Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Коллоидное золото в биохимических и микробиологических исследованиях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Коллоидное золото в биохимических и микробиологических исследованиях"

На правах рукописи

ДЫКМАН Лев Абрамович

КОЛЛОИДНОЕ ЗОЛОТО В БИОХИМИЧЕСКИХ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

03.00.04 - биохимия 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов - 2005 г.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научный консультант - доктор химических наук, профессор С.Ю. Щеголев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю.А. Попов доктор биологических наук, с.н.с. A.B. Носов доктор химических наук, профессор В.А. Несмеянов

Ведущая организация: Государственный научный центр

Защита состоится 4 мая 2005 г. в 13м час. на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13). Тел./факс (8452)970383.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан 30 марта 2005 г.

прикладной микробиологии

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

В.Е. Никитина

¿iS^eZ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из основополагающих черт современной науки является взаимное проникновение фундаментальных знаний и экспериментальных методик из одной отрасли науки в другую. Так, в иммунологии применяется целый ряд методов из других областей биологии: выделение антигенов (АГ) и антител (АТ) производят с помощью биохимических методов фракционирования белков, гены иммунологически важных молекул секвенируют молекулярно-генетическими методами и т.д. В свою очередь, в иммунологии разработаны свои специальные методы исследования разнообразных химических соединений, основанные на взаимодействии АГ-АТ. Эти иммунологические подходы нашли широчайшее применение в различных областях биологии и аналитической химии (Коллинз, 1991; Ройт с соавт., 2000).

В частности, иммунологические методы весьма эффективны в исследованиях структуры и функций компонентов клеточной поверхности микроорганизмов. Иммунохимический анализ поверхностных структур микробных и растительных клеток, ответственных за осуществление контактных взаимодействий почвенных микроорганизмов с растениями, занимает одно из центральных мест в проблеме микробного симбиоза, паразитизма и иммунитета растений (Михайлов, Симирский, 1991; Гнутова, 1993).

Высокоспецифичное и высокоаффинное взаимодействие АТ с АГ создает благоприятную препаративную и аналитическую основу для идентификации разнообразных биологических соединений, для изучения их физико-химических и биохимических свойств. Причем, какие бы новые методы иммуноанализа не разрабатывались, в них решающую роль играют АТ. АТ, являясь уникальными молекулярными детекторами, остаются базисом любого иммуноанализа, независимо от систем регистрации или применяемых реагентов. Однако известные технологии получения поли- и моноклональных АТ обладают рядом недостатков. К наиболее существенным из них следует, вероятно, отнести проблемы получения АТ к низкомолекулярным и низкоиммуногенным АГ, принципиальную невозможность применения моноклональных АТ в широком спектре традиционных методов иммуноанализа с использованием эффекта преципитации и т.д. В связи с этим особую актуальность приобретает развитие новых иммунотехнологических методов получения АТ как /и vivo, так и in vitro, позволяющих преодолеть в той или иной степени отмеченные выше ограничения.

Одним из важнейших компонентов современных иммунохимических тест-систем, обычно используемым в качестве метки, являются наночастицы коллоидного золота (КЗ). Несмотря на то, что само КЗ имеет более чем тысячелетнюю историю, "революция в цитохимии", связанная с использованием частиц золота в биологических исследованиях, произошла в 1971 г., когда сотрудники факультета зоологии и биохимии университета Северного Уэльса В. Фолк и Г. Тейлор опубликовали статью "Иммуноколлоидный метод для электронной микроскопии". В ней они описали способ конъюгации АТ с КЗ и использование полученных комплексов для электронно-микроскопической визуализации поверхностных АГ сальмонелл.

За более чем 30 лет. прошедших с момента выхода этой статьи, было предложено огромное количество вариантов использования иммунозолотого метода в биохимических, микробиологических, молекулярно-генетических и др. исследованиях. Причем до последнего времени коллоидно-золотые препараты использовались, в основном, в микроскопических методах анализа.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.Петерб>рг

Ш<РК

Однако в 2000 г. секция "Медицинская диагностика и химический анализ с использованием наносенсоров" в рамках крупнейшего мирового научного форума по биомедицинской оптике "B10S-2000" открывается докладом профессора Пенсильванского университета М. Натана "Коллоидное золото в биологии: теперь не только для электронной микроскопии". В докладе констатировалось, что в последние годы расширились области применения металлических нанокластеров как датчиков биоаффинных взаимодействий в разнообразных биосенсорных системах. Большинство подобных систем основано на уникальных оптических свойствах наночастиц КЗ, в частности, на явлении поверхностного плазменного резонанса. При этом для регистрации изменений, осуществляющихся в процессе реакции АГ-АТ, когда один из участников реакции адсорбирован на частицах КЗ, используют методы светорассеяния, колебательной спектроскопии и др.

Несмотря на огромное количество статей, посвященных использованию конъюгатов КЗ в биологических исследованиях, ко времени начала наших работ по данной проблематике мы не обнаружили в литературе публикаций, отражающих использование маркеров на основе КЗ для серологических исследований интактных клеток в вариантах твердофазного иммуноанализа. Был выявлен круг актуальных вопросов методологии и практики изучения структуры и свойств клеточной поверхности бактерий родов Azospirillum и Agrobacterium, не нашедших адекватного освещения в литературе. Кроме того, имелся дефицит данных о механизме синтеза золей золота в тех или иных конкретных схемах их получения и об эффективности известных способов контроля качества золей. Эти проблемы непосредственно связаны с актуальной задачей практического создания биомаркеров с требуемым диаметром золотых частиц и обеспечения их стабильности в широком интервале размеров частиц золота, а также использования при разработке экспресс-гестов для диагностики инфекционных заболеваний человека, животных и растений.

Анализ работ по изучению спектральных характеристик процессов агрегации наночастиц КЗ и биоспецифическому связыванию молекул-мишеней с биоконъюгатами на основе частиц КЗ показал наличие нерешенных проблем и в данном направлении. В частности, отсутствовали оценки возможностей применения спектроскопических методов для разработки аналитических тестов, основанных на биоспецифической агрегации частиц КЗ, в том числе с использованием современных средств регистрации биоспецифических взаимодействий - ИФА-ридеров и ИК-спектрометров.

Возвращаясь к актуальной проблеме получения AT к широкому спектру АГ, отметим, что в 1986 г. был описан способ получения AT к ряду гаптенов in vivo с использованием КЗ в качестве носителя АГ (Shiosaka et al.. 1986). Однако, данных, свидетельствующих об эффективности этого метода для АГ различной природы и об адьювантных свойствах самого КЗ, в доступной нам литературе мы не обнаружили. Кроме того, мы не встретили сведений об использовании золотых частиц для селекции миниантител из комбинаторных фаговых библиотек и получения их конъюгатов с КЗ, хотя метод фагового дисплея в последние годы приобретает все большее значение как эффективное средство получения функционально значимых фрагментов AT in vitro.

Таким образом, анализ литературных данных позволяет признать актуальной тему данной диссертации и констатировать, чго ко времени начала наших исследований в этой области эффективность использования КЗ в биохимических и микробиологических исследованиях ограничивалась дефицитом сведений по: а) вопросам синтеза золей золога с требуемым размером частиц и получения на их основе маркеров с широким спектром биоспецифических зондов, б) вариантам их

использования в твердофазном иммуноанализе и иммуноанализе на частицах золя, в) применению биомаркеров на основе КЗ в исследованиях поверхностных структур клеток и в диагностических тест-системах, г) проблемам использования КЗ в качестве носителя для получения AT к слабо иммуногенным АГ т vivo и in vitro.

Целью нашей работы было развитие теоретических и экспериментальных основ ряда иммунохимических, биохимических и физико-химических методов исследования биомолекул и клеток, расширяющих границы применения конъюгатов КЗ с биоспецифическими молекулами в различных вариантах иммуноанализа с применением современных регистрирующих средств и методик получения антител.

В соответствии с данной целью, в работе решались следующие конкретные задачи:

1. Разработать эффективные методы синтеза КЗ и его конъюгации с различными зондами, обеспечивающие получение биомаркеров с заданным диаметром частиц золота в интервале 5-50 нм.

2. Исследовать механизм получения золей золота с применением в качестве восстановителей ряда высокомолекулярных соединений и разработать методику определения относительной гидрофобности клеточной поверхности микроорганизмов с использованием золотосодержащего катионного маркера.

3. Оценить эффективность метода твердофазного иммуноанализа с биоспецифическими маркерами - конъюгатами КЗ в исследованиях поверхностных структур интактных клеток почвенных микроорганизмов.

4. Проанализировать целесообразность применения маркеров на основе КЗ для ранней диагностики инфекционных заболеваний человека, животных и растений.

5. Исследовать варианты использования конъюгатов КЗ в сочетании с методами спектрофотометрии и колебательной спектроскопии для разработки аналитических тестов, основанных на биоспецифической агрегации частиц КЗ.

6. Изучить возможности применения золотых наночастиц для получения AT in vivo с использованием адъювантных свойств КЗ и in vitro путем селекции из комбинаторных фаговых библиотек.

Научная новизна работы:

разработан оригинальный метод синтеза золей золота с диаметром частиц 5 нм; впервые предложены методики получения и варианты использования новых биомаркеров на основе перспективных зондов;

впервые с помощью метода иммунозолотого дот-анализа проведено исследование ряда физико-химических и иммунохимических свойств клеточной поверхности почвенных микроорганизмов родов Azospirillum и Agrobacterium и разработаны тест-системы для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний человека и животных, юловневой инфекции пшеницы, определения пролиферативного АГ ее инициалей;

разработан вариант метода иммуноанализа на частицах золя с использованием микротитровальных планшетов и фотометрического ридера и предложен новый метод биохимического анализа с использованием конъюгатов прогеолитических ферментов с КЗ для быстрого и чувствительного количественного определения белков;

впервые продемонстрирована возможность применения метода ИК-Фурье спектроскопии сухих пленок золотых биоконъюгаюв для определения

взаимодействия белковых молекул с поверхностью золотых частиц, а также для регистрации биоспецифических реакций;

получены достоверные данные, позволяющие констатировать наличие у золотых наночастиц адъювантных свойств;

разработан метод селекции антител из комбинаторных фаговых библиотек с использованием конъюгатов антигенов (в том числе и гаптенов) с частицами КЗ

Практическая значимость работы. На основе разработанного и защищенного патентом РФ способа получения биоспенифических маркеров - конъюгатов КЗ в рамках Госзаказа Министерства науки и технической политики РФ создан Лабораторный технологический регламент и наработаны образцы 138 препаратов. Синтезированные биомаркеры и разработанные новые методологические приемы используются в ряде лабораторий ИБФРМ РАН. Кроме того, часть образцов передана по заказам более чем 40 организациям, включая академические и прикладные научно-исследовательские институты, вузы, лечебные учреждения России, ближнего и дальнего зарубежья для проведения работ, связанных с решением широкого круга научных и прикладных задач в области биологии, биотехнологии и медицины.

Результаты работы были представлены на Международной выставке "Достижения российской биотехнологии" (ФРГ, 1996 г.), 3-м Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Россия, ВВЦ, 2003 г.), ряде российских и региональных выставках.

Представленные в диссертации разработки используются в учебном процессе в Саратовском госуниверситете, Саратовском аграрном университете и др., включены в методическое пособие (Карпунина J1.B, Мельникова У Ю., Дыкман Л.А., Иващенко C.B., Хапцев З.Ю., Щербаков A.A. Методические рекомендации по изучению взаимодействия лектинов бацилл с некоторыми бактериями рода Yersinia. - Саратов: СГАУ, 2000.- 12 с.).

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Полученные сведения о механизмах и усовершенствованные методы синтеза КЗ с требуемым размером частиц и их конъюгации с биоспецифическими зондами позволяют разработать эффективные технологии получения и варианты аналитического использования новых иммунохимических маркеров - конъюгатов КЗ на основе универсальных зондов: фаллоидина, целлюлазы, фетуина, полиэтиленимина, трипсина, миниантител.

2. Дог-блот анализ целых бактериальных клеток с применением коныогата КЗ с полиэтиленимином обеспечивает оценку относительной гидрофобности клеточной поверхности.

3. Методы твердофазного иммуноанализа с разработанными препаратами КЗ, примененными в иммуноцитохимических исследованиях ряда представителей почвенных диазотрофов, пригодны для серотипирования бактерий, позволяют зарегистрировать изменения поверхностных структур при R-S диссоциации типового штамма азоспирилл и мутациях штамма агробактерий, затрагивающих синтез их углеводных структур.

4. Использование конъюгатов КЗ с соответствующими биоспецифическими зондами (в том числе, полученных на образцах стандартных антисывороток) в варианте дот-анализа позволяет разработать эффективные тест-системы экспресс-диагностики острых кишечных инфекций у чеповека, а также диагностики головневой инфекции и количественного определения пролиферативного АГ инициалей пшеницы.

5. Конъюгаты трипсина с КЗ могут быть использованы для быстрого и чувствительного спеюрофотомеарического определения белков.

6. Метод ИК-Фурье спектроскопии обеспечивает надежную регистрацию иммунохимических взаимодействий, реализуемых на поверхности частиц КЗ.

7. У частиц КЗ обнаружены выраженные адъювантные свойства.

8. Использование конъюгатов ЛГ с золотыми наночастицами позволяет оптимизировать метод селекции миниантител из комбинаторных фаговых библиотек.

Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений" научный руководитель темы д.х.н. профессор С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 018900)7743; "Развитие методов светорассеяния и электрооптики применительно к анализу природных и синтетических дисперсных систем", научный руководитель темы д.ф.-м.н. профессор Н.Г. Хлебцов, № гос. регистрации 01912022281.

Частично данная работа получила финансовую поддержку Министерства науки и технической политики РФ (распоряжение № 1508ф), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ проектов 94-03-09286. 96-03-32504, 98-03-32664, 01-03-33130, 01-04-48736, 04-04-48224), Международного научною фонда (фонда Сороса) (№ RNR000), фонда INCAS-S (№ 99-4-04), фонда CRDF (№ REC-006). UNESCO Short-term Fellowship in biotechnology (№ 875.687.1). NATO Expert Visit Grant (№ LST.EV.979787).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с к.б.н. В.А. Богатыревым. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору данной диссертации и в получении которых роль автора была определяющей.

В иммунохимических экспериментах использовали AT, полученные к.х.н. Шварцбурдом Б.И. и к.б.н. Матора Л.Ю. (ЛФХКС ИБФРМ РАН): измерения колебательных спектров проводили совместно с д.х.н. Камневым A.A. (ИБФРМ РАН) и Dr. Tarantilis Р. (Афинский аграрный университет, Греция), работа с фаговым дисплеем AT стала возможной благодаря к.м.н. Сумарока М.В. (ЛФХКС ИБФРМ РАН) и к.х.н. Ламану А.Г., к.б.н. Шепеляковской А.О. (ФИБХ РАН). В исследованиях также принимали участие сотрудники группы иммунотехнологии ЛФХКС ИБФРМ РАН к.в.н. Староверов С.А., аспиранты Зайцева И.С. и Пристенский Д.В. Всем им автор выражает глубокую благодарность.

Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы д.х.н. профессора С.Ю. Щеголева и д.ф.-м.н. профессора Н.Г. Хлебцова (ИБФРМ РАН) за интересное и полезное обсуждение результатов на всех ее этапах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлялись, докладывались и обсуждались на: 5-th Int. Symp. "Nitrogen Fixation with Non-Legumes", Florence, Italy, Sept. 10-14, 1990; 15-th Int. Congr of Biochemistry, Jerusalem, Israel, Aug. 4-8, 1991; 8-th Eastern Eur. Symp on Biological Nitrogen Fixation, Saratov, Russia. Sept. 22-26, 1992; 1-st Int Conf. on Polysaccharide Engineering, Trondheim, Norway, June 6-8, 1994; 1-st Eur. Nitrogen Fixation Conf., Szeged. Hungary, Aug 28 - Sept. 2. 1994. NATO Advanced Research Workshop on Azosptrillum and Related

Microorganisms, Sarvar, Hungary, Sept. 4-6. 1994; Int. Workshop on Associative Interactions of Nitrogen-Fixing Bacteria with Plants, Saratov, Russia, June 5-8, 1995; Int. Symp. on Biomedical Optics, Barcelona, Spain, Sept. 12-16, 1995; Bcijerinck Centennial Conf. "Microbial Physiology and Gene Regulation' Emergings Principles and Applications'-, Hague, The Netherlands, Dec. 16-21, 1995; 4-th World Congr. on Biosensors, Bangkok. Thailand, May 29-31, 1996; 9-th, 10-th and 11-th Int. Conf of Surface and Colloid Science, Sofia, Bulgaria, July b-12, 1997, Bristol. UK, July 23-28, 2000, Iguassu Falls, Brazil, Sept. 15-19, 2003; 12-th Int. Congr. on Nitrogen Fixation. Parana, Brazil, Sept. 12-17, 1999; школе-конф. "Горизонты физико-химической биологии'", Пущине, Россия, 28 мая - 2 июня 2000; 5-th and 6-th John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology, Pushchino, Russia, Sept. 15-21, 2000, Sept. 15-22, 2002; 5-ой и 7-ой Путинской школе-конф. молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущине, Россия, 16-20 апреля 2001, 14-18 апреля 2003; Int. Symp. "Biological motility: New trends in research", Pushchino, Russia, Aug. 20-26, 2001; межд. научн. конф. "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий", Саранск, Россия, 12-15 сент., 2001; 1-ой per. конф. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, Россия, 26-27 марта, 2002; XXVI Eur. Congr. on Molecular Spectroscopy, Villeneuve d'Ascq, France, Sept. 1-6, 2002; 1-ом межд. конгр. "Биотехнология - состояние и перспективы развития", Москва, Россия, 14-18 октября, 2002; Donostia Int. Physics Center Workshop "Optica! Properties of Complex Materials over Different Length Scales", San Sebastian, Spain, July 7-11, 2003; VHI Int. Conf. "The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology", Saratov, Russia, Sept. 9-13, 2003; V съезде физиологов растений России, Пенза, Россия, 15-21 сентября 2003; NATO Advanced Study Institute on Photopolarimetry in Remote Sensing, Yalta, Ukraine, Sept. 20 - Oct. 3. 2003: Saratov Fall Meeting, Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine, Saratov, Russia, Oct. 7-10,2003; а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 98 печатных работ, в том числе 2 патента и 50 статей, список которых приведен в конце автореферата (включая 19 статей в журналах из списка ВАК, 8 статей в иностранных рецензируемых журналах, 22 статьи в отечественных и зарубежных сборниках научных трудов и 1 главу в книге).

Структура и объем работы. Диссертация состой г из введения, основной части, содержащей пять глав, заключения, списка использованных литературных источников и приложения. Работа изложена на 335 страницах, иллюстрирована 48 рисунками и включает 19 таблиц. Список использованных литературных источников содержит 767 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 представляет собой литературный обзор, в котором рассмотрены и проанализированы современные методы иммуноанализа, применяемые в биохимических и микробиологических исследованиях Наиболее подробно изложены вопросы, касающиеся основных свойств и аспектов возможного использования КЗ и его конъюгатов с биомакромолекулами. Большое внимание уделено анализу самых распространенных адъювантов и носителей АГ, используемых для получения AT и производства вакцин. Кроме того, необходимо отметить, что практически каждый из разделов диссертации предваряет собственный мини-обзор, посвященный конкретной проблеме, рассматриваемой в разделе. В заключительной части 1-й главы формулируются нерешенные проблемы, цель и задачи исследования.

Глава 2. Разработка технологии синтеза биоспсцифических маркеров -конъюгатов коллоидного золота

2 1 Синтез коллоидных золотых частиц с использованием низкомолекулярных

восстановителей

В настоящее время существуют два основных подхода в приготовлении коллоидных растворов золота. Первый основывается на дезинтеграции металлического золота (метод испарения-конденсации, дисперсионный метод). Второй - более распространенный метод - основывается на синтезе коллоидных частиц из галогенидов золота, например, золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК), с использованием химических восстановителей и'или облучения (ультразвук, ультрафиолет, пульсационный или лазерный радиолиз) (конденсационный метод).

Наибольшее распространение для синтеза сферических монодисперсных золотых наночастиц со средним диаметром <1 в пределах 10 - 60 нм получил метод Френса (Ргсп5, 1973). Суть этого метода заключается в следующем. К кипящему 0.01% водному раствору ЗХВК добавляют раствор цитрата натрия в концентрации, варьируемой в зависимости от требуемого размера частиц. Именно подбор концентраций для получения частиц с заранее заданными размерами отличает этот метод от аналогов, использующих в качестве восстановителя цитрат натрия. В отличие от эмпирически подобранных концентраций восстановителя, предложенных Френсом, нами была получена калибровочная кривая для расчета необходимого количества цитрата натрия при синтезе золотых частиц заданного размера.

Мы использовали этот метод для получения золей золота с диаметром частиц в диапазоне 15 - 60 нм Золи золота со средним диаметром частиц 8-10 нм мы получали, используя модификацию метода, предложенную в работе Де Мея с соавт. (1986), и отличающуюся порядком внесения реактивов (сначала цитрат натрия, а затем ЗХВК).

Однако, получение практически монодисперсных золей в диапазоне с1 порядка 3-5 нм оставалось сложной задачей, которая не была решена ни в одном из известных нам способов синтеза КЗ, в которых в качестве восстановителей использовались: белый фосфор, таннин или борогидрид натрия. Поэтому нами бьп предложен признанный изобретением способ, сущность которого заключается в восстановлении ЗХВК одновременно натриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты и борогидридом натрия при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. Полученные таким образом золи отличались высокой стабильностью и по данным трансмиссионной электронной микроскопии были практически монодисперсны

В описываемом разделе диссертации приведены протоколы синтеза золей золота с частицами различных размеров и спектрофотометрический метод определения среднего диаметра получаемых золотых наночастиц, основанный на известной зависимости максимума поглощения металлических золей от размера частиц (Борен, Хафмен. 1986).

2.2. Конъюгация коллоидного золота с биоспецифическими макромолекулами

Процедура получения конъюгатов КЗ с биомакромолекулами включает приготовление и очистку раствора зонда, определение "золотого числа", конъюгацию зонда с КЗ, внесение вторичного стабилизатора, конценфирование маркера и отимизацию конечного продукта с контролем качества получаемых препаратов. В данном разделе мы кратко рассматриваем каждый из этих этапов

В целях развития инструментальной базы твердофазного иммуноанали-за, приспосабливаемого к изучению растительно-

микробных взаимодействий, нами были синтезированы новые биоспецифические маркеры на основе универсальных зондов, которые отсутствуют в каталогах других производителей и лишь упоминаются в отдельных работах (Roth, 1983; Berg et al, 1988; Lachapelle et al., 1988). К их числу относятся фаллоидин, иеллюлаза, фетуин, полиэтиленимин, трипсин, scFv-фрагмснты AT, меченные КЗ.

Фаллоидин - один из токсинов бледной поганки (Amanita phalloides), бициклический гептапептид с молекулярной массой 846.9 Да. Он обладает способностью прочно связываться с полимерным (филаментным) актином (F-актином). Конъюгат фаплоидина с КЗ был использован нами для электронно-микроскопической идентификации и изучения характера мечения филаментов актина, а также для выявления F-форм актина и количественной оценки чувствительности маркера в дот-анализе. Поскольку на начальных этапах взаимодействия ассоциативных микроорганизмов с клетками корней растений активные изменения претерпевает вся система цитоскелета, то, по-видимому, создание маркера на один из самых характерных белков цитоскелета - актин - может существенно помочь в изучении этого процесса

До настоящего времени остается спорным вопрос о наличии актина в клетках прокариот. Существует всего несколько работ, посвященных этой проблеме (Neimark, 1977; Nakamura et al., 1978; Usmanova et al., 1998; van den Ent et al., 2001). Было показано присутствие актино- и миозиноподобных белков в клетках Escherichia coli, Mycoplasma pneumoniae, Spiruhna platensis. В нашей работе для обнаружения актина в клетках Azospirillum brasilense Sp 245 мы использовали маркер фаллоидин - КЗ. С помощью этого маркера показано присутствие актина во фракции, полученной методом полимеризации-деполимеризации. На рис. 1 представлен вариант выявления бактериального актина методом дот-анализа. На рисунке видно, что деполимеризованная фракция не связывается с маркером (таким же свойством обладает J

мышечный и растительный мономерный актин).

Целлюлаза (или, вернее, целлюлазный комплекс) - это группа гидролитических ферментов, обладающих способностью гидролизовать нерастворимую целлюлозу вплоть до ее мономера - глюкозы. Целью получения маркера целлюлаза - КЗ было решение задачи поиска целлюлозных фибрилл (или их глюкановых предшественников) у ряда штаммов A brasilense и Agrobacterium radiobacter Результаты исследований, проведенных методами электронно-микроскопического и твердофазною иммуноанализа, приведены в главе 3.

Одним из активно развивающихся вариантов гисто- и цитохимического анализа является способ выявления компонентов тканей и клеток мечеными лектинами Непрямые методы лектиновой гистохимии предполагают первоначальную обработку среза натипным лектином. а за1ем вторым реагентом, связанным с соответств>ющей

Ф Ф Ф

Рис. 1. Дот-анализ актин-содержащей фракции из А brasilen.se Эр 245 в последовательных двукратных разведениях после деполимеризации (С- форма) (1) и в полимеризующих условиях (Р- форма) (2) с использованием маркера фаллоидин - КЗ

меткой. В качестве специфичных реагентов на лектины использ>к>1 муцин, тиреоглобулин, псроксидазу, овомукоид, а также фетуин из фетальной сыворотки телят. Фетуин - ; ликопротеид, составляющий 40% белков эмбриональной (фетальной) сыворотки. В состав его углеводной части входят сиаловая кислота, гексозамин, ф>коза, галактоза и манноза. Таким образом, фечуин является универсальным зондом для большинства наиболее широко используемых в гистохимии лектинов.

Помимо лекжновой гистохимии, мы использовали маркер фетуин - КЗ в целях поиска лектинов на поверхности азоспирилл. Нами был проведен дот-анализ активных и неактивных по гемагглютинации вариантов штамма А. ЬгаяИете Яр 7 с использованием антилектиновых АТ и фетуина, меченных КЗ. Реакция активных и неактивных клеток одного и того же штамма с АТ оказалась идентичной, в то время как с фетуином взаимодействуют клетки только активного штамма. Эти результаты согласуются с данными, представленными в работе Никитиной с соавт. (1994), где с помощью методов гель-фильтрации и электрофореза показано, что на поверхности неактивных по гемагглютинации клеток азоспирилл, выращенных на богатых азотом средах, присутствуют лектины, идентичные по углеводной специфичности лектинам активных клеток, но с заблокированными углеводсвязывающими сайтами.

2.3. Синтез золотых коллоидных частиц с использованием высокомолекулярных восстановителей

Традиционные методы получения КЗ-маркеров заключаются в синтезе (восстановлением хлорауратов низкомолекулярными веществами) золотых наночастиц с последующей адсорбцией на них биополимеров. Гораздо реже используют методы синтеза КЗ в присутствие синтетических полимеров - полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона, поливинилацетага, полиамидоамина (дендримера). Отмечается, что частицы, сформированные таким образом, отличаются большей однородностью по размерам и форме.

В работе Симана и Бурштейна (1993) авторы впервые предложили использовать высомолекулярное вещество одновременно в качестве восстановителя и стабилизатора. При этом получаемые частицы золога оказывались покрытыми защитным слоем полимера (аминодекстрана). Как было отмечено авторами, это способствовало более длительному хранению золотых золей Затем биоспецифические макромолекулы "пришивали" к покрытым аминодекстраном частицам золота с помощью бифункциональных реагентов (в частности, глутарового альдегида). Интересно отметить, что, по наблюдениям авторов, в ходе восстановления ЗХВК аминодекстранами реакционная смесь сначала приобретала бледно-розовую окраску, которая затем становилась ярко-красной (т.е. не наблюдалось посинение раствора, соответствующее обра! имой агрегации мелких частиц).

Мы решили использовать подход, описанный указанными выше авторами, для одностадийного получения конъюгата КЗ с полиэтиленимином (ПЭИ). Целью синтеза этого конъюгага было создание катионного маркера - аналога поли-Ь-лизина. Последний был впервые использован в качестве зонда в работе Скутельски с соавт. (1986) в электронной микроскопии для маркирования отрицательно заряженных участков плазмалеммы. Однако следует отмет ить, что данный препарат, на наш взгляд, сложен в приготовлении и недостаточно устойчив при хранении.

Мы провели сравнительное спектрофотомстрическое изучение кинетики образования золей золота при восстановлении ЗХВК двумя различными гю химической структуре соединениями' цитратом нагрия и ПЭИ. Опыты проводили непосредственно

в кювете спектрофотометра Бресогс! М40, используя приставку для термостатирования проб. При этом были зарегистрированы существенные различия в скоростях реакции восстановления (относительно быстрого для цитрата натрия и значительно более медленного для Г1ЭИ) и в спектральных характеристиках формирующихся суспензий.

В обоих случаях начальные этапы реакций характеризуются снижением оптической плотности на коротковолновом участке спектра (в характерной точке спектра поглощения при Л = 320 нм), что обусловлено уменьшением концентрации золота, находящегося в ионной форме. При этом поглощение в области спектра 500-550 нм, характерное для золей золота, оказывается незначительным. Затем, однако, кинетика *

процессов восстановления ЗХВК в рассматриваемых случаях значительно отличается. При использовании цитрата натрия наблюдается резкое нарастание оптической плотности в длинноволновой области с постепенным смещением максимума полосы поглощения от 700 до 520 нм. В случае же с ПЭИ возникновение дополнительной полосы поглощения не наблюдается, а отмечается плавный рост оптической плотности с максимумом поглощения при 520 нм.

Зарегистрированные нами различия спектров поглощения и их временной зависимости при использовании двух реагентов можно, по-видимому, объяснить с позиций теории восстановления ЗХВК по механизму зародышеобразования, предложенной Жигмонди (1933). Такой механизм реализуется, вероятно, в случае с цитратом натрия. Согласно данной теории, формированию "зрелых" частиц КЗ при достаточной активности восстановителя предшествуют этапы образования зародышей новой фазы и их обратимой агрегации (пептизации) с образованием структур, размер которых заметно превосходит конечный размер взвешенных золотых частиц. Этим, возможно, и обусловлены появление и последующая трансформация максимума поглощения при Я = 700 нм при использовании цитрата натрия.

Активность ПЭИ в качестве восстановителя ЗХВК оказалась заметно ниже. К тому же, обладая достаточно большой молекулярной массой и адсорбируясь на поверхности частиц, данное соединение (подобно аминодекстранам) оказывает стабилизирующее действие на суспензию КЗ. Все это ограничивает критический размер зародышей новой фазы на уровне, сопоставимом по порядку величины с конечным размером частиц КЗ, уменьшает скорость их роста и препятствует пептизации. Об этом свидетельствует стабильность во времени положения максимума полосы поглощения света формирующейся суспензии при X = 520 нм.

В данном случае, по-видимому, мы имеем дело с механизмом, принципиально отличным от теории Жигмонди. На начальных этапах, возможно, происходит адсорбция ионов золота на полимерных цепях с их последующим восстановлением на ^

функциональных группах полимера (например, альдегидных и гидроксильных) Агрегации зародышей при этом не происходит, очевидно, из-за стабилизирующего действия полимера Это подтверждается результатами электронно-микроскопических исследований, согласно которым часть восстановленного КЗ при недостатке ПЭИ наблюдается в виде весьма мелких частиц (порядка 1 нм), вероятно, зародышей, адсорбированных на полимерных цепях В результате оказывается возможным образование ассоциатов полимерных цепей с частицами КЗ обоих типов (как зрелых частиц, так и стабилизированных зародышей).

По аналогии с описанным выше процессом восстановления ЗХВК синтетическими полимерами, мы проанализировали возможность одностадийного получения маркера также и с использованием в качестве восстановителя белка - антикроличьих Визуально и по данным спектрофотометрии было установлено, что при нагревании

смеси ЗХВК с белком до 70°С образования КЗ не происходит Дальнейший нагрев не имел смысла, поскольку белок терял начивные свойства вследствие тепловой денатурации. Тогда была предпринята попытка получить биоспецифический маркер, используя для восстановления ЗХВК одновременно с белком сильный низкомолекулярный восстановитель - борогидрид натрия. Полученный маркер -конъюгат КЗ с IgG проверяли на работоспособность методом дот-блог анализа Выявление проводили маркерами, полученными традиционным способом и по оригинальной одностадийной методике. По чувствительности выявления АГ оба маркера оказалась фактически эквивалентными.

Полученные результаты позволяют констатировать, что, выбирая тот или иной восстановитель и принимая во внимание особенности кинетики формирования коллоидной фазы, можно получать готовые маркеры с заданным размером частиц КЗ Именно этот принцип мы применили при получении конъюгата ПЭИ-КЗ со средним диаметром частиц золога 20 нм. Данный маркер был использован нами для определения относительной гидрофобности клеток почвенных микроорганизмов.

Глава 3. Развитие методологии твердофазного иммуноанализа с использованием конъюгатов коллоидного золота и ее применение в микробиологических и биохимических исследованиях

3.1 Краткий обзор современных методик твердофазного иммуноанализа с использованием мембранных носителей В настоящем разделе приведены сведения об основных принципах и вариантах применения методики дот-блот анализа, об использовании в твердофазных методах анализа КЗ-маркеров и процедуры усиления солями серебра. Изложены методики проведения дот и блот анализов с использованием конъюгатов КЗ, в том числе оригинальный способ дот-анализа целых бактериальных клеток - cell-gold immunoblotting

3 2. Изучение поверхностных структур почвенных бактерий с использованием биоспецифических маркеров - конъюгатов коллоидного золота

В данной части наших исследований биоспецифические маркеры - конъю^аты КЗ были использованы для усовершенствования методологии иммунохимического и иммуноциюхимического анализа компонентов клеточной поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий. При этом эксперименты проводились, в основном, с представителями родов Azospirillum и Agrobacterium, которым уделяется большое внимание со стороны исследователей, изучающих молекулярно-генетические механизмы взаимодействий микроорганизмов с растениями.

С середины прошлого века серологические методы стали использовать для изучения почвенных микроорганизмов. Для специфической детекции бактерий, их белковых или полисахаридных структур применяли как поликлональные. так и моноклональные AT, меченные флуоресцентными, ферментными и золотыми метками. Серологические методы использовали для идентификации, количественного определения, визуализации бактерий in situ (в том числе при изучении процессов колонизации почвенными диазотрофами корней растений)

Для надежного использования в серологических методах AT обязаны удовлетворять определенным критериям В частности, они не должны давать перекрестных реакций с бактериями других видов (в идеале - штаммов) и иметь высокую аффинность к

исследуемому АГ. На наш взгляд, наиболее полно этим критериям соответствуют AT, полученные методом, разработанным в ЛФХКС ИБФРМ РАН (Матора с соавт., 1998). Суть метода заключается в том, что am исыворотки к азоспириллам получают иммунизацией кроликов целыми бактериальными клетками, предварительно обработанными глутаро-вым альдегидом. Специальные исследования показали, что активация клеточной поверхности грамотрицательных бактерий глутаровым альдегидом приводит к получению AT, специфичных к бактериальным О-антигенам.

Мы использовали эти моноспецифические AT для ссротипирования азосгжрилл. На рис. 2 приведены результаты дот-блот анализа целых клеток для двух видов азоспирилл с использованием гомологичных AT, специфичных к О-полисахаридам клеточной поверхности каждого из исследуемых штаммов. При этом для выявления связавшихся с клетками AT использовали их непрямое мечение посредством конъюгага протеин А -КЗ. Использование непрямого мечения позволяет обойтись без стадий получения конъюгатов КЗ с AT к каждому из исследуемых штаммов бактерий и весьма целесообразно при проведении серии экспериментов с большим числом штаммов.

Результаты, представленные на рис. 2, показывают, что AT, полученные к целым клеткам азоспирилл по изложенной выше методике, обладают выраженной видовой и штаммовой специфичностью При этом четкие перекрестные реакции, сравнимые с прямыми реакциями по интенсивности окрашивания мест связывания AT с бактериальными поверхностными АГ, имеют место для штаммов A. brasilense Sp 107 и Sp 245. Данные штаммы были выделены из корней пшеницы и отличаются тем, что один был получен в полевых (Sp 245), а другой - в лабораторных (Sp 107) условиях Не исключено, что дополнительные исследования могут привести к заключению об идентичности данных штаммов по целому ряду фенотипических признаков. Четкая перекрестная реакция, сравнимая с прямой реакцией по интенсивности окрашивания, наблюдается также для штаммов A. brasilense Cd и Sp 7, что хорошо согласуется с литературными данными, полученными для этих близкородственных ипаммов (Schloter et al., 1992). В то же время для AT, полученных по традиционной методике, отмечается множество перекрестных реакций между разными штаммами, что определяется, вероятно, их белковым АГ

Таким образом, применение AT, полученных описанным выше способом, в методе cell-gold immunoblotting делает возможным надежную идентификацию штаммов азоспирилл, например, при проведении таксономических и экологических исследований

~ — --—.

3 »>

4 ___

5 »

6 • • ' г %

а б в г д с Рис. 2. Дот-анализ целых клеток A. brasilense Sp 245 (а, 1), Sp 7 (б, 2), JM125A2 (в, 3), Cd (д, 5), Sp 107 (е, 6) и A hpoferum Sp 59b (г, 4) с гомологичными AT

а б

Рис. 3. Результаты блсгг-анализа ЛПС А Ьгаи1еп$е Бр 7 а - неспецифическое окрашивание, б - специфическое окрашивание с использованием гомологичных АТ

С целью получения более детальных сведений об антигенных свойствах клеточной поверхности азоспирилл мы применили методику блот-анализа липополисахарида (ЛПС) бактерий после разделения препаратов ЛПС в полиакриламидном геле Для

неспецифической окраски перенесенного материала на мембране мы использовали золотой краситель (AuroDye) На рис 3 (а) представлены результаты подобного окрашивания препарата ЛПС штамма А. brasilense Sp 7. Для того чтобы определить, какие именно участки полного электрофоретического спектра ЛПС ответственны за иммунный ответ, мы провели их иммунохимическое выявление. В качестве первичных АТ использовали АТ к целым клеткам штамма A brasilense Sp 7, полученные по описанной выше методике. В качестве детектирующею агента - антикроличьи АТ, меченные КЗ. Полученные результаты приведены на рис. 3 (б). Как видно на рисунке, в соааве ЛПС штамма А. brasilense Sp 7 обнаруживаются два участка связывания со специфическими АТ. В дальнейшем независимыми методами были получены свидетельства того, что ЛПС этого штамма содержит в своем составе два О-специфических полисахарида (Магора с соавт.. 2002).

Локализация мест связывания с гомологичными АТ изолированных углеводных компонентов внешней мембраны азоспирилл при их электрофоретическом разделении может оказаться весьма перспективной в дальнейших иммунохимических и физиолого-биохимических исследованиях этих микроорганизмов Эксперименты такого рода могут быть использованы, в частности, при создании иммунологической тест-систсмы с возможным ее применением в таксономических (ссротипирование), экологических и молекулярно-генетических (скрининг штаммов с измененной структурой поверхностных АГ) исследованиях почвенных бактерий.

При изучении взаимоотношений растений с ассоциативной микрофлорой представляется существенным вопрос о роли поверхностных структур микроорганизма-ассоцианта в узнавании им растения-хозяина и прикреплении к поверхности растительных клеток. Одним из возможных подходов к решению этого вопроса может быть исследование мутантов с измененной структурой клеточной поверхност и.

Явление спонтанной изменчивости морфологии колоний (диссоциации) у азоспирилл обнаружено в 1987 г. Матвеевым с соавт.. однако до сих пор ее особенности и механизмы во многом не ясны. При проверке R- и S-клонов по ряд> биохимических признаков различий между ними не обнаружено, однако S-варианты отличались от R-вариантов характером колоний, интенсивностью образования оранжевого пигмента, обычно характерною для Azospirúlum. и степенью адсорбции красителя Конго красного Помимо морфологических изменений, диссоциация приводит к уменьшению адсорбции на корнях расгений и увеличению ацетилен-редуктазной активности

В работе Матвеева с соавт.. был изучен плазмидный состав R- и S-вариантов A. brasilense Sp 7. Было выяснено, что исходная культура A. brasilense Sp 7 содержит 4 плазмиды с молекулярными массами 360, 340, U5 и 90 МДа. Однако клетки стабильного S-варианта, как оказалось, имеют только 3 плазмиды: у них отсутствует плазмида 115 МДа. Следует отметить, что, несмотря на имеющийся опыт изучения плазмид Azospiríllum, их функции до настоящего времени не вполне ясны. Тем не менее, можно допустить, что диссоциация культур A brasilense Sp 7 связана с изменением плазмидного состава этого микроорганизма.

Известно, что изменение плазмидного профиля у некоторых азоспирилл вызывает изменения химического состава клеточной поверхности (нарушения в экзополисахаридном слое). Как правило, такие нарушения детектируются по отсутствию свечения при выращивании культур на средах, содержащих калькофлюор -вещество, специфически окрашивающее глюканы и их производные. Влияние подобных изменений на процессы прикрепления микроорганизмов к растительным клеткам обычно изучают с использованием модельной системы - суспензионной культуры клеток моркови, оценивая степень ее агглютинации при взаимодействии с бактериями. В дополнение к калькофлюорному тесту, для подобных оценок мы предлагаем использовать метод cell-gold immunobiotting с применением целлюлаз, меченных КЗ. Кроме того, целью данной части нашей работы было изучение некоторых физиолого-биохимических свойств поверхности R- и S-диссоциантов штамма А. brasilense Sp 7. В частности, выяснение наличия (или отсутствия) в клеточной стенке азоспирилл тех или иных форм ß-D-глюканов и оценка относительной гидрофобности их клеточной поверхности. Эти свойства, как мы полагаем, могут оказывать влияние, в частности, на адгезию бактериальных клеток к корням растений.

Для сравнения структур клеточной поверхности R- и S-форм A. brasilense Sp 7 были использованы целлюлаза, AT, и различные лектины, меченные КЗ. По результатам соответствующих исследований бактерий рода Rhizobium и Agrobacterium известно, что на первых этапах их взаимодействия с растениями у бактериальных клеток образуются целлюлозные фибриллы. Следовательно, наличие целлюлозы (или ее предшественников типа ß-D-глюканов) у бактерий рода Azospiríllum могло бы свидетельствовать о схожести механизмов взаимодействия с корнями высших растений для азоспирилл и других почвенных бактерий.

Результаты дот-блот анализа (рис. 4), проведенного с применением набора молекулярных зондов, специфичных к различным типам углеводных соединений, достаточно убедительно свидетельствуют о наличии глюканов в составе экзополисахарида (ЭПС) R- формы A brasilense Sp 7. Об этом, прежде всего, говорят четко выявляемые взаимодействия Con А (специфичного к маннозе и !люкозе) и

а • О • • •

е и о i"'

б Щ * • © á #

в £Г Чш

ш ж

Рис. 4. Дот-блот анализ целых клеток R-(верхние ряды) и в- (нижние ряды) форм бактерий А. Ьга5Иете Яр 7. Использованы АТ к 8- форме (а), лектины 11ЕА1 (б) и Соп А (в), целлюлаза (г), меченные КЗ

целлюлазы (выявляющей гликозидные связи i люканов) с клетками только R-формы данного штамма азоспирилл. Отсутствие взаимодействий Con А и целлюлазы с клетками S-формы, по-видимому, говорит о том, что соответствующие им лиганды не входят в состав поверхностных полисахаридов S-варианта A brasilense Sp 7. Эти соображения согласуются с результатами исследований моносахаридного состава ЭПС бактерий данного штамма, согласно которым в ЭПС из природной R-формы ш гамма Sp 7 обнаружены глюкоза, 1алактоза, фукоза и рамноза (De Troch et al., 1990). Тогда как для S- формы в поверхностных полисахаридах глюкоза не найдена (Коннова с соавт., ' 1990).

AT, полученные против S-формы штамма Sp 7, одинаково эффективно взаимодействовали с обеими формами данного микроорганизма Аналогичные I результаты были получены и в экспериментах с AT против R- формы. Как было

отмечено выше, использованные нами AT обладают О-антигенной специфичноегью. Таким образом, можно констатировать, что R-S диссоциация для бактерий данного штамма не связана с кардинальными изменениями липополисахаридной части их внешней мембраны, о чем свидетельствует также идентичность электрофоретических спектров ЛПС R- и S-форм. Эти наблюдения согласуется с результатами детальных иммунохимических исследований нетипичного характера R-S диссоциации у азоспирилл, приведенными в работе Матора с соавт. (2003)

Не выявили различий между R- и S-клонами также агглютинин зародышей пшеницы (WGA, специфичный к М-ацетил-О-глюкозамину) и лектин арахиса (PNA, специфичный к галактозе и i алактозамину). Однако лектин 1 из Ulex europeus (UFA 1) уже гораздо лучше взаимодействовал с R-формой бактерий по сравнению с их S-вариантом, что неудивительно, если учесть его специфичность к фукозе и (хотя и в меньшей степени) к глюкозе.

Одной из важнейших характеристик почвенных азотфиксирующих микроорганизмов, представляющих интерес с точки зрения их взаимодействия с растениями, является относительная гидрофобность клеточной поверхности. Это объясняется тем, что на первых этапах взаимодействия почвенных бактерий с корнями растений существенную роль играют процессы адгезии, а относительная гидрофобность клеточной поверхности во многом определяет ее адгезивные свойства Различия в составе клеточной поверхности R- и S-клонов должны оказывать влияние и на такой интегральный показатель клеток, как их гидрофобность.

Однако, на наш взгляд, традиционные методы определения относительной гидрофобност и клеточной поверхности довольно трудоемки и, в частности, требуют ' существенных затрат времени В связи с этим нами были проанализированы

возможности оригинального метода оценки гидрофобности: дот-блот анализа целых клеток с использованием катиопных маркеров - конъюгатов КЗ. Известно, что степень гидрофобности существенно зависит от заряда клеточной поверхности микроорганизмов Поэтому естественно допустить, что катионные зонды, меченные КЗ, будут лучше связываться с отрицательно заряженной клеточной поверхностью тех микробов, которые принято считать более гидрофильными Для оценки относительной гидрофобности клеток мы использовали синтезированный нами новый маркер полиэтиленимин - КЗ.

Процедура опыта была аналогична методике cell-gold immunoblotting Эксперименты показали, что предлагаемый метод отличается простотой реализации, а дос i оверносг ь результатов подтверждена еще четырьмя независимыми методами-

гидрофобной хроматографией, адгезией на полистироле, высаливанием сульфатом аммония и разделением в двухфазных системах.

Таким образом, суммируя результаты проведенных нами экспериментов (табл. 1) и учитывая данные, приведенные в литературных источниках, можно заключить, что в составе клеточной поверхности природной R-формы A brasilerise Sp 7 содержатся целлюлозные фибриллы (или их глюкановые предшественники), исчезающие при спонтанной мутации с образованием устойчивой S-формы бактерий данного штамма. Принимая во внимание результаты генетических исследований штамма Л brasilense Sp 7 (Лаборатория генетики ИБФРМ РАН), это можно связать с исчезновением из экстрахромосомного состояния плазмиды 115 Мда и ее встраиванием в основной геном.

Таблица 1. Сравнительная характеристика цитохимических и физико-химических свойств клеточной поверхности R- и S-вариантов A HRAS/LI XSl' SP 7

Тесты: j Cfl |MopK,j Целл. g WGa| PNA^ConT UEÄl~j Фет. | AT | ПЭИ | R-форма | + j + I +' | +" f" + | 4 | - I + | +' I

В связи с приведенными в этом разделе и известными из литературы данными, мы посчитали возможным выдвинуть гипотезу о роли R-S диссоциации в процессе взаимодействия азоспирилл с растениями. По нашему мнению, эта мутация, связанная с исчезновением из экстрахромосомного состояния плазмиды 115 МДа и приводящая к изменениям в балансе полисахаридного состава клеточной поверхности, относительной гидрофобности, азотфиксирующсй активности и собственной лектиновой активности, является одной из составляющих адатационного механизма при переходе бактерий от свободного обитания в почве к ассоциативному симбиозу с растением.

В работе Солововой с соавт. (1995) было показано, что для активно адгезирующих клеток A. radiobacter 5D-1 характерно наличие на их поверхности особых фибриллоподобных образований, по внешним признакам аналогичных структурам, которые образуются при взаимодействии ризобий с бобовыми и патогенных бактерий с двудольными растениями. Методом транспозонного мутагенеза были получены не связывающие калькофлюор мутанты A radiobacter 5D-1 с измененной способностью к продукции поверхностных полисахаридов. Некоторые из них (225, 362) показали пониженную способность прикрепляться к корням однодольных растений.

Мы провели исследования углеводных компонентов исходного и мутантных (предположительно дефектных по поверхностным полисахаридам) штаммов на уровне целых клеток с использованием биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ. Для оценки эффективности взаимодействия AT, целлюлазы и глкжозоспецифичных лектинов (UEA, Con А) с клеточной поверхностью использовали методы иммунопрецинитаиии в растворе и дот-анализ целых клеток с золоюй меткой. Было установлено, что мутанты 225 и 362, в отличие от исходного штамма, утратили способность взаимодействовать со специфичными AT, полученными против углеводов клеточной поверхности, целлюлазой и глюкозоспсцифичными лектинами. меченными КЗ. Мутанты 227, 228, 229 (табл 2) сохранили эту способность. Эти данные были подтверждены электронно-микроскопической визуализацией соответствующих структур с использованием AT и целлюлазы. меченных КЗ.

Таблица 2. Взаимодействие клеток штамма а клпюнас и.к 50-1

и его мутантов с г.иоспецифическими маркерами

| Маркер Шгамм

5Э-1 1 225 227 228 | 229 1 362

| Антитела + КЗ + 1 - - + | + | -

1 Целлюлаза + КЗ - + | + | _

| Лектины Соп А, 1!ЕА 1 + КЗ - 1 - + I + 1 -

Полученные результаты озволяют предположить, что в состав фибриллоподобных

структур у непатогенных агробактерий могут входить вещества полисахаридной природы (возможно, целлюлоза).

3 3. Применение дот-анализа и иммунозолотых маркеров для создания иммунохимическгсс тест-систем

Ранняя диагностика острых кишечных инфекций является весьма актуальной задачей современного здравоохранения. При достижении достаточной быстроты ответа (2-4 ч), экспресс-методы приобретают важное ориентирующее значение для своевременного проведения комплекса противоэпидемических мероприятий (изоляция, дезинфекция, обследование контактных) и назначения адекватной этиотропной терапии. Однако относящиеся к данной категории методы, например, иммунолюминесцентного и иммуноферментного анализа (ИФА) не нашли достаточно широкого применения в клинической практике.

Целью данного раздела нашей работы являлась адаптация и оценка информативности метода дот-анализа с использованием конъюгатов КЗ с биоспецифическими зондами (непрямое мечение) и стандартных агглютинирующих сывороток для экспресс-диагностики острых кишечных инфекций.

Исследуемый материал от больных использовали одновременно для дот-анализа и традиционного бактериологического исследования. Последний включал посев на среды обогащения (селенитовый бульон) и плотные селективные среды (Плоскирева, Эндо) с последующей идентификацией выделенных культур с помощью бактериоскопии, высевов на "пестрый ряд" и реакцию агглютинации с видовыми сыворотками.

Как для реакции агглютинации, так и для дот-анализа применяли стандартные сухие кроличьи сыворотки: агглютинирующую сальмонеллезную поливалентную О-сыворотку групп А, В, С. П. К (Тбилиси), поливалентную агглютинирующую эшерихиозную сыворотку ОКА (Москва), агглютинирующую поливалентную сыворотку к шигеллам Флекснера, Ньюкасл, Зонне (Днепропетровск) В качестве биоспецифического зонда мы использовали козьи АТ против кроличьего у-глобулина (Са1ЫосЬет, США), меченные КЗ.

Мы применили метод дот-анализа при исследовании материала от 28 больных, поступивших в стационар с предварительным диагнозом "кишечная инфекция неясной этиологии" Результаты исследований, полученных методом дот-анализа, сопоставляли с результатами бактериологическою анализа Оабл 3) В таблице приведено количество обследованных больных с диагнозами, установленными двумя методами.

Таким образом, метод дот-анализа с использованием иммунозолотых маркеров позволяет идентифицировать возбудителей кишечных инфекций, по нашему мнению, более надежно и оперативно, чем рутинные методы. Продолжительность анализа составляла около двух часов.

Таблица 3. Ргзультаты диагностики кишечных инфекций методами дот- и

бактериоло! ичьского анализа

у—— " .......... | Метод Диагноз

Коли- | Сальмонеллез Шигеллез Стафило- Кишечная

инфекция | кокковая инфекция инфекция неясной этиологии

I Дот-анализ 8 | 4 10 " 6 |

| Бак. анализ 6 ! 3 8 2 9 1

Приведенные данные позволяют заключить, что предлагаемый метод может быть с успехом использован в лабораторной диагностике кишечных инфекций, поскольку он обладает экспрессностыо, высокой специфичностью и чувствительностью. В настоящее время нами проводится работа по дальнейшей оптимизации метода с целью сокращения сроков проведения анализа при использовании большего количества сывороток с более узкой специфичностью, а также исследуется возможность автоматизации метода. Кроме того, мы использовали метод иммунозолотого дот-анализа для идентификации АГ стеблевых меристем пшеницы и для иммунохимического исследования возбудителя головневых инфекций пшеницы.

Таким образом, предложенный метод дот-блот ан&тиза с использованием маркеров - конъюгатов КЗ может быть, по нашему мнению, с успехом использован как для фундаментального изучения клеточной поверхности, ь частности, почвенных бактерий, так и для практического применения в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний человека и животных, а также для изучения и полевого анализа хозяйственно значимых АГ в селекционной работе и фитопатологических исследованиях.

Глава 4. Использование коллоидного золота для количественного определения белков

4.1. Оптимизация метода SP1A для количественного иммуноанализа

Метод дот-блот анализа с применением биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ, представленный в главе 3, находит все более широкое распространение и признание благодаря его высокой чувствительности и простоте выполнения. Однако этот метод имеет ряд ограничений, среди которых, в первую очередь, необходимо отметить трудности строгой количественной интерпретации результатов, сложность работы с низкомолекулярными лигандами и значительные затруднения, возникающие при выявлении компонентов сложных биологических систем (гомогенаты, экссудаты и т.п.).

В 1980 г. Лойверинг с соавт. предложили новый метод иммуноанализа, названный авторами иммуноанализ на частицах золя (sol particle immunoassay, SPIA). В этом методе используются два важных свойства золотых золей ич типичный яркий красный цвет, который практически не изменяется при адсорбции на частицах золота высокомолекулярных соединений, и значительное изменение поглощения в видимой области енктра и, следовательно, цвета золя, сопровождающее агрегацию чааиц. Это изменение спектра поглощения легко детектируется спектрофотометрически или визуально Метод SP1A в авторской интерпретации довопьно прост в исполнении.

Аликвоты забуфереяной взвеси золотосодержащею маркера и раствора исследуемого образца смешивают в реакционном сосуде. В течение инкубационного периода (05-2 часа) контролируют положение и величину максимума спектра поглощения суспензии, либо визуально оценивают ее цвет Если в результате биоспецифической реакции, реализуемой на поверхности коллоидных частиц, произошла дестабилизация золя, частицы золота агрегируют (при использовании поликлональных AT этот процесс называется агглютинацией), что приводит к существенным изменениям в спекгре поглощения суспензии с заметным изменением ее цвета (с красного на голубой или серый) Для количественной регистрации результатов реакции возможно применение широко распространенных спектрофотометров и колориметров.

Все варианты использования метода SPIA оказались весьма простыми в исполнении, демонстрировали высокую чувствительность и специфичность. Однако исследователи столкнулись с тем фактом, что не всегда реакция типа АГ-АТ на частицах золя приводит к дестабилизации системы (агрегации). В ряде случаев, несмотря на заведомую комплементарность пары, изменения цвета раствора и, соответственно, спектров поглощения не происходило или они были незначительными. После серии предварительных экспериментов нами было выдвинуто предположение, чго п этом случае, вероятно, происходит образование второго белкового слоя на золотых частицах без потери агрегативной устойчивости золя Изменения спектров, обусловленные адсорбцией биополимеров на поверхности металлических частиц, сравнительно малы Однако даже такие незначительные изменения спектров поглощения, обусловленные изменением структуры биополимерного слоя (и, в частности, его среднего показателя преломления) около поверхности золотых наночастиц, оказалось возможным регистрировать и использовать для количественного анализа в биологических приложениях, что продемонстрировал П. Енглибьен с соавт. (1998).

Несмотря на то. что метод SP1A весьма прост в реализации, за более чем 20-летнюю историю его развития количество публикаций и примеров его реального практического использования оказалось довольно скромным Только в самое последнее время появились работы, указывающие на возможность его использования в качестве высокопроизводительного клинического теста Причина слабого внедрения метода связана, на наш взгляд, с недостаточным пониманием физико-химических и оптических механизмов, ответственных за трансформацию сигналов, возникающих при биоспецифическом связывании молекул-мишеней с КЗ-конъюгатами, в показатели ослабления или рассеяния света суспензиями. В связи с этим, целью данной части нашей работы являлась разработка модифицированною варианта биоспецифического агрегационного анализа с использованием как серийного спектрофотометра, так и микротитровальных планшетов и ИФА-ридера.

В качестве биоспецифической пары для конъюгата КЗ с протеином А был выбран человеческий lgG (Sigma. США). Спектрофотометрические наблюдения взаимодействия биоспецифической пары проводили с использованием спектрофотометра Specord М-40. Смешение всех компонентов проводили непосредственно в 1-см фотометрических кюветах Спектры поглощения записывались в циклическом режиме с регулируемым временным интервалом между каждой регистрацией Минимальное время между смешением компонентов и регистрацией первого спектра составляло около 30 сек. Кроме того, регистрацию проводили в микротитровальных планшетах с использованием ИФА-ана шзатора АИФ-Ц-01С (ЗАО "ИЛИП", Россия).

500 550 600 Д^ина волны нм

Рис. 5. Динамика спектров

поглощения агрегатов, образованных в результате биоспецифического взаимодействия белка А и igG, меченных КЗ

На рис. 5 приведены спектры поглощения агрсгаюв, образующихся в результате биоспецифического взаимодействия конъюгата протеин А - КЗ и ^О. Протеин А - белок клеточной стенки стафилококка, способный с высокой константой связывания взаимодействовать с Рс-фрагменюм молекулы Причем каждая молекула протеина А способна связывать, по меньшей мере, две молекулы Обращает на себя внимание тот факт, что характер спектральных кривых агрегации отличается от такового для солевой агрегации, описанного Хлебцовым с соавт. (2000). В частности, отсутствует второй пик в длинноволновой области, характерный для быстрой солевой агрегации, а наблюдается лишь смещение максимума поглощения в красную область и снижение его абсолютного значения. Причем изменения спектров гораздо более выражены в случае, когда на золотых частицах сорбированы оба участника биоспецифической реакции. Визуально реакция проявлялась в изменении цвета раствора с красного на голубой или серый. В качестве контроля были использованы смеси золей с раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА). При этом изменений оптических характеристик взвесей не зарегистрировано.

В другой серии опытов мы смешивали стандартные суспензии маркера с растворами ^О различных концентраций. Результаты реакции регистрировали спектрофотометричсски через каждые 5 мин в течение часа. На основе полученного таким образом ряда спектральных кривых построен график зависимости положения максимума кривой ослабления света от концентрации вносимого вещества через 30 мин

после смешения (рис. 6) Таким образом, сопутствующие биоспецифической агрегации изменения оптических характеристик зависят от концентрации вносимого в суспензию вещества, что может послужить основой для его количественного определения (в том числе в составе различных смешанных систем). Подобный тест может найти применение в медицине, ветеринарии и лабораторной практике.

Однако такой способ регистрации биоспецифических взаимодействий обладает рядом недостатков, в том числе низкой оперативностью и большим расходом маркера и определяемого вещества. Для преодоления этих недостатков стандартной реализации ЙР1А на серийном спектрофотометре мы предложили использовать микротитровальные планшеты и ИФА-ридер Применение модифицированного варианта 5Р1А проиллюстрируем на примере количественного определения в реакции с

0(И 003 005 007 009 011 013 015 Концентрация IgG мг/мл

Рис. 6 Калибровочная кривая для количественного определения IgG при биоспсцифическом взаимодействии с маркером протеим Л - КЗ

протеином А, меченным КЗ. В лунках планшета делали последовательные двойные разведения ¡gG с начальной концентрацией 1 мг/мл, затем в каждую лунку добавляли одинаковое количество (50 мкл) маркера протеин А - КЗ с оптической плотностью Л$20 = 1.0. Через 30 мин измеряли оптическую плотность с использованием ИФА-ридера при X = 620 нм. Кривая зависимости оптической ПЛ01НОСТИ раствора от количества внесенного белка представлена на рис. 7. Следует отметить, что минимальное выявляемое количество белка при этом способе регистрации составило 0.2 мкг, по сравнению с 2 мк! при регистрации традиционным способом. Кроме того, значительно сократились расход белка и маркера, а также время проведения анализа. Аналогичные результаты были получены при исследовании взаимодействия \УОА и конъюгата фетуин - КЗ.

Исследованные нами агрегаты биоконъюгатов не имели строго детерминированного межчастичного расстояния, но для понимания оптических свойств наших объектов решающим обстоятельством является то, что золотые частицы кластера не находятся в непосредственном контакте, а разделены тонкой диэлектрической прослойкой биополимеров. Отсутствие непосредственного омического контакта между золотыми частицами при биоспецифической агрегации золей КЗ подтверждено электронно-микроскопическими исследованиями.

4 2. Разработка метода количественного определения белков с использованием конъюгата трипсин - коллоидное золото

Существуют различные методы количественного определения белков в растворе. Наиболее распространены спектрофогометрические (метод Варбурга-Христиана), флуорометрические и колориметрические (биуретовая реакция, методы Лоури, Бредфорда и др.). Способность золотых частиц при их взаимодействии с белками агрегировать с изменением цвета раствора послужила основой для разработки метода колориметрического количественного определения белков (51охсЬеск, 1987).

Общим для всех белков (в отличие от других биополимеров) является регулярное чередование пептидных связей, в то время как свойства белковых молекул определяются, главным образом, деталями строения их аминокислотных остатков. По нашему мнению, подлинно количественным определением белков могло бы стать определение количества пептидных связей. Однако единственный из известных методов, основанный на специфической реакции пептидной связи с ионами меди в щелочной среде - биуретовый - не отличается приемлемой чувствительностью и селективностью.

В нашей работе мы применили для количественного определения белка в растворе конъюгат КЗ с трипсином Трипсин - панкреатическая сериновая протеиназа, которая секретируется в кишечник и расщепляет белки пиши Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей белков, содержащих основные аминокислоты, гакие, как лизин или

0 01 0 10 Концентрация 1зО мг/ит

Рис. 7. Зависимость оптической плотности раствора про I еин А -КЗ при Я = 620 нм от количества внесенного ^О

аргинин. Те. используя в качестве выявляющего агента трипсин, мы гарантированно получаем возможность обнаружить в растворе только белковые молекулы.

Известно, что в гисто- и цитохимии, помимо иммунологических реагентов, для ультраструктурных исследований используют меченые золотом ферменты - целлюлазу. РНКазу, ДНКазу, р-глюкозидазу, полигалактуроназу и др Показано, что ферменты, иммобилизованные на золотых частицах, сохраняют свою биокаталитическую активность и способны взаимодействовать с белками, присоединяясь к субстрату без последующей его деградации А поскольку, как правило, к одной молекуле белка присоединяется несколько молекул фермента, создаются условия для агрегации, которую можно зафиксировать фотометрическими методами. На этом основан предлагаемый нами новый метод аналитического неспецифического определения белков с использованием конъюгата трипсин - КЗ, заключающийся в регистрации взаимодействия пептолитического фермента, адсорбированного на золотых наночастицах, и белка в растворе.

Конъюгат трипсина с КЗ готовили по обычной схеме Золотое число для трипсина составило 10 мкг/мл при рН золотого золя 9 5 Приготовленный конъюгат тестировали методом дот-анализа. В качестве молекул-мишеней в наших экспериментах мы использовали тот же белок - ^ человека - что и в методе 5Р!А. Измерения проводили с испопьзованием как спектрофотометра Эресогс! М40, гак и ИФА-ридера. Оказалось, что при взаимодействии конъюгата КЗ-трипсин с также происходят количественно детерминированные агрегационные процессы.

Кинетические спектры агрегации очень похожи на таковые для пары протеин А -Калибровочная кривая, построенная по данным регистрации оптической плотности при л - 620 нм на ИФА-ридере, представлена на рис. 8.

Необходимо отметить, что минимальное выявляемое количество 1§0 при использовании конъюгата трипсин - КЗ составило 0.2 мкг.

Таким образом, предложенный вариант метода 8Р1А с использованием микротитровальных планшетов и ИФА-ридера позволяет существенно сократить время анализа при большем количестве исследуемых проб и большей чувствительности. Новый метод анализа с использованием конъюгатов протеолитических ферментов с КЗ кажется нам весьма перспективным для быстрого и чувствительного количественного определения белков.

4.3. Использование конъюгатов золотых наночастиц с биологическими макромолекулами в методах колебательной спектроскопии

Спектры поглощения в видимой и УФ-областях, о которых шла речь выше, возникают в результате электронных переходов в атомах и молекулах между основными энергетическим уровнями. Поглощение же в ИК-области обусловлено переходами между колебательными подуровнями, отвечающими разной

колебательной энергии функциональных групп В ИК-спектроскопии чаще всего используют среднюю часть ИК-области 4000-400 см"1. Для итерпретации ИК-спектров составлены

001 ою

Концентрация igG, чи/мл

Рис 8 Зависимость оптической плотности раствора трипсин -КЗ при Л = 620 мм 01 количества внесенного

специальные каталоги и таблицы, в которых указаны характеристические частоты колебаний различных групп Значения молярных коэффициентов экстинкции для ИК~ области меньше, чем для видимой и УФ-областей. Поэтому с помощью ИК-спектроскопии целесообразно исследовать или чистые вещества, или достаточно концентрированные растворы.

ИК-Фурье спектроскопия представляет собой один из вариантов метода ИК-спектроскогши. Спектры веществ, полученные на ИК-Фурье спектрометрах, не отличаются от спектров, полученных на диспергирующих ИК-спектрометрах. Однако в ИК-Фурье спектрах достигается более высокое разрешение полос ИК-спектр принято считать индивидуальной характеристикой данного вещества Еще одним гипом колебательной спектроскопии является спектроскопия комбинационного (рамановского) рассеяния.

Как ИК-, так и спектроскопия комбинационного рассеяния являются весьма эффективным инструментом исследования строения молекул, поскольку набор частот внутримолекулярных колебаний однозначно связан со структурой молекул, а также межмолекулярным и внутримолекулярным взаимодействием. Однако малая интенсивность сигнала делает регистрацию спектра достаточно сложной задачей, требующей современных лазерных источников света и систем счета фотонов

Интенсивность сигнала можно увеличить в Ю10 и более раз, если использовать при регистрации спектров комбинационного рассеяния молекулы, адсорбированные на металлической поверхности. Различают два типа механизмов усиления при адсорбции: электромагнитные механизмы, связанные с увеличением локального электромагнитного поля вблизи поверхности, и молекулярные механизмы - за счет образования новых возбужденных состояний комплекса молекула - металл

В большинстве исследований используют адсорбцию биологических молекул на металлических электродах или тонких пленках Однако в последние годы наиболее широкое распространение получают методы, основанные на использовании для усиления сигнала коллоидных металлов (в основном золота и серебра). Это усиление определяется гигантскими нелинейными локальными полями, образующимися в металлических кластерах (Шалаев, Штокман, 1987). На основе этих методик разрабатываются варианты иммуноанализа с использованием AT или АГ. сорбированных на золотых наночастицах.

Мы использовали метод абсорбционной ИК-Фурьс спектроскопии с усилением на поверхности (surface-enhanced infrared absorption spectroscopy, SEIRA) для разработки способа детекции биоспецифических взаимодействий в системе, когда один из участников реакции сорбирован на частицах КЗ.

Были приготовлены конъюгаты протеина А с КЗ со средним диаметром частиц 15 и 30 нм. Предварительные эксперименты показапи, что лучшие результаты при регистрации SElRA-спектров получались при использовании конъюгатов с КЗ диаметром 30 нм, поэтому в дальнейшем мы применяли только их. Чтобы избежать дополнительных полос в спектрах, при пригоювлении коньюгатов вторичный стабилизатор не вносили. Концентрация протеина А в конъюгате составила 6 мкг/мл.

Проведение собственно биоспецифической реакции заключалось в следующем. К 5 мл конъюгага протеина А с КЗ (Л «о = 1.0) добавляли примерно эквимолярное количество (200 мкл) водного раствора человеческого IgG, или в качестве контроля -ЬСА Начальные концентрации обоих белков составляли 1 мг/мл После инкубации в течение часа при комнатной температуре пробы центрифугировали 5 мин при 4°С и

12000 g. Затем супернатант сливали, осадок ресуспен-дировали в 5 мл бидистил-лированной воды и центрифугировали при тех же условиях.

Измерения проводили на ИК-Фурье спектрометре Magna 1R 750 (Nicolet, США) с использованием метода ослабления полного внутреннего отражения на стандартных ZnSe подложках (Spectra-Tech. США). На подложки наносили 100 мкл водной суспензии осадка центрифугированной пробы (или растворов нативных протеина А и IgG) в виде полосы шириной ~ 3 мм по всей длине подложки и высушивали в сухо-воздушном термостате при 45°С 1 час. После этого проводили спектроскопические измерения образовавшейся сухой пленки с разрешением до 4 см"' с суммированием 100 разверток спектра на каждый образец. Спектроскопические данные обрабатывали с помощью стандартного программного обеспечения OMNIC 3.1 (Nicolet, США).

