению данных показателей к контрольным значениям.

3. При интоксикации крыс ССЦ и введении животным веществ - протекторов имеет место ряд особенностей регуляции активности ГП под действием ионов металлов (Ре2+, Ре3+, Са2+ ,Си2+), интермедиатов цикла Кребса и пентозофосфатного пути, нуклеотидфосфатов. Ряд модификаций регуляторных свойств ГП, характерных для фермента из пораженной гепатотоксином печени, такие как стимуляция активности 6 - фосфоглюконатом, 2 - оксоглутаратом, уменьшение чувствительности к ингибирующему действию ионов Си2+, АМФ могут способствовать увеличению активности фермента при патологии.

4. С учетом полученных данных о функционировании ГП в печени крысы в условиях токсического поражения и действия веществ - протекторов предложена гипотетическая схема, отражающая регуляцию активности данного фермента, обеспечивающего контроль интенсивности СРО.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 173 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы (253 источника) и приложения. Иллюстративный материал включает 39 рисунков и 7 таблиц. В приложении содержатся 18 рисунков и 1 таблица.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали взрослых лабораторных белых крыс (Rattus rattus L), самцов, массой 150 - 200 г, содержащихся на стандартном рационе питания в виварии.

Создание модели токсического гепатита. Моделирование ЭТГ осуществляли пероральным введением 33% раствора СС14 в вазелиновом масле из расчета 64 мкл СС14 на 100 г веса животного (Федорова Н.Ю., 1999). Забой животных производили на 4 сутки после введения гепатотоксина. Контрольным животным вводили соответствующую аликвоту вазелинового масла.

Животные были разделены на 4 экспериментальные группы: 1 - норма (интактные животные); 2 - животные, подвергнутые интоксикации СС14; 3 - группа животных, которым на фоне развития патологии вводили внутрибрюшинно ТК в дозе 35мг/кг, ежедневно, однократно, в течение 4-х дней эксперимента; 4 - группа животных, которым на фоне развития патологии вводили внутрибрюшинно восстановленный глутатион в дозе 150 мг/кг, ежедневно, однократно, в течение 4-х дней эксперимента.

Получение субклеточных фракций гепатоцитов. Для разделения цитоплазматической и митохондриальной фракций клеток печени использовали метод дифференциального центрифугирования. Митохондрии разрушали с помощью детергента тритона Х-100. Маркерным ферментом митохондрий служила сукцинатдегидрогеназа (СДГ). В качестве маркерного фермента цитоплазмы использовали лактатдегидрогеназу (ЛДГ)

Определение активности фермента. Активность ГП определяли спектрофотометрически на СФ-56 при длине волны 340 нм. О скорости протекания ГП - реакции судили по уменьшению оптической плотности образцов в результате окисления НАДФН в ходе протекания сопряженных ферментативных реакций -образования окисленного глутатиона под действием ГП и его последующего восстановления, взаимосвязанного с окислением НАДФН, под действием ГР. Реакцию начинали внесением ферментного препарата в среду. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта за 1 мин при 25 °С. Активность ферментов выражали в ферментативных единицах (Е) на 1 мг белка или Е в расчете на 1 г сырой массы материала. Активность СДГ определяли при 600 нм (Cooper, 1969); активность ЛДГ - при 340 нм (Кочетов, 1980). Общий белок определяли по методу Лоури (Lowry, 1951).

Выделение и очистка исследуемого фермента. Для получения высокоочищенных препаратов ГП были разработаны процедуры, включающие несколько стадий. В ходе выделения ГП после гомогенизации материала проводили освобождение фермента от низкомолекулярных примесей методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Концентрирование фракций, содержащих активность фермента, осуществляли с помощью концентрирующей ячейки Amicon

Полученный ферментный препарат использовали для дальнейшей очистки на Toyopearl HW-65 Все операции проводили в холодной камере при 0-4°С.

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента. Кинетические и регуляторные свойства ГП из печени крысы в норме, при токсическом гепатите и действии веществ-протекторов изучали на гомогенных препаратах Определение констант Михаэлиса, ингибирования, рК ионогенных групп осуществляли по Диксону и Уэббу (Диксон, 1982)

Аналитический электрофорез. Электрофорез проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) при 4°С по Дэвису (Davis, 1964). Контроль гомогенности фермента осуществляли, применяя метод универсального окрашивания на белок с использованием нитрата серебра (Shevchenko А., 1996).

Определение молекулярной массы фермента. Молекулярную массу ГП определяли методом гель - фильтрации. Определение субъединичной молекулярной массы проводили с помощью электрофореза по методу Лэммли (Laemmli U.K., 1970)

Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в 3-4-х кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в двух повторностях Результаты опытов сравнивали с контролем В таблице и на рисунках приводятся средние арифметические значения активностей данного фермента и их стандартные ошибки. Полученные данные обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента, обсуждаются статистически достоверные результаты при р<0,05(Ллойд, Ледерман, 1990)

СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ОЧИСТКА ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ГРУПП

Изучение субклеточной локализации ГП из печени контрольных и подвергнутых ЭТГ животных, а также крыс, которым вводили при патологии вещества-протекторы осуществляли методом дифференциального

центрифугирования Показано, что в условиях нормы 89% от общей активности ГП приходится на цитоплазматическую фракцию гепатоцитов, в то время как в митохондриальной фракции активность фермента составила 11% Данные по распределению активности ГП между субклеточными фракциями в условиях патологии и действия веществ-протекторов существенно не отличаются от таковых в норме Распределение активностей маркерных ферментов митохондрий и цитоплазмы указывает на то, что большая часть органелл оставалась не разрушенной после дифференциального центрифугирования. Степень перекрестного загрязнения цитоплазматической и митохондриальной фракций гомогената печени исследуемых групп животных существенно не отличалась- 7±0,3% и 6±0,2% (норма), 5±0,3% и 7±0,4% (гепатит), 6±0,2% и 7±0,3% (при введении ТК на фоне патологии), 6±0,4% и 5±0,3% (при введении TSH при ЭТГ) соответственно. Полученные результаты согласуются с литературными данными. В ряде работ отмечено, что в клетках животных ГП является типичным цитозольным ферментом, который присутствует во всех тканях (Kang S.G., 2004). Следует также отметить, что в растительных клетках данный фермент локализован как в цитоплазме, так и в хлоропластах (Hill Т D., 1989)

Результаты очистки ГП из печени крыс исследуемых групп представлены в таблицах 1, 2. С помощью разработанных процедур очистки были получены электрофоретически гомогенные препараты ГП из печени крыс контрольной группы, животных подвергнутых токсическому гепатиту, а также крыс, которым вводили на фоне развития патологического состояния вещества-протекторы с 112,4 -, 104,1 -, 107,1 — и 104,1 — кратной очисткой, удельной активностью 1,4, 3,6, 1,8 и 2,1 Е/мг белка и выходом 7,2, 8,0, 8,1 и 8,9% соответственно

Таблица 1.

Очистка глутатионпероксидазы из печени крыс контрольной группы и животных с токсическим гепатитом

Стадия очистки Условия опыта Общая активность Еобщ Количество белка, мг Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

гомогенат норма 2,64+0,11 203,00±9,74 0,013±0,001 100 1

гепатит 9,34±0,34 267,00+8,54 0,035+0,001 100 1

хроматография на сефадексе в-25 норма 2,38+0,07 122,00± 2,81 0,019±0,001 90,15 1,46

гепатит 7,94±0,26 103,00+ 4,12 0,077+0,002 85,01 2,20

хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе норма 1,06±0,03 2,08+0,08 0,510±0,015 40,15 39,23

гепатит 2,72±0,11 1,76+0,07 1,545+0,052 29,12 44,14

Концентри рование с помощью ячейки Аппсоп норма 0,53+0,02 0,57+0,03 0,930±0,037 20,07 71,54

гепатит 2,05±0,09 0,86+0,02 2,384±0,083 21,95 68,11

хроматография на Тоуореаг1 Н\У-65 норма 0,19±0,01 0,13+0,01 1,462±0,044 7,20 112,46

гепатит 0,75+0,03 0,21 ±0,01 3,644+0,178 8,00 104,11

Примечание: в табл. обсуждаются статистически достоверные различия при Р<0,05

Очистка глутатионпероксидазы из печени крыс с токсическим гепатитом при введении тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона

Стадия очистки Условия опыта Общая активность Н0бщ Количество белка, мг Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

гомогенат гепатит+ТК 4,10+0,13 241,00+11,81 0,017±0,001 100 1

гепатиг+ГЗН 5,61+0,21 267,00±7,74 0,021+0,001 100 1

хроматография на сефадексе 025 гепатит+ТК 3,21+0,11 58,36±1,72 0,055±0,001 78,35 3,23

гепатит+ГБН 4,36+0,17 70,40+2,60 0,062+0,002 77,89 2,95

хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе гепатит+ТК 1,53+0,07 1,82+0,05 0,837±0,031 37,20 49,23

гепатит+ГЗН 1,69±0,06 1,73±0,03 0,97б±0,028 30,08 46,48

Концентри рование с помощью ячейки Атюоп гепатит+ТК 0,95±0,03 0,81±0,01 1,181±0,045 23,24 69,47

гепатит+Г8Н 1,33±0,05 0,87±0,02 1,538±0,053 23,82 73,24

хроматография на Тоуореаг1 Н\У-65 гепатит+ТК 0,36+0,01 0,20+0,01 1,820±0,072 8,88 107,06

гепатит+ГЭИ 0,45±0,02 0,21+0,01 2,194+0,079 8,06 104,48

*Примечание: в табл. обсуждаются статистически достоверные различия

при Р<0,05

Гомогенность ферментных препаратов ГП была подтверждена электрофорезом в ПААГ (рис. 1). Показано, что исследуемый фермент, полученный после гель -хроматографии на колонке с ТоуореаН Н\¥-65, во фракциях с максимальной активностью был гомогенен. Белок проявлялся в виде одной полосы с одинаковой электрофоретической подвижностью, КГ= 0,41, как в условиях нормы, так и при токсическом гепатите и при введении веществ-протекторов при патологии.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ ИЗ ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ГРУПП

Молекулярная масса ГП из печени контрольных и подвергнутых ЭТГ животных, а также крыс, которым вводили при патологии вещества-протекторы, определенная с помощью калибровочного графика, полученного при элюции белков-метчиков в ходе гель-хроматографии на Тоуореаг1 Н\У-65, составила 88±1,8 кДа. Методом электрофореза в присутствии ДДС-№ было получено значение 22±1,3 кДа (рис. 2, 3), что позволяет сделать заключение о том, что ГП является гомотетрамером. Таким образом, при развитии ЭТГ, действии тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона на фоне патологического состояния не происходит изменения молекулярной массы фермента. Это свидетельствует о том, что выявленные изменения активности ГП при ЭТГ и введении веществ-протекторов, по всей видимости, не связаны с реализацией ассоциативно - диссоциативного механизма регуляции, связанного с изменением субъединичного состава. Определенная величина молекулярной массы ГП близка с данными литературы для фермента, выделенного из других источников. Так, ГП из эритроцитов быка и цитозоля клеток человека 7 опухолевых линий является тетрамером с общей молекулярной массой 87 кДа и 88 кДа, соответственно (Кулинский В.И., 1993).

Рис. 1. Электрофореграмма ферментного препарата

глутатионпероксидазы из печени крысы в норме (А), при введении СС14 (Б), тиоктовой кислоты (В) и восстановленного глутатиона (Г) на фоне развития патологии, после окрашивания на белок: 1 - ГП; 2 -фронт маркера (бромфеноловый синий). Направление движения белка указано стрелкой.

С использованием полученных очищенных ферментных препаратов ГП были исследованы кинетические и регуляторные свойства фермента в норме, при развитии ЭТГ, действии тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона на фоне патологии.

В табл. 3 отражены некоторые кинетические параметры каталитического действия ГП из печени крысы в норме, при токсическом гепатите и действии веществ-протекторов. Установлено, что кинетика ферментативной реакции, катализируемой ГП, подчиняется уравнению Михаэлиса - Ментен. Выявлено, что при патологии происходит увелечение сродства фермента к субстратам. Наблюдаемое увеличение Км для субстратов при введении ТК и ГЭН на фоне ЭТГ, вероятно,

сопряжено с антиоксидантными свойствами данных соединений, которые приводят к снижению интенсивности свободнорадикального окисления. Таким образом, концентрация субстратов является важным аспектом в регуляции активности фермента.

