Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка визуальных и спектрофотометрических методов определения содержания каротиноидов и степени зрелости плодов томата

ВАК РФ 06.01.03, Агропочвоведение и агрофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка визуальных и спектрофотометрических методов определения содержания каротиноидов и степени зрелости плодов томата"

На правах рукописи

ЖУЖА Евгения Дмитриевна

РАЗРАБОТКА ВИЗУАЛЬНЫХ И СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КАРОТИНОИДОВ И СТЕПЕНИ ЗРЕЛОСТИ ПЛОДОВ ТОМАТА

Специальность: 06.01.03 - агрофизика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

ооьиэ*---

Тирасполь-2013

005059445

Работа выполнена в Приднестровском государственном университете им. Т.Г. Шевченко

Научный руководитель:

Хлебников Валерий Федорович, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Приднестровский государственный госуниверситет им. Т.Г. Шевченко, зав. кафедрой ботаники и экологии

Официальные оппоненты:

Макарова Галина Александровна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник по специальности «Генетика», главный научный сотрудник отдела светофизиологии и биопродуктивности агроэкосистем ГНУ Агрофизический институт Россельхозакадемии

Банкина Татьяна Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры агрохимии биолого-почвенного факультета, Санкт-Петербургский государственный университет

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный аграрный университет

Защита диссертации состоится «20» марта 2013 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 006.001.01 при ГНУ Агрофизический научно-исследовательский институт Россельхозакадемии по адресу: 195220 Санкт-Петербург, Гражданский пр-т, д. 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Агрофизического научно-исследовательского института

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор биологических наук

Е.В. Канаш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Функции каротиноидов в растениях весьма многогранны. Теории, объясняющие эти функции, основаны, главным образом, на способности этих соединений поглощать кислород, а также световую энергию в синей области видимого спектра. Каротиноиды участвуют в общем обмене веществ, в процессах фотосинтеза, окислительно-восстановительных реакциях, влияют на ростовые процессы и развитие растений, на половые функции растений и т.д. (Лебедев, 1948; Луковникова, 1966; Мануелян, 1967; Мерзляк, 1989; Мерзляк, Гительсон, Чивкунова и др., 2003).

Каротиноиды, в частности ß-каротин, в организмах людей и животных превращается в витамин А, необходимый организму для нормальной работы органов зрения, роста и размножения всех клеток, поддержания нормального состояния кожи, волос, зубов, слизистых оболочек дыхательных путей. Особенно важно его влияние на развитие эмбриона, вследствие чего его называют вторым витамином размножения (Шнайдман, 1950). М. Вольф и К. Рансберг (1976) установили, что витамин А оказывает защитное действие при различных злокачественных процессах. В последние годы появилось много работ, подтверждающих антираковое действие витамина А и некоторых каротиноидов, например, крацетина, ликопина (Giovannucci, Rimm, Liu, Stampfer et al., 2002; Heber, Qing-Yilu, 2002; Campbell, Canene-Adams, Lindshield et al., 2003). Обнаружено, что витамин А и его производные могут предотвращать канцерогенез эпителиальных тканей. Установлено, что и ß-каротин может предупреждать рак кожи, вызываемый канцерогенами или ультрафиолетовым облучением (290-320 нм).

В основе традиционных методов определения содержания ß-каро-тина и ликопина в плодах томата лежат химические анализы (Мурри, 1958; Meredith, Purcell, 1966; Мануэлян, 1967; Ермаков, 1972; Васильева, 1978). Для их проведения необходимы специализированные лаборатории, квалифицированные специалисты-химики, соответствующее оборудование, различные, в том числе вредные для здоровья реактивы и материалы. Химические анализы являются наиболее продолжительным и дорогостоящим этапом в работе по созданию сортов томата с высоким содержанием ß-каротина и ликопина. Ускорить селекционный процесс можно, если для оценки содержания пигментов модифицировать известные (Шлык, 1968; Булда и др., 2008; Мерзляк и др., 1996) или создать экспресс-методы.

Наиболее эффективные методы можно разработать на базе визуально-фотометрических подходов, основанных на анализе параметров света, отраженного от исследуемого объекта и попадающего в глаз оператора. Для их разработки необходимо знать: 1. - характеристики спектральных кривых отражения исследуемых объектов; 2. - спектральные характеристики человеческого глаза; 3.- оптические параметры используемых для анализа приборов или материалов (фотометров, светофильтров и т.п.).

