Бесплатный автореферат и диссертация по геологии на тему

Геомикробиология и биохимия трансформации золота

ВАК РФ 04.00.03, Биогеохимия

Автореферат диссертации по теме "Геомикробиология и биохимия трансформации золота"

V. ч-'-

На правах рукописи

МАРАКУШЕВ Сергей Алексеевич

ГЕОМИКРОБИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ТРАНСФОРМАЦИИ

ЗОЛОТА

Специальность 04.00.03 - биогеохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА, 1997

Работа выполнена в Амурском комплексном научно - исследовательском институте ДВО РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Д.Н. Островский доктор биологических наук Г.В.Мсггузова чл.-корр. РАН,

доктор геолого-минералогических наук И.Я.Некрасов

Ведущая организация: Институт микробиологии РАН

Защита состоится 1997 г. в 15 час. 30 мин. в ауд. М - 2

на заседании диссертационного совета Д 053.05.57 МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просьба присылать по вышеуказанному адресу ученому секретарю.

Автореферат разослан >— 1997 г.

•2Д X

Ученый секретарь диссертационного совета

Аганкина Г.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Рассматриваемая в работе проблема трансформации золота является актуальной, как в теоретической , так и в прикладном значении.

К теоретическим аспектам относятся внутриклеточные молекулярные механизмы трансформации золота и его влияние на метаболизм клетки и, в особенности, на энергетические процессы: регуляция переноса электронов в мембранной электроннеггран-спортной цепи, влияние на электрохимический потенциал, прямое воздействие на АТФ - азу клетки и т. д. Решение этих проблем актуально в аспекте общей физиологии бактериальной клетки и жизнедеятельности микроорганизмов в экстремальных условиях. Практическое значение работы определяет выявленная в работе бактериальная аккумуляция золота, играющая важную роль при формировании окисленных зон месторождений и россыпей. В работе выявлены зол отоф ильные типы бактерий, которые можно использовать при поисках золоторудных месторождений.

Важны с точки зрения геохимии золота затрагиваемая в работе активность микроорганизмов, выполняющих концентрационную, транспортную, барьерную и ресурсную функции в ходе формирования осадочной оболочки земной коры, в частности, в корах выветривания и, вероятно, в рудоносных черносланцевых формаций.

Цель к задачи исследования Основной целью было выяснение роли и масштаба деятельности микроорганизмов в формировании гипергенных месторождений золота, а также исследование биохимических механизмов трансформации золота. Объектом исследования микробиологической деятельности микроорганизмов была зона окисления рудного месторождения Токур (Амурская область) и его дочерние россыпи. Главной задачей являлось выделение и определение микроорганизмов, обладающих золотоаккумулирующей и золотосолюбилизирующей способностью и исследование способов взаимодействия микроорганизмов с ионным и коллоидным золотом.

Целью работы являлось исследование возможности бактериального кристаллообразования золота и изучение механизма этого процесса. Проблемы "восходящего" укрупнения золота в гипергенной зоне, "возрождения" россыпей, "облагораживания" россыпного золота, а также выяснение биохимического механизма определяющего эти процессы входит в основную задачу выполненной работы. Второй задачей работы было исследование реакции бактериальной клетки на разнообразные формы золота, а также энергетических и каталитических свойств .бактериальной клетки, обеспечивающих способность вовлекать в окислительно -восстановительные реакции такой инертный металл, как золото.

Третьей задачей было исследование соотношений -транспортной и концентрирующей функции микроорганизмов по отношению к золоту.

Научная новизна. Результаты. Впервые в мировой практике была выявлена корреляция между концентрацией, крупностью и пробностью золота и общим количеством бактерий, а также бактерий флокулянтов в зоне окисления золоторудных месторождений. Это однозначно доказало взаимосвязь бактериального метаболизма и рудообразования золота в экзогенной обстановке. Применительно к золоторудному месторождению Токур были выделены неизвестные ранее штаммы бактерий, способные эффективно аккумулировать золото.

Впервые в экспериментальных условиях произведен бактериальный катализ кристаллизации золота. При этом удалось обнаружить игольчатые, кубические и октаэдрические кристаллы золота, образованные в результате деятельности микроорганизмов. Описан вероятный механизм бактериального кристаллообразования, который, как предполагается, составляет основу бактериального мтшералообразования золота в природе.

Впервые показано влияние золота на мембранную элеклроннотранспортную цепь бактериальной клетей. Выяснено, что золото влияет на перераспределение электронов, идущих от эндогенных субстратов бактериальной клетки к терминальным окевдазам. Показано, что золото смещает поток электронов из менахинонового пула в сторону терминальной оксидаза цитохрома "о", генерирующего перекись водорода. Высказано и в основном доказано предположение, что именно перекись водорода окисляет частицы коллоидного золота, зарождая при этом центры нуклеации, для дальнейшей кристаллизации золота.

Впервые в газово - жидких включениях золота обнаружены фосфолшщцные производные жирных кислот, анализ которых раскрывает в наибольшей мере существо микробиологического происхождения золота.

На основе исследования геомикробиологической трансформации золота рассмотрен общий принцип участия микроорганизмов в седиментации и литификации осадков, сопровождаемый образованием и преобразованием минералов. Микроорганизмы играют важную роль в качестве агентов концентрации, диспергирования или фракционирования золота. Защищаемые положения.

1. Обогащегшость окисленных зон золоторудных месторождений крупным высокопробным золотом прямо коррелирует с повышенным содержащем в них бактерий, обладающих способностью аккумулировать золото. Главная роль в этом процессе принадлежит гетеротрофным микроорганизмам, относящихся к родам Bacillus, Pseudomonas, Corinebacierium и Aficrococcus, которые накапливают до 30% золота по отношению к сухому весу клетки.

2. Противоположную транспортную функцию выполняют хемояитотрофные и некоторые виды гетеротрофных бактерий, способствующих образованию коллоидных и ионных миграционных форм золота, переносимого грунтовыми и поверхностными водами. Барьерную функцию подобной миграции создают золотофильные микроорганизмы, аккумулирующие коллоидное и ионное золото, способствующие его осаждению из истинных растворов в результате реакшш восстановления и диспропорционировашм.

3. Прямым доказательством биохимических процессов при формировании гипергенного золота служит обнаружение в россыпных золотинах газово-жидких включений с фосфолипидными жирными кислотами, образующимися в результате захвата растущими золотинами бактериальных органических соединений метаболизма и катаболизма.

4. Воспроизводимая экспериментально микробиолошческая кристаллизация золота начинается с роста игольчатых (1-5 мкм) или небольших кубических и октаэдрических (10-20 мкм) кристаллов на поверхности бактериальных клеток (Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Pseudomonas stutzen и др.). Сращивание кристаллов и кристаллических агрегатов золота, катализируемое бактериальными клетками, ведет к образованию более крупных золотил.

5. При экспериментальном взаимодействии золота с эффективным золотосорбирующим штаммом М. luteus наряду с самородным золотом возшшиот разнообразные комплексы трехвалентного золота с аминокислотными остатками триптофана, цистеина, гистидина, и аргшшна полипептидов и белков. Переход золота из одновалентного состояния в трехвалентное, сопровождающийся выделением самородного золота, представляет главный мехаэшзм осуществления бактериями их барьерных функций. Коллоидное золото связывается с углеводными компонентами клеточной стенки, триптофановыми и сульфгидрильными группами белков, и с фосфолипидом фосфатидилииозитолом.

6. Биохимическим механизмом взаимодействия золота с бактериальной клеткой является его непосредственное влияние на мембранную электроннотранспортную цепь, в результате которого поток электронов перераспределяется в сторону альтернативных оксидаз (в частности к шттохрому "о" в мембранах М. luteus), генерирующих перекись водорода, которая , в свою очередь, служит эффективным окислителем металлического золота.

7. Бактериальная геохимическая концентрация, исследованная в этой работе, касается не только золота, но и многих других рудных металлов (Ag, Си, Ni, Fe, Mn, Pt и др.). Она максимально проявляется в процессах образования кор выветривания, которые служат главным источником образующихся осадочных терригенных пород, чем определяется значение биогеохимии в формировагаш осадочной оболочки земной коры, составляющей важное звено в

развитии общих геохимических циклов и их металлогенической специализации.

Практическая значимость работы. Развитие геобиотехнологии и биогидрометаллургии различных металлов в последние годы вызвало значительное повышение интереса к геомикробиологической трансформации металлов в природных условиях и к биохимическим механизмам этих превращений. Применение в металлургии природных и созданных методами генной инженерии микроорганизмов, создание технологий обогащения и извлечения металлов, а также моделирование геохимических процессов в химической промышленности обусловит повсеместное создание принципиально новых, экологически чистых производств. Предлагается три варианта практического использования выявленных свойств микроорганизмов: 1. Аккреционной способности для извлечения золота из разбавленных растворов; 2. Способности микроорганизмов вызывать собирательную кристаллизацию золота для его укрупнения в отходах уже использованных месторождений, с последующей его добычей традиционными методами. 3. Характерных особенностей золотофмльных микроорганизмов в качестве поискового признака промышленных концентраций золота.

Фактический материал, методы исследования. Образцы для геохимических и микробиологических исследований были собраны на месторождениях золота Амурской области (золоторудное месторождение Токур, близлежащие россыпи, прииски Ворошиловский, Соловьевский и Октябрьский). Также, в меньшей степени было исследовано платиновое месторождение Кондер (Хабаровский край). Микроорганизмы, выделенные из отобранных образцов этих месторождений были определены до родов и видов по стандартным методикам.

В работе были использованы, главным образом, методы электронной микроскопии, атомно-адсорбционного анализа, полярографии, биохимического фракционирования и электронного парамагнитного резонанса.

Апробация работы. Фактические данные и выводы автора, включающие основные положения диссертации опубликованы в одной монографии и 21 публикациях. В виде пленарных и стендовых докладов данные диссертации были представлены на международных и Российских симпозиумах: Chemical physics of enzyme catalysis. Таллин, 1987, VIII-м - научном совещании по геологии россыпей, 1987, Киев, на II Амурской конференции молодых ученых и специалистов, Благовещенск, 1987, на III-rd Soviet-Chinese Symposium - Geology and Ecology of Amur Basin, Благовещенск, 1989, на XV rd- General meeting of the International Mineralógica! Association, Beijing, China, 1989г, на Pacific RIM 90 Congress, Quinsland, Australia, 1990, на Советско- - Индийском симпозиуме -"Экспериментальная минералогия", Чимкент, 1991 г., на VH-th symposium of Geology Mineral and Mineral Energy Resources Southeast Asia, Bangkok,

Thailand, 1991, на XlX-lh International Symposium of Geology, Kyoto, Japan, II-14-6. P-68, p.704. а также на ежегодных семинарах Институтов биоорган лчсской химии (Владивосток), Амурского комплексного института (Благовещенск), и Института Химической Физики (Черноголовка) (все Российской Академии наук). Объем и структура диссертации. Работа состоит из 112 машинописных страниц текста, содержит 44 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 147 наименовании. Диссертация включает 5 глав: "Бактериальная трансформация золота". "Бактериальный катализ кристаллообразования золота" "Бактериальная биохимия золота" , "Микробиологическая геохимия золота" . "Экспериментальная часть"

Автор признателен академикам РАН В.Г.Моисеенко, и А.А.Маракушеву, проф. А.Н.Ковалевской, д.ф.-м.н. А.В.Куликову, д.х.н. Л.А.Сырцовой, к.б.н. Л.АЛевченко, к.б.н. А.П.Садкопу, ТЛ.Балезиной, В. К. Васильеву, Н.Г.Куимовой, С.Л.Шахраю за иенные идеи, помощь в работе, реализашш и оформлении диссертащш.

Автор благодарит Фонд Сороса (Грант № JBD 100) и Российский фонд фундаментальных исследований (Грант N° 960448758) за предоставленную возможность завершить представляемую работу.

Всем коллегам, сотрудникам геологического отдела Амур КНИИ ДВО РАН, сектора кинетики и катализа ИХФЧ РАН и официальным лицам, оказавшим содействие в написании и оформлении настоящей работы автор выражает огромную признательность.

БАКТЕРИАЛЬНАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ ЗОЛОТА В ЗОНЕ ОКИСЛЕНИЯ РУДНЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ И РОССЫПЯХ

С целью изучения возможности участия микроорганизмов в формировании зоны окисления золоторудных месторождении и россыпей, был проведен микробиологический анализ различных горизонтов бногеохимической системы коренного золоторудного месторождений Токур и дочерней ему россыпи.

