Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Регенерационные процессы и сомаклональная вариабельность в культуре тканей новых сортов картофеля

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Регенерационные процессы и сомаклональная вариабельность в культуре тканей новых сортов картофеля"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЪЧСТВШИШХ 11АУК ВСЕРОССИЙСКИЙ МЭТНО^ССЛЕДОВАТЗЛЬСКШ ИНСТИТУТ КАРТОФЕЛЬНОГО

хозяйства

в О*

На правах рукописи

ЗВЕЗДИШ Татьяна Николаевна

РЕГЕНЕРАЩОШШЕ ПРОЦЕССЫ И СОГ/ДКЛОНАЛЬНЛЛ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ В КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ HODt.II СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ

• Специальность 06,01¿05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ, диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных йаук

МОСКВА - 1394

Работа выполнена в Научно-исследовательском селекционно-технологическом институте овощеводствэ (Молдавия) с 1985 по 1992 год.

Научный руководитель : доктор биологических наук Л.И.Косова.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Л.Н.Тро'Ттаец,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Б.В.Лниогаюв. Ведущая организация: кафодфа биотехнологии ТСХА.

Защита.состоится " мая 1С94 г. в 13.00 час. на заседании специализированного совета К.122.19.01. в Научно-исследовательски институте картофельного хозяйства.

0 диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке В1-ВДГ1К"

Автореферат разослан "'-¿V" апреля 1994 г.

Учений секретарь специализированного совота кандидат биологических наук Щ, ¿¿¡/л^> П.П.Склярова

ОЩАЯ ШЖТШЯШ РАБОТЫ

Актуальность* темы. Современный методы ведения семеновод-отва картофеця на бездарусвой основе базируются ш использовании ыериотемных линий, не несущей тфвщш, получение которых,в Ьвоь очередь, обеспечивается регонерш ¡конными процессами, андуцлрусними ярн культивировании апексов картофеля на- иоскуствелли,:. питательных средах, ,]$алхнейшее мякроклошроваше оздоровлеиимх) материала осуществляется через регенерация проростков да пазушные потек черенков картофеля. Получение соыаклональных линий через регенера-цкошые процессы каллусных культур и последующее ил включение в селекционные исследования, способствует не только ускорении.', но и наиболее эффективному проведении работ по выявление форм и линли, отличающихся комплексом положительные хозяйственных ларактеристш;.

Регеиерациоише процессы зависят от таких факторов как ьид експланта, генотип картофеля, состав питательных сред к ряда других. Таким образом, пришлая во ашшаше- существуквд^ генотлплчес-куо реакция оортообраэцов împvoqem на условия культивирования .¡п vit.ro , а также неоСходныость у совершен ствовашш и онтшииацан приемов и методов индукции регенерацлошш;; процессов, обесиечивы;-йьх аоикоанооть как промышленного производства оидоронлеи-гюго- материала картофеля сортов местной селекции,1 так и получение со;.:а-клональных: лшыи, явшотхеа перспективным материалом, расширяю- . щим воушкноом традиционно^ селекции, проведение данных исследований приобретает особую актуальность.

¡гость..

Цель а задачи г.соледовашш заключались в изучении следующих вонросо!з:

1. Лсслодовашо влияния геиотшшчиских особенностей сортооб-разцон кирто^»Л/1 па регенерациснше процессы » культуре тканей.

2. Изучение влияния ражгдчных. ,ч,оз « шков стероидных гллко- • зидов 1ы регелерациошше ироноиси ыеглбтймйшх к калдусянх культур чгфтс

3. Офодел-'чп'е завпсгиюсти аитеииипиобти иро-решитая; регенера-1июннм\ прстиоси; у лодат.ни.ч оап/внтог) ¡«ртс^оли от компонентов ппта'гелышх ороч и гдь.:у13И.кг »•.>, оптимального баланса в количественном и ютестлеином соотношении.

4. Мсслецоогшио 7-л:тшш ряда кшшнент* питательных сред и ьида порллчпим пкеилантол на нрохоаицгииё орт'Яиогенштх процоссов каллуеннх культур -лзучпешх сортол «ар^о'диди.

5. Цитологическая оценка регашратюшш.ч процессов, иницш-руемнч у колдуешь; ткппе.Ч каргефзлл.

6. Нсслздснише уровня изиенчнгос'га срод:г каллусных сомакло-|МЛЫ1Н.{ )!•')) ПО иорфолщ'ическн];',, Шюхимичесшш к хоянйетвеннвм характеристикам.

Научная понизил л практическая цшпюсть работы состоит в :

1. Использовании соединении класса отерокцннх гликозвдов в качестве регуляторов роста иртг куЯйтмвирозании меристемнюс кульТур- й индукции органогешшх кр'оё;йо<26$' каллусных тканей.