Содержание каротиноидов в плодах томата определяет их диетическую ценность, а также степень зрелости, а, следовательно, пригодность к длительному хранению, транспортировке, промышленной переработке (Медведев, Андрющенко, 1984). Оценку степени зрелости плодов различных культур производят разными методами (Кубышев и др., 1983; Выродов и др., 1988, 1989; Родиков, 2010). Однако и в этом случае визуально-фотометрические подходы предпочтительнее.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлась модификация традиционных и разработка экспресс-методов определения содержания Р-каротина и ликопина в плодах томата, применяемых для оценки селекционных образцов и определения степени зрелости плодов томата при выяснении пригодности к длительному хранению, транспортировке и промышленной переработке.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Экспериментально на примерах желтоплодных, оранжевоплод-ных и красноплодных сортов проанализировать существующие методы оценки содержания пигментов с учетом их применимости в селекции на повышенное содержание каротиноидов в плодах томата. В частности проработать методы, основанные на следующих операциях:

— регистрации спектров оптической плотности растворов бета-каротина и ликопина в гексане и петролейном эфире;

— использовании коэффициентов удельного поглощения, рекомендованных разными авторами, для оценки погрешностей при расчете концентраций растворов и содержания каротиноидов в плодах;

— определении концентрации пигментов без их хроматографичес-кого разделения на компоненты;

— определении содержания пигментов номографическим способом в гексановой вытяжке из плодов томата.

2. Модифицировать существующие методы оценки пигментов применительно к проблемам селекции на повышенное содержание каротиноидов.

3. Разработать ориентированный на непосредственное применение в полевых условиях метод определения содержания каротиноидов по спектрам отражения от плодов томата.

4. Исследовать влияние условий среды на содержание каротиноидов при одновременном выращивании томатов в десяти региональных точках.

5. Исследовать влияние условий среды на содержание каротиноидов при выращивании томатов на одном поле в течение 10 лет.

6. Определить корреляционные зависимости содержания каротина и ликопина от суммы активных температур (CAT) и продолжительности солнечного сияния (ПСС) в различные фазы формирования плодов.

7. Определить и рекомендовать параметры используемых для анализа приборов и материалов (фотометров, светофильтров и т.п.).

Связь работы с научными программами и темами

Исследования выполнялись в рамках: целевой программы по разработке методов определения содержания пигментов в частях растений в ПНИИСХ по государственной тематике Приднестровского НИИ сельского хозяйства «Создать генетические источники высокой адаптивности для культуры томата и перца с хозяйственно-ценными признаками», «Создать и передать в ГСИ высокопродуктивные сорта томата с высоким содержанием Р-каротина и ликопина в плодах, а также сорта с коротким вегетационным периодом (ранние и суперранние)», Приднестровского госуниверситета «Физические подходы к решению различных агробиологических задач».

Научная новизна работы заключается в том, что в ней:

1. Дано теоретическое обоснование возможности оценки степени зрелости плодов по уровню зрительного восприятия, с учетом кривой видности человеческого глаза, спектральных параметров плодов и светофильтров.

2. Впервые применен номографический метод для определения содержания Р-каротина и ликопина в плодах томата по спектрам оптической плотности смеси растворов этих пигментов без их хроматогра-фического разделения.

3. Установлена возможность разработки визуальных или визуально-фотометрических методов определения степени зрелости плодов томата на основе информации об изменении спектров отражения плодов томата в процессе онтогенеза, о механизмах цветовосприятия и спектральных кривых видности человеческого глаза, а также о спектральных характеристиках различных светофильтров.

4. Показано, что ошибка расчета содержания в плодах томата р-ка-ротина и ликопина (10%) посредством использования различных коэффициентов экстинкции (удельного поглощения) не превышает ошибки классического метода (по Мурри, 1958).

5. Выявлен феномен изменения цветового контрастирования, использованный для разработки и модификации методов определения степени зрелости плодов томата и содержания в них каротиноидов и разработан визуально-фотометрический способ сортировки плодов томата на фракции разной степени зрелости.

Научно-практическая значимость

1. Выполнен обзор методов определения содержания пигментов в различных органах растений (листьях, плодах, корнеплодах) различных культур.

2. Проведена оценка погрешностей при расчете содержания каротиноидов в плодах томата с использованием различных коэффициентов удельного поглощения, рекомендованных разными авторами.

3. Предложен номографический метод анализа спектральных кривых оптической плотности растворов каротиноидов при определении содержания Р-каротина и ликопина в плодах томата и даны рекомендации по построению и использованию номограмм.

4. Предложен модифицированный метод, основанный на сравнении коэффициентов отражения плодов на фиксированных длинах волн, регистрируемых на портативных фотометрах, например, ФМ-58.

5. Предложен визуально-фотометрический метод определения степени зрелости плодов томата, позволяющий сортировать плоды на фракции разной степени зрелости.

6. Определены и рекомендованы параметры используемых для анализа приборов и материалов (фотометров, светофильтров и т.п.).

7. Проведена регистрация спектральных кривых отражения поверхности плодов томата разных генотипов и гибридов Б , определено содержание каротиноидов в плодах томата по коэффициентам отражения их поверхности.