Месторождение по данным академика В.Г.Моисеенко (1975) относится к кварцевому малосульфидному арсенопиритовому типу. Золото сосредоточено п пирите, арсенопирите, галените, сфалерите, блеклых рудах и т.д. В первичных рудах золото более мелкое более низкопробное по сравнению с золотом в окисленных рудах. Золото пшергенно - обогащенных руд обладает аналогией с золотом близлежащих россыпей и резко отличается от золота первичных рул месторождения. Такое "аномальное поведение" золота позволило нам предположить некоторые нетрадиционные механизмы его формирования. Работы Ф.Корню и В.И.Вернадского положили начало формированию взглядов на огромное значение и универсальность дисперсного состояния элемс1гтов в земной коре [Вернадский , 1959: Овчаренко , Перцев . 19811. Коллоидное золото.

рааличной степени дисперсности послужило нам основой для моделирования экзогенного рудообразования золота.

Пробы различных горизонтов месторождения были проанализированы для выяснения следующих показателей: 1) Общее количество бактерий (в 1 г породы); 2) Количество бактерий, взаимодействующих с коллоидным золотом (адсорбция и флокуляция), 3) Количество тионовых хемолитотрофов; 4) Концентрация, крупность и пробноеть золота.

Микроорганизмы, выделенные из образцов рудного месторождения в отличие от россыпи характеризовались более медленным ростом и видовым составом. В качестве характеристики и отбора природных штаммов был выбран тест с нитратным лиофобным коллоидным золотом различной степени дисперсности -10, 15, 30, и 40 нм.

В результате скрининга обнаружены различные типы взаимодействия бактерий с частицами золота: 1) Адсорбция золота на поверхности клетки без изменения размеров частиц; 2) Адсорбция с одновременным укрупнением частиц до 50 - 100 нм, 3) Флокуляция золя золота на поверхности клетки; 4) Гетерокоагуляция частиц золота и бактериальных клеток.

горизонт (ы)

Рис. 1. Взаимосвязь количества бактерий (п) и ковцентрацяи золота в окисленных рудах различных горизонтов зоны окисления месторождения Токур (зова Октябоьская): 1 - концентрация золота (г/т); 2 - общее количество бактерий п); 3 - количество бактерий - флокулянтов; 4 - количество тионовых хемолитотрофов.

Золь золота размером 10 нмл, являющийся более монодисперсным и устойчивым по сравнению с золями размером 15, 30, и 40 нм в дальнейшем использовался как основной тест. В отобранных пробах

наблюдается явно выраженная корреляция между общим количеством бактерий, количеством бактерий-флокулянгов и общей концентрацией золота в различных горизонтах месторождения (рнс. 1). Было показано, что как в исследуемом месторождении Токур (рис. 2-4), так и в подавляющем большинстве месторождений Северо-Восточной Азии (Нестеров, 1985], установлены зоны гипергенного золотого обогащения, где главной закономерностью является увеличение концентрации, крупности и пробности золота при увеличении степени окнсленности руды.

А/А

/А \

У

<р»пхи ШКП* (» км)

Рнс. 2 Зависимость крупности золота (в мм) от его содержания в руде ({-первичной, 2-окнслснной)(весовые проценты) зоны Октябрьской. Рнс. 3. Зависимость пробы золота от размеров его выделений в окисленных рудах зоныОктябрьской (Токур).

елгямда« ХЯ<ЛА

> т»(г/о

Рис. 4. Концентрация золота в зоне окисления месторождения Токур.

Был проведен отбор с разных горизонтов месторождения Токур и россыпи, образовавшейся от размыва этого месторождения. При этом в каждой точке отбирались две пробы, из которых одна шла на изучение физико-химических параметров образования золота, а в другой - определялось общее бактерий, кол1Гчество бактерий -флокулянтов, их виды и функциональные характеристики. Оказалось, что в первичных рудах золото более мелкое и более низкопробное по сравнению с таковым в окисленных рудах (Рис. 2,3). Концентрация золота в зоне окисления наблюдается практически во всех жилах этого месторождения (Рис. 4).

Таким образом, нами обнаружена четко выраженная корреляция между количеством бактерий-концентраторов золота и концентрацией, крупностью и пробностью золота в различных горизонтах зоны окисления золоторудного месторождения Токур. Из горизонтов 820 и 490 выделены грибы А$рег%Ши$ лр., обладающие способностью адсорбировать коллоидное золото, с последующей флокуляцией. Наиболее крупное (вплоть до самородков) и высокопробное золото (выше 790 ед.) обнаружено в россыпи, генетически связанной с этим месторождением, где количество бактерий-флокулянтов в воде, иле, почве бортов дражного котлована достигало 10е в см^.

Корреляционная зависимость между содержанием золота и количеством органического вещества(Сди - Сорг) обнаружена многими исследователями(главным образом в золотоносных черных сланцах, а также авлеропесчанных толщах с обломочным золотом, в элювиальных корах выветривания и в вулканогенных накоплениях гидротермально-осадочного генезиса [Юдович, Кетрис, 1994]). ФАЛстников и Н.В.Вилор [1981] полагают что органические вещества (гл. обр. гуминовые кислоты, фульвокислоты и битумоиды) играют роль геохимического барьера для золотоносных гидротермальных флюидов. Тем не менее роль живого вещества в проявлении концентрирующей и барьерной функции для золота не получила всеобщего признания.

Таблица 1. Эффективные золотофильные штаммы микроорганизмов.

Среднее Штаммы микроорганизмов Укрупнение золя

содержание Аи мин

в

золотоносной

породе, г/т _

_10 им 15 нм 30 нм 40 нм

Рудное месторождение_

4—20 Мкгососсш 1и1ецз 8/2Е Осаждение без укрупнения

4-20 Pseudomonas acidovomns I/2B 25 20 10 1,0

4-20 Р. acidovomns 1/ЗВ 8 8 1.5 US

10 Staphyhcoccus aureus IT >60 >60 >60 >60

30 Р. stutzen 2/lli <0,5 <0,5 <0,5 <0,5

30 Р. stutzen 2/2B <o,5 <0,5 <0,5 ,<0,5

30 Р. acidovomns 9/1T >60 30 <0.5 1,5

Россыпное месторождение

0,2 Corinebacterium сек III 11 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5

0,2 Р. pseudoakaligenes 2C 20 17 15 17

0,1 Flavobacterium rigense 8C 12 10 1,0 1,0

0,15 F. rigense 230 25 20 2 5

0,3 P. alcaligenes 22C 5 4 <0,5 <0,5

0,3 Bacillus antmeoides 18C 10 8 <0,5 <0,5

0,25 ß. subtilis 17/10 >60 >60 20 35

0.25 S. cereus 17/20 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5

Среди гетеротрофных грамотрицательных и грамположительных бактерий рудного месторождения преобладали роды Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Chroma bacterium, тогда как в россыпи родовой состав немного изменялся - Pseudomonas, Bacillus, Flavobacterium, Corinebacterium. Исследование бактериального состава коренного месторождения и россыпи, сформировавшейся от его размыва показал, что, концентрирующей и, вероятно, барьерной функцией обладают не только бактерии в зоне окисления, но и микроорганизмы в россыпи.

В таблице 1 приведены наиболее эффективные штаммы бактерий-флокулянтов, среднее содержание золота в месте отбора проб и время флокуляции золя золота, различного диаметра. В дальнейших исследованиях процессов минералообразования золота в основном использовались штаммы Micrococcus luteus 8/2Т, Pseudomonas stutzen 2/1B, P. alcaligenes 22C и Bacillus cereus 17/20. Эти бактерии (за исключением М. luteus) резко изменяют агрегативную устойчивость золя золота, что может происходить двумя путями. Во-первых, обычная флокуляция, происходящая благодаря повышению концентрации противоиона сверх порога коагуляции. В основном этот процесс реализуется при действии бактериальных метаболитов. Во-вторых, устойчивость лиофобных коллоидов золота пошатается за счет увеличения растворимости, благодаря окислительному комплексообразованию. Обычно, для коллоидов слабо растворимого золота, роль переноса растворенных ионов мала и, поэтому, большее значение имеет флокуляция.

В экспериментах по термоинактивации бактериальных культур показано, что только живые, активно дышащие клетки бактерий способны флокулировать золь коллоидного золота. Максимальная скорость флокуляции . наблюдается при переходе от экспоненциальной к стационарной фазе роста. Известно, что физиологическое состояние бактерий ,во многом определяется возрастом культуры. В работе Никитина и др.(1986) была исследована способность коллекционных чистых культур грамотрицательных и грамположительных бактерий флокулировать и осаждать золь коллоидного золота. Быстрорастущие евтрофные бактерии (ризобии, псевдомонады, спириллы) менее эффективно взаимодействуют с золем золота, чем представители медленно растущих олиготрофов. Показано, что возраст культур не оказывает существенного влияния на их активность, что можно объяснить тем, что скорость флокуляции (определяемая механизмом адсорбции частиц золота) этих коллекционных штаммов на несколько порядков ниже, чем у выделенных нами природных культур (табл. 1).

Электронномикроскопическое исследование (ТЕМ) различных видов бактерий с флокулировашшм коллоидным золотом выявило различные типы их взаимодействия. На примере клеток Pseudomonas stützen отчетливо проявляется монодисперснсть гранул золя золота,

которое адсорбируются всей поверхности клеток и можно наблюдать начальные стадии образования цепочек и скопления частиц золота. На микрофотографии клеток В. сегеиз степень флоку.чяшш золя золота более значительна и агрегаты частиц золота прочно связаны с клеточной стенкой бактерии.

Рис. 5 Электронные макрофотографии клеток Р. эи^ен с адсорбированным коллоидным золотом. Ув. 32000.

Рис. 6 Электронные микрофотографии клеток В. сегсих с адсорбированным коллоидным золотом. Ув. 88000(а) и 64000(6).

Картину гетерокоагуляции электронномикроскопически наблюдали на препаратах клеток Р. акаИ^епсз, На\'оЬас1епшп п%егие и

Staphylococcus aureus где кокковидные клетки образуют плотную золаго-бактериальнукз массу. Как некоторое исключение из правила обнаружена золотофильность спор некоторых бактерий, что позволяет предположить, что концентрация золота происходит и в экстремальных абиогенных условиях.

Таким образом, в природных условиях эти бактерии являются концентрационным фактором и, вероятно, гсомикробиологическим барьером для коллоидного золота.

АККУМУЛЯЦИЯ ИОННОГО ЗОЛОТА

Золото в морских, озерных, грунтовых водах, ручьях и реках переносится в форме и стенных и коллоидных растворов. Содержание Аи в водах характеризуется громадной дисперсией достигающей 5 порядков. Как правило в естественных водах концентрация золота находится на пикомолярном уровне и поэтому представления о формах нахождения золота в mix до сих пор неоднозначны.

В 1931 г. В.И.Вернадским было введено понятие концентрационного фактора для живых организмов, т. е. отношение концентрации элемента, накопленного биомассой к концентрации его в окружающей среде. Тем не менее данные о коэффициенте накопления золота микроорганизмами практически отсутствуют.

Способность аккумулировать комплексные соединения золота была изучена с использованием штаммов из, собранной нами, коллекции золотофлокулирующих бактерий рудных и россыпных месторождений. В таблице 2 приведены данные по количеству золота поглощенного клетками бактерий в зависимости от времени контакта.

Таблица 2. Количество поглощенного золота (мг/г сухой биомассы) в зависимости от времени контакта при 25° С. Исходная концентрация металла 5x10 М.

Бактерии Время

10 мин 30 мин 2 часа 24 часа

P. stutzery 72,1 74,3 89,2 99,1

P. sp 58,6 59,6 65,9 84,2

В. subtilis 0 0 8,1 18,4

В. cereus 78,4 84,8 107,5 161,3

F. rigense 23,7 82,5 101,7 112,4

М. luteus 121,5 177,3 253,1 450,7

В первые 10 минут клетки проявляют различную способность к аккумулированию золота, однако она отражает общую тенденцию, которая проявляется, как через 2 часа, так и через сутки. Интересно, что зол отофлокули руюши е штаммы отличаются по реакционноспособности к ионному золоту, что, вероятно, связано с различием катионных участков на поверхности их клеточных стенок.

Наблюдаемая аккумуляция зологга клетками В. subiilis через 2 часа и 1 сутки, по-видимому, связана с неспецифическим восстановлением иона АиСЦ" .Увеличение аккумуляции ионного золота наблюдалось для всех изученных нами штаммов.

Бактериальные клеточные стенки являются неспецифическими ионообменниками и, поэтому, значительные количества металла способны адсорбироваться на них. Функциональными участками, обуславливающими связывание, являются различные анионные группы, такие как тейхоевые фосфодиэфирные группы, свободные гидроксильные группы пептидоглюканов и в меньшей степени гидроксильные группы углеводов и амидные группы пептидов. Возможно участие в первой стадии связывания сульфгидрильных групп пептидов клеточной стенки. На второй стадии происходит неспецифическое восстановление ионного золота до металлического

С0СТ0Я1ШЯ.