2,20 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00

о,и

0,3

0,4

0,5

0,9 В,

Рис. 2. Определение

субъединичной молекулярной

массы глутатионпероксидазы из печени крысы в норме (1), при экспериментальном токсическом гепатите (2), при введении тиоктовой кислоты при патологии (3). при введении восстановленного глутатиона при патологии (4) методом электрофореза с ДДС-№. Маркерные белки: 5 - фосфорилаза Ь (97 кДа), 6 - бычий сывороточный альбумин (66 кДа), 7 - яичный альбумин (45 кДа), 8 карбоангидраза (30 кДа), 9- а-лактоальбумин (14,4 кДа).

Проведено исследование зависимости скорости ГП - реакции от концентрации ионов Н+ в норме, при патологии и действии веществ-протекторов. Выявлено, что фермент в норме проявляет максимальную ферментативную активность в диапазоне рН=7,24-7,62. Однако, оптимальным значением для проявления ферментативной активности ГП из печени контрольных крыс является значение рН 7,42. Уменьшение рН до 6,82 или увеличение его до 8,22 приводит к резкому снижению активности фермента, так как ГП становится нестабильной.

При патологии наблюдается смещение рН оптимума в более кислую сторону, он составляет 7,24, что очевидно имеет значение для функционирования фермента в условиях ацидоза, сопровождающего развитие окислительного стресса при токсическом гепатите. При введении ТК и ГБН на фоне развития патологии наблюдается изменение оптимальных значений рН в сторону контрольных значений, и рНшп = 7,42. Наблюдаемые изменения, вероятно, связаны с тем, что тиоктовая кислота и восстановленный глутатион благодаря своим антиоксидантным свойствам могут снижать интенсивность свободнорадикального окисления и. соответственно, сопутствующее развитие ацидоза, что и отражается на этом показателе.

Рис. 3. Электрофореграмма

глутатионпероксидазы после

электрофореза в присутствии ДДС-№ в норме (А), при интоксикации крыс четыреххлористым углеродом (Б), при введении тиоктовой кислоты (В) при патологии и при введении восстановленного глутатиона (Г) при ЭТГ. Маркерные белки: 1 - фосфорилаза Ь (97 кДа), 2 - яичный альбумин (45 кДа), 3 - карбоангидраза (30 кДа), 4 -ингибитор трипсина (20,1 кДа), 5 - а-лактоальбумин (14,4 кДа). 6 - фронт маркера (бромфеноловый синмй), 7 - зона локализации ГП. Стрелкой показано направление движения белка при электрофорезе.

Исследование термостабильности ГП из печени животных исследуемых групп выявило, что фермент достаточно устойчив к высоким температурам. Было показано, что при токсическом гепатите ГП менее устойчива к воздействию температур по сравнению с ферментом из печени контрольных животных. Не исключено, что это может быть связано со структурными изменениями молекулы фермента, происходящими при ишемическом повреждении ткани печени, вызванным экспериментальным токсическим гепатитом. Исходя из полученных данных, можно предположить, что введение веществ-протекторов способствует стабилизации молекулы фермента. Значения температурного оптимума, энергии активации для ГП из печени крыс исследуемых групп представлены в табл. 3.

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ, ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ВЕЩЕСТВ -

ПРОТЕКТОРОВ

В связи с тем, что ионы таких металлов как железо, медь, кальций играют значительную роль в инициации и развитии процессов СРО, нами было проведено изучение влияния данных ионов на функционирование ГП, выделенной из печени контрольных крыс, животных, подвергшихся воздействию ЭТГ, и крыс, которым на фоне развития патологии вводили ТК и ГЭН. Установлено, что ионы Ре3 (табл. 4) оказывают ингибирующее влияние неконкурентного типа на исследуемый фермент в условиях нормы, при ЭТГ, а также при введении ТК и Г8Н на фоне развития патологии. Отмечено, что при концентрации Ре31 0,15мМ наблюдается незначительный активирующий эффект в условиях нормы, в то время как при ЭТГ он менее выражен. При концентрациях данных ионов 0,03-0,05 мМ наблюдается снижение активности ГП в 1,4 раза при введении ТК и в 1,5 раза при введении Г8Н при патологии.

Некоторые кинетические параметры глутатионпероксидазы из печени животных экспериментальных групп

Экспериментальные группы крыс Значения Км, мМ рН опт рКа , ор Чшт> Еакт кДж

сен н2о2

Норма 0,033+0,001 0,208+0,001 7,42 6,9 -7,8 35 29,1

Токсический гепатит 0,011 ±0,005 0,185+0,009 7,24 6,7-7,7 45 8,2

Введение тиоктовой кислоты при токсическом гепатите 0,029±0,001 0,190±0,009 7,38 6,9-7,7 40 9,9

Ведение глутатиона на фоне патологии 0,018+0,008 0,174±0,008 7,36 7,1-7,8 42 12,3

""Примечание: в табл. обсуждаются статистически достоверные различия при Р<0,05

Снижение значения К„ наблюдаемое при токсическом гепатите, свидетельствует о большей чувствительности фермента к ингибирующему действию данных ионов, на фоне развития патологии. Ионы Ре2' (рис.4, табл. 4) оказывают сходное влияние на ферментативную активность ГП из печени животных разных групп. Данные ионы оказывают на фермент ингибирующее влияние неконкурентного типа, как в норме, так и при ЭТГ и введении веществ-протекторов при развитии патологии

Обнаружено, что ионы Си2+ (рис.4, табл. 4) оказывают ингибирующее влияние смешанного типа на фермент в норме, при ЭТГ и при введении веществ-протекторов. Следует отметить, что большее торможение активности наблюдается для фермента, выделенного из печени контрольных крыс Показано, что ионы Са2> также могут принимать участие в регуляции активности ГП. Так, в норме и при ЭТГ при концентрации данного иона 0,05 мМ происходит ингибирование активности фермента, однако для ГП из пораженной гепатотоксином печени этот эффект более выражен. При введении протекторов на фоне развития патологии существенных различий в воздействии Са^ на ферментативную активность ГП выявлено не было.

Нами было также проведено исследование влияния ионов на скорость протекания ферментативной реакции, катализируемой ГП в норме, при

токсическом гепатите и при действии веществ-протекторов. Результаты проведенных экспериментов показали, что данные ионы значительно повышают активность исследуемого фермента как в условиях нормы, так и при патологии. Следует отметить, что при введении веществ- протекторов активация фермента наблюдалась только при введении ГБН, а при введении ТК ионы практически не оказывают влияния на фермент.

Одним из основных постановщиков НАДФН для ГР/ГП системы является пентозофосфатный путь (ПФП). В связи с этим, нами была исследована зависимость скорости протекания ГП - реакции в условиях нормы, при ЭТГ и при введении веществ-протекторов от концентрации интермедиаторов данного метаболитического пути. Выявлено, что глюкозо - 6 - фосфат (Г6Ф) при концентрациях до 0,1 мМ оказывает активирующее воздействие на активность ГП из печени крыс в норме, а также из печени животных, которым вводили ТК и ГЙН при патологии, и практически не влияет на фермент, выделенный из патологически изменённой печени. При дальнейшем увеличении концентрации Г6Ф наблюдается ингибирование фермента из печени контрольных крыс, животных с экспериментальным токсическим гепатитом, и крыс, которым вводили ТК при патологии (рис.5, табл. 5)

Ш В 0,4 У

С 0.1 с из

У и 11 О У I [СфЧ

Рис. 4. Влияние ионов Рс2+ (А) и Си2+ (Б) на активность глутатионпероксидазы из печени крыс в норме (1), при экспериментальном токсическом гепатите (2), при введении тиоктовой кислоты на фоне развития токсического гепатита (3), и при введении восстановленного глутатиона при патологии (4).

В норме Г6Ф ингибирует ГП по смешанному типу, при ЭТГ данный метаболит оказывает ингибирующее действие по конкурентному типу, при введении тиоктовой кислоты при патологии наблюдается изменение типа ингибирования Г6Ф на смешанный Снижение значения К„ наблюдаемое при токсическом гепатите, свидетельствует о большей чувствительности фермента к ингибирующему действию Г6Ф (рис.5, табл. 5).

При изучении влияния рибозо - 5 - фосфата (Р5Ф) на активность ГП из печени крыс исследуемых групп были выявлены сходные тенденции. Показано, что Р5Ф выступает в качестве ингибитора фермента как в норме, так и при патологии и введении веществ-протекторов практически на всем диапазоне исследованных концентраций

Исследование регуляции активности ГП под действием адениннуклеотидов также выявило изменения регуляторных свойств при патологии АМФ оказывает ингибирующее воздействие бесконкурентного типа в условиях нормы и неконкурентный ингибирующий эффект при патологии и при введении тиоктовой кислоты (рис.6, табл. 5). АДФ ингибирует ГП по смешанному типу. НАДН также оказывает ингибирующее действие смешанного типа, более выраженное при ЭТГ. Наблюдается различная чувствительность ГП к АТФ в условиях нормы, при ЭТГ и действии ТК и ГБН (рис 6, табл 5)

Рис. 5. Влияние глюкозо-6-фосфата (А) и 6-фосфоглюконата (Б) на активность глутатионпероксидазы из печени крыс в норме (1), при экспериментальном токсическом гепатите (2), при введении тиоктовой кислоты на фоне развития токсического гепатита (3), и при введении восстановленного глутатиона при патологии (4).

Результаты исследования показали, что регуляция активности ГП может осуществляться под действием интермсдиатов цикла Кребса Влияние данных метаболитов имело различный характер в норме, при токсическом гепатите и действии веществ - протекторов на фоне развития патологии Так, например, 2-оксоглутарат при концентрациях 0,2-1,0 мМ оказывает активирующее действие на фермент в обоих случаях. Однако для фермента из пораженной гепатотоксином печени активирующий эффект более выражен по сравнению с ГП из печени животных контрольной группы. При введении веществ-протекторов на фоне развития патологии наблюдались сходные тенденции изменения активности ГП под действием 2- оксоглутарата (рис.7). Цитрат и изоцитрат оказывают активирующее действие на

фермент при токсическом гепатите и практически не влияют на ГП, выделенную из печени животных контрольной группы. Данные метаболиты оказывали сходное влияние на ГП при введении ТК И ГЭП при патологии (рис.8). Малат при ЭТГ в концентрациях более 0,1 мМ вызывает возрастание активности фермента в 1,5 раза по сравнению с начальной активностью, а при дальнейшем повышении концентрации метаболита активность фермента снижается. Данный интермедиат оказывает активирующий эффект на фермент, выделенный из печени крыс, которым вводили ТК при патологии во всем диапазоне исследуемых концентраций. При введении Г5Н на фоне патологии наблюдается незначительный ингибирующий эффект маната на ГП (рис.7).

О 0,1 к У 0,4 «< Ц 0,7

М 0$ I [Щ,ыМ

И 03 03 0.4 М 0« 5,7 м И 1

|АМО], М

Рис. 6. Влияние АТФ (А) и АМФ (Б) на активность глутатионпероксидазы из печени крыс в норме (1), при экспериментальном токсическом гепатите (2), при введении тиоктовой кислоты на фоне развития токсического гепатита (3) и при введении восстановленного глутатиона при патологии (4).

А Б

[Циа^мМ [ЬпвдфД!

Рис. 7. Влияние малата (А) и 2-оксоглутарата (Б) на активность глутатионпероксидазы из печени крыс в норме (1), при экспериментальном токсическом гепатите (2), при введении тиоктовой кислоты на фоне развития токсического гепатита (3) и при введении восстановленного глутатиона при патологии (4).

Константы и тип ингибирования глутатионпероксидазы из печени крыс экспериментальных групп ионами металлов

Интермедиаты Условия опыта К„ мМ Тип ингнбирования

Ге3+ Норма 9,50±0,43 Неконкурентное

Гепатит 2,80±0,13 Неконкурентное

Гепатит+ ТК 4,20±0,21 Неконкурентное

Гепатит+ГБН 3,10±0,14 Неконкурентное

Ре2+ Норма 5,90±0,28 Неконкурентное

Гепатит 3,10±0,15 Неконкурентное

Гепатит+ ТК 4,60±0,23 Неконкурентное

Гепатит+ГЗН 3,80±0,17 Неконкурентное

Си2+ Норма 4.50±0,22 Смешанное

Гепатит 6,10±0,29 Смешанное

Гепатит+ ТК 1,40±0,06 Смешанное

Гепатиг+ГЗН 1,60±0,07 Смешанное

"Примечание: в табл обсуждаются статистически достоверные различия при Р<0,05

0,1 и цз

04 и ОД а» 0,9 1 [четрш], иМ

0,1 V о,э у у и 4,1 У У I (пчирг^вМ

Рис. 8. Влияние цитрата (А) и изоцитрата (Б) на активность глутатионпероксидазы из печени крыс в норме (1), при экспериментальном токсическом гепатите (2), при введении тиоктовой кислоты на фоне развития токсического гепатита (3) и при введении восстановленного глутатиона при патологии (4)

Таблица 5.