2. С использованием метода математического ¿¡лакирования эксперимента ранргЫотани питательные среды цля- культивирования ио-дплышх ссгаеитов растений картофеля- сортов' Светлячок' зг Ягодка с оптимальным содержанием гормоналышх препаратов и элекентоз1 митрального штаты, а также среды, обеспечивагащте наиболее интенел»-ноо просо; «дення органогенеза каллуенши культуради изученная ге-

нотипов.

. * .3. Методами цитологического анализа доказано возникновение de novo мернотематичеоких очагов при индукции органогенеза у кал-лусных тканей, исследованных сортов' картофеля.

4. Оздоровленно от вирусной инфекции 15 сортообразцов карто ля и получено для первичного семеноводства более 100 тнсяч безви ■русных регенерантов, которые явились основой получения исходного посадочного материала.

5. Получено 84 каллусных сомаклональных линий, переданных для дальнейшего использования в селекционных программах.

Апробация работа. Материала диссертационной работы -доложены на научно-технической конференции молодых ученых в НЙИКХ (КОре-нево,1987), на У съезде генетиков и селекционеров Молдавии (Кишинев,198?) ,на 1У научно-практической конференция молодых учены;» и аспирантов НПО "Россяя"(Москва,I9S0), на научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов ОСХИ (Одесса,1990), на заседаниях лаборатории культу ры тканей ПЭГ АН IviCCP (Кишинев, 1989-1990), на годовых отчетах сотрудников ШСТИО.

Публикация результатов исследований.Материалы диссертации опубликованы в восьми работах.

Объем работы.Диссертация изложена на; 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методики исследований, экспериментальной часта, выводов и спиока использованной литературы. В работе-приведено 26 таблиц и 21'рисунок. Список литературы включает 191 источник, в том чис ' де - 116 иностранных авторов.

Материал и методика исследований

Экспериментальные исследования проводились с 1985 no 1992

год в лаборатории биотехнологии и частной генетики ШСТИО.

¡Материалом для проведения опытов служили сорта картофеля селекции НИСТИО, районированные на территории Молдовы; Светлячок, Ягодка, Молдавский розовый, Спринтер и Кооператор.

Исследовательские работы по культивированию меристемных зкс-плаятов картофеля проводились согласно общепринятой методика (Тро-финец Л.Н. .Остапенко Д.Л., др. ,1885) с цогголштелыпы включением в питательные среды стероидных гликозицов (томатозиц, напсикозпц, цепозид,н1мотианозид,мелангозид, сомелангоэиц, томатошш в концентрациях 0,OB^,0,05/i.O,005;b), известных как биологические активные препараты, влкящме на ряд внутриклеточных процессов (Кинтя П.К., Лазурьевский Г.В.,др., 198?). В экспериментах по изучению воацей-ствид данного класса соединений на регенерационные процессы кал-лусннх культур картофеля были исследованы следующие вещества: томатозиц, капсикозиц, пурдуреагатозид.ланбгитозид.авейокозйд в концентрациях 0,05> и С,005л.

Тестирование на содержание вирусной инфекции в полученном меристепнон материале петоцом электронной микроскопия проводили сотрудники УкрНИИНХ а 1ШСШ0, методой IfeA - сотрудники лаборатории картофеля Ш1СТИ0.

Варианты питательных сред, обеспечивающие формирование каллу с ной ткани вышеуказанных генотипов картофеля, варьировали йо содержанию следующих препаратов: БАП (0,5-3,0мг/л), кинетина (0,01-1,0 мг/л).аденина (0-80 мг/л),2,4Д (1,0-5,7 мг/л),М (0,230,0 мг/л),ИУК (0,1-1,0 мг/л),A3 (0,5-10,0 мг/л)»сахарозы (2035 г/л), гидрояизата козеина ( 0-0,5 г/л), минеральная основа соответствовала прописи Мурасиге-Скуга (1962), либо Гамборга. (I96B). В ходе эксперимента оценивалась зависимость рассматриваемого процесса от количественного и качественного состава сред, .

• -5-

вида экспланта и генотипа картофеля.

Изучение влияния ряда концентрации отдельных компонентов питательных сред на регенерацчснные процессы иоцалышх сегментов картофеля (азотнокислого калия, гиббереллина,кинетика,ИЛС(НУК, сахарозн) и инициацию органогенных процессов каллусных культур (БАЛ,зеатина,2иП,1МС,ЗиБ,сахарозы) сортов Светлячок, Ягодка было проведено с использованием метопа математического планирования эксперимента, включающего 25 вариантов в 30 повторностях. Полученные результаты обрабатывались на ЭНЛ по программе P-mati (Смирнов В.А.,Смирнова Б.В..Евтоциенко Т.В.,1985), Что позволило получить графические модели, отраваюадш зависимость исследуемого процесса от содержания в питательной среде изученных веществ ц выявить-их оптимальные концентрации для каждого конкретного генотипа картофеля.

