Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие методологии иммуноанализа почвенных ассоциативных бактерий с использованием препаратов коллоидного золота

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Развитие методологии иммуноанализа почвенных ассоциативных бактерий с использованием препаратов коллоидного золота"

На правах рукописи

j

ETC - -

о

Ln L'"

Дыкман Лев Абрамович

РАЗВИТИЕ МЕТОДОЛОГИИ ИММУНОАНАЛИЗА ПОЧВЕННЫХ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРЕПАРАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА

03.00.07- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов, 1996

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН).

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Игнатов В.В., кандидат физико-математических наук, доцент Щеголей С.Ю.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Конное Н.П.,

доктор биологческих наук, доцент Панасенко В.И.

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (г. Оболенск)

Защита состоится " 19 " декабря 1996 г. в 13 час. на заседании Диссертационного совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан ноября 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Корнеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Судя по научным публикациям последних лет, биологи-еская фиксация азота атмосферы остается проблемой, значение которой возрас-ает и выходит далеко за рамки биологии и сельского хозяйства. Главные причи-:ы этого сводятся к тому, что производство азотных минеральных удобрений по-ребляет до трети энергии, выделяемой на сельское хозяйство в развитых странах, их применение ведет к крайне неблагоприятным экологическим последствиям, "аким образом, наиболее важной альтернативой использованию азотных удобре-ий следует признать активное развитие и внедрение в сельскохозяйственную рактику принципов и методов биологической азотфиксации (Мишустин, Черепов, 1979).

В анализе взаимоотношений почвенных диазотрофов с растениями одно из ;ентральных мест занимают исследования молекулярных основ контактных (и об-[енных) взаимодействий между растительной и микробной клетками. В связи с гим внимание исследователей привлекают поверхностные структуры партнеров, частвующих в такого рода взаимодействиях (De Maagd, Lugtenberg, 1987, Smit et 1., 1989). При решении этой проблемы хорошую перспективу, очевидно, имеют одходы, связанные с применением методов иммунохимии (Kabat, 1976, Петров, 1ерезин 1982, Polak, Van Noorden, 1987). Благодаря высокой чувствительности и пецифичности, реакции антиген + антитело и их аналоги (углевод + лектин, фер-[ент + субстрат и т.п.) создают благоприятную аналитическую основу для иден-ификации разнообразных природных соединений, для изучения их физико-имических и биологических свойств.

Одним из наиболее перспективных и быстро развивающихся аналитических редств иммуноцитохимии становится в последние годы метод, связанный с ис-ользованием в качестве биоспецифических маркеров конъюгатов коллоидного олота (КЗ) (Roth, 1983, Horisberger, 1985, De Mey et al. 1986, Богатырев, 1995). ¡ысокая электронная плотность золота и сильное поглощение им света в видимой бласти спектра обеспечивают высокую эффективность данной метки при ее ис-ользовании, например, в методах световой и электронной микроскопии (как про-вечивающей, так и сканирующей). Интенсивная окраска золотосодержащего [аркера позволяет также проводить непосредственную визуализацию продуктов иоспецифической реакции в методах гомогенного и гетерогенного твердофазного ио- и иммуноанализа.

Несмотря на известные достоинства золотой метки, примеры ее систематиче-кого применения в микробиологической практике и, конкретно, в исследованиях очвенной микрофлоры пока весьма немногочисленны. Это можно, по-видимому, бъяснить недостаточной развитостью методологии иммуноанализа с применени-м КЗ. В том числе потребностью в создании новых биомаркеров на основе пер-пективных зондов, удовлетворяющих запросам исследовательской практики в бласти почвенной микробиологии, разработку биохимических и физико-имических основ аналитических методик с применением широкого спектра мар-еров - конъюгатов КЗ в сочетании с методами световой и электронной микроско-ии, твердофазного био- и иммуноанализа.

Цель работы. В данной работе мы попытались использовать преимущества иоспецифических маркеров - конъюгатов коллоидного золота для усовершенст-ования методологии иммуноцитохимического анализа клеточной поверхности очвенных ассоциативных азотфиксирующих бактерий. При этом были использо-аны, в основном, представители родов Azospirillum и Agrobacterium, которым уде-

ляется большое внимание исследователей, изучающих молекулярно-генетические механизмы ассоциативных взаимодействий микроорганизмов с растениями. В соответствии с данной целью, в работе решались следующие конкретные задачи:

1. Разработать методику получения и варианты использования некоторых новых перспективных иммунохимических маркеров.

2. Разработать и апробировать методику определения относительной гидрофобное™ клеточной поверхности микроорганизмов с использованием золотосодержащего "катионного" маркера.

3. Исследовать особенности иммуноанализа на частицах золя золота в приложении к изучению биоспецифических взаимодействий.

4. Проанализировать варианты использования конъюгатов коллоидного золота в сочетании с методами световой и электронной микроскопии для изучения процессов колонизации корней пшеницы почвенными диазотрофами, для ультраструктурных исследований клеточной поверхности почвенных бактерий.

5. Оценить возможность использования коллоидного золота в качестве носителя при иммунизации животных для пол)'чения антител к низкомолекулярным соединениям.

Научная новизна работы. Впервые разработаны методики получения и варианты использования новых биомаркеров на основе перспективных зондов: фал-лоидина, целлюлазы, фетуина, полиэтиленимина, меченных коллоидным золотом. Последний из перечисленных зондов использован в разработке оригинальной методики определения относительной гидрофобности клеточной поверхности. Показано ее согласие с традиционными методами при том, что данная методика превосходит их в простоте и экспрессности. Впервые с помощью метода дот-анализа целых клеток (cell-gold immunoblotting) проведено изучение взаимодействия штамма A. radiobacter 5D-1 с антителами, целлюлазой и пектинами, меченными КЗ. Выявлены мутанты данного штамма, утратившие способность взаимодействовать с вышеперечисленными зондами. Блот-анализ с применением золотой метки сделал возможным определение участков полного электрофоретического спектра липополисахаридов (ЛПС) штамма A. brasilense Sp7, ответственных за иммунный ответ. С применением биоспецифических зондов - конъюгатов КЗ впервые проведено исследование локализации О-специфических полисахаридов, лектиновых рецепторов и целлюлозосодержащих компонентов на поверхности бактериальных клеток A. brasilense и A. radiobacter с использованием метода просвечивающей электронной микроскопии. Показана целесообразность и разработана методика использования коллоидного золота в качестве носителя при иммунизации животных для получения антител к биотину.