На рис. 9 (1) приведен ИК-Фурье спектр нативного протеина А, представляющий собой типичный ИК-спектр белка, включающий полосы валентных колебаний групп N-Н при 3290 и 3077 см"'; симметричных и антисимметричных валентных колебаний групп СН2 и СН3 боковых цепей аминокислот (около 3000-2800 см"1); характерные четкие полосы амид-1 (С=0) и амид-И (N-H и C-N) пептидов (соответственно, 1652 и 1540 см"1); полосу деформационных колебаний СН2 (1453 см'1); уширенные полосы С-NH2 боковых цепей первичных аминов (около 1400 см"'); слабые полосы C-N, С-0 и С-С-0 аминокислотных остатков (ниже 1350 см'1).

Спектр протеина А. конъюгированно! о с КЗ. заметно отличается от спектра нативного белка (рис. 9 (2)) Во-первых, обращает на себя внимание, что количество протеина А в образце конъюгата с КЗ было примерно в 5 раз меньше, чем в образце нативного белка. Тем не менее, наблюдалось 2-3-х кратное увеличение интенсивности поглощения. Этот факт свидетельствует о том. что связывание белка с золотыми частицами в приведенной схеме измерения приводит к усилению поглощения в 10-15 раз (эффект SE1RA). Такое усиление согласуется с природой конъюгатов биомолекул с

Рис. 9. Ик-Фурье спектры нативного протеина А (100 | мкг) (1), протеина А, конъюгированного с КЗ (20 мю белка) (2); коныогата протеина А с КЗ после взаимодействия с 13)

КЗ, обусловленной относительно слабыми нековалентными (электростатическими и гидрофобными) взаимодействиями, которые позволяют сохранить нативные свойства биомакромолекулы и ее функциональную активность. Как извест но, ковалентная пришивка макромолекул к металлической поверхности приводит к более выраженному эффекту усиления Во-вторых, SEIRA-спектр конъюгата протеина А с КЗ демонстрирует исчезновение полосы при 3290 см 1 и появление вместо двух полос амид-1 (1652 см"') и амид-П (1540 см"') единственного промежуточного интенсивного пика при 1569 см'1 с небольшим плечом около 1650 см"1. Эти изменения могут быть связаны с участием групп N-H во взаимодействии с поверхностью металлической частицы. Кроме того, усилены колебания боковых цепей аминогрупп C-NH2 в области 1400 см"1 и С-С/С-0 колебания (1150-1000 см'1).

Выраженные изменения спектра протеина А, конъюгированного с КЗ, по сравнению со спектром нативного белка, служат прямым доказательством прикрепления биомолекул к поверхности золотых наночастиц, что может быть положено в основу метода контроля процессов биоконъюгации

Другой существенный эффект был отмечен при биоспецифическом взаимодействии IgG с конъюгатом протеина А с КЗ. Он заключался в восстановлении основной формы спектра нативного протеина А с примерно 15-кратным усилением сигнала (рис. 9 (3)). Добавление БСА в качестве контроля к конъюгату протеина А с КЗ не приводило к изменению спектров (они оставались аналогичными представленному на рис. 9 (2)).

Тот факт, что спектр комплекса (КЗ-протеин A)-IgG (рис. 9 (3)) в значительной степени совпадает со спектром нативного протеина А (рис. 9 (1)) и отличается от спектра конъюгата протеина А с КЗ (рис. 9 (2)), свидетельствует о произошедшем взаимодействии IgG с протеином А, сорбированном на золотых наночастицах. Это согласуется с наблюдениями, полученными с использованием метода гигантского комбинационного рассеяния и золотых частиц для изучения реакции АГ-А'Г (Dou et al., 1998).

В заключение описания этого раздела отметим, что полученные результаты впервые продемонстрировали возможность применения SElRA-спектроскопии сухих пленок золотых биоконъюгатов для чувствительного определения взаимодействия белковых молекул с поверхностью золотых частиц, а также для достоверной и простой регистрации биоспецифических реакций. Описанный метод может послужить основой для разработки тест-систем, детектирующих биоспецифические взаимодействия типа АГ-АТ, фермент-субстрат, лектин-полисахарид и т.п. Кроме того, обнаруженные нами изменения спектров биомолекул на золотых частицах являются доказательством того, что биомолекулы действительно адсорбированы на частицах. Этот факт особенно важен с точки зрения проблем контроля синтеза конъюгатов гаптенов с частицами КЗ, которые могут быть использованы в качестве носителя для последующей иммунизации животных. Предложенный метод наряду с другими (например, гигантским комбинационным рассеянием) может быть использован для контроля качества таких конъюгатов.

Глава 5. Применение коллоидного золота для получения антител

in vivo и in vitro

5.1. Адъювантные свойства золотых наночастиц

Напомним, что получение AT к низкомолекулярным и низкоиммуногенным АГ остается одной из самых актуальных задач современной иммунологии. Это объясняется

тем. что иммунохимические тест-системы являются одним из самых удобных (зачастую единственным) методом мониторинга таких соединений, как антибиотики, гормоны, витамины, нейромедиаторы, пестициды и др. в крови людей и животных, в мясных и молочных продуктах, в культуральных средах Кроме того, в исследовании топографии и структуры биомакромолекул AT к их отдельным участкам являются незаменимым инструментом Весьма перспективным видится использование AT к низкомолекулярным соединениям в иммунотерапевтической практике.

Как известно, с 1986 г. (Shiosaka et al) КЗ используется в качестве носителя гаптенов при иммунизации животных для получения AT. Однако о механизме антителообразования при таком способе иммунизации сведений в доступной литературе мы не нашли. Это дало нам основания для постановки экспериментов, имеющих своей целью оценку эффективности КЗ как средства получения AT к разнообразным АГ и исследование механизма их биосинтеза.

Первым АГ, использованным нами для отработки методики, был выбран биотин (витамин Н). Известно, что биотин высокоспецифично взаимодействует с гликопротеином яичного белка авидином или с мембранным белком Streptomyces avidini - стрептавидином (Кл = 10"15 М). Причем для такого взаимодействия требуется только уреидное кольцо витамина, а карбоксильную группу остатка валериановой кислоты в биотине можно модифицировать и таким образом получать активные биотинилированные производные белков и нуклеиновых кислот (Bayer, Wilchek, 1980). При этом биотин, связанный с макромолекулой, сохраняет способность взаимодействовать с активным центром авидина. В последнее время система авидин-биотин нашла широкое применение в практике работ по обнаружению, локализации и очистке белков, исследованию генетических структур с использованием олиго- и полинуклеотидных зондов (методы молекулярной гибридизации), в иммуноанализе и т.п. При этом используют различные метки: ферменты, хемилюминесцентные соединения, флуорофоры, коллоидные частицы. В качестве дополнения (альтернативы) применению авидина или стрептавидина могут быть использованы антибиотиновые AT (Tomlinson et al, 1988).

Наши предварительные эксперименты показали неэффективность традиционного подхода - иммунизации кроликов препаратами конъюгата биотина с БСА Поэтому при иммунизации животных биотином в качестве носителя были использованы частицы КЗ. Для этого синтезировали КЗ со средним диаметром частиц 15 нм по методу Френса. Значения pH золя и раствора биотина с концентрацией 5 мг/мл доводили до 9.0 и 9.5 соответственно, используя 0.2 М водный раствор К2С03. Затем компоненты смешивали в соотношении 1:1. Об устойчивости комплекса судили по отсутствию агрегации (изменения цвета раствора) при добавлении NaCl до концентрации 0.5%. 1.0 мл раствора стабильного комплекса смешивали с 1.0 мл потного адъюванта Фрейнда (ПАФ). Затем полученную эмульсию (I 0 мл) вводили дробно подкожно кролику в дозе 0.1 мл на одну точку Эту процедуру повторяли 4 раза с интервалом в 2 недели. Таким образом, доза адъюванта на одну инъекцию составляла 50 мкл. а общее количество адъюванта в процессе иммунизации не превысило 0.5 мл Спустя 10 дней после последней инъекции кровь собирали и отделяли сыворотку. Фракцию иммуноглобулинов получали высаливанием сульфатом аммония. Затем проводили выделение фракции IgG с помощью высокоэффективной жидкостной анионообменной хроматографии на колонке Mono-Q в системе FPLC. Проверку полученных AT осуществляли методами колец преципитации, двойной иммунодиффузии и дот-блот анализа с использованием непрямого метода выявления связавшихся AT протеином А,

;

меченным КЗ. В качестве модельной системы применяли биотинилированный БСА. В качестве контроля использовали не меченный биотином БСЛ.

Реакция иммунопреципитации показала четко визуализируемое кольцо с биотинилированным БСА. Метод двойной иммунодиффузии позволил обнаружить преципитаты при разведении исходной сыворотки 1:32 Результаты дот-анализа продемонстрировали, что антибиотиновые AT показали большую чувствительность к выявлению биотина по сравнению со стрептавидином.

На следующем этапе нашей работы мы решили использовать для иммунизации животных конъюгаг КЗ с полноценным АГ. В качестве последнего был выбран АГ клеточной стенки бактерий Yersinia pseudotuberculosis. Выбор был обусловлен тем, что псевдотуберкулез, или экстраинтестинальный иерсиниоз, относится к числу инфекций, у широко распространенных как в нашей стране, так и за рубежом. Это, в первую

очередь, обусловлено выраженной адаптационной способностью возбудителя. Исследования последнего десятилетия позволяют говорить о практически повсеместном распространении этой инфекции в России. Однако число публикаций по разработке средств диагностики и профилактики иерсиниоза, на наш взгляд, пока невелико. Целью данного этапа нашей работы являлось определение эффективности КЗ как адъюванта, используемого для получения специфических AT к поверхностным белкам Y pseudotuberculosis, а также изучение его влияния на ферментативную и фагоцитарную активность лейкоцитов в процессе иммунизации животных.

Для получения специфических AT был использован АГ клеточной стенки бактерий У pseudotuberculosis. Бактериальную массу смывали с поверхпост и ai ара и разводили физиологическим раствором до концентрации 109 микробных клеток в миллилитре. Полученную взвесь обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин и центрифугировали при 18000 об/мин 30 мин при 4°С. Надосадочную жидкость декантировали и наносили на ионообменную колонку. Хроматографию проводили в 0.1 М трис-НС! буфере (рН 8.5) в градиенте от 0 до 1 М NaCl. При хроматографии выделялось 5 фракций Иммунологическую активность полученных АГ определяли методом иммунодот-анализа с поливалентной иерсиниозной сывороткой. В качестве детектирующего агента использовали протеин А, меченный КЗ. Белковый АГ фракции, обнаружившей наибольший отклик в дот-анализе, конъюгировали с КЗ. Процедуру получения конъюгатов КЗ с иерсиниозным АГ проводили при рП 5.6, минимальное защитное количество белка составило 10 мкг на 1 мл золя.

Иммунизировали шестерых половозрелых кроликов породы шиншилла. Животных разделили на три группы - по два в каждой Первую группу иммунизировали 100 мкл 2 конъюгата АГ с КЗ (таким образом, инъекционная доза составляла 1 mki АГ). Вторую

группу иммунизировали 100 мкг АГ, разведенного в физиологическом растворе и эмульгированного в 100 мкл ПАФ. Третью, контрольную группу, иммунизировали 100 j мкг АГ, разведенного в физиологическом растворе. Препараты с КЗ и физиологическим

раствором вводили внутримышечно, с ПАФ - подкожно. Иммунизацию проводили двукратно с интервалом 2 недели После второй иммунизации проводи шсь реиммунизация ("бустирование" - введение пативного А!" без адъювантов). Забор крови проводили из ушной вены через неделю после каждой иммунизации. Титр AT определяли в реакции гемагглютинации по общепринятой методике Ферментативную активность лимфоичных клеток крови (щелочную и кислую фосфатазу) определяли методами Кеплоу и Берстона. Фагоци! арную активность определяли по содержанию кат ионного белка методом Шубина и тестом восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) по Парку.

В табл. 4 приведены данные по изменению титра АТ при иммунизации по различным схемам Через неделю после первой иммунизации титр АТ составлял 1:32 в опытных группах (с использованием ПАФ или КЗ) и 1:2 в контрольной группе (без использования адъювантов) После второй иммунизации титры АТ во всех группах увеличились в восемь раз и составили во второй и первой группе 1:256, а в третьей группе 1:16. Основные результаты были получены посте реиммунизации. Во второй группе, где в качестве адъюванта был использован ПАФ, титр АТ увеличился до 1:10240. В эксперименте, где в качестве адъюванта было использовано КЗ, титр также составил 1:10240. Однако иммунизационная доза была при этом на два порядка меньше. При введении АГ с физиологическим раствором титр составил 1:512.

Таблица 4. Показатели титров антител в процессе иммунизации

| Препарат | 1-я иммунизация 2-я иммунизация Реиммунизация

КЗ + АГ 1 1:32 1:256 1:10240

ПАФ + АГ | 1:32 1:256 1:10240

Физ. р-р + АГ 1 1:16 1:512

Изучение фагоцитарной активности лимфоидных клеток проводили с учетом способности клеток восстанавливать зерна формазана, в тесте с нитротетразолевым синим и по образованию катионного белка в цитоплазме лимфоцитов. Полученные результаты свидетельствовали о способности КЗ стимулировать образование АТ при иммунизации АГ клеточной стенки микробных клеток На это указывало повышение активности как катионных белков клеток нейтрофильного ряда, так и повышенная активность данных клеток в восстановлении зерен формазана при проведении НСТ-теста ПАФ в данном случае стимулировал аналогичную или даже более низкую реакцию. Усиленный фагоцитоз частиц макрофагами, как нам представляется, вполне может быть ответственным за адъювантный эффект.

Таким образом, при использовании КЗ в качестве адъюванта титр АТ был таким же высоким, как и при использовании ПАФ, хотя количество вводимого АГ было на два порядка ниже. Приведенные данные показывают эффективность использования КЗ в качестве адъюванта при получении иммунной сыворотки против полноценного АГ.

На следующем этапе нашей работы мы получали АТ к слабоиммуногенному высокомолекулярному АГ - БСА и оценивали при этом факторы естественной клеточной и гуморальной резистенции организма крыс.

Для иммунизации использовали половозрелых крыс-самок Непосредственно перед иммунизацией конъюгат БСА с КЗ смешивали в соотношении 1:1 с ПАФ Полученную эмульсию вводили крысам внутрибрюшинно. Инъекции повторяли 4-кратно с интервалом 2 недели. Спустя 10 суток после последней инъекции производили отбор крови и отделение сыворотки Фракцию иммуноглобулинов получали высаливанием сульфатом аммония. Альтернативно животных иммунизировали АГ, конъюгированным с КЗ, АГ в смеси с ПАФ и АГ, растворенным в физрастворе.

Через 10 суток после второй, третьей и четвертой иммунизации у подопытных животных производили забор крови и проводили оценку факторов естественной клеточной и гуморальной резистенции. Тесты, определяющие функциональную и бактерицидную активность фагоцитов, содержание в сыворотке лизоцима и комплемента проводили по общепринятым методикам (Пастер с соавт., 1989).

Габл 5 демонстрирует нарастание титра сывороток в процессе иммунизации крыс БСА по описанным выше схемам. Обращает на себя внимание тот факт, что

максимальным титр после окончания иммунизации оказался у сыворотки, полученной при введении конъюгата БСА + КЗ без использования ПАФ.

Таблиц.». 5. Изменения титров сывороток в процессе иммунизации крыс БСА по

различным схемам

Отметим, что КЗ, использованное в качестве носителя АГ, активирует фагоцитарную активность лимфоидных клеток (рис. 10), что, возможно, и определяет его иммуномодулирующий эффект.

Задачей следующего этапа настоящей работы была оценка эффективности использования КЗ как средства получения AT in vivo на возможно большем количестве АГ различной природы с целью унифицирования методики и выяснения адъювантных свойств КЗ.

В качестве полноценных АГ использовали высокомолекулярные АГ: бактериородопсин - хромопротеид, выделяемый из мембраны Halobacterium halobíum (ИБХ РАН) и гладкомышечный актин из желудков кур (ИБФРМ РАН). Ряд антибиотиков, различных по химическому составу, таких, как левомицетин, гентамицин, неомицин, канамицин, ивермектин и тилмикозин (ЗАО "НИТА-ФАРМ", Саратов) использовали для иммунизации как гаптены Кроме того, использовали три синтетических пептида бактериородопсина, синтетический пептид из с-туе протоонкогена человека (в дальнейшем -"с-туе пептид") (ИБХ РАН), два синтетических пептида тропонина (Medix Biochemica, Финляндия), фитогормон -индолил-3-уксусную кислоту (Sigma, США).

Самым удивительным результатом явился тот, что на все использованные АГ (за исключением пептида 1 тропонина) были получены AT с достаточно высоким титром, который варьировал для различных АГ от 1:6400 до 1:51200. Наибольшие сложности были связаны с "посадкой" гаптенов на золотые частицы В частности, поскольку ивермектин и тилмикозин практически не растворимы в воде, конъюгацию КЗ с этими веществами проводили в растворе полипропиленгликоля. Кроме того, не все гаптены

оказывали стабилизирующее действие на золь золота, что выражалось в том, что золотое число определить было невозможно. В таких случаях мы смешивали 0.10 5% растворы гаптенов и КЗ в соотношении 1:1. Таким образом, количество использованного на каждую иньекцию АГ варьировало в пределах от 0.2 до 125 мкг. Тем не менее, эти количества были меньше таковых при использовании конъюгатов

100 80

60 40 20 О

III

■ А

■ Б

'□В

2-я

Иммунизация

Рис 10. Изменения фагоцитарной активности сыворотки в процессе иммунизации крыс БСА по различным схемам. А - БСА н КЗ; Б - БСА 4 ПАФ; В - нативный БСА

гаптенов с белками или полноценных АГ Возможно, что единственный отрицательный результат иммунизации (пептид I тропонина) был связан с самой низкой иммунизационной дозой - 0.2 мкг.

а э « -з » . . - |

5 <••••• * ♦♦•»•» ««« „

в __ .•*_">

1 2 3

Рис. 11 Результаты дот-анализа с-туе пептида (а), конъюгата с-тус пептида с БСА (б) и БСА (в). Выявляющие сыворотки получены при иммунизации мышей конъюгатом с-тус пептида с КЗ без использования ПАФ (1). с использованием Г1АФ (2), конъюгатом с-тус пептида с БСА с использованием ПАФ (3)

На рис. 11 и 12 приведены результаты иммунозолотого лот-анализа с-туе пептида и актина с применением АТ. полученных различными способами:

- иммунизацией нативным АГ;

- иммунизацией нативным АГ с использованием ПАФ;

- иммунизацией конъюгатом АГ с КЗ;

- иммунизацией конъюгатом АГ с КЗ с использованием ПАФ;

- иммунизацией конъюгатом АГ с БСА (для пептида).

Из рис. 11 и 12 видно, что минимальное выявляемое количество АГ (как гаптена, так и полноценного АГ) в дот-анализе с использованием сывороток, полученных с применением КЗ, по крайней мере, не ниже такового при использовании сывороток, полученных рутинным способом. При иммунизации мышей с-туе пептидом с использованием или без использования ПАФ положительного ответа мы не получили. Обращает па себя внимание тот факт, что при использовании конъюгатов АГ с КЗ ответ обнаруживался даже без использования ПАФ. Данное наблюдение подтверждает, на наш взгляд, наличие у золотых частиц иммуномодулирующих (адъювантных) свойств.

Таким образом, на основании полученных экспериментальных результатов мы вправе сделать предварительные выводы: 1) с помощью метода "золотой иммунизации"

можно получать АТ к гаптенам, в частности, к антибиотикам, витаминам и неиммуногенным пептидам, к которым традиционным способом получить АТ весьма затруднительно; 2) количество АГ, использованного в этом случае для иммунизации, намного меньше такового при традиционных методах, даже когда с их помощью удается получить иммунный ответ; 3) в опытах с с-тус, БСА и бактериальным АГ получен иммунный ответ без использования других

адъювантов.

По нашему мнению, все вышеприведенные факты достаточно убедительно говорят об иммуномодулирующих (адъювантных) свойствах КЗ Каков же механизм подобного действия золотых наночастиц? Для попытки ответа на этот вопрос следующие этапы нашей работы были

1 * * '

2 ■ « • • * * »

3

4 >••••• *

Рис. 12. Результаты дот-анализа куриного в-актина конъюгатом КЗ с антиактиновыми АТ. АТ получены иммунизацией мышей нативным актином (1),

актином с использованием ПАФ (2), конъюгатом актина с КЗ (3) и конъюгатом актина с КЗ с использованием ПАФ (4)

связаны с исследованиями взаимодействия золотых наночастиц с клетками иммунной системы ex vivo. Мы изучали непосредственное влияние частиц КЗ (без ЛГ) на культуру лимфоидных клеток в реакции бласттрансформации. Данная реакция является показателем общей иммунологической реактивности организма и косвенно свидетельствует о потенциальной способности иммунной системы к реакциям на АГ'. Индуцированная АГ активация и дифференцировка Т- и B-клеток обычно происходит в лимфоидных тканях и может быть воспроизведена in vitro при культивировании лимфоцитов в присутствии активирующего агента. Такими агентами могут служить, в частности, бактериальные ЛПС и лектины (чаще всего, фитогемагглютинин (ФГА) и Con А). Лектины стимулируют Т-лимфоциты, а ЛПС B-клетки. Активация лимфоцитов - необходимый этап в формировании иммунного ответа.

Мы изучили влияние частиц КЗ диаметром 15 и 60 нм на реакцию бласттрансформации лимфоцитов в присутствии ФГА и ЛПС Pseudomonas aerogenosa. Бласттрасформацию проводили по общепринятой методике (llaciep с соавт., 1989). Полученные данные приведены в табл. 6. Как можно видеть, наблюдается увеличение процента бласттрансформированных лимфоцитов при добавлении КЗ. Так, при использовании ФГА с добавлением КЗ с размером частиц 15 нм количество бласттрансформированных лимфоцитов увеличилось на 11%, а с добавлением КЗ с размером частиц 60 нм - на 20%, в отличие от использования ФГА без добавления КЗ в контроле. При использовании ЛПС с добавлением КЗ с размером частиц 15 нм количество бласттрансформированных лимфоцитов увеличилось на 8%, а с добавлением КЗ с размером частиц 60 нм - на 5% по сравнению с использованием ЛПС без добавления КЗ.

Таблица 6. Показатели еластгрансформации лимфоцитов при ст имуляции различными митогенами (%)

Название препарата Использование ФГА в качестве митогена Использование ЛПС в качестве митогена

КЗ 15 70.3+0.4 74.6+0 4

КЗ 60 80±0.4 71.6±0.4

Контроль с митогеном 59.3±0.4 66.6±0.4 1

Контроль без митогена 12.6±0.4 14.3±0.4 1

Таким образом, складывается впечатление, что частицы КЗ, кроме стимулирования фагоцитарной активности, способны активировать и лимфоциты, причем в большей степени Т-клетки В этой связи первоочередным, на наш взгляд, является ответ на вопрос: с какими иммунокомпетентными клетками взаимодействует конъюгат КЗ с АГ на начальных этапах иммунизации?

Нами были получены перитонеальные макрофаги и лимфоциты периферической крови Конъюгаты КЗ с гаптеном (ивермектином) инкубировали в течение 3-х часов с суспензиями этих клеток. После этого клетки трижды отмывали холодным физраствором и лизировали 0 1% Т\уееп 80. Количество гаптена в лизате клеток определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В результате проведенного анализа мы определили, что в лизате макрофагов содержится до 45% добавленного к клеткам гаптена, в то время как в лизате лимфоцитов - только около 5%. Таким образом, с большой долей вероятности можно заключить, что конъюгаты АГ с КЗ на первых этапах иммунизации ьк.мочаются в цитоплазму макрофагов.

Очередной эксперимент был осуществлен по следующей схеме: один из синтетических пептидов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и коньюгат этого пептида с КЗ в двукратных разведениях добавляли к B-клеткам (мишеням), которые рестриктированы по этому пептиду. Затем добавляли цитотоксические Т-клетки. Специфический пептид должен вызывать пролиферацию этих клеток. В результате экспериментов было обнаружено, что пептид, "сидящий" на золоте, усиливал пролиферацию в 10 раз по сравнению с нативным пептидом Таким образом, получено еще одно, на этот раз практически прямое, доказательство влияния частиц КЗ на функционирование иммунокомпетентных клеток.

В настоящем разделе показана принципиальная возможность получения AT in vivo к полноценным АГ и гаптенам различной природы с использованием в качестве носителя частиц КЗ. Кроме того, получение AT на конъюгаты БСА, актина и с-туе пептида с КЗ без использования ПАФ может свидетельствовать о наличии адъювантных свойств самого КЗ, что, безусловно, перспективно, например, в работах по созданию нового поколения вакцин. Показано, что КЗ, использованное в качестве носителя АГ, активирует фагоцитарную активность макрофагов и влияет на функционирование лимфоцитов, что, возможно, и определяет его иммуномодулирующий эффект.

5.2 Получение, селекция и иммунодетекция миниантител с использованием конъюгатов коллоидного золота и комбинаторных фаговых библиотек

В последнее десятилетие принципиально новой стратегией получения и отбора высокоаффинных А Г является создание комбинаторных фаговых библиотек AT. Данный метод начал развиваться с 1990 года, после опубликования в Nature работы Джона Мак-Каферти с соавт. Эти исследователи впервые показали возможность получения одноцепочечных последовательностей, составленных из вариабельных доменов AT, в составе гибридного белка оболочки фага. Они же продемонстрировали возможность высокоэффективной аффинной селекции клонов, несущих антигенспецифические одноцепочечные AT (scFv, миниантитела). Хотя AT из фаговых библиотек не способны в настоящее время полностью заменить моноклональные AT, создаваемые с помощью гибридомной технологии, они пригодны для получения антигенсвязывающих фрагментов, которые могут быть использованы для иммунодетекции и иммуноаффинного выделения макромолекул.

Технология фагового дисплея позволяет получать AT в системе in vitro без использования животных, длительных процедур иммунизации, дорогих сред и культур животных клеток. Это особенно ценно, когда традиционные методы получения AT, в том числе и гибридомная технология, оказываются малоэффективными. Например, при получении AT к минорным белкам клеточной поверхности, к высокотоксичным АГ или неиммуногенным соединениям Это также актуально при получении моноклональных человеческих AT к аутоантигенам.

Создание фагового диспиея А Г обязательно включает следующие этапы: выделение мРНК из иммунных или ишактных лимфоцитов, синтез на этой матрице генов вариабельных фрагментов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, объединение генов легких и тяжелых цепей с помощью олигонуклеотидного линкера, клонирование этих генов в фаг, инфицирование этим вектором Е coli В результате таких манипуляций получают библиотеки, в которых комбинации легких и тяжелых цепей экспрессируются в составе фагового белка в виде одноцепочечных AT, гетеродимеров или отдельных растворимых молекул Это мощный инструмент для быстрой

иммунодетекции и высокоэффективной селекции практически любых интересующих нас лигандов, будь то белки, пептиды или низкомолекулярные биологически активные соединения.

Заметим, что этот метод (как и любой другой) не свободен от ограничений. В частности, он требует специальной разработки способа отбора AT к гаптенам из имеющихся синтетических фаговых библиотек Селекцию AT из комбинаторных библиотек обычно проводят, используя сорбцию АГ на активированных пластиковых подложках (пробирках, планшетах), иммуноаффинную хроматографию. При этом низкомолекулярные АГ предварительно "сшивают" с высокомолекулярным носителем

Целью данного этапа нашей работы была разработка метода селекции AT из комбинаторных фаговых библиотек с использованием конъюгатов АГ (в том числе и гаптенов) с частицами КЗ.

В качестве АГ использовали куриный гладкомышечный актин и низкомолекулярный с-туе пептид протоонкогена человека. Интерес к актину в случае получения AT как in vivo, так и in vitro обусловлен тем, что высокая эволюционная консервативность актинов создает препятствия для выработки в организме животных высокоспецифичных и высокоаффинных AT к такому АГ. Получение AT к актинам до сих пор является весьма затруднительным вследствие их высокой гомологичности и, соответственно, низкой иммуногенности.

АГ конъюгировали с частицами КЗ (средний диаметр 15 нм). К полученным коныогатам добавляли библиотечный фаг (концентрация - I012 фаг/мл) и инкубировали 60 мин. Комплексы "КЗ-АГ-специфичный фаг" осаждали центрифугированием, фаги снимали триэтиламином и освобождались от золотых частиц повторным центрифугированием. Дальнейшие этапы получения мини-АТ не отличались от традиционных. Традиционный метод с сорбцией АГ на иммунотьюбах применяли в качестве контроля. В pa6oie использовали фаговый дисплей AT человека (GrifTin.l Library, MRC, UK).

Полученные как традиционным, так и предлагаемым способом клоны фагов были протестированы с применением твердофазных методов иммуноанализа -ELISA и дот-анализа с использованием в качестве детектирующего агента кроличьих антифаговых AT, меченных КЗ. На рис 13 представлены последовательные этапы селекции фагов, несущих в составе капсидного белка фрагменты

комбинаторных миниантител к актину. Чувствительность и специфичность AT, полученных различными способами, оказалась практически одинаковой. Однако, как нам кажется, предлагаемый метод проще и удобнее. Во-первых, не требуется конъюгация гашена с белком-носителем и, соответственно, дальнейшая очистка получаемых AT от "фоновых" AT. Во-вторых, он быстрее по времени, сорбция АГ на иммунотьюбах занимает 16-18 час.

Рис. 13. Дот-анализ куриного Р-актина с использованием фаговой библиотеки, обогащенной после первого (I), второго (2) и третьего (3) циклов селекции. Детекцию связавшихся с АГ фагов проводили кроличьими антифаговыми АТ, I меченными КЗ

против 1 часа при в предлагаемом методе. В-третьих, он не требует использования собственно самих весьма дорогих иммунотьюбов.

Учитывая перечисленные преимущества, предлагаемый метод может быть рекомендован как альтернатива традиционному методу селекции AT из комбинаторных фаговых библиотек. В частности, он, по-видимому, наиболее перспективен в случае получения мини-AT к гаптенам.

Фрагменты AT могут находиться как в составе фагового белка, так и секретироваться в виде растворимых молекул. Это достигается путем вставки амбер-стоп-кодона между генами AT и геном g3p и наращивания фаговых частиц в различных штаммах Е coli. При росте фагов на супрессорном supE штамме Е coli амбер-кодон считывается как глютамин и AT остаются в составе белков оболочки фага. В несупрессорных штаммах амбер-кодон считывается как стоп-кодон и растворимые AT (

секретируются в периплазму бактериальной клетки, где они приобретают определенную конформацию и секретируются из клетки в культуральную жидкость. Обнаружение фагов со встроенными в оболочку фрагментами Fab и scFv AT при селекции может в обоих случаях выполняться с помощью антифаговых AT.

Детекция и очистка растворимых фрагментов проводятся разными способами Fab-фрагменты могут быть обнаружены многими коммерчески доступными реагентами, такими, как анти-Fab-AT, анти-к-АТ и т д., конъюгированными с различными метками. ScFv-фрагменты могут быть обнаружены только путем включения маркерного tag-пептида в состав гибридного белка. Обычно используют tag-пептид, входящий в состав с-тус белка, который узнается моноклональными AT 9Е10. Этот пептид обеспечивает связь белка g3p с фрагментами AT. Tag-псптид позволяет определять фрагменты AT в иммуноанализе и очищать небольшие количества AT непосредственно из бактериальной культуральной среды на колонках с иммобилизованными AT.

Мы впервые, насколько нам известно, синтезировали прямую метку - конъюгат scFv-фрагментов с КЗ. Для этого использовали КЗ со средним диаметром частиц 15 нм, синтезированное по методу Френса. Была подобрана оптимальная кислотность среды конъюгирования (pH = 6.0). После чего определили золотое число, которое составило 6 мкг/мл. Конъюгацию проводили простым смешением (без использования сшивающих агентов) золя золота и миниантител. Для создания конъюгата использовали миниантитела к белку вирулентности агробактерий VirE2, полученные после 3-х раундов селекции из комбинаторной библиотеки scFv мыши.

Полученный маркер был протестирован методом иммунодот-анализа По чувствительности выявления \ЧгЕ2-белка он, по крайней мере, не уступал традиционным методам анализа, при этом время проведения анализа существенно сокращалось.

Таким образом, разработанный метод получения конъюгатов scFv с КЗ может быть использован при создании тест-систем на основе твердофазного иммуноанализа (дот- ,

блот анализ, иммунохроматография), а также в электронно-микроскопических исследованиях

В заключении к диссертации отмечается, что среди обширного арсенала средств иммунохимического и иммуноцитохимического анализа особое внимание в нашей работе уделено биоспецифическим маркерам - конъюгатам КЗ. С использованием их преимуществ мы попытались расширить методологическую базу иммунохимических исследований, применяемых в биохимии и микробиологии. К числу этих преимуществ относятся относительная простота получения и использования данных биореагентов,

высокая чувствительность и специфичность соответствующих методов анализа, универсальность способов применения маркеров эюго типа в разнообразных иммунохимических исследованиях.

Разработанные оригинальные варианты методик впервые были использованы, в частности, для выяснения особенностей строения клеточной поверхности представителей двух родов почвенных ассоциативных азотфиксирующих бактерий на основе методов твердофазного иммуноанализа.

Есть основания полагать, что приведенные в данной работе разработки по методологии иммунохимического анализа - новые маркеры на основе ряда универсальных зондов, способ определения относительной гидрофобности клеток, данные спектроскопических исследований механизма синтеза золотых частиц, применение КЗ для аналитического определения белков с использованием спектроскопических методов, установление адъювантных свойств КЗ и др. - могут иметь значение, выходящее за рамки биохимии и микробиологии почвенных микроорганизмов.

В настоящее время (на рубеже 20-го и 21-го веков) мы являемся свидетелями формирования и развития новой междисциплинарной области знаний - нанонауки. При этом ее нельзя связывать только с уменьшением размеров исследуемых объектов. Фактически в нанонауке тесно переплетаются представления химии, физики и биологии, направленные на создание новых фундаментальных знаний. На многих объектах показано, что переход от макро- к наноразмерам приводит к появлению качественных изменений в физико-химических свойствах отдельных соединений и получаемых на их основе систем. Хочется надеяться, что результаты, полученные в настоящей работе, могут представлять интерес как для фундаментальной нанонауки, так и для практического использования в различных нанотехнологичеких методах.

Выводы

1. С использованием известных и полученных в данной работе сведений о механизме синтеза золотых наночастиц разработаны методики получения и предложены варианты использования новых биоспецифичсских маркеров на основе фаллоидипа, целлюлазы, фетуина, полиэтиленимина, трипсина и миниантител, меченных КЗ.

2. Разработана методика определения относительной гидрофобности клеточной поверхности (на примере почвенных азотфиксирующих микроорганизмов) с использованием золотосодержащего катионного маркера.

3. Показана эффективность разработанного метода cell-gold immunoblotting в серотипировании азоспирилл.

4. Установлено, что R-S диссоциация штамма A. brasilense Sp 7 приводит к существенным изменениям в балансе полисахаридного состава клеточной поверхности и ее относительной гидрофобности, что может быть одной из составляющих адаптационного механизма при переходе бактерий от их свободного обитания в почве к ассоциативному симбиозу с растением.

5. Результаты цитохимического исследования углеводных структур клеточной поверхности штамма A radiobacter 5D-1 и его мутантов свидетельствуют о том, что в состав фибридлоподобных структур у непатогенных агробактерий входят вещества целлюлозной природы

6 На основе дот-анализа с использованием иммунозолотых маркеров разработаны иммунохимические тест-системы для диагностики инфекционных заболеваний

человека и животных, для идентификации пролиферативного антигена стеблевых меристем пшеницы и для определения возбудителя головневых инфекций пшеницы.

7. Разработан вариант метода иммуноанализа на частицах золя с использованием микротитровальных планшетов и ИФА-ридера. предложен новый метод быстрого и чувствительного количественного определения белков с использованием конъюгатов трипсина с КЗ.

8. Показана целесообразность использования метода ИК-Фурье спектроскопии для изучения биоспецифических взаимодействий, реализуемых на частицах КЗ.

9. Установлено, что использование частиц КЗ в качестве носителя АГ при иммунизации животных приводит к получению эффективного иммунного ответа за счет проявления адъювантных свойств самих золотых наночастиц.

10. Продемонстрирована эффективность применения КЗ, конъюгированного с гаптеном, для сорбции фрагментов AT при их селекции из комбинаторных фаговых библиотек, а также в методах твердофазною иммуноанализа с использованием конъюгатов КЗ с миниантителами.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота в серотипировании азоспирилл // Микробиология. - 1991. - Т. 60. - С. 524-529.

2. Матвеев В.Ю., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Физико-химические свойства клеточной поверхности R- и S-вариантов штамма Azospirillum brasilense II Микробиология. - 1992. - Т. 61. - С. 645-651.

3. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. The serotyping of Azospirillum spp by cell gold immunoblotting // FEMS Microbiol Lett. - 1992. - V. 96. -P. 115-118.

4. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Shchyogolev S.Yu., Ignatov V.V. Estimation of cell surface hydrophobicity of soil bacteria using cation probes labelled with colloidal gold II In: Proc. 1-st Eur. Nitrogen Fixation Conf. / Eds. Kiss G.B., Endre G. - Szeged: OfTicina Press, 1994. - P. 348.

5 Хлебцов Н.Г., Богатырев B.A., Дыкман Л.А., Мельников А.Г. Оптические свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макромолекулами // Коллоидный журнал. - 1995. - Т. 57. - С. 412-423.

6. Chumakov M.I., Solovova G.K., Velikov V.A., Gorban V.V., Krivopalov Yu.V., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Kennedy C. Associative interactions of Agrobacterium radiobacter 5D-1 with mono- and dicotyledonous plants // In: "Nitrogen Fixation: Fundamentals and Application" / Eds Tikhonovich I.A., Provorov N.A., Romanov V.l, Newton W.E. -Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1995. - P. 254.

7. Хлебцов Н.Г., Богатырев B.A., Дыкман Л.А., Мельников А.Г. Спектральные свойства коллоидного золота // Оптика и спектроскопия - 1996. - Т. 80. - С. 128137.

8. Dykman L.A, Matora L.Yu., Bogatyrev V.A. Use of colloidal gold to obtain antibiotin antibodies IIJ Microbiol. Meth. - 1996. - V. 24. - P. 247-248.

9 Khlebtsov N G.. Bogatyrev V A., Dykman L A., Melnikov A.G Spectral extinction of colloidal gold and its biospecific conjugates // J Colloid Interface Sci. - 1996. - V 180. -P. 436-445.

10 Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Melnikov A.G. Spectral properties of colloidal gold and its conjugates with biospecific macromolecules // In: "Biomedical Optoelectronics in Clinical Chemistry and Biotechnology". Proc. SPIE, V. 2629 / Eds. Andersen-Engels S., Corti M., Weber H.P., King T.A., Pratesi R., Seeger S. - Bellingham, Washington: SPIE Press, 1996. - P. 35-45.

11. Дыкман JI А., Богатырев В.А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа // Биохимия. - 1997. - Т. 62. - С. 411-418.

12. Дыкман Л.А., Ляхов А.А., Богатырев В.А., Щеголев С.Ю. Синтез коллоидного золота с применением высокомолекулярных органических восстановителей // В сб. научн. тр.: "Новые достижения в органической химии". - Саратов: Изд-во Сарат. унта, 1997.-С. 61.

13. Дыкман Л.А., Ляхов А.А., Богатырев В.А., Щеголев С.Ю. Синтез коллоидного золота с применением высокомолекулярных восстановителей И Коллоидный журнал. - 1998. - Т. 60. - С. 757-762.

14. Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Краснов Я.М., Пискунов В.А., Щеголев С.Ю. Использование коллоидного золота для диагностики острых кишечных инфекций // В сб. научн. тр.: "Химия для медицины и ветеринарии". - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998. - С. 54-57.

15. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. Применение дот-анализа и иммунозолотых маркеров для экспресс-диагностики острых кишечных инфекций // ЖМЭИ. - 1999. - № 4. - С. 93-94.

16. Дыкман Л.А. Использование коллоидного золота в современной диагностике инфекционных заболеваний // В матер, научн конф. "Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии". - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1999. - С. 192-193.

17. Khlebtsov N.G., Dykman L.A., Krasnov Ya.M., Melnikov A.G. Extinction of light by aggregated gold particles and aggregated conjugates of gold particles to biospecific macromolecules // In: Proc. 4-th Conference on Electromagnetic and Light Scattering by Nonspherical Particles: Theory and Applications / Eds. Obelleiro F., Rodriguez J.L., Wriedt Th. - Vigo: Universidade de Vigo, 1999. - P.43-50.

18. Dykman L.A., Bogatyrev V A Use of the dot-immunogold assay for the rapid diagnosis of acute enteric infections II FEMS Immunol Med Microbiol. - 2000. - V. 27. - P. 135137.

19. Sumaroka M.V., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Evseeva N.V., Zaitseva I.S, Shchyogoiev S.Yu., Volodarsky A.D Use of the dot-blot immunogold assay to identify a proliferative antigen in the initial cells of a wheat stem meristem // J Immunoassay. -2000.-V. 21.-P.401-410.

20. Хлебцов H.Г, Дыкман Л.А., Краснов Я.М., Мельников А Г. Поглощение света кластерами коллоидных золотых и серебряных частиц, формирующимися в режимах медленной и быстрой агрегации // Коллоидный журнал. - 2000. - Т. 62. - С 844-859.

21 Сумарока MB, Дыкман Л А., Богатырев В А., Зайцева И.С , Соколов О.И, Щеголев С.Ю., Харрис У. Получение, селекция и иммунодетекция антител к гаптенам с использованием конъюгатов коллоидного золота и комбинаторных фаговых библиотек // Аллергология и иммунология. - 2000 - Т 1 -С 134-135.

22 Khlebtsov N.G., Dykman LA, Bogatyrev V.A.. Krasnov Ya M, Medvedev B.A Extinction and scattering of light by gold nanoparticle clusters resulting from salt and biospecific aggregation // In' "Light Scattering by Nonspherical Particles: Theory.

Measurements, and Applications" / Eds. Videen G„ Fu Q., Chylek P. - Adelphy: Army Research Lab., 2000. - P. 245-248.

23. Егоренкова И.В., Коннова C.A., Федокенко Ю.П., Дыкман JI.A., Игнатов В.В. Роль полисахаридсодержащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense в адсорбции бактерий на корнях проростков пшеницы // Микробиология - 2001. - Т. 70. - С. 4550.

24. Чумаков М.И, Дыкман J1.A., Богатырев В.А., Курбанова И.В. Изучение внеклеточных структур агробактерий, участвующих в контактах с бактериальными и растительными клетками // Микробиология. - 2001. - Т. 70. - С. 275-282.

25. Dykman L.A., Krasnov Ya.M., Bogatyrev V.A., Khlebtsov N.G. Quantitative immunoassay method based on extinction spectra of colloidal gold bioconjugates II In: "Optical Technologies in Biophysics and Medicine II". Proc. SPIE, V. 4241 / Ed. Tuchin V.V. - Bellingham, Washington: SPIE Press, 2001. - P. 37-41.

26. Bogatyrev V.A., Medvedev B.A., Dykman L.A., Khlebtsov N.G. Light scattering spectra of colloidal gold aggregates: Experimental measurements and theoretical simulations // Ibid. P. 42-48.

27. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Krasnov Ya.M., Melnikov A.G. Optical properties of colloidal-gold bioconjugates // Известия ВУЗов Прикладная нелинейная динамика. - 2002. - Т. 10. - С. 172-187.

28. Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Зайцева И.С., Соколова М.К., Иванов В.В., Соколов О.И. Использование конъюгатов коллоидного золота для идентификации актинов различного происхождения // Биофизика. - 2002. - Т. 47. - С. 632-640.

29. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Краснов Я.М., Плотников В.К., Хлебцов Н.Г. Метод дифференциальной спектроскопии рассеянного света для исследования биоспецифических реакций в системах конъкматов золотых наночастиц с белками или олигонуклеотидами II Коллоидный журнал. - 2002. - Т. 64. - С. 745-755.

30. Kamnev А.А., Dykman L.A., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Spectroimmunochemistry using colloidal gold bioconjugates // Bioscience Reports. - 2002. - V. 22. - P. 541-547.

31. Kamnev A.A., Dykman L.A., Tarantilis P.A.. Polissiou M.G. Surface-enhanced FTIR spectra of protein A conjugated with colloidal gold II Микроэлементы в медицине. -2002. - Т. 3. - С. 53-54.

32. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Krasnov Ya.M., Plotnikov V.K., Khlebtsov N.G. Biospecific assembling of gold nanoparticles with protein or oligonucleotide linkers as studied by light scattering and extinction spectra // In: "Optical Technologies in Biophysics and Medicine III", Proc. SPIE, V. 4707 / Ed. Tuchin V.V. - Bellingham, Washington: SPIE Press, 2002. - P. 266-274.

33. Kamnev A.A., Dykman L.A., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Surface-enhanced Fourier transform infrared spectroscopy of protein A conjugated with colloidal gold // In: "Metal Ions in Biology and Medicine" / Edb Khassanova L., Collery Ph., Maymard I., Khassanova Z., Etienne J.-C. - Paris: John Libbey Eurotext, 2002. - P. 104-107.

34. Дыкман Л.Л., Семенов C.B, Староверов С.Л., Щербаков А А.. Ермилов Д.Н. Применение метода дот-иммуноанализа и конъюгатов коллоидного золота для идентификации Y pseudotuberculosis // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Сб. статей в 4 томах, Т. 3. М.: ООО "Росинэкс", 2002. - С. 256-257.

35. Староверов С.А., Ермилов Д.Н., Щербаков А.А.. Семенов С.В., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А Получение антител к антигенам Yersinia pseudotuberculosis с

использованием в качестве адъюванта частиц коллоидного золота //ЖМЭИ. - 2003. - № 3. - С. 54-57.

36. Хлебцов Н.Г., Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Хлебцов Б.Н. Двухслойная модель биоконъюгатов коллоидного золота и её применение для оптимизации наносенсоров // Коллоидный журнал. - 2003. - Т. 65. - С. 552-562.

37. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Хлебцов Б.Н., Дыкман Л.А., Englebienne Р. Многослойная модель биоконъюгатов золотых наночастиц: исследование адсорбции желатина и иммуноглобулина человека с использованием спектров статического рассеяния и поглощения света и метода динамического светорассеяния // Коллоидный журнал. - 2003. - Т. 65. - С. 679-693.

38. Дыкман Л.А.. Богатырев В.А., Хлебцов Н.Г., Щеголев С.Ю. Применение золотых наночастиц в биотехнологии и медицине // В сб. научн. тр.: "Высокие технологии -путь к прогрессу". - Саратов: Изд-во "Научная книга", 2003. - С. 53-58.

39. Зайцева И.С., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Анисимов А.П., Дыкман Л.А., Щеголев С.Ю., Соколов О.И., Игнатов В.В. Получение мини-антител против капсульного антигена Yersinia pestis с использованием комбинаторной библиотеки scFv мыши // В сб. научн. тр.: "Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней" / Под ред. Кутырева В.В. - Саратов: ОГУП РИК "Полиграфия Поволжья", 2003. - С. 64-65.

40. Зайцева И.С., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Киреев М.Н., Дыкман Л.А. Получение мини-антител против ß-субъединицы холерного токсина с использованием фагового дисплея scFv мыши // Там же. - С. 66-68.

41. Khlebtsov N.G.. Bogatyrev V.A., Melnikov A.G., Dykman L.A., Khlebtsov B.N., Krasnov Ya.M. Static light scattering spectroscopy: A new approach to studies of colloidal gold nanosensors // In: Proc. 7-th Conference on Electromagnetic and Light Scattering by Nonspherical Particles: Theory, Measurements, and Applications ! Ed. WriedtTh. - Bremen: Universität Bremen, 2003. - P. 135-138.

42 Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov B.N. Adsorption of biopolymers on gold nanoparticles: Experimental study and theoretical modeling // Ibid. -P. 139-142.

43. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V A.. Dykman L.A., Khlebtsov B.N. Optical models for colloidal gold bioconjugates // Ibid. - P. 152-155.

44. Дыкман Л.А., Сумарока M.B, Староверов С.А., Зайцева И.С., Богатырев В.А. Иммуногенные свойства коллоидного золота II Известия АН, Сер биол. - 2004. - Т. 31.-С. 86-91.

45. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. Определение среднего размера и оценка полидисперсности наночастиц золота по спектрам поглощения и рассеяния света И Оптика и спектроскопия. - 2004. - Т. 96. - С. 139-147.

46. Bunin V.D., Ignatov O.V., Guliy O.I., Voloshin A.G., Dykman L.A., O'Neil D„ Ivnitski D Studies of Listeria monocytogenes-aaiibody binding using electro-orientation И Biosens. Bioelectron. - 2004. - V. 19. - P. 1559-1561.

47. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Melnikov A.G., Dykman L.A., Khlebtsov B.N., Krasnov Ya.M. Differential light-scattering spectroscopy: A new approach to studying of colloidal gold nanosensors II J Quant Spectrosc. Radiat. Transfer - 2004. - V. 89. - P. 133-142.

48. Пристенский Д.В.. Староверов C.A., Сидоркин B.A., Щеголев С.Ю, Дыкман Л.А. Получение антител к ивсрмектину и изучение фармакокинетики препарата "Ивермек" иммуно-дот методом // В сб. научн. тр.: "Основные достижения и

перспективы развития паразитологии" - М: Институт паразитологии РАН, 2004. -С. 242-243.

49. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov B.N., Alekseyeva A.V., Polyakov A.A., Khlebtsov N.G. Gold nanoparticle sizing based on differential static light scattering spectroscopy, absorption spectroscopy, and dynamic light scattering // In: "Coherent Optics of Ordered and Random Media IV'". Proc. SPIE, V. 5475 / Ed. Zimnyakov D.A. -Bellingham, Washington: SPIE Press, 2004. - P. 38-47.

50. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Dykman L.A., Bogatyrev V.A. Optical properties and biomedical applications of nanostructures based on gold and silver bioconjugates // In: "Photopolarimetiy in Remote Sensing" / Eds. Videen G., Yatskiv Y., Mishchenko M. -Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2004. - P. 265-308.

51. Богатырев В,А., Дыкман Jl.А., Щеголев С.Ю. Способ получения биоспецифических маркеров - конъюгатов коллоидного золота // Патент РФ Лг8 2013374 (Бюл. изобр. № 10 от 30.05.94, приоритет от 26.06.1992).

52. Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Староверов С.А., Семенов С.В. Адъювант // Патент РФ № 2218937 (Бюл. изобр. № 35 от 20 12.03, приоритет от 13.12.2001).

Подписано к печати 12 01 05 Гарнитура Times New Roman 9 Формат 60x84 1/16 Объем 2 уел печ л Тираж 100 эю

Отпечатано в ИБФРМ РАН

410049 Саратов, пр Энтузиастов 13

/ !

ï

t

( I

t

i

I

t

i

t \

I

1

í Í

i

РНБ Русский фонд

2005-4 45462

2 2 ÄHp 2Q05

1058

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Дыкман, Лев Абрамович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Анализ литературы и постановка задач исследования.

1.1. Иммунохимические методы в биохимической и микробиологической практике.

1.2. Коллоидное золото и его конъюгаты с биомакромолекулами: основные свойства и аспекты возможного использования.

1.3. Адъюванты и носители антигенов, используемые для получения антител и производства вакцин.

1.3.1. Адъюванты.

1.3.2. Носители.

1.4. Постановка задач исследования.

Глава 2. Разработка технологии синтеза биоспецифических маркеров - конъюгатов коллоидного золота.

2.1. Синтез коллоидных золотых частиц с использованием низкомолекулярных восстановителей.

2.1.1. Обзор распространенных методик синтеза золотых наночастиц.

2.1.2. Получение коллоидного золота с требуемым размером частиц по методу Френса.

2.1.3. Разработка нового метода синтеза коллоидного золота со средним диаметром частиц 5 нм.

2.1.4. Определение среднего диаметра получаемых золотых наночастиц.

2.2. Конъюгация коллоидного золота с биоспецифическими макромолекулами.

2.2.1. Общие принципы конъюгации наночастиц с биомолекулами.

2.2.2. Процедура получения конъюгатов коллоидного золота с биоспецифическими макромолекулами.

2.2.3. Получение и использование новых биоспецифических маркеров.

2.3. Синтез золотых коллоидных частиц с использованием высокомолекулярных восстановителей.

Глава 3. Развитие методологии твердофазного иммуноанализа с использованием конъюгатов коллоидного золота и ее применение в микробиологических и биохимических исследованиях.

3.1 Краткий обзор современных методик твердофазного иммуноанализа с использованием мембранных носителей.

3.1.1. Дот-блот анализ: принципы и применение.

3.1.2. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа.

3.1.3. Методика проведения дот- и блот-анализов с использованием конъюгатов коллоидного золота. Cell-gold immunoblotting.

3.1.4. Повышение чувствительности выявления результатов биоспецифических реакций с использованием солей серебра.

3.2. Изучение поверхностных структур почвенных бактерий с использованием биоспецифических маркеров - конъюгатов коллоидного золота.

3.2.1. Краткая характеристика бактерий родов Azospirillum и Agrobacterium.

3.2.2. Использованные микробные штаммы, методы и условия выращивания бактерий.

3.2.3. Применение методов дот- и блот-анализа для серотипирования азоспирилл.

3.2.4. Исследование влияния R-S диссоциации штамма А. brasilense Sp 7 на физико-химические свойства клеточной поверхности.

3.2.5. Цитохимический анализ углеводных структур клеточной поверхности штамма A. radiobacter 5D-1 и его мутантов.

3.3. Применение дот-анализа и иммунозолотых маркеров в разработке иммунохимических тест-систем.

3.3.1. Использование коллоидного золота в современной диагностике инфекционных заболеваний человека и животных.

3.3.2. Использование конъюгатов коллоидного золота для идентификации антигена стеблевых меристем пшеницы.

3.3.3. Иммунохимическое исследование возбудителя головневой инфекции пшеницы.

Глава 4. Использование коллоидного золота для количественного определения белков.

4.1. Оптимизация метода SPIA для количественного иммуноанализа.

4.2. Разработка метода количественного определения белков с использованием конъюгата трипсин - коллоидное золото.

4.3. Использование конъюгатов золотых наночастиц с биологическими макромолекулами в методах колебательной спектроскопии.

Глава 5. Применение коллоидного золота для получения антител in vivo и in vitro.

5.1. Адъювантные свойства золотых наночастиц.

5.2. Получение, селекция и иммунодетекция миниантител с использованием конъгагатов коллоидного золота и комбинаторных фаговых библиотек.л.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Коллоидное золото в биохимических и микробиологических исследованиях"

Одной из основополагающих черт современной науки является взаимное проникновение фундаментальных знаний и экспериментальных методик из одной отрасли науки в другую. Так, в иммунологии применяется целый ряд методов из других областей биологии: выделение антигенов и антител производят с помощью биохимических методов фракционирования белков, гены иммунологически важных молекул секвенируют молекулярио-генетическими методами и т.п. В свою очередь, в иммунологии разработаны свои специальные методы исследования разнообразных химических соединений, основанные на взаимодействии антиген-антитело. Эти иммунологические подходы нашли широчайшее применение в различных областях биологии, медицины и аналитической химии [1, 2].

В частности, иммунологические методы весьма эффективны в исследованиях структуры и функций компонентов клеточной поверхности микроорганизмов. Иммунохимический анализ поверхностных структур микробных и растительных клеток, ответственных за осуществление контактных взаимодействий почвенных микроорганизмов с растениями, занимает одно из центральных мест в проблеме микробного симбиоза, паразитизма и иммунитета растений [3, 4].

Высокоспецифичное и высокоаффинное взаимодействие антител с антигенами создает благоприятную препаративную и аналитическую основу для идентификации разнообразных биологических соединений, для изучения их физико-химических и биохимических свойств. Причем, какие бы новые методы иммуноанализа не разрабатывались, в них решающую роль играют антитела. Антитела, являясь уникальными молекулярными детекторами, остаются базисом любого иммуноанализа, независимо от систем регистрации или применяемых реагентов. Однако, известные технологии получения поли- и моноклональных антител обладают рядом недостатков. К наиболее существенным из них следует, вероятно, отнести проблемы получения антител к низкомолекулярным и низкоиммуногенным антигенам, принципиальную невозможность применения моноклональных антител в широком спектре традиционных методов иммуноанализа с использованием эффекта преципитации и т.д. В связи с этим особую актуальность приобретает развитие новых иммунотехнологических методов получения антител как in vivo, так и in vitro, позволяющих преодолеть в той или иной степени отмеченные выше ограничения.

Одним из важнейших компонентов современных иммунохимических тест-систем, обычно используемым в качестве метки, являются наночастицы коллоидного золота. Несмотря на то, что само коллоидное золото имеет более чем тысячелетнюю историю, «революция в цитохимии», связанная с использованием частиц золота в биологических исследованиях, произошла в 1971 г., когда сотрудники факультета зоологии и биохимии университета Северного Уэльса В.П. Фолк и Г.М. Тейлор опубликовали статью «Иммуноколлоидный метод для электронной микроскопии» [5]. В ней они описали способ конъюгации антител с коллоидным золотом и использование полученных комплексов для прямой электронно-микроскопической визуализации поверхностных антигенов сальмонелл.

За более чем 30 лет, прошедших с момента выхода этой статьи, было предложено огромное количество вариантов использования иммунозолотого метода в биохимических, микробиологических, молекулярно-генетических и др. исследованиях. Причем до последнего времени коллоидно-золотые препараты использовались, в основном, в микроскопических методах анализа.

Однако в 2000 г. секция «Медицинская диагностика и химический анализ с использованием наносенсоров» в рамках крупнейшего мирового научного форума по биомедицинской оптике «BIOS-2000» открылась докладом профессора Пенсильванского университета М. Натана «Коллоидное золото в биологии: теперь не только для электронной микроскопии». В докладе констатировалось, что в последние годы расширились области применения металлических нанокластеров как датчиков биоаффинных взаимодействий в разнообразных биосенсорных системах. Большинство подобных систем основано на уникальных оптических свойствах паиочастиц коллоидного золота, в частности, на явлении поверхностного плазмонного резонанса. При этом для регистрации изменений, осуществляющихся в процессе реакции антиген-антитело, когда один из участников реакции адсорбирован на частицах коллоидного золота, используют методы светорассеяния, колебательной спектроскопии и др.

Анализ литературных данных позволяет признать актуальной тему данной диссертации и констатировать, что ко времени начала наших исследований в этой области эффективность использования коллоидного золота в биохимических и микробиологических исследованиях ограничивалась дефицитом сведений по: а) вопросам синтеза золей золота с требуемым размером частиц и получения на их основе маркеров с широким спектром биоспецифических зондов, б) вариантам их использования в твердофазном иммуноанализе и иммуноанализе на частицах золя, в) применению биомаркеров на основе коллоидного золота в исследованиях поверхностных структур клеток и в диагностических тест-системах, г) проблемам использования коллоидного золота в качестве носителя для получения антител к слабо иммуногенным антигенам in vivo и in vitro.

Цслыо нашей работы было развитие теоретических и экспериментальных основ ряда иммунохимических, биохимических и физико-химических методов исследования биомолекул и клеток, расширяющих границы применения конъюгатов коллоидного золота с биоспецифическими молекулами в различных вариантах иммуноанализа с применением современных регистрирующих средств и методик получения антител.

В ходе реализации этой цели были получены результаты, паучпан поипзиа которых заключается в следующем:

- разработан оригинальный метод синтеза золей золота с диаметром частиц 5 им;

- впервые предложены методики получения и варианты использования новых биомаркеров на основе перспективных зондов;

- впервые с помощью метода иммунозолотого дот-анализа проведено исследование физико-химических свойств клеточной поверхности почвенных микроорганизмов родов АгоэртЦит и А^гоЪаМепит и разработаны тест-системы для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний человека и животных, головневой инфекции пшеницы, определения пролиферативного антигена ее инициалей;

- разработан вариант метода иммуноанализа на частицах золя с использованием микротитровальных планшетов и фотометрического ридера и предложен новый метод биохимического анализа с использованием коныогатов протеолитических ферментов с коллоидным золотом для быстрого и чувствительного количественного определения белков;

- впервые продемонстрирована возможность применения метода ИК-Фурье спектроскопии сухих пленок золотых биоконъюгатов для определения взаимодействия белковых молекул с поверхностью золотых частиц, а также для регистрации биоспецифических реакций;

- получены достоверные данные, позволяющие констатировать наличие у золотых наночастиц адъювантных свойств;

- разработан метод селекции антител из комбинаторных фаговых библиотек с использованием коныогатов антигенов (в том числе и гаптенов) с частицами коллоидного золота.

Кроме того, полученные результаты имеют определенную практическую значимость. В частности, на основе разработанного и защищенного патентом РФ способа получения биоспецифических маркеров - коныогатов коллоидного золота в рамках Госзаказа Министерства науки и технической политики РФ создан Лабораторный технологический регламент и наработаны образцы 138 препаратов (см. приложение). Синтезированные биомаркеры и разработанные новые методологические приемы используются в ряде лабораторий ИБФРМ РАН. Кроме того, часть образцов передана по заказам более чем 40 организациям, включая академические и прикладные научно-исследовательские институты, вузы, лечебные учреждения России, ближнего и дальнего зарубежья для проведения работ, связанных с решением широкого круга научных и прикладных задач в области биологии, биотехнологии и медицины.

Результаты работы были представлены на Международной выставке «Достижения российской биотехнологии» (ФРГ, 1996 г.), 3-м Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Россия, ВВЦ, 2003 г.), ряде российских и региональных выставках.

Представленные в диссертации разработки используются в учебном процессе в Саратовском госуниверситете, Саратовском аграрном университете и др., включены в методическое пособие (Карпунина JI.B., Мельникова У.10., Дыкман JI.A., Иващенко C.B., Хапцев З.Ю., Щербаков A.A. Методические рекомендации по изучению взаимодействия лектинов бацилл с некоторыми бактериями рода Yersinia. — Саратов: СГАУ, 2000. - 12 е.).

На защиту выносится следующие основные положения:

1. Полученные сведения о механизмах и усовершенствованные методы синтеза коллоидного золота с требуемым размером частиц и их конъюгации с биоспецифическими зондами позволяют разработать эффективные технологии получения и варианты аналитического использования новых иммунохимических маркеров - коныогатов коллоидного золота на основе универсальных зондов: фаллоидина, целлюлазы, фетуина, полиэтиленимина, трипсина, миниантител.

Дот-блот анализ целых бактериальных клеток с применением конъюгата коллоидного золота с полиэтиленимином обеспечивает оценку относительной гидрофобности клеточной поверхности. Методы твердофазного иммуноанализа с разработанными препаратами коллоидного золота, примененными в иммуноцитохимических исследованиях ряда представителей почвенных диазотрофов, пригодны для серотипирования бактерий, позволяют зарегистрировать изменения поверхностных структур при Я-Б диссоциации типового штамма азоспирилл и мутациях штамма агробактерий, затрагивающих синтез их углеводных структур. Использование конъюгатов коллоидного золота с соответствующими биоспецифическими зондами (в том числе, полученных на образцах стандартных антисывороток) в варианте дот-анализа позволяет разработать эффективные тест-системы экспресс-диагностики острых кишечных инфекций у человека, а также диагностики головневой инфекции и количественного определения пролиферативного антигена инициалей пшеницы.

Конъюгаты трипсина с коллоидным золотом могут быть использованы для быстрого и чувствительного спектрофотометрического определения белков.

Метод ИК-Фурье спектроскопии обеспечивает надежную регистрацию иммунохимических взаимодействий, реализуемых на поверхности частиц коллоидного золота.

У частиц коллоидного золота обнаружены выраженные адъювантные свойства.

Использование конъюгатов антигенов с золотыми наночастицами позволяет оптимизировать метод селекции миниантител из комбинаторных фаговых библиотек.

Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАМ) по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений" научный руководитель темы д.х.н. профессор C.IO. Щеголев, № гос. регистрации 01890017743; "Развитие методов светорассеяния и электрооптики применительно к анализу природных и синтетических дисперсных систем", научный руководитель темы д.ф.-м.н. профессор Н.Г. Хлебцов, № гос. регистрации 01912022281.

Работа была поддержана Министерством науки и технической политики РФ (распоряжение № 1508ф). Частично данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (№№ проектов 94-03-09286, 96-03-32504, 98-03-32664, 01-03-33130, 01-04-48736, 04-04-48224), Международного научного фонда (фонда Сороса) (№ RNR000), фонда INCAS-S (№ 99-4-04), фонда CRDF (№ REC-006), UNESCO Short-term Fellowship in biotechnology (№ 875.687.1), NATO Expert Visit Grant (JVb LST.EV.979787).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с к.б.н. В.А. Богатыревым. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору данной диссертации и в получении которых роль автора была определяющей.

В иммунохимических экспериментах использовали антитела, полученные к.х.н. Шварцбурдом Б.И. и к.б.н. Матора Л.Ю. (ЛФХКС ИБФРМ РАН); измерения колебательных спектров проводили совместно с д.х.н. Камневым A.A. (ИБФРМ РАН) и Dr. Tarantilis Р. (Афинский аграрный университет, Греция), работа с фаговым дисплеем антител стала возможной благодаря к.м.н. Сумарока М.В. (ЛФХКС ИБФРМ РАН) и к.х.н. Ламану А.Г., к.б.н. Шепеляковской А.О. (ФИБХ РАН). В исследованиях также принимали участие сотрудники группы иммунотехнологии ЛФХКС ИБФРМ РАН к.в.н. Староверов С.Л., аспиранты Зайцева И.С. и Пристенский Д.В. Всем им автор выражает глубокую благодарность.

Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы д.х.н. профессора С.Ю. Щеголева и д.ф.-м.н. профессора Н.Г. Хлебцова (ИБФРМ РАН) за интересное и полезное обсуждение результатов на всех ее этапах.

Апробации работы. Основные результаты диссертационной работы представлялись, докладывались и обсуждались на: 5-th Int. Symp. "Nitrogen Fixation with Non-Legumes", Florence, Italy, Sept. 10-14, 1990; 15-th Int. Congr. of Biochemistry, Jerusalem, Israel, Aug. 4-8, 1991; 8-th Eastern Eur. Symp. on Biological Nitrogen Fixation, Saratov, Russia, Sept. 22-26, 1992; 1-st Int. Conf. on Polysaccharide Engineering, Trondheim, Norway, June 6-8, 1994; 1-st Eur. Nitrogen Fixation Conf., Szeged, Hungary, Aug. 28 - Sept. 2, 1994; NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms, Sarvar, Hungary, Sept. 4-6, 1994; Int. Workshop on Associative Interactions of Nitrogen-Fixing Bacteria with Plants, Saratov, Russia, June 5-8, 1995; Int. Symp. on Biomedical Optics, Barcelona, Spain, Sept. 12-16, 1995; Beijerinck Centennial Conf. "Microbial Physiology and Gene Regulation: Emergings Principles and Applications", Hague, The Netherlands, Dec. 16-21, 1995; 4-th World Congr. on Biosensors, Bangkok, Thailand, May 29-31, 1996; 9-th, 10-th and 11-th Int. Conf. of Surface and Colloid Science, Sofia, Bulgaria, July 6-12, 1997, Bristol, UK, July 23-28, 2000, Iguassu Falls, Brazil, Sept. 15-19, 2003; 12-th Int. Congr. on Nitrogen Fixation, Parana, Brazil, Sept. 12-17, 1999; школе-конф. "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, Россия, 28 мая - 2 июня 2000; 5-th and 6-th John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology, Pushchino, Russia, Sept. 15-21, 2000, Sept. 15-22, 2002; 5-ой и 7-ой Путинской школе-конф. молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, Россия, 16-20 апреля 2001, 14-18 апреля 2003; Int. Symp. "Biological motility: New trends in research", Pushchino, Russia, Aug. 20-26, 2001; межд. научи, конф. "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий", Саранск*, Россия, 12-15 сент., 2001; 1-ой per. конф. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, Россия, 26-27 марта, 2002; XXVI Eur. Congr. on Molecular Spectroscopy, Villeneuve d'Ascq, France, Sept. 1-6, 2002; 1-ом межд. конгр. "Биотехнология - состояние и перспективы развития", Москва, Россия, 14-18 октября, 2002; Donostia Int. Physics Center Workshop "Optical Properties of Complex Materials over Different Length Scales", San Sebastian, Spain, July 7-11, 2003; VIII Int. Conf. "The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology", Saratov, Russia, Sept. 9-13, 2003; V съезде физиологов растений России, Пенза, Россия, 15-21 сентября 2003; NATO Advanced Study Institute on Photopolarimetry in Remote Sensing, Yalta, Ukraine, Sept. 20 - Oct. 3, 2003; Saratov Fall Meeting, Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine, Saratov, Russia, Oct. 7-10, 2003; а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ и других институтов РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 98 печатных работ, в том числе 2 патента и 50 статей, список которых приведен в конце автореферата (включая 19 статей в журналах из списка ВАК, 8 статей в иностранных рецензируемых журналах, 22 статьи в отечественных и зарубежных сборниках научных трудов и 1 главу в книге).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дыкман, Лев Абрамович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Среди обширного арсенала средств иммунохимического и иммуноцитохимического анализа особое внимание в нашей работе уделено биоспецифическим маркерам - конъюгатам КЗ. С использованием их преимуществ мы попытались расширить методологическую базу иммунохимических исследований, применяемых в биохимии и микробиологии. К числу этих преимуществ относятся относительная простота получения и использования данных биореагентов, высокая чувствительность и специфичность соответствующих методов анализа, универсальность способов применения маркеров этого типа в разнообразных иммунохимических исследованиях.

Нам удалось разработать оригинальный способ синтеза тонкодисперсных золей золота со средним диаметром частиц 5 им. В целом полученные результаты позволяют констатировать, что, выбирая тот или иной восстановитель и принимая во внимание особенности кинетики формирования коллоидной фазы, можно получать готовые маркеры с заданным размером частиц КЗ. Именно этот принцип мы применили при получении конъюгата ПЭИ-КЗ со средним диаметром частиц золота 20 нм. Данный маркер был использован нами для определения относительной гидрофобности клеток почвенных микроорганизмов.

Развитый нами метод дот-блот анализа с использованием биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ, может быть, по нашему мнению, с успехом использован как для фундаментальных (например, в анализе строения клеточной поверхности почвенных бактерий), так и для прикладных исследований. К примеру, в практике лабораторной диагностики инфекционных заболеваний человека и животных, для изучения и полевого анализа хозяйственно-значимых АГ в селекционной работе и фитопатологических исследованиях и т.д.

Предложенный в нашей работе вариант метода SPIA с использованием микротитровальных планшетов и ИФА-ридера позволил существенно сократить время анализа при большем количестве исследуемых проб и большей чувствительности метода. Новый метод анализа с использованием конъюгатов протеолитических ферментов с КЗ кажется нам весьма перспективным для быстрого и чувствительного количественного определения белков.

Полученные результаты впервые продемонстрировали возможность применения SEIRA-спектроскопии сухих пленок золотых биоконъюгатов для чувствительного определения взаимодействия белковых молекул с поверхностью золотых частиц, а также для достоверной и простой регистрации биоспецнфических реакций. Описанный метод может послужить основой для разработки тест-систем, детектирующих биоспецифические взаимодействия типа АГ-АТ, фермент-субстрат, лектин-полисахарид и т.п. Кроме того, обнаруженные нами изменения спектров биомолекул на золотых частицах являются доказательством того, что биомолекулы действительно адсорбированы на частицах. Этот факт особенно важен с точки зрения проблем контроля синтеза конъюгатов гаптенов с КЗ, которое может быть использовано в качестве носителя для последующей иммунизации животных. Предложенный метод наряду с другими (например, ГКР) может быть использован для контроля качества таких конъюгатов.

Одним из наиболее существенных результатов нам представляется доказательство принципиальной возможности получения АТ in vivo к полноценным АГ и гаптенам различной природы с использованием в качестве носителя частиц КЗ. Кроме того, получение АТ на конъюгаты БСА, актина и с-тус пептида с КЗ без использования ПАФ может свидетельствовать о наличии адъювантных свойств самого КЗ, что, безусловно, перспективно, например, в работах по созданию нового поколения вакцин. Показано, что КЗ, использованное в качестве носителя АГ, активирует фагоцитарную активность макрофагов и влияет на функционирование лимфоцитов, что, возможно, и определяет его иммуномодулирующий эффект.

Предложен метод селекции АТ из комбинаторных фаговых библиотек с использованием частиц КЗ, как альтернатива традиционному. По нашему мнению, он наиболее перспективен в случае получения АТ к гаптенам. Разработан метод получения коныогатов бсРу с КЗ, который может быть использован при создании тест-систем на основе твердофазного иммуноанализа (дот-блот анализ, иммунохроматография), а также в электронно-микроскопических исследованиях.

Есть основания полагать, что приведенные в данной работе разработки по методологии иммунохимического анализа - новые маркеры на основе ряда универсальных зондов (см. приложение), способ определения относительной гидрофобности клеток, данные спектроскопических исследований механизма синтеза золотых частиц, применение КЗ для аналитического определения белков с использованием спектроскопических методов, установление адыовантных свойств КЗ и др. - могут иметь значение, выходящее за рамки биохимии и микробиологии почвенных микроорганизмов.

Об актуальности и востребованности исследований, посвященных использованию КЗ в биохимии и микробиологии, свидетельствует ряд весьма интересных работ, вышедших за время написания и оформления данной диссертации. Они посвящены, в частности, новым методам синтеза КЗ [748751] и самосборных структур на его основе [752, 753], конъюгации КЗ с биомолекулами [754, 755], развитию методологии оптического мониторинга получаемых коныогатов [756-759] и их использованию в биомедицинских аналитических системах [760-764] и терапии [765]. Особо хочется обратить внимание па обзор [766], который посвящен изучению чувствительности организма млекопитающих к введению металлического золота. В частности, в обзоре отмечено, что инъекционное введение лабораторным животным КЗ может приводить к воспалительным реакциям, накоплению золота в ретикулярных клетках лимфоиднои ткани, активации клеточного и гуморального иммунитета.

В заключении хотелось бы отметить, что в настоящее время (на рубеже 20-го и 21-го веков) мы являемся свидетелями формирования и развития новой междисциплинарной области знаний - нанонауки. При этом ее нельзя связывать только с уменьшением размеров исследуемых объектов. Фактически в нанонауке тесно переплетаются представления химии, физики и биологии, направленные на создание новых фундаментальных знаний. На многих объектах показано, что переход от макро- к наноразмерам приводит к появлению качественных изменений в физико-химических свойствах отдельных соединений и получаемых на их основе систем [33, 34, 767]. Хочется надеяться, что результаты, полученные в настоящей работе, могут представлять интерес как для фундаментальной нанонауки, так и для практического использования в различных нанотехнологичеких методах.

Исходя из результатов работы, можно сформулировать следующие выводы:

1. С использованием известных и полученных в данной работе сведений о механизме синтеза золотых наночастиц разработаны методики получения и предложены варианты использования новых бноспецифических маркеров на основе фаллоидина, целлюлазы, фетуина, полиэтиленимина, трипсина и миниантител, меченных КЗ.

2. Разработана методика определения относительной гидрофобности клеточной поверхности (на примере почвенных азотфиксирующих микроорганизмов) с использованием золотосодержащего катионного маркера.

3. Показана эффективность разработанного метода cell-gold immunoblotting в серотипировании азоспирилл.

4. Установлено, что R-S диссоциация штамма A. bmsilense Sp 7 приводит к существенным изменениям в балансе полисахаридного состава клеточной поверхности и ее относительной гидрофобности, что может быть одной из составляющих адаптационного механизма при переходе бактерий от их свободного обитания в почве к ассоциативному симбиозу с растением.

5. Результаты цитохимического исследования углеводных структур клеточной поверхности штамма А. гасНоЬас1ег 50-1 и его мутантов свидетельствуют о том, что в состав фибриллоподобных структур у непатогенных агробактерий входят вещества целлюлозной природы.

6. На основе дот-анализа с использованием иммунозолотых маркеров разработаны иммунохимические тест-системы для диагностики инфекционных заболеваний человека и животных, для идентификации пролиферативного антигена стеблевых меристем пшеницы и для определения возбудителя головневых инфекций пшеницы.

7. Разработан вариант метода иммуноанализа на частицах золя с использованием микротитровальных планшетов и ИФА-ридера, предложен новый метод быстрого и чувствительного количественного определения белков с использованием коныогатов трипсина с КЗ.

8. Показана целесообразность использования метода ИК-Фурье спектроскопии для изучения биоспецифических взаимодействий, реализуемых на частицах КЗ.

9. Установлено, что использование частиц КЗ в качестве носителя АГ при иммунизации животных приводит к получению эффективного иммунного ответа за счет проявления адыоваитных свойств самих золотых наночастиц.

10. Продемонстрирована эффективность применения КЗ, коныогированного с гаптеном, для сорбции фрагментов АТ при их селекции из комбинаторных фаговых библиотек, а также в методах твердофазного иммуноанализа с использованием коныогатов КЗ с миниантителами.

Благодарности

Считаю приятным долгом выразить глубокую признательность директору ИБФРМ РАН заслуженному деятелю науки РФ профессору доктору биологических наук Владимиру Владимировичу Игнатову и научному консультанту профессору доктору химических наук заведующему ЛФХКС Сергею Юрьевичу Щеголеву за постоянную помощь и полезные советы при выполнении и оформлении диссертации.

Я хочу выразить свою искреннюю благодарность сотрудникам ЛФХКС и ЛБНС ИБФРМ РАН - к.б.н. Богатыреву В.А., к.х.н. Шварцбурду Б.И., д.ф.-.м.н. Хлебцову Н.Г., к.м.н. Сумарока М.В., к.б.н. Матора Л.Ю., Зайцевой И.С., к.в.н. Староверову С.А., к.ф.-м.н. Мельникову А.Г. и сотрудникам других лабораторий ИБФРМ д.б.н. Соколову О.И., д.х.н. Камневу A.A., д.б.н. Игнатову О.В., к.б.н. Селиванову Н.Ю., д.б.н. Чумакову М.И. и всем сотрудникам группы научно-технической информации за содействие и поддержку при выполнении и оформлении данной работы.

Хочу поблагодарить сотрудников группы молекулярных аспектов иммунологии репродукции ФИБХ РАН к.х.н. Ламана А.Г. и к.б.н. Шепеляковскую А.О. за полезное и содержательное обсуждение и помощь в выполнении иммунологической части настоящей работы. Я глубоко признателен сотрудникам химического факультета Афинского аграрного университета профессору М. Полиссиу и доктору П. Тарантилису за помощь в проведении спектроскопических исследований.

Я также выражаю искреннюю признательность и благодарность семье, родным и друзьям за помощь и человеческую поддержку при выполнении данной работы.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Дыкман, Лев Абрамович, Саратов

1. Роит А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. - 592 с.

2. Новые методы иммуноанализа / под ред. Коллинза У.П. М.: Мир, 1991. - 280 с.

3. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. М.: Наука, 1991. - 228 с.

4. Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. М: Наука, 1993. -301 с.

5. Faulk W., Taylor G. An immunocolloid method for the electron microscope // Immunochemistry. 1971. - V. 8. - P. 1081-1083.

6. Петров P.В., Березин И.В. Иммунология и иммунохимия // Ж. Всес. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1982. - Т. 27. - С. 2-8.

7. Полак Д., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М.: Мир, 1987. - 74 с.

8. Singer J.M., Plotz С.М. The latex fixation test. I. Application to the serological diagnosis of rheumatoid arthritis//Amer. J. Med. 1956. - V. 21. - P. 888-891.

9. Israel H.A. Immunomagnetic separation: A tool microbiology // Amer. Biotechnol. Lab. 1994.-V. 12.-P. 50-52.

10. Кленин В.И., Шварцбурд Б.И., Астафьева Н.Г. Характеристика реакции преципитации на стадии формирования агрегатов комплексов «антиген-антитело» спектротурбидиметрическим методом // ЖМЭИ. 1979. - № 6. -С. 18-23.

11. Сирота Л.И., Стукова Т.Л., Шаталаева М.Ы. Электро-оптический метод региетации взаимодействия антиген-антитело для детекции антитромбоцитарных антител при геморрагичеких тромбоцитопатнях // Клин. лаб. диагн. 1993. - № 3. - С. 50-54.

12. Giaever I. The antibody-antigen reaction: Л visual observation // J. Immunol. -1973.-V. 110.-P. 1424-1426.

13. Yamamoto N., Nagasavva Y., Shuto S., Savvai M., Sudo Т., Tsuborumo H. The electrical method of investigation of the antigen-antibody and enzyme-enzyme inhibitor. Reaction using chemically modified electrodes // Chem. Lett. 1978. -V. 7. - P. 245-246.

14. Cotton F., Thiry P., Boeynaems J. Measurement of soluble transferrin receptor by immunoturbidimetry and immunonephelometry // Clin. Biochem. 2000. - V. 33. - P. 263-267.

15. Deverill I., Reeves W.G. Light scattering and absorption developments in immunology // J. Immunol. Meth. - 1980. - V. 38. - P. 191-204.

16. Murphy R.M., Yarmush M.L., Colton C.K. Determining molecular weight distributions of antigen-antibody complexes by quasi-elastic light scattering // Biopolimers. 1991. - V. 31. - P. 1289-1295.

17. Bunin V.D., Ignatov O.V., Guliy O.I., Voloshin A.G., Dykman L.A., O'Neil D., Ivnitski D. Studies of Listeria monocytogenes-antibody binding using electro-orientation//Biosens. Bioelectron. 2004. - V. 19.-P. 1559-1561.

18. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1941. - V. 47. - P. 200-202.

19. Coons A.I I., Kaplan M.H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. -1950.-V. 91.-P. 1-13.

20. Braun Т., Klein A., Zsindely S., Lyon W.S. Immunoassays: from RIA to VIA // Trends Analyt. Chem. 1992. - V. 11. - P. 5-7.

21. Mayer G., Bendayan M. Amplification methods for the immunolocalization of rare molecules in cells and tissues // Prog. Histochem. Cytochem. 2001. - V. 36. -P. 3-85.

22. Peruski A.M., Peruski L.F. Immunological methods for detection and identification of infectious disease and biological warfare agents // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. - V. 10. - P. 506-513.

23. Barnard G.J.R., Collins W.P. The development of luminescence immunoassays // Med. Lab. Sci. 1987. - V. 44. - P. 249-256.

24. Radbruch A. Flow Cytometry and Cell Sorting. Berlin: Springer-Verlag, 1992.

25. Wieder I. Background rejection in fluorescence immunoassay // In: Immunofluorescence and Related Staining Techniques / Eds. Knapp W., Holubar K., Wirk G. Amsterdam: Elsevier, 1978. - P. 67-80.

26. Sutherland R.M., Dahne C. IRC devices for optical immunoassays // In: Biosensors: Fundamentals and Applications / Eds. Turner A.P.F., Karube I., Wilson G.S. Oxford: Oxford University Press, 1988.

27. Weber G. Polarisation of the fluorescence of macromolecules // Biochem. J. -1952.-V. 51.-P. 155-167.

28. Dandliker W.B., de Saussure V.A. Fluorescence polarisation in immunochemistry // Immunochem. 1970. - V. 7. - P. 799-828.

29. Schroeder H.R., Mines C.N., Osborn D.D., Moore R.P., Hurtle R.L., Wogoman F.F., Rogers R.W., Vogelhut P.D. Immunochemiluminometric assay for hepatitis В surface antigen//Clin. Chem. 1981. - V. 27. - P. 1378-1384.

30. Власеико С.Б., Гаврилова E.M. Научные основы и перспективы применения в иммунохимических методах анализа хеми- и биолюминесцентныхреакции // Ж. Всес. хим. о-ва. им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34. - С. 2429.

31. Нанотехнология в ближайшем десятилетии / под ред. Роко М.К., Уильямса Р.С., Аливисатоса П. М.: Мир, 2002. - 292 с.

32. Nanobiotechnology: Concepts, Applications and Perspectives / Eds. Niemeyer C.M., Mirkin C.A. Weinheim: Wiley-VCH, 2004. - 491 p.

33. Chan W.C.W., Maxwell D.J., Gao X., Bailey R.E., Han M., Nie S. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - V. 13. - P. 40-46.

34. Penn S.G., He L., Natan M.J. Nanoparticles for bioanalysis // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. - V. 7.-P. 609-615.

35. Singer S.J., Schick A.F. The properties of specific stains for electron microscopy prepared by conjugation of antibody molecules with ferritin // J. Biophis. Biochem. Cytol. 1961. - V. 9. - P. 519-537.

36. Yalow R.S., Berson S.A. Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods//Nature. 1959. - V. 184. - P. 1648-1649.

37. Аметов A.C. Радиоиммунологический анализ в клинической практике // Ж. Всес. хим. о-ва. им. Д.И. Менделеева. 1982. - Т. 27. - С. 76-81.

38. Wei R., Almires R. Spinimmunoassay of progesterone // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. - V. 62. - P. 510-516.

39. Cais M., Dani S., Eden Y., Gandolfi O., Horn M., Isaacs E.E., Josephy Y., Saar Y., Slovin E., Snarsky L. Metalloimmunoassay // Nature. 1977. - V. 270. - P. 534-535.

40. Nakane P.K., Priece C.B.J. Enzyme-labelled antibodies: Preparation and application for the localization of antigens // J. Histochem. Cytochem. 1966. -V. 14. - P. 929-931.

41. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immunoglobulin G // J. Immunochem. 1971. - V. 8. - P. 871-874.

42. Van Weemen B.K., Schuurs A.II.W.M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugate//FEBS Lett. 1971. - V. 15. - P. 232-236.

43. Rubenstein K.E., Schneider R.S., Ulman E.F. Homogeneous enzyme immunoassay: A new immunochemical technique // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. - V. 47. - P. 846-851.

44. Иммуноферментный анализ / под ред. Нго Т.Т., Ленхофф Г. М.: Мир, 1988. - 446 с.

45. Oellerich М. Enzyme immunoassay in clinical chemistry: Present status and trends // J. Clin. Chem. Biochem. 1980. - V. 18. - P. 197-208.

46. Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ // Сорос, образ, ж. 1999. - № 12.-С. 9-15.

47. Hahn G., Bransch В. Universal immuno-stick test for direct rapid identification of microbial antigens within 5 minutes // Zbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1988. -Bd. 267.-S. 519-527.

48. Meier-Dieter U., Acker G., Mayer H. Detection of enterobacterial common antigen on bacterial cell surfaces by colony-immunoblotting: effect of its linkage to lipopolysaccharide // FEMS Microb. Let. 1989. - V. 59. - P. 215-220.

49. Падюков Л.Н., Семенов Б.Ф. Перспективы развития средств иммунохимической диагностики бактериальных инфекций // Ж. Всес. хим. о-ва. им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34. - С. 11-17.

50. Карулин АЛО., Дзантиев Б.Б., Орлова Г.Г., Егоров A.M. Некоторые закономерности иммуноферментного анализа бактериальных клеток // ЖМЭИ. 1987. - К» 9. - С. 12-18.

51. Beesley J.E. Colloidal gold: A new revolution in marking cytochemistry // Proc. Roy. Microsc. Soc. 1985. - V. 20. - P. 187-197.

52. Antonii F. Panacea Aurea-Auro Potabile. Hamburg: Bibliopolio Frobeniano, 1618.

53. Faraday M. Experimental relations of gold (and others metals) to light // Phil. Trans. Royal. Soc. (Lond.). 1857. - V. 147. - P. 145-181.

54. Zsigmondy R. Ueber wassrige Lösungen metallischen Goldes // Ann. Chem. -1898.-Bd. 301.-S. 29-54.

55. Жнгмонди P. Коллоидная химия. Харьков, Киев: Изд-во НКСнаба УССР, 1933.-256 с.

56. Сведберг Т. Образование коллоидов. JI.: Науч. хим.-техн. изд-во, 1927. -111с.

57. De Brouckere L., Casimir J. Preparation d'hydrosols d'or homeodisperses tres stables // Bull. Soc. Chim. Belg. 1948. - V. 57. - P. 517-524.

58. Fabrikanos A., Athanassiou S., Lieser K.H. Darstellung stabiler Hydrosole von Gold und Silber durch Reduktion mit Athylendiamintetraessigsaure // Z. Naturforschg. 1963. - Bd. 18. - S. 612-617.

59. Beigent C.L., Muller G. A colloidal gold prepared with ultrasonics // Experimentia. 1980. - V. 36. - P. 472-473.

60. Turkevich J. Colloidal gold//Gold Bull. 1985. - V. 18.-P. 86-91, 125-131.

61. Hainfeld J.F. A small gold-conjugated antibody label: improved resolution for electron microscopy // Science. 1987. - V. 236. - P. 450-453.

62. Mie G. Beitrage zur Optik trüber Medien, speziell kolloidaler Metallösungen // Ann. Phys. 1908. - Bd. 25. - S. 377-445.

63. Turkevich J., Garton G., Stevenson P.C. The color of colloidal gold // J. Colloid Sei. (Suppl.l). 1954. - V. 9. -P. 26-35.

64. Борен К., Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами. -М.: Мир, 1986.-660 с.

65. Kreibig U, Vollmer М. Optical properties of metal clusters. Heidelberg: Springer-Verlag, 1995.

66. Mishchenko M.I., Travis L.D., Lacis Л.Л. Scattering, Absorption, and Emission of Light by Small Particles. Cambridge: University Press, 2002.

67. Lin M.Y., Lindsay H.M., Weitz D.A., Ball R.C., Klein R., Meakin P. Universal reaction-limited colloid aggregation // Phys. Rev. A. 1990. - V. 41. - P. 20052020.

68. Lin M.Y., Lindsay H.M., Weitz D.A., Klein R., Ball R.C., Meakin P. Universal diffusion-limited colloid aggregation // J. Phys. B: Condens. Matter. 1990. - V. 2.-P. 3093-3113.

69. Кройт Г.Р. Наука о коллоидах. Т. 1. Необратимые системы. М.: Изд-во иностранной литературы, 1955. - 540 с.

70. Heller W., Pugh T.L. "Steric" stabilization of colloidal solutions by adsorbtion of flexible macromolecules // J. Polymer Sei. 1960. - V. 48. - P. 203-217.

71. Thiele I I., Hoppe К., Moll G. Über das kolloide Gold // Kolloid-Z. Z. Polymere. -1962.-Bd. 185.-S. 45-52.

72. Баран A.A. Полимерсодержащие дисперсные системы. Киев: Наук, думка, 1986.-204 с.

73. Chow М.К., Zukoski С.F. Gold sols formation mechanisms: Role of colloidal stability//J. Colloid Interface Sei. 1994.-V. 165.-P. 97-109.

74. Паддефет P. Химия золота. M.: Мир, 1982, - 264 с.

75. Бусев А.И., Иванов В.М. Аналитическая химия золота. М.: Наука, 1973. -264 с.

76. Маракушев С.А. Геомикробиология и биохимия золота. М.: Наука, 1991. -111с.

77. Ware M.J. Photographic printing in colloidal gold // J. Photogr. Sei. 1994. - V. 42.-P. 157-161.

78. Liu S., Leech D., Ju I I. Application of colloidal gold in protein immobilization, electron transfer, and biosensing// Analyt. Lett. 2003. - V. 36. - P. 1-19.

79. Грузина Т.Г., Чеховская Т.П., Вембер В.В., Ульберг З.Р. Влияние коллоидного золота на физиолого-биохимические процессы в Escherichia coli 1257 // Укр. биохим. ж. 2003. - Т. 75. - С. 95-98.

80. Green F. The colloidal gold reaction of the cerebrospinal fluid. Berlin: Medizin Fritz-Dieter Sohn, 1925.

81. Maclagan N.F. The serum colloidal gold reaction as a liver function test // Brit. J. Exp. Pathol. 1944. - V. 25. - P. 15-20.

82. Abraham G.E., Himmel P.B. Management of rheumatoid arthritis: Rationale for the use of colloidal metallic gold //J. Nutr. Med. 1997. - V. 7. - P. 295-305.

83. Rogoff E.E., Romano R., Hahn E.W. The prevention of Ehrlich ascites tumor using intraperitoneal colloidal 198Au // Radiology. 1975. - V. 114. - P. 225-226.

84. Feldherr C.M., Marshall J.M. The use of colloidal gold for studies of intracellular exchanged in the ameba Chaos chaos II J. Cell Biol. 1962. - V. 12. - P. 640-645.

85. Andreu E.J., de Llano J.J.M., Moreno I., Knecht E. A rapid procedure suitable to assess quantitatively the endocytosis of colloidal gold and its conjugates in cultured cells // J. Histochem. Cytochem. 1998. - V. 46. - P. 1199-1202.

86. Зеленин А.В. Генная терапия на границе третьего тысячелетия // Вестник РАН. 2001. - Т. 71. - С. 387-395.

87. Vyas S.P., Sihorkar V. Endogenous carriers and ligands in non-immunogenic site-specific drug delivery // Adv. Drug Delivery Rev. 2000. - V. 43. - P. 101164.

88. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions//Nature Phys. Sci. 1973. - V. 241. - P. 20-22.

89. Colloidal Gold: Principles, Methods and Applications / Ed. Hayat M.A. San Diego: Academic Press, 1989. - V. 1. - 538 p.; - V. 2. - 484 p.; 1990. - V. 3. - 421 P

90. Techniques in Immunocytochemistry / Eds. Bullock G.R., Petrusz P. London: Acad, press, 1982.-V. 1.-431 p.; 1983.-V. 2. - 306 p.; 1985. - V. 3. - 256 p.

91. Dc Mcy J., Moeremans M. The preparation of colloidal gold probes and their use as marker in electron microscopy // In: Advansed Techniques in Biological Electron Microscopy / Ed. Koehler J.K. Berlin: Springer-Verlag, 1986. - V. 3. -P. 229-271.

92. Хомутовский O.A., Луцик М.Д., Передерей О.Ф. Электронная гистохимия рецепторов клеточных мембран. Киев, 1986. - 168с.

93. Albrecht R.M. Hodges G.M. Biotechnology and Bioapplications of Colloidal Gold. Chicago: Scanning Microscopy International, 1987. - 312 p.

94. Verkleij A., Leunissen J. Immunogold Labelling in Cell Biology. Boca Raton: CRC Press, 1989.-376 p.

95. Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy / Ed. Donbrow M. -Boca Raton: CRC Press, 1992. 360 p.

96. Миронов A.A., Комиссарчик Я.10., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб.: Наука, 1994. - 400 с.

97. Beesley J.E. Colloidal gold: A new perspective for cytochemical marking. -Berlin: Springer-Verlag, 1998. 64 p.

98. Javois L.C. Immunocytochemical Methods & Protocols. Totowa: Humana Press, 1999.-465 p.

99. Feldheim D.L., Foss C.A. Metal Nanoparticles: Synthesis, Characterization, & Applications. N-Y.: Marcel Dekker, 2001. - 360 p.

100. Рехтер М.Д., Миронов А. А. Коллоидное золото в электронной микроскопии // Успехи современной биологии. 1990. - Т. 109. - С. 467480.

101. Tuckwell J. The uses of colloidal gold technology in biochemistry // Biochemist.- 1991.-V. 13.-P. 6-7.

102. Ilorisberger M. Colloidal gold and its application in cell biology // Int. Rev. Cytol. 1992. - V. 136. - P. 227-287.

103. Neagu C., van der Werf K.O., Putman C.A.J., Kraan Y.M., de Grooth B.G., van Hulst N.F., Greve J. Analysis of immunolabeled cells by atomic force microscopy, optical microscopy, and flow cytometry // J. Struct. Biol. 1994. -V. 112.-P. 32-40.

104. Roth J. The silver anniversary of gold: 25 years of the colloidal gold marker system for immunocytochemistry and histochemistry // Histochem.Cell Biol. -1996. -V. 106.-P. 1-8.

105. Lackie P.M. Immunogold silver staining for light microscopy // Histochem. Cell Biol. 1996.-V. 106.-P. 9-17.

106. Hermann R., Walther P., Muller M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy // Histochem. Cell Biol. 1996. - V. 106. - V. 31-39.

107. Дыкман JI.A., Богатырев В.А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа // Биохимия. 1997. - Т. 62. - С. 411-418.

108. Bendayan М. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology // Biotech. Histochem. 2000.- V. 75. P. 203-242.

109. Edwards P., Wilson T. Choose your labels // Laboratory practice. 1987. - V. 36.-P. 13-17.

110. Bio-Rad Labs Bulletin 1310. Western blotting detection systems: how do you choose? 1987.-P. 3.

111. Weiser I I.B. Inorganic Colloid Chemistry. N-Y.: Wiley, 1933. - P. 21-57.

112. Jiirgens L., Nichtl A., Werner U. Electron density imaging of protein films on gold-particle surfaces with transmission electron microscopy // Cytometry. -1999.-V. 37.-P. 87-92.

113. Böhmer R.M., King N.J.C. Immuno-gold labeling for flow cytometric analysis // J. Immunol. Meth. 1984. - V. 74. - P. 49-57.

114. Suzuto M., Hirakawa Y., Ohnishi H., Tachino S., Shingaki T., Eyring E.M., Masujima T. Nano-kinetics of probe-particles in solution vizualized by a pinfiber video scope // Analit. Sei. 2003. - V. 19. - P. 43-47.

115. Holgate C.S., Jackson P., Cowen P.N., Bird C.C. Immunogold-silver staining: New method for immuno-staining with enhanced sensitivity // J. Histochem. Cytochem. 1983. - V. 31. - P. 938-944.

116. Danscher G., Norgaard J.O.R. Light microscopic visualization of colloidal gold on resin-embedded tissue // J. Histochem. Cytochem. 1983. - V. 31. - P. 13941399.

117. Schalkhammer Th. Metal nano clusters as transducers for bioaffinity interactions // Chem. Monthly. 1998. - V. 129. - P. 1067-1092.

118. Malmqvist M. Biospecific interaction analysis using biosensor technology // Nature. 1993. - V. 361. - P. 186-187.

119. Huang W., Huang Y. Preparation and spectroscopic characterization of hydrophobic metallic nanoparticles and their LB films // Spectrosc. Spectr. Analys. 2000. - V. 20. - P. 449-452.

120. Musick M.D., Keating C.D., Lyon L.A., Botsko S.L., Pena D.J., Holliway W.D., McEvoy T.M., Richardson J.N., Natan M.J. Metal films prepared by stepwise assembly // Chem. Mater. 2000. - V. 12. - P. 2869-2881.

121. Shipway A.N., Katz E., Willner I. Nanoparticle arrays on surfaces for electronic, optical, and sensor applications // Chemphyschem. 2000. - V. 1. - P. 18-52.

122. Taniguchi N. On the basis concept of nanotechnology // Proc. Int. Conf. Prog. Eng. Part II. Tokyo: Jap. Soc. Prec. Eng., 1974.

123. Фейнман P. Внизу полным-полно места: приглашение в новый мир // Химия и жизнь. 2002. - N° 12. - С. 20-26.

124. De Heer W.A. The physics of simple metal clusters: Experimental aspects and simple models // Rev. Mod. Phys. 1993. - V. 65. - P. 611-676.

125. Brack M. The physics of simple metal clusters: Selfconsistant jellium and semiclassical approaches // Rev. Mod. Phys. 1993. - V. 65. - P. 677-732.

126. Schmid G., Chi L.F. Metal clusters and colloids // Adv. Mater. 1998. - V. 10. -P. 515-527.

127. Иванов В.К. Электронные свойства металлических кластеров // Сорос, образ, ж. 1999. - № 8. - С. 97-102.

128. Шалаев В.М., Штокман М.И. Оптические свойства фрактальных кластеров (восприимчивость, гигантское комбинационное рассеяние, рассеяние на примесях) // ЖЭТФ. 1987. - Т. 92. - С. 509-522.

129. Маркель В.А., Муратов JI.C., Штокман М.И. Теория и численное моделирование оптических свойств фракталов // ЖЭТФ. 1990. - Т. 98. - С. 819-837.

130. Бутенко Л.В., Шалаев В.М., Штокман М.И. Гигантские примесные нелинейности в оптике фрактальных кластеров // ЖЭТФ. 1988. - Т. 94. -С. 107-124.

131. Butenko A.V., Chubakov P.A., Danilova Yu.E. Nonlinear optics of metal fractal clusters // Z. Phys. D. 1990. - Bd. 17. - S. 283-289.

132. Templeton A.C., Pietron J.J., Murray R.W., Mulvaney P. Solvent refractive index and core charge influences on the surface plasmon absorbance of alkanethiolate monolayer-protected gold clusters // J. Phys. Chem. B. 2000. -V. 104.-P. 564-570.

133. Schuk P. Use of surface plasmon resonance to probe the equilibrium and dynamic aspects of interactions between biological macromolecules // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997. - V. 26. - P. 541-566.

134. Lyon L.A., Musick M.D., Natan M.J. Colloidal Au-enhanced surface-plasmon resonance immunosensing// Anal. Chem. 1998. - V. 70. - P. 5177-5183.

135. Martin C.R., Mitchell D.T. Nanomaterials in analytical chemistry // Analytical Chemistry News & Features. 1998. - P. 322A-327A.

136. Homola J., Yee S.S., Gauglitz G. Surface plasmon resonance sensors: Review // Sensors and Actuators B. 1999. - V. 54. - P. 3-15.

137. Mullett W.M., Lai E.P.C., Yeung J.M. Surface plasmon resonance-based immunoassays//Methods. 2000. - V. 22. - P. 77-91.

138. Schneider B.H., Dickinson E.L., Vach M.D., Hoijer J.V., Howard L.V. Highly sensitive optical chip immunoassays in human serum // Biosens. Bioelectron. -2000.-V. 15.-P. 13-22.

139. Rich R.L., Myszka D.G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. - V. 11. - P. 54-61.

140. Niemeyer C.M. Nanoparticles, proteins, and nucleic acids: Biotechnology meets materials science//Angew. Chem. Int. Ed. 2001. - V. 40. - P. 4128-4158.

141. Oldenburg S.J., Geniek C.C., Clark K.A., Sehultz D.A. Base pair mismatch recognition using plasmon resonant particle labels // Anal. Biochem. 2002. - V. 309.-P. 109-116.

142. Sehultz D.A. Plasmon resonant particles for biological detection // Curr. Opin. Biotechnol. 2003. - V. 14. - P. 13-22.

143. Harma H. Particle technologies in diagnostics. Helsinki: Tekes, 2002. - 30 p.

144. Frederix F., Friedt J.-M., Choi K.-H., Laureyn W., Campitelli A., Mondelaers D., Maes G., Borghs G. Biosensing based on light absorption of nanoscaled gold and silver particles // Anal. Chem. 2003. - V. 75. - P. 6894-6900.

145. Jain K.K. Nanodiagnostics: Application of nanotechnology in molecular diagnostics //Expert Rev. Mol. Diagn. 2003. - V. 3. - P. 153-161.

146. Parak W.J., Gerion D., Pellegrino T., Zanchet D., Micheel C., Williams S.C., Boudreau R., Le Gros M.A., Larabell C.A., Alivisatos A.P. Biological applications of colloidal nanocrystals // Nanotechnology. 2003. - V. 14. - P. R15-R27.

147. Riboh J.C., Haes A.J., McFarland A.D., Yonzon C.R., Van Duyne R.P. A nanoscale optical biosensor: Real-time immunoassay in physiological buffer enabled by improved nanoparticle adhesion // J. Pliys. Chem. B. 2003. - V. 107.-P. 1772-1780.

148. Frutos A.G., Corn R.M. SPR of ultrathin organic films // Anal. Chem. 1998.-V. 70. - P. 449A-455A.

149. Okamoto T., Yamaguchi I., Kobayashi T. Local plasmon sensor with gold colloid monolayers deposited upon glass substrates // Optics Letters. 2000. - V. 25. - P. 372-374.

150. Kurihara K., Suzuki K. Theoretical understanding of an absorption-based surface plasmon resonance sensor based on Kretchmann's theory // Anal. Chem. -2002.-V. 74.-P. 696-701.

151. Grabar K.C., Freeman R.G., Hommer M.B., Natan M.J. Preparation and characterization of Au colloid monolayers // Anal. Chem. 1995. - V. 67. - P. 735-743.

152. Ulman A. Formation and structure of self-assembled monolayers // Chem. Rev. -1996.-V. 96.-P. 1533-1554.

153. Nath N., Chilkoti A. A colorimetric gold nanoparticle sensor to interrogate biomolecular interactions in real time on a surface // Anal. Chem. 2002. - V. 74. - P. 504-509.

154. Prasad B.L.V., Stoeva S.I., Sorensen C.M., Klabunde K.J. Digestive-ripening agents for gold nanoparticles: Alternatives to thiols // Chem. Mater. 2003. - V. 15.-P. 935-943.

155. Haynes C.L., Van Duyne R.P. Nanosphere lithography: A versatile nanofabrication tool for studies of size-dependent nanoparticle optics // J. Phys. Chem. B. 2001. - V. 105. - P. 5599- 5611.

156. Adamczyk M., Moore J.A., Yu Z. Application of surface plasmon resonance toward studies of low-molecular weight antigen-antibody binding interactions // Methods. 2000. - V. 20. - P. 319-328.

157. Seo K.H., Brackett R.E., Hartman N.F., Campbell D.P. Development of a rapid response biosensor for detection of Salmonella typhimurium II J. Food Prot. -1999.-V. 62.-P. 431-437.

158. Mirkin C.A., Letsinger R.L., Mucic R.C., Storhoff J.J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials // Nature. 1996. - V. 382.-P. 607-609.