Константы и тип ингибирования глутатионпероксидазы из печени крыс

экспериментальных групп некоторыми метаболитами

Интермедиаты Условия опыта К„ мМ Тип ингибирования

Глюкозо— 6 — фосфат Норма 1,50±0,07 Смешанное

Гепатит 0,35±0,02 Конкурентное

Гепатит+ ТК 1,30±0,05 Смешанное

Гепатит+ГБН - -

6 —фосфоглюконат Норма 0,55±0,03 Неконкурентное

Гепатит - -

Гепатит+ ТК 3,00±0,15 Неконкурентное

Гепатит+ГБН - -

Рибозо — 5 -фосфат Норма 0,74±0,03 Бесконкурентн ое

Гепатит 2,00±0,09 Смешанное

Гепатит+ ТК 2,30±0,11 Смешанное

Гепатит+ГБН 2,80±0,13 Смешанное

АМФ Норма 0,90±0,04 Бесконкурентное

Гепатит 2,40±0,11 Неконкурентное

Гепатит+ ТК 1,60±0,07 Неконкурентное

Гепатит+ГБН - -

АДФ Норма - -

Гепатит 2,70±0,12 Смешанное

Гепатит+ ТК 0,95±0,04 Смешанное

Гепатит+Г5Н 1,45±0,07 Смешанное

НАДН Норма 3.00±0,15 Смешанное

Гепатит 1,70±0,08 Смешанное

Гепатит+ ТК 2,15±0,11 Смешанное

Гепатит+ГЭП 2,75±0,13 Смешанное

"■Примечание, в табл обсуждаются статистически достоверные различия

при Р<0,05

Таким образом, в ходе проведенных исследований было показано, что при развитии оксидативного стресса в печени крыс наряду со сходными чертами наблюдаются изменения некоторых кинетических свойств и регуляции активности ГП. Введение протекторов может способствовать нормализации процессов и приближению параметров каталитического действия фермента к контрольным значениям

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что возрастание интенсивности свободнорадикальных процессов при патологии может приводить к изменению структуры и функционирования многих ферментов (Колесниченко JI.C., 1990). Очевидно, это касается и ГП.

С использованием электрофоретически гомогенных ферментных препаратов выявлено, что наряду с изменением активности фермента при патологии и действии протекторов для ГП характерна модификация ряда каталитических и регуляторных свойств. Вместе с тем, такие свойства как молекулярная масса, субъединичная структура, электрофоретическая подвижность, субклеточная локализация ГП из печени контрольных крыс, животных подвергнутых токсическому гепатиту, а также крыс, которым вводили вещества - протекторы при патологии не изменялись. Полученные данные позволяют предполагать, что изменение активности фермента, наблюдаемое при развитии патологии, не сопряжено с реализацией ассоциативно-диссоциативного механизма регуляции, связанного с изменением субъединичного состава, а также с перераспределением активности между субклеточными фракциями

Результаты исследования свидетельствуют о том, что в пораженной гепатотоксином печени крыс происходит изменение сродства фермента к субстратам (уменьшение Км в 3 раза по отношению к TSH и в 1,2 раза по отношению к Н2О2), сдвиг рН-оптимума в сторону более кислых значений, температурного оптимума в сторону более высоких температур. Изменение регуляции активности ГП, наблюдаемое в условиях интенсификации СРО, по отношению к ионам некоторых металлов, нуклеотидфосфатам, интермедитам цикла Кребса и пентозофосфатного пути свидетельствует о модификации ряда механизмов метаболитной регуляции при патологии печени. Можно предположить, что изменение регуляции активности ГП может в определенной степени рассматриваться в рамках реализации физико -химического механизма адаптационной реакции к повышению концентрации АФК при патологии. В то же время введение веществ - протекторов животным при патологии приводит к изменению многих исследованных параметров в сторону нормы, что может являться следствием снижения данными соединениями уровня свободнорадикальных процессов, реализующегося как за счет их прямого антиоксидантного действия, так и участия в стимулировании антиоксидантных систем организма. При введении ТК на фоне развития патологии наблюдается снижение удельной активности ГП в 2 раза, а при введении TSH в 1,6 раза Характерно, что при этом также происходит изменение ряда каталитических свойств фермента, в частности, температурного и рН - оптимумов в сторону контрольных значений. Можно предположить, что изменение активности ГП и ряда регуляторных свойств происходит за счет конформационных перестроек в молекуле фермента.

На основании результатов проведённых исследований была предложена гипотетическая схема, отражающая регуляцию активности ГП, обеспечивающей контроль интенсивности СРО при патологии и действии веществ - протекторов. Согласно данной схеме представленной на рис. 8 четыреххлористый углерод, поступая в печень, инициирует развитие свободнорадикальных процессов, приводящих к повреждению клеточных структур. Интенсификация СРО приводит к нарушению структурно - функционального состояния клеточных мембран, увеличению их проницаемости и как следствие к повреждению гепатоцитов печени (Карташова О.Я., 1975; Zhu, Fung ,2000). Вместе с тем, при ЭТГ происходит мобилизация АОС организма, в которой важное место занимает ГР/ГП система

Известно, что интенсивность протекания центральных метаболических процессов в клетке может снижаться при развитии оксидативного стресса (Colussi С., Morgan Р.Е , 2002). В данном случае происходит изменение концентраций метаболитов,

участвующих в реализации функционирования данных путей в клетках. Модификация микроокружения фермента, очевидно, может отражаться на его регуляторных свойствах. Так, нами была показана возможность активирования ГП малатом в норме. При развитии ЭТГ малат оказывает слабый ингибирующий эффект на фермент. При введении ТК при патологии данный метаболит оказывает активирующее действие на ГП, а при введении TSH наблюдается незначительный ингибирующий эффект. 2 - Оксоглутарат оказывает активирующий эффект на ГП как в норме, так и при ЭТГ. Однако для фермента из пораженной гепатотоксином печени активирующий эффект более выражен по сравнению с ГП из печени животных контрольной группы. При введении протекторов наблюдались сходные тенденции изменения активности ГП под действием 2 - оксоглутарата. Было показано, что глюкозо - 6 - фосфат оказывает активирующее воздействие на активность ГП из печени крыс в норме, а также из печени животных, которым вводили ТК и TSH при патологии, и практически не влияет на фермент, выделенный из патологически изменённой печени. Особенности регуляции активности фермента при развитии патологии могут иметь определенное значение для сопряжения его функционирования с другими метаболическими путями. Также было выявлено активирующее действие АТФ на фермент из печени животных контрольной группы, данный эффект отсутствовал при ЭТГ. При введении ТК и TSH было показано ингибирующее действие АТФ на активность ГП. НАДН оказывает ингибирующее воздействие на активность ГП, выделенной из печени животных всех исследуемых групп, однако в условиях нормы этот эффект наиболее выражен

Согласно результатам проведенных исследований, ионы Са2+ ингибируют ГП в норме и при ЭТГ, однако для ГП из пораженной гепатотоксином печени этот эффект более выражен. При введении протекторов на фоне развития патологии существенных различий в воздействии Са2+ на ферментативную активность ГП выявлено не было. Ионы Fe2+ оказывают ингибирующий эффект практически на всем диапазоне исследуемых концентраций как в норме, так и при ЭТГ и введении веществ - протекторов при патологии. Показано, что ионы Си2+ снижают активность ГП, причём большее торможение ферментативной активности наблюдается для фермента, выделенного из печени контрольных крыс

Таким образом, было проведено исследование особенностей функционирования глутатионпероксидазы из печени контрольных, подвергнутых токсическому гепатиту крыс, а также животных, которым вводили вещества - протекторы на фоне патологии. Результаты исследований показали, что как в норме, так и при ЭТГ и введении веществ - протекторов существуют разнообразные механизмы регуляции активности ГП. Однако при патологии наблюдаются особенности регуляторных свойств фермента, которые могут иметь определенное значение для реализации адаптивных процессов на клеточном уровне в условиях изменения уровня генерирования АФК. Установлено, что при развитии токсического гепатита происходит изменение активности ГП под влиянием ионов некоторых металлов, адениннуклеотидов, интермедиатов пентозофосфатного пути и ЦТК. Это может быть сопряжено с возрастанием уровня АФК, значительно повышающегося при патологии. Введение протекторов может способствовать нормализации процессов происходящих в патологически изменённой печени, что также может отражаться на каталитических свойствах и регуляции активности фермента.

гликолиз

НАДО -

-\ДФН-Н

глюкоза

•.Л л?

1ЛКШГИ>- ---

6-ф<лфаг ^^

Г6ФДГ

6-фсч.ф(Л люка шкюи

НЛДФ ■

ЦФЦ.Ц у

бФГД1'(па>п)

• ЗА

6-фосфо! л юконз т \

\ / \ ✓

рибочо-5-фосфат

СП/

Условные обозначения:

О (• )-акгивируюший (ингибируюший) эффект в норме; О (■ )-активирующий (ингибируюший) эффект при экспериментальном

токсическом гепатите, Д (А )-активируюший (ингибируюший) эффект при введении тиоктовой кислоты на фоне развития токсического гепатита; ( 'А')-активируюший (иигибирующий) эффект при введении восстановленного глутатиона при патологии

Рис. 9. Гипотетическая схема, отражающая регуляцию активности глутатионпероксидазы при патологии и действии веществ - протекторов.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что активность ГП в печени крыс, возрастающая в 2,5 раза при ЭТГ, снижается при введении животным ТК и ГБН в 1,9 и 1,6 раза, соответственно.

2. С использованием гомогенных ферментных препаратов установлено, что ГП из печени контрольных, подвергнутых токсическому гепатиту крыс, а также животных, которым вводили вещества - протекторы на фоне патологии, наряду со сходными физико-химическими свойствами (молекулярная масса Мг=88 кДа, гомотетрамерная субъединичная структура, электрофоретическая подвижность), характерны различия некоторых кинетических и регуляторных свойств.

3. Обнаружено, что при токсическом поражении экспериментальных животных ССЦ происходят изменения кинетических параметров каталитического действия фермента: Км, температурного и рН-оптимумов, энергии активации. При введении ТК и ГЭН данные показатели приближаются к значениям, характерным для фермента из печени интактных животных.

4. В регуляции активности ГП могут принимать участие ионы ряда металлов (Си21, Са2+, Мц21, Ре21, Ре31). Действие ионов Гс2', Ре3+ на ГП из печени крыс исследуемых групп характеризуется неконкурентным типом ингибирования, ионов Си2' - смешанным типом К1 для данных ионов изменяются при патологии и действии веществ - протекторов. Ионы [у^2 ' оказывают активирующий эффект на фермент. Действие ионов Са на активность фермента из печени крыс исследуемых групп зависит от их концентрации.

5. Выявлены особенности регуляции активности фермента в условиях нормы, при токсическом гепатите и при введении ТК и ГБН под действием ряда метаболитов ЦТК: малата, 2- оксоглутарата, оксалоацетата.

6. Показано участие АТФ, АДФ, АМФ, НАДН и НАДФН в регуляции скорости протекания ГП - реакции в норме, при токсическом гепатите и при введении веществ - протекторов. Установлено, что в условиях развития ЭТГ и введения протекторов происходит изменение чувствительности фермента к действию данных метаболитов.

7. Выявлены различия в регуляции активности фермента некоторыми интермедиатами пентозофосфатного пути: глюкозо - 6 - фосфатом, 6-фосфоглюконатом в норме, при токсическом гепатите и введении веществ -протекторов на фоне развития патологии.

8. На основании результатов исследования функционирования ГП предложена схема, отражающая регуляцию активности фермента при патологии и действии веществ - протекторов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Шульгин К.К. Частичная очистка и некоторые свойства глутатионпероксидазы из печени крысы / К.К. Шульгин, Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова // Тезисы докладов I Всероссийской молодежной медицинской конференции студентов и молодых ученых «Экстремальные и терминальные состояния». - Омск, 2006. - С.97-98.