Цитологические исследования каллусных тканей картофеля после их культивирования на органогенных средах проводились следую-имм образом: материал помещали на 3-4 минуты в смесь Карнуа и -фиксировали в ясидкооги Наваиина. Постоянные прапараты готовили ыо общепринятой цитологической методике (Наваишн М.С.,1936), срезы толщиной 12-14 мк окрашивали по М.Гейденгайну (Ромейс Б., 1954). • •

Ссмакдональнко линии картофеля сортов.Светлячок,Ягодна молдавский розовый, полученные от каллусных культур, оценивали по следующим характеристикам: морфологические отличия от исходных родительских форм, клубнеобразование in vitro , а также в условиях вегетационного опыта и открытого грунта, Слохимичеокие исследования клубневой репродукции на содержание аскорбиновой кислота (по Гильмансу),крахмала (по йверсу), сухих -веществ (весо-шм методом), • рост и развитие рег^нерактов на солевых селект!ш-

ных фенах ;!п- -'иго ц их уронайность в условиях засоления б вегетационных опытах.

нормирование ммроклубией инициировали при культивировании ноцальных сегментов каллу сных регеиерантов картфеля на питательных средах с содержанием Сахаровы <о% и измененном температурном режиме, соответствовавши'.) 5-С°С, в отсутствий' освещения.

Вегетационные опиты проводили согласно общепринятой ¡лзтоди-ке (дурбищал; й.И., 1268). В условиях открытого грунта пробирочный материал калдусиих рогенерантов картофеля высаживали по схеме 15x20 ам.Понторность одага 10-кратная.

При создашш исокуствэнных солевых фонов был использован комплекс солей наиболее типичный для засоленных .почв Молдовы, который дополнительно вводился в оптимизированные для роста недальних сегментов юартофедя питательные среды в концентрациях 6,9 и 15 г/л, за исключением контроля. В вегетационных опытах использовался 0,6;ь раствор комплекса солеи, (КАлашнаков К.Г. ,1383).

Рзз.ультаты экспаршлвнтальных исследований I. Регенерацнонная активность ыеристемннх культур

Культивирование меристемных эксплактов картофеля различных ортов на питательных средах идентичных по качественному и кола-ественноыу составу, позволило проследить значительную зависи-ость регенепационцнх процессов от генотипа. Так, согласно шлу-знным пашшм, такой показатель как приживаемость меристем, оцре-5ЛЯЮЩИЙ количество сформированных растениА-регенерантов и отра-ищи-л начавшиеся регеиеращюшне процессы в культивируемых эксп-штах, варьировал от Щб (сорт Кооператор) до §2% .(сорт Ягодка). !::жвлемость меристем исследованных сортов картофеля, за дскяи-нием сорта лгодка, оставалась достаточно низкой и н& превышала и -кого уровня. С целью ту четы возможности увеличения панк о-

гб показателя ,•'а также исследования влиянии стероидных гллкоэщов,

нами были проведены эксперименты по культивяровашы ¡.юристом, а затеи и каллусних культур па питательных. среда.-, вклачайци.-с различные концентрация данных веществ. -

Анализ ответно« реакции различию; геистшшв картофеля т воздействие исследованных концентраций стероидных гликозпдов нсзволл-ет сделать вывод о ее неоднозначности и оавксшЬств от рицй (Дикторов таких, как сорт картофеля, период культивирования, вид препарата к его концентрация. Так, тсклатозид для все;:, трех сортов висту шл как стимулятор процессов регенерата: мерцотемшх .жснлантов картофеля. Причем наилучший; полештельшй ь^ект достигался при его концентрации 0,05/4, з дашю« случае нрш^гваеыость возлегала до Ъ%-. Но адн каждого отдельно взятого генотипа эта величина бчла различна н составили ./ сорго Молаааоки» розовый 70л, у сорта ьгод-Кй 95/с, у слота Светлячок 90,;. Интенсивность роста регенератов возрастала в сравнения с контролем в 6-11 раз, достигая максимального значения у'сорта Ягодка.

Подученные мериклони оценивала на-содержание вирусной инфекции методами 1Ш я электронной кнкроскопга. Количество безшрусик..-регенерантов варьировало от 22,» (сорт ПоладзокдЗ розовыгЭдо 71^ (сорт с;1р»штер). Апвлизируекш результаты определяются радой факторов, в первую очередь исходной зарелониоегь» материала, взятого в работу, т.шо.м вирусной инфекции, генотипом картофеля, взашоцей-ствпел) вирус-расгенпе-Аозлин.

2. йиьлш различных доз отдельных ¡.иигерлмних я гормиилыпи компонентов питательных сред на рост н уазвлтле .шдалышт согаонгов картофеля йр.1 ускорением ра:шю:.:еп.';п оиавируоного материала карго геля получение ¡н-п-;сппального количества растении ги

срашштельно короткое врег.ш. Это условие гложет быть соблодеш только íí случае удовлетворительного баланса компонентов питательной среды, оптымальнчго соч.оташя эндогенных п экзогенши гормональных веществ, Известно достаточно большое количество сред, рекомендованных для роста черенков картофзля j.n уц;;го(Винклер Г.Н.,Бутен-ко Р.Г.,1970¡Катаева Н.В. .Бутенко Р.Г. ,1983; согтог к.з. Д982). Эдиако, согласно многочисленным литературним данным (Попов Ю.Г., [S7S;Poro3¡uia E.J.,1289;Смояенская С.о.,1989) и нашим собственным, цля картофеля существует значительная генотшгаческая специфичность ' з отношент компонентов питательной среды, в связи с чем возникает яеоскоцшооть б дополнительных экспериментах по их подбору для каждого конкретного сорта, особенно при производстве безвирусного .цзобирочного .лэтериала а промышленных объемах.

Использование для этой, цолн метода математического планиро-заш-ш ¡эксперимента позволило в короткие срока «•в более полном зб^еме изучить влияние ряда компонентов питательных срец в их лаилачных концентрациях на рост, развитие растений л выявить статистически достоверные закономерности.

Выборочно приведем данные по воздействию на регенерационйые 1роцессы нодальных сегментов картофзлл двух веществ - кинетина и ^иббереллина.

Зависимость интенсивности роста растений картофеля сорта, (годка in vitro от концентрация кинетина в питательной среде пред-;тавлена на рисунке I. К пятнадцатому дню культивирования регене->антов оптимальная доза кинетина составила 0,1 нг/л, дальнейшее • -величание концентрации в значительной степени, ингибировало про-' leccH роста. Для нослещ'ВДИх.двух изученных периодов регенерации Трофические зависимости характеризуется наличием двух максимумов, :оллчествпшше значения первого составили 0,4 кг/л и 0,6 мг/л

Зависимость роста регенерантов картофеля сортов Ягодка (рисунок I) и Светлячок (рисунок 2) от конценграцги в питательной среде кинегина на 15-й (1),20-й (2),25-й (3) цепь культивирования.

Р и с. I Р и с. 2

Зависимость роста, регенэрантов картофеля сортов Ягодка (рисунок 3) и Светлячок (рисунок 4) от концентрации в питательной

шшеадна соответственно продолжительности культивирования. Стиму-ддруадге воздействие на исследуемые этапы развития регенерантов картофеля данного генотипа оказала концентрация кинетина 2,в мг/л, которая при графэтескои отображении процесса соответствовала второму ндку на кривил' занксшлостей.

При культивирована« нодальних сегментов кыртофзля сорта Светлячок потребность в кинетике на протяжении всего эксперимента била минимальна л составила 0,1-0,2 мг/л (рис.2).

Анализ получен-шч результатов, отралалэди зависимость интен-

■ олвностл роота регеьорантов от концентрации в питательной среде гиббереллииа, позволил сделать вивсц о том, что стимулирующие дола данного препарата для иодальни.ч сегментов сорта Ягодка ле;,*ат в пределах 0,6-0;9 ыг/д (в зависимости от продолжительности периода

■ культивирования), ва исключением пятаадцатндневных растений, по -требность которых в габбереллине равнялась 2,6 ыг/л( рис.3). Оптимальные цозь Клобереллииа для рассматриваемых нроцэсоов у сорта Светлячок составили 2,1-2,3 иг/л, меньшие значения лимитировали,

а большие ингиопровали рост регенерантов (рис.4),

Подальше сегменты картофеля сортов Светлячок и Ягодка высаживались на оптпымярованннэ питательные среды. Результат» эксперимента представлены в таблице I.

Высота рг'чтешш сорта Ягодка в опытном варианте на протяжении всего периода кульалн.шоаания превосходила контроль в 1,5-1,6 раза. У сорта Светлячок атот показатель значима не отличался от контроля, но при'этом число междоузлий у обоих сортов увеличилось на сдно-два. Культивирование регенерантов на оптимизированных средах позволило получить растения, которые в сравнении с контрольными имели (Золее развитые листовые цйастинки и корневую систему, утолщенный стебель, интенсивно аеленую окраску.