Практическая значимость работы. На основе разработанного и защищенного патентом РФ способа получения биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ в рамках Госзаказа Министерства науки и технической политики РФ создан Лабораторный технологический регламент и наработаны образцы 129 препаратов. Синтезированные биомаркеры и разработанные новые методологические приемы используются в ряде лабораторий ИБФРМ РАН. Кроме того, часть образцов передана по заказам 22-м организациям, включая академические и прикладные научно-исследовательские институты, Вузы, лечебные учреждения России и стран СНГ для проведения работ, связанных с решением широкого круга научных и прикладных задач в области биологии, биотехнологии и медицины.

Результаты работы были представлены на Международной выставке "Достижения Российской биотехнологии" (ФРГ, 1996 г.).

На защиту выносятся следующие основные положения:

Методики получения и варианты использования новых иммунохимических маркеров - конъюгатов КЗ на основе универсальных зондов: фаллоидина, целлюла-зы, фетуина, полиэтиленимина.

Новый метод определения относительной гидрофобности клеточной поверхности с использованием золотосодержащих "катионных" маркеров. Результаты иммуноцитохимических исследований клеточной поверхности у представителей почвенных диазотрофов с использованием препаратов КЗ в методах твердофазного иммуноанализа, световой и электронной микроскопии. Методика применения коллоидного золота в качестве носителя при иммунизации животных для получения антител к биотину.

Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур ФХКС) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих тем: "Изучение мо-кулярно-генетических механизмов узнавания, контакта и обмена метаболитами оспирилл и культурных злаков", научный руководитель темы д.б.н. профессор В. Игнатов, № гос. регистрации 01860024516; "Разработка эффективных тест-стем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений" научный ководитель темы к.ф.-м.н. зав. лаб. С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 890017743.

Работа поддерживалась Министерством науки и технической политики РФ в мках программы "Средства обеспечения исследований по физико-химической юлогии и биотехнологии" (Распоряжения № 1508ф от 11.05.93 г. и последующие). 1СТИЧНО данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда ■ндаментальных исследований (код проекта 94-03-09286) и Международного на-ного фонда (фонда Сороса) (номер гранта RNR000). Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы предав лялись, докладывались и обсуждались на: Всесоюзной школе "Электронная жроскопия в молекулярной биологии", Звенигород, 1990; V International mposium on Nitrogen Fixation with Non-legumes, Florense (Italy), 1990; XV ternational Congress of Biochemistry, Jerusalem (Israel), 1991; VIII Eastern European mposium on Biological Nitrogen Fixation, Saratov (Russia), 1992; I International inference on Polysaccharide Engineering, Trondheim (Norway), 1994; I European itrogen Fixation Conference, Szeged (Hungary), 1994; NATO Advanced Research orkshop on Azospirillum and Related Microorganisms, Sarvar (Hungary), 1994; ternational Workshop on Associative Interactions of Nitrogen-Fixing Bacteria with ants, Saratov (Russia), 1995; International Symposium on Biomedical Optics JROPE'95, Barselona (Spain), 1995; Beijerinck Centennial Conference Microbial lysiology and Gene Regulation: Emergings Principles and Applications, Hague (The :therlands), 1995, а также на заседании Саратовского отделения Всесоюзного юхимического общества и на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы ключая одно изобретение) в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав юпочающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, ложение полученных результатов и их обсуждение), заключения, списка исполь-ванных литературных источников и приложения. Работа изложена на 130 стратах, иллюстрирована 15 рисунками и включает 5 таблиц. Список использован-■IX литературных источников включает 187 наименований.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор представлен в первой главе, где рассмотрены история и современное состояние проблемы ассоциативной азотфиксации; приведены некоторые данные о важнейших свойствах и методах изучения клеточной поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий и о применении иммунохимических методов в микробиологической практике. Наиболее подробно изложены вопросы, касающиеся основных свойств и аспектов возможного применения коллоидного золота и его конъюгатов с биомакромолекулами.

Сведения об использованных материалах и методах изложены во второй главе. Кроме того, некоторые оригинальные методики представлены в соответствующих разделах третьей - пятой глав.

В работе использованы культуры Azospirillum brasilense Sp7, Sp 107, Sp245, JM125A2, S27, KR77, UQ1794, SpBrl4; Azospirillum lipoferum Sp59b, RG20a, 46, 65; Agrobacterium radiobacter 5D-1. При необходимости наращивания большого количества биомассы культуры высевали на жидкую синтетическую среду и растили на термостатированной качалке при температуре +28°С в течение 18 часов. В остальных случаях и при необходимости оперативного контроля за морфологией колоний культуру азоспирилл и агробактерий высевали на плотную питательную среду LB (Bulow, Dobereiner, 1975).

Определение относительной гидрофобности клеточной поверхности проводили с использованием методов гидрофобной хроматографии, разделения в двухфазных системах, солевой агрегации, способности к адгезии на некоторых полимерах (Сингуров, 1984; Dillon et al., 1986). Диск-электрофорез липополисахаридов в по-лиакриламидном геле проводили по методу, изложенному в работе Хичкока, Брауна, 1983.

Методики синтеза коллоидного золота различных размеров, дот- и блот-анализа, свето- и электронно-микроскопических исследований, техники усиления серебром результатов биоспецифических реакций изложены во второй главе диссертации в виде протоколов.

В работе использовали стандартное оборудование и реактивы ЛФХКС и других лабораторий ИБФРМ РАН, в том числе: спектрофотометр "Specord M 40" (Германия), высокоэффективный жидкостной хроматограф (FPLC) (Швеция), микроскоп электронный просвечивающий "Tesla BS-500" (Чехословакия), микроскопы "Люмам И-2" и "Биолам M" (JIOMO, СССР) и др.

Полученные результаты и их обсуждение

1. Твердофазный био- и иммуноанализ с использованием золотых меток в сетютипировании и изучении поверхностных свойств почвенных диазотрофов

В целях развития инструментальной базы твердофазного иммуноанализа, приспосабливаемого к изучению растительно-микробных взаимодействий, нами были синтезированы новые биоспецифические маркеры на основе универсальных зондов, которые отсутствуют в каталогах других производителей и лишь упоминаются в отдельных работах (Roth, 1983, Berg et al., 1988, Lachapelle et al., 1988). К их числу относятся фаллоидин, целлюлаза, фетуин и полиэтиленимин, меченные КЗ.

Фаллоидин - один из токсинов бледной поганки (Amanita phalloïdes), бицикли-ческий гептапептид с молекулярной массой 846.9. Он обладает способностью прочно связываться с полимерным (филаментным) актином (F-актином). Конъю-

т фаллоидин+КЗ был использован нами для электронно-микроскопической (ентификации и изучения характера мечения филаментов актина, а также для явления С- и Р-форм актина и количественной оценки чувствительности марке: в дот-анализе. Поскольку на начальных этапах взаимодействия ассоциативных жроорганизмов с клетками корней растений активные изменения претерпевает я система макромолекул, составляющих понятие цитоскелета, то, по-видимому, личие маркера на один из самых характерных белков цитоскелета - актин, мо-;т существенно помочь в изучении этого процесса.