2 Шульгин K.K Влияние некоторых интермедиатов пентозофосфатпого пути на активность глутатионпероксидазы из печени крыс в норме и при токсическом гепатите / Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова, А А. Агарков И Материалы научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)». - Ростов-на-Дону, 2006. -С. 35.

3. Шульгин К.К Сравнительная характеристика каталитических и регуляторных свойств глутатионпероксидазы в печени крысы в норме и при экспериментальном токсическом гепатите / Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова, A.A. Агарков // Вестник ВГУ, серия-химия, биология, фармация, - №1. 2007. - С.Ш-114.

4. Шульгин К.К. Исследование влияния некоторых органических кислот на активность глутатионпероксидазы в норме и при токсическом гепатите / Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова, A.A. Агарков // Тезисы докладов 20-го съезда физиологического общества им. И.П Павлова при РАН, Москва. - 2007. - С. 494

5. Шульгин К.К, Индукция активности глутатионпероксидазы в печени крысы при введении глутатиона / Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова, A.A. Грузинова // Материалы 3-ей Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ. Воронеж. - 2007,- С. 407-410

6. Шульгин К.К. Получение и свойства глутатионпероксидазы / Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова // Прикладная биохимия и микробиология. - 2008. - V.44. №3. - С. 276-280.

7. Шульгин К.К. Каталитические свойства глутатионпероксидазы в норме и при токсическом гепатите / Т.Н. Попова, Т.И. Рахманова, В.Г. Артюхов, A.A. Агарков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2008. - №3. - С. 38-41.

8. Шульгин К.К Влияние аденозинфосфатов на активность глутатионпероксидазы из печени крыс в норме и при развитии экспериментального токсического гепатита. / Т.И. Рахманова, Т.Н Попова, А А. Агарков // Сборник материалов международной научной конференции Саранск. - 2008. - Т.2. С. 87-89.

Статьи № 6, 7 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК.

Подписано в печать 27 10 08 Формат 60«84 '/,а Усл. печ л 1, Тираж 100 экз Заказ 2006

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательско-полиграфнческого центра Воронежского государственного университета 394000, Воронеж, ул Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шульгин, Константин Константинович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантиая система

1.1.1. Свободные радикалы и пути их образования

1.1.2. Пероксидное окисление липидов и его роль

1.1.3. Активные формы кислорода, механизм их образования

1.1.4. Роль свободнорадикального окисления в развитии 22 патологических состояний

1.1.5. Антиоксидантиая система защиты

1.1.5.1. Ферментативные антиоксиданты

1.1.5.2. Неферментативное звено антиоксидантной системы

1.1.6 Токсические гепатиты и вызывающие их факторы

1.2. Характеристика глутатионпероксидазы из различных 35 источников

1.2.1. Катализируемая реакция

1.2.2. Роль глутатионпероксидазы в организме

1.2.3. Тканевая и субклеточная локализация глутатионпероксидазы

1.2.4. Очистка глутатионпероксидазы

1.2.5. Структура и молекулярная масса фермента

1.2.6. Исследование активного центра глутатионпероксидазы

1.2.7. Сопряжение функционирования глутатионпероксидазы с 44 глутатионредуктазой

1.2.8. Участие глутатионпероксидазы в обмене эйкозаноидов

1.3. Кинетическое поведение глутатионпероксидазы

1.3.1. Влияние температуры и концентрации ионов водорода на 47 активность фермента

1.3.2. Регуляция активности глутатионпероксидазы

1.3.3. Изменение активности глутатионпероксидазы при патологических состояниях

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования

2.2. Создание модели экспериментального токсического гепатита

2.3. Получение субклеточных фракций гепатоцитов

2.4. Определение активности ферментов

2.5. Определение количества белка

2.6. Выделение и очистка глутатионпероксидазы из печени крыс

2.6.1. Экстракция

2.6.2. Гель-фильтрация на сефадексе С

2.6.3. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

2.6.4. Концентрирование фракций фермента

2.6.5. Гель-хроматография на Тоуореаг1 НГ\¥

2.7. Исследование кинетических характеристик и регуляции 58 активности фермента

2.8. Аналитический электрофорез

2.9. Определение молекулярной массы фермента

2.10. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. Активность, субклеточная локализация и 60 очистка глутатионпероксидазы из печени крысы в норме, при токсическом гепатите и действии веществ протекторов

3.1. Активность глутатионпероксидазы из печени крыс в норме, 60 при токсическом гепатите и введении протекторов при патологии

3.2. Исследование субклеточной локализации 60 глутатионпероксидазы

3.3. Очистка глутатионпероксидазы из печени крыс исследуемых групп

ГЛАВА 4. Физико - химические свойства и кинетические параметры каталитического действия глутатионпероксидазы из печени крысы в норме, при токсическом гепатите и действии веществ - протекторов

4.1. Молекулярная масса глутатионпероксидазы

4.2. Исследование кинетических параметров каталитического 70 действия глутатионпероксидазы в норме, при экспериментальном токсическом гепатите и действии веществ протекторов

4.3. Влияние концентрации ионов водорода на активность 74 глутатионпероксидазы из печени крыс в норме, при экспериментальном токсическом гепатите и при введении веществ — протекторов

4.4. Исследование влияния температуры на активность 77 глутатионпероксидазы из печени крыс в норме, при патологии и при введении веществ - протекторов

ГЛАВА 5. Регуляция активности глутатионпероксидазы 85 из печени крысы в норме, при токсическом гепатите и действии веществ - протекторов

5.1. Участие ионов металлов в регуляции активности 85 глутатионпероксидазы в норме, при токсическом поражении печени и введении веществ — протекторов на фоне развития патологии

5.1.1. Роль ионов Мё2+ в регуляции активности 85 глутатионпероксидазы

5.1.2. Влияние ионов железа на активность глутатионпероксидазы

5.1.3. Влияние ионов Си2+ , Са2+ на активность 94 глутатионпероксидазы

5.2. Влияние интермедиатов пентозофосфатного пути на активность глутатионпероксидазы

5.3. Влияние аденозинфосфатов на активность 104 глутатионпероксидазы из печени крысы исследуемых групп

5.4. Влияние нуклеотидов на активность глутатионпероксидазы

5.5. Влияние ряда органических кислот на активность 116 глутатионпероксидазы в норме, при токсическом поражении печени и введении веществ — протекторов на фоне развития патологии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция активности глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени крыс и действии веществ - протекторов"

Актуальность работы. В настоящее время важнейшим направлением современной биохимии является исследование функционирования отдельных звеньев клеточного метаболизма при патологических состояниях, что способствует выяснению молекулярных основ патогенеза многих заболеваний. Согласно современным представлениям, интенсификация свободнорадикальных процессов является одним из ведущих механизмов клеточной патологии, включая сердечно -сосудистые заболевания, аутоиммунные болезни, хронические воспаления, нейродегенеративные заболевания и другие [20, 25, 30, 33, 69, 101, 105, 123, 124, 241]. В основе развития ряда заболеваний печени также лежит нарушение баланса между интенсивностью процессов свободнорадикального окисления (СРО) и активностью антиоксидантной системы организма (АОС) [85, 229. 230]. Активные формы кислорода (АФК) выполняют важную роль в жизнедеятельности, однако при интенсификации их образования происходит усиление процессов СРО, что сопровождается нарушениями в свойствах биомембран, функционирования клеточного метаболизма и приводит к гибели клеток [126, 134, 145].

Глутатионпероксидаза (ГП; К.Ф. 1:11.1.9.) катализирует реакцию детоксикации органических и неорганических пероксидов без образования свободных радикалов, используя в качестве донора водорода восстановленный глутатион (ГЭН) [80]. Активность ГП существенно зависит от концентрации данного субстрата, а следовательно от активности глутатионредуктазы (ГР) и уровня НАДФН в клетке [158, 159, 163, 174, 205]. ГП находит широкое применение в научно-исследовательской практике, являясь удобным объектом изучения механизмов компенсации дезадаптационных сдвигов на уровне отдельных антиоксидантных ферментов, что представляет как самостоятельный научный интерес, так и служит ключом к пониманию роли происходящих метаболических изменений при интенсификации СРО [63, 111]. К настоящему времени изучены физико-химические свойства ГП, выделенной из ряда организмов, в норме [157, 160, 179]. Однако, такой аспект, как особенности функционирования фермента при патологии, в частности, при заболеваниях печени и действии веществ - протекторов остается не изученным. Вместе с тем, существенный интерес представляет поиск средств, способных воздействовать на компоненты АОС и повышать резистентность организма к повреждающему действию свободных радикалов в патологическом состоянии [41, 61]. Перспективными в этом отношении являются тиоктовая кислота (ТК) и восстановленный глутатион (ГБН), но их влияние на регуляцию активности ферментов АОС, и в частности ГП, остаются не исследоваиными. Антиоксидантный эффект ТК обусловлен наличием двух тиоловых групп в молекуле, а также способностью связывать радикалы и ионы металлов, предотвращая их участие в СРО. Антиоксидантный эффект TSH заключается в обезвреживании перекисей и гидроксильных радикалов. Являясь одним из важнейших компонентов системы антиоксидантной защиты клетки, FSH не только напрямую реагирует с радикалами в неэнзиматических реакциях, но и служит донором электронов при восстановлении клеточных пероксидов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование каталитических свойств и регуляции активности ГП из печени крыс в норме, при токсическом гепатите и введении веществ - протекторов: ТК и TSH, при патологии.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Определение активности и субклеточной локализации ГП из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и действии веществ — протекторов: ТК и ГБН.

3. Сравнительная характеристика кинетических параметров каталитического действия ГП из печени крыс в норме, в условиях развития оксидативного стресса, вызванного введением СС14, и действия веществ -протекторов при патологии.

4. Изучение участия ионов металлов и нуклеотидфосфатов в регуляции активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении ТК и Г8Н.

5. Исследование регуляции активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении веществ — протекторов под действием метаболитов цикла Кребса.

6. Изучение участия интермедиатов пентозофосфатного пути (ПФП) в регуляции активности ГП из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении ТК и ГБН при патологии.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование особенностей регуляции активности ГП в условиях развития токсического гепатита у экспериментальных животных, а также при действии веществ — протекторов в патологическом состоянии. Разработаны способы очистки и получены гомогенные препараты ГП из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс, а также животных, которым при развитии патологии вводили вещества - протекторы. Впервые дана сравнительная характеристика каталитических и регуляторных свойств ГП в норме, при токсическом поражении печени и действии ТК и Г8Н. Полученные данные свидетельствуют, что контроль образования АФК может осуществляться за счет изменения активности ГП, взаимосвязанного с модификацией кинетических свойств и регуляции активности фермента под действием

3+ 2+ ионов металлов (Бе , Бе , Са , Си ), интермедиатов цикла Кребса, пентозофосфатного пути, нуклеотидфосфатов. Полученные данные способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений о регуляции генерирования АФК с помощью ключевого фермента антиоксидантной системы в условиях развития токсического гепатита и действия веществ - протекторов.

Практическая значимость. Изучение метаболитной регуляции ГП в условиях экспериментального токсического гепатита и действия веществ — протекторов может играть существенную роль в понимании развития патологического процесса и поиске путей его коррекции в медицинской практике. Разработанные способы получения гомогенной ГП могут применяться для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Гомогенная ГП может быть использована для решения актуальных проблем молекулярной биологии в области разработки методов многопараметрического анализа (биочипов), направленных, кроме диагностики различных заболеваний человека, на выявление токсических компонентов в окружающей среде, а также для прерывания процессов самоокисления и стабилизации мембран липосом [23, 161, 164]. Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», «Медицинская биохимия», а также спецкурсов по аналитической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на I Всероссийской молодежной медицинской конференции студентов и молодых ученых «Экстремальные и терминальные состояния» (Омск, 2006), на научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» (Ростов-на-Дону, 2006), на 20-м съезде физиологического общества им. И.П. Павлова РАН (Москва, 2007), на 3-ей Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ (Воронеж, 2007), на международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Н.П. Огарёва, (Саранск, 2008), на научно-практической конференции «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболевай человека» Российской академии естествознания, 2008.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 8 публикациях - в 3 статьях и 5 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Активность ГП в печени крыс, возрастающая при ЭТГ, изменяется в сторону нормы при введении животным веществ — протекторов (ТК и TSH), что не сопряжено с модификацией таких характеристик фермента как молекулярная масса, субъединичная структура, электрофоретическая подвижность, субклеточная локализация.