159. Bao P., Frutos A. G., Greef Ch., Lahiri J., Muller U., Peterson T. C., Warden L., Xie X. High-sensitivity detection of DNA hybridization on microarrays using resonance light scattering // Anal. Chem. 2002. - V. 74. - P. 1792-1797.

160. Raschke G., Kowarik S., Franzl T., Sonnichsen C., Klar T. A., Feldmann J., Nichtl A., Kurzinger K. Biomolecular recognition based on single gold nanoparticle light scattering // Nano Lett. 2003. - V. 3. - P. 935-942.

161. McFarland A. D,. Van Duyne R. P. Single silver nanoparticles as real-time optical sensors with zeptomole sensitivity // Nano Lett. 2003. - V. 3. - P. 10571062.

162. Csaki A., Maubach G., Born D., Reichert J., Fritzsche W. DNA-based molecular nanotechnology // Single Mol. 2002. - V. 3. - P. 275-280.

163. Feldheim D.L., Keating C.D. Self-assembly of single electron transistors and related devices // Chem. Soc. Rev. 1998. - V. 27. - P. 1 -12.

164. Bozhevolnyi S.I. Near-field optics of nanostructured surfaces // In: Optics of Nanostructured Materials / Eds. Markel V.A., George Th.F. N-Y.: Wiley, 2000.-P. 73-142.

165. Kneipp K., Kneipp H., Itzkan I., Dasari R.R., Feld M.S. Surface-enhanced Raman scattering and biophysics // J. Phys.: Condens. Matter. 2002. - V. 14. -P. R597-R624.

166. Doering W.E., Nie S. Single-molecule and single-nanoparticle SERS: Examining the roles of surface active sites and chemical enhancement // J. Phys. Chem. B. 2002. - V. 106. - P.311-317.

167. Rothenhausler B., Knoll W. Surface-plasmon microscopy // Nature. 1988. - V. 6165.-P. 615-617.

168. Brockman J.M., Nelson B.P., Corn R.M. Surface plasmon resonance imaging measurements of ultrathin organic films // Annu. Rev. Phys. Chem. 2000. - V. 51.-P. 41-63.

169. Belloni J. Metal nanocolloids // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1996. - V. 1. -P. 184-196.

170. Yguerabide J., Yguerabide E. Light-scattering submicroscopic particles as highly fluorescent analogs and their use as tracer labels in clinical and biological applications. I. Theory // Anal. Biochem. 1998. - V. 262. - P. 137-156.

171. Ролдугин В.И. Квантоворазмерные металлические коллоидные системы // Успехи химии. 2000. - Т. 69. - С. 899-923.

172. Schatz G.C. Electrodynamics of nonspherical nobel nanoparticles and nanoparticle aggregates //Theochem. 2001. - V. 573. - P. 73.

173. Xu H., Kail M. Modeling the optical response of nanoparticle-based surface plasmon resonance sensors // Sensors and Actuators B. 2000. - V. 287. - P. 244-249.

174. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Krasnov Ya.M., Melnikov A.G. Optical properties of colloidal-gold bioconjugates // Applied Nonlinear Dynamics. 2002. - V. 10. - P. 172-187.

175. Kabat E.A. Basic principles of antigen-antibody reactions // In: Meth. Enzymol., Immunochem. Techniq. -N-Y.: Acad. Press., 1980. V. 70. Part A. P. 3-49.

176. Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология. M.: Высш. шк., 1985. - 287 с.

177. Иммунологические методы / под ред. Фримеля Г. М.: Мир, 1987. - 472 с.

178. Пастер Е.У., Овод В.В., Позур В.К., Вихоть Н.Е. Иммунология: Практикум. Киев: Вища шк., 1989. - 304 с.

179. Антитела. Методы / под ред. Кэтти Д. М.: Мир, 1991. - 287 с.

180. Вакцины и иммунизация: современное положение в мире. Женева: ВОЗ, 1996.- 189 с.

181. Воробьев А.А., Васильев Н.Н. Адыованты. М.: Медицина, 1969. - 206 с.

182. Jennings М.М. Review of selected adjuvants used in antibody production // ILARJ. 1995.-V. 37(3).

183. Hunter R.L., Olsen M.R., Bennett B. Copolymer adjuvants and TiterMax® // In: The Theory and Practical Application of Adjuvants / Ed. Stewart-Tull D.E.S. -N-Y.: Wiley, 1995. P. 51-94.

184. Kaeberle M.L. Functions of current adjuvants in induction of immune response // In: Advances in Carriers and Adjuvants for Veterinary Biologies / Eds. Nervig R.M., Gough P.M., Kaeberle M.L. Ames: Iowa State University Press, 1986. -P. 11-24.

185. Morein B., Hu K.-F. Biological aspects and prospects for adjuvants and delivery systems // In: New Vaccine Technologies / Ed. Ellis R.W. Georgetown: Landes Bioscience, 2000. - P. 274-291.

186. Kersten G.F.A., Crommelin D.J.A. Liposomes and ISCOMs // Vaccine. 2003. -V. 21.-P. 915-920.

187. Freund J., Casals J., Hosmer E.P. Sensitization and antibody formation after injection of tubercle bacilli and paraffin oil // Proc. Soc. Exp. Biol. 1937. - V. 37.-P. 509-513.

188. Freund J. The effect of paraffin oil and mycobacteria on antibody formation and sensitization: A review // Am. J. Clin. Pathol. 1951. - V. 21. - P. 645-656.

189. Stewart-Tull D.E.S. Freund-type mineral oil adjuvant emulsions // In: The Theory and Practical Application of Adjuvants / Ed. Stewart-Tull D.E.S. N-Y.: Wiley, 1995.-P. 1-19.

190. Herbert W.J. Mineral-oil adjuvants and the immunization of laboratory animals // In: Handbook of Experimental Immunology / Ed. Weir D.M. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1978. - P. A3:1-A3.15.

191. Moncada C., Torres V., Israel Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization // J. Immunol. Meth. 1993. - V. 162. - P. 133-140.

192. Ribi E.T., Meyer J., Azuma I., Parker R., Brehmer W. Biologically active components from mycobacterial cell walls. IV. Protection of mice against aerosol infection with virulent Mycobacterium tuberculosis II Cell. Immunol. -1975.-V. 16.-P. 1-10.

193. Altman A., Dixon F.J. Immunomodifiers in vaccines // Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 1989. - V. 33. - P. 301-343.

194. Rudbach J.A., Johnson D.A., Ulrich J.T. Ribi adjuvants: Chemistry, biology and utility in vaccines for human and veterinary medicine // In: The Theory and Practical Application of Adjuvants / Ed. Stewart-Tull D.E.S. N-Y.: Wiley, 1995.-P. 287-313.

195. Johnson A.G. Molecular adjuvants and immunomodulators: New approaches to immunization // Clin. Microbiol. Rev. 1994. - V. 7. - P. 277-289.

196. Morrison D.C., Rudbach J.A. Endotoxin-cell-membrane interactions leading to transmembrane signaling // In: Contemporary Topics in Molecular Immunology / Eds. Inman P., Mandy W.J. N-Y.: Plenum Press, 1981. - P. 181 -218.

197. Morrison D.C. Diversity of mammalian macromolecules which bind to bacterial lipopolysaccharides // In: Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions / Eds. Nowotny A., Spitzer J.J., Ziegler E.J. Amsterdam: Elsevier, 1990.-P. 183-189.

198. Henricson B.E., Benjamin W.R., Vogel S.N. Differential cytokine induction by doses of lipopolysaccharide and monophosphoryl lipid A that result in equivalent early endotoxin tolerance // Infect. Immun. 1990. - V. 58. - P. 24292437.

199. Unanue E.R., Allen P.M. The basis for the immunoregulatory role of macrophages and other accessory cells // Science. 1987. - V. 236. - P. 551-557.

200. Baker P.J., Hiernaux J.R., Fauntleroy M.B. Inactivation of suppressor T-cell activity by nontoxic monophosphoryl lipid A // Infect. Immun. 1988. - V. 56. -P. 1076-1083.

201. Adam A., Ciorbaru R., Petit J.F. Preparation and biological properties of water-soluble adjuvant fractions from dilapidated cells of Mycobacteria smegmatis and Nocardia opaca II Infect. Immun. 1973. - V. 7. - P. 855-861.

202. Ribi E., McLaughlin C.A., Cantrell J.L. Immunotherapy for tumors with microbial constituents or their synthetic analogues: A review // In: Immunotherapy of Human Cancer. N-Y.: Raven Press, 1978. - P. 131-154.

203. Hunter R.L., Strickland F., Kezdy F. Studies on the adjuvant activity of nonionic block polymer surfactants. I. The role of hydrophile-lipophile balance // J. Immunol. 1981. - V. 127. - P. 1244-1250.

204. Hunter R.L., Bennett B. The adjuvant activity of nonionic block polymer surfactants: III. Characterization of selected biologically active surfaces // Scand. J. Immunol. 1986. - V. 23. - P. 287-300.

205. Hunter R., Olsen M., Buynitzky S. Adjuvant activity of non-ionic block copolymers. IV. Effect of molecular weight and formulation on titer and isotype of antibody// Vaccine. 1991. - V. 9. - P. 250-256.

206. Bennet B., Check I.J., Olsen M.R., Hunter R.L. A comparison of commercially available adjuvants for use in research // J. Immunol. Meth. 1992. - V. 153. - P. 31-40.

207. Byars N.E., Allison A.C. Adjuvant formulation for use in vaccines to elicit both cell-mediated and humoral immunity // Vaccine. 1987. - V. 5. - P. 223-228.

208. Hunter R.L., Bennett B. The adjuvant activity of nonionic block polymer surfactants: II. Antibody formation and inflammation related to the structure of triblock and octablock copolymers // J. Immunol. 1984. - V. 133. - P. 31673175.

209. Howerton D.A., Hunter R.L., Ziegler H.K., Check I.J. Induction of macrophage la expression in vivo by a synthetic block copolymer, L81 // J. Immunol. 1990. -V. 144. - P. 1578-1584.

210. McClimon L.B., Glick B., Dick J.W. Effect of three commercially available adjuvants on the production of antibodies to Pasteurella multocida in broilers // Avian Dis. 1994. - V. 38. - P. 354-357.

211. Warren H.S., Vogel F.R., Chedid L.A. Current status of immunological adjuvants // Ann. Rev. Immunol. 1986. - V. 4. - P. 369-388.

212. Nicklas W. Aluminum salts // Res. Immunol. 1992. - V. 143. - P. 489-493.

213. Brewer J.M., Conacher M., Hunter C.A., Mohrs M., Brombacher F., Alexander J. Aluminum hydroxide adjuvant initiates strong antigen-specific Th2 responses in the absence of IL-4 or IL-13-mediated signaling // J. Immunol. 1999. - V. 163.- P. 6448-6454.

214. Cooper P.D., McComb C., Steele E.J. The adjuvanticity of Algammulin, a new vaccine adjuvant//Vaccine. 1991. - V. 9. - P. 408-415.

215. Leibl II., Tomasits R., Bruhl P., Kerschbaum A., Eibl M.M., Mannhalter J.W. Humoral and cellular immunity induced by antigens adjuvanted with colloidal iron hydroxide//Vaccine. 1999.-V. 17.-P. 1017-1023.

216. Nilsson B.O., Larsson A. Inert carriers for immunization // Res. Immunol.1992.-V. 143.-P. 553-557.

217. Del G.G. New carriers and adjuvants in the development of vaccines // Curr. Opin. Immunol. 1992. - V. 4. - P. 454-459.

218. Nesmeyanov V.A., Golovina T.V., Valyakina T.I., Andronova T.M., Ivanov V.T. Cellular and molecular mechanisms of biological activity of muramyl peptides // In: Immunotherapy of Infections / Ed. Masihi N. N-Y.: Marcel Dekker, 1994. - P. 213-223.

219. Arnon R., Levi R. Synthetic recombinant vaccine induces anti-influenza long-term immunity and cross-strain protection // In: Novel Strategies in Design and Production of Vaccines / Eds. Cohen S., Shafferman A. N-Y.: Plenum Press, 1996,-P. 23-29.

220. Староверов C.A., Семенов С.В., Сндоркнн В.А. Влияние поверхностно активных веществ и витаминов на формирование иммунного ответа // Ветеринария. 2003. - № 4. - С. 38-40.

221. Староверов С.А., Семенов С.В., Сидоркин В.А. Адъювантные свойства воднодисперсных растворов неионогенных поверхностно активных веществ и витаминов // Ветеринария. 2003. - № 10,- С. 30-31.

222. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям. М.: Наука, 1985, - 304 с.

223. Иванов В.Т., Вольпина О.М., Андронова Т.М. Пептидные антигены и адъюванты в синтетических вакцинах // Ж. Всес. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1988. - Т. 33. - С. 523-530.

224. Arnon R., Horwitz R.J. Synthetic peptides as vaccines // Curr. Opin. Immunol. -1992.-V. 4.-P. 449-453.

225. Ben-Yedidia Т., Arnon R. Design of peptide and polypeptide vaccines // Curr. Opin. Biotechnol. 1997. - V. 8. - P. 442-448.

226. Harris W.J., Cunniugham C. Antibody therapeutics. Berlin: Springer-Verlag, 1995,- 150 p.

227. Marco M.-P., Gee S., Hammock B.D. Immunochemical techniques for enviromental analysis//Trends in Anal. Chem. 1995. - V. 14. - P. 415-425.

228. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. Киев: Урожай, 1993. - 369 с.

229. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. Phage antibodies: Filamentous phage displaying antibody variable domains // Nature. 1990. - V. 348. - P. 552-554.

230. Петров P.В., Хаитов P.M. Вакцины нового поколения на основе синтетических полиионов: история создания, феноменология и механизмы действия, внедрение в практику // Иммунология. 1998. - № 1. - С. 4-11.

231. Петров Р.В., Кабанов В.А., Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины // Ж. Всес. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева.- 1988. Т. 33. - С. 502521.

232. Kreuter J. Nanoparticles as adjuvants for vaccines // Pharm. Biotechnol. 1995. - V. 6. - P. 463-472.

233. Gregoriadis G. Immunological adjuvants: A role for liposomes // Immunology Today. 1990. - V. 11. - P. 89-97.

234. Fukasawa M. Liposome oligomannan-coated with neoglycolipid, a new candidate for a safe adjuvant for induction of CD8+ cytotoxic T-lymphocytes // FEBS Letters. 1998. - V. 441. - P. 353-356.

235. Morris \V. Potential of polymer microencapsulation technology for vaccine innovation // Vaccine. 1994. -V. 12. - P. 5-11.

236. Андреев С.М., Бабахни А.А., Петрухина А.О., Романова B.C., Парнес З.Н., Петров Р.В. Иммуногенные и аллергенные свойства конъюгатов фуллерена с аминокислотами и белком // Докл. РАН. 2000. - Т. 370. - С. 261-264.

237. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins J.S. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipid // J. Mol. Biol. 1965. - V. 13. - P. 238252.

238. Papahajopoulos D., Kimelberg H.K. Phospholipid vesicles (liposomes) as models for biological membranes // Progr. Surface Sci. 1973. - V. 4. - P. 141232.

239. Chong C.S., Colbow K. Light csatterlng and turbidity measurements on lipid vesicles // Biochem. Biophys. Acta. 1976. - V. 436. - P. 260-282.

240. Das P.K., Ghosh P., Bachhawat B.K., Das M.K. Liposomes as carrier for production of sugar specific antibodies: Preparation of antigalactosyl antiserum // Immunol. Commun. 1982. - V. 11. - P. 17-24.

241. Марголис JI.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: Наука, 1984. - 240 с.

242. Liposomes, a practical approach / Ed. New R.R.C. Oxford: IRL Press, 1992. -390 p.

243. Ефременко В.И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии «медицине). Ставрополь: ЫИПЧИ, 1999. - 236 с.

244. Барсуков Л.И. Липосомы. // Сорос, образов, ж. 1998. - № 10. - С. 2-10.

245. Allison А.С., Gregoriadis G. Liposomes as immunological adjuvants // Recent Results Cancer Res. 1976. - V. 56. - P. 58-64.

246. Sanchex Y., Ionescu-Matiu I., Dreesman G. R. Humoral and cellular immunity to hepatitis В virus-derived antigens: Comparative activity of Freund's complete adjuvant, alum and liposomes // Infect. Immun. 1980. - V. 30. - P. 728-733.

247. Desiderio J.V., Campbell S.G. Immunization against experimental murine salmonellosis with liposome-associated O-antigen // Infect. Immun. 1985. - V. 48. - P. 658-663.

248. Niemi S.M., Fox J.G., Brown L.R., Langer R. Evaluation of ethylene-vinyl acetate copolymer as a non-inflammatory alternative to Freund's complete adjuvant in rabbits // Labor. Animal Sci. 1985. - V. 35. - P. 609-612.

249. Eldridge J.H., Staas J.K., Meulbroek J.A., McGhee J.R., Tice T.R., Gilley R.M. Biodegradable microspheres as a vaccine delivery system // Mol. Immunol. -1991.-V. 28.-P. 287-294.

250. Nakaoka R. Adjuvant effect of biodegradable poly(DL-lactic acid) granules capable for antigen release following intra-peritoneal injection // Vaccine. -1996.-V. 14.-P. 1671-1676.

251. Khlebtsov B.N., Kovler L.A., Bogatyrev V.A., Khlebtsov N.G., Shchyogolev S.Yu. Studies of phospatidilcholine vesicles by spectroturbidimetry and dynamiclight scattering methods // J. Quant. Spectr. Radiat. Transfer. 2003. - V. 79-80. - P. 829-838.

252. Shiosaka S., Kiyama H., Wanaka A., Tohyama M. A new method for produsing a specific and high titer antibody against glutamate using colloidal gold as a carrier // Brain Research. 1986. - V. 382. - P. 399-403.

253. Shiosaka S., Kohno J., Kiyama H., Tohyama M., Shiotani Y. Antibody specific to low-molecular weight substance and method of producing the same by using colloidal gold metal as carrier // European Patent № 0232717, 1987.

254. Ottersen O.P., Storm-Mathisen J. Localization of amino acid neurotransmitters by immunocytochemistry // Trends in Neurosci. 1987. - V. 10. - P. 250-255.

255. Tomii A., Masugi F. Production of anti-platelet-activating factor antibodies by the use of colloidal gold as carrier//Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1991. - V. 44. - P. 75-80.

256. Tatsumi N, Terano Y, Hashimoto K, Hiyoshi M, Matsuura S. An anti-platelet activating factor antibody and its effects on platelet aggregation // Osaka City Med. J. 1993. - V. 39. - P. 167-174.

257. Moffett J.R., Espey M.G., Namboodiri M.A.A. Antibodies to quinolinic acid and the determination of its cellular-distribution within the rat immune-system // Cell and Tissue Res. 1994. - V. 278. - P. 461-469.

258. Chen J., Zou F., Wang N., Xie S., Zhang X. Production and application of LPA polyclonal antibody// Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. - V. 10. - P. 1691-1693.

259. Оленина Jl.В., Колесанова Е.Ф., Гервазиев Ю.В., Зайцева И.С., Кураева Т.Е., Соболев Б.И., Арчаков А.И. Получение антипептидных антител к участкам связывания белка Е2 вируса гепатита С с CD81 // Мед. иммунол. -2001.-Т. З.-С. 231.

260. Загоскина Т.Ю. Теоретические и прикладные аспекты конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза // Дис. докт. мед. наук. Владивосток, 2003.

261. Pow D.V., Crook D.K. Extremely high titre polyclonal antisera against small neurotransmitter molecules: Rapid production, characterisation and use in light and electron-microscopic immunocytochemistry // J. Neurosci. Meth. 1993. -V. 48.-P. 51-63.

262. Baude A., Nusser Z., Molnar E., Mcllhinney R.A.J., Somogyi P. High-resolution immunogold localization of AMPA type glutamate receptor subunits at synaptic and non-synaptic sites in rat hippocampus // Neurosci. 1995. - V. 69. - P. 10311055.

263. Pickard L., Noel J., Henley J.M., Collingridge G.L., Molnar E. Developmental changes in synaptic AMPA and NMDA receptor distribution and AMPA receptor subunit composition in living hippocampal neurons // J. Neurosci. -2000.-V. 20.-P. 7922-7931.

264. Schell M.J., Molliver M.E., Snyder S.H. D-serine, an endogenous synaptic modulator: Localization to astrocytes and glutamate-stimulated release // PNAS. 1995.-V. 92. - P. 3948-3952.

265. Schell M.J., Cooper O.B., Snyder S.H. D-aspartate localizations imply neuronal and neuroendocrine roles // PNAS. 1997. - V. 94. - P. 2013-2018.

266. Eliasson M.J.L., Blackshaw S., Schell M.J., Snyder S.H. Neuronal nitric oxide synthase alternatively spliced forms: Prominent functional localizations in the brain // PNAS. 1997. - V. 94. - P. 3396-3401.

267. Staimer N., Gee S.J., Hammock B.D. Development of a sensitive enzyme immunoassay for the detection of phenil-p-D-thioglucoronide in human urine // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. - V. 369. - P. 273-279.

268. Деменев B.A., Щннова M.A., Иванов Л.И., Воробьева Р.Н., Здановская Н.И., Небайкнна Н.В. Совершенствование методических подходов к конструированию вакцины против клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. 1996. - Т. 41. - С. 107-110.

269. Деменев В.А., Щинова М.А., Иванов Л.И., Воробьева Р.Н., Здановская Н.И., Небайкина Н.В. Способ получения вакцины против клещевого энцефалита на основе растворимого антигена // Патент РФ № 94016771/13, 1997.

270. Kayed R., Head Е., Thompson J.L., Mclntire Т.М., Milton S.C., Cotman C.W., Glabe C.G. Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis // Science. 2003. - V. 300. - P. 486-489.

271. Kowalczyk D.W., Ertl H.C.J. Immune responses to DNA vaccines // Cell. Mol. Life Sci. 1999. - V. 55. - P. 751-770.

272. Hasan U.A., Abai A.M., Harper D.R., Wren B.W., Morrow W.J.W. Nucleic acid immunization: Concepts and techniques associated with third generation vaccines//J. Immunol. Meth. 1999. - V. 229. - P. 1-22.

273. Liu M.A., Hillerman M.R., Kurth R. DNA vaccines: A new era in vaccinology // Ann. N-Y. Acad. Sci. 1995. - V. 772. - P. 1-294.

274. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: Immunology, application, and optimization // Annu. Rev. Immunol. 2000. - V. 18. - P. 927974.

275. Cui Z., Mumper R.J. The effect of co-administration of adjuvants with a nanoparticle-based genetic vaccine delivery system on the resulting immune responses // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2003. - V. 5. - P. 11-18.

276. Chen D., Payne L.G. Targeting epidermal Langerhans cells by epidermal powder immunization // Cell Res. 2002. - V. 12. - P. 97-104.

277. Chen D., Zuleger C., Chu Q., Maa Y.F., Osorio J., Payne L.G. Epidermal powder immunization with a recombinant HIV gpl20 targets Langerhans cells and induces enhanced immune responses // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -2002.-V. 18.-P. 715-722.

278. Dean H.J., Fuller D., Osorio J.E. Powder and particle-mediated approachas for delivery of DNA and protein vaccines into the epidermis // Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 2003. - V. 26. - P. 373-388.

279. Thomas M., Klibanov A.M. Conjugation to gold nanoparticles enhances polyethylenimine's transfer of plasmid DNA into mammalian cells // PNAS. -2003.-V. 100.-P. 9138-9143.

280. Zhao Z., Wakita T., Yasui K. Inoculation of plasmids encoding Japanese encephalitis virus PrM-E proteins with colloidal gold elicits a protective immune response in BALB/c mice // J. Virol. 2003. - V. 77. - P. 4248-4260.

281. Teranishi T. Metallic colloids // In: Encyclopedia of Surface and Colloid Science / Ed. Hubbard A. N-Y.: Marcel Dekker, 2002. - P. 3314-3327.

282. Daniel M.C., Astruc D. Gold nanoparticles: Assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology // Chem. Rev. 2004. - V. 104. - P. 293-346.

283. Roth J. The colloidal gold marker systems for light and electron microscopic cytochemistry // In: Techniques in Immunocytochemistry / Eds. Bullock G.R., Petrusz P. London: Acad. Press, 1983. - V. 2. - P. 217-284.

284. Handley D.A. Methods for synthesis of colloidal gold // In: Colloidal Gold: Principles, Methods and Applications / Ed. Hayat M.A. San Diego: Academic Press, 1989.-V. 1.-P. 13-32.

285. Turkevich J., Stevenson P.C., Hillier J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold // Discuss. Faraday Soc. 1951. - V. 11.-P. 55.

286. Stathis E.C., Fabricanos A. Preparation of colloidal gold // Chem. Ind. (London) 1958.-V. 27.-P. 860-861.

287. Tschopp J., Podack E.R., Muller-Eberchard H.J. Ultrastructure of the membrane attack complex of complement: Detection of the tetramolecular C9polymerizing complex C5b-8 // PNAS. 1982. - V. 79. - P. 7474-7478.

288. Birrel G.B., Hedberg K.K. Immunogold labeling with small gold particles: Silver enhancement provides increased detectability at low magnifications // J. Electron Microsc. Tech. 1987. - V. 5. - P. 219-220.

289. DiScipio R.G. Preparation of colloidal gold particles of various sizes using sodium borohydride and sodium cyanoborohydride // Anal. Biochem. 1996. -V. 236.-P. 168-170.

290. Muhlpfordt H. The preparation of colloidal gold particles using tannic acid as an additional reducing agent // Experientia. 1982. - V. 38. - P. 1127-1128.

291. Slot J.W., Geuze H.J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry // Eur. J. Cell Biol. 1985. - V. 38. - P. 87-93.

292. Baschong W., Lucocq J.M., Roth J. "Thiocyanate gold": Small (2-3 nm) colloidal gold for affinity cytochemical labeling in electron microscopy // Histochemistry. 1985. - V. 83. - P. 409-411.

293. Thomas J.M. Colloidal metals: Past, present and future // Pure Appl. Chem. -1988.-V. 60.-P. 1517-1518.

294. Brown K.R., Natan M.J. Hydroxylamine seeding of colloidal Au nanoparticles in solution and on surfaces // Langmuir. 1998. - V. 14. - P. 726-728.

295. Brown K.R., Walter D.G., Natan M.J. Seeding of colloidal Au nanoparticles solutions. 2. Improved control of particle size and shape // Chem. Mater. 2000. -V. 12.-P. 306-313.

296. Jana N. R., Gearheart L., Murphy C.J. Seeding growth for size control of 5-40 nm diameter gold nanoparticles // Langmuir. 2001. - V. 17. - P. 6782 -6786.

297. Goia D.V., Matijevic E. Tailoring the particle size of monodispersed colloidal gold//Colloids and Surfaces A.- 1999.-V. 146.-P. 139-152.

298. Hirai H., Aizavva H. Preparation of stable dispersions of colloidal gold in hexanes by phase transfer// J. Colloid Interface Sci. 1993. - V. 161. - P. 471 -474.

299. Green M., O'Brien P. A simple one phase preparation of organically capped gold nanocrystals // Chem. Commun. 2000. - P. 183-184.

300. Giersig M., Mulvaney P. Preparation of ordered colloid monolayers by electrophoretic deposition // Langmuir. 1993. - V. 9. - P. 3408-3413.

301. Brust M., Walker D., Bethell D., Schiffrin D.J., Whyman R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994. - P. 801.

302. Brust M., Kiely C.J. Some recent advances in nanostructure preparation from gold and silver particles: A short topical review // Colloids and Surfaces A. -2002.-V. 202.-P. 175-186.

303. Dutta J., Hofmann H. Self-organization of colloidal nanoparticles // In: Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology / Ed. Nalwa H.S. N-Y.: American Scientific Publishers, 2003. - V. X. - P. 1-23.

304. Yeung S.A., Hobson R., Biggs S., Grieser F. Formation of gold sols using ultrasound //J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1993. - V. 4. - P. 378-379.

305. Chen W., Cai W., Zhang L., Wang G., Zhang L. Sonochemical processes and formation of gold nanoparticles within pores of mesoporous silica // J. Colloid Interface Sci. 2001. - V. 238. - P. 291-295.

306. Mandal M., Kundu S., Ghosh S.K., Pal T. UV-photoactivation technique for size and shape controlled synthesis and annealing of stable gold nanoparticles in micelle // Bull. Mater. Sci. 2002. - V. 25. - P. 509-511.

307. Niidome Y., Mori A., Sato T., Yamada S. Enormous size growth of thiol-passivated gold nanoparticles induced by near-IR laser light // Chem. Lett. -2000.-P. 310-311.

308. Gachard E., Remita II., Khatouri J., Keita В., Nadjo L., Belloni J. Radiation-induced and chemical formation of gold clusters // New J. Chem. 1998. - P. 1257-1265.

309. Mafume F., Kohno J.-Y., Takeda Y., Kondow Т., Sawabe H. Formation of gold nanoparticles by laser ablation in aqueous solution of surfactant // J. Phys. Chem. В 2001. - V. 105. - P. 5114-5120.

310. Ma H., Yin В., Wang S., Jiao Y., Pan W., Huang S., Chen S., Meng F. Synthesis of silver and gold nanoparticles by a novel electrochemical method // Chemphyschem. 2004. - V. 5. - P. 68-75.

311. Ершов Б.Г. Наночастицы металлов в водных растворах: электронные, оптические и каталитические свойства // Рос. хим. ж. 2001. - Т. XLV. - С. 20-30.

312. McPartlin М., Mason R., Malatesta L. Novel cluster complexes of gold(0)-gold(l) // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1969. - P. 334.

313. Bartlett Р.Л., Bauer В., Singer S.J. Synthesis of water-soluble undecagold cluster compounds of potential importance in electron microscopic and other studies of biological systems // J. Am. Chem. Soc. 1978. - V. 100. - P. 50855089.

314. Ilainfeld J.F., Powell R.D. New frontiers in gold labeling // J. Ilistochem. Cytochem. 2000. - V. 48. - P. 471 -480.

315. Jana N.R., Gearheart L., Obare S.O., Murphy C.J. Anisotropic chemical reactivity of gold spheroids and nanorods // Langmuir. 2002. - V. 18. - P. 922927.

316. Jana N.R., Gearheart L., Murphy C.J. Wet chemical synthesis of high aspect ratio cylindrical gold nanorods //J. Phys. Chem. B. 2001. - V. 105. - P. 40654067.

317. Nikoobakht В., El-Sayed M.A. Surface-enhanced Raman scattering studies on aggregated gold nanorods // J. Phys. Chem. A. 2003. - V. 107. - P. 3372-3378.

318. Mock J.J., Oldenburg S.J., Smith D.R., Schultz D.A., Schultz S. Composite plasmon resonant nanowires // Nano Letters. 2002. - V. 2. - P. 465-469.

319. Pham T., Jackson J.B., Halas N.J., Lee T.R. Preparation and characterization of gold nanoshells coated with self-assembled monolayers // Langmuir. 2002. - V. 18.-P. 4915-4920.

320. Ung T., Liz-Marzan L.M., Mulvaney P. Gold nanoparticle thin films // Colloids and Surfaces A. 2002. - V. 202. - P. 119-126.

321. Sun Y., Xia Y. Shape-controlled synthesis of gold and silver nanoparticles // Science. 2002. - V. 298. - P. 2176-2179.

322. Chen F., Xu G-Q., Hor T.S.A. Preparation and assembly of colloidal gold nanoparticles in CTAB-stabilized reverse microemulsion // Mater. Lett. 2003. -V. 4325.-P. 1-5.

323. Pan S.L., Chen M., Li I I.L. Aqueous gold sols of rod-shaped particles prepared by the template method // Colloids and Surfaces A. 2001. - V. 180. - P. 55-62.

324. Kinoshita T., Seino S., Okitsu K., Nakayama T., Nakagawa T., Yamamoto T.A. Magnetic evaluation of nanostructure of gold-iron composite particles synthesized by a reverse micelle method // J. Alloys Compounds. 2003. - V. 359. - P. 46-50.

325. Mallin M.P., Murphy C.J. Solution-phase synthesis of sub-10 nm Au-Ag alloy nanopartieles // Nano Lett. 2002. - V. 2. - P. 1235-1237.

326. Gardea-Torresdey J.L., Parsons J.G., Gomez E., Peralta-Videa J. Formation and growth of Au nanopartieles inside live alfalfa plants // Nanoletters. 2002. - V. 2.-P. 397-401.

327. Shankar C.S., Ahmad A., Pasricha R., Sastry M. Bioreduction of ehloroaurate ions by geranium leaves and its endophytic fungus yields gold nanopartieles of different shapes//J. Mater. Chem. 2003. - V. 143. - P. 1822-1826.

328. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман JT.А., Мельников А.Г. Оптические свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макромолекулами // Коллоидный журнал. 1995. - Т. 57. - С. 412-423.

329. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Щеголев С.Ю. Способ получения биоспецифических маркеров конъюгатов коллоидного золота // Патент РФ №2013374, 1994.

330. Goodman S., Hodges G., Livingston D. A review of the colloidal gold marker system // Scanning Electron. Microsc. 1980. - V. 2. - P. 133-154.

331. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Б.IL, Хлебцов Н.Г. Определение среднего размера и оценка полидисперсности наночастиц золота по спектрам поглощения и рассеяния света // Опт. и спектр. 2004. - Т. 96. - С. 139-147.

332. Berne B.J., Pecora R. Dynamic light scattering with application to chemistry, biology, and physics. N-Y: Dover Publ., 2002.

333. Клюбин B.B., Круглова Л.А., Сахарова H.А., Таллиер Ю.А. Измерение дисперсного состава латексов с помощью метода динамического рассеяния света // Коллоид, журн. 1990. - Т. 52. - С. 470-477.

334. Saraiva S.M., De Oliveira J.F. Control of particle size in the preparation of colloidal gold//J. Dispers. Sci. Technol. 2002. - V. 23. - P. 837-844.

335. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и дисперсионные системы. М.: Химия, 1989. - 464 с.

336. Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина Е.А. Коллоидная химия. М.: МГУ. -1982.-348 с.

337. Духин С.С., Дерягин Б.В. Электрофорез. М.: Наука, 1976.

338. Churaev N.V. The DLVO theory in russian colloid science // Adv. Colloid Interface Sci. 1999, - V. 83. - P. 19-32.

339. Goddard E.D., Vincent B. Polymer Adsorption and Dispersion Stability. -Washington: ACS Symp. Ser., 1984.

340. Mayer A.B.R., Mark J.E. Colloidal gold nanoparticles protected by cationic polyelectrolytes // Pure Appl. Chern. 1997. - V. 11. - P. 2151 -2164.

341. Shenton W., Davis S.A., Mann S. Directed self-assembly of nanoparticles into macroscopic materials using antibody-antigen recognition // Adv. Mater. 1999. -V. 11.-P. 449-452.

342. Dubois L.H., Nuzzo R.G. Synthesis, structure, and properties of model organic surfaces // Ann. Rev. Phys. Chem. 1992. - V. 43. - P. 437-467.

343. Lowe C.R Nanobiotechnology: The fabrication and applications of chemical and biological nanostructures // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. - V. 10. - P. 428434.

344. Letsinger R.L., Elghanian R., Viswanadham G., Mirkin C.A. Use of a steroid cyclic disulfide anchor in constructing gold nanoparticle-oligonucleotide conjugates // Bioconjugate Chem. 2000. - V. 11. - P. 289-291.

345. Li Z., Jin R.S., Mirkin С.Л., Letsinger R.L. Multiple thiol-anchor capped DNAgold nanoparticle conjugates // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - P. 15581562.

346. Ghosh S.S., Kao P.M., McCue A.W., Chappelle ILL. Use of maleimide-thiol coupling chemistry for efficient syntheses of oligonucleotide-enzyme conjugate hybridization probes // Bioconjugate Chem. 1990. - V. 1. - P. 71-76.

347. Storhoff J.J., Elghanian R., Mucic R.C., Mirkin C.A., Letsinger R.L. One-pot colorimetric differentiation of poly-nucleotides with single base imperfections using gold nano-particle probes // J. Am. Chem. Soc. 1998. - V. 120. - P. 19591964.

348. Horisberger М., Rosset J., Bauer Н. Colloidal gold granules as markers for cell surface receptors in the scanning electron microscopy // Experimentia. 1975. -V.31.-P. 1147-1151.

349. Lucocq J. Selective adsorption: A new method for purification of protein A-gold complexes // Microsc. Res. Techn. 1996. - V. 35. - P. 314-319.

350. Slot J.W., Geuze H.J. Sizing of protein A-colloidal gold probes for immunoelectron microscopy// J. Cell Biol. 1981. - V. 90. - P. 533-536.

351. Wang B.-L., Scopsi L., Nielsen M.H., Larsson L.-I. Simplified purification and testing of colloidal gold prodes // Histochem. 1985. - V. 83. - P. 109-115.

352. Siebrands Т., Giersig M., Mulvaney P., Fischer C.H. Steric exclusion chromatography of nanometer-sized gold particles // Langmuir. 1993. - V. 9. -P. 2297-2300.

353. Eck D., Helm C.A. Plasmon resonance measurements of the adsorption and adsorption kinetics of a biopolymer onto gold nanocolloids // Langmuir. 2001. -V. 17.-P. 957-960.

354. Lachapelle M., Aldrich H.C. Phalloidin gold complexes: A new tool for ultrastructural localization of F-actin // J. Histochem. Cytochem. - 1988. - V. 36. -P. 1197-1202.

355. Berg R.H., Erdos G.W., Gritzali M., Brown R.D. Enzyme-gold affinity labeling of cellulose // J. Electron Microsc. Tech. 1988. - V. 8. - P. 371-379.

356. Schmidt A.-C., Lambert A.-M. Characterization and dynamics of cytoplasmic F-actin in higher plant endosperm cells during interphase, mitosis and cytokinesis // J. Cell Biol. 1987. - V. 105. - P. 2157-2166.

357. Свиткина T.M. Организация цитоскелета эпителиальных клеток в культуре //Цитология. 1989.-Т. 31.-С. 1435-1440.

358. Lloyd C.W. The plant cytoskeleton: The impact of fluorescence microscopy // Annu. Rev. Plant Physiol. 1987. - V. 38. - P. 119-139.

359. Рихтер Т.Я., Грингауз O.K., Соколов О.И. Выявление и характер мечения F-актина маркером фаллоидин коллоидное золото // Цитология. - 1990. -Т. 32.-С. 1114-1119.

360. Дыкман JI.A., Богатырев В.А., Зайцева И.С., Соколова М.К., Иванов В.В., Соколов О.И. Использование конъюгатов коллоидного золота для идентификации актинов различного происхождения // Биофизика. 2002. -Т. 47. - С. 632-640.

361. Nakamura К., Takahashi К., Watanabe S. Myosin and actin from Escherichia coli K12 C600 // J. Biochem. 1978.-V. 84. - P. 1453-1458.

362. Neimark H.C. Extraction of an actin-like protein from the prokaryote Mycoplasma pneumoniae II PNAS. 1977. - V. - 74. - P. 4041-4045.

363. Molecular Interactions of Actin: Actin Structure and Actin-Binding Proteins / Eds. dos Remedios C.G., Thomas D.D. Berlin: Springer-Verlag, 2001.

364. Клесов A.A. Биохимия и энзимология гидролиза целлюлозы // Биохимия. -1990.-Т. 55.-С. 1731-1765.

365. Матвеев В.Ю., Богатырев В.А., Дыкман JI.A., Матора JI.IO., Шварцбурд Б.И. Физико-химические свойства клеточной поверхности R- и S-вариантов штамма Azospirillum brasilense II Микробиол. 1992. - Т. 61. - С. 645-651.

366. Чумаков М.И., Дыкман JI.A., Богатырев В.А., Курбанова И.В. Изучение внеклеточных структур агробактерий, участвующих в контактах с бактериальными и растительными клетками // Микробиол. 2001. - Т. 70. -С. 275-282.

367. Ponder B.A.J. Lectin histochemistry // In: Immunocytochemistry, practical applications in patology and biology / Eds. Polak J.M., Van Noorden S. -Bristol: J. Wright and Sons, 1983. P. 129-142.

368. Луцик А.Д., Детюк E.C., Луцик М.Д. Лектины в гистохимии. Львов: Выща школа, 1989. - 144 с.

369. Изучение и применение лектинов / Уч. зап. Тарт. ун-та. Тарту: Тарт. ун-т, 1989.-Вып. 869.-212с.

370. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Итальянская Ю.В., Пономарева Е.Г. Очистка и сравнение лектинов с клеточной поверхности активных и неактивных по гемагглютинации клеток азоспирилл // Биохимия. 1994. -Т. 59. - С. 656-662.

371. Sugimoto Т. Preparation of monodispersed colloidal particles // Adv. Colloid Interface Sei. 1987. - V. 28. - P. 65-108.

372. Longenberger L., Mills G. Formation of metal particles in aqueous-solutions by reactions of metal-complexes with polymers // J. Phys. Chem. 1995. - V. 99. -P. 475-478.

373. Teranishi Т., Miyake M. Size control of metal nanoparticles with aid of surface protection by polymer // Hyomen. 1997. - V. 35. - P. 439-452.

374. Hirai H., Nakao Y., Toshima N. Preparation of colloidal transition metals in polymers by reduction with alcohols or ethers // J. Macromol. Sei. Chem. -1979.-V. 13.-P. 727-750.

375. Spatz J.P., Mössmer, S., Möller M. Mineralization of gold nanoparticles in a block copolymer microemulsion // Chem.-Eur. J. 1996. - V. 12 - P. 1552-1555.

376. Esumi K., Susuki A., Aihara N., Usui K., Torigoe K. Preparation of gold colloids with UV irradiation using dendrimers as stabilizer// Langmuir. 1998. -V. 14.-P. 3157-3159.

377. Otsuka H., Akiyama Y., Nagasaki Y., Kataoka K. Quantitative and reversible lectin-induced association of gold nanoparticles modified with a-lactosyl-co-mercapto-poly(ethylene glycol) //J. Am. Chem. Soc. 2001. - V. 123. - P. 82268230.

378. Nuss S., Böttcher II., Wurm II., Hallensleben M.L. Gold nanoparticles with covalently attached polymer chains // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. - V. 40. -P. 4016-4018.

379. Kunz M.S., Shul K.R., Kellok A.J. Colloidal gold dispersions in polimeric matrices //J. Colloid Interface Sci. 1993. - V. 156. - P. 240-249.

380. Corbierre M.K., Cameron N.S., Sutton M., Mochrie S.G.J., Lurio L.B., Riihm A., Lennox R.B. Polymer-stabilized gold nanoparticles and their incorporation into polymer matrices // J. Am. Chem. Soc. 2001. - V. 123. - P. 10411 -10412.

381. Selvan S.T., Spatz J.P., Klock H.-A., Moller M. Gold-polypyrrole core-shell particles in diblock copolymer micelles // Adv. Mater. 1998. - V. 10. - P. 132134.

382. Siiman O., Burshteyn A. Formation of colloidal metal dispersions using aminodextrans as reductants and protective agents // US Patent № WO 93/15117.

383. Skutelsky E., Roth J. Cationic colloidal gold a new probe for the detection of anionic cell surface sites by electron microscopy // J. Histochem. Cytochem. -1986.-V. 34.-P. 693-696.

384. Дыкман Л.А., Ляхов A.A., Богатырев B.A., Щеголев С.Ю. Синтез коллоидного золота с применением высокомолекулярных восстановителей // Коллоидный журнал. 1998. - Т. 60. - С. 757-762.

385. Catt К.J., Tregear G.W. Solid-phase radioimmunoassay in antibody-coated tubes // Science. 1967. - V. 158. - P. 1570-1571.

386. Chessum B.S., Denmark J.R. Inconstant ELISA // Lancet. 1978. - V. 1. - P. 161.

387. Ilawkes R., Niday E., Gordon J. A dot immunobinding assay for monoclonal and other antibodies // Analyt. Biochem. 1982. - V. 119. - P. 142-147.

388. Tsang V.C.W., Peralta J.M., Simons A.R. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot techniques (ELISA) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis // Methods Enzymol. -1983.- V.92.-P.377 -391.

389. Towbin I I., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding current status and outlook // J. Jmmunol. Meth. - 1984. - V. 72. - P. 313-340.

390. Walton B.C., Pappas M.G., Sierra M., Hajkowski R., Jacson P.R., Custodio R. Field use of the Dot-ELISA test for human visceral leishmaniasis in Honduras // Bull. P.A.H.O. 1986. - V. 20. - P. 147-155.

391. Giannini S.H., Induction and detection of leishmanial infections in Rattus norvegicus II Trans. Roy. Trop. Med. Hyg. 1985. - V. 79. - P. 458-161.

392. Pappas M.G., Hajkowski R., Hockmeyer W.T. Dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA): A micro method for the rapid diagnosis of visceral leishmaniasis//J. Jmmunol. Meth. 1983. - V. 64. - P. 205-214.

393. Карулин А.Ю., Дзантиев Б.Б. Поливалентное взаимодействие АГ-АТ: теоретические модели и роль в иммуноанализе клеток // Ж. Всес. хим. о-ва. им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34. - С. 30-37.

394. Valle М., Munoz М., Kremer L., Valpuesta J.M., Martinez-A С., Carrascosa J.L., Albar J.P. Selection of antibody probes to correlate protein sequence domains with their structural distribution // Protein Sei. 1999. - V. 8. - P. 883889.

395. Larsson L.-I. A novel immunocytochemical model system for specificity and sensitivity screening of antisera against multiple antigens // J. Histochem. Cytochem. 1981. - V. 29. - P. 408-410.

396. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nutrocellulose sheets: Procedure and some application // PNAS. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

397. Мулдер M. Введение в мембранную технологию. Москва: Мир, 1999. -513 с.

398. Стародуб Н.Ф., Артюх В.П., Назаренко В.И., Коломиец Л.И. Белковый иммуноблот и иммунодот в биохимических исследованиях // Украинский биохимический журнал. 1987. - Т. 59. - С. 108-120.

399. Vaessen R.T.M.J., Kreike J., Groot G.S.P. Protein transfer to nitrocellulose filters // FEBS Lett. 1981. - V. 124. - P. 193-196.

400. Gourlet P., Svoboda M., Cauvin A., Christophe, J. The sensitivity of dot immunoassay for the peptides helodermin, PHI and PHM increases after peptide cross-linking to proteins prefixed on nitrocellulose // J. Immunol. Meth. 1990. -V. 133.-P. 151-157.

401. Добриков М.И., Тенетова Е.Д., Шишкин Г.В. Ковалентная иммобилизация белков на светочувствительных капроновых мембранах для твердофазного иммуноанализа// Биотехнология. 1991. - № 1. - С. 80-84.

402. Bowen B., Steinberg J., Laemmli U.K., Wientraub H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting // Nucl. Acid. Res. 1980. - V. 8. - P. 1-20.

403. Gershoni J.M., Palade G.E. Protein blotting: Principles and applications // Anal. Biochem. 1983. - V. 131. - P. 1-15.

404. Nonradioactive labeling and detection of biomolecules / Ed. Kessler C. Berlin: Springer-Verlag, 1992. 436 p.

405. Wirth P.J., Romano A. Staining methods in gel electrophoresis, including the use of multiple detection methods // J. Chromatogr. A. 1995. - V. 698. - P. 123-143.

406. Dunn M.J. Detection of proteins on blots using the avidin-biotin systems // Meth. Mol. Biol. 1994. - V. 32. - P. 227-232.

407. Härtig W., Kirazov L., Brückner G., Holzer M., Gärtner U., Bigl V. Blot analyses and immunocytochemistry of neural antigens with digoxigenylated primary and secondary antibodies // Brain Res. Protocols. 1997. - V. 2. - P. 3543.

408. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis//J. Mol. Biol. 1975. - V. 98. - P. 503-517.

409. Alwine J.C., Kemp D.J., Stark G.R. Method for detection of specific RNAs in agars gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes // PNAS. 1977. -V. 74. - P. 5350-5354.

410. Kurien B.T., Scofield R.H. Protein blotting: A review // J. Immunol. Meth. -2003.-V. 274.-P. 1-15.

411. Glass W.F., Briggs R.C., Hnilica L.S. Identification of tissue-specific nuclear antigens transferred to nitrocellulose// Science. 1981. - V. 211. - P. 70-72.

412. Bell M.L., Engvall E. The specific detection of collagenous proteins after electrophoresis using enzyme-conjugated collagen-binding fibronectin fragments // Anal. Biochem. 1982. - V. 123. - P. 329-335.

413. Jahn L., Schiebler B., Greengard P. A quntitative dot-immunobinding assay for proteins using nitrocellulose membrane filtres // PNAS. 1984. - V. 81. - P. 1684-1687.

414. Brada D., Roth J. «Golden blot»-detection of polyclonal and monoclonal antibodies bound to antigens on nitrocellulose by protein A gold complexes // Anal. Biochem. - 1984. - V. 142. - P. 79-83.

415. Moeremans M., Daneles G., van Dijck A., Langanger G., de Mey J. Sensitive visualization of antigen-antibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and immunogold/silver staining // J. Immunol. Meth. -1984.-V. 74. P. 353-360.

416. Surek B., Latzko E. Visualization of antigenic proteins blotted onto nitrocellulose using the immuni-gold-staining (IGS)-method // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. - V. 121. - P. 284-289.

417. Hsu Y.-I I. Immunogold for detection of antigen on nitrocellulose paper // Anal. Biochem. 1984. - V. 142. - P. 221-225.

418. Moeremans M., Daneels G., de Raeymaeker M., de Mey J. Colloidal metal staining of blots // In: Handbook of Immunoblotting of Proteins, V. I / Eds. Bjerrum O.J., Heegaard N.H.H. Orlando: CRC Press, 1988. - P. 137-144.

419. Rohringer R. Detection of proteins with colloidal gold // In: Colloidal Gold: Principles, Methods and Applications / Ed. Hayat M.A. San Diego: Academic Press, 1989.-V. l.-P. 396-410.

420. Fowler S.J. The detection of proteins on blots using gold or immunogold. Review // Methods Mol. Biol. 1994. - V. 32. - P. 239-255.

421. Moeremans M., Daneels G., De Mey J. Sensitive colloidal metal (gold or silver) staining of protein blots on nitrocellulose membranes // Anal. Biochem. 1985. -V. 145.-P. 315-321.

422. Daneels G, Moeremans M., De Raeymaeker M., De Mey J. Sequential immunostaining (gold/silver) and complete protein staining (AuroDye) on western blots // J. Immunol. Meth. 1986. - V. 89. - P. 89-91.

423. Egger D., Bienz K. Colloidal gold staining and immunoprobing of proteins on the same nitrocellulose blot // Anal. Biochem. 1987. - V. 166. - P. 413-417.

424. Schapira A.H.V., Keir G. Two-dimensional protein mapping by gold stain and immunoblotting// Anal. Biochem. 1988.-V. 169. - P. 167-171.

425. Jamaguchi K., Asakawa H. Preparation of colloidal gold for staining proteins electrotransferred onto nitrocellulose membranes // Anal. Biochem. 1988. - V. 172.-P. 104-107.

426. Egger D., Bienz K. Protein (Western) blotting // Mol. Biotechnol. 1994. - V. 1. - P. 289-305.

427. Li K.W., Geraerts W.P., van Elk R., Joosse J. Quantification of proteins in the subnanogram and nanogram range: Comparison of the AuroDye, FerriDye, and India ink staining methods // Anal. Biochem. 1989. - V. 182. - P. 44-47.

428. Cheley S., Bayley H. Assaying nanogram amounts of dilute protein // Biotechniques. 1991. - V. 10. - P. 730-732.

429. DotMETRIC Protein assay // CHEMICON Communications Update. 1998. -V. 8.-P. 12.

430. Casero P., Del Campo, G.B., Righetti P.G. Negative aurodye for Polyacrylamide gels: The impossible stain // Electrophoresis. 1985. - V. 6. - P. 367-372.

431. Saman E. A simple and sensitive method for detection of nucleic acids fixed on nylon-based filters // Gene Anal. Technol. 1986. - V. 3. - P. 1-7.

432. Jones G.L., Bailey J.A., O'Connell R.J. Sensitive staining of fungal extracellular matrices using colloidal gold // Mycol. Res. 1995. - V. 99. - P. 567-573.

433. Juurlink B.H., Devon R.M. Colloidal gold as a permanent marker of cells // Experientia. 1991. - V. 47. - P. 75-77.

434. Poulain D., Ayadi A., Fruit J. Detection d'un antigene temoin d'infection systemique a Candida a l'aide d'un anticorps monoclonal couple a l'or colloidal // Ann. Biol. Clin. 1987. - V. 45. - P. 565-572.

435. Seitz J. Karenzin a hormone dependent secretary protein of the rat seminal vesicle with actin-binding properties // Hoppe-Seyler's Z. Biol. Chem. - 1987. -Bd. 368. - S. 442-447.

436. Li W.P., Zuber C., Roth J. Use of Phaseolus vulgaris leukoagglutinating lectin in histochemical and blotting techniques: A comparison of digoxigenin and biotin labelled lectins // Histochemistry. 1993. - V. 100. - P. 347-356.

437. Nespolo A., Bianchi G., Salmaggi A., Lazzaroni M., Cerrato D., Tajoli L.M. Immunoblotting techniques with picogram sensitivity in cerebrospinal fluid protein detection// Electrophoresis. 1989. - V. 10. - P. 34-40.

438. Tomlinson S., Luga A., Huguenel E., Dattagupta N. Detection of biotinylated nucleic acid hybrids by antibody-coated gold colloid // Anal, biochem. 1988. -V. 171.-P. 217-222.

439. Righetti P.G., Casero P., Del Campo, G.B. Gold staining in cellulose acetate membranes//Clin. Chim. Acta. 1986.-V. 157.-P. 167-171.

440. Poor M.L., Santa P.F., Sittampalam G.S. Visualization of multiple protein bands on the same nitrocellulose membrane by double immunoblotting // Anal. Biochem. 1988. - V. 175. - P. 191-195.

441. Steffen W., Linck R.W. Multiple immunoblot: A sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica // Electrophoresis. 1989. - V. 10. - P. 714-718.

442. Raoult D., Dasch G.A. The line blot: An immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gram-negative bacteria // J. Immunol. Meth. 1989. - V. 125. - P. 57-65.

443. Petchclai B., Hiranras S., Potha U. Gold immunoblot analysis of IgM-specific antibody in the diagnosis of human leptospirosis // Am. J. Trop. Med. Hyg. -1991.-V. 45.-P. 672-675.

444. Scott J.M., Shreffler W.G., Ghalib H.W., el Asad A., Siddig M., Badaro R., Reed S.G. A rapid and simple diagnostic test for active visceral leishmaniasis // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1991. - V. 44. - P. 272-277.

445. Liu Y.S., Du W.P., Wu Z.X. Dot-immunogold-silver staining in the diagnosis of cysticercosis // Int. J. Parasitol. 1996. - V. 26. - P. 127-129.

446. Liu Y.S., Du W.P., Wu Y.M., Chen Y.G., Zheng K.Y., Shi J.M., Hu X.Z., Li G.Y., You C.F., Wu Z.X. Application of dot-immunogold-silver staining in the diagnosis of clonorchiasis//J. Trop. Med. Hyg. 1995. - V. 98. - P. 151-154.

447. Chu F., Ji Q., Yan R.-M. Study on using colloidal gold immuno-dot assay to detect special antibody of hemorrhagic fever renal syndrome // Chinese journal of integrated traditional and western medicine. 2001. - V. 21. - P. 504-506.

448. Dar V.S., Ghosh S., Broor S. Rapid detection of rotavirus by using colloidal gold particles labeled with monoclonal antibody // J. Virol. Meth. 1994. - V. 47.-P. 51-58.

449. Fernandez D., Valle I., Llamos R., Guerra M., Sorell L., Gavilondo J. Rapid detection of rotavirus in feces using a dipstick system with monoclonal-antibodies and colloidal gold as marker // J. Virol. Meth. 1994. - V. 48. - P. 315-323.

450. Yee J.L., Jennings M.B., Carlson J.R., Lerche N.W. Л simple, rapid immunoassay for the detection of simian immunodeficiency virus antibodies // Lab. Anim. Sci. 1991. - V. 41. - P. 119-122.

451. Reboli A.C. Diagnosis of invasive candidiasis by a dot immunobinding assay for Candida antigen-detection//J. Clin. Microbiol. 1993. - V. 31. - P. 518-523.

452. Poulain D., Mackenzie D.W., Van Cutsem J. Monoclonal antibody-gold silver staining dot assay for the detection of antigenaemia in candidosis // Mycoses. -1991.-V. 34.-P. 221-226.

453. Vera-Cabrera L., Rendon A., Diaz-Rodriguez M., Handzel V., Laszlo A. Dot blot assay for detection of antidiacyltrehalose antibodies in tuberculous patients // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999. - V. 6. - P. 686-689.

454. Kunakorn M., Petchclai В., Khupulsup K., Naigowit P. Gold blot for detection of immunoglobulin M (IgM)- and IgG-specific antibodies for rapid serodiagnosis of melioidosis // J. Clin. Microbiol. 1991. - V. 29. - P. 20652067.

455. Huang Q., Lan X., Tong Т., Wu X., Chen M., Feng X., Liu R., Tang Y., Zhu Z. Dot-immunogold filtration assay as a screening test for syphilis // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34. - P. 2011-2013.

456. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Использование специфических антител, меченных частицами коллоидного золота, для обнаружения антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа // ЖМЭИ. 1998. - К» 6. - С. 64-69.

457. Xu Z. Immunogold dot assay for diagnosis of early pregnancy // Chung Hua I Hsueh Tsa Chili (Taipei). 1992. - V. 72. - P. 216-218.

458. Matsuzawa S., Kimura H., Itoh Y., Wang II., Nakagawa Т. A rapid dot-blot method for species identification of bloodstains // J. Forensic Sci. 1993. - V. 38. - P. 448-454.

459. Walker A.G., Dawe K.I. The rapid and sensitive enumeration of antibody-secreting cells using immunogold/silver staining (SIG-blot assay) // J. Immunol. Meth. 1987. - V. 104. - P. 281-283.

460. Smithwick E.B., Young L.G. Solid-phase indirect immunogold localization of human sperm antigens reacting with antisperm antibodies in human sera // J. Androl. 1990. - V. 11. - P. 246-254.

461. Hatakeyama Т., Murakami K., Miyamoto Y., Yamasaki N. An assay for lectin activity using microtiter plate with chemically immobilized carbohydrates // Anal. Biochem. 1996. - V. 237. - P. 188-192.

462. Vazquez S., Lemos G., Pupo M., Ganzon O., Palenzuela D., Indart A., Guzman M.G. Diagnosis of Dengue virus infection by the visual and simple AuBioDOT immunoglobulin M capture system // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. - V. 10.-P. 1074-1077.

463. Kaur R., Raje M. A solid-phase method for evaluation of gold conjugate used in quantitative detection of antigen by immunogold-labeling electron microscopy // J. Immunol. Meth. 2003. - V. 279. - P. 33-40.

464. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Перспективы использования коллоидного серебра как маркера в иммуноанализе // Сибирь-Восток.-2002.-Вып. 3 (51).-С. 10-12.

465. Han A., Dufva М., Belleville Е., Christensen C.B.V. Detection of analyte binding to microarrays using gold nanoparticle labels and a desktop scanner // Lab. Chip. 2003. - V. 3. - P. 329-332.

466. Long G.W., O'Brien T. Antibody-based systems for the detection of Bacillus anthracis in environmental samples // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 87. - P. 214.

467. Bird C.B., Miller R.L., Miller B.M. Reveal for Salmonella test system // J. AOAC Int. 1999. - V. 82. - P. 625-633.

468. Escalante H.A., Huamanchay O.C., Davelois K.A. La inmunocromatografia para el diagnóstico de la infección por Taenia solium en Mesocricetus auratus mediante la detección de coproantígenos // Rev. Med. Exp. 2001. - V. 18. - P. 57-62.

469. Shyu R.H, Shyu II.F., Liu H.W., Tang S.S. Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin // Toxicon. 2002. - V. 40. -P. 255-258.

470. Chanteau S., Rahalison L., Ralafiarisoa L., Foulon J., Ratsitorahina M., Ratsifasoamanana L., Carniel E., Nato F. Development and testing of a rapid diagnostic test for bubonic and pneumonic plague // Lancet. 2003. - V. 361. -P. 211-216.

471. Grobusch M.P., Schormann D., Schwenke S., Teichmann D., Klein E. Rapid immunochromatographic assay for diagnosis of tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36. - P. 3443.

472. Glynou K., Ioannou P.C., Christopoulos Т.К., Syriopoulou V. Oligonucleotide-functionalized gold nanoparticles as probes in a dry-reagent strip biosensor for DNA analysis by hybridization // Anal. Chem. 2003. - V. 75. - P. 4155-4160.

473. Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Попов В.О., Венгеров Ю.Ю., Старовойтова Т.А., Тогузов Р.Т. Системы экспрессной иммунодетекции биологически активных соединений // Клин. лаб. диагн. 2002. - № 8. - С. 25-32.

474. Millipore's short guide for developing immunochromatographic test strips. -Bedford: Millipore Corporation, 1999. 42 p.

475. Cho J.-H., Pack S.-H. Semiquantitative, bar-code version of immunochromatographic assay system for human serum albumin as model analyte // Biotechnol. Bioengineer. 2001. - V. 75. - P. 725-732.

476. Liang R., Emerich D.W. Analysis of lectin binding by Bradyrhizobiwn japonicum strains grown on nitrocellulose filters using peroxidase-labelled lectin // Anal. Biochem. 1987. - V. 164. - P. 488-493.

477. Achacha M., Mittal K.R. Rapid identification of porcine Serpulina species by colony blot assay using a genus-specific monoclonal antibody // Vet. Rec. -1996.-V. 139.-P. 539-41.

478. Богатырев В. А., Дыкман JT. А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота в серотипировании азоспирилл // Микробиология. 1991. - Т. 60. - С. 524529.

479. Leammli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

480. Hitchcock P.J., Brown J. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // J. Bacteriol. 1983. - V. 154. - P. 269-277.

481. Peridas G., Plagens U., Traub P. Protein transfer from fixed, stained, and dried polyacrylamide gels and immunoblot with protein A-gold // Anal. Biochem. -1986.-V. 152.-P. 94-99.

482. Moeremans M., Daneels G., de Raeymaeker M., de Mey J. Staining method for protein and nucleic acids // European Patent № 0165633, 1985.

483. Jeppesen M.A., Barlow R.B. Determination of particle size of colloidal gold from absorption spectra//J. Opt. Soc. Am. 1962. - V. 52. - P. 99-101.

484. Behnke O., Ammitzboll Т., Jessen I I., Klokker M., Tranun-Jensen J., Olsson L. Non-specific binding of protein-stabilized gold sols as a source of error in immunocytochemistry// Eur. J. Cell Biol. 1986. - V. 41. - P. 326-338.

485. Hunter J.В., Hunter S.M. Protein assay in the low nanogram range by AuroDye staining//Anal. Biochem. 1987. - V. 164. - P. 430-433.

486. O'Toole D.K. The toluidine blue-membrane filter method: Absorption spectra of toluidine blue stained bacterial cells and the relationship between absorbance and dry mass of bacteria// Stain Techn. 1983. - V. 58. - P. 291-298.

487. Roach P.D., Zollinger M., Noel S.P. Detection of the low density lipoprotein (LDL) receptor on nitrocellulose paper with colloidal gold-LDL conjugates // J. Lipid Res. 1987. - V. 28. - P. 1515-1521.

488. Tarlton J.F., Knight. P.J. Comparison of reflectance and transmission densitometry, using document and laser scanners, for quantitation of stained Western blots//Anal. Biochem. 1996. - V. 237. - P. 123-128.

489. Чибисов К.И. Общая фотография. Москва: Искусство, 1984.

490. Картужанский A.JL, Красный-Адмони J1.B. Химия и физика фотографического процесса. Ленинград: Химия, 1986.

491. Van Beek L.K.H. Special properties of physical development process // J. Photogr. Sci. Eng. 1976. - V. 20. - P. 88-91.

492. Danscher G. Localization of gold in biological tissue. A photochemical method for light and electron microscopy// Histochemistry. 1981. - V. 71. - P. 81-88.

493. James Т.Н. The Theory of the Photographic Process. N-Y.: Macmillan, 1977.

494. Scopsi L. Silver-enhanced colloidal gold method // In: Colloidal Gold: Principles, Methods and Applications / Ed. Hayat M.A. San Diego: Academic Press, 1989.-V. l.-P. 251-295.

495. Lageman A., Buchheim P. Die Gold-Silber-Technik ein neues immunohistochemisches Verfahren zum Naclnveis von Zellmembranantigenen // Acta I-Iistochem. - 1985. - Bd. 76. - S. 113-120.

496. Noppe M.J.M., Konigs F.J. Method for depositing metal particles on a marker // European patent № 0293947, 1990.

497. Skutelsky E., Goyal V., Alroy J. The use of avidin-gold complex for light microscopic localization of lectin receptors // Histochemistry. 1987. - V. 86. -P. 291-295.

498. Hacker G.W., Polak J.M., Springall D.R., Tang S.-K., van Noorden S., Lackie P.M., Grimelius L., Flucher В., Adam H. Immunogold-silver sataining (IGSS) -a review // Mikroskopie (Vienna). 1985 - Bd. 42. - S. 318-325.

499. Кацы Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями. -Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. 172 с.

500. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. -Саратов: Слово, 2001. 256 с.

501. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. Intern. Symp. on N2-Fixation / Eds. Newton E., Nijman C.J. Washington: Pullman, 1976.-P. 518-538.

502. Eichhorn M. Offene Fragen bei der Azospirillum-Vlalbsymhiosc mit Pflanzen // Biol. Rundsch. 1989. - Bd. 27. - S. 204-205.

503. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-phnt relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43. - P. 103-121.

504. Krieg N.R., Dobereiner J. Genus Azospirillum (Tarrand, Krieg and Dobereiner, 1979) // In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Krieg N.R., Holt J.G. Baltimore/London: Williams & Wilkins, 1984. - P. 94-104.

505. Okon Y., Labandera-Gonzales С.Л. Agronomic application of Azospirillum: An evaluation of 20 years worldwide field inoculation // Soil Biol. Biochem. 1994. - V. 26.-P. 1591-1601.

506. Чумаков М.И., Емцев B.T. Формирование азотфиксирующей ассоциации бактерий с небобовыми растениями // Сельскохоз. биол. 1988. - № 6. - С. 50-57.

507. De Maagd R.A., Lugtenberg В. Outer membranes of Gramnegative bacteria // Biochem. Soc. Transaction. 1987. - V. 15. - P. 54-62.

508. Hernalsteens J.-P. The Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid as a host vector system for introducing foreign DNA in plant cell // Nature. 1980. - V. 287. - P. 654-656.

509. Kunik Т., Tzfira Т., Kapulnik Y., Gafni Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium II PNAS. 2001. - V. 98. - P. 1871-1876.

510. Kerr A. The genus Agrobacterium II In: The Procaryotes / Eds. Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K.-H. Berlin: Springer-Verlag, 1992.-P. 2214-2235.

511. Smit G., Kijne J., Lugtenberg B. Roles of flagella, lipopolysaccharide, and Ca2+-dependent cell surface protein in attachment of Rhizobium leguminosarum biovar viciae to pea root hair tips // J. Bacterid. 1989. - V. 171. - P. 569-572.

512. Wolpert J.S., Albertshen P. Host-symbiont interactions. 1. The lectins of legumes interact with the O-antigen containing lipopolisaccharides of their simbiont Rhizobia II Biochem. Biophys. Res. Comm. 1976. - V. 70. - P. 729

513. Huber Т.Л., Agarwal А.К., Keister D.L. Extracellular polysaccharide composition, ex planta nitrogenase activity, and DNA homology in Rhizobiwn japonicum //J. Bacteriol. 1984. - V. 158. - P. 1168-1171.

514. Whatley M.H., Godwin J.S., Lippincott B.B. Lippincott J.A. Role for Agrobacterium cell envelope lipopolisaccharides in infection site attachment // Infect. Immun. 1976. - V. 13. - P. 1080-1083.

515. Matthysse A.G., Wyman P.M., Holmes K.V. Plasmid-dependent attachment of Agrobacterium tumifaciens to plant tissue culture cells // Infect. Immun. 1978. - V. 22. - P. 516-522.

516. Lugtenberg В., van Aphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other Gram-negative bacteria // Biochem. Biophis. Acta. 1983. - V. 737. - P. 51-115.

517. Громов Б.В. Строение бактерий. JL: Изд-во Ленингр. ун-та, 1985. - 190 с.

518. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М: Мир, 1984.-479 с.

519. Biilow J.F.M. von, Dobereiner J. Potential for nitrogen fixation in maize genotypes in Brazil // PNAS. 1975. - V. 72. - P. 2389-2393.

520. De Polli H., Bohlool B.B., Dobereiner J. Serological differentiation of Azospirillum species belonding to different host-plant specificity groups // Arch. Microbiol. 1980. - V. 36. - P. 217-222.

521. Bohlool В.В., Schmidt Е. The immunofluorescence approach in microbial ecology // In: Advanced in Microbial Ecology / Ed. Alexander M. N.-Y.: Academic Press, 1980. - P. 203-241.

522. Schloter M., Aßmus В., Hartman A. The use of immunological methods to detect and identify bacteria in the environment // Biotechnol. Adv. 1995. - V. 13.-P. 75-90.

523. Kirchhof G., Schloter M., Aßmus В., Hartman A. Molecular microbial ecology approaches applied to diazotrophs associated with non-legumes // Soil Biol. Biochem. 1997. - V. 29. - P. 853-862.

524. Levanony H., Bashan Y. Localization of specific antigens of Azospirillwn brasilense Cd in its exopolysaccharide by immuno-gold staining technique // Curr. Microbiol. 1989. - V. 18. - P. 145-149.

525. Матора JT.IO., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillwn brasilense II Микробиология. 1998. - T. 67. - С. 815-820.

526. Ramos A., Zavala F., Hoecker G. Immune response to glutaraldehyde-treated cells. I. Dissociation of immunological memory and antibody production // Immunology. 1979. - V. 36. - P. 775-780.

527. Makinde A.A., Molokwu J.U., Ezeh A.O. Humoral antibody response to glutaraldehyde-treated antigens of Dermatophilus congolensis II Vet. Q. 1986. - V. 8.-P. 145-149.

528. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Inoculation of field-grown wheat (Triticwn aestivwn) with Azospirillwn sp. // Brasil. Biol. Fertil. Soils. 1987. -V. 4. - P. 37-40.

529. Schloter M., Bode W., Hartmann A. Characterization of monoclonal antibodies against cell surface structures of Azospirillum brasilense Sp 7 using ELISA techniques // Symbiosis. 1992. - V. 13. - P. 37-45.

530. Матора JI.IO., Щеголев C.IO. ' Антигенная идентичность липополисахаридов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brasilense II Микробиол. 2002. - Т. 71. - С. 211 -214.

531. Matthysse A.G. Role of bacterial cellulose fibrils in Agrobacterium tumefaciens infection // J. Bacteriol. 1983. - V. 154. - P. 906-915.

532. Michiels K.W., Vanderleyden J., Van GoolA.P., Singer E.R. Isolatin and characterizatin of Azospirillum brasilense loci that correct Rhizobium meliloti exo В and exo С mutations // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 5401-5404.

533. Милько E.C., Егоров H.C. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. М.: Изд-во МГУ, 1991. - 142 с.

534. Матвеев В.Ю., Петрова Л.П., Журавлева Е.А., Панасенко В.И. Особенности диссоциации в культурах Azospirillum brasilense Sp 7 // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1987. - № 8. - С. 16-18.

535. Bastarrahea F., Zamudio М., Rivas R. Non-encapsulated mutants of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II Can. J. Microbiol. 1988. - V. 34. - P.25-28.

536. Обухова Н.А., Колесников А.А., Маслов Д.А., Резепкина JI.A., Милько Е.С. Некоторые физико-химические свойства ДНК умеренного фага и возможное влияние его на изменчивость Mycobacterium lacticolum II Микробиол. 1985. - Т. 54. - С. 641-646.

537. Del Gallo М., Negi М., Neyra С.А. Calcofluor and lectin binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P.3504-3510.

538. Fisher J.M.C., Peterson C.A., Bols N.C. A new fluorescenty test for cell vitality using calcofluor white MR2 // Stain techn. 1985. - V. 60. - P. 116-121.

539. Matthysse A.G., Holmes K.V., Gurlitz H.G. Elaboration of cellulose fibrils by Agrobacterium tumefaciens during attachment to carrot cells // J. Bacteriol. -1981.-V. 145. P.583-595.

540. De Troch P., Michiels K., Philip-Hollingswonth S., Dazzo F., Vanderleyden J. Analysis of Azospirillum brasilense exopolysaccharides // V-th Int. Symp. N2-fixation with non-legumes. Florence, Itali, 1990. P. 129.

541. Choma A., Russa R., Mayer H., Lorkiewisz Z. Chemical analysis of Azospirillum lipopolysaclmrides // Arch. Microbiol. 1987. - V. 146. - P. 341345.

542. Fett W.F. Relationship of bacterial cell surface hydrophobicity and charge to pathogenicity, physiologic race, and immobilization in attached soybean leaves // Phitopat. 1985. - V. 75. - P. 1414-1418.

543. Dillon J.K., Fuerst J.A., Hayword A.C., Davis G.H.G. A comparison of the five methods for assaying bacterial hydrophobicity // J. Microbiol. Meth. 1986. - V. 6.-P. 13-19.

544. Сингуров A.10. Разделение клеточных суспензий в двухфазных системах // Цитол. 1984. - Т. 26. - С. 836-867.

545. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense II Микробиол. 2003. - Т. 72. - С. 60-63.

546. Zupan J.R., Zambryski Р.С. Transfer of T-DNA fron Agrobacieriuni to the plant cell I I Plant Physiol. 1995. - V. 107. - P. 1041-1047.

547. Соловова Г.К., Кривопалов Ю.В., Беликов В.А., Чумаков М.И. Прикрепление Agrobacieriuni radiobacter 5D-1 к корням пшеницы // Микробиол. 1995. - Т. 64. - С. 623-630.

548. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg B.J.J. Correlation between extracellular fibrils and attachment of Rhizobium leguminosarum to Pea root hair tips // J. Bacteriol. 1986.-V. 168.-P. 821-827.

549. Blanton R.L. Prestalk cells in monolayer cultures exhibit two distinct modes of cellulose synthesis during stalk cell differentiation in Dictyostelium II Development. 1993. - V. 119. - P. 703-710. ,

550. Егоренкова И.В., Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Дыкман JI.A., Игнатов В.В. Роль полнсахарндсодержащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense в адсорбции бактерии на корнях проростков пшеницы // Микробиол. 2001. - Т. 70. - С. 45-50.

551. Matora L.Yu., Sumaroka M.V., Dykman L.A., Serebrennikova О.В., Shchyogolev S.Yu. Revealing a cap on the polar flagellum of Azospirillum brasilense Sp 245 // 12-th Int. Congress on Nitrogen Fixation. Parana, Brazil, Sept. 12-17, 1999.-P. 99.

552. Тимофеева Г.А., Цинзерлинг А.В. Острые кишечные инфекции у детей. -Л.: Медицина, 1984. 304 с.

553. Petrov R.V., Khaitov R.M., Sidorovich I.G., Pavlikov S.P., Nikolaeva I.A., Ivachenko M.E., Andreev S.M., Sklyarov L.Yu. The use от synthetic peptides in the diagnosis of HIV-infections // Biomed. Sci. 1990. - V. 1. - P. 239-244.

554. Володарский А.Д., Курушина И.В., Романовская О.И. Антигенный состав клеток апикальной меристемы ржи при торможении у нее ростовых процессов этефоном // Физиология растений. 1986. - Т. 33. - С. 116-121.

555. Фещенко В.В., Евсеева Н.В., Подольный В.З., Володарский А.Д. Исследование функционального состояния апикальных меристем упшепиц, различающихся по реакции на длинный и короткий световой день // Доклады РАИ. 1992. - Т. 327. - С. 284-288.

556. Gondie R., Hörne C., Wilkinson P. A simple method for producing antibody specific to a single selected diffusible antigen // Lancet. 1966. - V. 3. - P. 1224.

557. Steinbuch M., Audran R. The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid // Arch. Biochem. Biophys. 1969. - V. 134. - P. 279-284.

558. Li C.-Y., Ziesmer S.C., Lazcano-Villareal O. Use of azide and hydrogen peroxide as an inhibitor for endogenous peroxidase in the immunoperoxidase method //J. Histochem. Cytochem. 1987. - V. 35. - P. 1457-1460.

559. Nessel A., Müder M. Über die physiologische Bedeutung der Peroxidase-Isoenzymgruppen des Tabaks anhand einiger biochemischer Eigenstanden // Ztschr. Pflanzenphysiol. 1977. - Bd. 82. - S. 235-240.

560. Кривченко В.И. Устойчивость зерновых колосовых к возбудителям головневых болезней. М.: Колос, 1984. - 304 с.

561. Вандерпланк Я. Генетические и молекулярные основы фитопатогенеза. -М.: Мир, 1981.-232 с.

562. Уритани И. Биохимические подходы к основополагающим принципам поражения растений болезнями // В: Инфекционные болезни растений:физиологические и биохимические основы / Под ред. Дьякова Ю.Т. М.: Агропромиздат, 1985. - С. 347-346.

563. Werres S., Steffens С. Immunological techniques used with fungal plant pathogens: Aspects of antigens, antibodies and assays for diagnosis // Ann. Appl. Biol. 1994. - V. 125. - P. 615-643.

564. Кривченко В.И., Бабий B.C., Гаврилюк О.Ф. Анализ солерастворимых фракций белков рас возбудителя пыльной головни и сортов пшеницы при их заражении // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. -1971.-Т. 43.-С. 60-65.

565. Страхов Т.Д., Ярошенко T.B., Федосеева З.Н. Вопросы патогенеза и иммуногенеза головневых заболеваний зерновых культур. Харьков: Вища школа, 1981.- 176 с.

566. Ямалеев A.M., Валиева В.Д., Трошина Н.Б. Цитофотометрическое содержание ДНК в клетках корней растений пшеницы, зараженных твердой головней // Сельсхоз. биол. 1985. - №. 12. - С. 49-51.

567. Banowetz G.M., Trione E.J., Krygier B.B. Immunological comparisons of teliospores of two wheat bunt fungi, Tilletia species, using monoclonal antibodies and antisera//Mycologia. 1984. - V. 76. - P. 51-62.

568. Cole L., Hawes C., Dewey M. Immunocytochemical localization of a specific antigen in cell walls of Pénicillium islandicum 11 Micol. Res. 1991. - V. 95. - P. 1369-1374.

569. Marchall M., Gull K., Jeffries F. Monoclonal antibodies as probes for fungal wall structure during morphogenesis // Micribiol. 1997. - V. 143. - P. 22552265.

570. Leuvering J.H.W., Thai P.J.H.M., van der Waart M., Schuurs A.II.W.M. Sol particle immunoassay (SPIA)//J. Immunoassay. 1980. - V. 1. - P. 77-91.

571. Leuvering J.H.W., Thai P.J.H.M., van der Waart M., Schuurs A.H.W.M. A sol particle agglutination assay for human chorionic gonadotrophin // J. Immunol. Meth. 1981. - V. 45. - P. 183-194.

572. Leuvering J.H.W., Coverde B.C., Thai P.J.ILM., Schuurs A.H.W.M. A homogeneous sol particle immunoassay for human chorionic gonadotrophin using monoclonal antibodies // J. Immunol. Meth. 1983. - V. 60. - P. 9-23.

573. Leuvering J.H.W., Thai P.J.H.M., Schuurs A.H.W.M. Optimization of a sandwich sol particle immunoassay for human chorionic gonadotrophin // J. Immunol. Meth. 1983. - V. 62. - P. 175-184.

574. Gribnau T.J.C., Leuvering J.H.W., van Hell H. Particle-labelled immunoassays. A review//J. Chromatogr. 1986. - V. 176. - P. 175-179.

575. Van Hell H., Leuvering J.H.W., Gribnau T.J.C. Particle immunoassays // In: Alternative Immunoassays / Ed. Collins W.P. Chichester: Wiley, 1985. - P. 3958.

576. Decider A.M., Dozy M.H. Applicability of sol particle immunoassay (SPIA) for detection of Schistosoma mansoni circulating antigens // Acta Leiden. 1982. -V. 48.-P. 17-22.

577. Wielaard F., Denissen A., van der Veen L., Rutjes I. A sol-particle immunoassay for determination of anti-rubella antibodies. Development and clinical validation //J. Virol. Meth. 1987.-V. 17.-P. 149-158.

578. Martin J.M.C., Paques M., van der Velden-de Groot T.A., Beuvery E.C. Characterization of antibody labeled colloidal gold particles and their applicability in a sol particle immunoassay (SPIA) // J. Immunoassay. 1990. -V. 11.-P. 31-47.

579. Van Erp R., Gribnau T.J.C., van Sommeren A.P., Bloemers H.P. Application of a sol particle immunoassay to the determination of affinity constant of monoclonal antibodies // J. Immunoassay. 1991. - V. 12. - P. 425-443.

580. Zeisler R., Stone S.F., Viscidi R.P., Cerny E.H. Sol particle immunoassays using colloidal gold and neutron activation // J. Radioanal. Nucl. Chem. 1993. - V. 167.-P. 445-452.

581. Tanaka M., Matsuo K., Enomoto M., Mizuno K. A sol particle homogeneous immunoassay for measuring serum cystatin C // Clin. Biochem. 2004. - V. 37.- P. 27-35.

582. Thanh N.T.K., Rosenzweig Z. Development of an aggregation-based immunoassay for anti-protein A using gold nanoparticles // Anal. Chem. 2002.- V. 74.-P. 1624-1628.

583. Sakashita H., Tomita A., Umeda Y., Narukawa H., Kishioka H., Kitamori T., Sawada T. Homogeneous immunoassay using photothermal beam deflection spectroscopy//Anal. Chem. 1995. - V. 67. - P. 1278-1282.

584. Thanh N.T.K., Rees J.H., Rosenzweig Z. Laser-based double beam absorption detection for aggregation immunoassays using gold nanoparticles // Anal. Bioanal. Chem. 2002. - V. 374. - P. 1174-1178.

585. Zhang C.X., Zhang Y., Wang X., Tang Z.M., Lu Z.H. Hyper-Rayleigh scattering of protein-modified gold nanoparticles // Anal. Biochem. 2003. - V. 320. - P. 136-140.

586. Benecky M.J., Post D.R., Schmitt S.M., Kochar M.S. Detection of hepatitis B surface antigen in whole blood by coupled particle light scattering (Copalis) // Clin. Chem. 1997. - V. 43. - P. 1764-1770.

587. Englebienne P. Use of colloidal gold surface plasmon resonance peak shift to infer affinity constants from the interactions between protein antigens and antibodies specific for single or multiple epitopes // Analyst. 1998. - V. 123. -P. 1599-1603.

588. Englebienne P., van Hoonacker A., Valsamis J. Rapid homogeneous immunoassay for human ferritin in the Cobas Mira using colloidal gold as the reporter reagent // Clin. Chem. 2000. - V. 46. - P. 2000-2003.

589. Englebienne P., van Hoonacker A., Verhas M. High-throughput using the surface plasmon resonance effect of colloidal gold nanoparticles // Analyst. -2001.-V. 126.-P. 1645-1648.

590. Englebienne P., van Hoonacker A., Verhas M., Khlebtsov N.G. Advances in high-throughput screening: Biomolecular interaction monitoring in real-time with colloidal metal nanoparticles // Comb. Chem. High Throughput Screen. -2003. V. 6. - P. 777-787.

591. Storhoff J.J., Lazarides A.A., Mucic R.C., Mirkin C.A., Letsinger R.L., Schatz G.C. What controls the optical properties of DNA-linked gold nanoparticle assemblies? //J. Am. Chem. Soc. 2000. - V. 122. - P. 4640-4650.

592. Mann S., Davis S.A., Hall S.R., Li M., Rhodes K.H., Shenton W., Vaucher S., Zhang B. Crystal tectonics:Chemical construction and self-organization beyond the unit cell // J. Chem. Soc., Dalton Trans. 2000. - P. 3753-3763.

593. Connolly S., Fitzmaurice D. Protein-programmed assembly of gold nanocrystals in aqueous solution // Adv. Mater. 1999. - V. 11.-P. 1202-1205.

594. Mann S., Shenton W., Li M., Connolly S., Fitzmaurice D. Biologically programmed nanoparticle assembly // Adv. Mater. 2000. - V. 12. - P. 147-150.

595. Егоров A.M., Диков M.M. Структура и механизм действия антител // Ж. Всес. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1982. - Т. 27. - С. 381-388.

596. Juarez-Salinas Н., Ott G.S. Process for binding IgG to protein A // US Patent № 4704366, 1987.

597. Хлебцов Н.Г., Дыкман JI.А., Краснов Я.М., Мельников А.Г. Поглощение света кластерами коллоидных золотых и серебряных частиц, формирующимися в режимах медленной и быстрой агрегации // Коллоидный журнал. 2000. - Т. 62. - С. 844-859.

598. Darbre A. Practical Protein Chemistry: A Handbook. Chichester: John Wiley & Sons, 1986.

599. Stoscheck C.M. Quantitation of protein // Meth. Enzymol. 1990. - V. 182. - P. 50-69.

600. Brush M. Array of Assays: Standard techniques and new methods provide alternatives for the quantitation of proteins in solution // The Scientist. 2000. -V. 14.-P. 21-23.

601. Geoghegan W.D., Scillian J.J., Ackerman G.A. Passive gold agglutination. An alternative to passive hemagglutination // J. Immunol. Meth. 1980. - V. 34. - P. 11-21.

602. Geoghegan W.D. The effect of three variables on adsorption of rabbit IgG to colloidal gold//J. Ilistochem. Cytochem. 1988. - V. 36. - P. 401-407.

603. Zhou II.S., Aoki S., Honma I., Hirasawa M., Nagamune Т., Komiyama II. Conformational change of protein cytochrome b-562 adsorbed on colloidal gold particles; absorption band shift // Chem. Commun. 1997. - P. 605-606.

604. Zhang F.X., Han L., Israel L.B., Daras J.G., Maye M.M., Ly N.K., Zhong C.-J. Colorimetric detection of thiol-containing amino acids using gold nanoparticles // Analyst. 2002. - V. 127. - P. 462-465.

605. Nair A.S., Tom R.T., Pradeep T. Detection and extraction of endosulfan by metal nanoparticles // J. Environ. Monit. 2003. - V. 5. - P. 363-365.

606. Kim Y., Johnson R.C., Hupp J.T. Gold nanoparticle-based sensing of "spectroscopically silent" heavy metal ions // Nano Lett. 2001. - V. 1. - P. 165167.

607. Lee C.R., Kim S.I., Yoon C.J., Gong M.S., Choi B.K., Kim K., Joo S.W. Size-dependent adsorption of 1,4-phenylenediisocyanide onto gold nanoparticle surfaces // J. Colloid Interface Sci. 2004. - V. 271. - P. 41 -46.

608. Stoscheck C.M. Protein assay sensitive at nanogram levels // Anal. Biochem. -1987.-V. 160.-P. 301-305.

609. Ciesiolka Т., Gabius H.-J. An 8 to 10 fold enhancement in sensitivity for quantitation of proteins by modified application of colloidal gold // Anal. Biochem. 1988. - V. 168. - P. 280-283.

610. Краснов Я.М. Исследование агрегации наночастиц коллоидного золота и их коныогатов с биополимерами: Автореф. дис. . канд. хим. наук. -Саратов, 2003. t

611. Bendayan М. Ultrastructural localization of nucleic acids by yhe use of enzymegold complexes//J. Histochem. Cytochem. 1981. - V. 29. - P. 531-541.

612. Bendayan M., Benhamou N. Ultrastructural localization of glucoside residues on tissue sections be applying the enzyme-gold approach // J. Histochem. Cytochem. 1987. - V. 35. - P. 1149-1155.

613. Cabinflaman A., Jauneau A., Morvan C., Demarty M. Endopolygalacturonase gold complex parameters influencing the labeling of pectic acid in the cellwalls of flax hypocotyl //J. Microsc. Oxford. - 1993. - V. 171. - P. 117-124.

614. Crumbliss A.L., Stonehuerner J., Menkens R.W., O'Daly J.P., Zhao J. The use of inorganic materials to control or maintain immobilized enzyme activity // New J. Chem. 1994. - V. 18. - P. 327-339.

615. Gole A., Dash C., Ramakrishnan V., Sainkar S.R., Mandale А.В., Rao M., Sastry M. Pepsin-gold colloid conjugates: Preparation, characterization, and enzymatic activity//Langmuir. 2001. - V. 17.-P. 1674-1679.

616. Bendayan M. Enzyme-gold electron microscopic cytochemistry: A new affinity approach for the ultrastructural localization of macromolecules // J. Electron Microsc. Tech. 1984. - V. 1. - P. 349-372.

617. Смит А. Прикладная ИК-спектроскопия. M.: Мир, 1982.

618. Киметач Т.Б., Понкратов К.В. Способы подготовки проб для исследования методом ИК-Фурье спектроскопии. М.: ПККН МЗ РФ: Методические рекомендации от 14.03.1997 № 1/55-97.

619. Ландсберг Г.С. Оптика. М.: Наука, 1976. - 928 с.

620. Горелик B.C. Комбинационное рассеяние света // Сорос, образ, ж. 1997. -№6.-С. 91-96.

621. Colaianni S.E.M., Aubard J., Hansen S.H., Nielsen O.F. Raman spectroscopic studies of some biochemically relevant molecules // Vibrat. Spectrosc. 1995. -V. 9.-P. 111-120.

622. Акципетров O.A. Гигантские нелинейно-оптические явления на поверхности металлов // Сорос, образ, ж. 2001. - X» 7. - С. 109-116.

623. Lyon L.A., Keating C.D., Fox А.Р., Baker B.E., He L., Nicewarner S.R., Mulvaney S.P., Natan M.J. Raman spectroscopy // Anal. Chem. 1998. - V. 70. -P. 341R-361R.

624. Набиев И.P., Ефремов Р.Г., Чуманов Г.Д. Гигантское комбинационное рассеяние и его применение к изучению биологических молекул // Успехи физических наук. 1988. - Т. 154. - С. 459-496.

625. Campion A., Kambhampati P. Surface-enhanced Raman scattering // Chem. Soc. Rev. 1998. - V. 27. - P. 241-250.

626. Kneipp K., Kneipp II., Itzkan I., Dasari R.R., Feld M.S. Surface-enhanced nonlinear Raman scattering at the single-molecule level // Chem. Phys. 1999. -V. 247.-P. 155-162.

627. Kreimer D.I., Nufert T.H. Advances in the direct detection of analytes in mixtures using optical spectroscopy as applied to and stimulated by molecular biology and biotechnology // JMBAB. 1999. - V. 1. - P. 4-16.

628. Maroun F., Ozanam F., Chazalviel J.-N., Theiß W. In situ infrared investigation of metals electrodeposited for SEIRAS // Vibrat. Spectrosc. 1999. - V. 19. - P. 193-198.

629. Naumann D., Helm D., Labischinski H. Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy//Nature. 1991. - V. 351. - P. 81-82.

630. Naumann D., Keller S., Helm D., Schultz Ch., Schräder B. FT-IR spectroscopy and FT-Raman spectroscopy are powerful analytical tools for the non-invasive characterization of intact microbial cells // J. Mol. Struct. 1995. - V. 347. - P. 399-405.

631. Mantsch H.H., Chapman D. Infrared Spectroscopy of Biomolecules. N.-Y.: Wiley, 1996.

632. Brandenburg K., Seydel U. Infrared spectroscopy of glycolipids // Chem. Phys. Lipids. 1998. - V. 96. - P. 23-40.

633. Osawa M. Surface-enhanced infrared absorption // In: Near-Field Optics and Surface Plasmon Polaritons / Ed. Kawata S. Topics in Applied Physics. V. 81. Berlin: Springer-Verlag, 2001. - P. 163-187.

634. Kneipp K., Wang Y., Dasari R.R., Feld M.S., Gilbert B.D., Janni J., Steinfield J.I. Near-infrared surface-enhanced Raman scattering of trinitrotoluene on colloidal gold and silver // Spectrochim. Acta A. 1995. - V. 51. - P. 2171 -2175.

635. Emory S.R., Nie S. Near-field surface-enhanced Raman spectroscopy on single silver nanoparticles // Anal. Chem. 1997. - V. 69. - P. 2631-2635.

636. Vo-Dinh T. Surface-enhanced Raman spectroscopy using metallic nanostructures//Trends in Analyt. Chem. 1998. - V. 17. - P. 557-582.

637. Dou X., Jung Y.M., Yamamoto H., Doi S., Ozaki Y. Near-infrared excited surface-enhanced Raman scattering of biological molecules on gold colloid // Appl. Spectrosc. 1999. - V. 53. - P. 133-138.

638. Seelenbinder J.A., Brown C.W., Pivarnik P., Rand A.G. Colloidal gold filtrates as metal substrates for surface-enhanced infrared absorption spectroscopy // Anal. Chem. 1999. - V. 71. - P. 1963-1966.

639. Kneipp K., Kneipp H., Manoharan R., Hanlon E.B., Itzkan I., Dasari R.R., Feld M.S. Extremely large enhancement factors in surface-enhanced Raman scattering for molecules on colloidal gold clusters // Appl. Spectrosc. 1998. -V. 52.-P. 1493-1497.

640. Brown C.W., Li Y., Seelenbinder J.A., Pivarnik P., Rand A.G., Letcher S.V., Gregory O.J., Platek M.J. Immunoassays based on surface-enhanced infrared absorption spectroscopy//Anal. Chem. 1998. - V. 70. - P. 2991-2996.

641. Grubisha D.S., Lipert R.J., Park II.Y., Driskell J., Porter M.D. Femtomolar detection of prostate-specific antigen: An immunoassay based on surface-enhanced Raman scattering and immunogold labels // Anal. Chem. 2003. - V. 75. - P. 5936-5943.

642. Dou X., Yamaguchi Y., Yamamoto I I., Doi S., Ozaki Y. NIR SERS detection of immune reaction on gold colloid particles without bound/free antigen separation // J. Raman Spectrosc. 1998. - V. 29. - P. 739-742.

643. Ni J., Lipert R.J., Dawson G.B., Porter M.D. Immunoassay readout method using extrinsic Raman labels adsorbed on immunogold colloids // Anal. Chem. -1999.-V. 71.-P. 4903-4908.

644. Xu S., Ji X., Xu W., Li X., Wang L., Bai Y., Zhao В., Ozaki Y. Immunoassay using probe-labelling immunogold nanopartieles with silver staining enhancement via surface-enhanced Raman scattering // Analyst. 2004. - V. 129.-P. 63-68.

645. Kamnev A.A., Dykman L.A., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Spectroimmunochemistry using colloidal gold bioconjugates // Biosci. Rep. -2002. V. 22. - P. 541-547.

646. Wanzenbok H.D., Mizaikoff В., Weissenbacher N., Kellner R. Multiple internal reflection in surface enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRA) and its significance for various analyte groups // J. Mol. Struct. 1997. - V. 410-411. -P. 535-538.

647. Schmitt J., Flemming H.-C. FTIR-spectroscopy in microbial and material analysis // Int. Biodeterior. Biodegrad. 1998. - V. 41. - P. 1-11.

648. Bonnin S., Besson F., Gelhausen M., Chierici S., Roux, B. A FTIR spectroscopy evidence of the interactions between wheat germ agglutinin and N-acetylglucosamine residues // FEBS Lett. 1999. - V. 456. - P. 361-364.

649. Naumann D., Schultz Ch., Gorne-Tschelnokow U., Hucho F. Secondary structure and temperature behavior of the acetylcholine receptor by Fourier transform infrared spectroscopy // Biochemistry. 1993. - V. 32. - P. 3162-3168.

650. Bayer E.A., Wilchek M. The use of avidin-biotin complex as a tool in molecular biology // Meth. Biochem. Anal. 1980. - V. 26, - P. 1-45.

651. Leary J.J., Brigati D.C., Ward D.C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualising biotin-labelled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots // PNAS. 1983. - V. 80. - P. 40454049.

652. Бадашкеева А.Г., Кнорре Д.Г. Олнго- и полннуклеотидные зонды. Метод молекулярной гибридизации // Мол. биол. 1991. - Т. 25. - С. 309-324.

653. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседиова Н.Н. Псевдотуберкулез. М.: Медицина, 1990. - 239 с.

654. Oberwalder U., Steineck Т. Observations of the occurrence of pseudotuberculosis in the European brown hare in Austria // Gibier faune sauvage. 1997. - V. 14. - P. 521-526.

655. Тимченко Н.Ф., Долматов И.10., Найденко Т.Х. Yersinia pseudotuberculosis в модельной морской экосистеме (экспериментальное исследование) // ЖМЭИ.- 1995. № 5. - С. 84-88.

656. Джентемирова К.М. Изменчивость Yersinia enterokolitica в процессе роста в популяции // Доклады ВАСХНИЛ. 1989. -№11.- С. 46-48.

657. Кузнецов В.Г. Роль местообитаний внеорганизменной популяции возбудителя в эпидемиологии псевдотуберкулеза // ЖМЭИ. 1997. - № 5. -С. 17-21.

658. Меньшикова В.В. Клиническая лабораторная аналитика. М.: Медицина, 1999.-346 с.

659. Вольпина О.М., Титова М.А., Жмак М.Н., Короев Д.О., Обозная М.Б., Волкова Т.Д., Иванов В.Т. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образованием антител у мышей // Биоорг. химия. 2002. - Т. 28.-С. 387-395.

660. Kruth H.S., Chang J., Ifrim I., Zhang W.Y. Characterization of patocytosis: Endocytosis into macrophage surface-connected compartments // Eur. J. Cell Biol. 1999.-V. 78.-P. 91-99.

661. Белки иммунной системы / под ред. Иванова В.Т. М.: ИБХ РАН, 1997. -140 с.

662. Persellin R.H., Hess E.V., Ziff М. Effect of a gold salt on the immune response // Arthritis Rheum. 1967. - V. 10. - P. 99-106.

663. Measel J.W. Effect of gold on the immune response of mice // Infect. Immun. -1975.-V. 11.-P. 350-354.

664. Harth M. Gold and modulation of the immune response // J. Rheumatol. Suppl. -V. 1979.-V. 5.-P. 7-11.

665. Lewis A.J., Cottney J., White D.D., Fox P.K., McNeillie A., Dunlop J., Smith W.E., Brown D.H. Action of gold salts in some inflammatory and immunological models // Agents Actions. 1980. - V. 10. - P. 63-77.

666. Bajaj S., Ahmad I., Fatima M., Raisuddin S., Vohora S.B. Immunomodulatory activity of a Unani gold preparation used in Indian system of medicine // Immunophannacol. Immunotoxicol. 1999. - V. 21. - P. 151-161.

667. Stejskal J., Stejskal V.D.M. The role of metals in autoimmunity and the link to neuroendocrinology//Neuroendocrinol. Lett. 1999. - V. 20. - P. 351-364.

668. Graham G. Medicinal chemistry of gold // Agents Actions Suppl. 1993. - V. 44. - P. 209-217.

669. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predetermined specificity//Nature. 1975. - V. 256. - P. 495-497.

670. Burton D.R., Barbas III C.F. Monoclonal Fab fragments from combinatorial libraries displayed on the surface of phage // Immunomethods. 1993. - V. 3. -P. 155-163.

671. Smith G.P. Filamentous phage fusion: Novel expression vectors that display cloned antigens on the surface of the viron // Science. 1985. - V. 228. - P. 1315-1317.

672. Liu В., Marks J.D. Applying phage antibodies to proteomics: Selecting single chain Fv antibodies to antigens blotted on nitrocellulose // Anal. Biochem. -2000.-V. 286.-P. 119-128.

673. Stich N., Gandhum A., Matyushin V., Raats J., Mayer C., Alguel Y., Schalkhammer T. Phage display antibody-based proteomic device using resonanace-enhanced detection // J. Nanosci. Nanotechnol. 2002. - V. 2 - P. 375-381.

674. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E., Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technique // Ann. Rev. Immunol. 1994. - V. 12. - P. 433-455.

675. Smith G.P., Petrenko V.A. Phage display // Chem. Rev. 1997. - V. 97. - P. 391410.

676. Willats W.G.T. Phage display: Practicalities and prospects // Plant Mol. Biol.2002. V. 50. - P. 837-854.

677. Yau K.Y.F., Lee H., Hall J.C. Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies // Biotechnol. Adv.2003.-V. 21.-P. 599-637.

678. McConnell S.J., Dinh Т., Le М.Н., Spinella D.G. Biopanning phage display libraries using magnetic beads vs. polystyrene plates // Biotechniques. 1999. -V. 26.-P. 208-210,214.

679. Molloy P.E., Harris W.J., Strachan G., Watts C., Cunniugham C. Production of soluble single-chain T-cell receptor fragments in Escherichia coli trxB mutants //J. Mol. Immunol. 1998. - V. 35. - P. 73-81.

680. Craig S.W.; Sanders S.K.; Pardo J.V. Purification of isoform-selective actin antibody from polyclonal antiserum // Meth. Enzymol. 1986. - V. 134. - P. 460-467.

681. Зайцева И.С., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Киреев М.Н., Дыкман Л.А. Получение миниантител против Р-субъединицы холерного токсина с использованием фагового дисплея scFv мыши // Там же. С. 66-68.

682. Goia D.V. Preparation and formation mechanisms of uniform metallic particles in homogeneous solutions // J. Mater. Chem. 2004. - V. 14. - P. 451-458.

683. Pal Л. Preparation of ultrafine colloidal gold particles using a bioactive molecule // J. Nanoparticle Res. 2004. - V. 6. - P. 27-34.

684. Shankar S.S., Rai A., Ankamwar В., Singh A., Ahmad A., Sastry M. Biological synthesis of triangular gold nanoprisms // Nat. Mater. 2004. - V. 3. - P. 482488.

685. Aslam M., Fu L., Su M., Vijayamohanan K., Dravid V.P. Novel one-step synthesis of amine-stabilized aqueous colloidal gold nanoparticles // J. Mater. Chem. 2004. - V. 14. - P. 1795-1797.

686. Goto Т., Fujihara H. Self-assembled spherical aggregates of gold nanoparticles and their network ensembles mediated by metal ion recognition // J. Mater. Sci. -2004.-V. 39.-P. 2171-2173.

687. Ролдугин В.И. Самоорганизация наночастиц на межфазных поверхностях // Успехи химии. 2004. - Т. 73. - С. 123-156.

688. Goodman С.М., Rotello V.M. Biomacromolecule surface recognition using nanoparticles // Mini-Reviews in Organic Chemistry. 2004. - V. 1. - P. 103114.

689. Tom R.T., Suryanarayanan V., Reddy P.G., Baskaran S., Pradeep T. Ciprofloxacin-protected gold nanoparticles // Langmuir. 2004. - V. 20. - P. 1909-1914.

690. Wang M., Wang L., Wang G., Ji X., Bai Y., Li Т., Gong S., Li J. Application of impedance spectroscopy for monitoring colloid Au-enhanced antibody immobilization and antibody-antigen reactions // Biosens. Bioelectron. 2004. -V. 19.-P. 575-582.

691. Suzuki Y., Makanae H., Kudo H., Miyanaga Т., Nanke Т., Kobayashi T. Anomalous infrared and visible light absorption by spherical gold nanoparticles dispersed in a comb copolymer // Appl. Phys. A. 2004. - V. 78. - P. 335-338.

692. Liz-Marzan L.M. Nanometals: Formation and color // Materials Today. 2004. -P. 26-31.

693. Scaffardi L.B., Pellegri N., de Sanctis O., Tocho J.O. Sizing gold nanoparticles by optical extinction spectroscopy // Nanotechnology. 2005. - V. 16. - P. 158163.

694. Storhoff J.J.,. Lucas A.D, Garimella V., Bao Y.P., Muller U.R. Homogeneous detection of unamplified genomic DNA sequences based on colorimetric scatter of gold nanopartile probes // Nature Biotechnol. 2004. - V. 22. - P. 883-887.

695. Asian K., Lakowicz J.R., Geddes C.D. Nanogold-plasmon-resonance-based glucose sensing//Anal. Biochem. 2004. - V. 330. - P. 145-155.

696. Hsu H.-Y., Huang Y.-Y. RCA combined nanoparticle-based optical detection technique for protein microarray: A novel approach // Biosens. Bioelectron. -2004.-V. 20.-P. 123-126.

697. Sia S.K., Linder V., Parviz B.A., Siegel A., Whitesides G.M. An integrated approach to a portable and low-cost immunoassay for resource-poor settings // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. - V. 43. - P. 498-502.

698. Liang R.-Q., Tan C.-Y., Ruan K.-C. Colorimetric gold-silver detection of protein microarrays // J. Immunol. Meth. 2004. - V. 285. - P. 157-163.

699. Paciotti G.F., Myer L., Weinreich D., Goia D., Pavel N., McLaughlin R.E., Tamarkin L. Colloidal gold: A novel nanoparticle vector for tumor directed drug delivery//Drug Deliv. 2004. - V. 11.-P. 169-183.

700. Eisler R. Mammalian sensitivity to elemental gold (Au°) // Biol. Trace Element Res. 2004. - V. 100.-P. 1-18.

701. Сергеев Г.Б. Нанохимия. M.: Изд-во МГУ, 2003. - 288 с.