-II.. г

Таблица I

Биометрические характеристики роста растении картойздя при культивировании на- оптииизированных средах

Показатели : Сорт

Све тлячок Ягодки

День культивирования

15-и з 20-й 25-Й : 15-й : 20- й : 25-М

Высота растений,мм

Опыт 83 97 ■ 138 114 146 181

Контроль 74 93 133 71 124

НСР0,95 II 13 16 13 17 21

Количество ыежцоу злий,шт.

Опыт 4 7 8 4 5 7

Контроль 3 6 7 3 3 5

НСГ0.95 0,6 0,6 0,7 0,6 0,6 0,6

3. Зависимость процессов каллусо- и органогенеза от составь

питательных сред, вица экспланта и генотипа картофеля Подученные экспериментальные данные свидетельствуют о влиянии на процессы каллусогенеза ряда факторов, а именно, состава питательных сред, вида экспланта, генотипа.картофеля. Так, напри мчр. содержание в ¡штательнон среде ЕАП 2,25 мг/л+НУК 0,2мг/л+ аде ниш. 80,0 мг/л индуцировало форсированно каллуснои ткани в 90 случаях из 100 при использовании в качестве исходных эксплангов черенков картофеля сорта. Ягодка, для сорта Светлячок эта величина равнялась 30^. Среда, включающая 0,5 кг/л кинетика и 1,0 мг/л 2»4Д стимулировала нарастание кадлуоа у 68'^ листовых эксплаитов сорта Сьотлячок и только у 20> стеблевых сегментов того 'же генотипа.

• Оптималькккл вариантами для индукции каллусогенеза обоих че»тк< сортов карто^елк холю счетать. штательнк? среди, вкл,.

чащие БЛП 1,0 :л7л, либо БАЯ 2,25 мг/л+ кинетнн 0,2 иг/л при ис~ пользовании черенков растений в качестве исходных аксплантов. В Данном случае на концах всех стеблевых отрезков, погруженных э им-татёлышу среду, формировался гранулярным зеленоонрашешшй каллус.

При использовании биотехнологических методов в решении задач селекционного направления, органогенез, т.е. процесс решг^'берзныта-ции каллускок ткаш, является одним из основслолагажц-к и достаточно сложным этапом. Результаты многочисленных исследований убеждают в необходимости его детальней отработки и изучения для успешного .разрешения поставленной проблемы (Бутенко Р.Г. ,1375$ кизж^у С., Окасоу ;Еутенно Р.Г. Л990).С этой целью нами были проведена

эксперименты ко оптимизации шггательжк сред, индуцирующих процессы клеточной пиффереицировки каллусной каосы, формирование ткашл-"; . и органов растительного индивидуума с использованием метода математического планирования эксперимента. Полученные результаты представлены в виде графических моделей, отражающих влияние каждого отдельно взятого исследуемого компонента питательных сред на регенорацпон-ные процессы каллусной ткани картофеля Грии.5-8).

Повышение концентрации БШ от 0,3 мг/л до 1,9 мг/л индуциропа-ло прохождение органогенных процессов каллусной тканью картофеля сорта Ягодка, превышение дозы вещества н I,9 мг/л вело к пнгибиро-занию данного процесса (рис.5). ■

Концентрация БАК, инициировавшая формирование наибольшего количества каллусннх регенералтон у сорта Сватлячок, составила и-злл-чину, равную 1,0 мг/л фис.6).Лозы, превлааггаие это значение, проявили ингиЗирум&й эффект, усилнвякщийся с возрастающем концентраций вещества до 2,0 кг/л. Дальнейшее уизлкпешю количества данного, препарата в питательней сроке г.ояет к постепеинзд? усилений ачггон-спбьости органогенеза, что отрицается в иже.чзнкк ход а крипе. Л,

Заваешость регенерациошшх процессов каллусной ткани картофеля сортов Ягоцка (рисунок 5) и Светлячок (рисунок 6) от концентрации в питательной среде ВАЛ.

85 /Л у,количество регецерантов

65

45

х,мг/л

1,0 1,5 2,0 2,5 Рис,5

1,0 1,5 2,0 2,5 Р и с.6

Зависимость регенерационннх процессов каллусной ткани картофеля сортов Ягодка (рисунок 7} и Светлячок (рисунок В) от концентрации в питательной среде эеатина. 75 л .15 у,количество регекерантов

60

10

1,0. 2,0 3,0 . й,0" Р и о.7

. х,мг/л

1,0 2,0 3,0 4,0 Р н с.е.