2. С использованием гомогенных ферментных препаратов ГП показано, что в условиях патологии и действия веществ - протекторов изменяются кинетические параметры каталитического действия фермента (Км, температурный и рН-оптимумы, энергия активации). Введение ТК и TSH животным приводит к приближению данных показателей к контрольным значениям.

3. При интоксикации крыс СС14 и введении животным веществ — протекторов имеет место ряд особенностей регуляции активности ГП под действием ионов металлов (Ре2+, Ре3+, Са2+ ,Си2+), интермедиатов цикла Кребса и пентозофосфатного пути, нуклеотидфосфатов. Ряд модификаций регуляторных свойств ГП, характерных для фермента из пораженной гепатотоксином печени, такие как стимуляция активности 6 — фосфоглюконатом, 2 — оксоглутаратом, уменьшение чувствительности к ингибирующему действию ионов

Си , АМФ могут способствовать увеличению активности фермента при патологии.

4. С учётом полученных данных о функционировании ГП в печени крысы в условиях токсического поражения и действия веществ — протекторов предложена гипотетическая схема, отражающая регуляцию активности данного фермента, обеспечивающего контроль интенсивности СРО.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шульгин, Константин Константинович

выводы

2. С использованием гомогенных ферментных препаратов установлено, что для ГП из печени контрольных, подвергнутых токсическому гепатиту крыс, а также животных, которым вводили вещества — протекторы на фоне патологии, наряду со сходными физико-химическими свойствами (молекулярная масса Мг=88 кДа, гомотетрамерная субъединичная структура, электрофоретическая подвижность), характерны различия некоторых кинетических и регуляторных свойств.

3. Обнаружено, что при токсическом поражении экспериментальных животных СС14 происходят изменения кинетических параметров каталитического действия фермента: Км, температурного и рН-оптимумов, энергии активации. При введении ТК и ГБН данные показатели приближаются к значениям, характерным для фермента из печени интактных животных.

4. В регуляции активности ГП могут принимать участие ионы ряда

21 ^7+ 2-(. 3~Ь 2+ 71 металлов (Си , Са , М^, Бе , Ге^). Действие ионов Бе , Ге на ГП из печени крыс исследуемых групп характеризуется неконкурентным типом ингибирования, ионов Си - смешанным типом. К1 для данных ионов изменяются при патологии и действии веществ — протекторов. Ионы оказывают активирующий эффект на фермент. Действие ионов Са на активность фермента из печени крыс исследуемых групп зависит от их концентрации.

6. Показано участие АТФ, АДФ, АМФ, НАДН и НАДФН в регуляции скорости протекания ГП - реакции в норме, при токсическом гепатите и при введении веществ — протекторов. Установлено, что в условиях развития ЭТТ и введения протекторов происходит изменение чувствительности фермента к действию данных метаболитов.

7. Выявлены различия в регуляции активности фермента некоторыми интермедиатами пентозофосфатного пути: глюкозо — 6 — фосфатом, 6-фосфоглюконатом в норме, при токсическом гепатите и введении веществ -протекторов на фоне развития патологии.

8. На основании результатов исследования функционирования ГП предложена схема, отражающая регуляцию активности фермента при патологии и действии веществ — протекторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённые исследования показали, что развитие процессов СРО в ткани печени при токсическом гепатите приводит к повышению активности глутатионпероксидазы в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой животных. Известно, что возрастание интенсивности свободнорадикальных процессов при патологии может приводить к изменению структуры и функционирования многих ферментов [76, 77]. Очевидно, это касается и ГП.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шульгин, Константин Константинович, Воронеж

1. Абдулаев Н.Х. Печень при интоксикации гепатотропными ядами / Н.Х. Абдулаев, Х.Я. Каримов. - Ташкент: Медицина УзСССР, 1989. - 25 с.

2. Абдуллаев Ф.И. Некоторые биохимические аспекты действия селена на организм животных / Ф.И. Абдуллаев // Успехи современной биологии. 1989. - Т. 108, №2. - С. 270-287.

3. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества / Ж.И. Абрамова, Г.И. Оксенгендлер — Л.: Наука, 1985. — 230 с.

4. Азизова O.A. О роли эндогенного свободного железа в ишемическом повреждении печени / O.A. Азизова, A.B. Козлов // Свободные радикалы и биостабилизаторы: 1-й болг. сов. симп., София, 2326 ноября 1987 г.: тез. докл. - София, 1987. - С. 3.

5. Антиоксидантная система, онтогенез и старение / О.Н. Воскресенский и др. // Вопросы медицинской химии. 1982. - №1. - С. 14-27.

6. Антиоксидантные свойства производных 3-оксипиридина: мексидола, эмоксипина и проксипина / Г.И. Клебанов и др. // Вопросы медицинской химии. 2001. - №3. — (http: // medi. ru / doc / 88. htm).

7. Антоненков В.Д. Дегидрогеназы пентозного цикла в пероксисомах печени крысы / В.Д. Антоненков, Л.Ф. Пасченко // Биохимия. 1984. -Т. 49.-С. 1159-1165.

8. Артюхов В.Г. Биологические мембраны (структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами) / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 2000. -296 с.

9. Арчаков А.И. Окисление чужеродных соединений и проблемы токсикологии /А.И. Арчаков, И.И. Карузина // Вест.АМН СССР. — 1988.-N. 1.- С. 14-24.

10. Афанасьев И.Б. Свободнорадикальные ингибиторы и промоторы в биологических процессах / И.Б. Афанасьев // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. — 1988. — С. 9-25.

11. Балаболкин М.И. Дифференциальная диагностика и лечение эндокринных заболеваний: Руководство / М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова, В.М. Креминская. М.: Медицина, 2002. - 360 с.

12. Баранов A.A. Актуальные вопросы детской гастроэнтерологии. / A.A. Баранов, П.Л. Щербаков // Вопросы современной педиатрии. 2002. -Т. 1. - №1. - С. 12-16.

13. Барышников А.Ю. Программированная клеточная смерть (апоптоз) / А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин // Росс. Онкол. Журн. 1996. - №1. - С. 58.

14. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. — М.: Медицина, 1998. 704 с.

15. Биленко М.В. Ишемическое и реперфузионное повреждение органов / М.В. Биленко. М.: Медицина, 1989. - 368 с.

16. Биохимия человека / Р. Марри и др.. М.: Мир, 1993. - 415с.

17. Блюгер А.Ф. Роль нарушений функций мембран в патологии печени / А.Ф. Блюгер, А .Я. Майоре, В.К. Залцмане // Биомембраны: Структура, функции, мед. аспекты. Рига, 1981. - С. 185-195.

18. Болдырев A.A. Окислительный стресс и мозг / A.A. Болдырев // Соросовский образовательный журнал. 2001. - Т. 7, № 4. - С. 21-28.

19. Бурлакова Е.Б. Молекулярные механизмы действия антиоксидантов при лечении сердечно-сосудистых заболеваний / Е.Б. Бурлакова // Кардиология. 1980. - №8. - С. 48-52.

20. Бустаманте Д. Метаболизм а-липоевой кислоты в печени при различных формах патологии / Д. Бустаманте, Д. Лодж, Л. Маркоччи // Международный медицинский журнал. 2001. — № 2. - С. 133-142.

21. Вартанян Л.С. Образование супероксидных радикалов в мембранах субклеточных органелл регенерирующей печени / Л.С. Вартанян // Биохимия. 1992.-Т. 57, №5.-С. 671-675.

22. Варфоломеев С.Д. Биосенсоры / С.Д. Варфоломеев // Соросовский образовательный журнал. 1997.- Т. 3, №1.- С. 45-49.

23. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного бислоя биологических мембран / Ю.А. Владимиров // Биофизика. 1987. - Т. 32, вып. 5. - С. 830-844.

24. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М.: Наука, 1972. - 252 с.

25. Владимиров Ю.А. Структурная организация мембраны / Ю.А. Владимиров, А.Ф. Поглазов // Биол. мембраны. М., 1973. - С. 7-47.

26. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы в биологических системах / Ю.А. Владимиров // Соросовский образовательный журнал. 2000. -Т. 6, №12.-С. 13-19.

27. Владимиров Ю.А. Кальциевые насосы живой клетки // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. №3. С. 20-27.

28. Воскресенский О.Н. Перекиси липидов в живом организме / О.Н. Воскресенский, А.П. Левицкий // Вопросы медицинской химии. -1970.-Т. 16, №6. -С. 563-583.

29. Воскресенский О.Н. Биоантиоксиданты облигатные факторы питания / О.Н. Воскресенский, В.Н. Бобырев // Вопросы медицинской химии. -1992. - №4.- С. 21-26.

30. Гаврилова А.Р. Определение активности глутатионпероксидазы эритроцитов при насыщенных концентрациях субстрата / А.Р. Гаврилова, Н.Ф. Хмара // Лабораторное дело. 1986. - №12.1. С. 724-727.

31. Галенюк В.А. Гипоксия и углеводный обмен макромолекул / В.А. Галенюк. Новосибирск, 1985. - 159 с.

32. Гацура В.В. Фармакологическая коррекция энергетического обмена ишемизированного миокарда / В.В. Гацура. М.: Антекс, 1993. - 254 с.

33. Горожанская Е.Г. Роль глутатионзависимых пероксидаз в регуляции утилизации липопероксидов в злокачественных опухолях / Э.Г. Горожанская, В.Б. Ларионова, Г.Н. Зубрихина // Биохимия. 2001. - Т. 66, вып. 2.-С. 273-278.

34. Григорьев П.Я. Диагностика и лечение органов пищеварения / П.Я. Григорьев, Э.П. Яковенко. М.: Медицина, 1996. - 515 с.

35. Губский Ю.И. Коррекция химических поражений печени / Ю.И. Губский. Киев: Здоровье, 1989. - 156 с.

36. Гусев В.А. Супероксидный радикал и супероксиддисмутаза в свободнорадикальной теории старения / В.А. Гусев, Л. Ф. Панченко // Вопр. мед. химии. 1982. - №4. - С. 8-25.

37. Делянин Н.В. Механизмы антиоксидантной системы организма при изменении режима кислородного обеспечения / Н.В. Делянин, A.M. Герасимов // Материалы международной научной конференции, Гродно, 1993.-С. 18-19.

38. Девяткина Т. А. Особенности процессов перекисного окисления липидов в различных тканях при остром стрессе и его коррекция пирацетамом и церебролизином / Т.А. Девяткина, Е.М. Важничая, Р.В. Луценко // Биохимия. 2000. - Т.4. - С. 38-41.

39. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма / Е.Е. Дубинина // Успехи современной биологии. 1989. - Т. 108, №1(4). - С. 3-12.

40. Дубинина Е.Е. Антиоксидантная система плазмы крови / Е.Е. Дубинина // Укр. биохим. журн. 1992. - Т. 64, №2. - С. 3-15.

41. Дубинина Е.Е. Некоторые особенности функционирования ферментативной антиоксидантной защиты плазмы крови человека / Е.Е. Дубинина // Биохимия. 1993. - Т.58, вып 2. - С. 268-273.

42. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т. 2.-515 с.

43. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т. 3. - 605 с.

44. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. -М.: Мир, 1970. 252 с.

45. Дэвис Г. Электрофорез. / Г. Дэвис. М.: Мир. - 1970. - 56 с.

46. Евстигнеева Р.П. Витамин Е как универсальный антиоксидант и стабилизатор биологических мембран / Р.П. Евстигнеева, И.М. Волкова, В.В. Чудинова // Биол. мембраны. 1998. - Т. 15, №2. - С. 119-137.

47. Жеребцов H.A. Биохимия: учебник / H.A. Жеребцов, Т.Н. Попова, В.Г.

48. Артюхов. Воронеж: Издат-во Воронеж, ун-та, 2002. - 696 с.

49. Зайцев В.Г. Методологические аспекты исследований свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма / В.Г. Зайцев, В.И. Закревский // Вестник Волгоградской медицинской академии. 1998. - Вып. 4. - С. 49-53.

50. Зенков H.A. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах / H.A. Зенков, Е.Б. Меньшикова // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113, вып. 3. - С. 286-296.

51. Зенков Н.К. Окислительный стресс: Биохимический и патофизический аспекты / Н.К. Зенков, В.З.Ланкин, Е.Б. Меньшикова. М.: МАИК «Наука / Интерпериодика», 2001. - 343 с.