Целлюлаза (или вернее целлюлазный комплекс) - это группа гидролитических ;рментов, обладающих способностью гидролизовать нерастворимую целлюлозу [лоть до ее мономера - глюкозы. Целью получения маркера целлюлаза+КЗ было шение задачи поиска целлюлозных фибрилл (или их глюкановых предшествен-1Ков) у ряда штаммов А. ЪгазИете и А. гайюЪаЫег. Результаты исследований для оспирилл частично обобщены в работах Матвеева с соавт. (1992), Богатырева 995). В данной работе (см. ниже) приведены результаты исследований для штам-г А. гайюЪасгег 5Э-1, проведенных методами электронно-микроскопического и ердофазного иммуноанализа. Одним из активно развивающихся вариантов гисто- и цитохимического анали-является способ выявления компонентов тканей и клеток мечеными пектинами, гпрямые методы лектиновой гистохимии предполагают первоначальную образку среза нативным пектином, а затем вторым реагентом, связанным с соответ-вующей меткой. В качестве специфичных агентов на лектины используют муцин, [реоглобулин, пероксидазу, овомукоид, а также фетуин из фетальной сыворотки лят. Фетуин - гликопротеид, составляющий 40% белков эмбриональной стальной) сыворотки. В состав его углеводной части входят сиаловая кислота, ксозамин, фукоза, галактоза и манноза. Таким образом, фетуин является универ-льным зондом для большинства наиболее широко используемых в гистохимии ктинов.

Помимо лектиновой гистохимии, мы использовали маркер фетуин+КЗ в целях »иска лектинов на поверхности азоспирилл. Нами был проведен дот-анализ ак-:вных и неактивных по тем агглютинации вариантов штамма А. ЬгазПепБе Бр7 с пользованием антилектиновых антител (АТ) и фетуина, меченных КЗ. Реакция :тивных и неактивных клеток одного и того же штамма с АТ оказалась идентична, в то время как с фетуином взаимодействуют клетки только активного штам-I. Эти результаты согласуются с данными, представленными в работе Никитиной :оавт. (1994), где с помощью методов гель-фильтрации и электрофореза показа), что на поверхности неактивных по гемагглютинации клеток азоспирилл, вы-щенных на богатых азотом средах, присутствуют лектины, идентичные по угле-|ДНой специфичности лектинам активных клеток, но с заблокированными угле-|дсвязывающими свойствами.

В работе Солововой с соавт. (1995) было показано, что для активно адгези-'ющих клеток А. гасИоЪасгег 50-1 характерно наличие на их поверхности особых ториллоподобных образований, по внешним признакам аналогичных структу-1М, которые образуются при взаимодействии ризобий с бобовыми и патогенных жтерий с двудольными растениями. Методом транспозонного мутагенеза были »лучены не связывающие калькофлюор мутанты А. гасИоЬас1ег 5Б-1 с измененной юсобностью к продукции поверхностных полисахаридов. Некоторые из них 25,362) показали пониженную способность прикрепляться к корням однодоль-.IX растений.

Мы провели исследования углеводных компонентов исходного и мутантных (предположительно по поверхностным полисахаридам) штаммов на уровне целых клеток с использованием биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ. Для оценки эффективности взаимодействия AT, целлюлазы и глюкозоспецифичных лектинов (UEA, Con А) с клеточной поверхностью использовали методы иммуно-преципитации в растворе и дот-анализ целых клеток с золотой меткой (cell-gold immunoblotting). Было установлено, что мутанты 225 и 362, в отличие от исходного штамма, утратили способность взаимодействовать со специфичными антителами, полученными против углеводов клеточной поверхности (Матора, 1992), цел-люлазой и глюкозоспецифичными лектинами, меченными КЗ. Мутанты 227, 228, 229 (табл. 1) сохранили эту способность. Эти данные были подтверждены электронно-микроскопической визуализацией соответствующих структур с использованием AT и целлюлазы, меченных КЗ.

Таблица 1.

Взаимодействие клеток штамма Л. radiobacter 5D-1 и его мутантов с биоспецифическими маркерами

Штамм

Маркер 5D-1 225 227 228 229 362

Антитела + КЗ + - + + + -

Целлюлаза + КЗ + - + + + -

Лектины Con A, UEA 1 + КЗ + - + + + -

Полученные результаты позволяют предположить, что в состав фибриллопо-добных структур у непатогенных агробактерий могут входить вещества полисаха-ридной природы (возможно целлюлоза).

Одной из важнейших характеристик почвенных азотфиксирующих микроорганизмов, представляющих интерес с точки зрения их взаимодействия с растениями, является относительная гидрофобность их клеточной поверхности. Это объясняется тем, что на первых этапах взаимодействия почвенных бактерий с тканями растений существенную роль играют процессы адгезии, а относительная гидрофобность клеточной поверхности во многом определяет ее адгезивные свойства. Традиционными способами исследования этого интегрального свойства клеток являются: определение угла смачивания, гидрофобная хроматография, разделение в двухфазных системах, солевая агрегация, способность к адгезии на некоторых полимерах и т.д. В предыдущих работах мы, используя большинство вышеперечисленных методов, провели измерения относительной гидрофобности ряда штаммов азоспирилл и обнаружили хорошую корреляцию данных, полученных различными методами. Однако на наш взгляд, традиционные методы определения относительной гидрофобности клеточной поверхности достаточно трудоемки и, в частности, требуют существенных затрат времени.

Поэтому нами были проанализированы возможности предлагаемого оригинального метода оценки гидрофобности: дот-блот анализа целых клеток с использованием катионных маркеров - конъюгатов КЗ. Известно, что степень гидрофобности существенно зависит от заряда клеточной поверхности микроорганизмов. Поэтому естественно допустить, что катионные зонды, меченные КЗ, будут лучше связываться с отрицательно заряженной клеточной поверхностью тех микробов, которые принято считать более гидрофильными.

В качестве катионных маркеров мы использовали конъюгаты поли-Ь-лизина и полиэтиленимина с КЗ. Поли-Ь-лизин в качестве зонда впервые был использован в работе Скутельски с соавт. (1986). Он применялся в электронной микроскопии для

1ркнрования отрицательно заряженных участков плазмалеммы. Следует, однако -метить, что данный препарат, на наш взгляд, сложен в приготовлении и недос-точно устойчив при хранении. Поэтому мы впервые применили в качестве кати-шого маркера конъюгат КЗ с полиэтиленимином. Для этого была использована ¡стандартная (одностадийная) процедура получения данного маркера, основан-1Я на том, что полиэтиленимин является одновременно и восстановителем золо-»хлористоводородной кислоты (ЗХВК) и агентом, стабилизирующим КЗ.