Максимальная золотоаккумулирующая способность обнаружена нами у клеток M.luteus. Количество связанного золота за один час достигало 45% от веса сухой биомассы микрококка. Это значительно превышает количество аккумулированного клетками микроорганизмов золота приведенное в работах других исследователей. Так, в лабораторных опытах было показано, что зеленая водоросль Chlorella vulgaris тоже имеет высокое сродство к соединениям Au(I) и Аи(Ш) в кислых водных растворах (pH 3) и при этом клетки накапливают более 10% золота на сухую биомассу (Watching et. а]., 1987]. Интересно, что при введении комплексов золота(1) лигандами металла в клетке оказываются атомы серы(вероятно сульфгидрильные группы белков), а при введении комплексов Au(III) происходит восстановление до Au(I), причем атом золота связан с азотным лигандом. В нашем случае клетки псевдомонад, бацилл и флавобактерий обладают золсггоаккумулирующей способностью сравнимой с хлореллой. Вероятно, что если клетка в природных условиях связывает различные ионы золота, то на первом этапе оно может запасаться в виде комплексов Au(I). Не исключено, что золото (в виде бидентатных одновалентных комплексов) может также связываться и транспортироваться низкомолекулярными белками Аи-тионеинами, обнаруженными в прокариотах [Olafson, 1984].

Достаточно высокое сродство клетки М. luteus имеют к комплексам золота(Ш). Мы исследовали связывание ионного золота в виде комплекса A11CI4" методом ЭПР. Известно, что ионы Мп2+ обратимо связываются с поверхностью биомембраны биологических систем. Амплитуда сигнала ЭПР от марганца при прочих равных условиях будет являться мерой концентрации растворенных в водной фазе ионов Мп2+. При добавлении ионов Мп2+ в концентрации Ю-2 М к образцам клеток М. luteus амплитуда сигнала ЭПР уменьшается примерно в 3 раза, что указывает на связывание Мп2+ в концентрации (6-7) х 10"3 М. После добавления к этим образцам

АиСЦ" (5 х 1(ИМ) амплитуда сигнала ЭПР от увеличивается и

остается неизменной. Приращение сигнала от Мп2+ соответствует концентрации вытесненного в раствор Мп2+ примерно

Таким образом Аи3+, связываясь с клетками М !и(еи! вытесняет в раствор значительно большее количество ионов марганца. На уровне таких кошдоггргщий происходит довольно селективное связывание золота, однако при повышении концентрации золота дальнейшее вытеснение марганца в раствор не происходит и золото связывается путем обычной биосорбции.

При исследовании селективности поглощения ионного золопга клетками М.Ыеиз (табл. 3), выяснилось, что существует частичная аналогия с коллоидной селективностью. Количество аккумулированного золота превышает количество любого другого поглощенного металла. Тем не менее, при расчетах в молярных концентрациях получается, что золото находится лишь на четвертом месте, пропуская вперед железо, медь и цинк.

Таблица 3. Количество поглощенных металлов клетками М. Шеш после 10 минутной инкубации при 25°С. Исходная концентрация металла 5х10"3 М.

Металл Количество поглощенного металла_

мг/г (сухой вес) М/г (сухой вес) биомассы биомассы

AI 1,2 44,4

Мп'+ 20,8 378,2

FeJ+ 88,2 1664,3

Со" 2,4 40,7

Niz+ 2,1 35,8

Си1+ 105,2 1643,7

Znl+ 7 6,6 1178,6

Ag+ 25,3 234,2

Au 125,1 635,0

H«f 27,9 139,6

РЪ 8,4 40,6

Накопление .исследуемых нами металлов клетками Euglena sp. algae исследовали в хвостах дражных стоков урановых месторождений Канады, сравнивая коэффициенты накопления в отношении среднего содержания в реках мира (Mann et.al., 1989]. В связи с очень низкими концентрациями этих металлов в водах (от 10" до 10" нг/л) проявляется явная концентрационная функция бактерий. В наших опытах при избытке концентрации металлов практически был установлен предел биосорбции и биоаккумуляции различных металлов клетками M.luteus. Не рассматривая редкоземельные и трансурановые элементы, можно утверждать, что наибольшая золотоаккумулирующая способность (450 мг Аи/г сухой биомассы) принадлежит ряду штаммов культуры M.luteus [табл. 2]. Род бактерий

Micrococcacea практически никогда ранее не рассматривался микробиологами в качестве участника геохимического цикла элементов за исключением единственного исследования его, как участника окисления соединений марганца и вольфрама [EhrLich, 1966].

Если рассматривать микробиологическое обогащение с точки зрения биотехнолопш селективного извлечения золота из растворов, то в настоящее время наиболее успешными оказались опыты по извлечению золота микрогрибами (Rliizopus arrhizus - 420 мг Ли/г сухой биомассы, Aspergillus terrius), дрожжами (Sacharomices cerevisae), водорослями (Sargassum natans, Chlarella vulgaris), биомассами отходов производства антибиотиков [Каравайко и др., 1996], а также гранулированной биомассой бактерий В. subtilis - 390 мг Ли/г сухой биомассы [Brieiley et, al., 1986]. По-видимому, целесообразно использовать в биотехнологии культуру клеток М. luteus.

Суммируя данные по концентрированию и осаждению золота в природных условиях и в лабораторных экспериментах, можно утверждать, что существует целый ряд золслоф ильных микроорганизмов, которые проявляют концентрирующую функцию и в благоприятных условиях являются эффективными биогеохимическими барьерами для различных форм золсгга.

БАКТЕРИАЛЬНОЕ РАСТВОРЕНИЕ ЗОЛОТА

Экспериментальные данные об участии микроорганизмов в геохимическом растворении золота впервые приведены в работах [Pares, 1964 а, b ]. Было показано, что обычный обитатель воды и почвы бактерия Serratia marcescens, а также фитопатогенный микроорганизм Agrobacterium tumifaciens способны растворять золото, находящееся в виде порошка или золотоносной руды., причем солюбилизирующая активность бактерии зависит от питательной среды и природы золотоносной руды. Авторы использовали золотоносные латериты и аргиллиты с содержанием золота от 11 до 18 г/т. При этом содержание золота в растворе достигало 1 мг/мл. Одним из первых отечественных опубликованных сообщешш является работа Н.НЛяликовой и Л_Я Мокеичевой [1969], в которой показано, что помимо соединений серы, накапливающихся в среде при окислении сульфидов тионовыми бактериями, способностью к растворению золота обладают многие гетеротрофные бактерии. В лабораторных опытах культура, выращенная из золоторудного месторождения, близкая к Bacillus alvei, растворяла за 3 нед. до 500 -600 мкг/л золота.

Мы провели работу по обнаружению и выделению микроорганизмов в исследуемом нами золоторудном месторождении Токур и дочерней ему россыпи. Для опытов брали шлиховое золото крупностью 0,4-0,8 мм (полученное травлением кварца или из россыпи). Методом полунепрерывного культивирования изучали растворение золота в течение трех месяцев. В культуральной

жидкости накопительных культур растворенного золота обнаружено не было. Тем не менее, было выделено два штамма Bacillus sp., способных растворять золото. Содержание золота в надосадочной жидкости (супернатанте) варьировало от 2,5 до 3,8 мг/л. Медленные скорости растворения крупных частиц золота не позволяют исследовать механизм его окисления и, поэтому, мы провели ряд опытов по изучению растворения тонкодисперсного (коллоидного) золота, с использованием аминокислот в качестве комплексообразователей.

Была найдена оптимальная система для окислешш золота. В качестве хомплексообразователей проверены различные аминокислоты (триптофан, гистидин, аршшш, лизин, цистеин), а также дитиотреитол, как аналог тиолсодержании соединений, Трис, как аналог аминогрупп с рК 8,5 и кроме того варьировали pH, температуру и буфер.

Рис. 7 Влияние триптофана на скорость окисления золота; 1 - без

триптофана; 2-[триптофан1=2хЮ"ЗМ; 3-[триптофан]=5x10"3 М.

Рис. 8 Влияние рН на скорость окисления золота; рН исходного

раствора Триса - 1 - 5,0; 2 - 6,0; 3 - 8,0; 4 - 9,0; 5 - 10,0

Рис. 9 Влияние Триса на скорость окисления золота; 1 - в отсутствие

Триса; 2 - в присутствии Триса.

Рис. 10 Зависимость скорости окисления золота от его концентрации; 1

- [Аи] = 3,8x10"%; 2 - [Аи] = 1,9хЮ"5М; 3 - [Аи] = 9,5х10"6м.

Известно, что при химическом окислении золота используют кислород, его радихалы и перекись водорода а, как будет показано в дальнейшем, связывание коллоидного золота бактериальными

клетками в ряде случаев приводит к образованию Н2О2. Поэтому, в качестве окислителя в системе была выбрана перекись водорода.

На рис. 7-10 представлены зависимости скорости окисления золота от концентрации триптофана, Триса, ионов водорода, и золота (от концентрации перекиси водорода скорость окисления золота практически не зависит). Из рис 7 следует, что окисление золота происходит только в присутствии триптофана, но, тем не менее, в отсутствии Триса скорость окисления золота заметно снижается.

Из проверенных значений рН (5-10) (рис. 8) наибольшая скорость окисления наблюдается при рН 10, на четвертый день в системе окисляется 50% золота и реакция еще не выходит на плато. При значениях рН 6 и ниже окисление золота практически не происходит, что указывает на вероятное участие амино!рупп в процессе окисления.

Таким образом, из вышеприведенных данных следует, что окисление золота происходит, по крайней мере, в две стадии - на первой образуется прочный комплекс с лигандом, который впоследствии окисляется перекисью водорода в присутствии аминогрупп . В физиологических условиях наилучшим лигандом для золота оказался триптофан, хотя при повышении температуры лигандами могут бьггь лизин, аргинин и гистадии. Соединения, содержащие тиол, по-видимому, образуют слишком прочные комплексы с золотом, которые не способны окисляться Н2О2.

С точки зрения биотехнологии извлечения золота, процесс микробиологического растворения золота представляет интерес, прежде всего, в качестве альтернативы стадии цианирования гидрометаллургического процесса. Созданная нами система также может бьггь использована в биотехнологии извлечения золота из руд, содержащих тонкодисперсное золото.

Таким образом, можно утверждать, что в природе существует экзогенный микробиологический цикл золота, хотя очевидно, что скорости осаждения и растворения золота несопоставимы. Превалирующим процессом является осаждение золота на биогеохимических барьерах, что приводит к концентрированию золота в зоне окисления рудных месторождений и россыпях.

БАКТЕРИАЛЬНЫЙ КАТАЛИЗ КРИСТАЛЛООБРАЗОВАНИЯ ЗОЛОТА

В предыдущем разделе мы рассматривали, главным образом, аккреционный путь минералообразования золота в экзогенных условиях, образующегося на биогеохимических барьерах, который в настоящее время признается основным механизмом биогенной концентрации золота в зоне окисления золоторудных месторождений и россыпях. Однако, существует и другой путь укрупнения коллоидного золота - кристаллизация , впервые отмеченная в работе [Овчаренко и др., 1985], где впервые наблюдали образование

игольчатых кристаллов золота на поверхности ВасШиз тЫШх, происходящее, по мнению авторов, в результате собирательной перекристаллизации. Также существуют единичные публикации по биминералообразованию золота [Коробушкина и др., 1989].

Для изучения морфологии и кристаллизации новообразованного золота, а также механизма перекристаллизации коллоидного золота нами были использованы ухазанные в табл. 1 штаммы В. сегет, 17/20, Р. ака1щепех 22С, М. Ысш 1Т, оказавшимися наиболее быстрыми "кристаллизаторами" золота. Культуры поддерживали методом отьемло - доливного культивирования (Герхард, 1983] в течение двух и более месяцев.

На электронных микрофотографиях при изучении методом растровой электронной микроскопии в смешанной культуре, содержащей бактерии В. сегеиз и Р. акаН%епе$ наблюдалось образование игольчатых кристаллов длиной 1-5 мкм (рис. 11а). Кристаллы располагаются или поодиночке или чаще образуют сростки. В ряде случаев виден непосредственный контакт игольчатых кристаллов с поверхностью бактериальной клетки , при этом маленькие кристаллы длиной около 1 мкм прикреплены к клеточной оболочке бактерии и, по-видимому, именно на поверхности бактерии начинается их зарождение и дальнейший рост (рис. 116) Некоторые бактерии буквально покрыты "шубой" из игольчатых кристаллов.

Рис. 11. Электронные микрофотографии игольчатых кристаллов золота, образовавшихся в сметанной культуре В. сегеия и Р. ака^епсв Ув.

9000(а) и 10000(6).

Величина образующихся отдельных кристаллов зависит от соотношения между скоростью зарождешгя новых центров кристаллизации и скоростью роста уже зародившихся кристаллов,

тогда как форма кристаллов зависит от соотношения скоростей роста их граней.

Таким образом, образование бактериальной клеткой массы кристаллических иголок связано с формированием на всей поверхности множества центров зарождения новой фазы.

Еще в первых рентгеноструктурных исследованиях гидрозоля золота Зигмонди (см. Тигкеую11, 1985] показал, что коллоидные частицы имеют истинную компактную кристаллическую структуру, которая относительно богата разупорядочными районами, как внутри частицы, так и на ее поверхности, и, вероятно, кристаллические коллоидные частицы могут служить зародышами (размер больше критического) новой фазы, что снимает проблему источника энергии зарождения, однако, дальнейший рост зародыша должен быть связан с непрерывным кооперативным окислением исходных коллоидных частиц с последующим восстановлением ионов золота на центре кристаллизации. Рост кристалла также требует, чтобы ионы золота переносились на кристаллическую поверхность (путем диффузии или изменением конформации клеточной поверхности, позволяющей приблизить связанные с лигандами ионы золота к центру кристаллизации) и ориентировались на поверхности кристаллической решетки. Дисперстность образующихся коллоидных и тонкодисперстных частиц зависит от скорости их образования и скорости их роста [Натансон, 19591- Трудно допустить возможность пересыщенного раствора атомов золота в водной среде в присутствии кислорода. Характерная особенность конденсации золота н коллоидных частицах, состоит в том, что этот процесс идет не из перенасыщенного раствора атомов золота в жидкой среде, а непосредственно в момент восстановления ионов золота. Тут мы переходим к очень важному вопросу - когда появляются "активные" ионы золота? Далее будет показано, что металлическое (коллоидное золото) окисляется , по крайней мете за несколько минут , клетками М. Меш. Ионы золота, входящие в упорядоченные структуры (клеточная стенха, мембраны бактерий) обладают свободным уровнем с меньшей энергией, чем отдельные атомы золота в растворе. Электроны, переходящие от различных восстановителей к такой (окисленной) группе золота, не распределяются по отдельным ионам, а сразу же суммируются, придавая группе ионов золота, по мере, по окончанию ее развития свойства конденсированного металла. Эти группы становятся зародышами при достижении размеров, благоприятствующих увеличению количества обобщенных электронов и появлению отчетливо выраженной физической поверхности раздела.

Выше была показана возможность окислительного комплексообразования золота различными аминокислотами. Образование игольчатых вытянутых кристаллов свидетельствует в данном случае о том, что количество энергии транедуцируемое клеткой, достаточно только для того, чтобы кристаллы из зародышей

разрастались в направлении только одной грани. Тем не менее, в некоторых случаях были обнаружены также кубические кристаллы золота, спязашгые с поверхностью клетки. Кубическая сингония высокопробного золота характерна для этого элемента [Петровская, 19731.

В другом эксперименте в качестве биокатализатора перекристаллизации золота была использована чистая культура М. luteus 1Т. Аналогичное полунепрерывное культивирование с коллоидным золотом проводилось в течение двух месяцев. Электронномикроскохшческие исследования позволили обнаружить более крупные кристаллы золота - многогранники размером около 10 мкм. Эти, действительно большие кристаллы, являются золотом, »по подтверждается микрозондовым анализом. Увеличение размеров кристаллов золота по сравнению с игольчатыми кристаллами свидетельствует о том, что на поверхности M. luteus содержится значительно меньше центров кристаллизации, т.е. основная масса адсорбированных частиц перекристаллизовывается на немногочисленных центрах и кристалл растет в направлении всех своих граней.

Как описывают, впоследствии [Southam, Beveridge, 1994] эта структура (многогранник) является октаэдричечеким золотом. Цитируемые авторы совершенно правильно считают, что морфология частиц золота может отражать структуру клетки микроорганизма. Согласно механизму, предложенному этими авторами, в процессе низкотемпературного диагенеза (60° С) внутриклеточное коллоидное золото (образовавшееся после восстановления

золотохлористоводородной кислоты бактериями В. subtilis) растворяется цитоплазматическими компонентами клетки и переосаждается в межклеточном пространстве в виде кристаллического, псевдотригонального (гексагонального) окгаэдрического или гексагонально-октаэдрического золота. Т. с. бактерии производят органические соединения, катализирующие этот процесс, который моделируется в лабораторных условиях, показывая истинную геологическую кристаллизацию золота

Образование более крупных частиц золота часто происходит путем сращивания мелких кристалликов, и образующиеся золотины размером более 10-20 мкм в свою очередь срастаются между собой. В этом можно рассмотреть различные детали (структурные элементы) золота, сформированного в результате каталитического и энергетического потенциала бактерий.

Интересной является проблема преобразования эндогенного золота в условиях формирования россыпей. Мы провели электронно-микроскопическое исследование структуры эндогенных золотил до и после культивирования в присутствии коллоидного золота и смешанной культуры 3. cereus и M. luteus. Интересно что, золото, на первом этапе, главным образом, адсорбируется на микрококке. Через 3 месяца обнаружено общее изменение структуры поверхности

золотин, а также образование новых кристаллов золота, связанных с золсгпшкой.

Кубический новообразованный кристалл золота (длина ребра 23 нм) образовался в углублении золотины, что, вероятно, является начальной стадией образования сростков золота, часто встречающихся в природных условиях. Съемка в характеристическом рентгеновском излучении Аи^.показала, что эти новообразованные кристаллы действительно являются золотом. В стерильных аналогичных условиях изменение морфологии золотин и формирование новых кристаллических фаз не обнаружено.

Наблюдаемый процесс кристаллизации "нового" золота на поверхности эндогенных золотин может объяснить обнаружение в россыпях самородного золота с высокопробной каемкой на поверхности частицы. Образование высокопробных каемок на поверхности частиц самородного золота (особенно рассыпного) отмечалось многими исследователями [Петровская, 1973; Моисеенко, 1977; Некрасов, 1991] и очевидно, что в образовании таких каемок бактериальные сообщества играют существенную роль.

Известно, что бактерии, как правило, хорошо адсорбируются различными минеральными частицами [Flatcher, Marshall, 1982], поэтому в приведенном выше примере обрастания золотин "новым" золотом, бактерии выполняют не только концентрирующую, но и барьерную функцию.

В окислительных природных условиях, как было показано в предыдущей главе, золото переносится в грунтовых водах в виде комплексных ионов и коллоидных частиц стабилизированные к ремнеки слотами и органическими кислотами. Бактериальное восстановление комплексных ионов золота при невысоких температурах с одновременной его кристаллизацией хорошо понятно и в достаточной степени описано, тогда как укрупнение частиц коллоидного золота более сложный процесс, в основе которого или собирательная кристаллизация или перекристаллизация.

Экспериментально наблюдаемое прекращение роста кристалла золота достигшего размера 20 мкм можно объяснить следующим образом. При неизменном поверхностном потенциале клетки должна сохраняться неизменной и плотность тока. Так как, при росте кристалла поверхность его граней увеличивается, а сила тока остается неизменной, должно происходить замедление скорости роста кристалла [Строителев, 1969 ]. По мере увеличения поверхности кристалла, поскольку сила тока остается неизменной, плотность тока падает и появляются участки на которых рост кристалла прекращается. Кроме того, в результате адсорбции поверхностно активных органических веществ на поверхности кристалла может прекратиться рост всех граней кроме одной и этим объясняется образование кристаллов вытянутой формы (хотя сингония может при этом не измениться).

В настоящей работе к культуре М. lúteas с коллоидным золотом на этапе образования кристаллов золота размером 20 мкм через 2 месяца была добавлена культура бактерий В. cereus для увеличения электрического потенциала и поддержания плотности тока на гранях на более высоком уровне. Оказалось »по дальнейший рост золотины связан с процессом сращивания более мелких частиц. Отмечено, что частица состоит из дискретных блоков размером 5-10 мкм. Можно наблюдать начальную стадию сращивания вытянутого кристалла золота (25 мкм с основной золотиной). Отчетливо видно, что частицы золота, как бы, стопками накладываются друг на друга. Видимо, благодаря такому сращиванию в природных условиях наблюдаются новообразовашше золотины самой причудливой формы (рис. 12).

Рис. 12. Электронная микрофотография (SEM) зологгинкя, сросшейся пз фрагментов, а - Ув. 2400, б - Ув. 6000.

В течение 8-10 месяцев полунепрерывного культивирования нами наблюдались золотины размером 1 мм и более, хотя их внутреннее дискретно-кристаллическое состояние электронномикроскопически различить уже невозможно. Около 80% золотил в этом эксперименте имели размеры от 0,2 до 0,8 мм, что примерно, соответствует размеру золота в окисленных рудах и россыпях исследуемого нами месторождения Токур.

В последнее время наши результаты по бактериальной кристаллизации золота, где впервые было показано образование игольчатых кристаллов и кристаллических многогранников золота на поверхности зщгаы*; бактерий нашли подтверждение в работах американских и канадских исследователей [БоиНшп, Beveridge, 1994].

Явление "укрупнения" золота и "возрождения", наблюдаемое в природе связанно именно с бактериальным катализом кристаллизации золота. Многие исследователи большое внимание уделяют морфологии выделений золОта, как одному из возможных критериев генезиса его месторождений [Петровская, 1973, \Vatterson, 1994]. Из приведенных выше данных видны перспективы такого подхода при сравнешш природных выделений золота и золота, образовавшегося в лабораторных модельных экспериментах.

БИОХИМИЯ АККУМУЛЯЦИИ И ТРАНСФОРМАЦИИ ЗОЛОТА В КЛЕТКАХ Micrococcus luteus

Как было показано в предыдущих разделах одним из самых эффективных золотоаккумулирующих микроорганизмов являются клетки грамлоложителъных кокков Micrococcus luteus. Обнаруженные в природных условиях в обогащешшх золотом реках, ручьях, породах, рудах и в почве, эти бактерии приобрели уникальную способность аккумулировать и трансформировать ионное и коллоидное золото.

В отличие от других, изученных нами микроорганизмов культура М. luteus не вызывает заметной флокуляции частиц коллоидного золота и в условиях насыщения 1 г сухой биомассы сорбирует до 45 мг золота, т. е. одна клетка связывает в среднем около 104 коллоидных частиц. Это экспериментально наблюдаемый предел связывания коллоидного золота. Вообще, различные штаммы М. luteus содержат неодшгаковое количество SH-групп на своей поверхности, а также связывают различное количество коллоидного золота ( около 5 мкг Аи на мг сырой бактериальной массы), однако корреляции между этими параметрами не наблюдается. На электронных микрофотографиях как одиночных, так и агрегатов клеток наблюдали первую стадию связывания коллоидного золота с клеточной стенкой бактерии

И---,---,---,-.-,---1-о

О 5 О 5 20 25

часы

Рис. 13 Кинетическая зависимость роста биомассы М-Медо (1), удельная адсорбция коллоидного золота мг золота/г сухой биомассы (2).

На рис. 13 представлена кинетическая кривая роста

биомассы клеток и коррелирующая с ней кривая удельной активности связывания коллоидного золота, из которой следует, что удельная активность связывания коллоидного золота увеличивается

пропорционально росту клеточной биомассы и максимальную золотоаккумулирующую способность клетки приобретают к кошгу логарифмической фазы роста. Кроме того мы обнаружили, что количество связанного золота в анаэробных условиях заметно уменьшается, в то время как начальная скорость связывания практически не изменяется.

Температурная зависимость адсорбции золота, характеризуемая широким максимумом в районе 20 - 25°, также свидетельствует о функциональном характере взаимодействия коллоидных частиц с поверхностью бактерий (оптимум роста М. Шеш 25° С). При приближении температуры к 70° оба типа взаимодействия практически исчезают. Зависимость скорости от концентрации Ли свидетельствует о сложном мехштзме взаимодействия частиц золота с клеткой, которую мы интерпретируем, как "активную" и "пассивную" биосорбцию.

Наблюдаемое влияние кислорода (в анаэробных условиях адсорбция золота клетками М. Шеиз снижается на 40-50%) на процесс адсорбции коллоидного золота свидетельствует о важной роли степени энергизованности клетки и, следовательно, влиянии трансмембранного электрохимического потенциала на этот процесс. Образование мембранного электрохимического потенциала происходит в результате переноса электрона по дыхательной электрон транспортной цепи, однако, влияние коллоидного золота на этот процесс и взаимодействие его с мембранными редокс -компонентами остается неизученным. В следствии этого, мы начали исследовать влияние золота на оксидорсдуктазную систему дыхательной цепи ,а также влияние переноса электронов на процесс окисления и возможной перекристаллизации золота клетками М. Ыаи.

Полярографический анализ содержания кислорода в суспензии клеток показал заметное увеличение интенсивности дыхания в присутствии золя коллоидного золота. При этом количество поглощешгого кислорода увеличивалось на 55 % (в единицу времени), и золото адсорбировалось на поверхности бактерий в количестве 50 мг на 1 г сухой биомассы. Кинетические исследования показали, что при концентрации золота от 10 до 50 мг на 1 г сухой биомассы наблюдается адекватное повышение уровня дыхания. Дальнейшее увеличение количества золота дает обратный эффект. При изменении рН в диапазоне 6,0 - 8,5 степень и скорость адсорбции клетками МАШеш практически не изменяется.

На рис. 14 приведены данные по влиянию некоторых ингибиторов электрон транспортной цепи (ЭТЦ) на процесс поглощения кислорода клетками в присутствии и отсутствие золота. Видно, что золото уменьшает степень ингибирования таких соединения, как ЭДТА, N3^ и, особенно, о - фенантролина, т. е. дыхание клетки с золотом оказывается заметно выше контроля.

Рис. 14 Влияние коллоидного золота и ингибиторов дыхания на поглощение кислорода клетками M.íuteus: 1 - исходные клетки; 2 -клетки с коллоидным золотом (25 мкг Au/мг сухой биомассы); 3 -клетки + о-фенантролин или а,а. - дипиридил; 4 - клетки + а -нафтол или NaN3_

С другой стороны, дыхание клеток, подавленное а,а - дипиридилом, а - нафтолом и AgNOj золотом не активируется. Это наводит на мысль о различии участков дыхательной цепи, активируемых золотом и ингибируемых о - фенантролкном, ЭДТА и NaNj. Из рисунка следует, что использованные нами соединения в различной степени ингабируют связывание золота клетками. Интересно, что о -фенантролин и ЭДТА ингабируют дыхание на уровне НАДН- и малат- дегидрогсназного участка ЭТЦ и, по-видимому, действие золота проявляется в активации других дегидрогеназ (напр. малат - и сукцинат - ДГ). Наиболее заметно ингибирование дыхания проявляется при действии <х - нафтола, который ингибирует процесс связывания золота практически на 100%. Это тем более интересно в связи с тем, что а - нафтол является конкурентным ингибитором мембранного природного переносчика электронов в мембранах М. ¡uteus. - менадиона.

В работе [Zannoni et.al., 1986J показано что альтернативная оксидаза (цитохром "о") клеток Rhodabacter capsúlales взаимодействует прямо с хинонными переносчиками электронов, а согласно данным работ [Тихонова и др., 1981, Artzatbanov, Ostrovsky, 1990] именно менадион в клетках М. ¡uteus является триггером, переключающим перенос электрона с цитохромоксвдазного пути на вторую терминальную оксидазу - цитохром "о" (цитохром ¿553) и обратно. Блокирование нафтохинонового мембранного "челнока" а - нафтолом приводит к полному ингибированию, как дыхания, (переноса электронов к терминальным оксидазам) так и поглощения золота, по-видимому

благодаря, резкому изменению мембранного потенциала, приводящего к изменению поверхностного заряда всей клетки.

С целью перераспределения электронов и увеличения потока электронов на цитохром "о" к клеткам М. 1Шеш был добавлен экзогенный менадион (М) - (2 - метил, 1,4 - нафтохгаюн) и его полугидрофильный аналог 4 - сульфонат - 1,2 - нафтохгаюн (СНХ). Различие между ними заключается в том, что первый - природный переносчик электронов, локализуется во всем объеме мембраны, тогда как второй жестко локализован в приповерхностном слое, благодаря гидрофильной сульфогруппе. На полярографических кривых дыхания клеток (рис. 15) можно наблюдать значительное увеличение скорости дыхания в присутствии СНХ и, в особенности в присутствии М.

t, мин

Ряс. 15 Влияние коллоидного золота и аналогов менахинонового пуля на поглощение кислорода, клетками M.luteus: 1- исходные клетки; 2 -клетки с коллоидным золотом( 10 мг Аи/1 г сухой биомассы); 3 -клетки + СНХ конечная концентрация Ю'°М); 4 - то же + колловдное золото; 5 -клетки + М; 6 - то же + коллоидное золото.

В этих опытах добавление коллоидного золота очень незначительно изменяло интенсивности поглощения кислорода, что свидетельствует о некоторой аналогии влияния экзогенного менадиона и коллоидного золота на. перенос электронов к терминальным оксидазам. Учитывая, что избыток нафтохинонов увеличивает поток электронов именно к терминальному цитохрому "о", генерирующему перекись водорода [White, Clark, 1988), обнаруженное нами комплексообразование коллоидного золота с лизином, аргинином и, особенно, с триптофаном, а также возможность образования ковалентных связей золота с NH2- и SH-группами [Freeman et.al,], можно представить, что перекись водорода, генерируемая цитохромом *о" восстанавливается связанным золотом,

одновременно окисляя его до Au(I) ( в работе [Watkins et. al, 1987] показано что в клетках Chlorella vulgaris комплекс Au(I) с азотным лигандом очень стабилен). Кроме того известно, что, в золотосодержащем белке Au - тионеине золото имеет степень окисления I и находится в виде двухкоординированного комплекса. Быстрое исчезновение перекиси интенсифицирует поток электронов к этой терминальной оксидазе, что приводит к увеличению потребления кислорода. Перенасыщение пула нафгохинонов увеличивает скорость образования Н2О2, которая начинает превышать скорость окисления золота, что отражается на исчезновении эффекта стимуляции дыхания золотом.

Заметное влияние коллоидного золота на компоненты ЭТЦ, казалось бы , противоречит наблюдению, что золото адсорбируется главным образом на поверхности клеточной стенки. Поэтому, мы изучили влияние золота на редокс состояние цитоплазматической мембраны М. luteus. Были исследованы окислительно восстановительные превращения нитроксильных спиновых зондов в мембранах клетки и влияние на этот процесс золя коллоидного золота. Использовали два гидрофобных спиновых зонда: 4 - (ундецил - 3 - оксил - 4,4 - диметил - 2 - оксазолидинил) - масляная кислота (С5) и 15 - (2 - этил - 3 - оксил -2 - оксазолидинил) - миристиновая кислота (Ci6).

Спектр метки С5, представляет собой сумму двух спектров -метки в водной фазе (один из пиков A3) и метки в лилидной фазе (AjH А2). Форма спектра свидетельствует, что значительная часть метки встроилась в липидный бислой клеточных мембран. Была измерена кинетика восстановления нитроксильного радикала внутриклеточными восстановителями (рис. 16).

А%

иин

Рис. 16 Кинетика восстановления радикала С5 в присутствии и отсутствие коллоидного золота.

Оказалось, что восстановление метки в присутствии золота, адсорбированного на поверхности бактериальной клетки, происходит

26

Оказалось, что восстановление метки в присутствии золота, адсорбированного на поверхности бактериальной клетки, происходит значительно медленнее, чем в контрольном варианте. Это наблюдается, как для водорастворимой (А3), так и для мембранных (А^ и Аз) компонентов спектра. С другой стороны, форма спектра и параметр 2Ац, характеризующий подвижность метки, не зависит от присутствия золя золота, что свидетельствует об отсутствии непосредственного взаимодействия частиц коллоидного золота и спин - меченой жирной кислоты, что может объясняться невысокой концентрацией золота или недоступностью нитроксильной группировки, находящейся на С5 атоме жирной кислоты, для частиц коллоидного золота.

На рис. 17 приведена кинетическая зависимость вех становления спинового зонда, обладающего нитроксильной группировкой глубоко погруженной в лгапщный бислой (С^).

мин

Рис. 17 Кинетика восстановления зонда С^ ■ присутствии (1) и отсутствие (2) коллоидного золота.

Форма спектра свидетельствует об анизотропном вращении радикала и отражает значительно более жидкое окружение в центре бислоя. О восстановлении радикала судили по изменению амплитуды низкопольной компоненты спектра. Как и в случае зонда С5 заметно значительное уменьшение скорости восстановления зонда С^ в присутствии золота, т. е. частицы коллоидного золота влияют на окислительно - восстановительную обстановку практически по всему профилю мембран М.1Шет.

'На рис. 18 показано в/ишпге ингибиторов ЭТЦ и коллоидного золота на кинетику восстановления зонда Ск;. Использовались ингибиторы, которые применялись при изучении влияния золота на дыхание клеток. При добавлении к такому образцу а - нафтола сигнал ЭПР появляется вновь и не изменяется во времени, что указывает на полное блокирование гафтохгаюнового пула.

приводящее к прерыванию ЭТЦ и исчезновению восстановительных эквивалентов для нитроксильного зонда .

а«

Вроде, инк

Рис. 18 Влияние ингибиторов на кинетику восстановления зонда C}g в клетках М. luteus. а — исходные клетки; б — клетки в присутствии коллоидного золота (25 мкг золота/мг сухой биомассы); д — клетки, обработанные а-нафтолом, в — клетки, обработанные о-фенантролином в отсутствии коллоидного золота, г — клетки, обработанные о-фенантролином в присутствии коллоидного золота. Концентрации ингибиторов 1 мМ.

При добавлении к образцам, меченным зондом Си;, о -фенантролина наблюдается существенное замедление восстановления спинового зонда, что, по-видимому, связано с ингибированием переноса электрона от NADH - дегидрогеназы]. Тем не менее, восстановление зонда происходит при переносе электрона от других дегидрогеназ (сукцинат ДГ, лакгат ДГ и др.) к цитохромоксидазе (цит. а,аз). Добавление коллоидного золота, которое сдвигает перенос электронов из менахинонового пула к альтернативной оксидазе - цитохрому - "о", практически полностью прекращает восстановление нитроксильного радикала зонда, который, следовательно, восстанавливается, главным образом, на цитохромоксидазном участке ЭТЦ.

Аналогичные результаты получены при исследовании кинетики восстановления зонда Cs в присутствии ингибиторов. Тот факт, что восстановление зонда С$ происходит значительно быстрее, чем зонда Ci6, не удивителен, т. к. пространственно ншроксильная группа зонда С5 находится ближе к поверхностному элекгронноакцепторному участку цитохромоксидазы, чем группа зонда Ci6.

9R

электронноакцепторному участку цшохромоксвдазы, чем группа зонда Ci6.

Для перераспределения потока электронов к терминальным окевдазам и для увеличения мембранного менахннонового пула к клеткам М. luteus со встроенным зондом С5 был добавлен экзогенный менадион (QH2) (рис. 19).

А % 103-

во-ш

2 3 4 Время, кин

Рве. 19 Влияние менаднона на кинетику восстановления зонда С5 в клетках М. luteus : 1—исходные клетки; 2—клетки в присутствии коллоидного золота, 3—клетки, обработанные менадионом; 4—клетки, обработанные менадионом и коллоидным золотом. Концентрации зонда и феррицианида калия I мМ, менадиона - 2 х 10" М; буфер Трис - НО 0,005 М, pH 8,0.

Как было показано нами ранее, скорость клеточного дыхания при этом заметно увеличивается, однако скорость восстановления спинового зонда С5 при этом остается неизменной. Это означает, что нитроксилыгый радикал не восстанавливается непосредственно компонентами менахионового пула. Добавление золя золота к югтактным клеткам приводит к существенному замедлению восстановления зонда, а в клетках, перенасыщенных менадионом, радикал практически не восстанавливается (рис. 19, кривые 2 и 4), что можно объяснить переориентацией потока электронов в направлении цитохрома "о" (цитохром bsss). Цшохромоксидазный участок, на котором, по-видимому, происходит восстановление зонда, оказывается в дефиците восстановительных эквивалентов, что и следует из анализа кинетических кривых восстановления спиновых зондов. Все эти выводы можно проиллюстрировать на модифицированной нами схеме В.Ю. Арцатбанова и Д.Н.

Островского [Тихонова и др., 1981; АпгаЛапоу, ОБЦхтку, 1990], где пунктирными линиями показаны участки действия ингибиторов ЭТЦ:

При добавлении менадиона к клеткам M.luteus наблюдается небольшое увеличение скорости восстановления зонда С5, что объясняется увеличением нафтохинонового пула и, соответственно, восстановительных эквивалентов. Так хе, как и в предыдущем примере, золото, увеличивая поток электронов к цитохрому "о", замедляет процесс восстановления радикала зонда.