52. Изменение активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в процессе интенсификации перекисного окисления липидов при ишемии печени / Л.Б. Дудник и др. // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. — 1981. №4. - С. 451453.

53. Исследование влияния растительных сборов с антиоксидантными свойствами на состояние животных при физической нагрузке и эмоциональном стрессе / Ю.Г. Азнабаева и др.-(http://www.trava.ufacom.ru/science7.htm).

54. Каган В. Е. Об участии свободных активных форм кислорода в ферментативном перекисном окислении липидов в биомембранах / В.Е. Каган, В.М. Саввов, Л.Л. Прилипко // Биофизика. 1979. - Т. 44, №3. - С. 482-489.

55. Каган В.Е. Проблема анализа эндогенных продуктов пероксидного окисления липидов / В.Е. Каган, О.Н. Орлов, Л.Л. Прилипко // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1986. - Т. 18, №4. - С. 136.

56. Каган В.Е. Биологические проблемы старения: замедление старения антиоксидантами / В.Е. Каган, О.Н. Орлов, Л.Л. Прилипко // Итоги науки и техники. Биофизика. 1986. - Т. 18. - С. 180-186.

57. Казимирко В.И. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия / В.И. Казимирко, В.И. Бутылин, Н.И. Горобец.- К.: Морион, 2004.- 160 с.

58. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: справочник. Мед. лаб. технологии / А.И. Карпищенко; под ред. А.И. Карпищенко. СПб.: Интермедика, 1992. - 656 с.

59. Карпищенко A.C. Медицинская технология и лабораторная диагностика. Справочник в 2т. Т.1. Медицинские и лабораторные технологии. / A.C. Карпищенко // СПб: Интермедика, 1999. 650 с.

60. Карташова О.Я. Моделирование патологических процессов в печени / О.Я. Карташова; под ред. А.Ф. Блюгер. Рига: Звайгзне, 1975. - 180 с.

61. Кения М.В. Роль низкомолекулярных антиоксид антов при окислительном стрессе / М.В. Кения, А.И. Лукаш, Е.П. Гуськов // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113, №4. - С. 456-470.

62. Коган А.Х. Свободнорадикальные перекисные механизмы патогенезаишемии и ИМ и их фармокологическая регуляция / А.Х. Коган, А.Н. Кудрин, JI.B. Кактурский // Патофизиология. — 1992. №2. - С. 5-15.

63. Кожевников Ю.Н. О перекисном окислении липидов в норме и патологии / Ю.Н. Колсевников // Вопросы медицинской химии. 1985. -№5. - С. 2-7.

64. Козлов A.B. Роль эндогенного свободного железа в активации перекисного окисления липидов при ишемии / A.B. Козлов, Л.И. Шинкаренко, Ю.А. Владимиров // Бюллютень экспериментальной биологии. 1985. - Т. 1. - С. 38-40.

65. Козлов A.B. Изучение механизмов активизации перекисного окисления липидов при патологических процессах: дис. . канд. биол. наук / A.B. Козлов.- М., 1985.- 155 с.

66. Козлов Ю.П. Свободнорадикальное окисление липидов в биомембранах в норме и патологии / Ю.П. Козлов // Биоантиокислители. М., 1975. - С. 5-14.

67. Кондрашова М.Н. Отрицательные аэроионы и активные формы кислорода / М.Н. Кондрашова // Биохимия. 1999. - Т. 64, №3. - С. 430432.

68. Корпачев В.В. Тиоктовая кислота: проблемы и перспективы использования / В.В. Корпачев, A.B. Щербак // В1сник фармакологи та фармацп. 2003. - №3. - С. 20-28.

69. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. М.: Высш. шк., 1980. - 272 с.

70. Колеспиченко Л.С. Изменение активности ферментов метаболизма глутатиона при иммобилизованном стрессе и их возможное значение / Л.С. Колесниченко, Н.С. Манторова, Л.А. Шапирова // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1990. - №4. - С. 9-13.

71. Колесниченко Л.С. Активность ферментов метаболизма глутатиона и их регуляция цАМФ в опухолях человека / Л.С. Колесниченко, Ю.А. Дыхно, Н.С. Манторова // Вопросы онкологии. 1987. - Т. 33, №3. —1. С. 45-50.

72. Крутикова Г.О. Глутатионпероксидазная и глутатионредуктазная активность печени крыс после введения селенита натрия / Г.О. Крутикова, И.М. Штутман // Укр. биохим. журн. 1976. - Т. 48, №2. — С. 223-227.

73. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул / В.И. Кулинский // Соросовский образовательный журнал. 1999. - № 1. - С. 2-8.

74. Кулинский В.И. Биологическая роль глутатиона / В.И. Кулинский, JI.C. Колесниченко // Успехи современной биологии. 1990. - Т. 110, №1. -С. 20.

75. Кулинский В.И. Глутатионтрансферазы / В.И. Кулинский, JI.C. Колесниченко // Успехи биологической химии. 1990. -Т. 31. - С. 157163.

76. Кулинский В.И. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы / В.И. Кулинский, JI.C. Колесниченко // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113, №1. - С. 107-122.

77. Кухтина E.H. Влияние железа, цинка, меди на процессы перекисного окисления липидов / E.H. Кухтина, H.H. Глущенко // Биохимия. — 1996. -Т. 61,№6.-С. 993-997.

78. Курганов Б.И. Анализ колокообразных pH-зависимостей скоростей ферментативных реакций / Б.И. Курганов, Е.В. Петушкова // Биохимия. 1992. - Т. 57. - С. 348-361.

79. Ланкин В.З. Ферментативное перекисное окисление липидов (ФПОЛ) / В.З. Ланкин // Укр. биохим. журн. 1984. - Т. 54, №3. - С. 317-331.

80. Левитан Б.Н. Способ лечения острых отравлений / Б.Н. Левитан, H.H. Евлашева, А.Э. Васильев. Пат. РФ 2144817. - 2000, Кл. А61К9/107, А61К31/02, А61Р7/00.

81. Лившиц В.М. Биохимические анализы в клинике: Справочник. / В.М. Лившиц, В.И. Сидельникова. — Воронеж: изд-во Воронеж, ун-та, 1995. -С. 65.

82. Ллойд Э. Справочник по прикладной статистике / Э. Ллойд, У. Ледерман. М.: Финансы и статистика, 1990. - С. 493-513.

83. Лобзин Ю.В. Руководство по инфекционным болезням / Ю.В. Лобзин; Под ред. проф. Ю.В. Лобзина, проф. А.П. Казанцева. Ростов-на Дону: Феникс, 1997. - 736 с.

84. Лужников Е.А. Клиническая токсикология / Е.А. Лужников. М.: Медицина, 1982. - 368 с.

85. Лукьянова Л. Д. Кислородзависимые процессы в клетке и её функциональное значение / Л.Д. Лукьянова. М.: Наука, 1982. - 301 с.

86. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий / В.И. Лущак // Биохимия . 2001. - Т. 66, №5. - С. 592-609.

87. Лущак В.И. Свободнорадикальное окисление белков и его связь с функциональным состоянием организма // Биохимия. 2007. - Т. 72, вып. 8. С. 995-1017.

88. Ляхович В.В. Активированные кислородные метаболиты в монооксидазных реакциях /В.В. Ляхович, В.А. Вавилин, Н.К. Зенков // Бюллетень СО РАМН. 2005. -№4(118). - С. 7-12.

89. Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека / У. Мак-Мюррей; Под ред. Е.А. Яновской. М.: Мир, 1980. - 362 с.

90. Мауэр Г. Диск-электрофорез. / Г. Мауэр // М.: Мир, 1971. 22 с.

91. Меньшикова Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окисленных процессов / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113, вып. 4. - С. 442-455.

92. Медведева Л.В. Функционирование НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и аконитатгидратазы в миокарде крысы в условиях активации свободнопрадикального окисления при ишемии: автореф. дис. . канд. биол. наук / Л.В. Медведева. Воронеж, 2002. - 24 с.

93. Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии. 1997. - Т. 117, вып. 2.-С. 155-165.

94. Мешкова Н.П. Практикум по биохимии / Н.П. Мешкова, С.Е. Северин.- М.: Мир, 1979. 430 с.

95. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца / Ф.З. Меерсон. М.: Медицина, 1984. - 272 с.

96. Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах / В.М. Моин // Лабораторное дело. 1986. - №12. - С. 19-22.

97. Муравьев P.A. Химические основы неспецифического иммунитета / P.A. Муравьев, В.В. Роговин // Известия АН. Серия биологическая.- 2001. №3. - С. 284-292.

98. Наградова Н.К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков / Н.К. Наградова // Соросовский образовательный журнал. 1996. - №7. - С. 10-18.

99. Нейтральная глюкозидаза мочи человека как маркер повреждения почек / И.С. Лукомская и др. // Вопросы медицинской химии. 1984. -№4. - С. 74-76.

100. Новиков Ю.К. Свободнорадикальное воспаление и антирадикальная защита у больных бронхиальной астмой. (http: //www. lmban.su/medicme/shtm/baza/rmj/rm-x/8.htm).

101. Об участии свободных активных форм кислорода в ферментативном перекисном окислении липидов в биомембранах / В.Е. Каган и др. // Биофизика. 1979. - Т. 44, №3. - С. 482-489.

102. Осипов А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А.Н. Осипов, O.A. Азизова, Ю.А. Владимиров // Успехи биологической химии. 1990. - Т. 31, №2. - С. 180-208.

103. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А.

104. Остерман. М: Наука, 1985. - 536 с.

105. Панченко Л.Ф. Роль пероксисом в патологии клетки / Л.Ф. Панченко, A.M. Герасимов, В.Д. Антоненков. М.: Медицина, 1981. - 207 с.

106. Передача клеточного сигнала и модуляция свободнорадикального окисления новым пептидомиметиком а-глутамилгистамином / М.А. Бабижаев и др. //Биохимия. 1999. - Т. 64, вып. 5. - С. 612-627.

107. Перекисное окисление липидов и системы, регулирующие его интенсивность / Н.Г.Храпова и др. // Биохимия липидов и их роль в обмене веществ/.-М., 1981.- С. 147-155.

108. Перекисное окисление и стресс / В.А. Барабой и др.. СПб.: Наука, 1992. - 148 с.

109. Петрович Ю.А. Глутатионпероксидазы в системе антиоксидантной защиты мембран / Ю.А. Петрович, Д.В. Гуткин // Пат физиол. 1981. -№5. - С. 76-78.

110. Петрович Ю.А. Селеноэнзимы и другие селенопротеиды, их значение / Ю.А. Петрович, Д.В. Гуткин // Успехи современной биологии. 1981. — Т. 91, №1. - С. 127-144.

111. Петровский В.Д. Большая медицинская энциклопедия / В.Д. Петровский; под ред. В.Д. Петровского. 3-е изд., дораб. - М.: Советская энциклопедия, 1977. - Т. 5. - 568 с.

112. Подобед О.В. / О.В. Подобед, Л.М. Федорова, И.В. Якушева // Вопросы медициеской химии. — 1995. №41. — С. 13-16.

113. Прайер У. Свободные радикалы в биологии: в 2-х т. / У. Прайер. М.: Мир, 1979. - Т. 1. - 311 с.

114. Прохорова М.И. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / М.И. Прохорова. Л.: Ленинградский университет.- 1982.-272с.

115. Радикалы / Д. Нонхибел и др.. М.: Мир, 1982. - 274 с.

116. Роль перекисного окисления липидов в этиологии и патогенезе атеросклероза / В.З. Ланкин и др. // Кардиология. 2000. - Т. 7. - С. 48-57.

117. Роль перекисного окисления липидов в патогенезе ишемического повреждения и антиоксидантная защита сердца / Ф.З. Меерсон и др. // Кардиология. 1982. - № 2. - С. 81-92.

118. Саванина Я.В. Накопление тиоловых соединений и изменения активности глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в клетках цианобактерии АпасузНз тсЬлЪт / Я.В.Саванина, А.Ф. Лебедева, Е.Л. Барский // Вестн. МГУ. 2004. - Сер. 16, N. 2. - С. 30-34.

119. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров и др. . // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1991. - Т. 29. - С. 110-122.

120. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло / В.П. Скулачев // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. - № 3. - С. 4-10.

121. Скулачев В.П. Кислород и явление запрограммированной смерти / В.П. Скулачев // Первое Северинское чтение. М., 2000. - 50 с.