В этой связи необходимо подчеркнуть, что качество маркеров - конъюгатов КЗ большой степени зависит от свойств метки - собственно частиц КЗ. Особое знание среди этих свойств имеют размеры коллоидных частиц и монодисперсность ля, зависящие от целого ряда физико-химических факторов. Однако до сих пор )актически все известные нам методики получения золей золота являются полу-ширическими, не имеющими четкого обоснования с точки зрения механизмов их [нтеза.

Механизм конденсационного восстановления ЗХВК с образованием коллоидах частиц определяет кинетику данного процесса и морфологические особенно-и формирующейся дисперсной фазы. Последние, в свою очередь, достаточно тко проявляются в спектрах поглощения света суспензиями. Поэтому, изучая за-¡симость этих спектров от времени, можно сделать заключение о реализации того ш иного физико-химического механизма образования суспензий и, что весьма шественно, обеспечить эффективный контроль за ходом формирования частиц, го делает возможным получение КЗ с заданными параметрами взвесей.

Мы провели спектрофотометрическое изучение кинетики образования золей лота при восстановлении ЗХВК двумя различными по химической структуре сомнениями: цитратом натрия и полиэтиленимином. Опыты проводили непосред-венно в кювете спектрофотометра "Бресогс! М 40", используя приставку для тер-эстатирования проб. При этом зарегистрировали существенные различия в ско->стях реакции восстановления (относительно быстрого для цитрата натрия и ;ачительно более медленного для полиэтиленимина) и в спектральных характе-1стиках формирующихся суспензий (рис. 1).

Рис. 1 Спектры ослабления золей золота, полученных в процессе восстановления ЗХВК полиэтиленимином (А) и цитратом натрия (В)

А

В

В обоих случаях начальные этапы реакций характеризуются снижением оптической плотности на коротковолновом участке спектра, что обусловлено уменьшением концентрации золота, находящегося в ионной форме. При этом поглощение в области спектра 500-550 нм, характерной для золей золота, оказывается незначительным. Затем, однако, кинетика процессов восстановления ЗХВК в рассматриваемых случаях значительно отличается. При использовании цитрата натрия наблюдается резкое нарастание оптической плотности в длинноволновой области с постепенным смещением максимума полосы поглощения от 700 до 520 нм. В случае же с полиэтиленимином возникновение дополнительной полосы поглощения не наблюдается, а отмечается плавный рост оптической плотности с максимумом поглощения при 520 нм.

Зарегистрированные нами различия спектров поглощения и их временной зависимости при использовании двух реагентов можно, по-видимому, объяснить с позиций теории восстановления ЗХВК по механизму зародышеобразования Жиг-монди. Такой механизм реализуется, вероятно, в случае с цитратом натрия. Согласно данной теории, формированию "зрелых" частиц КЗ при достаточной активности восстановителя предшествуют этапы образования зародышей новой фазы и их обратимой агрегации (пептизации) с образованием структур, размер которых заметно превосходит конечный размер взвешенных золотых частиц. Этим, возможно, и обусловлены появление и последующая трансформация максимума поглощения при длине волны 700 нм при использовании цитрата натрия.

Активность полиэтиленимина в качестве восстановителя ЗХВК заметно ниже. К тому же, обладая катионными свойствами и достаточно большой молекулярной массой и адсорбируясь на поверхности частиц (обладающих относительно большим отрицательным зарядом), данное соединение оказывает стабилизирующее действие на суспензию КЗ. Все это ограничивает критический размер зародышей новой фазы на уровне, сопоставимом по порядку величины с итоговым размером частиц КЗ, уменьшает скорость их роста и препятствует пептизации. Об этом свидетельствует практическая неизменность во времени положения максимума полосы поглощения света формирующейся суспензии при длине волны 520 нм.

Таким образом, полученные результаты позволяют констатировать, что, выбирая тот или иной восстановитель и принимая во внимание особенности кинетики формирования коллоидной фазы, можно, в принципе, получать готовые маркеры с заданным размером частиц КЗ. Именно таким способом был получен маркер полиэтиленимин+КЗ со средним диаметром частиц 20 нм, который мы использовали для определения относительной гидрофобности почвенных микроорганизмов.

В качестве объектов использовали культуры R- и S-вариантов A. brasilense Sp7. Процедура опыта была аналогична описанной методике cell-gold immunoblotting. Эксперименты показали, что предлагаемый метод отличается простотой реализации, а его результаты согласуются с данными традиционных методов анализа относительной гидрофобности (табл. 2).

Необходимо отметить, что катионные маркеры - конъюгаты КЗ могут быть использованы также для изучения гетерогенности популяций микроорганизмов по степени гидрофобности клеток с использованием световой и электронной микроскопии.

Успехи аналитической иммунохимии, достигнутые при исследованиях различных видов микроорганизмов, вступающих в сложные паразитические, симбиоти-ческие и ассоциативные взаимоотношения с животными и человеком, дают основания пока еще немногочисленным попыткам распространить иммунологические

Таблица 2.

Определение относительной гидрофобности клеточной поверхности К- и 5-вариантов штамма А. ЪтахНеюе Бр7

Метод

Вариант штамма А.ЪгазИете Бр7 Гидрофобная хроматография Солевая агрегация Адгезия на полистироле Разделение в 2-х фазных системах Катнон-ное мече-ние

И-форма 27%* 40%** - нижн. фаза +

5-форма 72% 15% + верхн. фаза -

- индекс гидрофобности (определяется отношением оптических плотностей клеток задер-

жавшихся на колонке и контроля); * - наименьшая концентрация сульфата аммония, вызывающая бактериальную агрегацию.

одходы на нетрадиционную (с точки зрения практической иммунологии) область очвенной микрофлоры. С точки зрения молекулярных основ взаимоотношений очвенных азотфиксирующих бактерий с растениями большой интерес представ-яют антигенные свойства компонентов их клеточной поверхности, принадлежа-шх к различным типам биополимеров. Нам кажется достаточно обоснованным редположение, что (помимо чисто структурных аспектов) результаты подобных сследований интересны, в частности, потому, что компоненты поверхности бак-гриальной клетки, проявляющие наибольшую активность при ее взаимодействи-х с компонентами иммунной системы животных, могут оказаться также активны-и "посредниками" при реализации контактных взаимодействий данных микроор-шизмов с растениями.