На приведенной выше схеме окисленные комплексы Au(I) могут восстанавливаться в цепи переноса электронов или диспропорционироватъ до Аи(0) и Au(III). Образовавшиеся атомы золота в нулевой степени окисления могут инициировать образование центров нуклеации для дальнейшего роста кристаллов золота. Как было показано выше в клетке могут зарождаться совершенно различные по своей сингонии кристаллы - кубические, гексагонально - октаэдрические и др. Механизм, по которому начинают развиваться эти формы кристаллов совершенно не известен и требует дополнительных исследований. В работе [van Blaaderen, 1997] показано, что коллоидная кристаллизация может осуществляться собирательным образом, путем осаждения на "шаблонный субстрат", служащий моделью его будущей сингонии. Т. е., в какой-то степени форма кристалла может отражать матрицу структурных компонентов бактериальной клетки или даже самой клетки, что, в некоторой степени, постулируется в работе fWatteison, 1974]. Рассматривая биохимический механизм окислительного комплексообразования коллоидного золота нужно учитывать, что в природных условиях происходит перенос также различных

^ NaN3

а -нафтол 2НгО «г— 02 ^/е'

кристалл

Au(O) + Au(lll)

комплексных ионов золота, которое также, как показано выше, могут эффективно адсорбироваться клетками микроорга!тзмов. Как было показано выше, клетки М. Шеиз могут адсорбировать до 45% ионного золота на единицу сухого веса биомассы с дальнейшим его восстановлением и кристаллизацией на поверхности бактерий.

С целью выявления клеточных компонентов, ответственных за поглощение золота, был осуществлен лизис клеточной стенки и получены фракции, содержащие компоненты лизированных клеточных оболочек - над осадочная жидкость после центрифугирования (22000 30 мин) и фракция клеток, лишенных оболочек - сферопласты.

Рис. 20 Полярографические кривые поглощения кислорода с феро пластами и над осадочной, полученными из клеток M.luteur. а)-

н ад осадочная от получения сферопластов; б)-исходные сферопласты; в)-надосадочная, обработанная коллоидным золотом; г)-сферопласты, обработанные коллоидным золотом; д)-сферопласты, объединенные с над осадочной, е)-сферо пласты, объединенные с надосадочнон и затем обработанные коллоидным золотом, ж)-сфсро пласты, обработанные CHX; э)-сферопласты, обработанные CHX, а затем коллоидным золотом. Концентрация белка в ячейке с надосадочной жидкостью 1мг/мл, концентрация коллоидного золота 0,4 мкг/мл. Концентрация белка в ячейке со сферопластами 40мг/мл, концентрация коллоидного золота 14 мкг/мл.

Видно, что фракция, содержащая преимущественно компоненты клеточных оболочек, не проявляла дыхательной активности (рис. 20 а). Фракция сферопластов слабо поглощала кислород (рис. 20 б). Добавление коллоидного золота к каждой фракции в отдельности не приводило к заметной активации дыхания (рис 20 в, г). В то же время при объединении обеих фракций процесс дыхания

восстанавливался до исходного уровня и одновременно увеличивалась его интенсивность в присутствии золота (кривые д, е). Однако это увеличение составляло всего лишь 10% и по спектрам поглощения реконструированные клетки в отличие от исходных не способны полноценно адсорбировать коллоидное золото на своей поверхности. Очевидно, что для осуществления этого процесса необходима целостная структура оболочки. Так добавление к сферопластам СНХ в отсутствие компонентов клеточных стенок, приводило к значительному увеличению поглощения О2 в присутствии Аи (кривые ж, з), как и было показано на интактных клетках. Некоторое увеличение оксидазной активности при добавлении к сферопластам коллоидного золота свидетельствует, что какое-то количество золота связывается с мембранами, это можно объяснить во-первых тем, что часть разрушенной клеточной стенки осталась на поверхности сферопластов и эта часть участвует в адсорбции золота. Во-вторых, мы исследовали возможность участия бактериальных липидов, формирующих структуру бислоя сферопластов, в адсорбции коллоидного золота.

Известно, что бактерии М.Ыею содержат четыре главных структурных липида в составе плазматической мембраны. Это кардиолигаш, диматозилдиацилглицерол, фосфатидилглицерол и фосфатидилинозитол (Р1) {с1е Вопу е1 а!., 1989]. Из сферопластов М/и/йм мы получили суммарную фракцию липидов и, полученные фосфолипидные везикулы обладали способностью связывать и флокулировать золь коллоидного золота на своей поверхности. Для выявления конкретного липидного компонента, ответственного за связывание золота проводили препаративную тонкослойную хроматографию. Исследование взаимодействия золота с липосомами из индивидуальных липидов показало, что только липосомы из Р1 способны связывать частицы коллоидного золота Тем не менее, следует учесть, что содержание Р1 составляет только 3% от всех липидов плазматической мембраны клеток М. Меш.

Ясно, что целостность клеточной стенки определяет лишь первоначальный этап закрепления частиц коллоидного золота на поверхности микрококков, в то время как ведущая роль в процессе трансформации Аи принадлежит структурным комплексам протопластов. Количественный анализ на содержание Аи во фракциях бактериальной клетки подтвердил этот вывод.

Практически все золото, утилизированное интактными клетками М.Ыеш, находилось во фракции сферопластов. Надосадочная жидкость не содержала Аи. Такое распределение наблюдалось нами при введении в инкубационную смесь строго определенного количества коллоидного золота (не более 0,3-0,5 мкг Аи/мг белка), которое активно трансформируется клетками М. ¡Шеиз в первые же минуты инкубации. Превышение этого количества приводит к ингибированию дыхания сферопластов.

С целью выявления молекулярных комплексов, ответственных за связывание Ли, сферопласты, полученные из клеток обработашгых золотом, разрушали ультразвуком, гомогенат центрифугировали при 80000 g в течении 2 часов и определяли количество Au в получешгых фракциях. Все золото, накопленное клетками М. luteus, оказалось связанным с мембраш!ыми частицами. Для того чтобы выяснить с какими молекулярными компонентами этих частиц связано золото, была проведена бутанольная экстракция мембран. Оказалось, что бутанольная вьпяжка, в которую переходят липиды и каротиноиды, не обнаруживает даже следовых количеств Au, в то время как водная фаза, в которой остаются практически все мембранные белки, содержит и все золото. Таким образом, совершенно очевидно, что коллоидное золото полностью трансформировалось (согласно приведенной выше схеме) благодаря окислительному комплексообразоваяию в золото - белковые компоненты в цитоплазматической мембране клеток М. luteus.

ВЛИЯНИЕ ЗОЛОТА НА ЭНЕРГЕТИКУ И МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ

Как известно, функцией бактериальной дыхательной цепи является генерация электрохимического мембранного потенциала и синтез АТФ, и поэтому в клеточных суспензиях Bacillus cereus и Pseudomonas alcaligenes было исследовано влияние золота на эти процессы. Оказалось, что поверхностно активные детергенты -додецилсульфат натрия и Тритон X - 100 разрушают структуру клеточных стенок и мембран бактерий, приводя к полной потере изучаемых микроорганизмов взаимодействовать с коллоидным золотом. В разобранном состоятш отдельные компоненты бактериальной клетки неспособны влиять на свойства золя золота, т.е. необходима целостность белково - лиги юных структур и цепей переноса электронов. Разобщитель окислительного

фосфорилировання 2, 4 - динитрофенол в концентрации менее 5 х 10"5 М слабо стимулирует процесс флокуляции золя золота (рис. 21, кривая 2), однако в более высоких концентрациях препятствует связыванию и флокуляции и гетерокоагуляции золя золота (кривая 3). В этом случае блокируется перенос электронов по дыхательной цепи в пункте сопряжения с синтезом АТФ. Действие динитрофенола свидетельствует от важной роли электрохимического потенциала плазматической мембраны в участии энергозависимых редокс - процессов в реакциях укрупнения и кристаллизации коллоидного золота. Аналогичные результаты получены при изучении действия известного антибактериального вещества HgCl2 на бактерии В. cereus. на рис. 21 представлена кривая(5), свидетельствующая о заметном уммтыиении скорости флокуляции золя в присутствии 10"4 М сулемы. Помимо известной реакции с сульфгидрилъными группами ионы ртути конкурируют с ионами

золота (в особенности Au(III) в реакциях с мягкими лигацдами (Гис, Apr, Мет и др.).

А

те

4

05

о

5

2

. 1

001 -

I

6

I

10

Рис. 21. Кинетические кривые изменения агрегатнвной устойчивости коллоидного золота (10 им) в бактериальных суспензиях: Реакционная среда - 2 - мМ фосфатный буфер, рН 7,2, 10"5 М коллоидного золота, 2 мг/мл клеток в расчете на сухую биомассу: 1-Я. сегеш + золь золота: 2 - 5 х 105М ДНФ: 3 - 2 х 10"3 ДНФ: 4 - Р. Лы/гел + золь золота: 5 - Ю-4 М ЩС12.

Приведенные данные по ингибированию свидетельствуют, что наблюдаемое взаимодействие бактерий с коллоидным золотом существенно отличаются по механизму от реакций, где агрегация происходит путем взаимодействия частиц золота с низкомолекулярными продуктами метаболизма бактерий, происходящему, по - видимому путем повышения концентраций противоиона сверх порога коагуляции частиц.

Суммируя все приведенные выше данные, можно утверждать, что процессы адсорбции, гетерокоагуляции и перекристаллизации коллоидного золота в бактериальной суспензии связаны с редокс -превращениями мембранной дыхательной цепи и трансмембранным электрохимическим потенциалом цитоплазматической мембраны бактериальной клетки. На приведенной в предыдущем разделе схеме золото смещает равновесие перераспределения электронов в клетках М.1Шеш в сторону альтернативной оксидазы - цитохрома "о", что изменяет редокс состояние внутримембранных переносчиков электронов и не может не сказаться на таком генераторе трансмембранного потенциала, как протонная АТФ - аза и, следовательно на энергетическом метаболизме всей клетки.

В связи с этим, очень интересно было проследить действие золота на цитоплазматическое пространство клетки. Для этого мы решили использовать естественный цитогшазматический зонд

присутствующий в жизнеспособных клетках М.1и1еш. В работах [Бшиоков и др. 1983; Островский и др., 1990] показано, что это соелзшенне (лизодектоза), обладающее при окислении характерным спектром ЭПР, является низкомолскулярнмм водорастворимым продуктом метаболизма клетки с М.В. = 559 Да.

Опыты показали изменение амплитуды сигналя лизодектозы в присутствии различных концентраций золя золота, Заметно уменьшение амплитуды сигнала с увеличением концентрации золота, хотя скорость уменьшения происходит примерно по одинаковой экспоненте. Учитывая, что золото изменяет направление переноса электронов в ЭТЦ (уменьшение скорости восстановления зонда С)6 и увеличение скорости поглощения Ог), это можно объяснить уменьшением восстановительных эквивалентов переносимых на шпохромокендазу и увеличением переноса электронов к цитохрому "о", тго и приводит к частичному восстановлению внутрицитоплазматического естественного зонда - лизодектозы.

Ингибитор дыхания а-нафтол (рис. 22. кривая 3) резко уменьшает амплитуду сигнала ЭПР лизодектозы, в связи с блокированием мембранной ЭТЦ, т.е. неизрасходованные внутриклеточные восстановители в основном восстанавливают нитроксильный радикал лизодектозы. В этом случае золото, оказывающее свое влияние на мембранном уровне, практически не влияет на изменение амплитуды сигнала ЭПР (кривая 7).

Несколько иная ситуация наблюдается в присутствии ингибитора о-фенантролина, когда благодаря частичному изп-ибированию ЭТЦ (кривая 2), неизрасходованные субстраты некоторых дегидрогеназ восстанавливают радикал лизодектозы практически на 50% (Это соответствует уменьшению оксидазной активности клеток). Добавление золя золота заметно стимулирует рост оксидазной активности, что приводит к увеличению амплитуды сигнала ЭПР практически до исходного уровня (кривая 6). Примерно такая же амплитуда сигнала ЭПР лизодектозы наблюдалась при ингибировании дыхания цианидом натрия (кривая 4). Действие золота в этом случае может объясняться как сдвигом потока электронов к цитохрому "о" (менее чувствительному к цианиду, чем цитохромоксидаза), так и снятием с мембранных участков цианидных лигандов, с образованием прочного комплекса Аи(СН)2.-ЧТО приводит к уменьшению восстановительного потенциала цитоплазмы клетки и, соответственно, к уменьшению степени восстановления радикала. В любом случае амплитуда сигнала ЭПР лизодектозы возрастает (рис. 22, кривая 8). Таким образом, эти данные подтверждают предположение, что участок действия золота находится в цепи переноса электронов к терминальному цитохрому "о",

В работах [Левченко и др., 1993; Левченко и др., 1996] показано, что золото в значительной степени трансформируется, приобретая, по-видимому, другие степени окисления, и накапливается в цитоплазматичесхой мембране клеток \f.luteus в концентрациях 40-

50 мкг на мг мембранного белка. Часть этого золота (а может быть все) прямо входит в структуру макромолекулы белка, обладающего молекулярной массой 600 кДа.

ю>

о->-Р-■-1-■-1---1---1---,

2 < в а ю 13

Вршив

Рис. 22. Влияние золота и ингибиторов ЭТЦ на амплитуду сигнала ЭПР лизодектозы. 1—интактные клетки M. luteus, 2~клетки + коллоидное золото, 3—клетки а-нафтол, , 4—клетки + а-нафгол + коллоидное золото, 5—клетки + о-фенантролин, 6—клетки + о-фенантралин + коллоидное золото. Концентрации ингибиторов 1 мМ, феррицианида 0,7 мМ.

Роль внутрямембранного золотосодержащего белка мы попытались выяснить, рассматривая его влияние на поведение состояния радикала - лизодектозы. Было показано, что добавление этого белка (золотосодержащего) к цитозолю клетки влияет на редокс состояние радикала ,в отличие от такого-же белка не содержащего золота. Наблюдается восстановления радикала, что аналогично поведению радикала внутри сферопластов т.е. можно предположить, что все эффекты, наблюдаемые нами на целых клетках (коллоидное золото), сферопластах (внутримембранное золото) и увеличение окевдазной активности связаны с действием именно этого белка.

Микробиологическая геохимия золота

Известно, что большинство, если не все, элементы периодической таблицы претерпели геохимические превращения в докембрии, архее и протерозое и, по-видимому. только геохимический цикл кремния является более поздним фанерозойским процессом. Общая схема таких преобразований представляется следующим образом: микроорганизмы участвуют в образовании осадочных пород, которые в последствии, в результате

метаморфизма, формируют гранитный слой. С другой стороны, при остывании магматических очагов в определенной последовательности кристаллизуются изверженные породы. Таким образом, ншроко распространенные гидротермальные месторождения являются полигенетичными - элементы поступают ,как из осадочных пород , так и из магматических источников. В результате окисления и выветривания рудные месторождения разрушаются, формируя осадочные породы и т. д. Этот процесс происходит в рамках концепции большого крутопорота веществ в земной коре, предложенной В. И. Вернадским.

В настоящий период геомикробиологический цикл элементов происходит еще быстрее, благодаря увеличению биомассы, и изучение этих процессов позволяет экстраполировать полученные экспериментальные данные и данные /я vivo на древний период развития земной коры. На примере золота мы попытались оценить этот геомикробиологический цикл.

Размеще1ше металлических руд около поверхности земной коры обычно объясняется заметным изменением физических и хишгческих параметров - концентрацией металлов на геофизических и геохимических барьерах. Однако, именно эти барьеры являются границами биосферы и зонами изменения направления геохимических процессов, смещая градиенты трансформации пород и рудного вещества, определяемых биохимическим катализом.

Прежде ,чем перейти к вопросу взаимодействия

микроорганизмов с различными формами золота, рассмотрим геохимическое повеление золота в процессе формирования земной коры.

ГЕОХИМИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИКА ЗОЛОТА

Широкое распространение золота в самородном состоят«! объясняется наличием двух стабильных степеней окисления Au(I и ГН), благодаря чему при восходящей миграции изначальные формы его переноса, стабильные в высокотемпературных глубинных условиях, (Аи(1) трансформируются в формы Au(III), типичных для приповерхностных условиях, в результате развития реакций диспропорционирования ( с осаждением части золота в виде самородного металла): 3AuCl = 2Аи + АиС1з, а в гипергенных гидратированных условиях - 3AuCl + Н2О = 2Au + H2IA11CI3O].

Низкие температуры и давления близ дневной поверхности приводят к появлению хрупких пород подвергаются процессу выветривания, при которых атмосферные, гидросферные и биологические процессы обуславливают развитие новых минералов золота. В приповерхностных условиях значительно увеличивается концентрация бромидных, иодидных, тиосульфатнъгх, тиоцианатных и цианидных (как правило имеющие биогенное происхождега1е) комплексов золота, что увеличивает его миграциозшую способность.

При рассмотрении окислительно-восстановительных потенциалов золота в присутствии органических и неорганических лигандов видно, что золото имеет тенденцию образовывать двухкоординационные одновалентные комплексные соединения с мягкими Льюисовскими лигандами (амино- окси- и серосодержащими). Кроме того, на примере золото-тионеинов, четко выявляется способность золота образовывать двух координационные комплексы с сульфгидрильными группами аминокислотных цистеиновых остатков белков. Это подтверждает наше предположение, что в процессе бактериального окисления и перекристаллизации золота на первом этапе образуется золото в степени окисления I (схема в главе 2). Впоследствии, золото может восстанавливаться эндогенными восстановительными эквивалентами бактерий или диспропорционировать до Аи(0) и Аи(Ш). Возможность окисления Аи(0) перекисью водорода, который является конечным продуктом терминального цитохрома "о" также термодинамически реальна. Окислительный потенциал реакции 2НзО = Н2О2 + 2Н+ + 2е" равен -1,77 В0, т.е. при взаимодействии Аи(0) с Н2О2 при образовании, например, комплекса с мочевиной (С8(ЬШ2)2 окислительный потенциал - 0,38 В0), следует ожидать, что реакция будет протекать самопроизвольно в прямом направлении, естественно при наличия хотя бы такого окислителя , как перекись водорода. В предыдущих разделах автореферата нами была показана возможность образования прочного комплекса золота с триптофаном при окислении перекисью водорода и, хотя, скорее всего, это не единственный механизм окислительного комплексообразования золота бактериальной клеткой, но это основной путь инициирования микробиологической трансформации золота. Из вышеприведенных данных ясно, что окислительное комплексообразование довольно быстрый процесс, тогда как кристаллизация происходит значительно медленнее и определяется временем проходящем между образованием центров нуклеации и началом кооперативного роста кристалла, при котором используется энергия бактериального метаболизма. При образовании "нового золота" в газово-жидких включениях отлагаются продукты бактериального метаболизма и катаболизма и, таким образом, изучение состава газово-жидких включений в золоте может служить индикатором, определяющим степень биогенности конкретного самородного золота.

газово - жидкие включения в золоте и обнаружение жирных кислот

В предыдущих разделах автореферата было показано, что на стадии осаждения микроорганизмы способны концентрировать, укрупнять и перекристаллизовывать золото. Однако возникает вопрос о возможности экстраполировать факты микробиологической трансформации золота происходящие в настоящее время на процессы

его генезиса в прошлом. В настоящей работе мы делаем попытку провести корреляцию между биогснностыо происхождения золога и химическим составом углеродистых веществ в гззово - жидких включениях самородного золота в россыпях и золото - рудных месторождениях Дальнего Востока.

В опытах по изучению углеводородного состава газово -жидких включений золота в исследуемой нами россыпи эти отклонения в пользу увеличения содержания высокоуглеролных и ненасыщенных углеводородов проявились еще отчетливей. Измерение углеводородного состава образцов золота в высокотемпературном интервале декрегпггации (290 - 430° С) показало "эндогенный" характер соотношения компонентов. Метан преобладает, хотя следует отмстить достаточно высокое содержание этилена и пропилена. В интервале 140 - 290° количество метана заметно уменьшается и наряду с ненасыщенными углеводородами С2 и С3 наблюдается повышенное содержание изо-бутана. При низких температурах декрегппации газовыделение радикальным образом отличается от состава газов в гидротермальных источштках. Практически полностаю исчезают насыщенные этан и пропан при заметном увеличении соответствующих ненасыщенных углеводородов, а содержание С4 - компонентов превышает содержание метана почти в 40 раз, и для некоторых образцов метан и низкомолекулярные насыщенные углеводороды полностью исчезают. Такое заметное изменещю углеводородного состава обстановке минерал ообразопания поверхностных слоев золотил,

низкотемпературных включений свидетельствует об окислительно)! Микроорпишзмы, присутствующие в зоне окисления золоторудных месторождений и россыпях в заметных количествах, разрушаются на ра!ших стадиях диагенеза, образуя, как в результате катаболизма, так и в результате метаболизма, аминокислоты, углеводы, нуклеотиды, жирные кислоты и т. д.

Сравнительно низкомолекулярные соединения могут участвовать в процессах окислительного комплексообразопаштя и последующей миграшш золота. С целью возможности такого переноса и дальнейшего осаждения золота мы исследовали жирнокислотный состав во включениях рудного и россыпного золота. В табл. 4 приведено процентное содержание жирных кислот во включениях рудного ("эндогенного") (1), рудного(из зоны окисления) (2) и россыпного (3) золота (образцы Б.Г.Моисеенко). Для изученных образцов вес жирных кислот превышает вес углеводородов более чем на порядок.

Преобладающими жирными кислотами оказались стеариновая( 16:0), линолевая(18:0) и линоленовая(18:1). Довольно неожиданным оказалось значительное количество разветвленных жирных кислот. Заметно некоторое различие в жирнокислотном составе между образцами золота из различных летом никои. Поэтому мы сгруппировали их по признакам - насыщенные, разветвлешше и

ненасыщенные кислоты и гистограмма их содержания представлена на рис. 23.

Таблица И. Жирнокислотный состав газово-жидких включений самородного золота.

Жирная кислота №1 №2 №3

12:0 1,37 0,46 0,28

31-13:0 0,45 0,19 0,53

13:0 0,73 0,37 0,53

¡-14:0 0,48 0,47 0,98

14:0 3,55 2,19 2,58

1-15:0 0,28 1,14 1,17

31-15:0 2,59 9,60 11,55

15:0 1,94 1,50 1,38

¡-16:0 0,65 0,51 0,54

16:0 22,67 18,53 16,93

16:1ю9 4,27 3,50 1,80

16:1ш7 - - 1,42

¡-17:0 0,49 0,79 0,68

31-17:0 0,40 0,37 0,30

17:0 2,18 2,48 1,36

17:1м8/9 0,56 0,56 0,57

18:0 12,64 12,23 9,41

18:1ш9 20,46 23,79. ■ . 26,50

18:1<я7 1,76 2,08 2,31

18:2(о6 5,04 . 5,13 6,56

20:1о)7 4,59 4,50 4.77

20:4ю6 - - 0,52

Неидентифицировашше кислоты 12,9 9,51 7,23

Рис. 23. Процентное соотношение насыщенных (1), разветвленных (2) и ненасыщенных (3) жирных кислот во включениях "эндогенного" золота (1), золота зоны окисления (2) и россыпного золота (3).

Наблюдается отчетливо видная тенденция к уменьшению процентного содержания насыщенных жирных кислот от рудного ("эндогенного") золота через зону окисления к россыпному золоту. С другой стороны, естественно, происходит увеличетк содержания разветвленных и ненасыщенных жирных кислот с увеличением степени окисленности окружающей среды т.е. среды минералообразования золота.

Транспортная, концентрационная, барьерная и ресурсная функция микроорганизмов

Рассмотрим микробиологическую геохимию золота, как функцию микроорганизмов, состоящую из четырех частей: транспортная функция (ТФМ); концентрационная функция (КФМ); ресурсная функция (РФМ); барьерная функция (БФМ). Так ТФМ реализуется практически полностью в результате метаболизма и катаболизма микроорганизмов. Как показано в главе 1 самые разнообразные органические соединения, составляющие бактериальную клетку, могут являться лигаядами, формирующие растворимые и высокоподвижные в водной среде комплексы золота. Огромное значение для реализации ТФМ имеют хемолитотрофные микроорганизмы, выщелачивающие золота из разнообразных руд и пород (золото в них существует в виде тонкодисперсных частицу, в атомарном состоянии и в виде органических комплексов - главным образом, в ореолах рассеяния черносланцевых месторождений), открывая доступ к нему подземных и поровых вод. Ряд исследователей полагают, что в Океане основной формой золота является хлор - ауратный комплекс, тогда как в поверхностных водах

открывая доступ к нему подземных и поровых вод. Ряд исследователей ползгают, что в Океане основной формой золота является хлор - ауратный комплекс, тогда как в поверхностных водах основной формой миграции золота являются его комплексы с гуминовымн кислотами [Юдович, Кетрис, 1094). Сейчас становится ясным, что не менее важную роль в комплексообразовании и переносе золота принадлежит аминокислотам, и можно предположить, что громадная природная дисперсия золота обусловлена именно ТФМ.

В биогеохимическом цикле золота, по-видимому, главная роль принадлежит КФМ и данные, приведенные в главах 1 и 2 показывают, что именно живые микроорганизмы являются основными концентраторами и кристаллизаторами золота в экзогенных условиях.

БФМ можно представить на примере на примере обрастания золотин "новым" золотом, катализируемое гетеротрофными микроорганизмами, укрупнением золота в зоне окисления рудных месторождений, наблюдаемым в природных условиях "возрождением" россыпей, а также описанное выше обрастание кристаллов платины тонкой пленкой золота.

РФМ, по-видимому, опосредована образованием органического вещества. В наиболее изученных, в смысле транспортной, концентрационной, барьерной, ресурсной и средообразующей функции органического вещества, черносланцевых месторождениях золота выделяются три основные формы нахождения золота Auopr, АиСуЛьф и AUq, соотношение которых крайне изменчиво и зависит, как от условий седиментогенеза, так и постдиагенетической истории черных сланцев [Юдович, Кетрис, 1094]. Данные о соотношении различных форм Au, о генезисе черных сланцев и о функциональной роли органического вещества приведены в много'шеленных работах [Radtke, Scheiner, 1970, Springer, 1985, Коробейников, 1985, Буряк, 1982, Летников, Вилор, 1981 и др.]. В настоящей работе мы рассмотрели, главным образом. ТФМ и КФМ, играющими ключевую роль в биогеохимическом цикле золота. Частично на примере образования высокопробных каемок наблюдается БФМ. РФМ, по-видимому реализуется главным образом на золотоносных месторождениях черных сланцев. Оставшаяся за рамками нашей работы средообразуюгцая функция, по-видимому, имеет меньшее значение в рудогенезе золота и требует отдельного исследования.

В наших работах по исследованию гидротермального по происхождению малосульфидного, арсенопиритового месторождения Токур (образовавшегося в результате мезо-кайнозойсхой активизации) и дочерних ему россыпей четко прослеживается микробиологический биогеохимический цикл золота. Общую схему микробиологического преобразования золота от первичного рудного через зону окисления до россыпи можно представить следующим образом: Хемолитотрофные бактерии (силикатные и тионовые)

выщела'птвают руды и вмещающие породы (1), высвобождая при этом мелкое, тонкое и коллоидное золото. Тонкое и коллоидное золото, обладая большой относительной поверхностью может растворяться (стадия 2) до ионного состояния, образуя различные комплексы. Органические комплексы и коллоидное золото может переноситься водотоками, грунтовыми и норовыми водами на значительное расстояние и в этом проявляется транспортная функция микроорганизмов.

300 мкм 10 - 300 мкм

Образование коллоидных частиц (стадия 3) из ионного золота благодаря стабилизации их амфифнльными органическими соединениями идет самопроизвольно в физиологических условиях. Концентрирование, укрупнение и перекристаллизация коллоидного золота (стадия 4) детально описана в разделах 2 и 3, где предложен молекулярный механизм этого процесса. В разделе 2 продемонстрировано обрастание зологин "новым" золотом, приводящее к укрупнению частиц и обрастание их высокопробной каемкой (стадия 5).

Помимо микробиологической трансформации золота в уже сформированных месторождениях микроорганизмы участвуют также в новообразовании золота в областях активного вулканизма. Показано, что термофильные альго-бактериальные сообщества этих областей могут способствовать образованию полей концентрирования и укрупнения золота [Коробушкнна, Коробушкин, 19891. Кроме того содержание Аи в гидротермальных растворах подводных источников типа "черных" и "белых курильщиков" сопоставимы с его концентрацией в горячих водах современных источников, где оно достигает 120 мг/т [Некрасов, 1991]. Так. в гидротермальных источниках зон спредашга Тихого океана помимо железо-марганцевых конкреций и сульфидных руд обнаружены видимые зерна самородного золота [Silver, 1990].

ВЫВОДЫ

1. На примере гидротермального, малосульфидного месторождения золота арсенопиритового типа (Токур, Амурская область) показано, что формирование зоны окисления месторожде1П1я и прилегающих к

нему россыпей определяется двумя прямо противоположными процессами - микробиологической миграцией и концентрированием золота. В разрезе зоны окисления месторождения обнаружена корреляция между, возрастающей к поверхности концентрации, крупности и пробности золота и, увеличения общего количества гетеротрофных бактерий и количества золотофильных бактерий -флокулянтов.

2. Электронномикроскопически показана адсорбция ионного и коллоидного золота, с последующей гетерокоагуляцией, природными штаммами микроорганизмов (выделенными из различных горизонтов золоторудного месторождения Токур и россыпей), принадлежащих преимущественно к родам Bacillus, Flavobacterium, Corinebacterium, Micrococcus и Pseudomonas.

3. В лабораторных экспериментах показана реальная возможность окисления золота в физиологических условиях перекисью водорода в присутствии комплексообразующих аминокислот (являющихся продуктами метаболизма и катаболизма микроорганизмов) аргинина, гистидина и триптофана. Триптофан, являясь наилучшим лигандом для комплексообразования золота, на первой стадии образует прочный комплекс с золотом, который на второй стадии окисляется HjOj.

4. В лабораторных экспериментах показана возможность микробиологического минералообразовашм золота в экзогенных условиях. Показано образование многочисленных игольчатых кристаллов золота, длинною 1-5 мкм на поверхности клеток Bacillus cereus при полунепрерывном культивировании этих бактерий с коллоидным золотом в течение двух месяцев. В случае полунепрерывного культивирования бактерий Micrococcus luteus образовывались крупные кристаллические многогранники золота размером более 10 мкм, по-видимому благодаря немногочисленности центров нуклеации на поверхности клетки. Использование смешанной ассоциативной культуры бактерий (М. luteus + В. cereus) в подобных экспериментах приводило к образованию более крупных частиц золота (по механизму сращивания более мелких частиц), достигающих размера 1 мм.

5. Полунепрерывное культивирование бактерий М. luteus и В. cereus с частичками экзогенного россыпного золота приводило к изменению формы золотин и росту кристаллического "нового" золота на их поверхности. Этот процесс, вероятно, определяет механизм образования высокопробных каемок на поверхности золота в зоне окисления рудных месторождений и в россыпях.

6. Методом полярографического анализа показано, что золото существенно стимулирует дыхательную активность клеток М. luteus (количество поглощенного кислорода увеличивается на 55% в ед. времени). Используя ингибиторы бактериальной электроннотранспортной цепи (ЭТЦ) и изменяя степень насыщенности мембранного менахшюнового пула было показано, что золото влияет на перераспределение электронов ЭТЦ между

терминальными оксидазами бактерии, смещая поток электронов в направлении альтернативной оксидазы цитохрому "о" (цит. bj58).

7. Методом гидрофобных спиновых зондов было показано, что частицы коллоидного золота влияют на окислительно восстановительную обстановку практически по всему профилю мембран M.luteus. Методом ЭПР было подтверждено, что золото перераспределяет восстановительный поток электронов в направлении цптохрома "о", катализирующего, в отличие от цитохромоксидазы, образование перекиси водорода.

8. Разработана биохимическая схема фракционирования ишактных клеток М. luteus, обработанных коллоидным золотом. Фракцио1шрование клеток показало, что все трансформированное золото обнаруживалось во фракции сферопластов, а при дальнейшем разрушении и дифференциальном центрифугировании которых, золото обнаруживалось в мембранно-белковых комплексах.

9. Предложена схема, согласно которой коллоидное золото в результате комллексообразования и последующего окисления перекисью водорода, образует золото-белковые комплексы в цшоплазматической мембране клеток М. luteus. Избыточное золото (в степени окисления I и III) при восстановлении бактериальными эндогенными редокс эквивалентами служит зародышем образования центров нуклеации и последующей кристаллизации, приводящей к образованию кристаллов самородного золота на поверхности бактерий.

10. На примере штаммов бактерий Pseudomonas stutzen и Bacillus cereus, выделенных из золотоносных россыпей приисков , показано, что целостность мембранных белково-липидных комплексов необходима для процесса связывания, флокуляции золя золота и последующей гетерокоагуляции, т. е. для выполнения бактериальной концентрирующей функции. Действие разобщителей окислительного фосфоршшрования свидетельствует о необходимости поддержания стабильного трансмембранного электрохимического потенциала (д\р) в энергозависимых реакциях укрупнения и перекристаллизации коллоидного золота.

11. Исследован состав газово - жидких включений самородного золота первичных руд, окисленных руд и россыпей, где впервые обнаружены жирные кислоты, характерные для фосфолипидов микроорганизмов. Анализ содержания насыщенных, ненасыщенных и разветвленных жирных кислот показал, 'по измерение их соотношения может служить индикатором степени биогенностн происхождения золота.

12. В рамках обшей теории круговорота элементов В.И.Вернадского показано существование концентрационной, транспортной, барьерной и в некоторой степени ресурсной функции микроорганизмов, определяющею микробиологический цикл золота в общем круговороте золота в земной коре. Предложена модель микробиологического формирования месторождений золота.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Маракушев СЛ., Левченко ЛА., Лихтенштейн Г.И., Каплун А.П., Меклер В.М., Раевский А.В., Щвец В.И. Новая меркарбидная электронноплотная метка для исследования углеводородной части липидного биелоя. Ц Биол, мембраны. 1986. т. 3. №4. с. 423-427.

2 Моисеенко В.Г., Маракушев С.А. Возможное участие микроорганизмов в укрупнении и "облагораживании" самородного золота в россыпях и в зоне окисления коренных месторождений. // Тезисы докл. VIII совещания по геологии россыпей, 1987. Киев. с. 199-200.

3 Моисеенко В.Г., Маракушев С А. Бактериальное концентрирование укрупнение и "облагораживание" золота в зоне окисления золоторудных месторождений и россыпях. Препринт Благовещенск 1987. 45 с.

5. Levchenko LA., Raevskii A.V., Sadkov A.P., Marakushev SA, Pivovarova T.S., Neshev N.I., Likhtenstein G.I. The structural investigation of enzyme and membrane active centers with electron density labels method. // Тезисы докл. международного симпозиума Chemical physics of enzyme catalysis. 1987. September. 21-24, p. 81.

5. Маракушев CA., Балезина TJL, Ковалевская A.H. Роль редокс процессов при взаимодействии гетеротрофных микроорганизмов золотоносных месторождений с коллоидным золотом. // Дохл. АН СССР. 1988. т. 300. №5. с. 1211-1214.

6. Moiseenko V.G., Marakushev S A. The experimental model of biogenic gold mineralization // Abstracts II USSR - India Symposium "Experimental mineralogy. 1989, Chimkent. October. 16-21. p. 109-110.

7. Маракушев CA, Ковалевская A.H., Сафронов П.П., Бородавкина О.Н., Моисеенко В.Г. Бактериальная перекристаллизация золота. // Докл. АН СССР. 1989. т. 308. №2. с. 482-485.

8. Balezina T.L., Kovalevskaya A.N., Vasiliyev Y.K., Marakushev SA. Aurifilous bacteria from the ore deposit of the Soviet Far East.// Abstracts of III Soviet - Chinese Symposium "Geology and Ecology of Amur Basin. 1989. Blagoveschensk. v. 4. p. 19-20.

9. Моисеенко В.Г., Маракушев CA. Бактериальная биоминерализация золота. //.Тезисы докл. Ill Советско-Китайского симпозиума "Геология и экология бассейна реки Амур. 1989. Благовещенск, т. 2. с. 110-111.

10. Moiseenko V.G., Marakushev SA. Bacterial gold mineralization. // Absracts of the 15-th General Meeting of the International Mineralogical Association. 1990. Beijing. China, v. 1. p. 197-199.

II. Moiseenko V.G., Marakushev SA. The microbiological concentration of gold in the ore deposits and placers. // Abstract of the Pacific RIM 90 Congress, Qinsland, Australia. 1990. p. 453-456.

12. Marakushev V.G., Moiseenko V.G. The role bacteria in geochemistry and metallogenia of gold. // Abstracts of seventh conference on geology,

mineral and energy resources of southeast Asia (GEOSEA VII). 5-8 November, v.l p.2I2-113. 1991.

13. Маракушев С.А., Бардюк Д. В. Взаимодействие коллоидного золота с поверхностным слоем Micrococcus luteus. // Изв. АН СССР. 1991. №1. с. 142-145.

14. Moiseenko V.G., Marakushev S.A., Bacterial mineralogy Far East gold deposits and placers. Abstracts of Symposium // "Geology Mineral and Energy Resources of Southeast Asia. Thailand. Bangkok. 1991. vl. p. 324.

15. Маракушев СЛ., Куликов A.B., Балезина TJI. Влияние золя коллоидного золота на восстановле!ше нитроксильных спиновых зондов в клетках. // Биофизика. 1991. т. 36. вып. 3. с. 467-469.

16. Маракушев СА. Геомикробиология и биохимия золота. // М.: Наука. 1991. 111 с.

17. Marakushev SA. Microbiological transformation of gold in the Earth crust/ // Abstracts of XIX International Symposium, 1993.Kioto, Japan, II-14-6, P-68, p.704.

18. Левченко Л.А, Садков ATI., Маракушев СЛ., Ларионпева Н.В. Роль клеточных структур в трансформации коллоидного золота клетками Micrococcus luteus. // Биол. мембраны. 1997. т. 14. jvfel. с. 105-108.

19. Маракушев СЛ., Левченхо Л.А., Садков А.П., Куликов А.В. Влияние золота на мембранную электронно-транспортную цепь и шггоплазматическое пространство Micrococcus luteus // Биофизика, т.42, вып.б, с.817-821, 1997.