сываюцей. исследуемый процесс.

Согласно графической интерпретации влияния зеатина Па процесс формирования каллусних регенерантов картофеля сорта Ягодка (рис.7), концентрация препарата в 1,3 мг/л проявила наибольший стшулпрувщй эффект. Вероятно наличие и второго пика на графике при возрастания дозы зеатина более 4,0 мг/л, но столь высокие концентрации препарата не изучались в ходе эксперимента. Вместе с тем, отмечается сравнительно незначительная зависимость органогенеза каллусной ткани Картофеля сорта Светлячок от наличия в питательное среде зеатина (рис.8). Бели потребность в данном препарате для интенсивного прохождения исаледуемых процессов у каллуемк экеллаятов сорта Ягодка составила 1,3 мг/л, то для. генотип! Светлячок эта величши равнялась '0,5 кг/л.. Согласно графическому решению изучаемой дроо'демн, дозы зеагииа, превышающие 0,5 мг/л,явились ингибиторами процесса органогенеза, уровни препарата в пр&делах 4,0 мг/л и более полностью исключили возможность формирования регенерантов.

Опкишзированные по гормональным компонентам питательные среды для органогенеза картофеля представлены в таблице 2.

Таблица 2

Оатишзированныз варианты питательных сред для органогенеза

картофеля

Компоненты : Сопт

питательных Ягодка : Светлячок

сред : концектгашя. мг/л

БАЛ 1.9 . 1,0

Зеатин • 1*3 0,5

■2иП 2,3 2,6

ИМК 0,05 0,05

ЗиЕ 0 ,027 ' 0,0

Сахароза, г/л II.0 • 10.0

4. Влияние стероидных гликозидов на процессы органогенеза

калпусных культур картофеля Наибольший интерес среди изученных в. данном эксперименте веществ (табл.3) представляет пурпуреагитозид. Если концентрация данного препарата 0,05$ проявляла ингибирующее действие на процесс органогенеза калл^сной ткани генотипов картофеля Светлячок, и Ягоцка - инициирование органогенных процессов у эксплантов сорта Светлячок снижалось в 1,8 раза я 2,0 раза .у сорта Ягодка, а количество полученных регинерантов уменьшалось в 1,4 раьа для сорта Светлячок и 3,8 раза для сорта Ягодка,-то оурпуреагатозид в дозе 0,005;» выступает как эффективный стимулятор, повышающий кек

уровень органогенеза, так и увеличивающий количество сформирован-1шх регенерантов в варианте опыта/Для сорта Светлячок органоге-чеа каллуокой ткани в процентном даракевич равнялся 55$ при контроле 35$, что составило увеличение в I¡€3 раза, а- количество сформированных проростков достигло 85, в 3,3 раза превосходя контроль.

ТаСдаща 3

Влияние стероидных гднкозндов на органогенез каллуонкх культур картофеля

! !Органогенез каллус - ! Получено регенеран -

Глякозиц!Концент~ !кой ткани____! тов__

¡рация, % ! с/ ! отношение ! ! отношение

_ .!_! ' 'опыт.'контроль!___! орут: контроль

Сорт Светлячок

Томатозлд 0,05 да 0,9 23 0,9

0,005 пс. 0,7 25 1,0

Капсяко - 0,05 5 0,1 3 0,1

5КД 0,005 0 0 0 0

Пурпуреа- 0,05 20 0,6 10 0,7

гитозид 0,005 55 1,6 83 3,3

Ланогито- С,05 20 0,6 23 0,3

зпц 0,005 ■¿ь - 0,7 24 (),У

Ав"Нско - .0,05 10 0,3 15 0,6

оПД 0,000 25 0,7 21 0,3

Контроль 0 35 - 2В -

Сорт Ягодка

'Гоматозиц 0,05 , 0,8 68 ' 0,0

0,005 50 0,3 " *5С' 0,6

Капскко - 0,05 55 0,6 .17 0,2

5ИЦ 0,005 50 0,8 45 0,6

Пурпуреа- 0,05 30 0,5 21 0,3

гптсзид 0,0С5 SO 1,3 139 1,7

Лаяошто- 0,05 3S 0,6 48 0,6

зщ 0,005 зс 0,5 3? 0,5

Лвено.со - 0,05 25 0,-1 12 0,1

3II д С.ООо 45 0,7 57 0,'?

Контроль 0 ОС' - ßi -

-17- '

5. Цитологическая оценка органогенных процессов

Как известно us литературных даннах- ( noddle я.,тсо11ег г;., Sot-terileld.Ql9ti3; Husuey G. .,1966), процесс формирования кал-лусшх рех-зиерантов ыоаег идти двумя путяг.™, а именно, через соматический амбриоидогекез л при непосредственной закладке мерис-тематических зон. С целью выяснения данного вопроса нами были проведены цитологические исследования каллусних эксилантов в стадии индукции органогенных процессов. Согласно полученным в ходе эксперимента результатам, Можно прийти к однозначному bubo® о том, тгс формирование целостного растительного организма происходило за счет возникновения ао novo меристематичаскях очагов в массе недифференцированной клеточной ткани.

6. Основные характеристики сомаклонадьных линий

При исследовании процесса формирования клубней картофеля in vitro у изучаемых калдусных сомаклонов, наибольший интерес . представили линии й£Е326, 1327, полученные от сорта Светлячок,у которых клубнеобразование достигло IOOJi, уровня. В контрольном варианте эта величина составила 33/». Llacca клубней, полученных от сомаклонов этого же генотипа, варьировала от 64 до 341 мг при 27 мг в контроле, т.е. увеличение данного показателя составило 2,4-12,6 раза.

. Отличие по морфологическим признакам сомаклснальных вариантов от исходных сортов состояло в изменении формы листа (срастание верхние Долей сложного листа), окраски цветка и кожуры клубней. Белая окраска кожуры клубней наблюдалась у трех сомаклснальных линий сорта Ягодка и четырех сорта Светлячок,, в то время как исходные сорта имели клубни розового цвета.

В ходе вегетационных опытов и выращивания сомаклонов в открытом грунте были отобраны линии 1167,1172, 1220 сорта Ягод-

-18, ка, средняя масса клубней которых превосходила контрольный вариант в 1,1-1,6 раза. У вариантных линий сорта Светлячок с данной точки зрения интерес представляют Ше 13.26,1327, превосходившие' контроль в 1,2-1,4 раза.

Была проведена серия экспериментов по изучению влияния разных концентраций комплекса солей па регенераыпонные процессы но-дальных сегментов картофеля сортов Светлячок, Ягодка, Молдавский розовый. Проведенный анализ позволил выделить линии, превосходящие контрольные варианты по интенсивности роста а условиях солевых селективных фонов in vitro , 3 дальнейшзм проводились исследования влияния 0,6/0-ной концентрации комплекса солей на формирование клубневой масса аомаклонов в условия:«; вегетационного опыта! что позволило отселектироЕвтъ линии töffi 1109 (от сорта Ягоцка) и 1421 (от сорта Молдавский розовый), у которых величина данного параметра превосходила контрольный вариант соответственно в 1,6 и 1,7 раза..

Согласно литературным данным (Лейке Г..Лабоо Р.,Эртель К., . 19805Неляк-Саркисов O.G..Авегисов В.А.,Т986;Кучко A.A..Иарученко И.М.,1989), при прйведении работ по оздоровлению материала от вирусной инфекции, т.е. при культивировании мористей,• варьирование по генетическим признакам остается на"уровнё естественного иопу-лящюнного фона, лгЗо незначительно превышает его. Использование каллусных культур с целью дальнейшего получения сомакло.чалышх линий, значительно расширяет споктр генотлпичеокой изменчивости и ведет к получения форм, отличных по ряду признаков от исходных материнских. В связи с.чем, задачей эксперимента, помимо оценки соиаялонов по биохимическим параметрам, явилось определение уровней варьирования данных показателей з клубневом материале в продел-эх каллусннх сомпкло.чалигпх лгнчй, черкклс1!ов и растений су-

перэдиты.

Согласно подученным результатам, варьирование в пределах каллусннх сомаклонов сорта Ягодка по содержанию сухих веществ и крахмала значительно превышало контрольные варианты. В сравнении с мериклонаш коэффициенты варьирования в пределах сомаклональ-ных линий возрастали в 1,6 раза (сухие вещества), 2,1 pasa (крахмал), а относительно растений суперэлит-н это увеличение соответственно достигло 2,4 и 3,0 раз.

Следовательно, применение каллусних культур с целью расширения, спектра геномшяческой изменчивости помет оказаться действенным методом, пополняющим традиционные селекционные программы.

вывода.-

1. Инициация рагенерацлонных процессов при культивировании керистемных эксшшнтов картофеля в значительной степени определялась их генотипом. Приживаемость меристем в зависимости от сорта варьировала от 16,1% до &1,В%.

2. Стимулирование регенерацноннкх процессов ыеристемных культур отмечена при введении б среды 0,05í»-iioí'j концентрации тогато-зица. Такие показатели, как приживаемость меристешшх зксплантов

и интенсивность роста ре1'енерантов в данном случае возрастали в 2,3-3,2 раза и 7,0-11,0 pas соответственно з зависимосгс от сорта картофеля.

.3. При культивировании нодальных сегментов картофеля отмечено значительное варьирование но потребности сортов в кинетине, гийбереллине, ИУК, НУК, нитратном азоте, сахарозе. Оптимальные дозы данных веществ изменялись на протяжении периода культивирования.

4. Оптимизированные з ходе эксперимента питательные среды для культивирования нодальных сегментов картофеля сортов Светля-

чок и Ягодка позволяют получить за 20-25 дневный период хорошо развитые регенеранты о 7-8 междоузлиями, сформированной корневой системой, которые успешно приживаются без дополнительных, меропрй-ятйй по юс адаптации в почве. ,

5. Нодальные сегменты, использованные б качестве исходных эксплантов для получения каллусной ткани о целью ее последующего органогенеза, являются предпочтительными по сравнению о другиш изученными видами изолятов.

6. Отмечена значительная генотипическая специфичность сортов картофеля к концентрациям гормональных препаратов питательных сред при индукции органогенных процессов каллусных культур.

7. Пурпуреагитозид в 0,005^-hovI концентрации оказывал стпму-* лирующее воздействие на процессы органогенеза кзялусшсс культур картофеля, увеличивая как количество эксплантов, перешедших я Органогенным процессам, так и количество полученных регенератов. Данные показатели превосходили контроль соответственно в I,3--J,6 раза и 1,7-3,3 раза в зависимости от генотипа.

8. Цитологическое исследование каллусных культур, культивированных На органогенных средах, внявило закладку de novo меристема -

тических очагов. Наличие процессов эмбриогенеза не наблюдалось ни

/

в одном случае. г м

9. Среди изученных сомаклокальных линий выявлено значительное . варьирование по морфологическим признакам таким,кая окраска кожуры клубней, изменение формы листа, а также по ряду биохимических ". показателей качества клубневой репродукции. ; :

10. Использование солевых селективных фшов кри оценке Оймгь' клонов как in vitro ,так и в вегетационном опыте, позволило вы* явить наличие определенного уровня варьирования в реакция нослс-дованяых линий, на их культивирование в уоловилх избаточкегг» ноля-

чества комплекса солей. В данном эксперименте превышение контроля в формировании клубневой массы в 1,6 и 1,7 раза выявлено у со-маклоноЕ 1163, 1421.

II. Подученные результаты указывают на эффективность использования каллуоных сомаклоналышх линий для расширения спектра ге-нотипической изменчивости у картофеля.

Рекомендации для практической работы

1. При культивировании мернстешых эксплантов целесообразно включение в питательные среды томатозида в концентрации 0,05^, что обеспечивает значительное повышение их приживаемости к усиление интенсивности роста регенерантов.

2. Использование пурпуреагитозида в 0,005/ь концентрации при индукции органогенеза каллусшх культур способствует интенси:|и-' нации цротекашя данного процесса.

3. Целесообразно проведение шсацкк пробирочных оздоровленных регенерантов в открытий грунт пол пленку, исключая стадии их выращивания в остекленных теплицах, либо применяя данный метод дополнительно к предыдущему при строгом соблюдении фитосаннтарянх режимов.

4. • Использование в селекционных программах дополнительно к традиционным методам биотехнологыческжс приемов, в частности, включение в исследования сомаклональных линий, создает дополни-.телыше возможности для получения новых форм и сортов картофеля,

5. Ведение семеноводства картофеля на безвирусной основе позволяет повысить урожайность данной культуры в условиях Молдо-е® ад- 45-52 т/га, в зависимости от сорта, значительно улучшить г>\й зфом его качества и сократить до минимума потери при хранении-

CimcoK работ, ..опубликованных, по .материалам диссертации

1. Звездина Т.II. .Косова Л.И.,Юштя II.К."ПитательДая среда для . регенерации меристем картофеля"//Авторское свидетельство №1402301, 1988. .

2. Звездина Т.Н..Косова А.И..Смирнов В.А."Использование истода математического планирования эксперимента при оптимизации питательной среды для черенкования картофеля"//Сборник "Пути интенсификации картофелеводства в Молдавии".Кишинев,¡йиннца,1Э88,с.24-30.

3. Звездина Т.П." Изучение сомаклональной вариабельности некоторых сортов картофелл'У/СОорнкк "Селекция, атуотвхаит и орошение овощных культур", 1{н1!гинев,1йииица, 1989,с. 15-19.

Подписало к печати 2I.04.S4 Формат бумаги 60x90 Заказ й 74. Объем печатного ляста 1,2 п.д. Тираж ICO экз._,

Отпечатано на ротапринте BIJIJ1KX п/о. Ксренево Московской обл.