Реакция остеогенных клеток на механическое воздействие и специфичность их рецепторов к компонентам внеклеточного матрикса

Садофьев, Леонид Аполлонович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Реакция остеогенных клеток на механическое воздействие и специфичность их рецепторов к компонентам внеклеточного матрикса
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Реакция остеогенных клеток на механическое воздействие и специфичность их рецепторов к компонентам внеклеточного матрикса"

На правах рукописи

САДОФЬЕВ Р Г Б 0,'!

Леонид Аполлонович

« .4 ¿11 с^-.}

РЕАКЦИЯ ОСТЕОГЕННЫХ КЛЕТОК НА МЕХАНИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ ИХ РЕЦЕПТОРОВ К КОМПОНЕНТАМ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, С.-Петербург

Научный руководитель:

кандидат биологических наук О.И. Подгорная, Институт цитологии РАН, С.-Петербург

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Е. С. Корнилова, Институт цитологии РАН, С.-Петербург

доктор биологических наук, профессор М. Н. Маслова Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН,

С.-Петербург

Ведущее учереждение: Биолого-почвенный факультет

Санкт- Петербургского

Государственного университета

Защита диссертации состоится " марта 2000 г. в 13 часов на

заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий

проспект, дом 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан

' февраля 2000 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета Л ' * , доктор биологических наук(-

Л. Н. Писарева

3, О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Микроокружение клетки играет ключевую роль в регуляции ее поведения, в том числе в переключении состояний пролиферация/диф-ференцировка. Особую роль играет взаимодействие клеточных рецепторов с белками внеклеточного матрикса (ВКМ).

Взаимодействие этих рецепторов со своими лигандами может приводить как к формированию сигнала химической природы (например каскады фосфорилирования) так и к изменению формы клетки и перераспределению баланса механических сил (Ingber et al, 1994). Механическое воздействие на клетку в свою очередь неизбежно изменяет характеристики связывания рецепторов с белками ВКМ. Таким образом, рецепторы к белкам ВКМ являются и сигнальными рецепторами и механорецепторами. Эта двоякая роль рецепторов непосредственно связана с процессом формирования многоклеточного, пространственно организованного организма из одной клетки (Belousov et al, 1994), репаративной регенерацией и функционированием тканей взрослого организма (Simpson et al, 1994).

Перераспределение баланса механических сил в клетке, вызванное или механическим воздействием или взаимодействием клеточных рецепторов с белками ВКМ, предполагает участие клеточных структур, в частности - структурную перестройку компонентов цитоскелета.

Изучение вопроса о роли формообразующих воздействий в функционировании клетки предполагает проведение работ по трем основным направлениям:

1. Исследование процессов адаптации клетки к механическим воздействиям: структурных перестроек клеточных компонентов, включая изменение формы клетки и структуры цитоскелета.

2. Исследование долговременных клеточных реакций, затрагивающих вызванные адаптационными перестройками изменения функционирования клеточного генома.

3. Исследование механизмов формирования сигнала, вызывающего кратковременные и долговременные изменения функционирования клетки. К этому направлению относится исследование клеточных рецепторов, способных воспринимать и генерировать формообразующие сигналы.

Имеются многочисленные данные, показывающие, что при внешних формообразующих воздействиях на клетку, как чисто механических, так и механохимических, вызванных изменением состава ВКМ, наблюдаются значительные адаптационные перестройки внутриклеточных структур, в частности цитоскелета (Ingber et al, 1994). К сожалению, большинство применяемых методов исследования, позволяющих отслеживать структурные изменения отдельных клеточных элементов, не обладают временным разрешением, достаточным для выявления изменений, происходящих в течение первых минут после воздействия. Большинство этих методов являются разрушающими и, следовательно, они не дают возможности отслеживать изменения, происходящие в одной и той же клетке. До сих пор не удалось однозначно связать долговременную (несколько суток) реакцию клеток на механическое или механохимическое воздействие с наблюдавшимися адаптационными перестройками.

По литературным данным, механическое воздействие на клетки обладает длительным пост-эффектом. Воздействие сказывается на таких параметрах, как изменение уровня транскрипции некоторых генов, изменение уровня активности ряда ферментов, и ряде других, свидетельствующих о значительных изменениях функционального состояния клетки (Садофьев, Подгорная, 1999). Однако данные, полученные разными авторами противоречивы. Есть данные о том, что механическое воздействие на клетки повышает степень их дифференцированнос-ти, определяемой по экспрессии генов тканеспецифичных белков (Kubota et al, 1993; Harter et al, 1995), но по данным других авторов -понижает, стимулируя одновременно клеточную пролиферацию (Stanford et al, 1995).

Воздействие механической нагрузки на клетки опосредуется ВКМ (Maniotis et al, 1997). Следовательно, целесообразно говорить о механохимических формообразующих воздействиях, определяющихся как внешними по отношению к клетке силами, так и взаимодействием клетки с ВКМ.

Ингбером (Ingber) с сотрудниками была сформулирована теория интеграции клеточных напряжений (Cellular Tensegrity), постулирующая существование единой цепочки связей "внеклеточный матрикс (ВКМ) - цитоскелет - форма клетки - форма ядра - структура хроматина - изменение функционирования клеточного генома" (Ingber 1997), ключевая роль в которой отводится взаимодействию белков ВКМ с рецеп-

торами семейства интегринов (Белякова и др., 1999).

Большинство описанных рецепторов к белкам ВКМ принадлежит к семейству интегринов (Buck and Horwitz, 1987; Albelda and Buck, 1990; Hynes 1992). Интегрины, состоят из двух субъединиц, разных типов (а и р субъединицы). Как правило, с одной р субъединицей может ассоциироваться несколько различных а субъединиц, образуя рецепторы, связывающиеся с различными лигандами.

Имеются данные о существенной роли рецепторов этого семейства в передаче механических, изменяющих форму клетки сигналов, на клеточное ядро (Carvalcho et al, 1995, Maniotis et al, 1997). Было показано наличие непосредственной механической связи между кол-лагеновым рецептором - интегрином a.2pi, цитоскелетом и ядерным матриксом (Maniotis et al, 1997). Можно предположить, что взаимодействуя с коллагеном, интегрины оказывают механическое воздействие на структуру ядерного матрикса, возможно модулируя функционирование транскрипционных факторов (Boudreauet al., 1995). Функциональная значимость такой связи подтверждается наличием в составе ядерного матрикса транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов белков, специфичных для костной ткани (Урусов и др., 1998).

Одним из основных компонентов ВКМ являются коллагены - семейство структурных белков, имеющих характерное строение и содержащих ряд аминокислот, практически не встречающихся в других белках. Показано, что коллаген, в результате взаимодействия с интегрина-ми, оказывает ключевое влияние на дифференцировку по крайней мере некоторых типов клеток (Lynch et al, 1995). Накопленные данные по воздействию коллагена на клеточные процессы позволяют считать его одной из основных информационных систем организма (Лебедев, 1979).

Большинство интегринов, способных связываться с коллагенами, взаимодействуют с двумя основными аминокислотными последовательностями в лиганде - RGD(S) и DGEA. Эти последовательности широко распространены в белках, в том числе белках ВКМ. Способность интегринов избирательно связываться только с некоторыми из них не получила удовлетворительного объяснения. Более того, имеются данные, что специфичность может меняться в зависимости от типа клетки (Elices and Hemler, 1989). Большинство авторов считают интегрины относительно мало специфичными рецепторами, не способными различать члены семейства коллагенов. Наличие каких-либо рецепторов,

способных различать типы коллагена ранее было показано только для одного типа клеток - хондроцитов (Mollenchauer et al, 1984).

Однако, коллагены разных типов оказывают различное воздействие наклеточную пролиферацию и дифференцировку,в зависимости от степеии зрелости ткани (Зайденберг и Андреев, 1998).

Вряд ли требует доказательств тот факт, что теория клеточных напряжений может быть применима только в том случае, если у клеток, контактирующих с коллагеном в ткани, имеются рецепторы, способные к высокоселективному связыванию с компонентами ВКМ и соответственно, способные различать члены семейства коллагенов.

Способность рецепторов к распознаванию типа коллагена особенно важна для клеток костной ткани. Как при нормальном морфогенезе, так и в процессе репаративной регенерации костной ткани, остеобласты и остеоциты контактируют с разными типами коллагена, сменяющими друг друга в определенной последовательности (Лебедев, 1979). Основной моделью в настоящей работе стала клеточная линия остеосаркомы крыс ROS 17/2.8, по многим параметрам сходная со зрелыми остеобластами (Majeska et al., 1978).

Поиск и идентификация рецепторов, способных различать типы коллагена, исследование реакции цитоскелета и долговременного ответа клеток линии ROS на механическое воздействие, превышающее физиологическую величину, представляются весьма актуальной задачей, так как являются попыткой исследования на цитологической модели процессов, происходящих в регенерирующей костной ткани.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось исследование механизмов воздействия формообразующих сигналов на поведение клеток в культуре. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменения цитоскелета в ответ на механические формообразующие воздействия.

2. Исследовать долговременную реакцию клеток на механическое воздействие.

3. Разработать метод определения специфичности клеточных рецепторов по отношению к типам коллагена.

4. Выделить и идентифицировать клеточные рецепторы, способные распознавать типы коллагена.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Механическое воздействие на клетку вызывает адаптационную перестройку актинового цитоскелета, сопровождающуюся увеличением содержания Ф-актина и количества стресс-фибрилл.

2. Характер адаптационной перестройки структур актинового цитоскелета в ответ на механическую нагрузку на клетки зависит от физиологичное™ нагрузки для данного типа клеток.

3. Интегрины способны различать типы коллагена, причем интег-рины проявляют специфичность по отношению к тем типам коллагена, с которыми клетки контактируют в ткани-источнике.

Научная новизна

Разработан метод выделения и анализа клеточных рецепторов, основанный на их функциональных свойствах. На основании этого метода показано, что клетки соединительно-тканного происхождения имеют рецепторы, способные распознавать высоко гомологичные члены семейства коллагенов (коллаген I и III) и существует корреляция между связываемым этими рецепторами типом коллагена и типом коллагена, с которым клетки взаимодействуют в ткани-источнике. Два из трех выделенных полипептидов идентифицированы как а цепи интег-ринов. Полученные данные показывают, что интегрины способны различать высоко гомологичные белки ВКМ и специфичность интегринов по отношению к типам коллагена зависит от типа клетки. Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу о существовании динамического механизма регуляции специфичности интегринов, определяющего характер воздействия компонентов ВКМ на клеточную дифференци-ровку.

Показано, что механическое воздействие на клетки в культуре сопровождается характеристическими изменениями структуры цитоскелета и транскрипции некоторых фенотип-специфичных генов. Эти изменения зависят от типа клетки.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты, полученные на основании традиционных методов исследования специфичности рецепторов по отношению к типам коллагена, таких как ингибирование клеточной адгезии с помощью антител, противоречат имеющимся данным о различиях в воздействии коллаге-

нов разных типов на поведение клеток. Разработанный метод анализа специфичности интегринов показал, что интегрины способны проявлять значительно большую специфичность по отношению к типам коллагена, чем считалось ранее.

Способность интегринов к высокоспецифичному распознаванию типов коллагена в сочетании с полученными данными об изменении структуры цитоскелета при механических воздействиях на клетки позволила интериретиривать протекающие при репаративной регенерации процессы в рамках теории клеточных напряжений.

Полученные данные имеют не только теоретическое, но и практическое значение. Углубление понимания механизмов взаимодействия клеток с коллагеном необходимо для решения задачи подбора оптимальной композиции ВКМ, позволяющей поддерживать клетки в культуре в дифференцированном состоянии, что имеет огромное значение для трансплантологии.

Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Результаты работы докладывались на Всероссийском симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1995), конференциях ЕСВО 1994 и 1997 годов, 7-м международном симпозиуме по ба-зальным мембранам (Bethesda, 1995), Европейском семинаре по клеточной инженерии у животных (Costa Brava, 1997).

Диссертационная работа апробирована на семинаре Отдела клеточных культур Института цитологии РАН 12 декабря 1999 года.

Объем и структура диссертаци

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", выводов и списка цитируемой литературы, содержащего публикаций,иллюстрирована рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры. В работе использованы следующие клеточные культуры: линия клеток остеосаркомы крысы ROS 17/2.8 предоставленная Dr. Foebe Leboy (Пенсильванский университет, США), линию иммортализованнных эмбриональных фибробластов крысы El А-12S, линии клеток эпидермоидной карциномы человека HeLa и А431, линия клеток опухоли тимуса мыши GH3, диплоидные культуры фибробластов крысы, выделенных из легких и скелетно-мышечного мешка новорожденных крысят, линию остеосаркомы человека HOS, (Российская коллекция клеточных культур Института цитологии РАН). Все упомянутыеклеточные линии культивировались в смеси сред DME -Fl 2 (3:1) в присутствии 10% эмбриональной сыворотки коров. Кроме того была использована линия иммортализованных эндотелиальных клеток из сердца головастика Xenopus Laevis ХТН-2 (получены в лаборатории Dr. Bereiter-Hahn, Германия). Клетки этой линии культивировались в среде САМ (Gibco, Великобритания) с добавкой 10 мМ HEPES, 0,2% NaIIC03 и 5% эмбриональной сыворотки коров при 28°С.

Механическое воздействие на клетки. Для этих экспериментов использовались две клеточные линии - ROS 17/2.8 и ХТН-2. Для механического растяжения клеток были использованы силиконовые камеры, закрепленные в специальном устройстве, позволяющем проводить дозированное однократное или циклическое растяжение. Перед началом опыта, клетки высевали на силиконовые подложки и выдерживали в течение ночи с среде того же состава, который применялся и для их культивирования в С02 - инкубаторе. В случае однократного растяжения клетки растягивались на 15% первоначальной длины. Это значение соответствует физиологическому для клеток линии ХТН-2 и значительно превосходит физиологическое для клеток линии ROS. Циклическое растяжение проводилось по следующей схеме: однократное растяжение длительностью 45 минут и далее - 10 циклов растяжения в течение 15 минут-расслабления в течение 45 минут. Циклически клетки растягивались на 10% первоначальной длины.