122. Скулачев В.П. Пероксид водорода сенсор легких и кровеносных сосудов и их роль в антиоксидантной защите организма / В.П. Скулачев // Биохимия. - 2001. - Т. 66, №10. - С. 1425-1429.

123. Стальная И.Д. Метод определения диеновой коньюгации ненасыщенных высших жирных кислот / И.Д. Стальная // Современные методы в биохимии; под ред. В.Д. Ореховича. М.: 1977. С. 63-64.

124. Сидорова В.Ф. Регенерация печени у млекопитающих / В.Ф. Сидорова, З.А. Рябинина, Е.М. Лейкина. Л.: Изд-во Медицина, Ленинградское отд-ние, 1966. - 210 с

125. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью 2-тиобарбитуровой кислоты. / И.Д. Стальная // Современные методы в биохимии. М., 19776. С. 66-68.

126. Уклистая Е.А. Антиоксиданты и антигипоксанты в комплексном лечении больных хроническим бронхитом / Е.А. Уклистая, Г.А. Трубников, A.A. Панов // Южно-российский журнал. 1998. -№4. - С. 94-98.

127. Федорова Н.Ю. Состояние системы глутатионпероксидазы-глутатионредуктазы в стимулированном к регенерации органе и ее роль в клеточной пролиферации: дис. . канд. биол. наук / Н.Ю. Федорова. Воронеж, 1999. — 186 с.

128. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов / Э. Фершт. — М.: Мир, 1980.-432 с.

129. Фридович И. Радикалы кислорода, пероксид водорода и токсичность кислорода // Свободные радикалы в биологии / Под ред. У. Прайора. -М.: Мир, 1979. Т. 1. - С. 272-314.

130. Храпова Н.Г. О взаимозаменяемости природных и синтетических антиоксидантов / Н.Г. Храпова // Биоантиокислители в регуляцииметаболизма в норме и патологии: Труды MOPFFL. М., 1982. - Т. LMVII. - С. 59-73.

131. Хемилюминесцентная оценка антиоксидантного статуса больных атеросклерозом / O.A. Азизова и др. // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. 2001. - Т. 131, №5. - С. 524-526.

132. Ченас Н.К. Соотношение между глутатионредуктазной и диафоразной активностью глутатионпероксидазы из Sacharomyces cerevisiae / H.K. Ченас, P.K. Ракаускенс, Ю.Ю. Кулис // Биохимия. 1989. - Т. 54, №7.1. C. 1090-1097.

133. Чеснокова Н.П. Молекулярно-клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Успехи современного естествознания. -2006. -№7.-С. 29-36.

134. Шаронов Б.П. Окисление церулоплазмина гипохлоритом, потеря голубой окраски и сохранение оксидазной активности / Б.П. Шаронов, Н.Ю. Говорова // Биохимия. 1990. - Т. 55, №6. - С. 1145-1148.

135. Шишкина JI.H. Связь повреждения мембраны с процессом перекисного окисления липидов при слабых воздействиях / JI.H. Шишкина, М.А. Смотряева // Биохимия. 2000. - Т. 45, № 5. - С. 844852.

136. Alpha-lipoic acid in liver metabolism and disease / J. Bustamante et al. // Free Radic. Biol. Med. 1998. - V. 24, №6. - P. 1023-1039.

137. Alpha-lipoic acid: effect on glucose uptake, sorbitol pathway, and energy metabolism in experimental diabetic neuropathy / Y. Kishi et al. // Diabetes. 1999. - V. 48. - P. 2045.

138. Antonenkov V. D. Effect of chronic ethanol, catalase inhibitor on the activity of enzymes related to peroxide metabolism in rat liver and heart / V.

139. D. Antonenkov, L.F. Panchenko // International Journal of Biochemistry. -1988. V. 20, №8. - P. 823-828.

140. Arivazhagan P. Effect of DL-alpha-lipoic acid on glutathione metabolic enzymes in ager rats / P. Arivazhagan, K. Ramanathan, C. Panneerselvam // Exp. Gerontol. — 2001. — V. 37, №1. — P. 81-87.

141. Belomo G. Cell damage by oxygen free radicals / G. Belomo // Cytotechnology. 1991. - V.5, №1. - P. 571-573.

142. Berkson B. M. A conservative triple antioxidant approach to the treatment of hepatitis C. Combination of alpha lipoic acid (thioctic acid), silymarin, and selenium: three case histories / B. M. Berkson // Med. Klin. 1999. - V. 94. -P. 84-89.

143. Brigellius-flohe R. Vitamin E: function and metabolism / R. Brigelius-flohe, G. Traben // The FASEB Journal. 1999. - №13. - P. 1145-1155.

144. Bewier M. Superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase in the red cells of patient with mall gnant lymphoma / M. Bewier, W. Coutie, G.R. Tudhope // Brit. J. Haematol. 1987. - V.65. - P. 347-360.

145. Cloning of the bovine plasma selenium — dependent glutathione peroxidase cDNA from the ocular ciliaru epithelium. Expression of plasma and cellular forms within the manumalan eye / M. A. Jose Manuel et al. //1. Biochem. -1993.-V. 114, №2.-P. 284-291.

146. Catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase activities in various rat tissues after carbon tetrachloride intoxication / S. Szymonik-Lesiuk et al. // Hepatobiliary Pancreat. Surg. 2003. - V. 10, N.4. - P. 309-315.

147. Cooper T.G. Mitochondria and glyoxysomes from castor been endosperm / T.G. Cooper, H. Beevers // J. Biol. Chem. 1969. - V. 244, №13. - P. 3507-3513.

148. Characterisation and partial animo asid sequence of human plasma glutathione peroxidase / R. S. Esnjrthy et al. // Arch. Biochem. And Biophys . 1991. - V. 286, № 2 . - P. 330-336.

149. Charles E. Hepatic Glutathione Reductase I. purification and general kinetic properties / E. Charles, E.T. Thompson, G.R. Langdon // The Journal of Biological Chemistry. 1962. - V. 237, N. 5. - P. 1596-1600.

150. Charles E. Hepatic Glutathione Reductase II. PHYSICAL properties and mechanism of action / E. Charles, E.T. Thompson, G.R. Langdon // The Journal of Biological Chemistry. 1962. - V. 237, N. 5. - P. 1596-1600.

151. Cheng W.H. Endoscope assisted microsurgery for treatment of a suppasellar craniophary ngioma presenting precocious puberty / W.H. Cheng, F.W. Quimby, X.G. Lei. // Free Radical. Biol. Med. 2003. - V. 34. №7. P. 918927.

152. Chrungoo V.J. Differential biochemical response of fleshly isolated rat hepatocytes to paracetamol, carbon tetrachloride and D-galactosamine toxicity / V.J. Chrungoo, K. Singh, J. Singh // Indian J. Exp. Biol. 1997. -V. 35,N.6.~ P. 603-610.

153. Chung P.M. Inhibitione of glutathione disulfide reductase by glutathione / P. M. Chung, R. E. Cappel // Arch. Biochem. and Biophys. 1991. - V. 288, №1. - P. 48 -53.

154. Dixon C.J. Evidence for two Ca mobilizing purinoreceptors on rat hepatocytes / C.J. Dixon 11 Biochem. J. 1990. V. 269, №2. - P. 499- 502.

155. Dicker E. Increased oxygen radical-dependent inactivation of metabolic enzymes by liver microsomes after chronic ethanol consumption / E. Dicker, A.I. Cederbaum // FASER J. 1988. - V. 2. - P. 2901-2906.

156. DeLeve L. Glutathione metabolism and its role in hepatotoxity / L. DeLeve,

157. N. Kaplowitz // Pharmacol. Ther. 1991. - №52. - P. 287-305.

158. Diagnostic evaluation of carbon tetrachloride-induced rat hepatic cirrhosis model / G.P. Lee et al. // Anticancer Res. 2005. - V. 25, N.2A. - P. 1029-1038.

159. Effect of oral dosing vehicles on the subchronic hepatotoxity of carbon tetrachloride in the rat / K.P. Koporec et al. // J. Toxicol. Environ. Health.- 1995. V. 44, N. 1. - P. 13-27.

160. Effect of route and pattern of exposure on the plasmacokinetics and acute hepatotoxity of carbon tetrachloride / U.Y. Sanzgiri et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol.- 1995.-V. 134,N.1.-P. 148-154.

161. Enzymes antioxidants chez Plasmodium / D. Dive et al. // Cr. sciences Soc. Boil. 1996. - V. 190, № 5 - 6 . - P. 663.

162. Erel O. Automanted measurement of serum ferroxidase activity / O. Erel // Clinical Chemistry/ 1998. - V.44, №11. - P. 2313-2319.

163. Evaluation of oxidative stress during apoptosis and necrosis caused by carbon tetrachloride in rat liver / F.Sun et al. // Biochim. Biophys. Acta. -2001.-V. 1535, N.2. P. 186-191.

164. Evidence of hepatocyte apoptosis in rat liver after the administration of carbon tetrachloride / J. Shi et al. // Am. J. Pathol. 1998. - V. 153. - P. 515-525.

165. Extracellular glutathione disulfide reductase by glutathione / N. Avisar et al. // Arch. Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1994. - V. 309, № 2.1. P. 239 246.

166. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutase / I. Fridovich // Annu. Rev. Biochem. 1995. -V. 64. - P. 97-112.

167. Glutathione redox potential in response to differentiation and enzyme inducers / W. G. Kirlin et al. // Free Radical Biology and Medicine. 1999.- V.27,№ 1.- P. 1208- 1218.

168. Grootveld M. Measurement of allantion and uric acid in human body fluids. A potential index of free-radical reactions in vivo? / M. Grootveld, D. Hallivel // Biochem. J. 1987. - V. 243. - P. 803-808.

169. Halliwel B. The importance of free radicals and catalytic metalions in human diseases / B. Halliwel, J.M. Gutteridge // Molec. Aspects Med. -1985.-V. 8.-P. 89-193.

170. Hill T. D. Rolle of glutathione and glutathione peroxidase in human platelet arachidonic acid metabolism / T. D. Hill, Y. G. White, G. H. Rao // Protoglandins. 1989. - V. 39, №1. - P. 21-32.

171. Hinson J. A. Phase II enzymes and bioactivation / J. A. Hinson, P. G. Forkert // Can. J. Physiol Pharmacol. 1995. - V. 73, №10. - P. 1407-1413.

172. Implay J.A. DNA damage and oxygen radical toxity / J.A Implay, S/ Linn // Science.-1988.-V. 240.- P. 1302-1309.

173. Increase of lipid hydroperoxides in liver mitochondria and inhibition of cytochrome oxidase by carbon tetrachloride intoxication in rats / Ikeda K. et al.// Free. Radic. Res.- 1998.-V.28,N.4. P. 403-410.

174. Johnston D.E. Mechanism of early carbon tetrachloride toxicity in cultured rat hepatocytes / D.E. Johnston, C. Kroening // Pharmacol. Toxicol. 1998. -V. 83,N.6. - P. 231-239.

175. Kamal-Eldin A. The chemistry and antioxidant properties of tocopherols and tocotrienols / A.L. Kamal-Eldin, A. Appelqvist // Lipids. 1996. - V. 31. -P. 671-701.

176. Kang S. G. Characterisation of a new member of the glutathione peroxidase gene family in Orusa satira / S. G. Kang, H. K. Yeong, H. S. Suh // Mol. Cells. 2004. - V. 17, № 1. - P. 23-28.

177. Karihtana P. Peroxiredoxinc in Breast Carcinoma / P. Karihtana., A.

178. Mantyniemi, S. Won Kang // Clinical Cancer Research. 2003. - V. 9. - P. 3418-3424.

179. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680685.

180. Lee W. M. Drug-induced hepatotoxity / W. M. Lee // N. Eng. J. Med. -1995. V. 333, №.17. - P. 1118-1127.

181. Low activity of superoxide dismutase and high activity of glutathione reductase in erythrocytes from centenarians / H. R. Andersen et al. // Age and Ageing. 1998. - V. 27. - P. 643-648.

182. Malshet V.G. Fluorescent products of lipid peroxidation. I. structural requirement for fluorescence in conjugated schiff bases / V.G. Malshet, A.L. Tappel // Lipids. 1973. - V. 8, №4. - P. 194-198.

183. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained Polyacrylamide / A. Shevchenko et al. // Anal. Chem. 1996. - V. 68. - P. 850-858.

184. McCord J.M. Superoxide inactivates creatine phosphokinase during reperfusion of ischemic heart / J.M. McCord, M.J. Russewell // Clin. Biochem. 1993. - V. 26. - P. 351-357.

185. Millerand H. Peroxide modification of monoalkylated glutathione reductase stabilization of an active-site cysteine-sulfenic acid / H. Millerand, AL Claibornej //J. Biol. Chem. 1991. - V. 266, №29. - P. 19342-19350.

186. Minotti G. Superoxide-dependent redox cyching of citrate-Fe3+ : Evidence for a superoxide dismutaselike activity / G. Minotti, S.D. Anst // Arch. Biochem. and Biophys. 1987. - V. 253, №1. - P. 257 - 267.

187. Morgan P.E. Inhibition of glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase by peptide and protein peroxides generated by singlet oxygen attack / P.E. Morgan, T.D. Roger, M.J. Davies // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269. - P. 1916-1925.

188. Neuzil J. Requirement for promotion or inhibition by alpha-tocopherol of radical-induced of plasma lipoprotein lipid peroxidation / J. Neuzil, S.R. Thomas, R. Stocker // Free Radie. Biol. Med. 1997. - V. 22. - P. 57-71.

189. Noda Y. Hydroxyl and superoxide anion radical scavenging activités of natural source antioxidants using the computerized JES-FR30 ESP spectrometer system / Y. Noda, K. Anzai, A. Mori // Biochem. Mol. Biol. Int.- 1997.- V. 42, №1.- p. 35-44.

190. Nohl H. Generation of activated oxygen species as side products of cell respiration / H. Nohl // Free Radie. Biol, and Med. 1990. - Suppl. №1. - P. 141.

191. Ookhtens M. Role of the liver in interorgan homeostatis of glutathione and cystine / M. Ookhtens, N. Kaplowitz // Sem. Liver Dis. 1998. - №18. - P. 313-329.

192. Oxygen-dependent processes in the liver and immunologic reactivity of rats in chronic liver damage induced by carbone tetrachloride / I.N. Alekseeva et. al. // Fizioh Zh. 1993. - V. 39, № 4. - P. 47-52.

193. Oberley L.W. Free radicals, againg and degenerative disease / L.W. Oberley, T.D. Oberley//N.Y.: Liss. 1986. - P. 325-372.

194. Pai E.F. The catalytic mechanism of glutathione reductase as derived from ray diffraction analyses of reaction intermediates / E.F. Pai, G.E. Schulz // J. Biol. Chem. 1983. - V. 3, №.258. - P. 1752-1757.

195. Pantili E. Distribution of glutathione reductase in rat brain mitochondria / E. Pantili, G. Sandri, L. Ernster // FEBS Lett. 1991. - V.290, №. 12. - P. 3537.

196. Passwater R.A. Lipoic Acid / R.A. Passwater // The Metabolic Antioxidant.

197. New Canaan, CT: Keats Publishing, Inc. 1995. - P. 1-47.

198. Paulikova H. Effect of heparin and dextran sulfate on the activity of glutathione reductase from yeast / H. Paulikova, L Petrickova, M. Antalik // Biochem. and Mol. Biol. Int. 1996. - V. 38, N.6. - P. 1117-1126.

199. Promemazine inhibits the formation of aldehydic products of lipid peroxidation but not covalent binding resulting from the exposure of rat liver fractions to CC14 / G. Poli et al. // Biochem. J. 1989. - V. 264, № 21. - P. 527-532.

200. Protection of rat liver microsomes against carbon tetrachloride-induced lipid peroxidation by red ginseng saponin through cytochrome P-450 inhibition / H.J. Kim et al. // Planta Med. 1997. - V. 63, N.5. - P. 415-418.

201. Protein measurement with the Folin-Phenol reagent / O.H. Lowry et al. // J. Biol. Chem. 1951. - V. 194, №1. - P. 265-271.

202. Purification, properties, and oligomeric structure of glutathione peroxidase from the cyanobacterium Spirulina maxima / J.L. Rendon et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1986. - V. 1. -N.248.- P. 215-223.

203. Ray S.D. A hepatotoxic dose of acetaminophen modulates expression of BCL 2, BCL - X (L), and BCL - X(S) during apoptotic and necrotic deathof mouse liver cells in vivo / S.D. Ray, N.A. Jena // Arch. Toxicol. 2000. — V. 73, N. 10-11.-P. 594-606.

204. Reed D. The role of methionin in glutathione biosynthesis by isolfted hepa tocytes / D. Reed, S. Orrenius // Arch. Biochem. and Biophys. 1977. - V. 77, №4.- P. 1257-1264.

205. Reitman S. Method for determination of cholesterol lowdensity lipoproteins / S. Reitman, S. Frankel // Amer. J. Clin. Pathol. 1957. - V. 28. - P. 56-61.

206. Release of iron from ferritin and its role on oxygen radicals toxicities / V.M. Samokyszyn et al. // Drug Metab. Rev. 1988. - V. 19, № 3-4. - P. 283303.

207. Robert E. A glutathione reductase from escherichia coli / E. Robert // The Journal, of Biological Chemistry. 1955. - V. 26. - P. 77-85.

208. Robin Mockett. Overexpression of glutathione peroxidase extends survival in transgenic Drosophila melanogaster under hyperoxia but not normoxia / Mockett Robin, Rajindar S. Sohal, William C. Orrl // The FASEB Journal. -1999.-V. 13. P. 1733-1742.

209. Salfur F. Induction of selenium glutathione reductase and glutathione peroxidase at Chlamidomonas / F. Salfur, V. Sisian, N. Vertub // Mol. Biol. 1992. - V. 67/ - N. 16. - P. 439-444.

210. Schirmer R.H. Structural compassion of the flavoenzyme glutathione reductase with other proteins / R.H. Schirmer // Biomol. Struct. 1978. - V. 1, N.6. - P. 33-38.

211. Schulr G.E. High resolution structure and catalytieaction of human glutathione reductase and glutathione peroxidase / G.E. Schulr, A. Karplus // Biochem. Soc. Trans. 1988. - V. 12, N.2. - P. 81-84.

212. Schulz G.E. FAD-binding site of Glutathione peroxidase / G.E.Schulz, R.H. Schirmer, E.F.Pai // J.Mol. Biol. 1982. - V. 160. - P. 287-308.

213. Searle A.J. Glutathione peroxidase: effect of superoxide, hydraxil and bromine free radicals of enzyme activity / A.J. Searle, R.K. Willson // Int. J. Radiat. By Al. 1980. - V. 37, №2. - P. 213-217.

214. Selenum deficiency does not promte acute gepatitis in long-evans cinnamon (LEC) rats / Junichi et al. //1. Trase. Elem. Exp. Med. 1997. - V. 10, № 2. -P. 119-128.

215. Smith A. Glutathione peroxidase in human and animals aortas / A. Smith, W. Harland, J. W. Chanles // Steroids and Lipids. Res. 1973. - V.4, №12. - P. 122-128.

216. Stadtman E.R. Protein oxidation / E.R. Stadtman, R.L. Levine // An. N.Y. Acad. Seien. 2000. - V. 899. - P. 191-208.

217. Stadtman E.R. Protein oxidation in aging and age-related diseases / E.R. Stadtman // An. N.Y. Acad. Seien. 2001. - V. 928. - P. 22-38.

218. Steroid hydroperoxides as substrates for glutathione peroxidase / Little Clive // Biochim. et Biophys. acta. 1972. - V. 284, №2. - P. 375-381.

219. Stoll V.S. Glutathione reductase turned intj trypanothione reductase: Structural analysis of an engineered change in substrate specificity / V.S. Stoll, S.J. Simpson, L.R. Krauth-Siegel // Biochemistry. 1997. - V. 36, N.21. - P. 6437-6447.

220. Structural, spectroscopic and catalytic activity studies on glutathione reductase and glutathione peroxidase reconstituted with FAD analogues / U. Ermler et al. // European J. of Biochemistry. 1991. - V. 199. - P. 133138.

221. Stuart R.L. Isoniazid toxicity in health care workers / R.L. Stuart, J.Wilson, M.L.Grayson // Clin. Infect. DIS. 1999. - V. 28, N.4. - P. 895-897.

222. Studies on the mechanism of the UVA light-dependent loss of glutathione reductase activity in human lenses / mikhail linetsky et al. // Pediatric Research. 1994. - V. 35. - P. 311-315.

223. Stone W.L. Selenium and non selenium glutathione peroxidase activities in selected ocular and non ocular rat tissues / W.L. Stone, E.A. Drats // Expil. Eye Res. 1982. - V. 35, №5. - P. 405.

224. Styblo M. In vitro inhibition of glutathione peroxidase by arsenotriglutatione / M. Styblo, D. Thomas // Biochem. Pharmacol. 1995. - V. 49, N.7. - P. 971-977.

225. Sugiyama K. Inhibition of glutathione peroxidase chinones / K.Sugiyama, A. Tyasy // Planta. 1993. -V. 45,N.4. - P. 1456-1463.

226. Suh J. Anti-and pro-oxidant effects of ascorbate on iron-mediated oxidative damage to bovine serum albumin / J. Suh, B.Z. Zhu, B. Frei // Free Radic. Biol. Med. 1999. - V. 27. - P. 305-311.

227. Sunde Roger A. Selrnium status regulates glutathione peroxidase expression / Roger A. Sunde // J. Inorg. Biochem. 1991. - V. 43, №2-3. - P. 283.

228. Stimulated human neutrophils limit iron-catalyzed hydroxyl radical formation as detected by spin-trapping techniques / B.Y. Thompson et al. // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 17026 - 17032.o i

229. Suzuki YJ. Inhibition of Ca ATPase of vascular smooth muscle sarcoplasmic reticulum by reactive oxygen intermediates / YJ. Suzuki, G.D. Ford // Amer. J. Physiol. - 1991. - V. 261, Pt 2. - P. H 568 - H 574.

230. Suzuki Y.J. Free Radical / Y.J. Suzuki, HJ. Forman, A. Sevanian // Biol. Med. 1996. - V. 22, № 1/2. - P. 269-285.

231. Theodore W. Rallt Glutathione reductase of animal tissues / W.R. Theodore, L.A. Lehninger // The Journal of Biological Chemistry. 1952. -V. 3.-P. 119-130.

232. Torrielli M.V. Free radicals in inflammatory disease / M.V. Torrielli, M.U. Dianzani // Free Radicals in molecular Biology, Aging, and Disease. N.Y.: Raven press. - 1984. - P. 355-379.

233. Uptake, distribution, and elimination of carbon tetrachloride in rat tissues following inhalation and ingestion exposures / C.E. Dallas et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1997. - V. 143, N.I.- P. 120-129.

234. Vissers M.C.M. Oxidative damage fibronectin. 2. The effect of H202 and hydrohyl radical / M.C.M. Vissers, C.C. Winterbourn // Arch. Biochem and Biophys. 1991. - V. 285, №1 - P. 357- 365.

235. Weiss S.J. The interolay of oxidants and proteinases in neutrophil-mediated tissue damage / S J.Weiss // J. Cell Biochem. 1991. - Suppl. 5 c. - P. 210.

236. Weiss S.J. The role of superoxide in the destruction of eruthrocyte targets by human neutrophils / S.J. Weiss // J. Biol. Chem. 1980. - V. 255. - P. 99129917.

237. Wong K.K. Glutathione reductase: solvent equilibrium and kinetic isotope effects / K.K. Wong, M.A. Vanosi, J.S. Blanchard // Biochemistry. 1988. -V. 18.- N.27,- P. 7091-7096.

238. Wulf Droge. Free radicals in the physiological control of cell function / D. Wulf //Physiol. Rev. 2002. - V. 82. - P. 47-95.

239. Zaidi S.M. Effects of antioxidant vitamins on glutathione depletion and lipid peroxidation induced by restraint stress in the rat liver / S.M. Zaidi, T.M. Al-Qirim, N. Banu // Drugs. R.D. 2005. -V. 6, N.3. - P. 157-165.

240. Zhu W. The roles played by crucial free radicals like lipid free radicals, nitric oxide, and enzymes NOS and NADPH in CCU,-induced acute liver injury of mice / W. Zhu, P.C. Fung II Free Radic. Biol. Med. 2000. - V. 29, №9. - P. 870-880.

Информация о работе

Шульгин, Константин Константинович
кандидата биологических наук
Воронеж, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Регуляция активности глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени крыс и действии веществ - протекторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы