Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Редокс-катализ в активации синтеза АТФ в окислительном фосфорилировании

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Редокс-катализ в активации синтеза АТФ в окислительном фосфорилировании"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОП ФИЗИКИ им. Н. Н. СЕМЕНОВА

На правах рукописи НЕДЕЛИНА Ольга Серафимовна

УДК 577.3.

РЕДОКС-КАТАЛИЗ В АКТИВАЦИИ СИНТЕЗА АТФ В ОКИСЛИТЕЛЬНОМ ФОСФОРИЛИРОВАНИИ

03.00.02 — биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1980

Работа выполнена в ордена Ленина Институте химической физики АН СССР им. Н. Н. Семенова.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Л. А. Блюменфельд, доктор биологических наук, член-корреспондент АН БССР С. В. Конев, доктор биологических наук Э. А. Бурштейн

Ведущая организация — . биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита состоится «.

.1990 г. в.

.час.

на заседании Специализированного совета Д.002.26.07 при Инс титуте химической физики АН СССР им. Н. Н. Семенов? (г. Москва, ул. Косыгина, д. 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт; химической физики АН СССР им. Н. Н. Семенова.

Автореферат разослан «-».

1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

А. Ф. Вани

»

© Ордена Ленина Институт химической физики им. H. Н. Семенова АН ССС

I. ОВЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Реакция синтеза АТФ в окислительном и ■ отофосфорилированли осуществляется предельно точной и направлен- ' ой балансировкой множества физических и химических процессов во иутренней мембране митохондрий. Существующие в настоящее время редставлеиия иллюстрируют скорее сложность всего процесса, чем , [•О суть. Сама проблема расшифровки механизма синтеза АТФ изиа-ш>но иеоднородна и состоит из нескольких слагаема, даке число >торих неопределенно и возрастает по мере развития исследований, эадационно проблему синтеза АТФ в окислительном фосфорилироввнии, )пряженного с электронным транспортом, подразделяет на три сос-1вляхзщиб, последовательно отражающие процесс в целом: I) каким ¡разом энергия окисления улавливаетоя в мембранном комплексе; 1 каким образом эта трансформированная энергия (энергетическое . селение) передается ка сопрягающее устройство АТФ-синтетазу;

как эта энергия используется для синтеза АТФ в активном цонтро -рмента или, другими словами, каким образом эта энергия повышает акциокную активность иубстратов решении АДФ и ф,1еорГ< » благода-: чему становится возможным протекание эвдергонической раагашл.-, торически сложилось тшс, что основное вгошагае пока скопцэнтри-вано на первых двух волрооах, что логически определяется есте-венной последовательностью стадий процесса, а также более ран-ми неудачными попытками в расшифровке .химического лгеханизмэ, ' пользушдая при шипы, установленные ддя субстратного фосфорили-*-вани^. Именно в решении первых двух вопросов достигнуты крутой» пвхи¿ связанные с именами П.Митчелла, Р.Шльямса, Л.Бойера,

Третий из вопросов является наименее исследований. Ответ на го Долкен содержать информацию о том, к какому типу химических акций относится реакция образования ковалвй?ной связи между Ъ н Фдеорг^ И каким стразом этот тип.реакции обеспечивается на пекулярном уровне» , • .

Подходы к решению этой задета принципиально отличны ot метопота первых дву5и Первым шагом должен быть анализ всех возмож-с путей взаимодействия методу реальными участниками реакции в ферментативной системе и выбор наиболее оптимальных вариантов основе соответствующих химических моделей. Далее следует оцё~ гь, насколько.найденный оптимальный вариант протекания ревкгаи

может быть обеспечен ферментом АТФ-синтвтазой на. молекулярном уровне т на уровне регуляции форманта внутри целой систем! окислительного фосфорилиpoua iшя. Необходимо также провести сравнительный анализ с другими ферментативными реакциями, возможно, проте-. каюшими «о предполагаемому типу химического механизма, само выявление подобных роаквдй является хорошей поддержкой в пользу прогнозируемого механизма, поскольку говорит о том, что данный механизм' принципиально включен в весьма ограниченное число хтлическях клише, задействованные в биологическом метабол.аме.

Анализ механизма синтеза АТФ в окислительном фосфорилировании по этой весьма очевидной программе расшифровки ш 'аболичееких реакций требует подробных характерютик каждой из- систем, вюгочае мых в поле зрения: химии образования фосфорильной связи, молекулярной организации АТФ-синтетазы и способов регуляции фермента. Эти области представляют вполне кивые и отнюдь не ортодоксальные ьетви науки, накоплен' е новых фактов идет стремительно, но, по-вдцимому,' только в самое недавнее время их число достигло необходимого уровня, позволяющего строить рабочие схемы, описывающие механизм сичтезг АТФ в химических терминах. Создание таких схем, учитывающих основополагающие концепции, принятые ео вполне на первый взгляд автономных областях исследования, и создание на их основе химических и ферментативных моделей представляется одам из основных путей изучения механизма, синтеза АТФ в окислительном фосфорилировании.

Рус? п, .задачи. тдастзвденнно в работа. Цель диссертационной работы - решение комплекса задач, позволяющих сформулировать модель химического механизма синтеза АТФ в окислительном фосфорили' ровании» согласованную с современными представлениями о химии реакций фосфорилироващя и о свойствах и регуляции фермента АТФ-сшггетазы, вынолшшцей эту рэякцшо в митохондриях.

Для достижения этой цыи-как основные были выполнены следующие, задачи:

- исследование моделыа хшаческях. реакций синтеза АТФ, про текахдах а отсутствие фосфоршшруюшх реагентов: определение спя теза AT® в условиях образования свободных радикалов реагентов ра акции ври аестком и УФ-^облучешт, при облуче}щи вицимым светом в присутстЕЖ!' '^ютосенсибилиз^тора флавкна, при восстановлен фпа-шна в темповой катодной части фотогалваничоской ячейки? . исследование прЬмеяуточншс продуктов фотовэаимодеиствия

лавина и ДЦФ, возникающих при фотосенсиоялизации синтеза АТФ;

- исследование родокс регуляции АТФ-синтетазы, необходимой гся обеспечения протекашя реакции по свободнорадакалъпому меха-изму, и выявление редокс цечтров, синхронизированных с АТФ-син-этэяной активностью, в целых митохондриях, СЫЧ и в изоларован-эм ферменте Р^-АТФазе: изучешю методом ЭПР переживакжих што-эндрий в специальной, встроенной в ШР-споктрометр, проточной «теме; проведение при 77 К сравнительного исследования парамаг-иных центров в митохондриях и фосфорилирухщих и нефосфорялирую-IX ШЧ; Еыяснешв природы парамагнитного центра с ^ = 2.00, ин-энсивность которого максимальна в условиях энергизавди, путем ^следования влияния видимого света в полосе поглощения фяашпа 1 фосфоршшрующую активность митохондрий и их ШР-поглощенив; твлетв флавиновой группы в составе изолированного растворшо-> препарата 3?|-АТФаэы ме- эдат оптической и ЭДР-спектроскопии, ¿яснекие роли флавинового центра, в функциональной активности [Ф-синтетазы.

Прэдставлялось необходимым обобщить собствешше и литератур-íe данные для обоснования схемы химического синтеза АТФ в окис-цельном фосфорилировашти, в основе которой лежат представления ведущей роли редоке регуляции элементарного химического акта.

Научное значение, новизна работы, практическая ценность.Пт>эд- ' гавленная работа является первым систематическим исследованием, эсвященнш анализу элементарного химического акта синтеза АТмг, лгалняемого АТФ-синтетазой в окислительном фосфорилировании и юсобу его обеспечения в целостной метаболической системе мито->ндрай. Особое, внимание обращено на анализ литературного матера. Собраны свидетельства о несомненной роли редоко регуляции [Ф-синтетазы в осуществлении ее каталитической функции, которые эдко цитируются в современных обзорах по окислительному фосфо-глированию, сосредоточенных на описании первичных стэдий преоб-азования энергии окисления в "энергетическое давление" и вняс-5нию его природы* Следствия несомненно имеющей место редбкс рефляции фермента неоднозначны для проявления его функцион льйой ггивности. Такого рода регуляция может обеспечить разнообразные гадии в активации химической реакции, например, энергозависимые )нформаиионные изменения белковой матрицы или ооддертаний необ-адииого протонного градиента внутри фермента АТФ-синтетЭзы. В шной работе исследована возможность редоко регуляции в обеспе-

чеши активации непосредственных участников реакции, имеющей принципиальное значение в химик образования фосфорильной связи. Б этом плане работа являэтея развитием более.ранних гипотез Й.Уонга, Л.А. Ечюменфелъда, В.П.Слулачева и сравнительно недавней гипотезы Дж. Бокриса о ведущей роли одноэлектронной активации в синтезо АТФ в окисдительком фосх&орилароватии Нови:,: моментом, развитым в настоящей работе, явилась попытка обнаружения свободнорадикальных интер-медиатов в модели синтеза АТФ с участием флавин^ в качестве донора электрона для АДФ. Присутствие фловина. в составе АТФ-синтетазы, обнаруженное в нескольких лабораториях и подтвержденное в наших экспериментах, свидетельствует о жизнеспособности разработанной модели химического синтеза АТФ.

Выяснение химического механизма реакции синтеза АТФ в окислительном фосфоршшроваши изначально относится к фундаментальным разделам оиолопга, и любое исследование по атому вопросу поневоле огряничеко .яеетгаши датами теории. Тем не меное, хотелось бы отметить, что выявленная в настоящей работе роль шлавшга в обеспечении функции биологического сопряжения может явиться основой подходов для диагностики и репарации ряда-патологий, связанных с нарушением энергетических процессов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзных симпозиумах "Магнитный резонанс в биологии л медицине" ' (Звенигород, 1979, 1981, 1983, 1989; Одесса, 1986), на Всесоюзных совещаниях "Биохимия митоховдрий" (Одосса, 1976), "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пущине. 1988), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на конференции "Действие видимого свота на. биологические объекты" (Ялта, 1984), на 16 конференции ФЕБО (Москва, 1984), на 6 симпозиум ШЕА "глектрошщй парамагнитный резонанс в биохимии, молекулярной биолещи и медицине" (Братислава., 1988), на заседании Всесоюзного биохимического общества ■ (Москва, 1983).. -

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 обзора, 19 статей в тезисы 14 докладов, на веведаайк-:. 1г.,м0вдущра|®к доов^еренци;

Объем и структур^'тобрук. Диссертация изложена па стра-пицах текста, включая таблиц, рисунков и список литературы, содержащей 1385 наименований.

Работа состоит из введения и гзсти частей. Час ь I - Введение, содержит наложение актуальности исследования, формулировку целей и задач исследования; в части П кпатки перечислены основные метод)

зследования, в частя Ш проведен анализ химических механизмов »сформирован:'/* и сопоставление основных способов получения фос->рклирующиХ реагентов, в toií числе ATS, в пропаративной химии химической технологии с химическими моделяш синтезов ЛТО в эебиотическйх процессах и в биологическом фосфорилировашш. Под-аркнута обязательность редокс катализа, в тем числе свободнора-[кального, на какой-либо из стадий подготовки реагентов к реак-га, и показана возможность его. использования в момент реакции ш активации некомплементарных партнеров.

В части 1У описано проведение синтеза АТФ в условиях гэнера-т свободных радикалов АДФ реагентов под действием пучка элект->нов, УФ облучения, при фотосенсибилизащч видимым светом в прч-лгетвии флавина и в темновой катодной части фотогальваниче ской ЮЙЮ1 npi восстановлении флавина. В этой же части описаны иссле-' )вания по идентификации рогложут очных продуктов взаимодействия гаанна и АЦЗ.

Часть У содершт описание исследований по выявлению редокс гнтров в митохондриях и СМЧ, связанных с АТФ-синтетазной функ-

В части У1 проанализирована функциональная значимость рвдоко »гулянии для АТФ-синтетпзы и возможные способы ее обеспечения системе окислительного фосфорилирования и описаны эксперименты, ( которых получен синтез А1Ф в растворе Fj-ДТФ-азы, сопряженный " родокс переходами эндогенного фпавина, индуцированными воздей- . ?шт видимого света.

В части рассмотрена модель синтеза АТФ в окислительном >сфорилировании по свободнорадикалыгому механизму, вобравшая в эбя теоретические соображения и экспериментальные дачные, изло-нвде г диссертации,

П. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССШОВАНИЯ

В качестве объектов исследования в диссертационной работе пользовались биологические и химические си стеки, выполняющие, гатез АТФ: ыитоховдршг,. СГ.П» растворимый фермент Pj-АТФ-аза из зчени крыс и растворы АДО и ®ноорг, в условиях высокой р-роятно-ги одяоэлектронных переходов реагентов и/или сенсибштзаторов закщпг. . •

Радокс-переходы (образование свободных радикалов) в растворных химических системах генерировались воздействием ионизирующей здиации, УФ-облучелзем, освещением видимым светом в присутствии

красителя - флашш и аяектрохишчесю.;* восстановлением флаышо.

Дня идентификации одноолсктрошшх интердодиатов и редокс центров, могущих обеспечивать их возникновение, в реакциях биологического и химического моделирования синтеза. А'ГФ использовали метод ЕЛР, при исследовании модельных хтжчоских роакций щлшаиюш татся< погоды оптической спектроскопии и импульсного фотолиза.

Дяя адекватной характеристики как химической, так и биологпчв' ской систем, спнтезируывдх АТФ, пршенялись соответствующие метод: поддержания и контроля задаваемых условий для протекания pet щш. Дпп создания оитишдышх. условий функ.ло1шровашя митохондрий и ШЧ в момент записи спектров ШР использовали специальную проточную систему о электродом Кларка, встроенную в резонатор. АТФ опре деляли хроматографическим, ферментативным и биолюшнесцентным метод аш.

Ш. ИЕЗ-ИгШЯАТИБНШЗ СИНТЕЗЫ ФОСФОРИЛЫШ СОЩЩЕИЖ И ЖМГЖЖ МОДЕЛИ СИНТЕЗА ATФ В ОКИСЛИТЕЛЬНОМ ' . ФО СФ0РШШР0ВА1ШИ

Синтез АТФ мокно характер: зовать как роакщго кслденсации двух фосфатов - ДП£? и ®Н00рГ - с высвобождением молекулы воды и как реакцию фосфорилирования - перенос фосфорилыюй группи - FOgllg -из Ф,1е0рГ< 1 концевому атому 6 в АДФ или фосфатной группы - ePOgfl - к атому Р в ДЦФ,

. АОРбРСу^ + Н2»

ADF6H. + Н0РО^Н2 "

ADIi'PO^IIg + IL^e

Формально синтез АТФ из АД-& и ®НООрГ< классифицируется как реакция нузокгсфильного замещения у атома Р либо в ®110орг.» лийо 1 АДФ и резулътируется в образовании ковалентной связи Р-0.

В соответствии о классической -термодинамикой эта реакция является эвдергонической, т.е. да может произойти без вклада энерп Классическая энергетика но- рассматривает молекулярный механизм тралсформащи субстратов й'продукты; природа истинных субстратов, вступаящих во взаимодействие, и механизм элементарного химическо:

кта образования связи не является предметом этой науки.

Валовые урч^ненья реакций синтеза АТФ (I и 2) nor зывают, что каздом из этих случаев происходит разрыв связи Р-ОН, т.е. связи тома Р с сильной электровдгкорноЛ группой, Именно эта стадия яв~ кется лтащтирувдей в синтезе АТФ из АДФ и ФНеорг.* Трудности поучения фосфорилированных прг вводных, в том чиоле АТФ, при иополь-* мани Фнеорг, являются принципиальными и обусловлены особенностя-t электронной структуры фосфатов.

Устойчивость этой структуры объясняют в разных терминах, на-эймер, резонансно стабилизирован! эй структуры (Полинг, 1978), шгтастл ¿JT-сопряжения (Кирби, 1971), деформацией электронных рбиталей атомов О под действием положительно заряженного атома Р втягиванием электронного облака, в область связи (Бочвар, 1976;. гедствяем является как бы распределение двоосвязанности по всей 1 хлекуле и укорочение связи Р-О(Н) по сравнению с расчетной (1.51 А 1,71 А соответственно, - Кирби, I97X).

Особенности структуры фосфатов, в особенности фне0рГ> > обус-1влив",0т отсутствие четко выраженного разделения зарядов в этих илкулах, что результируе^оя в очень слабой хидаческой активиьлтй« téopr. проявляет некоторые нуклеофильны,. свойства, обусловленные юбой поляризацией гибридных связей в направлении атомов О, злек-юфилышо свойства не выявлены вовсе ввиду маскирования положи- " щьного заряда на атше Р. В силу этого Фнв0рГ, редко реагирует

ix электропил по атому Р, а только как нутаеофил по атому 0.

Поэтому в реакциях фосфорилировяния фН0ОрГ, обычно выступает'

дько как донор фосфатной группы-ОРО^ и только-в реакции о вяь сильным электрофилышм центром. Перенос фосфорильной - FOgHg ' lyima гз фосфатов становится возможным после выявления латентного яожйтельного центра на атше Р, например, при отвлечении донор-

x электронов атома 0 в какую-либо связь, что равноценно замене охо уходящей группы OfT на какую-либо другую группу (неггример:

зильную > Корана, 1964> или при э.тлдпйровашя •

уппы ОГ с помощью восстановления (другае способы прямого отрч-ОН-группы из Фкеорг # , приводящего к образованию метафосфата РОз]", неизвестны). * • '

Таким образом, способы активации ®не0рГ< вполне ограничены и гко поддаются анализу. На схеме I показаны основные направления нтеза фосфоргльяых соединений, принятые в препаративной хт.сти >

Схема I. Основные направления синтеза, фосфорилирущгх реагентов (АТФ) из субстратов с плохо уходящими группаин(01 прявят.ыв в препаративной'я модельной зошях -

Субстраю к продукты рзакцни заключит в прнмоуголышо рашиг, ясъжпиыо реагенты для исходных ноакгввярованлых су& стратор - в овальные рамкн / в низшей части схемы это ак№ в»ровад«кв фосфаты/. Варианты прямого взаимодействуя исход субстратов АДРШ ( Я' Щ « MFOjHg обоэначеяы соответствен точйчннм и п^нкмрйьшн• _ »у. стрелкам*..

л направления совпадав» & основными идеями химического модели-вания синтеза АТФ в окислительном фосфорилировании.

В левой части схемы показана реакция двойного замещения, в горой имеет место электрофяльная активация атома Р, акцептор-го для слабого нуклеофила ^например, АДФ> .посредством ковалент-го катализа. Такой тип актгвэдии естественен для фосфатов, осо-Ещо чувствительных к природе уходящей группы и безразличных к актически любому изменению свойств нузиюо'Тила . На первом ее аш происходят образование фоофорилирующего реагента путем прл-

эдинения фосфатной группы "ftPO^fig (иля ^ в сяльно~

электрофильному центру, т.е. нуклеофилк'оа замещение у гетера-

ома

^ X -

—; на втором этапе - перенос фосфо-

яьной группы -К)3Н2 на конечный акцептор, т.е. реакция нуклео-яьного замещения у атома Р:

а*е~ + V ^ л V

2гхвп ггмк'

зультатом х.эакции двойного замещения является синтез связи Э-Р (и АТФ в том числе) и окисленный продукт

Как правило, лимитядрувдим этапом является первая стадия, а енно, образование достаточно сильного одектрофильного центра (х), могущего захватить фосфатную группу* Такими нентррш в зншпе могут быть соединения с высоким потенциалом переноса уго Б?—х, ион карбония К?" и электрондефиштшй. свободный ра,-кал Б?» Дяя образования этих центров эффективны' главным образок цоке катализ- (как двухзлоктрошшй, так и одаоэлекгронгжй), а я реагентов, в которых уже есть некоторое разд&тенив аарядов —х) - конформациовдый, общий кислотно основной и метвллоката,-э. Реакция протекают по механизмам 5Н1, Б^г, зШ[1, зЯ1(г. Образованное на первом этапе фосфорилироваячое производное

2*10582 является активированным фосфатом с демаскированным

жйситшЬ>ным зарядом на атоме Р, поскольку неподеленная пара актронов атома 0 , ранее вносившая вклад в ¿п -оощдееще, оточена В другую СВЯЗЬ. Длина СВЯЗИ С фосфорИЛЬНоА группой -РО3Н2 ионофграх фосфатов увеличена по сравне^р о длиной связи НОв ®неорг. й «оставляет уже не 1,51 А, а .Г»60-1,?3 А в за-

висирости от электрон-акцепторных свойств заместителя (Корбрида, 1982? Hayes, 1978; Ewig, 1986 ).

Второй втая реакции двойного замещения - перенос фосфорильпой группы -POßHg на конечный акцептор - часто тоне требует дополнит« ной активации, но уже существенно более мягкой. Здесь эффективна любые электрофильного катализа: окислительный катализ, мета'

ловатализ, конформэционный катализ, обдай кислотный катализ. Вторе aran обеспечивает переход низкоэноргетического фосфата в высокоэнергетический, т.о. повышение потенциала переноса фосфорильной группы. IIa этом этапе происходит дальнейшее демаскирование положите иного заряда на. атоме Р и подготовка его к взаимодействию со слабыми нукпеофнлэмя, каковыми и являются фосфаты, например, АДФ, по механизмам нуклеофилыюго замещения sfJ3 или Sy2 .

Среди вааснейших препаративных, метаболических н модельных реакций, использованных для построения левой'ветви схемы, отметим синтез нуклеотидов помощью конденсирую:цих реагентов (Корана.,196' Кнорре, 1975; Шабарова, 1978), фосфородвз гликогена (Мецлер,1930) субстратное фосфорилирование (Рэкзр, 1979), синтез АТФ через сво-боцнар'адикалькую стадию образования фосфоишэдазола (Wang, 1971) й фосфогаалтрен перхлората (oíase , 1974).

: ' Правая ветвь схемы I иллюстрирует реакции фоофорилирования, осуществляемые с помощью фосфитов Р(0)(0н)2. В оргадаческом синтезе нуклеотидов именно зти соединения применяются наиболее успешно (Кирби, I97I; Todd, 1959). Фосфиты обладают как элект^офильными так и щттсофильгшмт свойствам. Выступая в роди электрофилов, они легко реагируют с нуюгеозвдамрг, давая соответствующие вторичные фосфиты» их последующее окисление приводит к образованию фосфатов. Фосцаты являются сильными восстановителями и в присутствии окислителей легко образуют активировадные фосфаты и пирофосфаты (Диенко,- 1971). Фосфиты легко атакуют атом кислорода карбонильной группы, что приводит к восстановительному фосфорилирввашго хино-нов (Кирби, 1971),

» В реакциях фоофорилирования фосфиты действуют гораздо активнее фосфатов, подтверждая общее положение о том, что удаление ста билизйрухнцей мономер группы ОН" восстановлением способствует поли меризаодя (Сайке, 1977)'. Действительно, имаетоя ряд примеров конденсации ортофосфатов, ишииироврнной восстановит- лями (Корбрйдг;, '1.982;' Bahn, 1981). .

Восстеноштельное замещение анионных лигакцов йаблюдается я

радаолитичеоких условиях. Прямое наблюдение промежуточных сьо-эдных радикалов по: оляот выявить детали процесса и показать, го элиминирование нуклеофильиого фрагмента (группы 01Г) происхо-ït из электрошгзбыточного свобогюго радикала. Разрыв связи Р-ОН 5казан при диссоциативном захвате электрона Ф,1еорГ# ( Symone, 373) и фосфоранилэтшюламином (Barntiard, IS79). Восстановлеш$о I одноэлекгронное) также увеличивает кукяоофидьныв свойства реа-энта, что облегчает образование промежуточного переходного соо-зяния в реакциях s152 ( snM2 h

Таким образом, схема I показывает, что для осуществления ре-щяи фосфорилирования редокс катализ является ключевым моментом а какой-либо из стадий в общей цепи превращений исходных реаген-îbî окисление в реакциях двойного замощения (левая ветвь) и воо- ' гановленио (с последующим окислением) -(правая ветвь). Именно с • жющьв редокс-катализа irxra сходит активация, т.е. выявде:шв ла-знтных реакционных центров, в реагентах, глухих ко всем другим тособам воздействия«

Предложенные в разное время теоретические модели синтеза АТФ соответствующие им экспериментальные модельные химические реэч-т легко локализовать на приведешюй ох^ме.

Разработки 50-60-х гх1., в пору наивысшего интереса к химчос-зму механизму элементарного акта синтеза AW, ггредставляли собой«» J3личные варианты реакции двойного замещения, в которой осущост-етется ковалентный катализ, и по существу описывали движение 1Эктрофильного центра сначала к фНо0рГ.t а затем к АДЕ (левая . мгвь схемы I). Основное внимание было фиксировано на способах 5разования соединения о высоким потепвд«-лом переноса групп К1"- х > гажроэпга) , где обязательным этапом полагалась редокс-стодия жисление - lardy, 1969, восстановление - ыршшш» 1953; Блшой-шд , 1362; Скулачев, 1968)* В качество восприемника ФцЁОрГ. бы-[ предложены и такие злектрофильные центры, как карбокатаон*Р+ Baltrop,X962) И свободный рзддакал К* ( Wang, Î972; Ввд-rleirt, >74). '

В намоядае время приходится отказаться от реаквди двойного одещения как основы моделей .биологического синтеза АТФ, посколь-г установлено, что й активном центре Д1Ф-синтетазы имеет* место хямое одностадийное взаимодействие между ЛДФ и $Н00рГ,» в кото->м ФнворГ4 выполняет роль злегсгрофила (отереохишчесюгй тест ^ îowlee, 1981-83). Отсутствие фосфорилированного интерд^даптя

исключает из поля зрения сэшш распространенный способ активации фнеовг. 11 нумеотидов в реакциях фосфорвдирования - коваяонтннй катализ (замена плохо уходящей групт).

Возникает наст чтэльная необходимость анализа пригодности для биологического моделирования других методов (типов катализа), вн-зш^ющих выявление латентного реакционного центра на атоме Р в фяеорг.' Сейчас имеется несколько вариантов "энергизацки" ®яе0рГ • В л окую часть схемы ложатся теоретические модели, в которых активя ронянное состояние ®Н0ОрГ|1 можно формализовать как соединение с высоким потенциалом перенл-са групп В+ — X или ион карбоиия В+ (нижняя часть левой ветви), т.р, HOfO-jIIg и мета„зсфат соответственно. Хотя, если строго следовать ограничениям, введенным стерео-лшическгш тестом, а именно, наблюдаемой инверсией, а не рацемизацией продукт.' реакции, модели, предлагающие в качестве интермедиа' та метаа'ОсФат, уже но являются актуальными;

Особенно популяг'Ш в настоящее время представления о возможности проявления положительного заряда на атоме Р посредством кислотного, конформационного и металл¿катализа или их комбинации ( KagHWa, IPB5; с ова, 1981; Frash, Selraan, I9bJ), что должно спссобст: овать протекают реакции по заданному механизму sK2 .

Образованию метафосфата. из ^Н00рГ/ код действием кислотного ■ катализа и,-следовательно, протекание синтеза ЛТФ по механизму. sN било предложено Митчеллом ( Mitchell , 1976). Идея о генерации в рёакции фотофосфорилирования метафосфата, инициированной одноэлек-ттюнннм счислением Ф.,.„п„ , разрабатывается Гончаровой 41977,2981)

» ilt-VJJl ■ *

и Пешковым (1986).

Ограниченность выборо способов активации фНеош\ и явная проб-лег.гатичносчь действенности разновидностей электрофильного катащзг в отношении ^Н0Орт>.» нв подкрепленная.пока, экспериментальны;® химическими- моделями, заставляет обратиться к анализу возможности экстраполяции принципов фосфорилирования с яомогцью фрсфк х'ов на ферментативную реакшго синтеза АТФ,

Ранее полагалось, что химические реакции фосфорилировання, выполняемые с помощью фосф. ?ов. (правая часть схемы I), не могут лет в основу биологического моделирования, поскольку биологические . оргтщзмн никогда не содержат фосфитов ( Blackburn, 1969). Тем не менее, два эскиза биологического сийгеза АТФ, опосредованного "яосстачоЕ-енибм фосфата, появилось в Последнее десятилетие; фосЯш тяояовнГ механизм (Лшёшко,. 1980) и электрохимический механизм, в

этором АТФ-сянтетаза представляется катодом, при котором происхо-тг одноэлвктро{(ноо ¿оссташвлекив Фце0рГ> (воскпя, 1905). Полу-земый НРО3 соответствует аяоктрофильному цент зу Я+, с которым ■ згут легко реагировать фосфаты, и данном случае АДФ.

Ключевым моментом для реаквдй, изображенных в правой части семы X, может быть и не пряг е восстаношген-'е Фне0рГ<» способст-дщоо элишнироэшшю (вытеснение) стабштизирутацой группы 01Г, а цюэлектронаое восстановление яукяеофила, взаимодействуйтего с

( 3утопа, 1973). Восстановительная активация, приводящая усилешго нуклеофилышх свойств реагента, особенно важных в отно-5НИИ реагошй с очень слабыми злектрофидзщг, часто задействовали метаболизме (например, В^) (Мецщр, 1980).

Существенно, что активацаоннон стадией в первой теоретической ' здели синтеза. АТФ в окислительном фосфорилировании ( Ыртапп , ■ 146) полагалось одноэлег ронное воостаяовленио дыхательного нере-ючика, усиливащее его нунлеофильше свойства, что и шгаттарова-I его взаимодействие с 5>неорг.» синтез первого фосфорилиро-шног^ макроэрга. В этой модели дыхательный переноечик принимал [астие одновременно в редокс-реакции л в реакции нуклео$'ильна"о мещония, причем активность его как нук:еофила обеспечивалась (докс-ироцессом. В модели Липмана полученный полувоссталрллспаи!! ссателышй переносчик, согласно современной терминологии, являетг г свободным радикалом, а сама реакция относится к классу реакций юбоднорадийалыюго замещения б^2 , выделенного в отдельную 1тегор1по сравнительно недавно (Ингольд, 1974; Балецкая, 1979). • :е значительно позже появились экспериментальные факты в химии юбодлых радикалов и пребиотическом моделировании синтеза АТФ, торте можно рассматривать как экспериментальное подтвергедегаш ой модели.

В настоящее время модель Липмана представляет особую ценность и вынужденном фокусирований последовательных активашошмх ста- • й, имеющих место в многоступенчатых реакциях фосфорилированйя, . обеспечение одностадрйного взаимодействия двух нетоттеадентор- ( х фосфатов АДФ й фНе0рГ.« При замене дыхательного переносчика Я" к реагента на АДФ, модель полностью соответствует современным «вставлениям о механизме элементарного химического акта, в котом АДФ должна быть нужлеофилом, а ФН00рГ, - электрофилом. Вог'г.тоя-сть участия свободного радикала АДФ в синтезе макроэргичеокой язи впервые била сформулирована Л.А.Блкменфельдом (1962) и зп-

тем послужила основой трехкомпокантной схеш окислительного фосфо-рилировадая, ввдшнутой ВЛ.Скулачевым (1969). Положенная в основу этих теоретических моделей идея об определяющей роли переноса эле! трона в образован», и разрыве неактивировашюй химичоско? связи в настоящее время представляется наиболее перспективной ддя анализа хндаческого механизма элементарного акта синтеза АТФ в окислительном фосфорилировании.

1У. СИНТЕЗ АТФ В УСЛОВИЯХ. ГЕНЕРАЦИИ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ АДФ

Взаимодействие м&жду взаимно ин&рт'шми реагентами часто становится возможным в условиях образования их свобод-чх радикалов, Лр переходе реагента в свободней радикал, в электронной структуре которого ослаблена связь с уходящей группой, аклгвационная стадия оказывается максимально приближенной к элементарному акту образо-вашя новой химической связи и/или разрыву.старой, что резко повы шает спевд^ичность тюакдаи.

•В части 1У описали эксперименты, поставленные для выяснения принципиальной возможности синтеза АТФ из АДФ и Ф,ЮОрГ> по свобод норадякальному мехажзму в условиях высокой вероятности образований свобода'« радикалов АДФ: при воздействии иошзярувдей радиаци и УФ-облучения, при облучении видимым светом в присутствии флавив при восстановлении флавина в темновой катодной части фотогапьвани ческой ячейки. В такой последовательности условий осуществляется фокусирование энергетического воздействия, ведущего к образовании свободных радикалов в среде, на молекулу нуклеотида. если под воздействием ионизирующей радиации энергия 'поглоща&тся всеми компонентами системы, в;;гдачая растворитель, то гри УФ-облучении -преимувдет енно нуклеотидом АДФ, при освещении видимым светом -только красигелем. Круг возможных химических реакций доследовать но сужает-ся, поскольку уменьшается число супероктивннх реагентов в системе. Такая фокусировка энергетического воздействи" позволя« не только направленно получить ведущий шггердедиат, "но и выявить активирующий реагент, пригодный для экстраполирования процесса ш условия биологического метаболизма.

Синтез АТФ при облучении пучком электронов и при УФ-облучогтя

В условиях жесткого облучения энергия воздействия так велика: ■ что практически не существует никаких ограничение ни для разрыва rot для образования любых.химических связей (Хегс, 1973). Синтез токценеиревенных фосфатов был зафиксирован в условиях жэсткого о<

тения ( Clarldge, 1963; Schima, 1961), так же, как и синтез грофоофатов И ДТФ г^и УФ-облучениИ ( Beck, 1965; Ponnawperuma , . >63). •

№ такхе наблюдали увеличешя содержания АТФ в лвводном раст->рителе »ЮО при облучении пучком электронов (ускоритель У-12, гергия электронов 5 мэВ, дом облучения за. 400 импульсов 1,2.IG2® }/;.ut) и УФ-освещении в полосе поглощения нуклеотидов. Выход АТФ этих экспериментах составлял 1-2? от содержания АДФ.

Синтез АТФ под действием видимого света

Фотозашсйшй синтез фосфортлирушгах реагентов (и АТФ) был провес ¡н в разное время в нескольких лабораториях (Гончарова, 1977; Яс-IKOB, 1906; Dycker, I960; "Sang, 1969; bin, 1978; Pox, I97C, »igln, 1981), но вопрос о механизме процессов пока остается от-, зцтш. В то же время обрззование свободных радикалов нуклеотадос," ¡тосенсябилизировашое красителями« документировано в многочислен-ix работах то исследованию фотодинэшческого эффекта в нуклеинов гх кислотах { Berg, 1978; Burr, 1969). Факт фотосенсибилизготй з„ гптнляш химических реакций нуклеотидов надежно установлен, жчш получаемые продукты часто идентичны таковым, получаемым прй эдиодизе (Кочетгсов» 19?о). Вероятность протекания этих реакций > овободнорздикаяьному механизму достаточно велика, хотя и не всэ-t принята Штокман, 1987).

. При освещении на воздугэ водных растворов, содеркшагх рибофта-.а 3.10"%, АДФ 5,10"% в 0,jöiфосфатном буфере при pH 6,4 метода-г хроматографяческого анализа нуклеотадов и бяолвдиншюнтннм этодом регистрируется прирост AT® по cpi. люнию с контрол^нчнгт не-. звещеннымн пробами, равный ^ 0,5% от исходного количества АДФ.

Фотореакция образования АТФ ингибируётоя фенолом 5.10"% - ггз-эстным ингибитором свободнорадикальных реакций, в данной конкрот-эй системе, по-видимому, имеет место уменьшение свободных рапика-зв - "обратное дониродашга"мааду седазошоном ¿извита и образуются при взаимодействии фенола с фотовозбузденныМ состоянием флаг ша феноксильным -радикалом ( Psreira, 1937). В присутствии 2,4© угнетения синтеза. АТФ не наблвдается, более того, приест АРФ Знаружен при освещении АДФ и 2,4-ДШФ в отсутствие флазинэ. По-и;--шому, 2,4-ДНФ, поглощащий при Л « 450 им, фотосенсибилкзируот 1Нтоз АТФ подобно фпавину.

При замене Ф^орт, на его структурный и электронной р чу лог на-1 эдат, в системе ГФ + АЛФ + У(У) наблюдается обраэоранпе ни?-

ния, предполагаемого аналогом АТ&-АЩ5-УО3, определенного; методам хроматографии. Об образовании "»того аналога судили по количеству У(У), освобождаемого при 10 ш кислотном гидролиза шшаха из пятен, соответствуй"»х АТФ. Повышение отншенкл концентрацрч освобождаемого при гидролизе ванадия в освещенных пробах найлвдалось только в хроматографической фракции, соответствующей АТФ. При ос» щеяии этого же раствора, но с введенным $нв0рг. конкурент-

ного ингибитора процесса, изменение относительной концентрации ванадия, освобождаемого при гидролиза, не превышает разброса значений этой величины для темповых образцов.

Дашше эксперименты по синтезу ванадиевого а злога АТФ - АДфО-УО3 - позволяют исключить возможность фотосашак&ишзировадаого синтеза АТФ в этой модели со реакции дксмутации. В самое последив! время синтез ванадиевого, аналога АТФ получек и детектирован методом ШР ( Огеввег, 1988).

Синтез /ТФ в темновой катодной частя фотогальванической ячейки при восстановлении флавота.

Для вчявяе"ия механизма наблюдаемой фотосеисибилизацни фданв-ком синтеза АТФ важно выявить его "знергазованноеп производное, яепосредстверчо взаимодействующее с АДФ в реакции переноса электрона.. Фотосистема не дает однозначного ответа на агог вопрос, т.к содореят и фотовозбузденные состояния, и семихипоны, и восстановленный флавин.

Дет ^членения этого вопроса представлялось рациональным испол зовать методические приемы, принт, ■■•не в фотоэлектрохимии. Особенно привлекателен в этом смысле принпип устройства, фотогальванкческой ячейки, позволяющей пространственна разделить фотовозбуздапныэ и свободно радикальные состояния красителей-сенсибилизаторов ( Fox, 1986). Электрохимическая ячейка была собрана по образцу, описаний му íamaae (1981) и вст^оени в кюветный отсек спектрофотометра sг'.-cora úv-vie . Фотогальваннческий эффект вызывался р^докс-1*зкпиеЙ в освещаемой анодной части длатиновый электрод) ячейки тхру фотовоз^увденным ти.влетным состоянием флавина (<ЯШ) и доио рои ялектрона ЭДТА. В катодной части (золотой электрод) нами было патт-'-эно вос-узловлешо различных красителей и контролируемо' пс соогветствущему появлению попощешгя. их восст- ювленной фор.-ч Fíj.io j'ot'rrniD, что в присутствии АДФ восстановление ШГ замадлег. э что сстпзтптпует изг.р-Г1'ому явлению подавления фотовыцретания

расителай в комплексах +

( МсОогт1ск, 1958) (рио. I).

Рис. I. Зависимость скорости восстановления окисленного ©Ш в темновой катодной камере фотогальвапической ячейки от концентрации нук-леотидов: I - Адо, 2 - А«Ф( 3 - АДФ, 4 - АТФ, 5 - без нуклеотидов.

Уменьшение выхода полностью восстановленного флавика модат ыть связано с участием его различных восстановленных форм в дони-оваяии электрона на АДФ.

В этих же условиях определен прирост АТФ в темновой катодной асти ячейки, сопоставидай с голученкад при,фотосенсибилнзшщи лавипсм (ряо. 2). Найлвдаеиый синтез А№ ингибируегся в присутст-яя ИУК, тормозящей образование полностью восстановленного флазина.

(-ТшяГ

К***-}

Рис. 2, Синтез АТФ в тм-нсшой катодной части фотогальванической ячейки, при восстановлена? флапина.

Ршведенные нош модельные синтезы АТФ подтверздают результат! многих авторов, исследовавших сходные системы ( Fox, 1978) при мо. делировални пребиотических процессов, характерной чертой которых является генерациг высокороактивннх реагентов, в том числе свободных радикалов, под действием экстремальных внешних факторов. Было. Kpc.nojiav.biio, что синтезы АТФ, протшдешшв в более мягких условия; (при фотоооисибилиsain*и флаишом и в фотогальванической ячейке), также протекают по свободнораднкальному механизму по аналогии со своооднорадикалышш. реакциями, инициированным« одноэлектрош.лми переносчиками, т.е. сопря-еннши с одноэлокгронной редокс-роакцие. в' чанном случае о окислением с^михинона флаьина, В принципе показано участие ваших биологических метаболитов (НАДЕ!, флавин, тиа-минпирофосфат) в реакциях такого рода ( suinkai, 1984).

, . СЪтоивдуцкроваяноё образовать свободных

радикалов АДФ в водных растворах Рф+АДФ.

. Естественным условием для прогнозирования свободнорадикальног механизма является обнаружение-свободных радикалов.

Системы, подвергаемые воздействию ионизирующего я УФ-обдуче-,ния - тргдишп. лыс объекты для получения и исследования свободных радикалов нукяеотидов (Кочетков, 1970; s choies, 1978); проведенные нами.измерения в них ЗПР носят иллюстративный характер».

Сравнительное сопоставление спектров ЗДР растворителя ДОСО в - отсутствие и присутствии АДО под действием УФ-облучения показало примерно десятикратной увеличение интенсивности сигнале ЭДР свобс ных радикалов, отнесенных к СНд, что свидетельствует о том, что под действием УФ~облученгтя нуклс .гид является эффективным акцепте ром электронов. В оптических спектрах облученных опытных жидких растворов погнется поглощение в области Л 300 нм, особенно эг метпое после облучения п;чком электронов, аналогичное наблюдаемо!, в спектрах оптического поглощения при электролизе аденина в апро-т01ишх растворителях ( Sa.nfchanem, 1974 ). *

К Началу эксперимента мы не располагали сведениями о механизм фотовзаимодвийтшя выбранных наш кслкретных реагентов - флавина и i\ДФ. Хотя для некоторых тр краоитеяь-нуклеотид показана фото-сенсибилияация Свободных ради 'адов нукдяотода, экстраполяция этю ' палних на Другие, яоры, в три числе флаотн+АДФ, представлялась нс-правомерной, ' ' ' .

Полученные наг® даяние иллюстрируют существование двух разк'> 'мафвнчепкнх функций АДФ s исследуемой фотосистеме Pi*/1©. Перш

из них состоит в интенсификации образования фшавосемихинонов и может быть определена как элекгрондонорная функция основного состояния АДФ на Триплет фдагнна, что подтверждается наблюдаемым ме- • тодом импульсного фотолиза эффектом тления триплета флаввна АДФ , (рас. 3). Отщты по низкотемпературной сенсибилизации овооодных радикалов щи непрерывном освещении в системах Рф+АДФ и В&+АД9 позволяют предположить, что донором электронов в данном случае является сахарный фрагмент "уклеотида. „г. ■ • /.........

' - Рис. 3. Зависимость оптической плотности пр! . Л - 640 нм (I) и свободных радикалов РфН* при А = 580 нм (2) от концентрации ' АДФ (ОД М, фосфатный буфер, рНб,").

О 4 8 [AD9]- 10ч, м •

Другая функция АДФ в исследуемой системе состоит в акцептировании электрона с семахинона фшавина. Наш получены следующие сви-п де-ельства о таком тешовом переносе электрона, ■ ведущем к образованию свободного радикала АДФ. '

1. В замороженных образцах (7? К) растворов Вф+АДФ, подвврг-нувшихся длительному облучению ( ^ 40 мин) регистрируется сигнал ШР триплетной структуры, характерный для протон-аддуктов анион-радикалов адениновых производных ( Box, 1976}.

2. Интенсивность и скорость релаксации сигнала. 3IP, наблюдаемого в системе Рфч-АДФ при умеренных временах освещения ("10-15 win), отличны1 от этих пара*"чтров сигнала ШР» наблюдаемого в от аут^твие АДФ (рис. 4). Сигналы ЭПР свободных радикалов, образующихся в Присутствии АДФ , характеризуются значительно более быстрым 'насыщением при увеличении модности СВЧ-излучения, что характерно и для сигнала Slip от свободных радикалов АДФ, полученных, при УФ-облученяи. .

При высокой интенсивности освещения интенсивность этогс фотосенси билязированного сигнала ЭДР, измеренная в области линейной завися мости от ^РТ возрастет при увеличении концентрации луклеотида вплоть до АДФ = 5.10"%, а далее ыдоет мосто концентрационное насыщение сигнала (рио. 5).

1« { УСА

о.) 1,0-

,0,5

I

I ...-в-

Л-

" 26 го"

Т

—I— <0

Йоо

Рис. 4. Зависимость нормирс ванной интенсивности сигналов ШР ( 1н ) от мощности СВЧ-ие лучения /Г. I - Рф 3.10"^, 2 - Рф+АДФ БД0~%.

10-

Рио. 5. Зависимость фотосс сибилизированиого сигнала ШР раствора Рф 3.10"% + АДФ от концентравдш АДФ. Р - 0,05 мВ

О 1— О

6 [АВФНО'М '

3. В присутствии ЛДФ обнаруживаются термоотабильныв свободные вдикалы, отличные от свободных радикалов фпавина (рио. 6).

1/1«, 10

0.5

4 •

\ «* \

\ V \!

Рис. 6. Изменение интенсивности фотосенсибилизиро-ванных при 77 К сигналов при отжиге: I - Рф 3.10"%. 2 -Вф З.пНм + £ДФ .

3 - ДЦФ 5.10_3М (УФ).

80

1&0

20О Т'К

4. В фотосистеме Щ+АДФ+У(У), в которой происходит синтез налога АТФ АДФО'-'УОд и накопление У(1У), наряду о сигналом У(1У), аблюдае-^ам и в отсутствие нуклеотида (з1 ), четко выявлена его одификаття ( Зг ), характерная и для раствора Р*>+Адо+У(У), ло не ля 1ф+Аде+У(У). Параметры сигнала з? совпадают с "арактеристи- • ■ат рибозо-ванадиловых комплексов, образуй?—ся в щолочных раст-орах АТФ+У(1У) ( Закига1, 1982). Образование такого комплекса шно ожи ать при генерал „и свободного радикала гетероцикла нз с-вотида, поскольку его протонированца происходит _за счет отрыва роюна от сахарного фрагмента.

5. Оптическое поглощение, наблюдаемое методом импульсного отолиза, после табели РфН* в^присутствии АДФ, макет быть отнеоь-:о к свободному радикалу АДФ1Г| по аналогии о АдоИ^ ( Ннуоп , 975), после выявления Форш спектра с помощью анализ, концевнх частков кинетических к^явых изменения оптической плотности при азлтгчних длинах волн (рис. 7). '

6. При исследовании влияния АДФ на фотозависимое поглосэдит ислорода растворами Ре?, народу с увеличением скорости поглощения, бъяснимом донорными функциями н'уклеотидов в восстановлении Рф, аблюдается и торможение в присутствии ЭДТА. Этот эффект астест-енно объяснить уменьшением концентрации семибитна обуслов-енным его взаимодействием с нуклоотид м, что и резулмируетсл в нижении выхода 0^, а следовательно, и в торможении поглопшия

Рис. 7. Оптический спектр поглощения свободных радикала АДФН|, получаемых при больших временах после вспншки.(2), спектр поглощет AdoH| /Науоп,1975/ (I).

Обнаружешше наш факты существования электронного переноса м^хду реагентами в освещаемых видимым светом растворах Вф+АДФ могут служить указанием на свободнорадикальный механизм синтеза АТФ, н.аблюдаешй в этих условиях.

, ■ Возникновение электрон-избыточных свободных радикалов АД» в исследуемой фотосистеме Рф+АДФ, естественно, ставит вопрос о том, под действием каких факторов произошло улучшение электронакцеп-торннк свойств АДФ в данной систоме, так как прямой перенос электрона с семихинона флавина. на основное состояние АДФ, по-видимому неблагоприятен из-за несоответствия их редокс-потеншталов. То, что свободные радикалы АДФ регистрируются в области высоких концентраций АДФ ( >Ю-3М) позволяет предположить, что эффект их образовалия может быть связан с присутствием самоаесошатов нук-леотида (Кса = 8,8 М-1). Эффекты коыплексообразования как о другими молекулами, так. и самоассоциации часто являются определяющими для выбора направления переноса электрона между реагентами и дяя химического процесса (Матага, 1984; Кирби, 1985).

Нами получены некоторые свидетельства того, что более эффективным акцептором электрона в данной фотосистеме могут быть даме-ры АДФ. В исследовании зависимости.времени жизни флуоресцирующих состояний донора электронов /3-нафтиламина от [АДФ] показано, что констайта скорости взаимодействия димерного ассоциата с фотовозбужденным состоянием р> -нафгююмина существенно превышает соответствующую величину для мономерной форма и находится в облаем

диффузного ограничения. В опытах по исследованию темпового поглощения кислорода раствором НАДН+АДФ и при анализе интенсивности сигналов У(1У) в фотосистеме Рф+АДФ+У(У) получен квадратичный характер зависимости изменения скорости поглощения 02 и интенсивности сигнала У(1У) от [АДФ] при ГШ] < ИГ2 М, Этот эффект можно толковать в пользу того, что. в данных системах дополнительными (к заданным 02 и У(У) ) акцепторными редокс-агентами являются дилеры АДФ.

Таким образом, исследованные химические модели синтеза АТФ показали реальную возможность проведения синтеза АТФ яз АДФ и фнеорг. П1М осуществлении прямой редокс-активации непосредственных партнеров этой реакция.

У. ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССГГАНОШТИШНЫЕ ЦВДГРЫ МИТОХОНДРИЙ, СОПРЯЖЕННЫЕ С АТФ-СИНГБТАЗНОЙ АКТИЫзОСШ)

Необходимым обоснованием для возможности обсуждения прямой-радокс-активацш реагентов синтеза АТФ а окислительном фосфорвля-ровании является выявление в биологическом объекте редокс-центров, синхронизированных с этой реакдаой.

В настоящее время тлеется несколько выразительных примеров того, что любая метаболическая реакция, протекающая по свободно-радикальному механизму, обслуживается собственной локальной -олек^ тронтрайспоргной цепью, входящей в состав фермента: пздроксилазн (Диксон, 1982; Andereon, 1987), рибонукдеотидредуктазы ( Ator, Î984; Shrenberg, 1978), В^-зашсимыи реакции внутримолекулярного переноса групя Шевдер, 1980; Юркевич, 1985), фотолиаза ( Нее-* lia, 1987). Локальная ЭТЦ обеспечивает введение электрона в зону : реакции и его выведение по прошествии элементарного акта синтеза новой связи. В этих локалынгх ШЦ обязательными Фрапетгеада. являются одноэлектронные переносчики, чаще фяани» и/или ?в -s центры.

Митохондрия, выполняющая окислительное фосфоргиировашо» содержит множество окислитагмю-восстшоЕэтодьшгх центров, иричои очевидно, что их число избыточно для выполнения традиционно рассматриваемой их функция как переносчиков электронов от субстратов • х О2 ( Beinert» 1976). По-видамому, в настоящее вреш следует-вншлател!нее отнестись к этой избыточности, поскольку она наверия- . ,ка вшшчг уг в себя еще не до конца понятые структуры внутренней ' мембраны, обеспечивающие j. дакс-рсгуляцат многих фэрглеятов, в ïok числе самих чихательных, пооеносчиков, переносчиков метаболитов ( Köeninga, 1984) и, возможно, АТФ-сшггетази. . • .

Выявление родокс-регуляторов какого-либо фермента на общем фона многочисленных окислительно-ьосстановитольных центров, выпол няюцих другие Функции, представляется крайне сложной задачей. Тем «о мелоо методические подхода, сочетающие спектроскопические исследования митохондрий с биохимическим контролем конкретной метаболической реакции, дают возможность оценить характер регуляции фзр.101гга и тем самым получить указания на механизм исследуемой химической реакции

В сравнительном исследована дама ки свободных радикалов в штохолдриях, шполндашзгх синтез АТФ, первостепенной. задачей нами полагалось обеспочеют сохранности системы окислительного фосфори-лирования и благоприятна условий дня переживания митохондрий во В|^Я4Я записи спектров ШР.

Сохранение адекватных значений потенциала редокс-центров, задействованных в реакции, а следовательно, выявление их участия в ферментативном акте, может быть гарантировано только в отсутствие какой-либо фиксации биологического препарата. Спектроскопические исследования митохондрий в оптимуме должны быть прог денн при комнатной температура и в условиях постоянного притока кислорода. Этим требованиям отвечала специальная проточная система с электродом Кларка туш йя-кредая скорости дыхания, встроенная в ШР-спек-траыетр. Нераздельно с регистрацией ЩР-пог. эщения и записью полл-рограммы такая конструкция позволяла проводить отбор проб для анализ» скорости фосфориларовшшя. Малое вр-^дя смешивания о до\.двка-юг Сне болев 0,5 сэк) к высокая скорость протока в системе обеспечивали быстрое установление того или иного метаболического состоянии китохо!щраи в резонаторе. Объем проточной системы - 12 мл, концентрация ыитохоядриального белка - 10-15 кг/мл.

Примеиедие этой аппаратуры позволило провести исследование окислительного фосфорилиролшия. на качественно новом методическом . уровне а изучать зависимость, концонтроции свободных радикалов не только от состояния.цепи дыхательных переносчиков, но и от степе-ш активности штаховдриальной АТФ-синтетазы.

Было показано, что в условиях сопряжения, когда штохондрии активно синтезируют АТй, происходит значительное (до 80$) увеличение содержания свободных радикалов по . сравнению с обнаруживаемыми свободными радикалами в ыитоховдркях, находящихся в присутствии только субмратов окисления. Разобщение окисления и фосфоридирова-пак 2,4—да нитрофенолом (2,4-ДЕЙ) приводит к снятию этого прироста

сигнала свободных радикалов с ^ = 2.00, наблюдяомого в состоянии активного фосфорилирования. Ингибированио фосфорилирущего окисления олигшицшкш (ОМ) приводит к стабилизации сигнала с с^ = 2.00 • (pic. 8).

Сиги-л ЭДР в митохондриях, кнгкбиродашшх ОМ, отличен от такового, наблюдаемого в разобщенных митохондриях, не только-по интенсивности, но и по форме. Шло предположено, что спектр Щ? и присутствии ОМ тлеет сло;шую природу и включает а себя но только сигналы ШР свободных радикалов компонент дыхательно]! цзди, но и спг-нал «IIP фермент-субстратного комплекса в ЛТФ-сшгготазе-. Прг загго-роаившши митохтщрий, инкубируемых с ОМ, выявляется структура сигнала, непостоянная во времени (рис, 9), Гетерогенность полученного спектра ШР иллюстрирована отсутствием едикоебргтя йдаеншзтя его компонент в зависимости от мощности шперовелнезого. излучения* . Входящий в этот спектр сигнал с ^ = 2.00 свободных рсдггзсалов таккэ неоднороден, что .подтверздается ср»з!пттельнкш зксвсришнтащ. проведенными на фосфорилирутощих и н&росЗюриларугацих ШЧ (тис. 10)./

При измерении спиновой релаксации сигнала свободных раэдкадоэ в митохондриях также была получена отчетливая дкхстсжая хркжх. насыщения для сопряженных и разобщенных митохондрий,.

Приведенные факты иллюстрируют гетерЬгешс.^ть пуло свободах . радикалов в митохондриях, одна часть jcoroporo связана с неходовом Электрон по ЭТЦ, й -другая - с функцией сопряжения* Очавадед вклад

Ейс. 8, Зависимость интенсивности сигнала. ШР с о=2.00 в митохондриях от уровня их окислительной и фосфорялируищей ■активностей.

о «

з

Ряс, д. сигналы ШР митохондрий, регистрируемые при 77 К в разное время после добавления ОМ.

Рис. 10. Изменение интенсивности сигнала ШР од« 2.С в фосфоршш! угадое (I) и нефоо-форилирующих (2) СЫЧ в зависимости от СВЧ. мощности.

Оз

флавийзависидах ферментов, не связанных о терминальной цепь» окисления*

Свободные радикалы в митохондриях относят к флатнт и Кой. £ Еапюпааоп , 1970). В У.2 проведен еногагз возможного вклада каждого из этих редокс-центров в наблюдаемый сигнал ШР о с$ « 2.00 и отмечена предпочтительность тезиса о флавиновой природе этого ' сигнала.

Для уточнения участия именно флавиновой группы в процессе сопряжения были проведены эксперименты по опред&лйютю влияния разной степени окисленности флавиновых коферментов митохондрий на АТФ-синтетазную активность. Было использовано свойство флавияа восстанавливаться под действием видимого свата, что позволяло направленно менять редокс-статус этого кофермента без введения посторонних химических агентов, всегда обладающих побочным действием.

Окйслительно-восстановит&тгь.1оэ состояние эндогенных адалинов 1 митохондриях регулировали облучением вадамш свотом ( X > 400 им) -суспензии митохондрий в тонки,1 слое в термостатированной кювете как в условиях быстро наступающего анаэробиоза, так ь при продувании т.оком 02 или аргона в облученной суспензии. Контролировали затем скорость дыхания, синтез АТФ я содержание свободных ради.ча- -лов. Обнаружено, что восстановление фгавина при освещении в анаэробиозе приводит к снижению дыхательного контроля, синтеза АЭД и ■ снижению содеркания свободных радикалов ло сравнению о темповым

контролем (рис. II)......__.........................

ЗПР, ^«2.00

/"У

йп И 0. те» «

14 II-

12

Ь Р,8?Г

Рис. И. Влияние видимого овета на сопрягающую активность

митохондрий. А - поглощение —тслорода. штоховдриями,: Б - зависимость интенсивности сигнала от СВЧ-мо^юсти.

•Щ^иЕг -ЗГситвавтся хцзд ойдуашаш в атмосфере аргона:я ■ обращается . в igxicyTexaui дш огорода. "№> указывает, ва фушшзшэльную защси-зюкзз» мадаг степенна окиаданил флавивоаых:жоферыв21С5а Л-£1Ф~ашхв-.жЕзаай .ЕКшшостьв штотовдрий«

"йшик оОрааш, .г зпхледоюният кзтабшизщущ?ас шггохощжЗ лштодом ШР wfrMiftH. аюбгадцорадоальлш шктр с g = 2.00, цредпол . эеиагьна -ддашнопод дрггроды, - седхроаизированннй с АТФ-ссствтазасш {цуяншай дитпхотэдды. Однако m шхера ада. досдадояалая таяях ■ csaas-ши. объемов, жак элатоходщжя,. ншпая одасзвачно тасовать этот ре ззз&таг в аозьзу участия фтшношй. грусгы в ■ катдзппячасисм акта . лжнгеза:,М& ила. даже дшшшэовахь это?цеятр вдукЕгасопрягеагл ам в А~£-<щ-ятетаза. ■Очевидно, что яняягание этого дантра в иште-згфуквдис' АГЗ> датохщц;_Ш1Г ыожат сввдатадьствовазгь - не только od - его еелмчеяип в активаций aroii реакции, но г посЕОльгу редоко-готен-ишл фаашгаов чуэстЕпгааан л «акш^дпо шкроохрухеаая, харакгеризо гать кшвдие моста при сопряжении, изивдения структура беяково-ашш; него комплекса. внутренней ькзабраны.зшг дааэ указывать на стииуяяпг в условиях эяергизацни.какого-'-о параллельного сзытезуАТО процесса. Хотя сушу проведение нами экспериментов как будто предпочти. тельнэз объяснить первой из лерачгсленншс возыокностью, очевидно, ,-чхо серьезное обсуздение функдаональной знаяяиостя фдзвишэой груп па для <$ериеигативного катализа сиятеза АТФ возшш> только прв ее щеш-ификаоги в изолированных. препаратах фермента.

71. машюмя юта в сосгаве атф-сшгеташ и

ее возшвдд вдь в «шшяапдаи синтезе т

Несмотря нало, что существует.консаноус об отсутствии простатических. груш в ATS-сингетазе ж тем Ошшо в ео фратята Р^-АТФ-азэ, указания на присутствие фяашня в "гаятоваггом" раствора препаратов фгксированы нецднокрахао ( Geläut а, .1979; Saaadi, 1982;

Caatharan, , 1938} Brnstar, ..1976). Вгруппо Еедерсзна ( Зорвг, : 1979} было специально опшчепо уводичадае содержания фяааинов :*/яли4АЛ) по ыорэ очистит Щ-чувстаатааьдого АТФазного кпмплтгеа :жз «сходнойна^ралжЛфракции..^ исследование

ьв грушв Сантьяго. (Santiago, 1978) иотодаш одтачаскоЛ;д флуоресцентной спектроскопия, доадащахироваввве: нашлв флашпа в ■ составе феркоиге, на смогло трансформировать обеаго мнения о фяажни как досадной пркавсх дазштакыаи юоыпонент. к аагожвдаому фарюнту. ; По-аадакацу. такая вагвгоричцоэть: наулестпа ? г настоящее.вреыд, :юо-iiÄa c4op^iapoBaffirocsoBffiie npaaHaKB .3Hepr*38aaa (йыя аязявашга)

Fj-АТЕазы: изменение сродства форманта к субстрата® ж продукта» реахпия',. т.е. АД5 и АГФ, изменение конфориаптг белковой матриш"» изменение титра' еа SR- -rpiiur. Последний из пврвчислепвнх прпгаяаг* ков прямо указывает на то, что амортизация: ферионгз тан оетгсшг-телыю—восстановит вдьнкй характер. Ташш: образом» АЮ-саятотазз , moser быть каассмфйцирована как отегсляталъяо-вос стзнанггельш'А фермент, поскольку -течение реакции обеспечивается его соответствующий редоко-статусш.. Таким образом, при возшшгей необходимости ответа на естественна! вопрос, каким образом обеспечивается: зтот редокс-сгатус, т.е.. какова природа мвтаболичесгавс доноров л нягзаг-торов электронов на АТФ-синтетгзу, утвзрядшше о включении флазЕ-па в этот фериаэг уже ir представляется абсурдпшл» Следует erais*--шть, что на роль донора электротяг для С?^ 7,Титчед ( ппз 1922) и Бргаяал ( llcKinnsy , 1979) предаозвшг тагоредоконг, чтг отнюдь, ка исключает из поля зрегагя флааш, пос-катаку ж тиоредэксшг явет-к -я фяавазавкзшым. ферментом С Holmgren, 1935 ).

Эксперимента, проведении® натяг по- оггредалетш йлав^новой грузин в составе Pj-АТФазы в препаратах, полученных катодами Напотеет и Вгчз„ подгвэрйЕли даянда- авторов, штировашшх вша.

Типичный спектр флуоресценции,. наблздаешй в препарате азы при возбуЕдешгк светом Д = 340 ни, имеет. маясизум. зшссщг • щи - А = 536 нм, характерный для окисленной Форш -фйзиш?» npnatr ■ -иывет место корреляция мевду снижением: иашилуж* флуорнсцонют: и возрастанием ее при Л = 486 ям С область фяуорссдятнг зосстансз-леншх фяашнов) ггргт освещении видимым светом (рте- 12í. Крг-е того, док выявления фяаэгна истользовата метод, врсдтаенний Мэесиг з. Пальмером ( líassey, I9S&J для обнаружения, этого хромофора в потешщаших флавопротевдвх. Этот метод комбинирует: воздействие Еидашго света на эндогенный флавг т с последующей, регистрацией спектра ЩР фагашдуцяроватшх семгосипсЕоз флазаяа. В Р--АТ5азз-этим методом шяаяяэтея сигнал ШР» характерный Для флашновой группнровет в со стало белка. Характер изменения интенсивлостзг оп>-нача ШР в зшзгктмости от даша всяльс нибужданцего света ^оетадэ» от с тайлздаеман длят рг-створа Бр+АД^- СраЯ'. 13}. Прс сетгщепягг ДХФаза в полоса погашения окисленного фалгша обнаруживается обычно сщо одяп зффекг, ггроявлявгжй ¿там хромофором cpt -агатовой.'. екслозЕПспт,- поглвдзшо гасгорода ■ (U¿3 шлояь/впг.иг-белка}, точуветтатвдыгость препаратов Р^АТФезн иожн» cnrrars • достаточно^ вестт» доказательстве®/! того, что ¿раазягнбзвя: группа достаточно •.

Рис. 12, Спектры флуоресценции препарата З^-АТОазы, регистрируемые при возбуждении светом Л = 340 нм. ,1 - исходный, 2 - после ос-1 вещекия А ~ 440 нм.

X, и«

а!«жц

1Д

ад

-о

1-К-5

Р* Щи«» Е-есЧ Е-ЬЫО

Ц-ЖС« И-ЖС-П

'(ЯГ *•««

да"«

Кто. 13, Зависимость инте! оивностя фотоиндуцарованного сигнала ШР (77 К) от ширины возбуждающего света, I - Вф ЗДСГ% 2 - Рф 3.10_3М * АШ Б.Ю-3^ 3 - %-АТФаза. •

жестко связана с белковой молекулой и является необходимым компонентом системы сопряжения.

Возможность выступления флавина в роли регулятора оютагапаль-но-восстановитального состояния сульфидных групп в Р^-АТФазе, существенного для протекания ферментативного синтеза АТФ, бшн показана в опытах по определении изменения количества зн -групп после освещения раствора препарата (^ 5 мг/мл) видимым светом (хне» 14).

о

•50

Ж"

Рис. 14. Корреляция между интенсивность» флуоресценции окисленного фшавчна ц препаратах Р^-АТФазы и изменением содержания зн -групп при облучении видимым светом 440 им.

во

Очевидная активирующая роль флавина в энергазацяи Р^-АТФ'зн . была подтверждена наш выполнением световой модели синтеза АТФ при освещении Р|-АТФазы видалым светом. Предполагалось, что фотовоз-буадениа хромофора, приводящее к его редокс-переходам, может моделировать темновыэ редоко-процессы, ведущие к активации фермента.' Следует отметить, что такой пришли моделирования темновнх процессов часто используется в исследованиях механизма действия флаво- . протеидов. Синтез АТФ И50 да/мт белка) наблюдали при облучении водных растворов,РрАТФазы <гЧ мг/т), содержащих АТР (2,5.10"%), ^неорг. и М^-КГ^, вги облучения растворов светом в по-

лосе поглощения окисленного фяавина, но йв красным светам. Уваст-чение количества АТФ определяется в течение перзнх 15 минут освещения.. Образования АТ? не зафиксировала при освещении реакционной смеси как в аияоефёрв аргона, так я кислорода. Поведенный сннтса

аналога АТФ - АДФ-УО3 (при замене Фнеорг< на ванадат), по-шяшому исключает реакцию дисмутации возможной примесью аденилатгашазы.

Таким образом, участие флавиновой группу в акте сопряжения представляется весьма вероятным.

В то я;о время определение редокс-группы в составе фермента не является однозначным показашем для определения механизма элементарного химического акта. Окислительно-восстановительные ферменты катализирует сияю разнообразнее реакции» в том числе но связанные с рсдоко-превращеюшз! субстратов, часто, налримор, посредством рвдокс-переходов просгетичоских и сульфидных групп обеспечивается рабочая, активированная конфигурация активного центра фермента. Вместе с тем обнаружение редокс-зависамости фермента с высокой степенью вероятности позьоляет предположить наличие скрытой редокс-стадии в активации субстратов, что суцес*.зенно уже дтя. выявления химического механизма катализ руемой реакции.

УЛ. МОДЕЛЬ Ф£ШЗгГА'ШВНОГО СЛГГЕЗА АТ5> ПО СВОБОДНОРАдаКАЛЬЩ'Я МЕХАШЗ.Г/

Для построения схемы э тешит арного химического акта важно объяснить, что представляют собой активированные роагенты, изменившиеся'под воздействием энергии, припедшей к ним через сложную систему передач.

Очевидно, что активированные,или "знергизованные", или истинные реагенты должны представлять собой молекулы о хорошо выраженным внутримолекулярным разделением зарядов, ибо только в этом случае между ними возможна химическая реакция. Цель активации и состоит в разделении зарядов в молекуле реагента.

Анализ неферментативных'1 реакп«а фосфоршгрования (раздал Ш, схеиа I) показывает, что число таких состояний с разделенными заряда® для данных субстратов вполне ограничено: ими могут быть моно-э$пр фосфате, иотафоофат н свободные радикалы реагентов.

Яри генерации и стабилизации в среде реакции под воздействием какого-лли^о вида энергии любого из выпшеречислешых активированных состояний реагентов АДФ я Фав0рр, синтез АТФ становится реаль-ш событием (раздел Ш).

ИзЕестнне к настоящему времени свойства ферментативной реакции, вадсиой АТФ-синтетазой, позволяют сузить этот «руг возможных акти-шрованзих состояние, опродоляюсск механизм химической реакции. ' ИсхжЕпшагз вз валнзрвигятагаа; активированных фори субстратов как

иовоэс^ф ЕО-РОд я ивта£осфэт, предполагает точение реакция по меха*

Претендентами на роль истинных, т.е. активированных субстратов, ютаются Л1бо свободные радикалы реагентов, либо аналог ВО-РО^ -годифишроввнная каким-либо образом структура ф1ШОрГ% • в которой демаскирован полаштельнцй заряд на реакционном атоме Р.

Возможность ыодггфикаши структуры фНООрГ посредством яислотно-юновного,. кожйорчацйонного.ыеталлокаталкэов .часто привлекаемых рш прогнозировать механизмов мк боляческих реакций (раздел VI), юка нп подкреплена моделышмя неферментатшшыми хишчесши синтезами АТФ из АДФ и ФИ00рГ,«

Шесте с тем возможность участиясвободных радикалов реагентов » образовании фосфорильной связи, и в том числе в АТФ, следует нз щализа большой. группы яеферм нтатив!шх синтезов фосфорилврувдих зсагентов К0-Р03 и нуклеотвдов, игапшрованных в условиях, способ-¡твующйх взаимодействию реагентов с электроном: под действием радиации при термолизе УФ-облучения, под действием видимого -света в ¡р-сутствии сенсибилизаторов, в электрохимических условиях при сопряжении с окислителыю-восстэновителышмп реакциями. Зта группа [©ферментативных синтезов АТФ является едияствешшм реальным свиде-•атьством протекания синтеза АТФ из АДФ. и Фне0рГ, йоз промежуток юго образования ковалентно активированного интермедвата й удов-гетворяет требованиям, предъявляемым особешюстянз конкретной фер-юнтативной реакции на АТФ-синтетаае.

Нами предлагается модель синтеза АТФ лри окислительном'.фосфю- . зонировании, в которой активированная или "энерхдаованная" молеху-1а. АДФ являет собой образовавшуюся в результате одноэлектрокпого герэноса полувосстановленную форлу - свободный радикал, легко взаимодействующий с Ф,шорг>.

В основе нашей модели лояит предпола .ение о существовании пв~ юсредственного взаимного переходя: высокоэнергетяческий электрон -(бразование макроэргичаской связи АТФ в том смысле, как это пони-(ал А.Сент-Дьердьи, когда писач, что "для того, чтобы энергая-Р гогла быть использована, она должна перейти в энергию электрона,-гричем зта реакция обратима" (Сент-Дьердыс, 1970),

Сегодня этим словам можно предать впо/"е материальные, очерта-ия, которые легко трактуются в терминах классической химии: энер-ия электрона - это энергия высокоактивного свободного радикала ДФО*, и именно его возникновение обеспечивает взаимодейстши. А® неактивщял Фдарру,, то есть протекание синтеза АТФ, „ .

Общая схема прйдяагаемсн нами Модели си..газа АТФ в окислит агат* :ом фосфорилироваляи по свободнорадакальноМу механизму. Такова! поя

действием пераичного энергетического давления, а именно , в результате онергозависимых изменений конформации ATS-синтотаза в активном центре фермента формируется локальная электрон-перенося-цзя цепь, состоящая из флэвина, АДФ и какого-то акцептора электрона. Первичным восприемником энергетического давления в этой локаль ной ЭТЦ является флавик, исключительно гибкая молекула, легко реа-гарупцая на самые разнообразные воздействия и преобразующая их л едану» форму ответа - изменение своего редоко-потенциела, что и приводит к запуску цепи переноса электрона и образование в ней главного шиврмедяата - свободного радикала АМ- Эта локальная 3TÜ в прешзига может быть отбытой, т.е. донором электрона для нее монет сг^звяуь общая ЗТД, в которую встраивается АТФ-синтетаза в момент сопряжения бла: одаря наведению соответствующего редокс-по-тешдала флавина. Ута же цепь монет быть и замкнутой, круговой, автономной от общей дыхательной цеш, хотя запуск ее макет также осуществляться ..ооредством энергозависимого изменения конфорлации форланта. В метаболизме поняты оба режима работы локальной ЭТЦ в форнонтах, использующих редокс-~ктивацию для прямого разрыва (образования) связи в метаболитах, в которых разделение зарядов слабо внракено.

Основной тезис нашей модели, состоящий в том, что активированная посредством редокс-катализа АДО представляет собой свободный радикал, ведущий реакцию нуклеофильного замещения, отнюдь на выходит за рамки способов активации реагентов, принятых в метаболизме. В реакциях разрыва прочной связи вообще трудно провести границу ■между механизмами нуклеофильного замещения и окислительно-восстановительным.

.Образование ATO из АДФ к в прцшипе можно рассматриваг

как окисляташго-восстановительную реакцию, суть которой состоит э ввода »тема кислорода (АДФ мохно формализовать как НО") к атому фосфора в насыщенной молекуле $HQopi>. и вывод восстановленного атома кислорода из ®неорГ. s виде ОН". Результат этой реакции заключается в разделении зарядов» ранее маоккрованных в фнеорГ.» тл в образовании двух активированных центров: электрофильного центра на атоме Р в АТФ (аток кислорода в связи 14)-? выполняет роль стабилизатора "окисленного" атома Р) и иуклеофияьноГ ' в ОН", 1фаЙнв существенных для проведения метаболических реакций.

Введение Og s непсяяркые молекулы в метаболизме осуществляется ?поорадствш его одноадекгронной активации, т.е. переходом в свобод 1ннЙ .радикал, который легко внедряется в неаквдзированную молекулу.

>ерментативннй процесс внедрения 02, малоактивного нуклеофильного )гента, сопряжен с обязательным участием редок.-групп (флавин, ггеридин, аскорбиновая кислота), способных налряьтую воашлодейство-зать с кислородом, переводя его в свободный радикал, .

Взгляд на реакцию синтеза АТФ, как на. окислительно-восстановя-гедьный процесс, позволяет естественно включать в качество возмсес-шх путей ее реализации механизмы катализа., использующие участие прямых окислителей и восстановителей для активации рэагентов, что s сделано наш при конструировании предлагаемой модели синтеза А ТФ. в окислительном фосфорилироваши.-

В нашей модели мы предполагаем, что неспаренный электрон ло-. кализован на концевом фрагменте, что и сообщает АДФ повышенную нуклеофилыюсть. Соображения о локализаций неспаренного электрона в нуклеотидах рассмотрены в разделе П1.7, в принципе они не. опровергают представлений о молекуле АДФ как об устройстве, способном воспринимать электрон на кольцевой фрагмент с тем, чтобы перенести его затем на реакционную фосфорную группу, обеспечив таким образом протекание синтеза АТФ.

Принципи-тьным моментом в правомерности построения нашей модели является вопрос о том, может ли свободный радикал АДФ быть генерирован в биологической системе, использующей весьма узкий диапазон редокс-потенсиалов, т.е. может ли АДФ быть встроена в "биологическую ЭТЦ. Впервые такая возможность сила исследовала экспериментально В.П.Скулачевым (Скулачев, 1969), полученный пояснительный результат лег в.основу его трехкомпонентной схемы окислительного фосфорилирования, в которой предполагаюсь, что анион-радикал АДФ, генерируемый при встраивании АДФ а ЭТЦ, участвует в образовании первичной макроэрглческой связи. Эта модель в свете с^времан- -• них представлений о механизме синтеза АТФ имеет ту же неточность, что и схема Ф.Липмвнна поскольку предполагает образовало промежуточного ковалентного интермедиатаг но с точки зрения хияг-ческих обоснований, на наш взгляд, она безупречна. Возможность образования свободного радикала АДФ при взаимодействии с ф. лвином,. показана нами (раздел 1У), что поддержнва.г лродлагаемую модель синтеза АТФ по свободяорадикашкяду механизму.

Важным подходом в диагностике ^¡ободнорадикального механизма . любой реакции является тестирование свободаорадикальнюс ингъоито-.! ров. В этом плане особый интерес представляет анализ действия разобщителей на окислительное фосфорадирование, указывающий На то, .

что выявленное непротонофорное действие некоторых из них может быть объяснено их вмешательством в перенос электрона в пункте со пряжепия (раздел 71,1.3), в раздела 1У.З представлены некоторые эксперименты, свидетельствующие о свободнорадикалыгаы механизме разобщения фенолами.

Предлагаемая схема свободнорадикального синтеза АТФ в окисли тальном фосфоршировании, описывающая только, элементарный акт химической реакции, относится к последней теме в раду логической последовательности проблем окислительного фосфорилирования: каш обрезал энергия, выделяющаяся при переносе электронов, улавливается в мембране, как трансформированная энергия передается на AT1 синтез дзу и как используется для синтеза АТФ* Предлагаемая схема вполне согласована с основными положениями, полученными в исслед ваниях первых двух означенных проблем. Отличительная черта принятой нами линии исследования состоит в некотором акцентировании внимания на химических моделях синтеза AT® как основном критерии оценки прогнозируемых механизмов,

... Полученные результаты ест ственно ложатся в русло продставле ний о редокс-катализе как мощном инструменте для обеспечения самых трудных химических реакций, в том. числе синтеза AT® из АДФ и ^неорг. .('bipe»nn 1946; Larty , 1969; Wlland ,1967; Wang, 1970; Блюиенфельд, 1962; Скулачев» 1969).

В последнее время наблюдается новая волна внимания к редокс-регулявди процесса сопряжения, естественная в осознаваяии единст ва действия двух протагонистов химической активации - протона и электрона.

В^Ц В ОДЫ

1. В результате анализа химических механизмов реакций фосфорилирования в препаративной органической химии и в модельных реакциях пробиотического и ферментативного синтезов ATO, проведенного о учетом ограничений,.вводимых химический свойствами АТФ-синтетазы, предложено теоретическое обоснование•необходимости включения реакций прямой океидоредугаии роагентов АДО и/или ®неорг. 8 'Ф?1' возможных механизмов элементарного химичеокого ак та синтеза АТФ в окислительном фоофорвлировании

2. При генерации свободных радикалов АДФ получен синтез АТФ в едедуичих условиях?

. aï в «вводных растворах АД& * ®aa0pi.4 яод действием пучка алектрснов ж УФ-освещегагя; в ДМСО выход AT® составил 1-2% от ко-

о

ходной концентрации АДФ, равной ~ 2,5.10 11;

б) в водном'растворе-РФ'+ АДФ + ФН90рГ. по-4 Действием видимого света о выходом ~ 0,5$ от исходной концентрации АДФ ( ~ 3,5.1СГ%). В этих же условиях при замене ортофосфата на вакадат получен продует, идентифицированный как аналог АТФ - АДФ-УОд}

в) в водном растворе РФ + АДФ + ®ддорг ® катодной темновой части фотогальванической ячейки выход АТФ зависал от величины фототока и от рН катодного раствора и составлял^ 2% от исходной АТФ

.синтез ингибирован в присутствии ПУК, соединения о хоро- . шо выраженными алектрон-донорноакцепторнымя свойства!.®.

3. Метода® ШР и импульсного фотолиза исследованы продукты взаимодействия РФ и АДФ чря с-ведении видимым светом. Установлено, что: - -

а) фотоивдуцированные сигналы ШР представляют суперпозтщ) сигналов по крайней мерз двух' ги^ов: флавссетхпиопоа и полувос-сг чювлонной фсрш АДФ; - ' '

б) показана донорная функция АДФ по отношению- к проявляющаяся в образовании, флавосешшшонов;

в), выявлена акцепторная функция АДФ по отношению к фяавосещ-хинонам флавина, и идентифицирован по оптическому поглощению свободный радикал АДФН^ ;

, г) показано, что для образования свободного радикала прн'тем- .. новом окислении флавосемихияонов сущеетвблна самоассоциация АДФ, проявляющаяся при £АДФ} > 10-3М, что способствует улучшению акЦепторных свойств АДФ. -

В этих экспериментах показана принципиальная возможность образования свободного, радикала АДФ в окислительно-восстановительны..' реакщях с физиологически?® редокс-агеш м флавинотл.

4. При исследовании окислителт ного фосфорилировастя в .»ято-ховдриях выявлена часть свободнорадикального пула, обусловленного, переходом митохондрий в энергизованное состояние:

• а) исследование интактшх ьштохондрий в специальной проточной системе, встроенной в ШР-спектрометр и снабжаемой кислородом, -позволяющей одновременно проводить защсь ИР- поглощения и контролировать содержание кислорода в измерительной трубке, показало, что в условиях сопряжения наблюдается значительное увеличение сигнала ШР с 9 = 2.00 по сравнению с разобщенным г,4-ДНФ сост таем. ОМ на фоне субстрата окисления и акцептора фосфата стабилизирует ,: сиггая 31Р с дв 2,00{. . . ;•

. б) сигнал с ^ ■ 2.00 в митохондриях, ингибированнаде СМ, реэ-

ко отличается по форме и интенсивности от такового в разобщенных митохондриях, причиной различия предполагается выявление локальной ЭТЦ в пункте сопряжения в присутствии ОМ;

в) при воздействии на митохондрии видимого света в полосе поглощения флавина обнаружено снижение синтеза АТФ и синхронное падение сигнала ЗПР с д = 2,00, причем процесс обращается кислорс дом. Зги аффекты объяснены участием флавина в процессе сопряжение ' 5. При освещоши Р^-АТФазы водимым светил при 77 К регистрируется сигнал Ш? с д = 2.00, отнесенный к флавину, интенсивное которого коррелирует с исходщэд редокс-состоянием фермента. При освещении раствора прй комнатной температуре наблюдается уменьшение количества за-групп и уменьшение флуоресценции окисленного флавина, что говорит э возможности регуляции редокс-статуса ферме та посредством эндогенной флавйновой гргппы,

6. Под дейотвием видимого све^а на раствор Р-рАТФазы получен синтез АТФ и его ванадиевого аналога 50 им АТФ/мг белка).

7. Предложена.модель элементарного химического акта синтеза АТФ в окислительном фосфорилир-вании, согласно которой внутримолЕ кулярноа разделение зарягов в исходных реагентах (активация) обеспечивается редокс-катализом, причем инициирующей стадией является образование свободного радикала АДф при взаимодействии с эндогенным флавином в момент энергизации.

Осйовныо положения диссертации опубликована в работах:

I. ЭДР исследование окислительного фосфорилирования в митохон дриях в проточной сиотеме ( Квтшн :Л,П., Ержевская 0,Н., Неделина О.С. , Сепетов ¡1,0., Швкшеев З.М. // Биохимия митохондрий: Тез. докл. - Одесса, 1976. - С. 53.

2» ЭЦР фосфоралиругощях митохондрий / Бржевская 0,Н., Неделине О.С,, Швкшеев Э.М., Каюшин Л.П, // Докл. АН СССР, - 1977? - Т.232

- С. 221-224,

. 3« С^ободнорадекальный механизм действия АТФ-взы / Кашин Л.П Бряевская О.Й., Неделина О.С.» Шекшэев Э,М, // Магнитный резонанс в биологии и медицине: Тез .докл. •>• Москва, 1977. - С, 54,

4. Об участии свободных радикалов в синтеза л РФ / Каши» Л,П, Бргевская 0,Ы,, Неделина О.С., Шекшеев Э.М. // Биофизика. - 1978,,

- Т, 23. - С, 915-916.

5, йсследовдаив окислительного фосфорилирования в верешвааии митохондриях методой ШР / Кашин Л.П., £ркввская О.Н,, Недалина

i.e., Шектоев Э.М. // Биофизика. - 1978. - Т. 23. - С. 1024-1027.

6. Исследование митохондрий в основных метаболических состоя-иях при различных уровнях активности АТФ-скнтетазц методом ЗПР / 'акшш Л.П., Брхевская О.Н., Неделина О.С., Шакшеов Э.М. // Еяо-изика. - 1979. - Т, 24. - С. 248-253. •

7. Обнаружение парамагнитного продукта, возникающего при окис-ительном фосфоршировалии в митохондриях / Вишневский S.O., Надеина O.G.,. Браевская О.Н., Кашин Л.П., Шакшеев Э.М. // Биофизика. • 1980. - Т. 25. - С. 740-742.

8. Окислительно-восстановительные центры АТФ-синтотазы мито-оодрий / Кашин Л.П., Вишневский E.G., Бркевская О.Н., Нвдатна .С., Шекшеев Э.М. // Д.лл. АН СССР, - 1930, - Т. 252. - С. 1497501,

9. Синтез'АТФ: стимулированшй УФ-облучением / Лозине. а Т.Х., ркевская О.Н., Неделина О.С., Кашин Л.П, // Биофизика. - 1931. -. 26, - С. 394-397.

10. Неделина O.G., Бржевекая О.Н'., Кашин Л.П, Сво^одноради-альный мехшшзм синтеза АТФ в окислительном фосфорялированцн // сесозозшй сготоэиум "Магнитный резонанс в биологии и медицине™: ез. докл. - Черноголовка, 1981, - С. 134-135.

11. Окислительно-восстановительные центры АТФ-синтетазы / аделииа О.С., Бркевская О.Н., Вишневский Е.С., Шокшев .Li., Кпю-' ан Э.М. // Воесоюз. симп. "Магнитный резонанс в биологии и.медиане": Тез. докл. - Черноголовка, 1981. .- С. 133-134.

12. Электрохимическое восстановление адешшнуялеоявдов / Ло-инова Т.А., Сокол О.Г., Неделина O.G., Бркевская О.Н., Казакова ,М,, Кашин Л.П. // Всесоюз. симп. 'Магнитный резонанс в биологии медицине"! Тез, докл. - Черноголовка, 1981. - С. 25.

13. Э1Р-поглощецие фосфорилирующих и нофосфорилзгрующих субгда-оховдрпалышх частиц / Еотневсгай Е.С., Бркевская О.Н,, Неделина .С., Катан Л.П., Еекшеев Э.М. // Всосоюз. спит. "Магнитный ро-онанс в биологии я ¡.шшшдне: Тез. докл. - Черноголовка, 1981. -

. 136.

' 14. Синтез АТФ, стимулированный УФ-облучением /Лозиноза Т.Й., • одолина О.С., Брвевская'О.Н,, Кашин Л.П. // Всасош. етмп. "Маг-птный разонано в биология я медицине": Тез. докл. - Черноголовка, • 981. - С. 241-242.

15. Домина О.В., Неделина О.С», Кавдш. Л»П. Анйон-радакагш j ртофосфатов в водных и неводных растворах // Всесовз, семп. ->цг-итинй резонанс в биолотаи и медицине": Тез. доил. - Ч-рногс тавяа,

1931. - С. J56.

16. Ноделина Û.C., Бржовская О.Н., Каюшн Л.П. СВобсдноравдкаль вый синтез АТФ в окислительном фюсфорилироваюш. - Í.I.: ВИНИТИ, 1931. -51 с.

17. ШР-поглощение фосфорилкрущах и нофосфорилирующих субмито-хондриалышх частиц / Вишневский Е.С., Недолина О.С., Бргкевская O.ÍI., Какими Л.П.» Шеииеев З.М. // Биофизика,-1382. - Т. 27. - С. 653-657.

18. Кашин ЛЛ., Неделина O.G., Табагуа И.А» Перенос электрона и- магнитно-резонансная спектроскопия фотооиофизических процессов// I Всесоюз. биофиэ. съезд: Тез. докл. - Москва, 1982. - С. 68,

19. глР-исследование А1Ф-синтетазной функции митохондрий / Неделина О.С., Бркевская }.Н., Кашин Л.П., Шекщеев З.Ы. // I Всесоюз <5иофиз. сгезд: Тез. докл. - Москва, 1982. • T. I. - С. 264.

20. Влияние видимого света ча Р^-АТФ-синтетазу митохондрий / Неделина О.С., Ваковская O.K., Пискунов U.A., Кающин Л.П. //

I Всесоюз. бно|из. съезд: Тез. докл. - Москва, 1982. - T. I. -С. 260.

21. Фогосенсибилизировг :ный синтез аденозинтрафосфата / Лози-нова Т.А., Демина О.В., Неделина. О.С., Бржовская О.Н., Кашин Л.П. // Биофизика. - 1983. - Т* 28. - С. 555-558.

22. Неделина О.С., Пискунов U.A., Бржавскзя О.Н., Кашин Л.П. Еяияние видимого света на Fj-ATO-азу митохондрий // Биофизика, -Í983, - Т. 28. - С, 341-342.

23. Окислительно-восстановитедышо центра в процессе сопряжения щс окислительном фосфориларовянш. Парамагнитная модель синтеза АТФ / Неделина O.G., Брхевсхая О.Н., Вишневский Е.С., Лозино-ва Т.А,, Ыекшеев З.М,, Каюший Л.П. 7 Ш конф. ФЕБО: Тез. докл. -Москва, 1984. - С. 207.

24. Hedelina O.S., Kayushin L.f, Energy-äependent pool of оад-eleetrpn redox centres i» oxidative phosphorylation ana ATP ejntheele regulation // Biophys. Congrega. - London, 1984.

25.- Парамагнитная модель, синтеза АТФ. в окислительном фоофори-jorpoBäffira / Неделина О.С., Бржевская О.Н., Вишневский Ii.С., Дози-иова T.A., Кашин. Л.П, // Обзор ШШТИ. Доп. & 5922-83 от I ноября 1983. Аннотация. - Бкофшша,- - I9ö4. - T. 29. • С. 165.

26. йедеяииа O.G., Браеаская О.Й., Кашин Л.П. Окислительно-восстановитедьная рагуляаая в синтезе АТФ ff Биофизика. - 1985. -Т. 30. - С. Ï79-I9I.

27. Hedelina O.S., Kayushin L.P. One-electron activation in ATP 3yntheelo//Aota Biophys.31oehim.(Hung.) .-1986. V.21.- P. 129-154.

28. Лозинова Т.Л., Неделина Q.C., Кашин Л.П, Влияние аденозян-шфосфата на индуцированное свотом поглощение кислорода флавинш // Зиофизика. - 1986. - Т. 31. - С. 10-15.

29. Электронный парамагнитный резонанс комплекса Р-рН^АТФазы и зинтез аденозинтрифосфата при его освещении видимым светом / Кеде-тина О.-С., Бржевская О.Н., Лозинова Т.Д., Кашин Л.П. // Биофизика.

- 1986. - Т. 31. - С. 417-421.

30. Синтез ванадиевого аналога аденозшггрифосфата npf фотосен-зибилизации рибофлавпгом / Логинова Т.А,, Бряевская О.Н., Недолина З.С.» Кашин Л.П.// ВКШ:.И. Деп. Я I496-B-87 от 27 февраля 1987. !\лнотация. - Биофизика. - 1987. - Т. 32. - С. 535.

31. Энергизация Fj-ЛТФазы при облучений видимым свехс / Ддзи-аова Т.А., Вишневский B.C., Неделина О.С. и др. // Биофизика. 1Ьо7. - Т. 32. - С. 520-521.

32. Неминущий З.Г., Неделина О.С., Каотак Л.П. Зое» талоьдегитэ красителей в растворах флавгпатоионуклеотйда в фотогальвзничоской таейке //Биофизика. - 1987. - Т. 32. - С. 156.

33. Неминувдтй В.Г., Неделина-О.С., Кающн Л.П. Зосстановлзняе Зиашвлононуклеотнда в фотогальванической ячекко в присутствии nyit-неотидов // Биофизика. - 1987. - Т. 32. - С. 5I&-52Q.

34. Влляшкз самоассоцкации на акцепторные сх эйства адепозинди-£ос$ата. jjpi взгг.плодЫ'сткти с некоторыми восстановителями / Лсзкно- . ва Т.А., Арутюнян А.Э., Недел1ша О.С., Катаин Л.П. // ВШБ-НИ- "Деп. - . !! 4063-В-83 от 26 мая 1988. Аннотащя. - Вшфизнка. - 1988. - Т.З? .

- С. 906.

35. Обнаружение свободных радикалов АДО-щя фотос.енсяС лизадай ;' Маетном / Лозинова Т.Д., Неделть О.С., Какшш Л.П. я др. // В1ДСП11. Цеп. Г» 4065-В-83 от 26 мая I9S8,-' Биофизика.- 1988.- Т.ЗЗ,- С. 907.

36. Синтез одекозшгтр1фос(1;ата в йотогальваютесксй ячейке rrpii -ооссталовлетши флавянмоконукяеетяда / Нга,тауЕгай В,Г.-, Арутюмян А.Э., Кеделина О.С., Кашйн Л.П. // Биофизика. - 1989.- 1.34.-6.132-133.

37. Окиататольно-БосстаноЕ5гголышэ до ¡пру в nyicfre сшрзйошя шюховдрий и одноэлектронше модели синтеза / Надоляяа О.С.,. Бртевская О.Н. . Втаювский Е.С. и др. // Всесош.коиф. "йаг:гт!шй • резонанс в Зиологзли медицина": Тоз» дока, - Чорисголовяа, 1989.

- С. 61-62. . • ."