Исследование внутриклеточной подвижности и изменения формы клеток с помощью сканирующего акустического микроскопа. Метод сканирующей акустической микроскопии позволяет проводить прижизненные, не повреждающие клетку исследования. Это дает возможность изучать изменения, происходящие в течение всего опыта в одной и той

же клетке. Сканирующие акустические микроскопические исследования были выполнены с помощью ELSAM (Leitz, Wetzwar, Germany). Использовался метод оценки акустических параметров клеток в культуре, разработанный Bereiter-Hahn и Buhlesm (Bereiter-Hahn and Buhlesm, 1987). Клетки, культивируемые на эластичной силиконовой мембране, помещали под линзу акустического микроскопа и получали изображения одной клетки при частоте звука 1.3 Гц.

Сканирующий акустический микроскоп функционирует на основе сравнительного анализа интерференционных картин, формируемых при взаимодействии ультразвуковых колебаний с клеткой. Интерференционная картина определяется такими параметрами клетки, как характеристики клеточной мембраны, вязкость и акустическая проницаемость цитоплазмы, форма клетки, структура ци-тоскелета (Hildeband and Rugar, 1984; Bereiter-Hahn and Buhlesm, 1987). Итоговая интерференционная картина зависит от большого количества параметров и трудно интерпретируема. Более информативным являегся сравнение интерференционных картин, полученных через короткие промежутки времени (10 сек.). В этом случае возможно выявить те участки клетки, в которых происходят наиболее интенсивные изменения. В результате компьютерной обработки, разность интерференционных картин преобразуется в изображение клетки, на котором наиболее темные области соответствуют участкам, в которых выявились наиболее существенные различия, и в которых, соответственно, происходят наиболее существенные изменения (рис. 1). Для количественного выражения происходящих в исследу-

Рис.1 Компьютерное изображение клетки, полученное в результате наложения двух интерференционных карпш, полученных для одной и тон же клетки с интервалом в 10 сек. Более темные участки изображения соответствуют тем участкам клетки, в которых различия наиболее сильны. Буквой Ф обозначен участок, использованный для определения интенсивности цвета фона.

емой области клетки изменений по алгоритму предложенному BerieterHahn рассчитывали статистическую функцию изменения механических параметров клетки (параметр К), характеризующую внутриклеточную подвижность (Berieter-Hahn and Buhlesm, 1987).

Измерения параметра К проводились через 5, 10, 15, 20, 30 и 60 минут после растяжения в одном направлении на 15%.

Исследование реакции цитоскелета на механическое воздействие. Для исследования реакции актинового цитоскелета применяли два метода:

Флюоресцентная микроскопия клеток после окрашивания тритс-фаллоидином и количественное флюориметрическое определение содержания Ф-актина.

Для флюоресцентной микроскопии окрашивание актина тритс-фаллоиднном проводили по стандартной методике на клетках, предварительно фиксированных 4% раствором формальдегида в течение 50 минут.

Для количественного измерения содержания Ф-актина окрашенные клетки экстрагировали метанолом в течение двух часов. Флюоресценцию экстракта замеряли на флюориметре, при максимуме флюоресценции 563 нм.

Вычислялось содержание актина в расчете на 1 мг. ДНК. Содержание ДНК определяли по Хексту.

Определение активности щелочной фосфатазы. Активность щелочной фосфатазы определяли стандартным методом, с использованием р-нитрофенилфосфата в качестве хромогенного субстрата. Содержание р-нитрофенола измеряли через 15 минут после начала реакции по поглощению при 410 нм. Калибровку производили по раствору чистого р-нитрофенола. Активность щелочной фосфатазы оценивалась в расчете на 1 мг белка. Содержание белка измеряли по Бредфорду.

Выделение и очистка коллагенов. Коллагены из кожи крыс (I и III типы коллагена) и плаценты человека (коллагены I, III, IV) выделяли по стандартной методике (Miller and Rhodes, 1982). Для повышения степени чистоты препаратов коллагена были добавлены две стадии хроматографической очистки - гель-хроматография на Сефакрил S-300 и ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. Полученные препараты коллагена имели чистоту более 90% по данным электрофореза и не содержали примесей неколлагеновых белков.

Выделение клеточных рецепторов к коллагенам. В основу разработанного метода выделения и оценки специфичности рецепторов был положен метод сравнения спектра белков, выделенных аффинной хроматографией на коллагенах разных типов.

Для аналитических целей рецепторы выделяли из препаратов мембран исследуемых клеток, для препаративных - из экстрактов печени эмбриона человека (абортивный материал).

Все белки, использованные для приготовления аффинных колонок иммобилизовали на бромциан-активированной сефарозе 4В (LKB-Pharmacia, Швеция), по инструкциям производителя. Полученные сорбенты содержали приблизительно 5 мг белка на 1 млсефарозы.

Все процедуры проводились при 4°С. Экстракты клеточных мембран в буфере, содержащем 2,5 мМ Mg2+, 2,5 мМ Са2+ и 0,15 мМ NaCl (буфер для связывания), пропускали через колонку с бычьим сывороточным альбумином (БСА-сефароза) для очистки от неспецифически связывающихся белков. Очищенный таким образом экстракт делили на 3 равные части по числу используемых коллагенов (типы I, III и IV). После нанесения препарата и промывки для удаления не связавшихся белков, коллаген - связывающие белки элюировали последовательно буфером, содержащим 10 мМ ЭДТА и 0,5 М NaCl (высокосолевой буфер). Полученные таким образом препараты коллаген-связывающих белков очищали от солей методом диализа и концентрировали. Анализ спектра полученных белков проводился методом диск-электрофореза по Лэммли (Laemmly, 1970) в 7,5% полиакриламидном геле.

Для выявления рецепторов, связывание которых с коллагеном зависит от наличия двухвалентных катионов, элюцию с аффинных колонок проводили в два этапа. На первом -элюция буфером, содержащим 10 мМ ЭДТА и только физиологическую (0,15 М) концентрацию NaCl. На втором этапе проводили элюцию высокосолевым буфером.

Для определения аффинности рецепторов к коллагену использовали буфер для связывания без NaCl. Элюция в этом случае проводилась линейным градиентом концентрации хлористого натрия от 0 до 1М.

Получение антител. Для иммунизации мышей были использованы зоны.белков, полученные в результате диск-электрофореза, как описывалось выше. Сыворотку забирали после 4-х инъекций, с недельным интевалом между инъекциями. Суммарно, на каждое животное было использовано по 10 мкг белка. Тестирование антител проводили методом иммуноблоттинга с использованием экстрактов очищенных цент-

рифугированием в градиенте плотности сахарозы мембран клеток печени человека. Специфичность полученных антител против полипептидов с массами 170 и 140 КДа была признана достаточной для дальнейшей работы.

Иммуноблотпшг. Иммуноблотгинг проводился по стандартной методике. В качестве вторых антител использовали меченные биотином антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, с последующей обработкой конъюгатом стрептовидинасо щелочной фосфатазой. Окрашивание проводили с помощью NBT/BCIP. Все реагенты - фирмы Sigma, США. Помимо полученных поликлональных антител использовали коммерческие моноклональные антитела против а.2 цепи интегринов человека (DAKO, Норвегия) и pi цепи интегринов (Sigma, США).

Аффинная хроматография на иммобилизованных антителах против белка 140 КДа. Для приготовления аффинной колонки было использовано 200 мкл антисыворотки против белка с массой 140 Кда. Иммобилизацию проводили на 200 мкл бромциан - активированной сефарозы (Sigma, США) по методике, рекомендованной изготовителем. Для выделения белков, связывающихся с антителами, использовали препарат коллаген-связывающих белков из мембран клеток печени эмбриона человека. После промывки колонки до исчезновения белка в элюате, связавшиеся с антисывороткой белки элюировали 0,1 М уксусной кислотой. Белки, связавшиеся с антителами анализировали методом иммуноблотгинга.

Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток. Для изучения распределения рецепторов на клеточной мембране использовали полученные антитела против белков, распознающих типы коллагена и антитела против р 1 цепи интегрина (Sigma, США). Окрашивание проводили как на фиксированных формальдегидом, так и на нефиксированных клетках. В качестве вторых антител применяли меченные флюоресцеи-ном антитела кролика против иммуноглобулинов мыши (Sigma).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Реакция клеток на механическое воздействие. Был проведен сравнительный анализ реакции на механическое воздействие клеток линий ROS и ХТН-2. Реакция цитоскелета определялась по следующим показателям:

1. Исследование подвижности отдельных участков клетки (Cell

Motility) с помощью сканирующего акустического микроскопа.

2. Изменения формы клетки и структуры актинового цитоскелета (флюоресцентная микроскопия с тритс-фаллоидиновым окрашиванием)

3. Изменение количественного содержания Ф-актина. Изменение подвижности участков клетки. При исследовании подвижности отдельных участков клетки особое внимание уделяли сравнению подвижности центральной части клетки, включая клеточное

ядро, и клеточной ламеллы. Полученные результаты представлены на рис. 2 А-Г.

Как эндотелиальные, так и костные клетки показали заметное изменение внутриклеточной подвижности в ответ на однократное 5 10 То "зсГёо t механическое растяжение.

Характер этих изменений у клеток обоих типов не имеет качественных различий, однако количественные различия весьма существенны.

У эндотелиальных клеток ХТН-2 через 5 минут после растяжения клеточная t подвижность всей клетки и центральной части снижа-

К16 14 12 10

6 4 2 0

1 : 1 1

1 1 (1 ! i, i

1 il ь I II 1 i Н' i |

i| > 1 Л i ii TTÍl ■ ftl ni И' 1 \ 1И 9 1 * la i la.1 1 1

5 10 20 30 60

•О'.й'О^ИйЯ OP.WPn.fM

О 5 10 20 30 60 0

В-Клетна в цепом В - Центральна» часть

Рис.2. Гистограммы изменения параметра лась примерно на 20-30%, К (внутриклеточной подвижности) клеток хтш затем в течении часа возвра-(А, В) и ROS (Б, Г)- По оси ординат отложено щалась К первоначальному абсолютное значение параметра К с доверитель- (рИС.2В). Изменения

ным интервалом по 5 паолюдениям, по оси аос- J г 1

цисс - время в минутах. Гистограммы А и Б В ПОДВИЖНОСТИ ламеллы КОр-соотвегствуют контрольным клеткам, гистог- рСЛИруЮТС ИЗМСНеНИЯМИ ВСеЙ раммы В и Г - клеткам после механического клетки

растяжения. Механическое воздействие одно- ^ динии RQS на

кратное, растяжение на 15%.

растяжение реагировали более активно. Так через 5 минут после растяжения клеточная подвижность всей клетки и центральной части снижалась в среднем в 5 раз, и приближалась к исходному уровню через час. Поведение ламеллы еле-

дует за изменениями подвижности всей клетки, также как в случае эн-дотелиальных клеток.

Таким образом, у клеток линии ROS в ответ на механическое воздействие наблюдается значительное и достоверное снижение подвижности приядерной части клетки по сравнению с ламеллой (рис 2Г).

Отмеченные изменения внутриклеточной подвижности могут быть связаны с состоянием внутриклеточного актина. Для проверки этого предположения была проведена окраска на Ф-актин.

Форма клеток и Ф-актин

Данные представлены на рис. 3. Независимо от происхождения, в клетках уже через 5-10 мин после воздействия выявлялись значительно более выраженные, чем в контроле, стресс-фибриллы, количество которых снижалось постепенно через 1 час. Однако, преимущественная ориентация стресс-фибрилл и их локализация зависели от типа клетки.

В момент максимального уменьшения внутриклеточной подвижности после растяжения (рис.2) стресс-фибриллы актина часто располагались вдоль линии растяжения в клетках ХТН2 (рис ЗА,Б) и, скорее, перпендикулярно ему в клетках ROS (рис. ЗВ,Г). В последнем случае ориентация сгресс-фибрилл менее выражена на фоне общего повышения количества фибриллярного актина, особенно в центральном районе и в клеточной ламелле. У клеток линии ХТН-2 стресс - фибриллы распределялись достаточно равномерно по всему объему клетки и наиболее значительное увеличение содержания Ф-актина наблюдалось в области клеточной ламеллы. У клеток линии ROS наблюдалось увеличение количества Ф-актина по преимуществу в районе клеточного ядра.

В физиологических условиях клетки линии ХТН-2 испытывают постоянные механические растяжения, сопоставимые с выбранными в настоящей работе. Для клеток линии ROS, выбранная величина растяжения (15%) превышает физиологический уровень. Остеогенные клетки отвечают на такое воздействие переключением состояния пролифе-рация/дифференцировка, или резким изменением спектра транскрибируемых белков (Harter et al., 1995; Stanford et al., 1995). Оба процесса требуют передачи сигнала от механорецепторов клеточной поверхности к структурам клеточного ядра. Возможно, именно этим объясняется концентрация Ф-актина в околоядерной области и ламелле клеток ROS, в отличие от клеток ХТН2, где более выражены стресс-фибрил-

лы (рис.ЗВ,Г). При циклическом воздействии (10 циклов растяжения на 10%) характер распределения Ф-актина в клетках ROS сохраняется и усиливается.

Рис.3. Окраска TRITC-фаллоидином (негативное изображение) клеток ХТН2 (Л, Б) и ROS (В, Г) беч механического воздействия (А, В) н через 10 мин после однократного растяжения (Б, Г). Направление растяжения на 15% указано стрелками слепа. Приведен контрольный отрезок 10 пт.

Изменение количества Ф-актина клеток ROS после растяжения (рис.4) обратно коррелирует с изменениями параметра К (внутриклеточной подвижности) (рис.2Г). В первые 5 мин после воздействия в 5 раз уменьшается параметр К и в 5 раз возрастает количество Ф-акти-на. Через час внутриклеточная подвижность лишь на 10% превышает исходный уровень, но количество Ф-актина вдвое выше, чем в контроле. Вероятно, большое количество Ф-актина отражает начавшиеся изменения в белковом синтезе, что относится к продленным ответам на механическое воздействие. Для проверки предположения о том, что механическое воздействие способно вызывать долговременный ответ,

включающий стойкие изменения транскрипции генов ткане-специфич-ных белков, было изучено изменение активности щелочной фосфатазы у клеток линии ROS.

Исследование длительного ответа остеогенных клеток на механическое воздействие в культуре. Щелочная фосфатаза является одним из ферментов, характеризующим степень зрелости остеогенных клеток. Изменения активности этого фермента изучали в течение 6 дней после механического воздействия. Проводили сравнительный анализ механического воздействия самого по себе и на фоне действия индуктора остеогенной диф-ференцировки - дексаме-тазона.

Гистограмма, показывающая изменение активности щелочной фосфатазы у клеток линии ROS в ответ на механическое растяжение, представлена на рисунке 5.

Механическое воздействие несколько снижает активность щелочной фосфатазы по сравнению с контролем. Хотя, наблюдаемое снижение не является статистически достоверным, оно наблюдалось и через 3 и через 6 суток. При комбинировании растяжения с воздействием дексаметазона, наоборот, растяжение несколько увеличивало активность щелочной фосфатазы, что особенно выражено через 3 суток. Таким образом, механическое воздействие на остеогенные клетки в культуре способно иметь длительный пост-эффект. Однако, собственно характер ответа клеток на это воздействие определяется другими факторами.

Сравнение эффекта воздействия дексаметазона на клетки, культивируемые на подложках из пластика и силикона (рис. 5) показало, что на силиконовых подложках при обработке дексаметазоном достигается двукратное увеличение активности щелочной фосфатазы по срав-

(МИНуТЫ}

Рис.4. Количество Ф-актина в клетках ROS после однократного растяжения на 15%. По оси ординат - количество Ф-акпша в % от контроля (100%), по оси абсцисс -время (t) после воздействия. Дисперсия указана но 5 измерениям.

нению с подложками из пластика. Без воздействия десксаметазона, силикон стимулировал активность щелочной фосфатазы по сравнению с пластиком незначительно. Двукратное повышение активности щелочной фосфатазы при обработке клеток дексаметазоном на силиконе %

РД' ОЛЕГ! - <• DC- -■ С- + 0С*-

вс*»

Зсут бсут

Рис. 5. Изменения активности щелочной фосфатазы у клеток линии ROS после однократного механического воздействия. По оси ординат отложен уровень активности щелочной фосфатазы в % от контроля. По оси абсцисс - время от начала эксперимента в сутках. Обозначения: П-клетки культивировались на пластике, С - на силиконе. Р - механическое растяжение, Д - присутствие дексаметазо-на. Знак "+" означает что данный вид воздействия применялся, знак - что данное воздействие не применялось.

по сравнению с пластиком может быть связано с большей легкостью изменения клетками своей формы в первом случае. Не исключено, что такой эффект связан с известным феноменом сжатия коллагенового геля клетками в процессе дифференцировки(^Ьег et al., 1994; Yamamoto et al., 1996).

Различия в воздействии коллагенов разных типов на функционирование клетки может быть связано именно с изменением клетками своей формы в зависимости от субстрата. Однако, это предполагает способность клеточных рецепторов, в первую очередь семейства интегринов, распознавать типы коллагена. Ранее такая способность интегринов не была показана. Для проверки предположения о том, что интегрины способны распознавать типы коллагена был предпринят поиск клеточных рецепторов, обладающих такой способностью.

Выделение коллаген-связывающих белков. В основу метода было положено сравнение спектра белков, выделенных аффинной хроматографией на коллагенах разных типов. Если белок присутствовал в элю-ате только с некоторых, а не со всех, колонок его считали способным различать типы коллагена. На основании этого критерия, было выявлено три полипептида с молекулярными массами 250, 170, 140 КДа.

Два полипептида с массами 250 и 140 КДа преимущественно связывались с коллагенами III и IV. Белок с массой 170 КДа связывался исключительно с коллагеном I. Результаты представлены на рис. 6.

У клеток линий HeLa, А431 и GH3 ни один из этих полипептидов не показывал способности связываться с коллагеном в условиях аффинной хроматографии. У клеток печени ни один из трех белков не показывал специфичности по отношению к типу коллагена. Данные, по способности рецепторов различать типы коллагена в зависимости от типа клетки суммированы в таблице 1.

В некоторых случаях, наблюдалась зависимость эффекта распознавания типа коллагена от ионной силы буфера для связывания. У фиб-робластов и клеток линии ROS, при понижении ионной силы буфера для связывания до 0, полипептиды 250 и 140 КДа связывали коллаген

HOS

250-

3 ROS 4

250- ST^i Г"1 250_:

Рис. 6. Белки, связывающиеся с коллагеном разных типов в условиях аффинной хроматографии. Диск-электрофорез в 7,5 % акриламид-ном геле. Окрашивание серебром. Название клеток - источников указано наверху. Римскими цифрами внизу дорожек обозначены типы коллагена, использованные для приготовления аффинных колонок. Стрелками обозначены белки с молекулярной массой около 90 Кда, скобкой -группа ннзкомолекуляр-ных белков. Сбоку каждой группы дорожек указаны мол. массы белков, различающих типы коллагена.

I (Садофьев и др., 1997). При использовании буфера с физиологической ионной силой, связывания этих белков с коллагеном I не наблюдалось. Эксперименты по элюции рецепторов градиентом ионной силы показали, что в случае фибробластов и клеток линии ROS, ингибиро-

вание связывания белков 250 и 140 КДа с коллагеном I наступает при ионной силе буфера 0,1 М NaCl.

Таким образом, способность выделенных рецепторов распознавать типы коллагена зависит от типа клетки.

Данные опытов по зависимости связывания рецепторов с коллагенами от наличия двухвалентных катионов показали, что связывание полипептидов 250 и 140 КДа во всех случаях ингибировалось ЭДТА, то есть зависело от наличия двухвалентных катионов. Для полипептида 170 КДа такой зависимости не было обнаружено ни в одном случае.

На основании сходства молекулярных масс было выдвинуто предположение, что выделенные полипептиды являются а-цепями интегринов. Это предположение было проверено с помощью полученных антител.

Таблица 1

Распознавание рецепторами типа коллагена

в зависимости от типа клетки

Белок Фибробласты - Остеогенные клетки Клетки

(КДа) HOS ROS печени

I ш N I III IV I ш IV I Ш IV

250 + + - + + - 0 + + +

170. - - - + - - + - 0 + + +

140 -С) + + - + + - 0 + + +

Обозначения к таблице: + - белок присутствовал в элюате с колонки - - белок отсутствовал в элюате О - эксперименты не проводились

(*) - эффект зависит от концентрации NaCl .в буфере для связывания.

Идентификация коллаген-связывающих рецепторов. Антитела против полипептидов 250,170 и 140 КДа выделенных из клеток печени человека (А250, А170 и А140 соответственно) были получены иммунизацией мышей. По данным тестирования, антитела А170 и А140 были признаны достаточно специфичными для дальнейшего использования. А250 показали недостаточную специфичность.

Для доказательства того, что выделенные белки действительно являются мембранными, методом иммунофлюоресценции было изуче-

но распределение этих белков в клетке. Полученные результаты приведены на рис. 7.

Как следует из представленных данных, наблюдалось окрашивание только клеточной мембраны. Таким образом, белки с массами 170 и 140 КДа являются мембранными белками. Характер распределения этих белков на мембране (рис. 7А и рис. 7Б) имеет несомненное сходство с распределением Р1 -цепи интегрина (рис. 7В).

Сравнение результатов иммуноблоттингас А140 и моноклональ-

ными антителами против а2-цепи интегрина (рис. 8), показало, что и те и другие антитела окрашивают один и тот же белок. Более того, и А140 и анти-а2 показали перекрестную реакцию с белком 170 КДа. Аффинная хроматография на поликло-нальных антителах против белка 140 КДа показала присутствие среди белков, связывающихся с антисывороткой а2 и pi цепей интегрина (рис 9).

На основании иммуноблоттинга и сходства распределения по клеточной мембране между белками 170 и 140 КДа с одной стороны, и (i 1 -цепью интегрина - с другой, можно считать установленным, что выделенный полипептид с массой 140 КДа является а2-цепыо интегрина, а белок 170 КДа является a-цепью интегрина с высокой степенью вероятности (Sadofíev et al., 2000).

Таким образом, интегрины способны различать высокогомологичные I и III типы коллагена и этот эффект непосредственно зависит от типа клетки.

Для интегринов известны механизмы регуляции специфичности, основанные на механизме альтернативного сплайсинга или посттрансляционной модификации некоторых аминокислотных остатков (Hynes, 1992).

В соединительной ткани большинства органов, за исключение зрелой кости, фибриллы коллагена I окружены оболочкой из коллагена III (Keene et al, 1987). Таким образом, в ткани-источнике фибробласты контактируют с коллагеном типа III. Зрелые остеобласты, аналогом которых являются клетки линии ROS, контактируют с коллагеном

Рис. 7. Иммуиофлюорссцснтное окрашивание клеток линии ROS. Л - Антитела против белка 140 КДа; Б - Антитела против белка 170 КДа; В - моноклональные антитела против Ы цепи интегрина (Sigma).

1 2 3

250170-

и2 Р140

Рис. в. Иммуноблоттипг К'0.1-лаген-связываюших рецепторов из клеток печени эмбриона человека. Окрашивание монокло-нальными антителами против а2-цепи ннтегрнна (1) и поликло-нальными антителами против белка 140 КДа (2).

-MB

piro а2 pi

Рис. 9. Иммуноблоттинг коллаген-свя-зываюших рецепторов клеток печени эмбриона человека, связывающихся с антителами А140. 1 - окрашивание антителами против белка с масссой 170 КДа. 2 - окрашивание антителами против а2-цепи ннтегрнна (DAKO). 3 - окрашивание антителами про mu 1)1-цепи интегрина (Sigma).

типа I. Наблюдается отчетливая корреляция между полученными данными о специфичности некоторых интегринов по отношению к типу коллагена и преобладающим типом коллагена контактирующего с клетками в ткани-источнике.

В процессе формирования костной ткани происходит сложная последовательная смена типов коллагена, синтезируемого клетками, и следовательно - контактирующего с ними. Можно предположить существование динамического механизма регуляции специфичности интегринов по отношению к типам коллагена, осно-

ванного на посттрансляционных модификациях или на механизме альтернативного сплайсинга.

ОБСУЖДЕНИЕ

Большинство исследований в настоящее время посвящено анализу молекулярных детерминант развития, характеру химических взаимодействий синтезируемых молекул и сиквенированию генов. Однако, нельзя отрицать, что развивающаяся ткань воспринимает также влияние механических сил, и под их действием меняет свою структуру.

Модель, рассматривающая клетку как единую систему и учитывающая механические и биохимические фактор!,] взаимодействия ее с микроокружением, была разработана американским ученым Д. Е. Ингбером. Согласно этой модели, клетка может быть описана как серия отдельных способных противостоять сжатию элементов, которые взаимосвязаны с окружающей их сетью растяжимых нитей. Такие структуры обладают внутренним пре-стрессом, который генерируется на растяжимых частях и стабилизируется с помощью прочных опорных элементов ( ^Ьег е1 а1, 1994; 1п§Ьег, 1997).

Модель интеграции клеточных напряжений предсказывает, что клетки распластываются на твердых субстратах и округляются на мягких, форма клетки и ядра и характер организации цитоскелета меняются координированным образом, ядро поляризуется и движется базаль-но, когда клетки прикрепляются к субстрату (1п§Ьег, 1997). Модель можно применить для объяснения механизмов клеточного ответа на сигналы микроокружения, в том числе и ВКМ.

Цитоскелетные структуры в клетке вполне соответствуют требованиям, предъявляемым элементам модели интеграции клеточных напряжений. Так, роль опорных элементов, способных противостоять сжатию, выполняют построенные из актина стресс-фибриллы. Это соответствует данным о поведении актинового цитоскелета (рис.3) и возрастании содержания Ф-актина (рис. 4) в ответ на механическое воздействие. Роль растяжимой сети играют микрофиламенты и промежуточные филаменты. Пре-стресс генерируется в пределах растяжимых частей системы, в то время как стресс-фибриллы и микротрубочки стабилизируют структуру.

Опорные элементы цитоскелета чтобы успешно выполнять свою функцию не могут находиться в цитоплазме в подвешенном состоянии.

С одной стороны, они связаны с элементами поверхностной мембраны клетки: фокальными контактами в случае связи клеток с ВКМ и десмо-сомами в случае связи клеток между собой; с другой стороны - должны иметь связь с ядерными структурами. Возникающий в клетке таким образом пре-стресс вызывает натяжение на внеклеточном матриксе. Следовательно, возникает баланс между силами воздействия клеток на матрикс и матрикса на клетки. Рецепторы поверхностной мембраны являются структурами, ответственными за поддержание этого баланса. Являясь связующим звеном между клетками и ВКМ, они выполняют функцию переносчиков механических сил извне на цитоскелет и с цитоскелета на ВКМ.

При оказании внешних механических воздействий существующий силовой баланс нарушается, изменяются термодинамические параметры, и в результате происходят перестройки цитоскелета. Эти структурные перестройки затрагивают и весь метаболизм клетки: нарушаются взаимодействия отдельных структур цитоскелета с рецепторами мембраны, ферментами, полирибосомами, мРНК, органеллами, или меняется структура ядра. Активация клеточного ответа, таким образом, происходит при изменении баланса механических сил.

В зависимости от плотности фокальных контактов на поверхности клетки она ведет себя по-разному: если плотность адгезионных комплексов мала, клетка округляется и отделяется от субстрата, а если велика - прикрепляется и распластывается. Исследования Ингбера на искусственных моделях клеток (^Ьег, 1997) дают основание полагать , что клеточное распластывание может являться результатом переноса напряжения со структур цитоскелета на структуры внеклеточного матрикса. Более важную роль играет сопутствующее распластыванию перераспределение внутреннего натяжения в пределах цитоскелета, чем увеличение количества или длины составляющих его филамен-тов.

Внеклеточный матрикс не является инертной структурой. В случае, если структурные перестройки цитоскелета клетки вызваны другими причинами, например идущим процессом дифференцировки, перенос напряжений на ВКМ должен приводить к его реорганизации, фиксирующей новый баланс механических сил. Так, при культивировании на коллагеновом геле, клетки способны менять его пространственную структуру, создавая неоднородности (^Ьег е! а1., 1994; Уашашо1о е1 а1,1996). Этот эффект особенно характерен для клеток,

находящихся в стадии дифференцировки. Можно предположить, что культивирование клеток на эластичных подложках, способных воспринимать передаваемые от цитоскелета напряжения, должно сопровождаться более эффективным протеканием клеточной дифференцировки. Это предположение согласуется с данными о 2х кратном повышении активности щелочной фосфатазы для клеток, культивируемых на силиконе, по сравнению с клетками, культивируемыми на пластике в ответ на индукцию дифференцировки дексаметазоном (рис. 5).

Интегриновые рецепторы связываются с актиновыми филамента-ми через систему специфических белков: талина, винкулина, паксил-лина,тензина, альфа-актинина и зиксина Интегрины могут влиять на функционирование клеток и тканей путем изменения количества, расположения и прочности фокальных контактов. Интегрины являются теми рецепторами, которые поддерживают существующий баланс механических сил и осуществляют передачу механических сигналов и следовательно, они являются механорецепторами (Wang et al., 1993).

Учитывая, что ВКМ является сложной, многокомпонентной структурой, общая теория клеточных напряжений требует наличия у клетки высокоселективных рецепторов, способных избирательно связываться с отдельными компонентами ВКМ. Поскольку основная роль в формировании единой механохимической структуры "цитоскелет-ВКМ" отводится интегринам, именно рецепторы этого семейства должны проявлять высокую специфичность. Действительно, для интегринов показана возможность специфично связывать некоторые компоненты ВКМ, такие как ламинин и фибронектин (Elices et al., 1991;Hynes, 1992).Вто же время, согласно распространенному мнению, интегрины не обладают способностью распознавать типы коллагена. Таким образом, различие в воздействии коллагенов разных типов на поведение клеток не может быть удовлетворительно объяснена в рамках теории клеточных напряжений. Наши исследования показали, что некоторые интегрины способны к распознаванию типов коллагена по крайней мере in vitro (рис.6)(Садофьев и др, 1997; Sadofiev et al, 2000). В последнее время появились единичные работы, в которых возможность интегринов распознавать типы коллагена показана и in vivo (Kern and Marcantonio, 1998).

Разработанные новые методы исследования специфичности интегринов, основанных tía их функциональных свойствах, позволили показать, что по отношению к типам коллагена интегрины проявляют

большую специфичность, чем считалось ранее. Это дает возможность объяснения различий в воздействии коллагенов разных типов на клеточное поведение в рамках теории клеточных напряжений.

ВЫВОДЫ

1. В первые минуты после механического воздействия внутриклеточная подвижность в живых клетках резко падает. Величина ее падения для клеток линии ROS коррелирует с возрастанием содержания Ф-актина.

2. Вновь образованные стресс-фибриллы в клетках линии ROS группируются вокруг ядра и преимущественно перпендикулярны направлению механического растяжения. В эндотелиальных клетках стресс-фибриллы параллельны оси растяжения и группируются в области клеточной ламеллы.

3. Метод аффинной хроматографии на коллагенах разных типов в сочетании с иммуноблотингом с использованием собственных и коммерческих антител позволил доказать, что a2ßl интегрин способен распознавать I и III типы коллагена.

4. Присутствие интегринов, различающих типы коллагена, характерно для соединительнотканных клеток. Интегрины обнаруживают специфичность по отношению к тем типам коллагена, с которыми клетки контактируют в ткани-источнике.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Садофьев JI. А., Николаенко Н. С., Молодых А. Ю., Подгорная О. И. Коллаген-связывающие белки культивируемых клеток. //Цитология, 1996, 38, 246

Николаенко Н.С., Садофьев JI.A., Кухарева JI.B. Сравнительное исследование состава белков внеклеточного матрикса культивируемых фибробластов крысы. //Цитология 1996,38,1.

Садофьев JT. А., Молодых А. Ю., Николаенко Н. С., Подгорная

0. И. Коллаген-связывающие белки мембран соединительно-тканных клеток.//Цитология 1997. Т. 39, N1. С.15-18

Урусов А. Г., Садофьев Л. А., Подгорная О. И. Два белка в составе ядерного матрикса связываются с промотором гена остеопонтина.// Цитология. 1998. Т.40, N7 С. 627-632.

Садофьев Л. А., Подгорная О. И. Дифференцировка остеогенных клеток в культуре (обзор). //Цитология 1999. T41,N10 С. 877-885

Белякова Н. С., Садофьев Л. А., Подгорная О. И. Теория интеграции клеточных напряжений и следствия из нее. //Цитология. 1999. T41.N11 С. 923-926

L. A. Sadofiev, N. A. Mikhailova 1994 "Receptors to collagen types

1, III, IV of various cell lines" Cell Biol. Int. v. 18 p.558

Sadofiev L.A., Molodich A.U., Nikolaenko N. S. Connective tissue cells have a collagen type specific receptor(s). // Seventh International Simposium on Basement Membranes Bethesda, 1995, p. 61

A.G. Urusov, N. Belyakova, L. A. Sadofiev, О. I. Podgornaya, "Nuclear matrix proteins which bind specifically promoter region of osteopontin gene", European Workshop on Animal Cell Engineering, Costa Brava, Spain, Oct. 30 - Nov. 2,1997

Sadofiev L. A., Nikolaenko N. S., Podgornaya О. I. Discrimination of collagens I and III by integrins with a2 chain. Molecular Biology of The Cell, 1998, v9. p428a

SadofievL. A.,Nikolaenko N. S.,KalmykovaN. V., Podgornaya O. I. Cell-type depending collagen type recognition by cell receptors// Cell Biol. Int. (in press, CBI 328).

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Зайденберг М.А., Андреев В.И. 1988. Различия между коллагенами интерстециальных типов в их влиянии на биосинтез ДНК, РНК и активность некоторых ферментов в биоптатах тканей ран крыс. Журн-.мед.химии, 3,97-100

Лебедев Д.А. 1979. Коллагеновые структуры - одна из информационных систем организма. Успехи совр.биологии, 88,36-48

Albelda S.V., Buck С.А., 1990. Integrins and other cell adhesion molecules. FASEB J., 4, 2868-2880.

BeloussovL. V.,Saveliev S. V.,Naudimi I. I.,Novoselov V. V. 1994. Mechanical stresses in embryonic tissues: patterns, morphogenetic role, and involvement in regulatory feedback. In: Mechanical engineering of the cytoskeleton in developmental biology. San Diego: Academic Press, 150, 1-34.

Bereiter-Hahn J., Buhlesm N. 1987. Basic principles in interpretation of scanning acoustic images obtained from cell cultures and histological sections. In "Imeging and visual documentation in medicine", Wamsteker K., ed., Elsevier Publ., Amsterdam, 537-543.

Boudreau N., Myers C., Bissel Mj. 1995. From laminin to lamin: regulation of tissue-specific gene expression by the ECM. Trends Cell Biol., 5, 1-4

Buck C.F., Horwitz A.F., 1987. Cell surface receptors for extracellular matrix proteins. Ann Rev Cell Biol., 3, 179-205.

Carvalcho R.S., Scott J.E., Yen E.H. 1995. The effects of mechanical stimulation on the distribution of ?1 integrin expession of?l-integrin mRNA in TE-85 human osteosarcoma cells. Arch. Oral. Biol., 40, 257-64.

Elices M.J., Hcmler M.E., 1989. The human integrin VLA-2 is a collagen receptor on some cells and a collagen/laminin receptor on others. Proc Natl Acad Sci USA, 86,9906-9910.

Elices M.J. ,UrryL.A.,HemlerM.E., 1991. Receptor function for the integrin VLA-3: Fibronectin, collagen, and laminin binding are differentially influenced by Arg-Gly-Asp peptide and divalent cations. J Cell Biol., 112, 169-181.

Harter L. V.,Hruska K. A.,Duncan R. L. 1995. Human osteoblast-like cells respond to mechanical strain with increased bone matrix protein production independent of hormonal regulation. Endocrinology, 36, 528-35

Hilderrand J.A., Rugar D. 1984. Measurement of cellular elastic properties by acoustic microscopy. J. Micr., 134, 245-260

Hynes R.O., 1992. Integrins: Versatility, Modulation, and Signaling in Cell Adhesion. Cell, 69, 11-25.

Ingber D. E., Dike L., Hansen L., Karp S., Liley H., Maniotis A., McNamee H., Mooney D., Plopper G., Sims J., and WangN. 1994. Cellular tensegrity: exploring how mechanical changes in the cytoskeleton regulate cell growth, migration, and tissue pattern during morphogenesis. In: Mechanical engineering of the cytoskeleton in developmental biology. San Diego: Academic Press, 150, 173-224.

Ingber D. E. 1997. Tensegrity: the architectural basis of cellular mechanotransduction. Annu. Rev. Physiol., 59,575-599.

Keene D.R., Sakai L.Y., Bachinger H.P.,. Burgeson R.E. 1987. Type III Collagen Can be Present on Banded Collagen Fibrills Regardless of Fibril Diametr. J. Cell Biol., 105, 2393-2398. "

Kern A., Marcantonio E.E., 1998. Role of the I-domain in collagen binding specificity and activation of the integrins albl and a2bl. J Cell Physiol 176, 634-641.

Kubota T., Yamauchi M., Onozaki J., Sato S., Suzuki Y., Sodek J. 1993. Influence of an intermittent compressive force on matrix protein expression by ROS 17/2.8, with selective stimulation of osteopontin. Arch. Oral. Biol., 38, 23-30.

Laemmli U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 22,680-685.

Lynch M.P., Stein J.L., Stein G.S., Lian J.B. 1995. The influence of type I collagen on the development and maintainance of the osteoblast phenotype in primary and passaged rat calvarial osteoblasts: modification of expression of genes supporting cell growth, adhesion, and extracellular matrix mineralization. Exp. Cell Res., 216, 465-468.

Majeska RJ, Rodan SB, Rodan GA 1978. Maintenance of parathyroid hormone response in clonal rat osteosarcoma lines. Exp. Cell Res., 111(2), 465-468

Maniotis A. J., Chen S. C., and Ingber D. E. 1997. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 94, 849-854.

Miller E.J., Rhodes K., 1982. Preparation and characterization of the different types of collagen. Meth In Enzymol., 82,33-64

Mollenchauer J., Bee J.A., Lizarbe MA., von den Mark K., 1984. Role of anchorin CII, a 31,000 molecular weight membrane protein, in the interaction of chondrocytes with type II collagen. J Cell Biol., 98, 1572-1578

Simpson D.G., Carver W., Borg T. K., Terracio L. 1994. Role of mechanical stimulation in the establishment and maintenance of muscle cell differentiation. In: Mechanical engineering of the cytoskeleton in developmental biology. San Diego: Academic Press,150,69-94.

Stanford C.M., Morcuende J.A., Brand R.A. 1995. Proliferative and phenotipic responses of bone-like cells to mechanical deformation. J.Orthop.res., 13, 664-70

WangN., Butler J. P., IngberD. E. 1993. Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton. Science, 260, 1124-1127.

Yamamoto M.,Nakamura H., Yamato M., Aoyagi M., Yamamoto K. 1996. Retardation of phenotypic transition of rabbit arterial smooth muscle cells in three-dimensional primary culture. Exp. Cell Res., 225,12-21

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Садофьев, Леонид Аполлонович

ВВЕДЕНИЕ.

Основные положения, выносимые на защиту.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Особенности костной ткани и остеогенез.

Гормональная регуляция дифференцировки остеогенных клеток в культуре.

Результаты механических воздействий на культивируемые остеогенные клетки.

Взаимодействие культивируемых остеогенных клеток с внеклеточным матриксом.

Формирование и передача сигнала от ВКМ и механического сигнала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Клеточные культуры.

Механичеркое воздействие на клетки.

Исследование внутриклеточной подвижности с помощью сканирующего акустического микррскопа.

Окрашивание клеток на Ф-актин.

Определение активности щелочной фосфатазы.

Выделение и очистка коллагенов. а. Экстракция коллагенов из кожи крыс. б. Экстракция коллагенов из плаценты человека. в. Разделение коллагенов дробным солевым осаждением. г. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. д. Гель-хроматография на сефакриле Sе. Лиофилизация и хранение.

Приготовление колонок для аффинной хроматографии.

Выделение белков плазматической мембраны клеток.

Препаративное выделение рецепторов.

Определение специфичности рецепторов по отношению к типу коллагена.

Определение аффинности рецепторов к коллагенам разных типов.

Получение антител.

Иммунобдоттинг.

Аффинная хроматография на иммобилизованных антителах против белка 140 КДа

Иммуноф^юоресцентное окрашивание клеток.

Компьютерные методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Реакция клеток на механическое воздействие.

Форма клеток и Ф-актин.

Содержание Ф-актина в клетках линии ROS.

Изменение подвижности участков клетки.

Исследование длительного ответа остеогенных клеток на механическое воздействие в культуре.

Анализ специфичности рецепторов по отношению к типу коллагена.

Коллагену высокой степени чистоты.

Специфичность рецепторов по отношению к типу коллагена.

Зависимость специфичности от условий хроматографии.

Идентификация коллаген-связывающих рецепторов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реакция остеогенных клеток на механическое воздействие и специфичность их рецепторов к компонентам внеклеточного матрикса"

Микроокружение клетки играет ключевую роль в регуляции ее поведения, в том числе в переключении состояний пролиферация/дифференцировка. Особую роль играет взаимодействие клеточных рецепторов с белками внеклеточного матрикса (ВКМ).

Взаимодействие этих рецепторов со своими лигандами может приводить как к формированию сигнала химической природы (например каскады фосфорилирования) так и к изменению формы клетки и перераспределению баланса механических сил (Ingber et al, 1994). Механическое воздействие на клетку в свою очередь неизбежно изменяет характеристики связывания рецепторов с белками ВКМ. Таким образом, рецепторы к белкам ВКМ являются и сигнальными рецепторами и механорецепторами. Эта двоякая роль рецепторов непосредственно связана с процессом формирования многоклеточного, пространственно организованного организма из одной клетки (Belousov et al, 1994), репара-тивной регенерацией и функционированием тканей взрослого организма (Simpson et al, 1994).

2. Исследование долговременных клеточных реакций, в первую очередь затрагивающих вызванные адаптационными перестройками изменения функционирования клеточного генома.

По литературным данным, механическое воздействие на клетки обладает длительным пост-эффектом. Воздействие сказывается на таких параметрах, как изменение уровня транскрипции некоторых генов, изменение уровня активности ряда ферментов, и ряде других, свидетельствующих о значительных изменениях функционального состояния клетки (Садофьев, Подгорная, 1999). Однако данные, полученные разными авторами противоречивы. Есть данные о том, что механическое воздействие на клетки повышает степень их дифференцированности, определяемой по экспрессии генов тканеспецифичных белков (Kubota et al, 1993; Harter et al, 1995), но по данным других авторов - понижает, стимулируя одновременно клеточную пролиферацию (Stanford et al, 1995).

Ингбером (Ingber) с сотрудниками была сформулирована теория интеграции клеточных напряжений (Cellular Tensegrity), постулирующая существование единой цепочки связей «внеклеточный матрикс (ВКМ) - цитоскелет - форма клетки - форма ядра - структура хроматина - изменение функционирования клеточного генома» (Ingber 1997), ключевая роль в которой отводится взаимодействию белков ВКМ с рецепторами семейства интегринов.

Большинство описанных рецепторов к белкам ВКМ принадлежит к семейству интегринов (Buck and Horwitz, 1987; Albelda and Buck, 1990; Hynes 1992). Интегрины, состоят из двух субъединиц, разных типов (а и (3 субъединицы). Как правило, с одной |3 субъединицей может ассоциироваться несколько различных а субъединиц, образуя рецепторы, связывающиеся с различными лигандами.

Имеются данные о существенной роли рецепторов этого семейства в передаче механических, изменяющих форму клетки сигналов, на клеточное ядро (Carvalcho et al, 1995, Maniotis et al, 1997). Было показано наличие непосредственной механической связи между коллагеновым рецептором - интегрином «2(31, цитоскелетом и ядерным матриксом (Maniotis et al, 1997). Можно предположить, что взаимодействуя с коллагеном, интегри-ны через цитоскелет оказывают механическое воздействие на структуру ядерного мат-рикса, возможно модулируя функционирование транскрипционных факторов (Boudreau et al., 1995). Функциональная значимость такой связи подтверждается наличием в составе ядерного матрикса транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов белков, специфичных для костной ткани (Урусов и др., 1998).

Одним из основных компонентов ВКМ являются коллагены - семейство структурных белков, имеющих характерное строение и содержащих ряд аминокислот, практически не встречающихся в других белках (гидроксипролин, гидроксилизин). Высокое содержание глицина (-30% аминокислотных остатков) и оксипролина придают этому белку структуру плотной тройной спирали, не встречающейся в других белках. Показано, что коллаген, в результате взаимодействия с интегринами, оказывает ключевое влияние на дифферен-цировку по крайней мере некоторых типов клеток (Lynch et al, 1995). Накопленные данные по воздействию коллагена на клеточные процессы позволяют считать его одной из основных информационных систем организма (Лебедев, 1979).

Однако, коллагены разных типов оказывают различное воздействие на клеточную пролиферацию и дифференцировку, в зависимости от степени зрелости ткани (Зайденберг и Андреев, 1998).

Способность рецепторов к распознаванию типа коллагена особенно важна для клеток костной ткани. Как при нормальном морфогенезе, так и в процессе репаративной регенерации костной ткани, остеобласты и остеоциты контактируют с разными типами коллагена, сменяющими друг друга в определенной последовательности (Лебедев, 1979). Основной моделью в настоящей работе стала клеточная линия остеосаркомы крыс ROS 17/ 2.8, по многим параметрам сходная со зрелыми остеобластами (Majeska et al, 1978).

Целью настоящей работы являлось комплексное исследование механизмов воздействия формообразующих сигналов на поведение клеток в культуре. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменения цитоскелета в ответ на механические формообразующие воздействия.

2. Исследовать долговременную реакцию клеток на механическое воздействие.

3. Разработать метод определения специфичности клеточных рецепторов по отношению к типам коллагена.

4. Выделить и идентифицировать клеточные рецепторы, способные распознавать типы коллагена.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Механическое воздействие на клетку вызывает адаптационную перестройку акти-нового цитоскелета, сопровождающуюся увеличением содержания Ф-актина и количества стресс-фибрилл.

3. Интегрины способны различать типы коллагена, причем интегрины проявляют специфичность по отношению к тем типам коллагена, с которыми клетки контактируют в ткани-источнике.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Особенности костной ткани и остеогенез

Костная ткань составляет основу опорно-двигательной системы организма. Для костной ткани характерны следующие особенности: развитый внеклеточный матрикс (ВКМ), наличие минеральных компонентов, чувствительность к механическим нагрузкам (Горбенко и Карсавина, 1977).

Внеклеточный матрикс костной ткани состоит преимущественно из коллагена, который составляет более 90% массы органических компонентов кости (Торбенко, Карсавина, 1977). В зрелой костной ткани коллаген представлен типом I, однако, в процессе остеогенеза, как в эмбриогенезе, так и при репаративной регенерации костной ткани, происходит сложная последовательная смена типов коллагена образующего ВКМ кости (Лебедев, 1979).

Органо-типическая структура кости в основном создается остеобластами, которые формально могут считаться не полностью дифференцированными клетками. (Торбенко и Карсавина, 1977). В частности, остеобласты обладают способностью к пролиферации. Остеобласты могут быть разделены на зрелые, т.е. способные к биосинтезу органо-типи-ческих белков, и незрелые, в которых гены специфичные для функционально-оформленной костной ткани, практически не экспрессируются. Таким образом, для понимания механизма формирования костной ткани наибольший интерес представляет превращение незрелых остеобластов в зрелые, т. е. переход клеток костной ткани на следующий этап диффереицировки.

Значительное изменение механической нагрузки на костную ткань приводит к ее адаптивной перестройке. По-видимому, остеогенные клетки должны отвечать в этом случае изменением экспрессии генов остеоспецифичных белков. С другой стороны, кратковременные нагрузки, возникающие, например, при ходьбе, не должны приводить к изменению функционирования остеобластов.

Активное использование костной ткани в качестве модели для изучения процессов репаративной регенерации обусловлено, с одной стороны, относительной простотой ее структуры, а с другой - необходимостью поиска новых методов лечения травм.

Репаративная регенерация костной ткани, как и формирование кости в эмбриогенезе - сложные многоступенчатые процессы, в управлении которыми участвуют все известные регуляторы. При исследовании регенерирующей ткани in vivo практически невозможно выявить роль каждого из ключевых регуляторов процесса регенерации. Исследование клеток в культуре, несмотря на ряд ограничений этого подхода, позволяет не только изучать действие на клетки отдельных регуляторных факторов, но и дозировать его.

Дифференцировка остеогенных клеток в культуре сопровождается снижением транскрипции генов белков участвующих в клеточной пролиферации и адгезии, с параллельным повышением транскрипции генов остеобласт-специфичных белков (Stein et al, 1995).

По окончании активной пролиферации начинается постепенная экспрессия генов, специфичных для зрелых остеобластов. Однако наработка этих белков происходит не синхронно. Сначала накопливаются компоненты внеклеточного матрикса, характерного для зрелой костной ткани. В дальнейшем постепенно нарастает экспрессия генов белков, принимающих участие в минерализации ВКМ (Owen et al, 1990; Stein and van Wayen, 1995). Экспрессия генов белков, участвующих в делении и адгезии клеток, при этом практически прекращается.

Таким образом, по уровню экспрессии генов той или иной группы можно судить о степени дифференцировки остеобластов в культуре, что широко используется при исследовании воздействия различных регуляторов на дифференцировку остеогенных клеток в культуре.

Клетки костной ткани in vivo испытывают регуляторные воздействия следующих основных типов, которые могут быть воспроизведены in vitro: гормональная регуляция; механическое воздействие; воздействие со стороны микроокружения клетки, в первую очередь, компонентов (ВКМ).

Гормональная регуляция дифференцировки остеогенных клеток в культуре

Под термином "гормональная регуляция" мы понимаем регуляцию дифференцировки остеогенных клеток не только гормонами как таковыми, но и рядом других веществ с гормоноподобным механизмом действия. Применительно к костным клеткам в качестве таких веществ в первую очередь выступают производные витамина D3 и семейство костных морфогенетических белков (bone morphogenic proteins). Наиболее распространенным способом индукции дифференцировки остеогенных клеток в культуре является воздействие на них гормонами, а также веществами другой природы, но со сходным механизмом действия. Краткое описание наиболее значимых работ по гормональной индукции остеогенной дифференцировки первичных культур клеток представлено в табл. 1.

Как следует из данных таблицы, по меньшей мере некоторые гормоны способны индуцировать дифференцировку остеогенных клеток в первичных культурах.

Однако если гормональному воздействию были подвергнуты остеогенные клетки в начальный период культивирования, т.е. по ходу их активной пролиферации, результат может оказаться прямо противоположным - стимулируется пролиферация и тормозится дифференцировка (Rickard et al, 1994). На этом основании можно предположить, что гормональное воздействие на остеогенные клетки служит не столько собственно индуктором дифференцировки, сколько фактором, способствующим протеканию процесса дифференцировки, вызванного другими воздействиями на клетку.

В связи с относительной трудностью получения первичных культур остеогенных клеток значительно больше работ выполнено на постоянных линиях остеогенных клеток. Однако вопрос о том, насколько эти линии являются подходящей моделью для исследования механизмов дифференцировки ^трансформированных клеток, пока остается открытым.

Некоторые наиболее типичные результаты исследований гормональной индукции дифференцировки клеток остеогенньгх клеточных линий представлены в табл. 2.

Поскольку в такого рода исследованиях чаще всего используется клеточная линия остеосаркомы крысы ROS 17/2.8 (Majeska et al, 1978), был проведен ряд специальных сравнительных исследований клеток этой линии и первичных культур нормальных остеобластов (см., например, McCabe et al, 1994). Было показано, что как по набору конститутивно экспрессируемых генов, так и по реакции на различные воздействия клетки линии ROS не отличаются от нормальных зрелых остеобластов. Так, в клетках этой линии Однако повышение экспрессии этих генов не обязательно связано с протеканием про

Таблица 1

Результаты гормональных воздействий на костные клетки в первичных культурах

Клетки Воздействие а Регистрируемый показатель" Результат воздействияв Источник

Клетки костного мозга ДМ остеокальцин + ВегевГогё а а1„ костный сиалопротеин +

1994 остеопонтин +

ЩФ +

1,25-В-Бз остеокальцин -ь

ЩФ + активность.ЩФ ++(8 сут) иРНКЩФ +(8 сут)

ДМ остеопонтин +(6 сут)

Строма костного мозга 5-6-недельных крыс В и стар костный сиалопротеин +(8 сут) остеокальцин +{8 сут) Шскагс! ег а1, 1994 иРНК коллагена I +(6 сут) пролиферация 0(10 сут)

ДМ + В-Б3 иРНКЩФ +(8 сут) остеопонтин +(8 сут) иРНК остеокальцина +(8 сут)

КМБ-2 иРНКЩФ -+(8 сут) иРНК остеопонтина + иРНК осгсокальцина + костный сиалопротеин коллаген I +

КМБ-2 иРНКЩФ ++(8 сут) ДМ иРНК остеопонтина ++ иРНК остеокальцина ++ костный сиалопротеин ++ icoллaгeн I ++ аДМ - дексаметазон, В-Б3 - витамин Оэ, 1.25-В-П3 - 1,25-дигидроксивитамин 1>; , КМБ-2 костный морфогенетический белок 2. бЩФ - Щелочная фосфатаза

О" - отсутствие изменений,"-" - уменьшение,"+" - увеличение,"++" - сильное увеличение

Как следует из данных табл. 2, при действии гормонов на клетки этой линии в них может повышаться экспрессия остеобласт-специфичных генов.

Таблица 2.

Результаты гормональных воздействий на клетки остеогенных клеточных линий

Клеточная линия8 Воздействие0 Регистрируемый показатель® Результат воздействия1^ Источник

ROS 1,25-В4)3 и аналоги коллаген! + Bernd et al. 1995 остеокальцин + пролиферация +

MG-63 1,25-В-Оз и аналоги коллаген I + остеокальцин + пролиферация -

ROS ДМ ЩФ + Green et al, 1990

ROS ДМ активность РПТГ + Urena et al., 1994 иРНКРПТГ +

OK дм активность РПТГ 0 иРНКРПТГ 0

ROS 1,25-В-Б3 или 1,25-В-ЕЬ +аскорбиновая кислота ЩФ + Franceschi et. al. 1994 коллаген +

MG-63 1,25-В-Д, или 1,25-В-Б, (аскорбиновая кислота ЩФ + коллаген +

UMR ДМ костный сиалопротеин + Sodek et al., 1995

ROS ДМ костный сиалопротеин +

HOS ДМ глюкокортико идный рецептор пролиферация + Song 1994

MG-63 ДМ В-О-рецептор - Godsclialk et al., 1992

MC3T3-E1 тироидный гормон ЩФ + Kasomo et. AI., 1988

ROS 17/2.8 форболовые эфиры активность ПКС ++ Bos et al., 1994 тромбин активность ПКС +

ПТГ-р (1-34) активность ПКС 0

ТФР-Р2 активность ПКС 0

UMR 106-01 (|юрболовые эфиры активность ПКС + тромбин активность ПКС +

ПТГ-р (1-34) активность ПКС 0

ТФР-Р2 активность ПКС 0 продолжение таблицы 2

МСЗТЗ-Е1 эндотелии-1 фосфолипазаС + Takuwa et al., 1989

Ca2"* +

Са2+ + синтез ДНК +

ЩФ -

MOB 3-4 ФК (Ca~')i + Kawase, Suzuki, 1990

Ca"* - cAMP - активность ЩФ +

Пролиферация +

ИТФ +

ФК+сфингозин ИТФ а) ROS - остеосаркома крысы, HOS - осгеосаркома человека, MG-63 - остеосаркома человека, UMR - остеосаркома крысы, МСЗТЗ-Е1 - остеосаркома мыши. OK - осгеосаркома, MOB 3-4 - остеобласт-подобные клетки мыши б) 1,25 -E-D3 - 1,25-дигидрокси витамин D3 ДМ - дексаметазон, ЬРТН (1-34) -синтетический аналог паратироидного гормона, T®P-ß2 - трансформирующий фактор роста ß2, ФК - фосфатвдиловая кислота. в) ЩФ - щелочная фосфатаза, РГГГГ - рецептор паратироидного гормона, B-D рецептор -рецептор витамина D3, ПКС - лротеинкиназа С, ИТФ - инозитолгрифосфат, Са~+ - внеклеточный кальций, (Са^И - внутриклеточный кальций. г) "О" - отсутствие изменений, и-и - уменьшение, "+и - увеличение, "++" - сильное увеличение цесса клеточной дифференцировки. В промоторных участках большинства генов, кодирующих остеобласт-специфичные белки, имеются элементы, чувствительные к ряду гормонов и гормоноподобных веществ, в частности, к 1,25-дигидроксивитамину Вг В основном эти элементы выполняют функцию энхансеров. Следовательно, обработка клеток такими препаратами может приводить к возрастанию уровня экспрессии остеобласт-специфичных генов без включения регуляторных каскадов, характерных для процесса дифференцировки (индуцибельный синтез).

Включение регуляторных каскадов, связанных с протеканием процесса клеточной дифференцировки, требует более значительной перестройки функционирования клеточного генома, и следовательно - большей длительности реакции, чем индуцибельный синтез. Таким образом, промежуток времени между воздействием на клетки и их ответом может служить одним из показателей, позволяющих различить эти два процесса.

Суммируя данные по гормональной регуляции дифференцировки остеогенных клеток в культуре можно прийти к следующим выводам: 1. Гормональное воздействие на остео-генные клетки в культуре способно стимулировать экспрессию остеобласт-специфичных генов. 2. Гормональное воздействие способно вызывать процесс дифференцировки остеогенных клеток в культуре. 3. Гормональное воздействие в некоторых случаях способно вызывать усиление транскрипции остеобласт-специфичных генов без включения диффе-ренцировочных каскадов. 4. Представляется вероятным, что гормональное воздействие не является индуктором дифференцировки, а облегчает и стимулирует протекание процесса дифференцировки остеогенных клеток, вызванного другими причинами.

Результаты механических воздействий на культивируемые остеогенные клетки

Механические воздействия вносят большой вклад в регуляцию процессов, происходящих в костной ткани, и значительное число работ посвящено изучению влияния механических факторов на поведение костных клеток. Результаты основных работ в этом направлении представлены в табл. 3. конститу тивно синтезируются практически все белки, специфичные для зрелых остеобластов - щелочная фосфатаза, остеопонтин, остеокальцин, коллаген I (Majeska et al, 1978).

Приведенные данные показывают, что механическое воздействие существенно влияет на поведение остеогенных клеток в культуре. Особенно ярко это влияние проявляется в случае циклического растяжения клеток. Однако обращают на себя внимание значительные противоречия между результатами, полученными разными группами исследователей. По данным одних авторов, механическое воздействие вызывает усиление синтеза белков, характерных для фенотипа зрелых остеобластов (Kubota et al, 1993; Harter et al, 1995). По данным других исследователей, механическое воздействие стимулирует пролиферацию клеток и ингибирует синтез остеобласт-специфичных белков, т. е. вызывает де-дифференцировку клеток (Stanford et al, 1995).

Наиболее вероятной причиной расхождения полученных результатов представляется различие в использованных способах оказания механического воздействия. Учитывая специфику функционирования костной ткани в организме и связанную с этим необходи

Таблица 3

Результаты механического воздействия на оетеогенные клетки в культуре

Клетки Механическое воздействие Химический инд\ iciop Регистрируемый показатель8 Результат6 Источник

Клетки линии HOS циклическое растяжение 3 цикл/мин ЗО'-З дня ? 1-интегрин ++ Carvalcho et. al., 1995

Остеобласте -подобные клетки крысы вакуумное растяжение -1 кПа, 0,5Гц 1 цикл/день коллаген I пролиферация ++ Standford et al., 1995 вакуумное . растяжение -1 кПа, 0.5Гц 4 цикла/день коллаген I пролиферация активность ЩФ остеокальцин ++

Клетки линии ROS 17/2.8 циклическое сдавливание 13 кПа, 18 цикл/мин - коллаген 1 фибронекгин остеонектин активность ЩФ остеопонтин 0 0 0 + + Kubota et al.,1993

Клетки надкостницы курицы однократное механическое воздействие индометацин <40 мг/мл) простагландины - Pead 1989

Первичные остеобласты Крысы циклическое или статическое механическое воздействие - синтез ДНК неко л лагеновые. белки + + Silin et al., 1985

Остеобласто подобные клетки растяжение - коллаген I остеокальцин + + Harter et al.,1995 витамин D3 коллаген I ++ а) ЩФ - щелочная фосфатаза б) обозначения результатов воздействия те же, что и в табл. 1. мость адекватной реакции костных клеток на механическую нагрузку, можно допустить, что характер и сила ответа остеогенных клеток на механическое воздействие должны резко меняться при достижении пороговых значений некоторых параметров механического воздействия. Наиболее вероятным параметром представляется величина приложенной к клеткам силы.

Нам не удалось выявить на основании литературных данных какую-либо "стандартную" величину механической нагрузки на остеогенные клетки, однозначно стимулирующую их дифференцировку.

Зависимость характера реакции остеогенных клеток в культуре от параметров механического воздействия на них не позволяет считать само по себе механическое воздействие ни индуктором пролиферации, ни индуктором дифференцировки. Представляется вероятным, что механическое воздействие является мощным стимулирующим фактором, резко активирующим текущие внутриклеточные процессы.

Таким образом, реакция клетки на механическое воздействие является сложной, многоступенчатой и комплексной, затрагивающей практически все основные системы реакции клеток на внешние воздействия (см. табл. 4).

Механическое воздействие на клетку в любом случае должно изменять характер ее взаимодействия с микроокружением и, в частности с компонентами внеклеточного мат-рикса (см. следующий раздел). Об этом говорят данные, представленные в табл. 3. Авторы отмечают увеличение биосинтеза компонентов внеклеточного матрикса (коллаген I, Harter et al, 1995) и рецепторов, участвующих в клеточной адгезии к внеклеточному мат-риксу (ßl цепь интегрина, Carvalcho et al, 1995) в ответ на механическое воздействие на клетки.

Таким образом, имеющиеся в литературе данные об изменениях в клетках при механическом воздействии на них позволяют сделать следующие выводы: 1. Механическое воздействие оказывает существенное активирующее влияние на остеогенные клетки. 2. Характер влияния механической нагрузки на остеогенные клетки зависит как от природы механической стимуляции, так и от ее величины. 3. Реакция остеогенных клеток на механические воздействия - комплексный многоступенчатый процесс, затрагивающий практически все известные системы клеточной реакции на внешние сигналы. 4. Представляется вероятным, что существенную роль в запуске каскада реакций остеогенных клеток на механическое воздействие играет изменение взаимодействия клетки с внеклеточным матриксом.

Таблица 4

Этапы внутриклеточного формирования механического сигнала (по Banes et al, 1995)

Время Ответ

Миллисекунды-секунды сигнализация с помощью мессенджеров механически активируемые каналы (Са , 1\'а~,К ,Н ) - инозитолтрифосфат, сАМР - активация 6 белков - активация фосфорилирования

Минуты-часы - сигнализация с помощью киназ - транскрипция (с-Гоя, ¡ип, другие транскрипционные факторы) - трансляция - полимеризация актина, тубулина и других белков цитоплазматических филаментов реорганизация фокальных контактов - изменения формы клеток и ядра

Дни увеличение основного внутреннего напряжения до нового, равного внешнему - сжатие внеклеточного матрикса - миграция клеток - изменение состава внеклеточного матрикса деление или приостановка деления клеток - адаптация всех систем клетки к. новому равновесию механических-сил

Взаимодействие культивируемых остеогенных клеток с внеклеточным матрик-сом

Как известно, различные компоненты ВКМ, и в частности - коллагены разных типов, оказывают различное влияние на процессы клеточной пролиферации и дифференциров-ки. В случае регенерирующей соединительной ткани это влияние может меняться в зависимости от срока с момента травмы (Зайденберг и Андреев, 1988).

Процесс регенерации костной ткани in vivo сопровождается сложными закономерными изменениями в составе синтезируемого клетками внеклеточного матрикса (Лебедев, 1979). В частности, происходит и последовательная смена типов коллагена, синтезируемого остеогенными клетками на разных этапах созревания кости. На ранних этапах преобладает биосинтез коллагенов II и III, в то время как остеобласты зрелой костной ткани синтезируют почти исключительно коллаген I (Лебедев, 1979). Это заставляет предположить, что состав и структура ВКМ играют важную роль в процессе остеогенеза и оказывают влияние на протекание дифференцировки остеогенных клеток. К сожалению, мы не обнаружили ни одной работы, в которой проводился бы сравнительный анализ влияния разных компонентов ВКМ на протекание дифференцировки остеогенных клеток в культуре, хотя такой анализ представляется в высшей степени желательным. Существуют лишь работы, посвященные исследованию влияния коллагена I (основного коллагена зрелой костной ткани) на ход остеогенной дифференцировки в культуре (Audrionarivo et al, 1992, Lynch et a!, 1995; Takeuchi et ai, 1996), в которых показано, что культивирование клеток на подложках из коллагена I стимулирует экспрессию остеобласт-специфичных генов и диф-ференцировку остеогенных клеток. Однако механизмы такого влияния до сих пор не изучены.

Передача сигнала от белков ВКМ обусловлена взаимодействием белков с соответствующими рецепторами клеточной мембраны. Такие рецепторы остеогенных клеток достаточно подробно охарактеризованы (Pistone et al, 1995). Большую роль в передаче сигнала от белков ВКМ к клеткам играют интегрины, в основном принадлежащие к (31 семейству. Взаимодействие интегринов pi семейства, в частности интегрина а2|У1 - основного ин-тегринового рецептора к коллагену - с коллагеном 1 является критически важным для протекания поздних стадий остеогенной дифференцировки (Takeuchi et al, 1996). На клетках линии МСЗТЗ-Е1 (частично дифференцированные остеобласты мыши) показано, что активация интегрина а2Р1, как естественная - при культивировании на коллагеновых подложках, так и искусственная - тетрапептидом асп-гли-глу-ала (представляющим собой участок молекулы коллагена I, ответственный за связывание с а2р 1 интегрином) добавленным в культуральную среду, стимулирует формирование фенотипа зрелых остеобластов. Одновременно существенно снижается количество рецепторов к ТФР-р, который стимулирует пролиферацию костных клеток и ингибирует их дифференцировку (ТакеисЫ & а1, 1996).

Формирование и передача сигнала от В КМ и механического сигнала

Механорецепторами клетки в настоящее время считают рецепторы семейства интег-ринов (ГпзЬег е( а1, 1994), которые также являются и рецепторами к белкам ВКМ (НупеБ, 1992).

Как и большинство других классов рецепторов, при связывании с лигандом, интегри-ны запускают сложный комплекс химических реакций в клетке, включая каскады фосфо-рилирования (Нунев, 1992; Коэкйеу е! а1, 1995). Однако, это не единственный путь, по которому сигнал от рецепторов семейства интегринов может быть передан к клеточному ядру.

Интегриновые рецепторы связываются с актиновыми филаментами через систему специфических белков, таких как талин, винкулин, паксиллин, тензин, альфа-актинин и зик-син. В свою очередь, цитоскелет связан с клеточным ядром, и его адаптационные перестройки при механическом воздействии на клетку или при изменении состава ВКМ способны вызывать ответ на уровне клеточного ядра (1п§Ьег й а1, 1994).

Структуры клетки изменяются координированным образом при наличии внешних механических стимулов. Так, и цитоскелет, и ядро под действием механической силы, приложенной на интегрины фокальных контактов, перестраиваются вдоль главной оси приложенного поля (Машойэ е1 а1, 1997а; Маш от е1 а1, 1997Ь). При этом цитоскелет претерпевает ряд последовательных изменений и ведущая роль в перестройке цитоскелета принадлежит актину.

Видимо, адаптационные перестройки цитоскелета являются непосредственным путем передачи сигнала, вызывающего изменение поведения клетки.

Экспериментально показано наличие опосредуемой интегринами и цитоскелетом связи между ядерным матриксом и компонентами ВКМ (Воиёгеаи ет а1, 1995; МагмоШ й а1,

1997), Таким образом, интегрины являются ключевой точкой в цепи передачи сигнала ВКМ - цитоскелет - геном.

Как показано для эпителиальных клеток, ВКМ влияет на процессы, происходящие в клеточном ядре. Так, функционирование транскрипционных факторов известного семейства С/ЕВР регулируется взаимодействием клетки с ВКМ (Sehimdhauser et al, 1990,1992). То же самое было продемонстрировано и для энхансерного элемента вируса опухоли молочной железы мышей MMTV (Archer et al, 1992, Lee and Archer, 1994; Sehimdhauser et al, 1994). В обоих случаях особенности регуляторного влияния ВКМ позволяют предположить вовлеченность в этот процесс ядерного матрикса. Так, в случае транскрипционных факторов С/ЕВР функцонирование растворимых членов семейства не регулируется ВКМ. Регуляция наблюдается только для изоформ, прочно сцепленных с ядерным мат-риксом (Roskeley et al, 1995). В случае энхансера MMTV, активация ВКМ сопровождается перестройкой структуры хроматина этой области (Archer et al, 1992; Lee and Archer, 1994).

Для остеобластов показано наличие двух ассоциированных с ядерным матриксом транскрипционных факторов NMP-1 и NMP-2, регулирующих экспрессию остеокальцина - маркерного белка зрелых остеобластов (Bidwell et al, 1993; Stein et al, 1994). Те же транскрипционные факторы возможно, вовлечены и в регуляцию экспрессии других остеобласт-специфичных генов, в частности, остеопонтина (Урусов и др., 1998).

На основании изложенного представляется вероятным, что ядерный матрикс играет важную роль в передаче сигнала от ВКМ к геному клетки и что сигнал от ВКМ модулирует функции транскрипционных факторов ядерного матрикса.

Представления о единой интегрированной архитектуре клетки, объединяющей все ее основные структурные компоненты и придающей векторную направленность как сигналу, так и ответу на него, выраженному в направленных экспрессии гена и секреции его продукта, уже сформулированы (Ingber 1993, Maniotis et al, 1997). Но необходима еще большая работа по выяснению конкретных механизмов передачи сигнала в ключевых точках, а именно между ВКМ и интегринами, интегринами и цитоскелетом, цитоскеле-том и ядерным матриксом, транскрипционными факторами ядерного матрикса и промоторами тканеспецифичных генов. Существуют также высокомолекулярные рецепторы клеточной мембраны к коллагену, принадлежность которых к семейству интегринов не установлена (Dedchar et al, 1987) и роль которых в регуляции остеогенной дифференци-ровки не изучена.

Интегрины считаются относительно малоспецифичными рецепторами (Buck and Horwitz, 1987; Albelda and Buck, 1990; Hynes, 1992), узнающими ограниченное число аминокислотных последовательностей в лиганде (чаще всего - последовательности арг-гли-асп(сер) и асп-гли-глу-ала) (Buck and Horwitz, 1987; Albelda and Buck, 1990; Hynes, 1992). Однако такие последовательности имеются в составе практически всех белков внеклеточного матрикса. В связи с этим, встает ряд вопросов, которые,требуют дальнейшего изучения: 1. Синтез коллагена I характерен преимущественно для относительно поздних стадий дифференцировки соединительнотканных клеток (Лебедев, 1979; Yamada, 1983). Если взаимодействие с коллагенами I и III обусловлено одними и теми же рецепторами клеточной мембраны, то непонятно, почему эти два типа коллагена воздействуют на клетки по разному ? Какими именно рецепторами опосредуется взаимодействие остеогенных клеток с коллагеном III ? 2. а2(31 - не единственный интегрин остеобластов, способный взаимодействовать с коллагеном (Albelda and Buck, 1990; Hynes, 1992). Непонятно, какова роль других интегринов в остеогенной дифференцировке ? 3. Для ряда интегринов, в том числе принадлежащих к (31- семейству, было показано наличие тканезависимого механизма регуляции специфичности (Elices and Hemler, 1989). Непонятно, изменяется ли специфичность интегринов остеогенных клеток в процессе их диффференцировки ?

В связи с существованием механизма динамической регуляции специфичности и аффинности интегринов (Elices and Hemler, 1989; Elices et al, 1991), основанного по преимуществу на посттрансляционных модификациях, для ответа на поставленные вопросы необходима разработка подхода к исследованию интегринов, основанного на функциональных тестах. Существующие подходы к исследованию интегринов, основанные на определении уровня экспрессии их генов или на количественном определении содержания интегринов с помощью антител, представляются недостаточными. При таких подходах не могут быть учтены изменения функционирования интегринов вследствие их посттрансляционных модификаций.

Таким образом:

1. Благодаря относительно простой структуре ВКМ костной ткани и ее высокой меха-ночувствительности, остеобласты являются оптимальной моделью для изучения эффекта влияния механических воздействий на клетку.

2. Ведущая роль в формировании механического сигнала принадлежит актиновому цитоскелету и исследование его адаптационных перестроек при механическом воздействии на ьргетку является критически важным для понимания путей формирования этого сигнала.

3. Механическое воздействие на клетки в культуре способно вызывать длительный пост-эффект, однако характер длительного ответа на механическое воздействие требует дальнейшего изучения.

4. Взаимодействие клеточных рецепторов с белками ВКМ, способно ключевым образом воздействовать на поведение клетки. Результат зависит от состава ВКМ. Однако, имеющиеся к настоящему времени данные о специфичности основной группы рецепторов к белкам ВКМ - интегринов не позволяют объяснить эту зависимость.

МАТЕРИАЛЫ Ii МЕТОДЫ

Клеточные культуры

В работе использованы следующие клеточные культуры: линия клеток остеосаркомы крысы ROS 17/2.8 предоставленная Dr. Foebe Leboy (Пенсильванский университет, США), линию иммортализованнных эмбриональных фибробластов крысы E1A-12S, линии клеток огшдермоидной карциномы человека HeLa и А431, линия клеток опухоли тимуса мыши GH3, диплоидные культуры фибробластов крысы, выделенных из легких и скелет-но-мышечного мешка новорожденных крысят, линию остеосаркомы человека HOS, (Российская коллекция клеточных культур Института цитологии РАН). Все упомянутые клеточные линии культивировались в смеси сред DME - F12(3:1)b присутствии 10% эмбриональной сыворотки коров. Кроме того была использована линия иммортализованных эндотелиальных клеток из сердца головастика Xenopus Laevis ХТН-2 (получены в лаборатории Dr. Bereiter-Hahn, Германия). Клетки этой линии культивировались в среде САМ (Gibco, Великобритания) с добавкой 10 mM HEPES; 0,2% NaHCO, и 5% эмбриональной сыворотки коров при 28°С.

Механическое воздействие на клетки

Для этих экспериментов использовались две клеточные линии - ROS 17/2.8 и ХТН-2. Для механического растяжения клеток были использованы силиконовые камеры. Камеры закреплялись в специальном устройстве, разработанном в лаборатории Dr. Bereiter-Hahn'a (Германия), позволяющем проводить дозированное однократное или циклическое растяжение. Установленная в устройстве для растяжения камера показана на рис. 1 Пе

Рис. 1. Устройство для дозиро-ваниого растяжения клеток ред началом опыта, клетки высевали на силиконовые подложки и выдерживали в течение ночи е среде того же состава, который применялся и для их культивирования в С02 - инкубаторе. В случае однократного растяжения клетки растягивались на 15% первоначальной длины. Это значение соответствует физиологическому для клеток линии ХТН-2 и значительно превосходит физиологическое для клеток линии ROS. Циклическое растяжение проводилось по следующей схеме: однократное растяжение длительностью 45 минут и далее - 10 циклов растяжения в течение 15 минут - расслабления в течение 45 минут. Циклически клетки растягивались на 10% первоначальной длины.

Исследование внутриклеточной подвижности с помощью сканирующего акустического микроскопа

Метод сканирующей акустической микроскопии позволяет проводить прижизненные, не повреждающие клетку исследования. Это дает возможность изучать изменения, происходящие в течение всего опыта в одной и той же клетке. Сканирующие акустические микроскопические исследования были выполнены с помощью ELSAM (Leitz, Wetzwar, Germany). Использовался метод оценки акустических параметров клеток в культуре, разработанный Bereiter-Hahn и Buhlesm (Bereiter-Hahn and Buhlesm, 1987). Клетки, культивируемые на эластичной силиконовой мембране, помещали под линзу акустического микроскопа и получали изображения одной клетки при частоте звука 1.3 Гц.

Сканирующий акустический микроскоп функционирует на основе сравнительного анализа интерференционных картин, формируемых при взаимодействии ультразвуковых колебаний с клеткой. Интерференционная картина определяется такими параметрами клетки, как характеристики клеточной мембраны, вязкость и акустическая проницаемость цитоплазмы, форма клетки, структура цитоскелета (Hildeband and Rugar, 1984; Bereiter-Hahn and Buhlesm, 1987). Итоговая интерференционная картина зависит от большого количества параметров и трудно интерпретируема. Более информативным является сравнение интерференционных картин, полученных через короткие промежутки времени (10 сек.). В этом случае возможно выявить те участки клетки, в которых происходят наиболее интенсивные изменения. В результате компьютерной обработки, разность интерференционных картин преобразуется в изображение клетки, на котором более тем

Определение внутриклеточной подвижности с помощью сканирующего акустического микроскопа

1. Облучение клетки потоком звуковых волн формирует интерференционную картину Ы< у"

10 сек яд

Шт

3. На полученном изображении более темные области соответствуют более сильным различиям, не. Указывают на те участки клетки, где происходят наибольшие изменения

2. Два изображения, полученные для одной и той же клетки с интервалом 10 сек сравниваются между собой. После компьютерной обработки формируется изображение клетки

- К

4, Расчеты по приведенной на формуле позволяют подучить численную характеристику интенсивности изменений (параметр К)

Рис. 2. Принцип акустической микроскопипии клеток - О О

X - интенсивность серого цвета

-той точки изображения.^0-255)

IIX.) - частота повторяемости 1-гозначенця интенсивности цвета

X - среднее значение фона А - площадь, изображения К — |аа-лд|-|ио-ло) |

Величины с индексом а'относятся к исследуемой области изображения, с индексом V - к фону

Рис. 3. Формула для расчета параметра К иые области соответствуют участкам, в которых выявились наиболее существенные различия. и в которых, соответственно, происходят наиболее существенные изменения (рис.2). Для количественного выражения происходящих в исследуемой области клетки изменений по алгоритму предложенному Вепе1ег-На1ш рассчитывали статистическую функцию изменения механических параметров клетки (параметр К), характеризующую внутриклеточную подвижность (Вепегег-НаНп апс! ВиЫеэт, 1987). Методика расчета и формулы приведены рис 3.

Измерения параметра К проводились через 5, 10, 15, 20, 30 и 60 минут после растя-кения в одном направлении на 15%.

Окрашивание клеток на Ф-актин

Для количественного и качественного определения Ф-актина клетки ополаскивали >аствором ФБР и фиксировали 50 мин в 4% растворе формальдегида. Затем отмывали в ечении 1 часа в растворе ФБР (смена раствора каждые 10 мин) и окрашивали тритс-эаллоидином (0.25 мг на чашку Петри диаметром 3.5 см) в течение 1 часа. Затем отмы-али в течении часа. Клетки изучали под флуоресцентным микроскопом и фотографи-овали, либо получали изображения с помощью сканирующего конфокального микрокопа.

Для определения количества Ф-актина из окрашенных клеток экстрагировали тритс-фаллоидин, добавляя по 2 мл метанола к каждой камере с клетками (на 2 часа в темноте). Затем метанол собирали в эппендорфы, а поверхность еще раз споласкивали 0.5 мл метанола.

Объем экстракта доводили до 2 мл метанолом и помещали в пластиковые кюветы. Измерения проводили при длине волны входящего излучения 542 нм, выходящего 563 нм.

Для определения количества ДНК в пробах после экстракции метанолом поверхность чашки или силиконовой камеры высушивали на воздухе и ополаскивали 1 раз ФБР. На 10 мин дабавляли 2 мл окрашивающего раствора Hoechst (0.5 мг/мл стокового раствора растворить в 70% метаноле в соотношении 1:200). Промывали 3 раза ФБР, снимали клетки с помощью резинового скребка и разрушали ультразвуком 3 раза по 5 секунд.

Измеряли количество ДНК на флуоспектрометре (длина волны входящего излучения - 360 нм, выходящего - 480 нм), выставляя ноль по ФБР. Количество Ф-актина в пробе определяли как отношение флуоресценции экстрагируемого тритс-фаллоидина к флуоресценции окрашенной Hoechst ДНК. Результаты определяли как отношение интенсивности флуоресценции Ф-актина клеток подвергшихся растяжению к флуоресценции Ф-актина контрольных клеток, выраженное в процентах.

Фиксация и окрашивание клеток проводились через 5, 10 , 15, 30, 60 минут после растяжения.

Определение активности щелочной фосфатазы

Активность щелочной фосфатазы определяли в клеточном лизате. Клетки споласкивали от остатков культуральной среды тремя порциями по 5 мл ФБР, заливали 2 мл ФБР и снимали с подложки резиновым скребком. Суспензию клеток разрушали ультразвуком 3 раза по 5 секунд. Аликвоту суспензии разрушенных клеток объемом 50 мкл смешивали с лидирующим буфером (1,5 М три-HCl, pH 9,2; 1мМ ZnCl2; 1 мМ MgCl2; 1% Тритон X-100) в соотношении 1:1 и оставляли на 10 минут при 37°С. К лизату добавляли 900 мкл 7 мМ раствора р-нитрофенилфосфата (Sigma, США) в лизирующем буфере. Содержание рнитрофенола измеряли через 15 минут по поглощению на длине волны 410 нм. Калибровочная кривая строилась по раствору р-нитрофенола в лизирующем буфере.

Активность щелочной фосфатазы оценивалась в расчете на 1 мг белка. Содержание белка измеряли по Бредфорду.

Выделение и очистка коллагенов

Коллагены из кожи крыс (I и III типы коллагена) и плаценты человека (коллагены I, III, IV) выделяли по описанной в литературе методике (Miller and Rhodes, 1982). Для повышения степени чистоты препаратов коллагена были добавлены две стадии хрома-тографической очистки - гель-хроматография на Сефакрил S-300 и ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. Все операции проводили при 4°С. а. Экстракция коллагенов из кожи крыс.

Для получения коллагенов 1 и III, содержащих телопептиды, были использованы шкуры крыс с искусственно вызванным латиризмом. Латиризм вызывали добавкой к рациону животных b-аминопропионитрила в количестве 10 мг на животное ежедневно в течение недели. После забоя, шкуры снимали, механически очищали от подкожной клетчатки и волосяного покрова и гомогенизировали в 0,5 М уксусной кислоте. К гомогенату добавляли 0,5 М уксусную кислоту из расчета 500 мл на 100 г. шкур и экстрагировали 24 ч при постоянном перемешивании. б. Экстракция коллагенов из плаценты человека.

Молекулы коллагена сшиты между собой устойчивыми ковалентными связями, расположенными в области концевых фрагментов молекулы (телопептидов). Поэтому, для выделения коллагена из ткани может потребоваться ферементативное отщепление тело-пептидов. Коллагены типов I, III и IV экстрагировали из плаценты человека обработкой пепсином, так как этот фермент гидролизует телопептиды и не затрагивает спиральные участки коллагенов. Отмытую от крови плаценту гомогенизировали в 0,5 М уксусной кислоте. К гомогенату добавляли 0,5 М уксусную кислоту (с подведенным соляной кислотой pH 2,0), содержащую пепсин в концентрации 0,5 г /100 мл из расчета 500 мл на 100 г ткани и экстрагировали 48 ч при постоянном перемешивании.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Садофьев, Леонид Аполлонович

выводы

3. Метод аффинной хроматографии на коллагенах разных типов в сочетании с имму-ноблотингом с использованием собственных и коммерческих антител позволил доказать, что a2ßl интегрин способен распознавать I и III типы коллагена.

БЛАГОДАРНОСТИ

Ог. Ирене Каждан (Пенсильванский университет, США) за предоставленные клеточные линии к.б.н. Наталье Сергеевне Николаенко (ИНЦРАН) за методическую помощь и ценный вклад в обсуждение результатов

Анастасии Юрьевне Молодых (Биолого-почвенный факультет СПбГУ за методическую помощь)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Садофьев, Леонид Аполлонович, Санкт-Петербург

1. Лебедев Д. А. 1979. Коллагеновые структуры одна из информационных систем организма. Успехи совр.биологин, 88, 36-48

2. Садофьев Л. А., Молодых А. Ю. Николаем ко Н. С., Подгорная О. И. Коллаген-евя-зывающие белки мембран соединительно-тканных клеток.//Цнтология 1997. Т. 39, N1. С.15-18

3. Садофьев Л. А., Подгорная О. И. Днфференцировка остеогенных клеток в культуре (обзор). //Цитология 1999. Т41, N10 С. 877-885

4. Торбенко Н. Г., Карсавина В. А. 1977. Функциональная биохимия костной ткани. М, Наука, 41% с.

5. Урусов А. Г., Садофьев Л. А., Подгорная О. И. Два белка в составе ядерного матрик-са связываются с промотором гена остеопонтина.// Цитология. 1998. Т.40, N7 С. 627-632.

6. S.Albelda S.V., Buck С. А., 1990. inicgrins and other eel! adhesion molecules. FASEB J., 4, 2868-2880,

7. Archer Т.К., Lefebvre P., Wolford R. G., Hager G. L. 1992. Transcription factor loading on the MMTy promoter: a bimodal mechanism for promoter activation. Science. 255: 1573-1576

8. Andrionario A.G., Robinson J. A., Mann K.G., Tracy R.P. 1992. Growth on type 1 collagen promotes expression of the osteoblastic phenotype in human osteosarcoma MG-63 cells. J. of Cell Physiol. 153: 256-265.

9. Banes A.J., Truzaki M., Yamamoto J., Fischer Т., Brigman В., Brown Т., Miller L. 1995. Mechanoreception at the cellular level: the detection, interpretation, and diversity of responses to mechanical signals. Biochem. Cell Biol. 73: 349-365

10. Be!oussov L. V., Saveliev S. V., Naudimi 1.1., Novoselov V. V. 1994. Mechanical stresses in embryonic tissues: patterns, morphogenetic role, and involvement in regulatory feedback. In:

11. Beresford J. N., Joyner C. J., Devlin C., Triffitt J. T. 1994. The effects of dexamethasone and 1,25-dihydroxyvitamin D3 on osteogenic differentiaton of human marrow stromal cells in vitro. Arch. Oral. Biol. 39: 941-947

12. Bidwell J.P., van Wijen A.J., Few E.G., Dworetsky S., Penman S., Stein J.L., Lian J. B., Stein G. S, 1993. Osteocalcin gene promoter-binding factors are tissue-specific nuclear matrix components. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 90: 3162-3166.

13. Bos M P, van der Meer J.M., Harrmann-Erlee M.P. 1994. Regulation of protein kinase C activity by phorbol ester, thrombin, parathyroid hormone and transforming growth factor-beta 2 in different types of osteoblastic cells. Bone Miner. 26: 141-154.

14. Boudreau N., Myers C., Bissel Mj. 1995. From laminin to lamin: regulation of tissue-specific gei>e expression by the ECM. Trends Cell Biol., 5, 1-4

15. Buck C.F., Horwitz A.F., 1987. Cell surface receptors for extracellular matrix proteins. Ann Rev QellBiol., 3, 179-205.

16. Carvalcho R.S., Scott J.E., Yen E.H. 1995. The effects of mechanical stimulation on the distribution of J31 integrin expession of |31-integrin mRNA in TE-85 human osteosarcoma cells. Arch. Oral. Biol., 40, 257-64.

17. Chicurel M. E,, Singer R. H., Christian J. M., Ingber D. E. 1998. Integrin binding and mechanical tension induce movement of mRNA and ribosomes to focal adhesions. Nature. 392: 730-733.

18. Dedchar S, Ruoslahti E, Pierchbacher M.D. 1987. A cell surface receptor complex for collagen type I recognizes the Arg-Gly-Asp sequence. J.Cell Biol. 104: 585-593.

19. Elices M.J., Hemler M.E., 1989. The human integrin VLA-2 is a collagen receptor on some cells and a collagen/laminin receptor on others. Proc Natl Acad Sci USA, 86, 9906-9910.

20. Elices M.J., Urry L.A., Hemler M.E., 1991. Receptor function for the integrin VLA-3: Fibronectin, collagen, and laminin binding are differentially influenced by Arg-Gly-Asp peptide and divalent cations. J Cell Biol., 112, 169-181.

21. Franceschi R.T., Iyer B.S., and Cui Y. 1994. Effects of ascorbic acid on collagen matrix formation and osteoblast differentiation in murine MC3T3-E1 cells. J. Bone Miner. Res. 9: 843854

22. GodschalkM., Levy J.R., Downs RW. 1992. Glucocorticoids decrease vitamin D receptor number ancj gene expression in human osteosarcoma cells. J. Bone Miner. Res. 7: 21-27

23. Green E., Todd B., Heath D. 1990. Mechanism of glucocorticoid regulation of alkaline phosphatase gene expression in osteoblas-like cells. Eur. J. Biochem. 188: 147-53

24. Harter L. V,,Hruska K. A.,Duncan R. L. 1995. Human osteoblast-like cells respond to mechanical strain with increased bone matrix protein production independent of hormonal regulation. Endocrinology, 36, 528-35

25. Hasegawa S., Sato S., Saito S., Suzuki Y., Brunette D.M. 1985. Mechanical stretching increases the number cultured bone cells synthesizing DNA and alters their pattern of protein synthesis. Calcif. Tissue Int. 37: 431-436.

26. Holger Luers, Kristian Hillmann, Jerzy L-itniewski, and J. Bereiter-Hahn (1992) Acoustic microscopy of cultured cells. Cell Biophisics 32, 279-293

27. Hynes RO., 1992. Integrins: Versatility, Modulation, and Signaling in Cell Adhesion. Cell, 69, 11-25.

28. Ingber D. E. Integrins as mechanochemical transducers. 1991. Curr. Op. in Cell Biol. 3: 841-848.35.1ngber D.E. 1993a. Cellular tensegrity: defining new rules of biological design that govern the cytoskeleton. J. Cell Sci. 104: 613-627

29. Ingber D. E. 1997. Tensegrity: the architectural basis of cellular mechanotransduction. Annu. Rev. Physiol., 59, 575-599.

30. Kawase T., Suzuki A. 1990. Initial responces of a clonal osteoblast like cell line, MOB 34, to phosphatidic acid in vitro. Bone Miner. 10: 61-70.

31. Keene D.R., Sakai L.Y., Bachinger H.P.,. Burgeson R E. 1987. Type III Collagen Can be Present on Banded Collagen Fibrills Regardless of Fibril Diametr. J. Cell Biol., 105, 2393-2398.

32. Kern A., Marcantonio E.E., 1998. Role of the I-domain in collagen binding specificity and activation of the integrins albl and a2bl. J Cell Physiol 176, 634-641.

33. Kono T., Furukawa M., Tanii T., Kitajima J., Mizuno N., Ishii M., Hamada T. 1990. Contraction phenomenon of type I collagen gel by melanoma cells. Acta Derm Venerol. 70:185188.

34. Kubota T., Yamauchi M., Onozaki J., Sato S., Suzuki Y., Sodek J. 1993. Influence of an intermittent compressive force on matrix protein expression by ROS 17/2.8, with selective stimulation of osteopontin. Arch. Oral. Biol, 38, 23-30.

35. Kurosaka H., Kurosaka D., Kato K., Mashima Y., Tanaka Y. 1998. Transforming growth factor-beta 1 promotes contraction of collagen gel by bovine corneal fibroblasts through differentiation of myofibroblasts. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39: 699-704.

36. Laemmli U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 22, 680-685.

37. LeeH. L., Archer T. K. 1994. Nucleosome-mediated disruption of transcription factor-chromatin initiation complexes at the mouse mammary tumor virus long terminal repeat in vivo. Mol. Cell. Biol. 14: 32-41

38. Majeska RJ, Rodan SB, Rodan GA 1978. Maintenance of parathyroid hormone response in clonal rat osteosarcoma lines. Exp. Cell Res., 111(2), 465-468

39. Maniotis A. J., Bojanowski K., and Ingber D. E. 1997a. Mechanical community and reversible phromosome dissasembly within intact genomes removed from living cells. J. cell. Biochem. 64: 1-17.

40. Maniotis A. J., Chen S. C., and Ingber D. E. 1997b. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 94, 849-854.

41. McCabe L.R.; Last T. J.; Lynch M.; Lian J.; Stein J.; Stein G. 1994. Expression of cell growth and bone phenotypic genes during the cell cycle of normal diploid osteoblasts and osteosarcoma cells. J. Cell. Biochem. 56(2): 274-82.

42. Miller E.J., Rhodes K., 1982. Preparation and characterization of the different types of collagen. Ivjeth InEnzymol., 82, 33-64.

43. Moir R. D., Spann T. P., Goldman R. D. 1995. The dynamic properties and possible functions of nuclear Jamins. In: Structural and functional organization of the nuclear matrix. San Diego: Academic Press, 162B: 141-184.

44. Mollenchauer J., Bee J. A., Lizarbe M.A., von den Mark K., 1984. Role of anchorin CII, a 31,000 molecular weight membrane protein, in the interaction of chondrocytes with type II collagen. J Cell Biol., 98, 1572-1578.

45. Nickerson J. A., Blencowe B. J., Penman S. 1995. The architectural organization of nuclear metabolisrp. In: Structural and functional organization of the nuclear matrix. San Diego: Academic Press, 162A: 67-124.

46. Ohno S. 1995. Active Sites of Ligands and Their Receptors Are Made of Common Peptides That Are Also Found Elsewhere J. Mol. Evol., 40, 102-106.

47. Pead M.J., Lanyon L.E. 1989. Indomethacin modulation of load-related stimulation of new bone formation in vivo. Calcif. Tissue Int. 45: 34-40

48. PistoneM., Sanguineti C., Federici A., Sanguineti F., Defilippi P., Santolini F., Querze G., Marchisio P.C., and Manduca P. 1996. Integrin syntesis and utilization in cultured human osteoblasts. Cell Biol. Inter., 20: 471-479.

49. Rickard D.J., T.A.Sullivan, B.J.Shenker, P.S.Leboy, I.Kazhdan. 1994. Induction of rapid osteoblast differentiation in rat bone marrow stromal cell cultures by dexamethasone and BMP-2. Devel.Biol. 161: 218-228.

50. Roskelly C. D., Srebrow A. andBissellM. 1995. A hierarchy of ESM-mediated signalling regulates tissue-specific gene expression. Current opinion in cell biology. 7: 736-747.

51. Sadofiev L. A., Nikolaenko N. S., KalmykovaN. V., Podgornaya O. I. Cell-type depending collagen type recognition by cell receptors// Cell Biol. Int. (in press, CBI 328).

52. Schimdhauser C., Bissel M.J, Myers C. A., Casperson G. F. 1990. Extracellular matrix and hormpnes transcriptionally regulate bovine beta-casein 5' sequences in stably transfected mouse mammary cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 9118-9122.

53. Schim4hauser C. CaspersonG. F„ MyersC. A., Sanzo K. T., Bolten S., BisselM. J. 1992. A novel transcriptional enchancer is involved in the prolactin and ECM-dependent regulation of beta-casein gene expression. Mol. Biol. Cell 3: 699-709

54. Schinidhauser C., Casperson G. F , Bissel M. J. 1994. Transcriptional activation by viral enchancers: critical dependence on extracellular matrix-cell interactions in mammary epithelial cells. Mol. Carcinogen. 10: 55-71

55. Shopman, R.L., Traub, P. 1990. The in vitro DNA-binding properties of purified nuclear lamin proteins and vimentin. J. Biol. Chem. 265: 9055-9061.

56. SodeJi J., KimR. H.,Ogata Y.,Li J.,YamauchiM., Zhang Q., FreedmanL. P. 1995. Regulation of bone sialoprotein gene transcription by steroid hormones. Connect. Tissue Res. 32: 209-217

57. Song L. N. 1994. Effects of retinoic acid and dexamethasone on proliferation, differentiation, and glucocorticoid receptor expression in cultured human osteosarcoma cells. Oncol. Res. 6: 111-118.

58. Stein G. S., van Wayen A. J., Stein J. 1995. Contributions of nuclear architecture to transcriptional control. Int. Rev. of Cytology. 162A: 251- 278.

59. Takeuchi Y., Nakayama K., Mansumoto T. 1996. Differentiation and cell surface expression of transforming growth factor-receptors are regulated by interaction with matrix collagen in murine osteoblast cells. J. Biol. Chem. 271: 3938-3944

60. Takuwa Y., Ohue Y., TakuwaN., Yamashita K. 1989. Endothelin-1 activates phospholipase C and mobilizes Ca2+ from extra- and intracellular pools in osteoblasitc cells. Am. J.Physiol. 257: 797-803.

61. WangN., Butler J. P., Ingber D. E. 1993. Mechanotransduction across the cell surface and through thp cytoskeleton. Science, 260, 1124-1127.

62. Xing Y., Johnson C. V., Dobner P. R., Lawrence J. B. 1993. Higher level organization of individual gene transcription and RNA splicing. Science. 259: 1326-1330.

63. Yamada K.M. 1983. Cell Interactions and Development: Molecular Mechanisms. New York., J. Wiley and Sons, 518 c.

64. Yamamoto M., Nakamura H., Yamato M., Aoyagi M., Yamamoto K. 1996. Retardation of phenotypic transition of rabbit arterial smooth muscle cells in three-dimensional primary culture. Exp. Cell Res., 225, 12-21

Информация о работе

Садофьев, Леонид Аполлонович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.25

Диссертация

Реакция остеогенных клеток на механическое воздействие и специфичность их рецепторов к компонентам внеклеточного матрикса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Реакция остеогенных клеток на механическое воздействие и специфичность их рецепторов к компонентам внеклеточного матрикса - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы