Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологическое и авторадиографическое исследование регенерирующей чешуи у Carassius auratus

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфологическое и авторадиографическое исследование регенерирующей чешуи у Carassius auratus"

На правах рукописи

СИДОРОВА ЕКАТЕРИНА ИГОРЕВНА

МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ И АВТОРАДИОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ ЧЕШУИ У Carassшs auratus

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре клеточной биологии и гистологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент

Ланге Мария Александровна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Галактионов Вадим Гелиевич

кандидат биологических наук Павлов Дмитрий Александрович

Ведущая организация Всероссийский научно-исследовательский

институт рыбного хозяйства и океанографии (ВНИИРО)

Защита состоится «_»_2004 года в 15 часов 30 минут на заседании

Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд._

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Калистратова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время внимание многих исследователей привлекает проблема гистогенеза тканей внутренней среды, и в частности, костной ткани, что определяется их важной ролью в различных физиологических и патологических процессах. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в этой области, существует много принципиальных вопросов, требующих детального исследования. К ним относится проблема гистогенетических взаимоотношений гемальных и стромальных элементов в системе тканей внутренней среды, а также анализ структур и факторов, ответственных за их дифференцировку. Существуют современные рабош, прямо указывающие на общность происхождения кроветворных и стромальных элементов, однако широко распространена точка зрения о существовании разных источников формирования клеток, выполняющих защитно-трофические (гемальные элементы) и опорные функции (истинные механоциты). Для решения этого вопроса используются разнообразные методические подходы, однако, многие проблемы не подлежат в настоящее время прямому экспериментальному исследованию. Необходим поиск новых моделей, которые позволят не только решить ряд конкретных гистологических задач, но подведут к пониманию многих общебиологических проблем. Одним из перспективных приемов является сравнительное изучение гистогенеза тканей внутренней среды у животных разных таксономических групп с использованием современных методов цитологического анализа, широко вошедших в практику работы с млекопитающими.

Н.Г. Хрущевым (1973) было высказано предположение о существовании двух популяций фибробластов в соединительной ткани млекопитающих. Одна из них характеризуется быстрым обновлением, участвует в регенерации соединительной ткани (фибробласты защитно-трофического типа), другая популяция — долгоживущая — выполняет преимущественно опорные функции. В многочисленных работах, выполненных на млекопитающих, было показано, что в рыхлой волокнистой соединительной ткани существует популяция

фибробластов, клетки которой в определенных условиях могут дифференцироваться в остеогенные элементы. В результате деятельности этих клеток формируется типичная костная ткань (Фриденштейн, 1952, 1973). Подобное образование костной ткани в нехарактерном для нее месте получило название эктопический остеогенез, причина которого до настоящего времени не выяснена.

Костная чешуя рыб является уникальным, естественным примером образования костной ткани на основе соединительнотканной дермы и может с успехом служить модельной системой для исследования-фундаментальных проблем остеогенеза у млекопитающих. К сожалению, в литературе встречается немного работ, посвященных исследованию особенностей организации, роста и регенерации костной (так называемой эласмоидной) чешуи рыб. В основном они носят описательный характер и выполнены преимущественно с использованием морфологических методов анализа, практически не охарактеризованы клетки, формирующие костные пластинки чешуи, нет единого мнения в вопросе их происхождения. В связи с этим, объектом данного исследования была выбрана модель регенерации костной чешуи рыб после ее механического удаления, так как в этих условиях появляется возможность в короткий срок проследить последовательные этапы образования костных пластинок чешуи, морфологически и гистохимически охарактеризовать клетки остеогенного ряда, участвующие в их формировании. Кроме этого, использование методов клеточной маркировки (Н3-тимидиновая авторадиография) позволит оценить уровень пролиферации клеток остеогенного ряда, исследовать скорость их обновления, а также выявить источники их новообразования.

Целью исследования явился анализ последовательных этапов образования костных пластинок эласмоидной чешуи после ее механического удаления, морфологическая (гистологическая, электронномикроскопическая и гистохимическая) характеристика клеток, участвующих в формировании костных пластинок; а также оценка уровня их пролиферации и выявление

источников новообразования остеогенных элементов с помощью метода Н3-

тимидиновой авторадиографии.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать последовательные этапы и скорость формирования костных пластинок эласмоидной чешуи после ее механического удаления, используя классические гистологические методы.

2. Дать морфологическую (на светооптическом и электронномикроскопическом уровне) характеристику клеткам, ответственным за восстановление костных пластинок эласмоидной чешуи в разные сроки после начала регенерации.

3. Выявить клетки, осуществляющие кальцинацию межклеточного матрикса регенерирующей чешуи с помощью реакции на щелочную фосфатазу, и на электронномикроскопическом уровне.

4. С помощью метода Н3-тимидиновой авторадиографии оценить уровень пролиферации клеток чешуйного кармана и местной соединительной ткани, а также охарактеризовать скорость обновления остеотенных элементов и выявить источники их новообразования.

Научная новизна работы. Впервые с помощью метода Н^-шмидиновой авторадиографии показано, что в ходе регенерации костной чешуи после ее механического удаления активная пролиферация предшественников остеогенных элементов происходит за пределами подкожной соединительной ткани, в кроветворном органе рыб - почке. Впоследствии эти клетки мигрируют с током крови в очаг новообразования чешуи, где снижают уровень пролиферации и завершают процессы дифференцировки. По морфологическим

и функциональным признакам остеогснные элементы (преостеобласты, остеобласты, остеоциты) аналогичны клеткам костной ткани млекопитающих. Полное восстановление эласмоидной чешуи после ее механического удаления происходит в короткие сроки, за 14 дней формируется 7 костных пластинок.

Данные настоящей работы существенно дополняют современные представления об особенностях организации костной чешуи рыб, механизмах гистогенеза костной ткани у животных разных таксономических групп.

Практическое значение работы. Модель регенерации костной чешуи после ее механического удаления может быть рекомендована в практике для исследований особенностей остсогенеза у млекопитающих. Результаты настоящего исследования о закономерностях восстановления костной чешуи после ее механического удаления позволяют получать более объективную информацию о физиологическом состоянии рыб. Полученные в работе данные об особенностях организации и закономерностях регенерации костной чешуи могут быть использованы в лекционных курсах по гистологии, ихтиологии и сравнительной зоологии.

Апробация работы. Результаты проделанной работы были изложены на конференциях «Проблемы эволюционной и экологической морфологии» в 2001 году, «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы» в 2003 году, на семинарах Института Биологии Развития им. Н.К. Кольцова и кафедры клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова в 2001-2004 годах.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 печатные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2-х глав результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Иллюстративный материал представлен 4 таблицами и 37 рисунками. Список литературы содержит 97 наименований цитированной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы.

Объектом настоящего исследования служили сеголетки золотых аквариумных рыбок (Carassius auratus). Экспериментальную регенерацию вызывали удалением нескольких рядов чешуй, расположенных вдоль боковой линии.

Для морфологического анализа кусочки кожи фиксировали смесью формалин-спирт-ледяная уксусная кислота в соотношении 9:3:1 через 1-е, 3-й, 7-е и 14-и сутки после начала экспериментальной регенерации, материал декальцинировали в 10% ЭДТА в течение 3-х дней при 370С, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и хлороформе, заливали в парафин, получали срезы толщиной 4-7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, азаном по Гейденгайну. Для электронномикроскопического анализа на 7-ой и 14-ый день регенерации кусочки кожи фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом на какодилатном буфере (рН=7,3) в течение 2-х часов, дофиксировали контрастировали 0,5% уранилацетатом на 70%

спирте. После обезвоживания материал заливали в смесь эпона и аралдита. Готовили полутонкие срезы для прицельной заточки, окрашивали их метиленовым синим. Ультратонкие срезы, полученные на ультратоме LKBIII, дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу. Полученные срезы исследовали в электронный микроскоп JEM-100CX2.

Для гистохимического анализа (реакция на щелочную фосфагазу) использовался метод азосочетания с AS-B нафтолом. Кусочки кожи через 14 дней после начала регенерации, замораживали при получали

криостатные срезы толщиной 10-15 мкм. Срезы монтировали на стекла и покрывали смесью: нафтол - 25мг, ДМСО - 50мкл, трис (НС1)-буфер - 50мл (рН=9), прочный красный - 50мг. Реакцию проводили в течение 1 часа при окрашивали гематоксилином, заключали в глицерин-желатину.

Авторадиографическое_исследование. Для авторадиографического

исследования была использована выборка из 16 рыб, у которых вдоль боковой линии удаляли несколько рядов чешуй. Исследование проводили через 1, 3, 7, 14 дней после начала экспериментальной регенерации. Н3-тимидин (уд.акт. 1,8 мкКюри/мг) вводили рыбам внутримышечно из расчета 10 мкКюри на 1 г веса особи . Изотоп в зависимости от целей эксперимента вводился импульсно (за 3 часа до фиксации материала), либо предварительно (одновременно с удалением чешуйного покрова) (схема1). Кусочки кожи фиксировали смесью формалин-спирт-ледяная уксусная кислота (9:3:1), декальцинировали в 10% ЭДТА. обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и хлороформе, заливали в парафин, получали срезы толщиной 4-5 мкм.

Схема 1. Методика проведения эксперимента.

1 сутки* 3 сутки 7 сутки 14 сутки

\__2

Введение Нэ-тимидина за 3 часа до фиксации

Депарафинированные срезы после обработки 5% раствором трихлоруксусной кислоты, покрывали фотоэмульсией типа М, экспонировали при температуре в течение 4-х недель (Хрущов, 1969). После

фотообработки препараты тщательно промывали, срезы окрашивали гематоксилином. В разных участках регенерирующей пластинки подсчитывали

процент меченых клеток на 200 клеток (индекс мечения). Мечеными считались клетки, которые имели над ядром более 7-ми зерен автографа. Результаты подсчетов обрабатывались статистически. Достоверность различий показателей определяли с помощью ^критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Морфологическое и гистохимическое исследование регенерирующей чешуи.

Гистологической анализ срезов декальцинированной кожи рыб позволил детально изучить строение чешуйного покрова Carasius auratus (рис.1). Свободный конец чешуи покрыт эпителиальным чехлом, который входит в состав единого эпителиального пласта. Эпителий рыб - многослойный плоский неороговевающий, среди эпителиальных отмечается много слизистых клеток. Он отделен от чешуи тонкой прослойкой рыхлой волокнистой соедини тельной ткани, пронизанной многочисленными сосудами, обеспечивающими питание эпителиального пласта, и содержащей пигментные клетки. Основание каждой чешуи залегает в особом соединительнотканном чешуйном кармане, в котором обнаруживаются клетки, называемые либо склеробластами (Klaatsch, 1894), либо остеобластами (Meunier, 1984). Именно этим клеткам отводится ведущая роль в процессе формирования костных пластинок. Чешуя имеет отчетливо слоистое строение, пластинки отделены друг от друга соединительнотканными прослойками. Каждая пластинка завершается валиком, так называемым склеритом. Около склеритов находятся клетки, имеющие уплощенную форму.

Рис.1. Строение чешуйного покрова Caгassius auгatus. 1- чешуя; 2 - эпителий; 3 - подлежащая соединительная ткань (по Румянцеву, 1958).

Восстановление чешуйного покрова после его механического удаления. При анализе срезов кожи через сутки после удаления чешуи в чешуйном кармане обнаружена поврежденная соединительная ткань и разрушенный эпителий, признаков восстановления тканей поврежденной области не отмечено. Уже на третьи сутки регенерации в чешуйном кармане наблюдается скопление малодифференцированных клеток, веретеновидной формы, со слабо базофильной. цитоплазмой. Между клетками видна тонкая полоска базофильного материала, представленная коллагеновыми волокнами, то есть в это время начинается формирование межклеточного матрикса пластинок. Полученные нами данные согласуются с данными других исследователей, которые также отмечают подобные изменения в зоне новообразования чешуи (Frietshe, Bailey, 1980; Olson, Watabe, 1980). Через неделю после удаления чешуи в зоне чешуеобразования отчетливо видны первые сформированные пластинки, окруженные соединительной тканью, пронизанной сетью капилляров. При окраске срезов регенерирующей чешуи азаном по Гейденгайну пластинки в области чешуйного кармана имеют базофильную окраску, что свидетельствует об их коллагеновой природе, пластинки ближе к поверхности - оксифильны, видимо, уже кальцинированы.

Зона чешуйного кармана

Рис.2. Зона чешуеобразования на 7-е сутки регенерации.

На светооптическом уровне выявляются следующие клеточные популяции, которые имеют разную локализацию, различаются морфологически, и видимо, функционально: преостеобласты, остеобласты, остеоциты (Lowe, Stevens, 1991). Преостеобласты - клетки веретеновидной формы, располагаются в основании растущей чешуи, в области чешуйного кармана. Остеобласты, подстилающие растущую пластинку - крупные клетки кубической формы, имеют округлое ядро с рыхлым хроматином и ядрышко. Остеобласты на поверхности пластинок - клетки вытянутой формы, располагаются преимущественно в области склеритов (рис.2). Проведенное нами электронномикроскопическое исследование регенерирующей чешуи показало, что остеобласты растущей пластинки представляют собой клетки с большим количеством отростков, в цитоплазме которых хорошо развит гранулярный эндоплазматический ретикулум, присутствует система мелких везикул. В межклеточном пространстве отчетливо различимы коллагеновые волокна с характерной исчерченостью, что свидетельствует о способности этих клеток формировать межклеточный матрикс пластинок, подобно остеобластам млекопитающих. Полученные результаты морфологического исследования согласуются с данными Ланге, Новикова (2001), которые с помощью метода Н3-пролиновой авторадиографии показали способность остеобластов, подстилающих пластинки синтезировать компоненты межклеточного матрикса пластинок. На электронномикроскопическом уровне среди коллагеновых волокон хорошо видны кристаллы гидроксиапатита, что свидетельствует о начале кальцинации межклеточного матрикса пластинок. Такие же структуры на электронномикроскопическом уровне были обнаружены в растущей чешуе другими авторами (Maekawa, Yamada, 1970). Через две недели после удаления чешуи нами обнаружено, что большинство пластинок оксифильны, то есть уже полностью кальцинированы. Из литературы известно, что часть остеобластов рыб ответственна за кальцинацию межклеточного матрикса пластинок чешуи (Shonborner et. al., 1979). Для уточнения локализации этих

клеток нами была проведена реакция на щелочную фосфатазу, которая часто используется как маркер процессов кальцинации остеоида у млекопитающих. Оказалось, что остеобласты на поверхности пластинок в ее маргинальной части обладают выраженной реакцией на щелочную фосфатазу, этот факт свидетельствует о том, что кальцинация межклеточного матрикса пластинок происходит с поверхности. Остеобласты в области склеритов, где межклеточный матрикс уже кальцинирован, характеризуются слабовыраженной реакцией на щелочную фосфатазу. Необходимо отметить, что в случае интактной чешуи остеобласты обладают отрицательной реакцией на щелочную фосфатазу.

В условиях настоящего эксперимента через две недели после механического удаления чешуя полностью восстанавливается, при этом размер восстановленной чешуи соответствует размеру интактной. За это время сформировано 7 костных пластинок. На тотальных препаратах новообразованной чешуи в ее более глубокой части отчетливо видны остеоциты - уплощенные клетки, с большим количеством отростков, объединенные в единую сеть, по морфологическим признакам эти клетки аналогичны остеоцитам млекопитающих.

Таким образом, проведенный морфологический анализ регенерирующей чешуи костистых рыб, показал, что восстановление чешуйного покрова после его механического удаления происходит в короткие сроки, за две недели. Морфологические и функциональные признаки клеток, ответственных за формирование костных пластинок чешуи, позволяют отнести их к популяции остогенных элементов, составляющих костный дифферон. Преостеобласты располагаются в соединительной ткани чешуйного кармана; остеобласты, подстилающие пластинки, формируют межклеточный матрикс; остеобласты, располагающиеся на поверхности пластинок, кальцинируют межклеточный матрикс; в наиболее глубоких участках чешуи обнаруживаются остеоциты -замурованные в кальцинированный матрикс отросчатые клетки.

2. Авторадиографическое исследование.

Интактная чешуя.

Анализ автографов позволил установить, что индекс мечения клеток соединительнотканной дермы составляет 9,4%; преостеобластов 3,75%, остеобластов, подстилающих пластинки - 2,6%; остеобласты на поверхности пластинок, в области склеритов, изотоп практически не включали (рис.3,4, 5). Индекс мечения эпителиальных клеток составил 14,4%, причем меченые клетки встречаются не только в базальном, но и в вышележащих слоях эпителиального пласта. Такой уровень пролиферации клеток в области чешуйного кармана обеспечивают постоянный рост чешуи в онтогенезе.

1 сутки после удаления чешуи

Через сутки после удаления чешуи при импульсном введении изотопа наблюдается достоверное увеличение числа меченых клеток соединительной ткани (индекс мечения - 11,4%), что свидетельствует об активации местного резерва малодифференцированных клеток. При предварительном введении Н3-тимидина индекс мечения клеток соединительной ткани составляет 14%. Так как через сутки после удаления чешуи пластинки еще не сформированы, индекс мечения для всех популяций остеобластов был принят за 0%.

3 сутки регенерации

На 3-и сутки после удаления чешуи при импульсном введении изотопа наблюдается достоверное увеличение числа меченых клеток соединительной ткани (индекс мечения составил 14,6%), (рис.3). Наряду с этим при предварительном введении мечеными оказываются многие клетки соединительной ткани (индекс мечения - 22%), что свидетельствует о миграции новых клеток в зону чешуеобразования (рис.3). В это время наблюдается скопление преостеобластов, индекс мечения которых составляет при предварительном введении Н3-тимидина 20,6% (рис.4), при импульсном

введении изотопа - 7,7%. Полученные результаты подсчетов свидетельствуют, что на фоне продолжающейся пролиферации клеток местной соединительной ткани начинается миграция новых клеточных популяций в зону чешуеобразования. В это время пластинки еще не сформированы, поэтому индекс мечения остеобластов на внешней поверхности пластинки и остеобластов, подстилающих пластинки принят за 0%. Индекс мечения эпителиальных клеток при импульсном введении изотопа составляет 29,2%, что говорит об их активной пролиферации.

60-г 50 ••

импульсное введение Н3-тимидина предварительное введение Н3-тимидина контроль

Рис.3. Индекс мечения клеток соединительной ткани в разные сроки эксперимента.

7 сутки регенерации

Наиболее выраженные изменения происходят через неделю после удаления чешуи. Индекс мечения клеток соединительной ткани остается на том же уровне при импульсном введении изотопа (11,8%, рис.3), при этом резко возрастает количество пришлых элементов (предварительное введение изотопа, индекс мечения - 39,8%). Эти данные говорят о том, что происходит активная миграция клеток в зону образования пластинок, которые на светооптическом уровне уже хорошо различимы. Показатель индекса мечения преостеобластов при предварительном введении изотопа достоверно увеличивается (28,4%), что свидетельствует о миграции этих клеток в область чешуйного кармана, часть клеток сохраняет спсобность к делению, так как 13% клеток включают изотоп при импульсном введении изотопа (рис.4). Таким образом, на 7-е сутки регенерации наблюдается активная миграция клеток в зону чешуеобразования. При этом мигрирующие клетки способны пройти еще несколько делений перед окончательной дифференцировкой в остеобласты, индекс мечения которых также достоверно увеличивался при предварительном введении изотопа (12,6%). Важно отметить, что в зоне роста пластинок при предварительном введении изотопа появляется много слабо меченных клеток (до 80%), содержащих над ядрами 3-4 зерна автографа. Этот факт свидетельствует об активной пролиферации клеток предшественников остеогенных элементов за пределами местной соединительной ткани, что приводит к разведению метки. Единственным местом у рыб, где происходит столь активная пролиферация клеток, относящихся к системе тканей внутренней среды, является почка (Золотова, 1989). Индекс мечения эпителиальных клеток снижается и составляет 20,8%.

60 50 40

1с Зс время 7с 14с

импульсное введение Н3-тимидина предварительное введение Н*-тимидина контроль

Рис.4. Изменение индекса мечения преостеобластов в разные сроки эксперимента.

14 сутки регенерации

Через две недели после удаления чешуи чешуйный покров полностью восстановлен. Число меченых клеток соединительной ткани при предварительном введении изотопа достоверно снижается (индекс мечения составляет 18,2%), при импульсном введении изотопа индекс мечения клеток соединительной ткани не меняется (рис.3).

во

50 40

г« 30 20

импульсное введение Н3-тимидина ..3

предварительное введение Н -тимидина контроль

Рис.5. Изменение индекса мечения остеобластов в разные сроки эксперимента.

Индекс мечения преостеобластов при предварительном введении изотопа пластинки также достоверно снижается (18,2%), при импульсном введении Н3-тимидина индекс мечения составляет 6,7% (рис.4). Индекс мечения остеобластов при предварительном введении изотопа несколько возрастает (13,4%) (рис.5), при импульсном введении изотопа снижается (4,8%). Полученные данные свидетельствуют о том, что через две недели после механического удаления чешуи, когда чешуйный покров восстановлен, процессы активной пролиферации предшественников остеогенных элементов за пределами соединительной ткани и последующая их миграция в зону чешуеобразования постепенно затухают. Увеличение числа меченых остеобластов объясняется тем, что их популяция постоянно пополняется за счет созревания преостеобластов, источником которых являются фибробластоподобные клетки соединительной ткани (рис.6).

Рис.6. Индекс мечения (в%) клеток соединительной ткани, преостеобластов, остеобластов в разные сроки эксперимента при предварительном введении изотопа.

Таким образом, проведенные исследования позволяют предложить следующую схему событий, происходящих в ходе регенерации чешуи (рис.7)

Непосредственно после удаления чешуи в соединительной ткани активизируется местный резерв малодифференцированных клеток, способных к ограниченной пролиферации, который, однако, быстро истощается. Этот факт подтверждается данными авторадиографического анализа, которые говорят о том, что при импульсном введении изотопа индекс мечения клеток соединительной ткани увеличивается к 3-им суткам, а затем снижается к 7-м суткам регенерации (рис.3). Однако уровень их пролиферации явно недостаточен для поддержания активного роста пластинок.

Гемопоэтический Кровь Зона

островок почки чешуеобразования

»С-* —

»» V-.—-• ®

<55*' Ограниченная

Миграция пролиферация

Активная пролиферация г малодифференцированных

предшественников клеток остеогенных элементов

Рис.7. Гипотетическая схема происходящих событий в ходе регенерации эласмоидной чешуи.

Известно, что у млекопитающих индекс тимидиновой метки в участках активного роста костной ткани составляет не менее 30% (Фриденштейн, Лалыкина, 1973). Параллельно с активизацией местного резерва клеток соединительной ткани на 3-7 сутки регенерации происходит миграция предшественников остеогенных элементов из кроветворного органа рыб -почки, где эти клетки активно делятся. Именно в это время происходит интенсивный рост пластинок, для поддержания которого необходимы все новые популяции остеогенных элементов. В зоне чешуеобразования предшественники остеогенных элементов проходят ограниченное число делений перед окончательной дифференцировкой в остеобласты. Остеобласты, подстилающие пластинки, по многим морфологическим признакам аналогичны остеобластам млекопитающих, они формируют межклеточный матрикс пластинки. Остеобласты на поверхности пластинок кальцинируют межклеточный матрикс, что было показано с помощью реакции на щелочную фосфатазу и электронномикроскопически. К 14-м суткам чешуйный покров восстанавливается, индекс мечения всех клеточных категорий при импульсном

и предварительном введении изотопа снижается. В это время практически все пластинки чешуи кальцинированы, и новообразованная чешуя легко удаляется. За две недели формируется 7 костных пластинок, то есть за 2 дня образуется 1 костная пластинка. В наиболее глубокой части новообразованной чешуи выявляются полностью дифференцированные остеогенные элементы -остеоциты, не способные к делению. После полного восстановления чешуйного покрова в соединительной ткани чешуйного кармана остается запас малодифференцированных клеток, обеспечивающих постоянный рост чешуи в онтогенезе.

Проведенное морфологическое, гистохимическое и авторадиографическое исследование регенерирующей костной чешуи позволяют заключить, что у рыб существует популяция быстрообновляющихся, короткоживущих предшественников остеогенных элементов, способных в короткий срок мигрировать в зону повреждения из почки, завершить дифференцировку и начать усиленный синтез межклеточного матрикса. Популяция предшественников остеогенных элементов по характеру обновления аналогична быстрообновляющейся популяции фибробластоподобных элементов, участвующих в заживлении кожных ран у рыб (Золотова, 1989; Гревати, 1991). Таким образом, у рыб существует единая камбиальная система клеток всех типов соединительных тканей, территориально объединенная с кроветворной тканью. Этот факт находит и генетическое подтверждение, основанное на проявлении одной из мутаций карпа обыкновенного. Известно, что сплошной чешуйный покров у карпа, доминирующий над зеркальным типом, определяется двумя парами аутосомных, не сцепленных друг с другом генов, ответственных за характер чешуйного покрова ^ЫЫ, ssnn). При этом гомозиготные особи, несущие рецессивный ген бесчешуйности, нежизнеспособны и погибают на стадии вылупления, гетерозиготы по гену N жизнеспособны, но в большом проценте случаев имеют нарушения покрова, осевого скелета и системы кроветворения и иммунодефицитны (Кирпичников, 1987).

Выводы

1. Полное восстановление чешуи после ее механического удаления происходит за две недели, при этом 1 костная пластинка формируется 2 дня.

2. По морфологическим и функциональным, признакам клетки, формирующие костные пластинки чешуи, являются остсогснными элементами. Выявлены малодифференцированные, способные к делению преостеобласты, а также остеобласты, синтезирующие межклеточный матрикс и впоследствии его кальцинирующие.

3. Остеобласты, выполняющие разные функции разобщены территориально. Так, клетки нижней поверхности пластинки синтезируют межклеточный матрикс, элементы, находящиеся на поверхности, ответственны за его кальцинацию.

4. Авторадиографически показано, что остеогенные элементы, участвующие в чешуеобразовании у рыб, являются быстрообновляющейся клеточной системой, включающей активно-пролиферирующие предшественники, локализованные за пределами местной соединительной ткани (видимо, в органах гемопоэза), с током крови мигрирующие в очаг новообразования чешуи, где постепенно снижают потенции к делению и завершают процессы дифференцировки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.Сидорова Е.И., Ланге МА., Головина Н.А. «Патологии печени осетровых рыб как результат использования токсических кормов в пресноводной аквакультуре»// Тезисы III международной конференции «Экополис-2000: экология и устойчивое развитие города» (Москва, 24-25 ноября 2000 г.), с.225-226.

2.Сидорова Е.И., Ланге М.А. «Изучение регенерации чешуи костистых рыб»//Материалы школы-семинара «Проблемы эволюционной и экологической морфологии» (Москва, 15-16 мая 2001г.), с.14-15.

3. Сидорова Е.И., Ланге М.А. «Исследование регенерации эласмоидной чешуи»// Тезисы конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы» (Москва, 22-24 октября 2003г.), с. 127-128.

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 495, тираж 100 экз. Подписано в печать 12.04.2004 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сидорова, Екатерина Игоревна

Ввведение.

Цели и задачи.

Обзор литературы

Особенности строения покровов костистых рыб.

Развитие чешуйного покрова в онтогенезе.

Регенерация эласмоидной чешуи и костных лучей хвостового плавника у костистых рыб.

Регуляция роста эласмоидной чешуи.

Материалы и методы.

Результаты и их обсуждение

Глава I. Морфологическое и гистохимическое исследование регенерирующей чешуи.

Интактная чешуя.

Восстановление чешуйного покрова после его механического удаления.

Глава II. Авторадиографическое исследование.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфологическое и авторадиографическое исследование регенерирующей чешуи у Carassius auratus"

В настоящее время внимание многих исследователей привлекает проблема гистогенеза тканей внутренней среды, и в частности, костной ткани, что определяется их важной ролью в различных физиологических и патологических процессах. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в этой, области существует много принципиальных вопросов, требующих детального исследования. К ним относится проблема гистогенетических взаимоотношений гемальных и стромальных элементов в системе тканей внутренней среды, а также анализ структур и факторов, ответственных за их дифференцировку. Существуют современные работы, прямо указывающие на общность происхождения кроветворных и стромальных элементов, однако широко распространена точка зрения о существовании разных источников формирования клеток, выполняющих защитно-трофические (гемальные элементы) и опорные функции (истинные механоциты). Для решения этого вопроса используются разнообразные методические подходы, однако, многие проблемы не подлежат в настоящее время прямому экспериментальному исследованию. Необходим поиск новых моделей , которые позволят не только решить ряд конкретных гистологических задач, но подведут к пониманию многих общебиологических проблем. Одним из перспективных приемов является сравнительное изучение гистогенеза тканей внутренней среды у животных разных таксономических групп с использованием современных методов цитологического анализа, широко вошедших в практику работы с млекопитающими.

Н.Г. Хрущовым (1973) было высказано предположение о существовании двух популяций фибробластов в соединительной ткани млекопитающих. Одна из них характеризуется быстрым обновлением, участвует в регенерации соединительной ткани (фибробласты защитно-трофического типа), другая популяция - долгоживущая -выполняет преимущественно опорные функции. В многочисленных работах, выполненных на млекопитающих, было показано, что в рыхлой волокнистой соединительной ткани существует популяция фибробластов, клетки которой в определенных условиях могут дифференцироваться в остеогенные элементы. В результате деятельности этих клеток формируется типичная костная ткань (Фриденштейн, 1952, 1973). Подобное образование костной ткани в нехарактерном для нее месте получило название эктопический остеогенез, причина которого до настоящего времени не выяснена.

Костная чешуя рыб является уникальным, естественным примером образования костной ткани на основе соединительнотканной дермы и может с успехом служить модельной системой для исследования фундаментальных проблем остеогенеза у млекопитающих. К сожалению, в литературе встречается немного работ, посвященных исследованию особенностей организации, роста и регенерации костной (так называемой эласмоидной) чешуи рыб. В основном они носят описательный характер и выполнены преимущественно с использованием морфологических методов анализа, практически не охарактеризованы клетки, формирующие костные пластинки чешуи, нет единого мнения в вопросе их происхождения. В связи с этим, объектом данного исследования была выбрана модель регенерации костной чешуи рыб после ее механического удаления, так как в этих условиях появляется возможность в короткий срок проследить последовательные этапы образования костных пластинок чешуи, морфологически и гистохимически охарактеризовать клетки остеогенного ряда, участвующие в их формировании. Кроме этого, использование методов клеточной маркировки (Н3-тимидиновая авторадиография) позволит оценить уровень пролиферации клеток остеогенного ряда, исследовать скорость их обновления, а также выявить источники их новообразования.

Целью исследования явился анализ последовательных этапов образования костных пластинок эласмоидной чешуи после ее механического удаления, морфологическая и функциональная характеристика клеток, участвующих в формировании костных пластинок; а также оценка уровня их пролиферации и выявление источников новообразования остеогенных элементов.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать последовательные этапы и скорость формирования костных пластинок эласмоидной чешуи после ее механического удаления, используя классические гистологические методы.

2. Дать морфологическую (на светооптическом и электронномикроскопическом уровне) характеристику клеткам, ответственным за восстановление костных пластинок эласмоидной чешуи в разные сроки после начала регенерации.

3. Выявить клетки, осуществляющие кальцинацию межклеточного матрикса регенерирующей чешуи с помощью реакции на щелочную фосфатазу, а также на электронномикроскопическом уровне.

4. С помощью метода Н3-тимидиновой авторадиографии оценить уровень пролиферации клеток чешуйного кармана и местной соединительной ткани; охарактеризовать скорость обновления остеогенных элементов и выявить источники их новообразования.

Обзор литературы Особенности строения покровов костистых рыб

Кожа рыб является сложноорганизованным органом, построенным из тканей разных типов (эпителиальной, соединительной, костной). Эпителий.

В структурной организации покровов различных рыб удается обнаружить ряд общих черт строения с помощью электронной микроскопии (Henrikson, Matoltsy, 1968; Brown, Wellings, 1970; Harris, Hant,1975). Как правило, эпителий представляет собой многослойный пласт с выраженной полиморфностью клеток. На границе с подстилающей эпителий соединительной тканью располагается слой базальных клеток, способных к делению и обеспечивающих обновление всего эпителиального пласта. Образующиеся в результате делений клетки дифференцируются в двух направлениях: в направлении кроющих, уплощенных поверхностных клеток и в направлении образования различного рода железистых элементов. Наличие в составе эпителиального пласта белковых, слизистых и некоторых других специфических клеток - характерная особенность многослойных эпителиев рыб. Железистые клетки, выделяя разнообразные секреты на поверхность тела рыб, играют важную роль в обеспечении барьерной функции эпителиального пласта. При дифференцировке клеток в направлении кроющих элементов происходит изменение их размеров от призматических до плоских. Полностью дифференцированные кроющие элементы — клетки уплощенной формы, имеют пикнотическое ядро. На апикальной поверхности клеток имеются микроворсинки, увеличивающие поверхность плазматической мембраны. Сверху они покрыты секретом, выделяемым железистыми клетками. Секрет располагается в виде тонкого электронноплотного слоя на поверхности плазматической мембраны. Между собой поверхностные клетки соединены посредством десмосом, благодаря чему обеспечивается целостность всего эпителиального пласта. Необходимо отметить, что процессы регенерации эпителия рыб изучены недостаточно. Однако известно, что к пролиферации способны клетки всех слоев эпителиального пласта, за исключением кроющих, уплощенных клеток, которые к делению не способны. Наибольшая метаболическая активность отмечена в клетках средних слоев (Заварзин, 1976).

Таким образом, по общепринятой классификации эпителий рыб можно отнести к типичному многослойному плоскому неороговевающему эпителию. Однако, существуют некоторые модификации организации многослойных эпителиальных пластов. У одного из представителей пресноводных костистых рыб (Bagarius bagarius) описано наличие на поверхности эпителиального пласта сплошного слоя ороговевших клеток (Mittal, Munshi, 1970). Ороговевшие покровные клетки обнаружены также на некоторых участках кожи Carassius auratus (Sasse et al, 1970). Детальный цитохимический и электронномикроскопический анализ позволил сравнить этим авторам эпителий рыб с многослойным ороговевающим эпителием высших позвоночных. Это сопоставление говорит о том, что потенции к ороговению эпителиев закреплены филогенетически, что соответствует представлениям Хлопина о свойствах эктодермальных эпителиев и их производных, главной особенностью которых является многослойность и способность к ороговению в определенных условиях (Хлопин, 1947). У млекопитающих также известны примеры ороговения многослойных эпителиев в ответ на действие повреждающих факторов (Хэм, Кормак, 1983).

Соединительная ткань. Многослойный плоский неороговевающий эпителий подстилает рыхлая волокнистая соединительная ткань, богатая сосудами. На границе соединительной ткани и эпителия лежит базальная пластинка, выполняющая ряд важных функций (Альберте и др., 1994). В литературе встречается немного работ, посвященных исследованию особенностей строения и функционирования соединительной ткани рыб. Однако известно, что и у рыб она содержит классический набор клеточных элементов и межклеточных структур, характерных для высших позвоночных (Bloom, Fowsett, 1986). Постоянными клетками рыхлой волокнистой соединительной ткани являются элементы фибробластического ряда, макрофаги, тучные и жировые клетки, а также характерные для рыб пигментные клетки. Рыхлая волокнистая ткань инфильтрирована многочисленными гемальными элементами (лимфоциты, гранулоциты, моноциты) (Terri, Macha, 1982), которые имеют ряд важных функций. Макрофаги участвуют в воспалительных- реакциях и в процессе заживления ран (Fim, Nielson, 1971; Phromsuthirak, 1977; Hickey, 1982). Кроме того, показано участие макрофагов в утилизации погибших пигментных клеток, их миграция через эпителиальный пласт с последующим слущиванием совместно с эпителиальными клетками (Roberts, 1971). Источником образования макрофагов соединительной ткани являются клетки-предшественники, локализованные в кроветворном органе рыб -почке. В дальнейшем клетки мигрируют в соединительную ткань, где завершают процесс дифференцировки и активно функционируют (Золотова, 1989; Гревати, 1990). Тучные клетки также относят к постоянным клеточным элементам соединительной ткани рыб. Функции и гистогенез тучных клеток исследованы недостаточно, однако известно, что содержащиеся в их гранулах вещества регулируют проницаемость сосудов и контролируют химический состав внеклеточного матрикса соединительной ткани. Большое количество тучных клеток обнаружено в соединительной ткани, окружающей основание костной чешуи (Roberts, 1971; Bullock, 1974). Клетки фибробластического ряда обеспечивают синтез межклеточного вещества соединительной ткани и принимают непосредственное участие в образовании костной чешуи (Румянцев, 1958; Onozato, Watabe, 1979). Фибробластическая линия дифференцировки подробно исследована у млекопитающих (Сатдыкова и др, 1977; Хрущов и др., 1989). Детально исследовано участие фибробластов в синтезе коллагеновых волокон и основного аморфного вещества соединительной ткани, хряща и кости. Известно, что обновление элементов фибробластического ряда происходит за счет костно-мозговых предшественников, сложилось представление о механизмах регуляции дифференцировок клеток этой линии (Хрущов; 1973). Однако аналогичные работы в ихтиологии практически отсутствуют. Тем не менее, единичные исследования позволяют отождествлять фибробласты рыб и фибробласты млекопитающих. Морфологическая характеристика фибробластов рыб приводится во многих работах, выполненных на световом и электронномикроскопическом уровне (Brown, Wellings, 1969; Roberts, 1971; Lanzing, Wright, 1976; Shonborner et al., 1979). В цитоплазме этих клеток присутствует хорошо развитый гранулярный эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи, что позволяет авторам сделать вывод о белоксинтетической активности фибробластов рыб. Об этом также свидетельствует постоянное присутствие коллагеновых волокон в непосредственной близости от фибробластов. Тем не менее, остается открытым вопрос об участии фибробластов в синтезе межклеточных структур, не исследованы закономерности их обновления. Для фибробластов, участвующих в рубцевании ран (Золотова, 1989) авторадиографически показано. что малодифференцированные предшественники располагаются за пределами подкожной соединительной ткани, в кроветворных органах рыб - головной и туловищной почке, где происходит их активная пролиферация. Впоследствии эти клетки мигрируют в соединительную ткань, где окончательно дифференцируются в фибробласты и начинают синтез основных компонентов межклеточного вещества (Iger, et al., 1994; Bullock, Roberts, 1974). Подкожная соединительная ткань - дерма - состоит из двух слоев: наружного, рыхлого, богатого клетками и снабженного густой сетью капилляров; и внутреннего волокнистого, содержащего мощные коллагеновые волокна. Строение чешуи. Подразделение чешуй всех костных рыб на два типа: ганоидные и костные (циклоидные и ктеноидные) прочно вошло в науку со времен Агасица (Agassis, 1833, 1834). Агасиц был первым исследователем, предложившим использовать строение чешуи в систематике рыб. Ганоидные чешуи, в основном, характерны для наиболее древних рыб, в то время как циклоидные и ктеноидные встречаются, главным образом, у настоящих костистых рыб (класс Teleostei). Циклоидным чешуям свойственна преимущественно округлая форма с присутствием на переднем крае радиальных бороздок, сходящихся приблизительно к центру. Ктеноидная чешуя также имеет округлую форму, но лишена бороздок и центр чешуи сдвинут к задней части, где наблюдаются зубцы (ктеноиды).

Костная чешуя состоит из концентрических пластинок, подстилающих друг друга, при этом диаметр каждой последующей пластинки больше предыдущей. Наружная поверхность каждого кольца завершается полосой склеритов, маркирующих краевую зону и позволяющий визуально идентифицировать каждый последующий слой на изолированной чешуе. Особенно отчетливо полосы (зоны прироста, годичные зоны) видны в ростральном (головном) отделе чешуи, погруженном в дерму. Хвостовой отдел (каудальный) чешуи, выступает на поверхность и покрыт эпителиальным чехлом. Эти два разных участка чешуи (ростральный и каудальный концы), как отмечено разными авторами имеют разный рельеф поверхности (Lanzing, Higginbotham,1974; Sire, 1986; Roberts, 1993; Чугунова, 1952), при этом рельеф поверхности головного конца более постоянен.

Цитологические подходы позволяют исследовать клеточное строение разных отделов чешуи, выявлять и характеризовать клетки, участвующие в формировании структур, различимых на макроуровне. ftttirtf nut

I-1-"-»

Count* ЫЧ

Рис.1. Общий вид чешуи костистых рыб.

Подробности гистологического строения чешуй обоих типов детально исследованы в начале века (Times, 1906; Hase, 1907,1911) на светооптическом уровне. Позднее появились электронномикроскопические работы, в которых анализу подвергались чешуи многих костистых рыб (Lanzihg, Wright, 1976; Schonborner et al., 1971, 1979).

Основания костных чешуй находятся в подкожной соединительной ткани (дерме). Чешуи наклонены под углом к поверхности тела и черепицеобразно налегают друг на друга.

Рис.2. Схема строения кожного покрова костистых рыб (по Румянцеву, 1958): 1- чешуя, 2- эпителий, 3-дерма.

Верхняя сторона заостренной с обеих сторон чешуи несет зубовидные выросты, представляющие собой поперечные разрезы концентрических пластинок, хорошо различимых на изолированной чешуе (Румянцев, 1958). Чешуи имеют четко выраженное пластинчатое строение и состоят из большого числа следующих друг за другом слоев, волокна каждого из которых проходят под прямым углом к волокнам предыдущего. Каждая костная пластинка отделена от соседней тонкой волокнистой прослойкой (цементирующим веществом) (Onozato, Watabe, 1979). Пластинки гомогенны, не содержат клеток и расположены параллельно, перекрывая друг друга (смещаясь на определенный шаг). Пластинка заканчивается на свободном конце выступом - склеритом (Бурдак, 1943; Лапин, 1971), который окрашивается более интенсивно, чем матрикс самой пластинки. Считается, что зубчики состоят из наиболее уплотненного кальцинированного коллагена, называемого некоторыми авторами гиалодентином (Румянцев, 1958).

Возможные механизмы формирования склеритов, завершающих костные пластинки обсуждаются в ряде работ (Lanzing, Wright, 1976; Shoulner et al, 1979). Авторы считают, что склериты являются продуктом своеобразного фронта кальцинации.

Развитие чешуйного покрова в онтогенезе

Исследованию формирования чешуи на начальных этапах онтогенеза посвящены немногочисленные работы, выполненные в начале века (Hase, 1907,1911). Эти подробные морфологические исследования позволили создать достаточно стройные схемы развития костных чешуй. В более поздних работах представления Газе уточнялись на светооптическом и электронномикроскопическом уровне, исследовалась закладка чешуи у разных видов рыб, но общие представления о гистогенезе чешуи, основанные преимущественно на морфологических наблюдениях до настоящего времени не изменились (Гринберг, 1961; Olson, 1976; Yamada, 1971). Знакомство с современной литературой позволяет следующим образом охарактеризовать последовательность событий, наблюдаемых при развитии костных чешуй у мальков.

На ранних этапах онтогенеза покров рыб представлен эпителием, который подстилает достаточно толстый слой соединительнотанной дермы, составленный коллагеновыми волокнами (Sire et al, 1997). Развитие чешуи в раннем онтогенезе начинается с выпячивания эпидермиса и скопления под ним мезенхимных клеток, которые разные авторы называют либо склеробластами, либо остеобластами (Sire, 1997; Вагих 1997). Некоторые авторы называют эти клетки фибробластами, так как в дальнейшем они синтезируют коллаген (Whitear et al., 1980). Другие исследователи предлагают называть эти клетки "дермальными эндотелиальными" клетками, так как ,по мнению авторов, они имеют эпидермальное происхождение, в отличие от фибробластов дермы (Sire et al., 1997).

Наиболее точным является термин "остеобласты", так как по гистологическому строению чешуя костистых рыб представляет собой костную ткань. Образование чешуи начинается со скопления фибробластоподобных клеток в области будущего чешуйного кармана. При этом клетки базального слоя эпителия имеют хорошо развитый гранулярный эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи и некоторое количество везикул (Sire et al., 1997). Вскоре между остеобластами (склеробластами) появляются коллагеновые волокна, которые разделяют остеобласты (склеробласты) на два поля: верхнее и нижнее (так называемые "эписквамальные" и "гипосквамальные" склеробласты (Waterman, 1970). По мере дальнейшего развития волокна укрупняются, число их увеличивается и в результате образуется костная пластинка, по краям которой можно видеть остеобласты. Разрастаясь во все стороны и приобретая округлую форму, костная пластинка приближается к эпидермису, приподнимает его и выпячивается наружу. Авторы обращают особое внимание на активное врастание сосудов в зону формирования зачатка чешуи. Отмечается также усиленная пролиферация клеток эпителия, в результате чего эпидермис становится многослойным. В дальнейшем в верхней части фиброзной (коллагеновой) пластинки откладываются соли кальция, остеобласты исчезают, сохраняясь только по краям пластинки, и верхний слой приобретает вид плотной, гомогенной структуры. Нижняя часть чешуи обызвествляется слабо и в течение долгого времени сохраняет волокнистый характер (Olson, Watabe, 1980), что дает возможность подслаиваться новым остеогенным клеткам и продуцировать следующую пластинку чешуи. Тонкой организации клеток, осуществляющих развитие костных пластинок, посвящен ряд электронномикроскопических исследований, проведенных в сочетании с гистохимией и дифракционным анализом локализации кальцинированного материала (Olson, Watabe, 1980; Yamada, 1971). Вокруг кальцинирующейся костной пластинки авторы описывают 3 клеточные формы, отличающиеся по ультраструктуре ядра, степени развития гранулярного эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи, и делают вывод, что наблюдаемые клетки являются последовательными стадиями созревания остеогенных элементов. Изменения ультраструктурных особенностей этих клеток авторы связывают с их разной функциональной активностью (способности к белковому метаболизму), и отмечают поляризацию процессов синтеза коллагена и его кальцинации. В зоне развития первых костных пластинок описаны клетки разной степени зрелости. Так, по мнению авторов, клетки, подстилающие матрикс снизу (названные авторами фибробластами), ответственны за синтез межклеточного матрикса (Ланге, Новиков, 2001), верхние (остеобласты) участвуют в кальцинации фибриллярной пластинки. В работе Zylberberg, Bereiter-Hahn, Sire (1988) показано, что во время формирования коллагеновой основы будущей пластинки происходит периодическая реорганизация элементов цитоскелета остеобластов (склеробластов). Авторы предполагают, что микротрубочки являются внутриклеточной структурой, организующей внеклеточные коллагеновые фибриллы. Показано, что коллагеновые фибриллы представлены коллагеном I типа, сходным с коллагеном I типа млекопитающих (Bigi et al, 2000). Кальцинация остеоида (коллагеновой основы пластинки) происходит благодаря отложению кластеров кристаллов гидроксиапатита вдоль коллагеновых фибрилл. Эти кластеры располагаются беспорядоченно, без какой-либо корреляции с направлением коллагеновых волокон (Yamada, Watabe, 1979). Третий тип клеток, по мнению авторов (Olson, Watabe, 1980), наименее дифференцированных, локализован на самом краю растущей костной пластинки. Источником предшественников остеогенных элементов, ответственных за формирование чешуи в онтогенезе является кроветворный орган рыб - почка, что было показано авторадиографически в работе Ланге, Новиков (2001). По мнению авторов именно здесь происходит активная пролиферация клеток-предшественников остеогенных элементов, которые в дальнейшем с током крови мигрируют в соединительную ткань, подстилающую чешую, сохраняя ограниченные потенции к делению. Территория, где сосредоточены все три клеточные категории, достаточно локальна и может быть названа маргинальной зоной формирующейся пластинки.

Остеокласты рыб практически не охарактеризованы, однако Вагих(1997) в формирующихся щитках у колюшки отмечает появление крупных клеток, содержащих в цитоплазме несколько ядер. По морфологическим признакам эти клетки подобны остеокластам млекопитающих (Love, Stevens, 1994), что позволяет предположить их функциональную идентичность. Наличие многоядерных клеток в костных каналах чешуи панцирной щуки отмечено Керром (Kerr, 1955).

Таким образом, первая костная пластинка (верхняя) чешуи, имеющая правильную округлую форму, образуется очень быстро (1-2 дня) (Sire, 1988, 1994). Отмечено, что поверхностный слой быстро кальцинируется (Olson, Watabe, 1980). Эти наблюдения определяются пространственным расположением остеобластов и направлением синтеза коллагена (рис.3).

Rostral (S?

Caudal Ca

Коллаген

Рис.3. Схема роста чешуи в онтогенезе (Ланге, Новиков, 2001).

Центральные клетки выделяют синтезированный белок во всех направлениях достаточно равномерно, либо окружая себя слоями матрикса, либо сохраняя преимущественно поверхностное положение. Клетки, локализованные на внешнем крае пластинки, синтезируют коллаген односторонне, по направлению к центру растущей пластинки (Zylberberg et al, 1988; 1991). Кальцинация матрикса начинается практически одновременно с синтезом коллагена. В онтогенезе первые признаки кальцинации отмечены через 4-6 часов после морфологической регистрации появления волокон матрикса. Фронт кальцинации связан с клетками, лежащими на внешней поверхности растущего матрикса и остеобластами, расположенными в краевой зоне костной пластинки. Нижние, обращенные к соединительной ткани слои остаются не кальцинированными до 3-х недель. Такое расположение клеток поляризует процессы синтеза коллагена и его кальцинации и делает возможным подслоение новых волокнистых слоев только снизу за счет новых генераций остеобластов, подселяющихся в зону роста чешуи. Кальцинация верхнего и краевого слоя приостанавливает возможность, как миграции клеток, так и возможность подселения новых клеток и формирования фибрилл исключительно снизу. Таким образом, кальцинация является механизмом ограничения роста костной пластинки на периферии (Ланге, Новиков, 2001). Дальнейшая судьба остеобластов неизвестна. Некоторые авторы считают, что остеобласты после завершения синтеза коллагена гибнут и никогда не становятся истинными остеоцитами (Weiss, Watabe, 1979). Другие авторы утверждают, что, по крайней мере, часть остеобластов замуровывает себя в костный матрикс, и становится остеоцитами, но вскоре погибает вследствие ухудшения трофики (Вагих, 1997). В результате описанного процесса формируется своеобразная кальцинированная крышка, находящаяся на поверхности будущей многослойной чешуи. Следующая пластинка формируется за счет подстилающих ее остеобластов, формирующих фибриллярные структуры центральной части пластинки. Эти клетки, как свидетельствуют иммуноморфологические наблюдения, синтезируют коллаген во всех направлениях, увеличивая толщину пластинки. Остеобласты, локализованные на внешнем крае, синтезируют коллаген однонаправлено к центру пластинки, что приводит к появлению своеобразного валика, который вскоре кальцинируется благодаря тем же клеткам. Результатом деятельности краевых остеобластов является появление склеритов (Zylberberg et al, 1988; Dane, Tucker, 1986; Byerss et al, 1980; Lanzing, Wright,1976; Schonborner et al, 1979).

Постепенное подслаивание остеобластов, синтез матрикса и его последующая кальцинация продолжаются на протяжении всего онтогенеза, что и определяет непрерывный рост костной чешуи. Сначала кальцинация охватывает только периферию концентрической, волокнистой пластинки, где возникает первичный фронт кальцинации (Lanzing, Wright, 1976). Впоследствии кальцинация распространяется вдоль всей фиброзной пластинки и захватывает ее целиком. В результате этих процессов возникает слоистая чешуя, верхняя часть которой представлена кальцинированной тканью, нижняя имеет волокнистую структуру (Вагих, 1997). Поддержание жизнеспособности фибриллярного слоя осуществляется благодаря сосудам, локализованным в волокнистой ткани радиусов глубокой зоны чешуи, здесь же локализованы и лимфатические сосуды (Oosten, 1957). Параллельно с постепенным созреванием матрикса отдельной пластинки происходит процесс формирования цементирующего вещества, .соединяющего отдельные пластинки. Цементирующее вещество содержит коллагеновые волокна меньшей, чем в самих пластинках толщины, они ориентированы перпендикулярно костным пластинкам, которые формируют своеобразные поперечные сшивки (Onozato, Watabe, 1979). Таким образом, зоны прироста чешуи (циркули), отделенные друг от друга рядами склеритов, являются результатом деятельности клеток остеогенного ряда, локализованных в маргинальной зоне чешуи (Вагих, 1997).

Регенерация эласмоидной чешуи и костных лучей хвостового плавника у костистых рыб

Исследованию процесса регенерации разных органов и тканей у костистых рыб посвящены многочисленные работы последних лет. В настоящее время клеточные биологи активно используют разные виды костистых рыб для исследования особенностей регенерации нервной ткани, мышечной ткани и т. д. Особенно популярными объектами для таких исследований явялются Carassius auratus и Danio rerio. Однако в литературе встречается немного работ, авторы которых исследуют особенности процесса регенерации костной ткани на примере чешуи костистых рыб. В последнее время для изучения фундаментальных проблем остеогенеза также используется модель регенерации хвостового плавника костистых рыб.

Авторы отмечают, что через сутки после удаления чешуйного покрова наблюдается активная пролиферация эпителиальных клеток (Frietsche and Bailey, 1980), в результате образуются склеробласты - клетки, ответственные за формирование костных пластинок. Sire et al. (1999) используя метод Н3-тимидиновой авторадиографии, показали, что в ходе ранних этапов регенерации чешуйного покрова наблюдается пролиферация клеток базального слоя эпителия. Эпителизация раны происходит очень быстро, и, по мнению авторов, быстрая дифференцировка клеток базального слоя эпителия - первый шаг на пути восстановления чешуйного покрова (Sire et al., 1999).

По мнению других исследователей склеробласты дифференцируются из фибробластов чешуйного кармана (Walling, 1957). Эти клетки имеют кубическую форму, их цитоплазма базофильна. На 2-4 день регенерации появляется полоска базофильного материала между группой склеробластов. Она представлена коллагеновыми волокнами (Onozato, Watabe, 1979), которые формируются благодаря деятельности склеробластов. В более поздней работе Zylberberg, Bereiter (1991) показали, что во время формирования коллагеновой пластинки происходит перестройка элементов цитоскелета в склеробластах, подстилающих пластинки. Благодаря этому формируется характерная структура пластинки, где слои коллагеновых волокон располагаются перпендикулярно друг другу (Zylberberg, Bereiter, 1988). К 6-му дню регенерации большинство пластинок кальцинировано, при этом кальцинация происходит благодаря отложению иглоподобных кристаллов гидроксиапатита вдоль коллагеновых фибрилл (Yamada, Watabe, 1979). Через две недели после удаления чешуйного покрова восстановленная чешуя полностью кальцинирована. С помощью некоторых гистохимических методов авторам удалось показать, что за кальцинацию волокнистой части пластинки ответственна ,по крайней мере, часть склеробластов.

Исследования последних лет посвящены особенностям регенерации хвостового плавника костистых рыб (Akimenko et al.,1995; Santamaria et al, 1996; Geraudie et al, 1996). Особый интерес представляет вопрос о происхождении клеток, ответственных за восстановление костной ткани плавника. Во многих работах для ответа на этот вопрос используется метод, аналогичный Н3-тимидиновой авторадиографии. Он заключается в использовании бромдезоксиуридина, который включают клетки, находящиеся в S-периоде. Такие клетки могут быть выявлены иммуноцитохимически и, таким образом, возможно проследить их пролиферацию и миграцию. Показано, что регенерация костных лучей хвостового плавника у Danio rerio (образование структуры, которую авторы называют "бластема") после их ампутации происходит благодаря взаимодействию эпителиальных и мезенхимных клеток (Poleo et al., 2001). Авторы отмечают, что уже через сутки после ампутации рану окружают эпителиальные клетки, которые включают бромдезоксиуридин. Через 2 дня после ампутации бластема состоит из группы недифференцированных, плотно упакованных клеток, которые практически все оказались мечеными. На 3-й сутки регенерации обнаруживаются меченые бромдезоксиуридином мезенхимные клетки формирующейся бластемы на некотором расстоянии от места ампутации. Авторы делают вывод, что в результате ампутации плавника происходит активная пролиферация и миграция эпителиальных клеток, за образование собственно костной ткани плавника ответственны склеробласты - клетки, окружающие бластему снаружи и отделяющие ее от эпителия, по их мнению, эти клетки имеют эпидермальное происхождение. Исследование бластемы через продолжительное время после введения бромдезоксиуридина показывает, что интенсивность метки падает, и авторы делают вывод об активной пролиферации мезенхимных клеток. В некоторых работах показано, что на мезенхимных клетках бластемы экспрессируется рецептор к фактору роста фибробластов. Ингибиторы экспрессии этого рецептора приводят к блокировке пролиферации мезенхимных клеток, и рост бластемы останавливается (Poss et al., 2000) . Действие некоторых веществ, таких как аспирин, дексаметазол, пенициллин у млекопитающих приводит к дефектам синтеза коллагена. Аналогичное влияние эти вещества оказывают также на формирующийся коллагеновый матрикс бластемы (Bechara et al., 2000; Montes et al., 1982). Эти исследования могут косвенно свидетельствовать о том, что мезенхимные клетки бластемы, видимо, можно отнести к популяции фибробластов. Тем не менее, большинство авторов утверждают, что так называемый "экзоскелет", то есть чешуя и костные лучи плавников, формируется благодаря активности склеробластов - клеток эпидермального происхождения (Akimenko et al., 2003).

Регуляция роста эласмоидной чешуи

Рост чешуи, несомненно, контролируется набором факторов, тонкие механизмы которых трудно поддаются прямому экспериментальному исследованию. Зона роста костной чешуи является областью высокой метаболической активности. Любой дефицит питательных веществ, влияющих на синтез белков и углеводов, отражается на механизме роста в этой области и приводит к необратимым изменениям. Нормальный рост костной пластинки зависит от интенсивности синтеза белка и скорости обызвествления. Эти два процесса происходят синхронно и связаны друг с другом, а также зависят от ряда факторов. Для остеогенеза млекопитающих охарактеризован ряд подобных факторов. Так, пролиферацию остеогенных предшественников в культуре тканей контролирует тромбоцитарный фактор роста, находящийся в сыворотке крови (Deuel, 1987). Другой фактор регулирует созревание остеогенных предшественников в культуре. Это трансформирующий фактор роста (Альберте и др., 1994), также выделенный из сыворотки крови. При остеогенезе млекопитающих наиболее известны и хорошо охарактеризованы кальцитонин (гормон щитовидной железы) и паратгормон (околощитовидная железа), которые контролируют процессы резорбции и новообразования кости. Мишенью для этих гормонов являются специализированные многоядерные клетки - остеокласты, являющиеся потомками макрофагов. Клетки, способные резорбировать костные ткани скелета и чешуи рыб в литературе описаны, но не охарактеризованы (Weiss, Watabe, 1978; Kerr, 1955). Тем не менее, можно предполагать сходные механизмы регуляции, поскольку гормон, аналогичный кальцитонину млекопитающих, у рыб известен. Показано, что экстракт гипофиза, ответственного, видимо, за продукцию этого гормона, снижает уровень кальция в крови рыб, приостанавливая резорбцию кости (Millet, 1976). Специальные ультимобранхиальные железы вырабатывают гормон, регулирующий баланс кальция в организме рыб и усиливающий резорбцию кости. Видимо, он аналогичен паратгормону млекопитающих. Анатомическое расположение ультимобранхиальных желез и их закладка в эмбриогенезе позволяют авторам предполагать, что данные структуры рыб совмещают в себе функции щитовидных и паращитовидных желез. Однако, авторы сомневаются, является ли чешуя рыб таким же депо кальция, как кости скелета (Сорр, 1969; Weiss, Watabe, 1979).

У млекопитающих многие факторы вырабатываются специальными клетками и функционируют местно, при непосредственном клеточном контакте (короткодистантные факторы дифференцировки). Эти факторы, получившие название интерлейкинов, контролируют пролиферацию клеток разных линий и источником их образования являются моноциты и лимфоциты. Подобные механизмы регуляции у рыб не исследованы, но они , несомненно существуют. Косвенным доказательством этого является постоянное присутствие в зоне новообразования костной пластинки лимфоцитов, макрофагов (иногда с явными признаками фагоцитоза) (Hickey, 1982; Roberts et al., 1971), а также тучных клеток, часто непосредственно прилегающих к чешуе (Roberts et al., 1971). Это факт представляет особый интерес, так как известна роль тучных клеток в регуляции проницаемости сосудов и осуществлении контроля за состоянием межклеточного вещества. Кроме того, одним из факторов регуляции клеточного деления у рыб является температура. В настоящее время существует большое количество экспериментальных данных, свидетельствующих о возможности блокировки митотического цикла клеток, культивируемых in vitro при изменении температуры. Механизм остановки митоза многие авторы объясняют изменением поведения микротрубочек, формирующих веретено деления. Существуют данные, что у организмов, живущих при низких температурах система контроля за сборкой микротрубочек характеризуется рядом биохимических особенностей (Алов, 1982; Ricder, 1981). В работе Вагих (1997) отмечено, что при 4°С клетки кроветворной ткани у зеркального карпа не включали Н3-тимидин. Это свидетельствует о том, что при низкой температуре клетки - предшественники крови, обычно активно делящиеся, входят в митотический блок. То есть при понижении температуры происходит блокирование митоза, что приводит к резкому уменьшению числа остеобластов, и приостановке (замедлению) роста костной пластинки. Температурный фактор влияет и на скорость белкового метаболизма у рыб, но прямые экспериментальные доказательства этого отсутствуют. Специальные исследования влияния температуры на особенности функционирования клеток и тканевых систем у рыб, к сожалению, единичны. Однако, авторы отмечают резкое замедление миграции клеток в область воспаления при заживлении кожных ран у рыб при понижении температуры, отмечена также менее эффективная эпителизация поверхности ран (Roberts et al., 1972; Hickey,

1982). Содержание рыб при повышенных температурах приводит к появлению большего числа капилляров, активизации работы фибробластов соединительной ткани

Iger et al., 1993; Mawdesley et al., 1972). Количество клеток и активность их t функционирования при разных температурах определяет скорость формирования межклеточного матрикса, одним из важнейших звеньев при этом является выделение и внеклеточная сборка коллагеновых фибрилл межклеточного матрикса. Как показано в ряде работ (Zylberberg, BeriiterHalin, 1991; Dane, Tuker, 1986), ведущую роль в обеспечении процесса целенаправленного выведения коллагена из остеобластов играют элементы цитоскелета этих клеток (микротрубочки, промежуточные филаменты), исследованные авторами в костных клетках чешуи. В многочисленных работах показано, что элементы цитоскелета наиболее чувствительны к воздействию температурного фактора. Так при понижении температуры происходит приостановка выведения из клеток молекул коллагена (Альберте и др., 1994) что в свою очередь может сказаться на структуре поверхности чешуи.

Таким образом, регуляция роста чешуи может осуществляться как на уровне клеточной пролиферации, так и на уровне белкового синтеза. Интенсивность подрастания костной пластинки определяется и соотношением процесса формирования органической части матрикса, скоростью его выведения из клеток, а также последующей кальцинацией.

Литературные данные, посвященные особенностям роста чешуи в онтогенезе, немногочисленны и носят, в основном, описательный характер. Показано, что эласмоидная чешуя представлена костной тканью, исследованы механизмы кальцинации межклеточного матрикса пластинки, однако практически не охарактеризованы клетки, формирующие пластинки чешуи, нет единых терминов, обозначающие эти клетки. В ихтиологических исследованиях клетки, участвующие в формировании коллагеновой основы пластинки, часто называют фибробластами (Brown, Welling, 1969; Maekava and Yamada, 1970; Onozato, Watabe, 1979). Клетки, подстилающие пластинки сформированной чешуи, принято называть склеробластами (Zylberberg, Bereiter-Hahn, 1991; Sire et al., 1997). Некоторые авторы определяют эти клетки как остеобласты (Frietsh and Bailey, 1980; Вагйх, 1997). Многие исследователи отмечают, что остеобласты (склеробласты) различаются морфологически и имеют разную локализацию. Так клетки, подстилающие пластинки имеют кубическую форму и содержат хорошо развитый гранулярный эндоплазматический ретикулум; клетки, находящиеся на поверхности пластинок, . уплощены. Вероятно, эти клеточные категории выполняют разные функции. Ряд авторов называет наименее дифференцированные элементы в области чешуйного кармана фибробластоподобными или мезенхимными клетками (Sire et al., 1997; Akimenko et al., 2001). Таким образом, знакомство с литературой позволяет отметить искусственную усложненность классификации чешуеобразующих клеток (табл. I).

Таблица 1

Термины, обозначающие клетки, формирующие костные пластинки эласмоидной чешуи и клетки костной ткани.

Фибробласт (фиброцит) Клетка, продуцирующая межклеточный матрикс в системе тканей внутренней среды (Хэм, Кормак, 1983)

Остеобласт (остеоцит) Клетка костной ткани (Хэм, Кормак, 1983)

Мезенхимная клетка Источник всех элементов тканей внутренней среды в эмбриогенезе, в старой литературе используется как синоним к термину «фибробласт»

Склеробласт Клетка фибробластического ряда, участвующие в образовании костных пластинок чешуи рыб (Sire, 1997)

Эласмобласт Клетка, формирующая эласмридную чешую рыб (Meunier, 1983)

Следует отметить, что в результате многолетних гистологических исследований особенностей остеогенеза у млекопитающих сложилась четкая классификация клеток остеогенного ряда. Так, клетки, способные к пролиферации были названы преостеобластами; элементы, активно синтезирующие межклеточное вещество и утратившие способность к делению - остеобластами; и ,наконец, клетки, замурованные в кальцинироыванный матрикс и связанные между собой отростками, с помощью которых осуществляется их трофика - остеоцитами. Термин "мезенхимный элемент"как правило, используется только в случае эмбриогенеза. Опираясь на классические гистологические исследования остеогенеза у млекопитающих при характеристике костных пластинок чешуи целесообразно использовать общепринятую в экспериментальной гистологии терминологию. Поскольку костная дифференцировка у млекопитающих исследована более детально, чем у рыб, экспериментальные подходы, используемые при работе с млекопитающими, являются эталоном исследований, проводимых с другими высшими позвоночными.

Таким образом, необходима подробная морфологическая характеристика чешуеобразующих клеток, уточнение их функций и происхождения. Для решения этих вопросов особенно перспективной может быть модель регенерации костной чешуи, так как появляется возможность проследить последовательные этапы восстановления костных пластинок и дифференцировки клеток, формирующих чешую. К сожалению, вопрос о происхождении чешуеобразующих клеток в литературе практически не обсуждается. Большинство исследователей склоняется к тому, что костные пластинки чешуи формируют клетки эпидермального происхождения (Sire et al., 1997; Sire et al., 2003). Такой вывод авторы делают, основываясь на результатах морфологических исследований. Методы клеточной маркировки (Н3-тимидиновая авторадиография) используются авторами только с целью выяснения пролиферативной активности клеток базального слоя эпителия (Sire, 1999). В работе Ланге, Новикова (2001) достаточно подробно исследован вопрос о происхождении чешуеобразующих клеток. Эти авторы также использовали метод Н3-тимидиновой авторадиографии и показали, что клетки, ответственные за постоянный рост чешуи в онтогенезе являются остеогенными элементами, а активная пролиферация клеток-предшественников происходит в кроветворном органе рыб - почке. Для подтверждения этих данных необходимо выяснить происхождение чешуеобразующих клеток в случае регенерации чешуи, наличие запаса малодифференцированных клеток в зоне чешуйного кармана, а также оценить участие в этом процессе клеток-предшественников, мигрирующих с током крови. Ответы на эти вопросы возможно получить, используя метод Н3-тимидиновой авторадиографии (сочетание импульсного и предварительного введения изотопа

Хрущов, 1976), который часто используется в работах с быстрообновляющимися популяциями клеток у млекопитающих.

Материалы и методы исследования

Объектом настоящего исследования были выбраны сеголетки золотых аквариумных рыбок (Carassius auratus). Экспериментальную регенерацию вызывали удалением вдоль боковой линии нескольких рядов чешуй.

Для морфологического анализа кусочки кожи фиксировали смесью формалин-спирт-ледяная уксусная кислота в соотношении 9:3:1; через 1-е, 3-й, 7-е и 14-и сутки после начала экспериментальной регенерации материал декальцинировали в 10% ЭДТА в течение 3-х дней при 37°С, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и хлороформе, заливали в парафин, получали срезы толщиной 4-7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилин и эозином, азаном по Гейденгайну. Для электронномикроскопического анализа на 7-ой и 14-ый день регенерации кусочки кожи фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом на какодилатном буфере (рН=7,3) в течение 2-х часов, дофиксировали 1% OSO4, контрастировали 0,5% уранилацетатом на 70% спирте. После обезвоживания материал заливали в смесь эпона и аралдита. Готовили полутонкие срезы для прицельной заточки, окрашивали их метиленовым синим (азур Н-фуксин). Ультратонкие срезы, полученные на ультратоме LKBIII, дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу. Полученные срезы исследовали в электронный микроскоп JEM-100CX2.

Для гистохимического анализа ("реакция на щелочную фосфатазу) использовался метод азосочетания с AS-B нафтолом. Кусочки кожи через 14 дней после начала регенерации, замораживали при -20°С, получали криостатные срезы толщиной 10-15 мкм. Срезы монтировали на стекла и покрывали смесью: нафтол - 25мг, ДМСО -50мкл, трис (НС1)-буфер - 50мл (рН=9), прочный красный - 50мг. Реакцию проводили в течение 1 часа при 37°С, окрашивали гематоксилином, заключали в глицерин-желатину.

Авторадиографическое исследование. Для авторадиографического исследования была использована выборка из 16 рыб, у которых вдоль боковой линии удаляли несколько рядов чешуй. Исследование проводили через 1, 3, 7, 14 дней после начала экспериментальной регенерации. Н3-тимидин (уд.акт. 1,8 мкКюри/мг) вводили рыбам внутримышечно из расчета 10 мкКюри на 1 г веса особи . Изотоп в зависимости от целей эксперимента вводился импульсно (за 3 часа до фиксации материала), и предварительно (одновременно с удалением чешуйного покрова) (схема1). Кусочки кожи фиксировали смесью формалин-спирт-ледяная уксусная кислота (9:3:1), декальцинировали в 10% ЭДТА, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и хлороформе, заливали в парафин, получали срезы толщиной 4-5 мкм.

Схема 1. Методика проведения эксперимента.

Депарафинированные срезы после обработки 5% раствором трихлоруксусной кислоты, покрывали фотоэмульсией типа М, экспонировали при температуре 4°С в течение 4-х недель (Хрущов, 1969). После фотообработки препараты тщательно промывали, окрашивали гематоксилином, в разных участках регенерирующей пластинки подсчитывали число меченых клеток на 200 клеток (индекс мечения). Мечеными считались клетки, которые имели над ядром более 7-ми зерен автографа. Результаты подсчетов обрабатывались статистически. Достоверность различий показателей определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Сидорова, Екатерина Игоревна

Выводы

1. Полное восстановление чешуи после его механического удаления происходит за две недели, при этом 1 костная пластинка формируется 2 дня.

2. По морфологическим и функциональным признакам клетки, формирующие костные пластинки чешуи, являются остеогенными элементами. Выявлены малодифференцированные, способные к делению преостеобласты, а также остеобласты, синтезирующие межклеточный матрикс и впоследствии его кальцинирующие.

3. Остеобласты, выполняющие разные функции разобщены территориально. Так, клетки нижней поверхности пластинки синтезируют межклеточный матрикс, элементы, находящиеся на поверхности, ответственны за его кальцинацию.

4. Авторадиографически показано, что остеогенные элементы, участвующие в чешуеобразовании у рыб, являются быстрообновляющейся клеточной системой, включающей активно-пролиферирующие предшественники, локализованные за пределами местной соединительной ткани (видимо, в органах гемопоэза), с током крови мигрирующие в очаг новообразования чешуи, где постепенно снижают потенции к делению и завершают процессы дифференцировки.

Заключение

Проведенный морфологический и авторадиографический анализ регенерирующей чешуи Carassius auratus показал, что чешуйный покров полностью восстанавливается за две недели, при этом образуется 7 костных пластинок,'то есть 1 пластинка за 2 дня. В онтогенезе с такой скоростью формируется только первая пластинка (Sire, 1988, 1994), в дальнейшем чешуя растет постоянно со скоростью 1 пластинка в неделю (Ланге, Новиков, 2001). Такая высокая скорость регенерации позволяет проследить последовательные этапы дифференцировок клеток, ответственных за восстановление чешуи. Использование классических гистологических подходов, а также метода электронной микроскопии позволяет установить, что клетки, формирующие чешуйные пластинки относятся к популяции остеогенных элементов и представляют собой костный дифферон. Основываясь на полученных результатах можно предложить следующую классификацию остеогенных элементов, обнаруженных нами в области чешуйного кармана:

1. Преостеобласты - наименее дифференцированные клетки вытянутой формы, располагаются в соединительной ткани чешуйного кармана. Эти клетки некоторые авторы называют "фибробластоподобные клетки" (Sire et al., 1997) или "мезенхимные клетки" (Akimenko et al., 2001) в случае регенерации костных лучей плавника. Однако, более точным термином для этой популяции остеогенных элементов является термин "преостеобласты".

2. Остеобласты - клетки кубической формы, подстилающие растущие пластинки. Многие авторы называют эти клетки "склеробласты" (Zylberberg, Bereiter-Hahn, 1991; Sire et al., 1997), видимо, исходя из представления об их эпидермальном происхождении, другие авторы относят их к остеобластам (Zylberberg, Bereiter-Hahn, 1991; Sire et al., 1997), некоторые исследователи считают их фибробластами, тем самым, говоря об их способности формировать межклеточный матрикс пластинок (Brown, Welling, 1969; Maekava and Yamada, 1970; Onozato, Watabe, 1979). По многим морфологическим признакам эти клетки сходны с остеобластами млекопитающих, таким образом, наиболее подходящий термин для этих клеток - "остеобласты". Данные проведенного нами морфологического исследования согласуются с результатами Ланге, Новикова (2001), которые с помощью Н3-пролиновой авторадиографии показали, что остеобласты, подстилающие растущие пластинки синтезируют компоненты коллагеновой основы пластинки. В литературе очень подробно описаны механизмы минерализации костной пластинки, однако клетки, участвующие в кальцинации практически не охарактеризованы, спорным остается вопрос об их локализации (Olson, Watabe, 1980; Yamada, Watabe, 1979). В работе Ланге, Новикова (2001) отмечено наличие уплощенных остеобластов на поверхности пластинок, в области склеритов, авторы предполагают их участие в кальцинации межклеточного матрикса пластинок в онтогенезе. Использованный нами метод азосочетания с AS-B нафтолом позволил установить, что остеобласты на поверхности пластинок действительно принимают участие в кальцинации коллагеновой основы пластинок. Электронномикроскапически продемонстрировано, что . процесс отложения кристаллов гидроксиапатита в ходе минерализации сходен с процессом кальцинации остеоида у млекопитающих (Хэм, Кормак, 1983). Остеоциты - полностью дифференцированные клетки, морфологически сходны с остеоцитами млекопитающих. По мнению некоторых авторов (Shonborner et.al., 1979) остеобласты, выполнив свою функцию, погибают. Полученные нами результаты позволяют утверждать, что, по крайней мере, часть остеобластов замуровывает себя в костный матрикс и становится истинными остеоцитами. На тотальных препаратах эти клетки обнаружены нами в наиболее глубоких участках восстановленной чешуи. В более зрелых кальцинированных пластинках остеоциты не выявляются, вероятно, они погибают вследствие ухудшения трофики, в связи с кальцинацией матрикса.

Таким образом, проведенный морфологический и гистохимический анализ, а также сопоставление полученных данных с результатами других исследователей позволяет утверждать, что пластинки костной чешуи Carassius auratus представляют собой типичную грубоволокнистую кость, клетки ее формирующие являются остеобластами и сходны с остеобластами млекопитающих. Известно, что у млекопитающих грубоволокнистая кость образуется на месте мезенхимы, а также в патологических случаях, например при переломах костей, в дальнейшем она замещается пластинчатой костью.

До сих пор оставался спорным вопрос о происхождении остеогенных элементов, формирующих костную чешую у рыб. В настоящее время в работах, посвященных особенностям формирования костной чешуи, высказывается мнение, что клетки, ответственные за регенерацию и рост костной чешуи, а также костных лучей плавников имеют эпидермальное происхождение (Akimenko et al., 2003; Sire et al., 1999). Результаты единичных исследований отечественных авторов (Ланге, Новиков, 2001; Вагих, 1997), проведенные с помощью Н3-тимидиновой авторадиографии говорят о том, что в соединительной ткани рыб существует постоянный запас малодифференцированных элементов, которые обеспечивают рост чешуи в онтогенезе. Проведенное нами исследование регенерирующей чешуи с помощью метода Н3-тимидиновой авторадиографии (сочетание импульсного и предварительного введения изотопа), а также статистическая обработка полученных результатов позволяют предложить следующую последовательность событий, происходящих в процессе восстановления чешуйного покрова (рис. 37). Через сутки после удаления чешуи активизируется местный резерв малодифференцированных клеток соединительной ткани, о чем свидетельствует увеличение индекса мечения этих клеток по сравнению контролем при импульсном введении изотопа.

Гемопоэтический островок почки

Активная пролиферация предшественников остеогенных элементов

Рис.37. Схема происходящих событий в ходе авторадиографического исследований).

Кровь

Зона чешуеобразования

О

Миграция gODDDOOO

А ® ©

Созревание клеток

Ограниченная пролиферация малодифференцированных клеток регенерации эласмоидной чешуи (по результатам морфологического и

К 7-м суткам регенерации местный резерв малодифференцированных клеток быстро истощается, о чем свидетельствует снижение индекса мечения клеток соединительной ткани при импульсном введении изотопа. На смену этим клеткам мигрируют предшественники остеогенных элементов, активная пролиферация которых происходит за пределами соединительной ткани, в кроветворном органе рыб — почке. Поэтому при предварительном введении изотопа в соединительной ткани чешуйного кармана наблюдается появление большого количества слабо-меченных клеток (индекс мечения 39%). В это время происходит активный рост костных пластинок, для его поддержания необходимы все новые популяции остеогенных элементов. Преостеобласты, которые хорошо видны в области чешуйного кармана, способны к ограниченной пролиферации, о чем свидетельствует увеличение индекса мечения этих клеток при импульсном введении изотопа на 7-е сутки регенерации. Повышение индекса мечения преостеобластов при предварительном введении изотопа говорит о продолжающейся миграции преостеобластов в зону чешуйного кармана. В дальнейшем преостеобласты дифференцируются в остеобласты, которые формируют межклеточный матрикс пластинки и принимают участие в его кальцинации. Остеобласты на поверхности пластинок содержали над ядрами больше зерен автографа, чем остеобласты, подстилающие пластинки. Вероятно, после миграции на поверхность пластинки эти клетки не прошли ни одного деления. К 14-м суткам, когда чешуйный покров восстановлен, индекс мечения клеток соединительной ткани и преостеобластов при предварительном введении изотопа снижается и достигает контрольного уровня. При импульсном введении изотопа в соединительной ткани чешуйного кармана отмечаются отдельные интенсивно меченые клетки, которые составляют резервную популяцию предшественников остеогенных элементов. Сочетание предварительного (одновременно с началом регенерации чешуи) и импульсного введения Н3-тимидна (в разные сроки восстановления) позволяет нам утверждать, что в соединительной ткани чешуйного кармана существует резерв быстрообновляющихся, короткоживущих предшественников остеогенных элементов, способных в короткий срок мигрировать в зону повреждения, завершить дифференцировку и начать усиленный синтез межклеточного матрикса. Популяция предшественников остеогенных элементов по характеру обновления аналогична быстрообновляющейся популяции фибробластоподобных элементов, участвующих в заживлении кожных ран у рыб (Золотова, 1989; Гревати, 1991). Таким образом, у рыб существует единая камбиальная система клеток всех типов соединительных тканей, территориально объединенная с кроветворной тканью. Этот факт находит и генетическое подтверждение, основанное на проявлении одной из мутаций карпа обыкновенного. Известно, что сплошной чешуйный покров у карпа, доминирующий над зеркальным типом, определяется двумя парами аутосомных, не сцепленных друг с другом генов, ответственных за характер чешуйного покрова (SSNN, ssnn). При этом гомозиготные особи, несущие рецессивный ген бесчешуйности, нежизнеспособны и погибают на стадии вылупления, гетерозиготы по гену N жизнеспособны, но в большом проценте случаев имеют нарушения покрова, осевого скелета и системы кроветворения и имуннодефицитны (Кирпичников, 1987).

Некоторые авторы считают источником клеток, формирующих костную чешую у рыб эпидермис (Sire, 1999), однако автор использовал только импульсное введение Н3-тимидина и, анализировал базальный слой эпителия. Он отмечает появление интенсивно меченых клеток в соединительной ткани чешуйного кармана и делает вывод о пролиферации и миграции в зону чешуйного кармана эпителиальных клеток. В нашем исследовании производился подсчет числа меченых эпителиальных клеток в разные сроки регенерации. Результаты произведенных подсчетов говорят лишь о том, что действительно клетки эпителиального пласта активно пролиферируют, особенно в первые дни регенерации, что связано с реакцией эпителиального пласта на повреждение. Вскоре новообразованный эпителиальный пласт закрывает зону повреждения, и к 7-м суткам регенерации пролиферативная активность клеток эпителиального пласта падает.

Таким образом, чешуя рыб является уникальным, естественным примером образования костной ткани на основе соединительнотканной дермы, ее формируют клетки соединительной ткани, наделенные остеогенными потенциями. У млекопитающих также существует подобное явление образования костной ткани в таком месте, где в норме кость не образуется, так называемый эктопический остеогенез. У человека, в частности, патологоанатомические находки костной ткани в заживающих операционных рубцах передней брюшной стенки, в стенках артерий, почке, печени, в излеченных туберкулезных очагах легких не представляют большой редкости (Фриденштейн, 1973). Хаггинс была разработана модель эктопического остеогенеза у млекопитающих (Huggins, 1936; 1969). В ходе эксперимента было показано, что при трансплантации кусочков стенки мочевого пузыря, или соскобов переходного эпителия в переднюю брюшную стенку образуется типичная грубоволокнистая кость. В литературе долгое время оставался открытым вопрос о механизмах возникновения костной ткани при трансплантации переходного эпителия мочевого пузыря, высказывалось мнение, что переходный эпителий обладает остеогенными потенциями. В последствие, однако, Фриденштейн (1952), проведя ряд исследований образования костной ткани в почке, пришел к выводу, что переходный эпителий оказывает лишь остеогенетическое влияние на соединительную ткань и является источником индуцирующих стимулов, вызывающих остеогенез. В более поздних работах ряд отечественных ученых (Хрущов, 1972, 1974; Ланге, 1975), проведя авторадиографические исследования особенностей обновления фибробластов у млекопитающих, пришли к выводу о существовании в соединительной ткани двух популяций фибробластов. Одна популяция фибробластов - короткоживущая с высоким уровнем обновления клеток, основная функция этих клеток заключается в обеспечении защитнотрофических процессов, таких как воспалительная реакция и заживление ран. Эта популяция фибробластов соединительной ткани имеет' костномозговое происхождение (Хрущов, 1973). В пользу этого утверждения также свидетельствует тот факт, что при летальных дозах облучения формирование рубца вокруг введенного инородного тела подавляется. Другая популяция фибробластов - долгоживущая, клетки которой редко делятся и выполняют преимущественно опорную функцию (Ланге, 1975). С точки зрения филогенетических построений можно допустить, что фибробласты подкожной соединительной ткани млекопитающих содержат филогенетически древнюю популяцию клеток, способную при определенных условиях к остеогенезу, что отчетливо проявляется у'рыб. У млекопитающих такое явление наблюдается в патологических условиях, а также при контакте с некоторыми факторами дифференцировки (например, хорошо изучено влияние группы костных морфогенетических белков (Быков, 1999)). Эволюционный подход в решении многих фундаментальных проблем биологии у млекопитающих может оказаться перспективным, и, как показало настоящее исследование, весьма удобной и адекватной моделью для исследования основных проблем остеогенеза является модель регенерации костной чешуи.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сидорова, Екатерина Игоревна, Москва

1. Алов И.А. Механизмы реакции делящихся клеток на гипертермию. Усп. совр. биол. - 1982. - 93. - С. 64-72.

2. Альберте Б, Брей Д. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир. - 1994.

3. Афанасьев Ю.А., Юрина Н.А. Гистология. М.:Медицина. - 1999. - 774с.

4. Бурдак В.Д. Функциональная морфология чешуйного покрова рыб. Киев: Наук. Думка. -1979.-C.3-130.

5. Быков В. JI. Цитология и общая гистология. С. -Петербург: СОТИС. - 1999.

6. Гревати А.Д. Электронномикроскопическое исследование клеток крови и кроветворных органов зеркального карпа. Автореферат канд. дисс., М., 1991, 24 с.

7. Гринберг М.М. Об онтогенезе чешуи у костистых рыб. Зоол. журнал. - 1961. — 40, 2. - С. 234-243.

8. Заварзин А.А. Основы частной цитологии и сравнительной гистологии многоклеточных животных. М.: Наука. 1976. -410с.

9. Золотова Т.Е. Экспериментальное исследование кроветворения у рыб. -Автореф. диссерт. на соиск. учен. степ, канд наук. М., МГУ. - 1989.

10. Епифанова О.И., Терских В.В., Захаров Ф. Радиоавтография. М.: Высшая школа. - 1977 - 246с.

11. Кирпичников В. С. Генетика и селекция рыб. Л.: Наука. - 1987. - 519с.

12. Ланге М. А. Авторадиографическое исследование клеток-предшественников фибробластоподобных элементов очага новообразования соединительной ткани. Автореф. канд. диссер. - М.: Из-во МГУ. - 1975.

13. Ланге М.А., Новиков Г.Г. Экспериментальные исследования механизмов роста костной (эласмоидной) чешуи у тиляпий. Экологические проблемы онтогенеза рыб. - М.: МГУ. - 2001. - с. 101 -113.

14. Лапин Ю.Е. Закономерности динамики популяции рыб в связи с длительностью их жизненного цикла.-М.: Наука.?- 1971.-С. 175.

15. Ллойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. М.: Мир. - 1982. -272с.

16. М. Вагих. Изучение структуры и формирования чешуи рыб разных видов. Дисс. на соискание уч. ст. к.б.н. М. - 1997.

17. Румянцев А.В. Опыт исследования эволюции хрящевой и костной тканей. М.: Из-во АН СССР. - 1958. - с. 77-237.

18. Сатдыкова Г.П., Ланге М. А., Хрущов Н.Г. Происхождение фибробластов в постнатальном онтогенезе млекопитающих. Итоги науки и техники ВИНИТИ, Москва. - 1977. - Т.7 - с.6-33.

19. Фриденштейн А.Я. Остеогенез в почках. Арх. анат., гистол., эмбр. - 1952. -29. - 4. - 75.

20. Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники. М.: "Медицина". - 1973.

21. Хлопин Н.Г. Общебиологические экспериментальные основы гистологии. Л.: Из-во АН СССР.- 1946. - 492с.

22. Хрущов Н.Г. Функциональная цитохимия рыхлой соединительной ткани. -М.:Наука. -1969.

23. Хрущов Н.Г. Гистогенез соединительной ткани. М.: Наука. - 1976. - 118с.

24. Хрущов Н.Г. Проблема происхождения фибробластов в постнатальном онтогенезе млекопитающих. Онтогенез. - 1974. - 5. - N 4. - с.3-12.

25. Хрущов Н.Г. Происхождение клеточных форм соединительной ткани и их отношение к стволовой кроветворной клетке. В кн.: Гистофизиология соединительной ткани, т.1 Новосибирск, "Наука". - 1972. - с. 5-12.

26. Хрущов Н.Г. Экспериментальная гистология и проблемы эволюции тканей. -Журнал общей биологии. 1989. - 1. - с.5-18.

27. Хрущов Н.Г. Современные экспериментальные данные о происхождении клеток соединительной ткани. -Архив, патол. 1973. - 35. - N4. - с.7-14.

28. Хэм А, Кормак Д. Гистология. Т.2.- М.: Мир.- 1983. 254с.

29. Чугунова Н.И. Руководство по изучению возраста и роста рыб. М. - 1952.

30. Akimenko MA., Jonson SL., Westerfield M., Ekker M. Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish. -Development. 1994. - 121. - 347-357.

31. Akimenko MA; Mari-Beffa M; Becerra J; Geraudie J. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Dev Dyn. - 2003. - 226(2). -190201.

32. Bechara I.J., Joazeiro PP., Mari-Beffa M., Becerra J., Montes GS. Collagen-affecting drugs impaire regeneration of teleost tail fin. J. Submicrosc. Cytol. Pathol. - 2000. - 32. - 273-280.

33. Bigi A; Burghammer M; Falconi R; Koch MH; Panzavolta S; Riekel С Twisted plywood pattern of collagen fibrils in teleost scales: an X-ray diffraction investigation. J Struct Biol. - 2001. - 136. - 137-143.

34. Bigi A; Koch MH; Panzavolta S; Roveri N; Rubini K. Structural aspects of the calcification process of lower vertebrate collagen. Connect Tissue Res. -2000. -41. -37-43.

35. Bloom, Fowsett. Text book of Histology. 1986. - Sannders Company P. - 1017.

36. Brown G. A., Welling S. R. Collagen formation and calcification in teleost scales. -Z.Zeliforch. microsk. anat. 1969. - 93. - 571-582.

37. Brown G. A., Welling S. R. Electron microscopy of the skin of the teleost Hippoglossoides elassodon. Z. Zellforch. - 1970. - 103. - 149-169.

38. Bullock A. M., Roberts R.I. The dermatology of marine teleost fish. The normal intergument. Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev. - 1974. -13. - 383-411.

39. Byers H. R., Fugiwara K., Porter K.R. Visualization of microtubules of cell in situ by indirect immunofluorescence. Cell Biol. - 1980. - 77. - 11. - 6657-6661.

40. Copp D. N. The ultimobranchial glands and calcium regulation. J. Fish Physiol. (Hoar W. S., Randall D. J. eds.). - 1969. - 2. - 375-384.

41. Dane P. J., Tucker J.B. Supracellular microtubule alignment in cell layers associated with the secretion of certain fish scale. J. Cell Sci. Suppl. - 1986. - 5. - 273-291.

42. Deuel Т. E. Polypepetide growth factors: roles in normal and abnormal growth. -Ann. Rev. Cell. Biol. 1987. - 3. - 443-492.

43. Fim J.P., Nielson N.O. The inflammatory response of rainbow trout. J.Fish Biol. -1971.-3.-463-478.

44. Frietshe R. A. and Bailey C. F. The histology and calcification of regenerating scale in the blackspotted tompinow, Fundulus olivaceus (storer). J. Fish Biol. 1980.- 16, 693-700.

45. Geraudie J; Monnot MJ; Brulfert A; Ferretti P. Caudal fin regeneration in wild type and long-fin mutant zebrafish is affected by retinoic acid. Int J Dev Biol. - 1995. -39(2).-373-381.

46. Harris J.E., Hunt S. The fine structure of the epidermis of two species of salmonid fish, the atlantic salmon (Salmo salar L.) and the brown trout (Salmo trutta L.). Cell and Tissue Res. - 1975. - 157. - 553-565.

47. Hay E. D. Cell and extracellular matrix: thei organization and mutural dependece. -Modern Cell Biology. 1983. - Vol. 2. - 509-548.

48. Herikson R.C., Matoltsy A.C. The fine structure of teleost epidermis. J. Ultrastruct. Res.- 1968.-21.- 194-232.

49. Hickey A. H. Wound healing in fish Iarwal. J. Exp. Mar. Biol, and Ecol. - 1982. -57. - 149-168.

50. Hildeman W. H. Scales homotransplantation of goldfish ( Carassius auratus). Ann. W. J. Acad. Sci. 1957. - 64. - 775.

51. Huggins C., McCarrol H., Blocksom B. Experiments on the theory of osteogenesis. -Arch. Sur.- 1936.-32.-p.915.

52. Huggins C. Epithelial osteogenesis a biological chain reaction. - Proc.Am.Phil Soc. - 1969.- 113.-453.

53. Iger J., Abraham M., -Dotan A., Fattal В., Rahamim E. Cellular responses of the skin of carp maintained in organically fertilized water. J.Fish Biol. - 1994. - 33. - 711720.

54. Kerr T. The scales of primitive living actinopterygyans. Proc. zool. society Zond. -1955. - 122, 1. - 55-78.

55. Lanzing W. J. R., Wright R. G. The ultrastructure and caicification of the scales of Tilapia mossambica (Peters). Cell Tissue Res. - 1976. - 167. - 37-47.

56. Lanzing WJR., Nigginhotham DR. Scanning microscopy of surface structures of Tilapia mossambica scale. J.Fish Biol. - 1974. - 154. - 251 -264.

57. Maekawa K. and Yamada Y. Some histochemical and fine structural aspects of growing scales of the rainbow trout -1970.- XXI, 2, 70-78.

58. Mawdesley-Thomas L.E., Bucke D. Tissue repair in a poikilothermie vertebrate Carassius auratus. J. Fish Biol. - 1973. -5.- 115-119.59. (Meunier, 1953)

59. Millet C. Effect of calcitonin and ultimobranchialutomy on calcium and bone metabolism in the eel (Anguilla anguilla L.). Calcif. Tissue Res. - 1976. - 20. - 175186.

60. Mittal А. К., Munshi J. S. Structure of the interwater teleost Bagarius bagarius. J. Morphol. - 1970. - 130. -3-10.

61. Montes G.S., Becerra J., Toledo OMS., .Gordilho MA., Junqueira LCU. Fine structure and histochemistry of the tail fin ray in teleosts. Histochemistry. - 1982. - 75. -363-376.

62. Olson O. P., Watabe N. Studies on formation and resorption of fish scales. Ultrastructure of developing scales in newly hatched fry of the sheep shead minnors ( Cyprinodon narietatus). Cell Tissue Res. - 1980. -211.- 303-316.

63. Onozato H., Watabe N. Studies on fish scale formation and resorption. Cell. Tiss. Res. - 1979.-201.-409-422.

64. Oosten Y.V. Physiology of fishes. Acad. Press. - V.l. - 207-244.

65. Phromsuthirak A. Electron microscopy of wound healing in the skin of the Gasterosteus aculeatus. J.Fish Biol. - 1977. - 3. - 463-478.

66. Poleo G, Brown CW, Laforest L, Akimenko MA. Cell proliferation and movement during early fin regeneration in zebrafish.

67. Dev Dyn. -2001. 221(4) .-380-90.

68. Poss KD; Keating MT; Nechiporuk A. Tales of regeneration in zebrafish. Dev Dyn. -2003.-226(2).-202-210.

69. Quilhac A; Sire JY. Spreading, proliferation, and differentiation of the epidermis after wounding a cichlid fish, Hemichromis bimaculatus. Anat Rec. - 1999. -254(3). -435-451. *

70. Rieder CL. The structure of the coldstable kinetochore fiber in metaphase Ptk cells. -Chromosoma. 1981. - 84. - 145-158.

71. Roberts CD. Comparative morphology of spineol scales and their phylogenetic significancase in the Teleostei. Bull. Of marine Science. - 1994. - 52,1. - 60-113.

72. Ч* 72. Roberts R. J. Studies on the skin of Piaice (Pleuronctes plstessa L.). The structure andultrastructure of normal plaice skin. J.Fish Biol. - 1971.-4. 87-98.

73. Roberts R. J. Studies on the skin of Plaice (Pleuronectes platessa L.). The structure and ultrastructure of normal plaice skin. J. Fish Biol. - 1971. - 4. -87-98.

74. Roberts R. J., Bell M., Yong H. Studies on the skin of plaice (Pleuronectes platessa L.). The development of larval plaice skin. J. Fish Biol. - 1975. - 5. - 103-108.

75. Roberts R.J., Bell M., Young H. Studies on the skin of plaice (Pleuronectes platessa L.). The development of larval plaice skin. J. Fish Biol. - 1973. - 5. - 103-108.

76. Santamaria J.A., Mari-Beffa M., Santos Ruiz L., Becerra J. Incorporation bromdezoxiuridine in regenerating fin tissue of the goldfish Carassius auratus. - J. Exp. Zool. - 1996. - 275. - 300-307.

77. Sasse D., Pfeiffer W., Arnold M.Epidermal organ at Cyprinidae. Z. Zellforch. 1970. - 103.-218-231.

78. Schroder J.H. Methods of screening radiation induced mutation in fish. -Methodology for assessing impacts of radioactivity on aguatic ecosystem, Viena. Jech. Rep. Ser. 1979. -190.-381 -402.'

79. Shonborne A.A., Boivin G., Bond C.A. The mineralization processes in Teleost fish scale. Cell tissue res. - 1979. - 202. - 203-212.

80. Shonborne A.A., Meunier F.G. The fine structure of calcified Mandls corpuscles in teleost fish scales. Cell tissue res. - 1981. - 13. - 589-597.

81. Shonborner A. A., Menuier E. J. and Castanet J. The fine structure of calcified Mandl s corpuscles in teleost fish scales. Tissue cell Res. - 1976. - 167. - 37-47.

82. Sire J. Y. Scale in young polypterus senegales are elasmoidi; new phylogenetic implication. The american journal of anatomy. - 1988. - 186. - 315-323.

83. Sire J.-A. A light and ТЕМ study of non-regenerated and experimentally regenerated scales of Lepisosteus oculatus (Holostei) with particular attention to ganoine formation. Anat. Rec. - 1994. - 240. - 189-207.

84. Sire JY, Allizard F, Babiar O, Bourguignon J, Quilhac A. Scale development in zebrafish (Danio rerio). J Anat. - 1997. - 190. 545-561.

85. Sire JY; Huysseune A. Formation of dermal skeletal and dental tissues in fish: a comparative and evolutionary approach. Biol Rev Camb Philos Soc. - 2003. -78. -219-249.

86. Sire JY. Spreading, proliferation, and differentiation of the epidermis after wounding a cichlic fish, Hemichromis bimaculatus. Anat. Rec. 1999.-254. -3. - 435-451.

87. Stevens A., Lowe JS. Histology. Mosby. - 1991.

88. Stucki U., Schmid J., Hammerle CF., Lang NP. Temporal and local appearance of alkaline phosphatase activity in early stages of guided bone regeneration. A descriptive histochemical study in human. Clin. Oral. Implants Res. - 2001. - 12. -121-127.

89. Times H. Developmental structure, morphology of the scales in some teleostean fish. Quart. J. Micr. Sci. - 1906. - 49. -39.

90. Waterman R. E. Fine structure of scale development in the teleost Brachydanio rerio. -1970. -168. -361-380.

91. Weiss R. E., Watabe N. Studies on the biology of fish bone. Bone resorption after scale removal. Сотр. Biochem. Fhysiol. - 1978. - 60 A - 245-251.

92. Weiss R. E., Watabe N. Studies on the biology of fish bone. Ultrustructure of osteogenesis and resorption on octeocytic (cellular) and anosteocytic (acellular) bones. Calcif. Tissue International. - 1979. - 28. - 43-56.

93. Whitear M., Mittal A.K. Lane E. B. EndOtelial layers in fish skin. J. of fish boil. -1980.- 17.-43-65.

94. Yamada J. A fine structural of scale development in the teleost Brachydanio rerio. -Anat. Rec. 1971. - 169. - 361-380.

95. Yamada J. and Watabe N. Studies on fish scale formation and resorption. Finestructure and calcification on the scale in Fundulus heteroctitus (Atheriniformes:fcyprinodontidae). J. Morph. - 1979. - 159. - 49-66.

96. Zylbeberg L., Bereiter-Hahn J., Sire J. Y. The distribution of Tyr- and Glu-microtubules during fish scale regeneration. Eurpean J. of Cell Biol. - 1991. - 54. -132-139.

97. Zylberberg L., Bereiter-Hahn J., Sire J. Y. Cytoskeletal organization and collagen orientation in the fish scales. Cell. Tissue Res. - 1988. - 253. - 597-607.