Для более детального изучения антигенных особенностей клеточной поверхно-ги азоспирилл мы применяли методику блот-анализа ЛПС бактерий после разде-ения его в полиакриламидном геле.

Для неспецифической окраски перенесенного материала на мембране обычно спользуют различные красители - индийские чернила, амидочерный, кумасси риллиантовый голубой, анилиновый голубой, нафталиновый черный, прочный гленый, толуидиновый голубой и др. Однако методики, основанные на примене-ии этих красителей, достаточно трудоемки, дороги и обладают невысокой чувст-ительностью. Мы для этой цели использовали "золотой" краситель, впервые редложенный в работе Моереманса с соавт., 1984.

"Золотой" краситель представляет собой золь золота, частично стабилизиро-анный синтетическими полимерами типа ПЭГ-20М, Т\уееп-20 и др., который в ислых условиях обладает способностью неспецифически взаимодействовать с иомакромолекулами. Это происходит за счет гидрофобных и электростатических заимодействий частиц КЗ с макромолекулами, а также за счет ионных взаимодей-гвий стабилизирующих полимеров с тиоловыми и свободными аминогруппами сновных белков.

На рисунке 2(А) представлены результаты подобного окрашивания препарата ¡ПС штамма А. Ьгахйете Бр7.

Для того чтобы определить какие именно участки полного электрофоретиче-кого спектра ЛПС ответственны за иммунный ответ, мы провели их специфиче-кое выявление. В качестве первичных АТ мы использовали АТ к целым клеткам ггамма А. ЬгсиНепке Бр7, полученные по методике, описанной в работе Матора 1992). В качестве детектирующего агента - антикроличьи АТ, меченные КЗ. Ре-у'льтаты приведены на рисунке 2(В).

По нашему мнению, способ локализации ! мест связывания с гомологичными AT изоли-

j «» рованных углеводных компонентов внешней

-: " мембраны азоспирилл при их электрофорети-

ческом разделении может оказаться весьма i перспективным в дальнейших иммунохимиче-

j ских и физиолого-биохимических исследова-

! ниях этих микроорганизмов. В частности, при

создании иммунологической тест-системы с перспективой ее использования в таксономических (серотипирование), экологических и молекулярно-генетических исследованиях 4 почвенных бактерий.

A g Метод дот-блот анализа с применением

„ , „„,. биоспецифических маркеров - конъюгатов

Рис. 2 Результаты слот-анализа ЛПС тг„ „ 5 ,

A. brasilense SP7. А - неспеци- К3> развиваемым в нашей лаборатории, нахо-

фическое окрашивание, В - дит все более широкое распространение и специфическое окрашивание с признание благодаря его высокой чувстви-использованием гомологичных тельности и простоте выполнения. Однако AT этот метод имеет ряд ограничений, среди ко-

торых, в первую очередь, необходимо отметить трудности строгой количественной интерпретации результатов, невозможность работы с низкомолекулярными лиган-дами и значительные затруднения, возникающие при выявлении компонентов сложных биологических систем (гомогенаты, экссудаты и т.п.).

Известен альтернативный вариант иммуноанализа с использованием частиц коллоидного золота, предложенный Лойверинг с соавт. (1981) и получивший название иммуноанализа на частицах золя (sol particle immunoassay, SP1A). В этом методе используются два важных свойства золотых золей: их типичный яркий красный цвет, который практически не изменяется при адсорбции на частицах золота высокомолекулярных соединений, и значительное изменение спектра поглощения и, следовательно, цвета золя, сопровождающее агрегацию частиц. Это изменение спектра поглощения легко детектируется спектрофотометрически или визуально. В данном случае в качестве твердой фазы выступают сами золотые частицы.

Метод SPIA в авторской интерпретации довольно прост в исполнении. Алик-воты забуференной взвеси золотосодержащего маркера и раствора исследуемого образца смешивают в реакционном сосуде. В течение инкубационного периода (0.5 - 2 часа) контролируют положение и величину максимума спектра поглощения суспензии, либо визуально оценивают ее цвет. Если в результате биоспецифической реакции, реализуемой на поверхности коллоидных частиц, произошла дестабилизация золя, частицы КЗ агрегируют, что приводит к существенным изменениям в спектре поглощения суспензии с заметным изменением ее цвета (с красного на голубой или серый). Для количественной регистрации результатов реакции возможно применение широко распространенных спектрофотометров и колориметров.

Важно то, что в качестве выявляемых в этом методе лигандов могут быть использованы низкомолекулярные соединения (гормоны, витамины и т.д.), а также вещества, находящиеся в составе сложных многокомпонентных биологических жидкостей (крови, растительных экстрактов и др.).

Предварительная серия экспериментов была проведена на моделях: антитела отив IgG человека или протеин А, меченные КЗ + нормальная человеческая сы-ротка. Измерения проводили на приборе "Specord М 40". Однако существенного фекта мы не получили. Произошло незначительное смещение положения максима спектра поглощения в длинноволновую область и незначительный рост ве-чины максимума, а также уширение длинноволновой части (правого крыла) ектра экстинкции. Визуально цвет раствора не изменялся. В следующей серии экспериментов были использованы пары типа углевод -ктин: фетуин+КЗ и овомукоид+КЗ против WGA, PNA и Con А. Наиболее под-бно была исследована временная и концентрационная зависимости оптических ойств системы фетуин+КЗ против WGA. Для этого непосредственно в кювете ектрофотометра "Specord М 40" смешивали стандартные суспензии маркера с створами лектина различных концентраций (в серии их последовательных двой-ix разведений) от 100 до 3 мкг лектина в расчете на 1 мл реакционной смеси. Ре-льтаты реакции регистрировали через каждые 5 мин в течение получаса. На основе полученного таким образом ряда спектральных кривых был постро-график зависимости положения максимумов светоослабления от концентрации времени протекания реакции. По этим данным был сделан вывод о том, что наи-inee информативным является участок, соответствующий первым 5 минутам ре-ции, в течение которых происходит наиболее заметное изменение данного пара-яра. Причем угол наклона кинетических кривых практически линейно зависит концентрации выявляемого компонента, что позволило построить калибровоч-то кривую для определения концентрации WGA, добавляемого к суспензии фе-ин+КЗ. Визуально реакция проявляется в изменении цвета раствора с красного i голубой. Аналогичные результаты были получены и для остальных из перечис-нных выше систем углевод + лектин. В качестве контроля были использованы 1еси золей с раствором БСА, при этом описанных выше изменений оптических .рактеристик зарегистрировано не было.

Таким образом, в каждом конкретном случае a priori следует допустить воз-эжность одного из двух исходов биоспецифических взаимодействий, реализуема на частицах коллоидного золота в суспензии. В первом случае (системы типа >ликлональные антитела против IgG + IgG и протеин А + IgG), очевидно, проис->дит образование второго стабилизационного белкового слоя на золотых части-IX без потери агрегативной устойчивости золя. Во втором случае (системы типа :ктин + углевод, моноклональные AT к различным сайтам антигена + АГ) в ре-сционной смеси, по-видимому, возникают условия для реализации агтлютинаци-шых явлений. Сопутствующие им изменения оптических характеристик зависят г концентрации вносимого в суспензию вещества, что может послужить основой тя его количественного определения (в том числе в составе различных смешан-aix систем, например, растительных экстрактов). Выяснение конкретных физико-шических механизмов биоспецифических реакций на поверхности частиц золо->ix золей, которые обусловливают отмеченные различия, требует, очевидно, прошения специальных исследований.

Цитохимическое изучение почвенных азотфиксирующих микроорганизмов на основе микроскопических методов с применением коллоидного золота

Изучение процессов колонизации корней растений различными штаммами очвенных микроорганизмов имеет важное теоретическое и прикладное значение, ^многочисленные работы такого типа обычно выполняются с привлечением тектронной просвечивающей и сканирующей микроскопии. Однако процедуры

препаративной подготовки объектов для электронной микроскопии достаточно дороги и трудоемки. Поэтому, учитывая потребности в проведении серий экспериментов с большим количеством различных микробных штаммов, мы решили исследовать возможности более доступного метода световой микроскопии с применением биоспецифических зондов, меченных КЗ.

Принципы визуализации мест связывания выявляемых биологических структур с золотосодержащими маркерами в световом микроскопе основаны на свойствах коллоидного золота поглощать (просвечивающая техника) и рассеивать (темнопольная и эпиполяризационная оптика) видимый свет. Преимущество золотых меток перед, например, флуоресцентными заключается в возможности практически неограниченного числа повторных регистрации мечения, поскольку препараты, меченные КЗ, могут храниться длительное время без потери интенсивности окрашивания.

В мировой исследовательской практике известны приборы, позволяющие увидеть частицы золота нанометровых размеров, например, микроскоп "Ь'апо\чс1". Как альтернатива, нами была предпринята попытка реализации эпиполяризаци-онной технологии путем модификации микроскопов отечественного производства "Люмам И-2" и "Биолам М". Для этого в отсеки для светофильтров верхних осветителей были помещены поляризаторы, а анализатор был установлен над делительной пластинкой под окулярным тубусом. Скрещивание направлений векторов поляризации света добивались путем поворота поляризатора. Использовали верхнее освещение через объективы с опак-иллюминаторами (темное поле) и люминесцентные объективы (светлое поле). С целью монохроматизации света применяли красный светофильтр.

В качестве моделей использовали влажные препараты суспензии микроорганизмов А. brasilen.se 5р245, меченные непрямым способом маркером протеин А+ КЗ-ЗО, и те же клетки, адсорбированные на корнях пшеницы. В результате предложенной модификации достигался максимальный контраст, а меченые бактерии (в отличие от немеченых) наблюдались относительно фона как более светлые.

Для того чтобы убедиться в том, что в эпиполяризации видны именно требуемые метки, мы провели мечение золотом ослиных антикроличьих АТ, меченых ФИТЦ. Таким образом, один и тот же зонд был помечен сразу двумя метками. Подготовив препарат клеток азоспирилл и обработав его последовательно штам-моспецифическими АТ и маркером анти-АТ+ФИТЦ+КЗ, мы установили, что клетки, дающие флуоресценцию, одновременно были видны и в эпиполяризации.

Однако, при наблюдении бактерий на корнях растений контраст оказался недостаточным для того, чтобы можно было отличить меченые клетки от сильно преломляющих свет растительных тканей. Удовлетворительного контраста удалось добиться только с использованием методики усиления меток солями серебра. В связи с этим необходимо отметить, что если в качестве метки при работе на световом уровне используют коллоидное золото, то интенсивность розовой окраски 6 местах образования иммунных комплексов при нормальной системе освещения может быть довольно низкой. Однако, используя методику усиления солями серебра, с помощью которой достигается увеличение размеров частиц до 80-100 нм, мы регистрировали четкие различия между мечеными и немечеными клетками как в суспензии, так и на корнях растений.

Таким образом, нами было показано, что метод эпиполяризационной микроскопии с использованием КЗ и модификацией серийных световых микроскопов и метод просвечивающей микроскопии с использованием методики усиления солями

ребра позволяет, в принципе, достаточно эффективно изучать процессы колони-ции корней растений почвенными микроорганизмами.

Следующая часть нашей работы была связана с методом электронной микро-:опии. Заметим, что иммунозолотая цитохимия в сочетании с просвечивающей рансмиссионной) электронной микроскопией (ТЭМ) традиционно используется 1я высокоспецифичной, точной ультраструктурной идентификации и локализа-ш клеток и клеточных структур в животных тканях. Однако попытки примене-1я этой методики в почвенной микробиологаи для изучения растительно-1ктериальных взаимодействий и, в частности, в исследовании структуры клеточ->й поверхности ассоциативных микроорганизмов предпринимались крайне ред-

Мы использовали этот метод для изучения характера взаимодействия различ-.IX биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ (АТ, лектинов, ферментов) с [еточной поверхностью почвенных бактерий родов Агозртйит и Agrobacterium.

На рисунке 3 приведена микрофотография клетки штамма А. ЬтазИеюе Бр7, ме-нной конъюгатом \УОА+КЗ. Обращает I себя внимание тот факт, что, как и в учае использования маркера АТ+КЗ, 1стицы золота располагаются равномер-> по всей поверхности бактериальной гетки и не связаны с какими-либо фила-:нтами. Периферическое расположение цепторов связывания с агглютинином родышей пшеницы (как и 0-ецифического АГ), по нашему мнению, зжет косвенно свидетельствовать об их [астии во взаимодействии бактерий с ¡стениями.

Как было показано выше, клетки гамма А. гайюЪас1ег 5Б-1 выявляются в >т-анализе маркером целлюлаза+КЗ. Медом ТЭМ мы попытались выяснить ло-лизацию поверхностных структур клет-[, взаимодействующих с целлюлазой. На [сунке 4 представлена микрофотография [етки штамма А. гайюЪасХег 50-1, мечен->й маркером целлюлаза+КЗ. На ней от-тливо видно, что частицы метки распо-1жены не равномерно по всей клеточной »верхности, а группируются в области ких электронно-прозрачных фибрилло-»добных структур, отходящих от поверх-1сти бактериальной клетки.

Таким образом, методом просвечивающей электронной микроскопии с приме-нием указанных выше биоспецифических зондов становится возможной оценка жализации О-специфических полисахаридов, лектиновых рецепторов и целлю->зосодержащих компонентов на поверхности бактериальных клеток А. Ьга$Пеп$е >245, Бр7 и А. габюЪасш 50-1. Необходимо отметить, что при этом была выяв-на значительная гетерогенность внутри популяций бактерий перечисленных гаммов по их способности связывать данные биоспецифические маркеры (а так-

Рис. 3 Трансмиссионная электронная микроскопия клеток штамма А. ЬгазИепзе 5р7, меченных маркером 'УЛЗА+КЗ

Рис. 4 Трансмиссионная электронная микроскопия клеток штамма А. гасИоЬаМег 50-1, меченных маркером целлюлаза+КЗ

же катионный маркер - полиэтиленимин). Возможно, что для получения более четкого представления о распределении меток на поверхности бактериальной клетки, справедливого для популяции в целом, необходимо использовать в той или иной мере синхронизированные культуры бактерий.

3. Изучение возможностей использования коллоидного золота в решении

проблем получения антител к низкомолекулярным соединениям

Одной из весьма актуальных проблем иммунохимического анализа является проблема получения антител к низкомолекулярным соединениям (гаптенам). Ее принципиальный аспект - задача побора оптимального носителя, обеспечивающего необходимый иммунный ответ и, вместе с тем, допускающего получение достаточно чистых препаратов антител. Известны трудности решения данной проблемы при использовании в качестве носителей, например, белковых молекул. В то же время, в одном из европейских патентов (Бас1ао ее а1., 1987) появились сведения об успешной попытке получения АТ к некоторым аминокислотам с использованием в качестве носителя коллоидного золота. Это побудило нас к оценке эффективности использования КЗ в технике иммунизации при получении антител к более широкому кругу гаптенов. В качестве примера на данном этапе нашей работы был выбран биотин.

В последнее время система авидин-биотин нашла широкое применение при локализации, обнаружении и очистке белков, в методах молекулярной гибридизации, в иммуноанализе. При этом используются различные метки: ферменты, хемилюминесцентные соединения, флуорофоры, коллоидные частицы. В качестве дополнения (альтернативы) применению авидина (стрептавидина) могут быть использованы антибиотиновые антитела. Однако их получение сопряжено с трудностями, характерными для задач получения АТ к гаптенам.

Кратко о методике применения КЗ для получения АТ к биотину. Синтезировали коллоидное золото со средним диаметром частиц 15 нм. рН золя и раствора биотина с концентрацией 5 мг/мл доводили до 9.0 и 9.5 соответственно, используя водный раствор поташа. Затем компоненты смешивали в соотношении 1:1. Об устойчивости комплекса судили по отсутствию агрегации при добавлении ЫаС1 до концентрации 0.5%. 1.0 мл раствора стабильного комплекса смешивали с 1.0 мл полного адъюванта Фрейнда до образования эмульсии. Затем полученную эмульсию (1.0 мл) вводили дробно подкожно кролику в дозе 0.1 мл на одну точку. Такая процедура повторялась 4 раза с интервалом в 2 недели. Спустя 10 дней после последней инъекции кровь собирали и отделяли сыворотку. Фракцию иммуноглобулинов получали высаливанием сульфатом аммония. Затем проводили очистку фракции с помощью высокоэффективной жидкостной анионообменной хроматографии на колонке Мопо-<2 (БРЬС). Проверку полученных антител осуществляли методами колец преципитации, двойной иммунодиффузии и дот-блот анализа с использованием непрямого метода выявления связавшихся антител протеином А, меченным коллоидным золотом. В качестве модельной системы применяли биотинилированный бычий сывороточный альбумин (БСА). В качестве контроля использовали немеченый биотином БСА.

Реакция иммунопреципитации показала четко визуализируемое кольцо с био-тинилированным БСА. Результат двойной иммунодиффузии позволил обнаружить преципитаты при разведении исходной сыворотки 1:8.

На рисунке 5 представлены результаты дот-блот анализа. На нитроцеллюлоз-ную мембрану наносили двойные разведения биотинилированного БСА (начальная концентрация 1.0 мг/мл). Затем верхняя полоска инкубировалась в рас-

ope меченого коллоидным золотом стрептавиди-.. Нижняя полоска инкубировалась в растворе ггибиотиновых антител с концентрацией ¡0 сг/мл в течение 1 часа при комнатной температу-, а затем результат реакции детектировался про-ином А, меченным КЗ. Как можно видеть на ринке антибиотиновые антитела обладали большей ■вствительностью чем стрептавидин.

Мы надеемся, что антибиотиновые антитела, шученные предложенным методом, найдут ши-жое применение в практике иммуноанализа.

В заключение к диссертации сделано предложение о том, что приведенные в ней разработки I методологии иммунохимического анализа овые маркеры на основе ряда универсальных ндов, способ определения относительной гидро-эбности клеток, данные спектроскопического учения биоспецифических взаимодействий на поверхности золотых частиц, шнципы использования КЗ в сочетании с методами световой и электронной мик->скопии, применение КЗ для получения антител к гаптенам и др.) могут иметь ачение, не ограниченное рамками только почвенной микробиологии.

ВЫВОДЫ

Разработана методика получения и предложены варианты использования новых биоспецифических маркеров - фаллоидина, целлюлазы, фетуина и полиэтиле-нимина, меченных коллоидным золотом.

Разработана и апробирована методика определения относительной гидрофоб-ности клеточной поверхности почвенных азотфиксирующих микроорганизмов с использованием золотосодержащего "катионного" маркера. Показана целесообразность использования иммуноанализа, реализуемого на частицах золей золота, для изучения ряда биоспецифических взаимодействий с использованием метода спектрофотометрии.

Установлено, что метод эпиполяризационной световой микроскопии с использованием золотой метки и модификацией отечественных световых микроскопов, также как и метод просвечивающей микроскопии с использованием методики усиления солями серебра обеспечивают достаточную информативность в изучении процессов колонизации корней растений микроорганизмами. Методом просвечивающей электронной микроскопии с применением биоспецифических зондов - конъюгатов коллоидного золота оценена локализации 0-специфических полисахаридов, лектиновых рецепторов и целлюлозосодержа-щих компонентов на поверхности бактериальных клеток A. brasilense Sp7, Sp245 и A. radiobacter 5D-1.

Разработана методика использования коллоидного золота в качестве носителя при иммунизации для получения антител к биотину.

А ^ . . , * < * " в I о о . • -

Рис. 5 Результаты дот-анализ биотинилированного БСА с использованием маркера стрептави-дин+КЗ (А) и антнбио-тиновых АТ, выявленных конъюгатом протеин А+КЗ (В)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Matora L.Yu., Bogatyrev V.A., Dykman LA., Katzy E.I., Schwartsburd B.I. Effect of plasmid content on cell-surface antigens of Azospirillum brasilense Sp245 // 5~th Int. Symp. Nitrogen Fixation with Non-legumes. Florense, Italy, Sept. 10-14,1990.

2. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Pozdnyakova L.I., Schwartsburd B.I. Relative surface hydrophobicity of N2-fixing bacteria of the Azospirillum genus // Ibid.

3. Богатырев B.A., Дыкман JI.A., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Твердофазный иммуноанадиз с использованием коллоидного золота в серотипировании азос-пирилл // Микробиол. -1991. -Т.60. -С.524-529.

4. Petrov R.V., Schwartsburd B.I., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Shchyogolev S.Yu., Sidorovich I.L., Nikolaeva I.A., Pavlikov S.P., Shevalier A.F., Mikhailov M.V., Khaitov R.M., Ignatov V.V. Solid-phase immunoassay with colloidal gold conjugates for diagnosis of HIV-infection II 15",h Int. Congr. of Biochemistry. Jerusalem, Israel, Aug. 4-8,1991.

5. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. The serotyping of Azospirillum Spp by cell gold immunoblotting // FEMS Microbiol. Lett. -1992. -V.96. -P.l 15-118.

6. Матвеев В.Ю., Богатырев B.A., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Физико-химические свойства клеточной поверхности R- и S-вариантов штамма Azospirillum brasilense И Микробиол. -1992. -Т.61. -С .645-651.

7. Schwartsburd B.I., Matora L.Yu., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Shchyogolev S.Yu. Structure of the cell surface carbohydrate determinants and its dependence on the plasmid content in bacteria of the genus Azospirillum // 8~th Eastern Europe Symp. on Biol. Nitrogen Fixation. Saratov, Russia, Sept. 22-26, 1992.

8. Bogatyrev V.A., Dykman L.A. The methodology development and practice of colloidal gold conjugates application to studying of biospecific interactions // Ibid.

9. Matveev V.Yu., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. Changes of physico-chemical properties of Azospirillum brasilense Sp7 cell surface in consequense of R-S dissotiation // Ibid.

10. Solovova G., Velikov V., Dykman L., Bogatyrev V., Shelud'ko A., Chumakov M. The evidence involving of surface polysaccharides of Agrobacterium radiobacter 5D-1 in attachment process to wheat roots // The First International Conference on Polysaccharide Engineering. Trondheim, Norway, June, 6-8, 1994.

11. Dykman L., Bogatyrev V., Shchyogolev S., Ignatov V. Estimation of cell surface hydrophobicity of soil bacteria using cation probes labelled with colloidal gold II The First European Nitrogen Fixation Conference. Szeged, Hungary, Aug. 28 - Sept. 2, 1994.

12. Solovova G., Matora L., Bogatyrev V., Dykman L., Shchyogolev S., Chumakov M. Short-term localization and attachment of bacteria of the family Rhizobiaceae and of the genus Azospirillum to plant roots // NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms. Sarvar, Hungary, Sept. 4-6, 1994.

13. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Shchyogolev S.Yu., Ignatov V.V. Estimation of cell surface hydrophobicity of soil bacteria using cation probes labelled with colloidal gold II In: Proc. l~st Eur. Nitrogen Fixation Conf. Szeged, Hungary, Aug.28 - Sept.2, 1994 / Eds. Kiss G.B., Endre G. -Szeged: Officina Press, 1994. -P.348.

14. Хлебцов Н.Г., Богатырев B.A., Дыкман Л.А., Мельников А.Г. Оптические свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макро-

молекулами // Коллоидный журнал. -1995. -Т.57. -С.412-423. (Поправка: КЖ -1996. -Т.58. -С.144)

i. Chumakov M.I., Solovova G.K., Velikov V.A., Gorban V.V., Krivopalov Yu.V., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Kennedy C. Associative interactions Agrobacterium radiobacter 5D-1 with mono- and dicotyledonous plants II In: Nitrogen Fixation: Fundamentals and Application / Eds. Tikhonovich I.A., Provorov N.A., Romanov V.I., Newton W.E. -Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers, 1995.-P.254.

i. Matora L., Bogatyrev V., Dykman L., Shchyogolev S. Development of an efficient immunoassay system for monitoring soil nitrogen-fixing bacteria associated with higher plants П Int. Workshop on Associative Interactions of Nitrogen-Fixing Bacteria with Plants. Saratov, Russia, June 5-8,1995.

. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Melnikov A.G. Optical properties of colloidal gold and its biospecific conjugates // Intern. Svmp. on Biomedical Optics EUROPE'95. Barselona, Spain, Sept. 12-16,1995.

. Chumakov M.I., Solovova G.K., Velikov V.A., Krivopalov Yu.V., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Shchyogolev S.Yu. Involving of cellulose microfibrils of Agrobacterium radiobacter in attachment to wheat roots // Beijerinck Centennial Conference Microbial Physiology and Gene Regulation: Emergings Principles and Applications, Hague, The Netherlands, Dec. 16-21, 1995.

!. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Melnikov A.G. Spectral properties of colloidal gold and its conjugates with biospecific macromolecules // In: Lasers in Clinical Chemistry and Biotechnology I Eds. Andersen-Engels S., Pratesi R. Proc. SPIE, V.2629, 1996.

Хлебцов Н.Г., Богатырев B.A., Дыкман Л.А., Мельников А.Г. Спектральные свойства коллоидного золота II Опт. и спектр. -1996. -Т.80. -С.128-137.

. Dykman L.A., Matora L.Yu., Bogatyrev V.A. Use of colloidal gold to obtain antibiotin antibodies // J. Microbiol. Meth. -1996. -V.24. -P.247-248.

,. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Melnikov A.G. Spectral extinction of colliodal gold and its biospecific conjugates // J. Coll. and Interf. Sci. -1996. -V.180. -P436-445.

Патент РФ № 2013374, МКИ С 01 G 7/00, В 01 J 13/00. Способ получения биоспецифических маркеров - конъюгатов коллоидного золота / Богатырев В.А.,

Дыкман Л.А., Щеголев С.Ю. (Россия). -6с.

Подписано к печати 6. И .96. Отвеггсвенный за выпуск Мельников А.Г. _Объем 1 п. л. Тираж 100. Заказ 10._

Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13.