8. В процессе выполнения программы по разработке методов определения содержания пигментов в частях растений в ПНИИСХ созданы сорта томата с повышенным содержанием каротиноидов в плодах (Мечта, Новелла, Оберег).

9. Результаты работы используются в качестве научно-учебного материала при изучении курса физики и биофизики студентами аграр-

но-технологического и медицинского факультетов Приднестровского Госуниверситета им. Т.Г. Шевченко.

На защиту выносятся:

1. Номографический метод анализа спектральных кривых оптической плотности растворов каротиноидов для определения содержания (3-каротина и ликопина в плодах томата без хроматографического разделения пигментов.

2. Метод отбора форм томата с высоким содержанием Р-каротина и ликопина по сравнительным коэффициентам отражения на фиксированных длинах волн.

3. Визуально-фотометрические способы и устройства (очки, фотометры) для сортировки плодов томата на фракции разной степени зрелости.

Апробация результатов исследований. Основные результаты работы были представлены:

Юбилейная конференция ППС ПГУ, Тирасполь, РИО ПТУ, 2000; Международная научно-практическая конференция «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке», Москва, 2000г.; Республиканская конференция «Проблемы медицины и здравоохранения ПМР», Тирасполь, РИО ПГУ, 2002; Республиканская научно-практическая конференция «Совершенствование математического образования в общеобразовательных школах, средних и высших профессиональных учебных заведениях ПМР» Тирасполь, РИО ПГУ, 2003; XV Международная научная конференция, «Состояние и перспективы изучения онтогенеза растений природных и культурных флор Евразии», Харьков, 2003; III, VI Международные научно-практические конференции «Математическое моделирование в образовании, науке и производстве». Тирасполь РИО ПГУ, 2003, 2009 гг.; Международная научно-производственная конференция «Овощебахчевые культуры и картофель», Тирасполь, 2005; Международный симпозиум, «Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства овощных культур». М., 2005; Международная научно-практическая конференция «Инновационные технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур» М. 2006; IX, XI, XIV международные конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения», Белгород, 2005, 2007, 2010 гг.; VII международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Москва, 2007; I и II Международные научно-практические конференции «Современные тенденции в селекции и

семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы», М., 2008, 2010 гг.; Международная научно-практическая конференция «Генофонд, селекция и технологии возделывания пасленовых культур», Астрахань, 2008; Всероссийская конференция с международным участием «Продукционный процесс растений: теория и практика эффективного и ресурсосберегающего управления», С-П, 2009; XXIV Съезд по спектроскопии, Москва-Троицк, 2010.

Публикации. Основные положения диссертационной работы отражены в двух монографиях, 16 научных публикациях, в том числе 3 -в рецензируемых изданиях, рекомендуемых экспертным советом ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста, включает 21 таблицу, 25 рисунков, состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 229 источников, в том числе 111 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Каротиноидные пигменты плодов томата и методы их определения

На основании анализа литературы описаны достоинства томатной продукции, наличие в ней витаминов, органических кислот, пектинов и т.п. Даны характеристики каротиноидов, их физико-химических свойств, антимутагенного и антиканцерогенного действия, рассмотрены пути синтеза, сделан анализ традиционных методов определения содержания каротинов в плодах томата.

Глава II. Условия проведения, материал и методы исследований

В работе использованы образцы томата с плодами разных генетически обусловленных окрасок (желтые, оранжевые, красные и др.). Исследования проводились в течение 2000—2010 гг. на кафедрах Ботаники и экологии и Общей физики Приднестровского государственного университета им. Т.Г. Шевченко, на экспериментальной базе отдела селекции ПНИИСХ: растения выращивали в полевых условиях и в вегетационных сосудах по методике Журбицкого (1968), влажность почвы в сосудах поддерживалась на уровне 70-90% от ПВ с помощью устройств полуавтоматического полива растений (Выродов, Жужа, 1988, 1990). Экспериментальные данные по содержанию р-каротина и

ликопина за период с 1991 по 2001 год взяты из литературных источников и отчетов лабораторий частной генетики, иммунитета, селекции пасленовых культур ПНИИСХ.

Содержание каротиноидов (ß-каротина и ликопина) в плодах томата определяли спектрофотометрически в гексановых растворах по традиционным методикам (Porter, Lincoln, 1950; Мурри, 1958; Мануэлян, 1967; Выродова, 1976). Влияние условий выращивания на накопление пигментов в плодах определяли по корреляционным зависимостям между содержанием ß-каротина и ликопина в плодах и продолжительностью солнечного сияния (ПСС), суммой активных температур (САТ), пространственной и временной разнесенностью вариантов опытов. В качестве временных интервалов учитывали весь вегетационный период после высадки в поле (май - август месяцы), три и один месяц до сбора плодов на анализ.

Спектральные кривые отражения плодов томата регистрировали на спектрофотометре СФ-18, плоды устанавливали в левое по ходу луча нижнее окно сферы Ульбрихта. При регистрации дифференциальных спектров отражения плодов, эталонный плод устанавливали в правое нижнее окно сферы. Математическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием методов статистического анализа по компьютерным программам Microsoft Office Exel, координаты цветности плодов определяли с помощью программ Corel PHOTO-PAINT ХЗ.

Глава III. Определение содержания /?-каротина и ликопина в плодах томата по спектральным кривым оптической плотности

В работах Goodwin (1952), Гудвин (1954), Андрющенко и др. (1991) приводятся данные о влиянии генетических и экологических факторов на содержание каротиноидов в плодах томата. По этим данным, которые подтверждаются и нашими исследованиями, основное влияние оказывает генотип (табл.1).

Влияние экологических факторов (свет, температура, водообеспе-ченность, погодные и климатические условия) сказывается незначительно. Вывод о слабом влиянии условий окружающей среды на содержание каротиноидов в плодах томата подтверждают и наши данные (табл. 2-3, рис.1). Изменчивость содержания ß-каротина, ликопина и их суммы для сорта Слава Молдавии в зависимости от места и года выращивания определяли по коэффициентам (V) вариации, численные значения которых составили 3,5; 4,74 и 3,79% - для места (табл. 2), и 11,5; 31,43 и 15,8% -для года выращивания (табл. 3).

Влияние генотипа на содержание пигментов в плодах

Образец Генотип Содержание пишентов, мг/100 г сырой массы Отношение: Р-каротин/ликопин

Р-каротин ликопин

Мо 49 ВВтор то„ 6,04±0,09 0,24±0,08 25,17

Мо 48 ВВто+н то+„ 2,85±0,03 1,51±0,14 1,89

Линия В с ВВто+в то+псс 3,35±0,25 1,98±0,13 1,69

Каробета ВВтов тов 4,31±1,4 0,44±0,28 9,79

Луч ВВтОд тОд 2,86±0,19 0,61±0,06 4,69

Слава Молдавии ВВто+в то+п 2,63±0,08 1,46±0,12 1,8

Алекс ВВто+д то+„ 2,98±0,12 1,29±0,10 2,31

Незабудка ВВто+д то+в 3,5±0,28 1,56±0,48 2,24

Мечта ВВто+в шо+д 3,05±0,18 1,97±0,17 1,55

Мо 112 ЬрЬрЬЬтОдШОд 0,71±0,02 7,86±0,23 0,09

Кармин ЬрЬрЬЬто+в то+д 0,44±0,04 7,48±1,25 0,06

Мо 50 ЬЬтОд то„ 1,06±0,17 5,98±1,44 0,18

Линия 38 ЬЬто+„ то+в 0,44±0,13 6,95±1,26 0,06

Мо 70 1Т 0,07±0,01 следы -

Таблица 2

Содержание |]-каротина и ликопина в плодах оранжевоплодного сорта Слава Молдавии, выращенного в хозяйствах разных районов Молдавии в 1991 году

Место выращивания Содержание пигментов, мг/100 г сырой массы Отношение Р-каротина к ликопину Отношение ликопина к р-каротину

Р-каротин ликопин сумма

1 2,39 1,33 3,72 1,79 0,56

2 2,42 1,34 3,76 1,81 0,55

3 2,42 1,31 3,73 1,85 0,54

4 2,4 1,3 3,7 1,85 0,54

5 2,54 1,39 3,93 1.83 0,55

6 2,5 1,41 3,91 1,77 0,56

7 2,62 1,44 4,06 1,82 0,55

8 2,63 1,45 4,08 1,81 0,55

9 2,5 1,32 1,84 1,89 0,53

10 2,54 1,48 1.83 1,72 0,58

среднее 2,49±0,03 1,36±0,02 3,86±0,05 1,83±0,01 0,55±0,01

Коэффициент вариации,У,% 3,51 4,74 3,79 1,81 0,024

Динамика изменения содержания Р-каротина и ликопина в плодах оранжево- и красноплодных образцов в зависимости от года выращивания (в период с 1991-2010 гг.) в одной региональной точке

Образцы Параметры Содержали е, мг/100 г Сумма Отношение содержания

Р-каротин Ликопин Р-каротина к ликопииу ликопина к Р-каротину

оранжевоплодные образцы

Слава Молдавии Х±ш 2,63±0,08 1,46±0,12 4,13±0,17 1,8 0,56

V,% 11,5 31,43 15,87

е,% 3,0 8,2 3,9

Алекс Х±т 2,98±0,12 1,29±0,12 4,26±0,36 2,31 0,43

V,% 13,99 32,06 14,51

Е,% 6,7 9,3 9,1

Луч Х±т 2,86±0,19 0,61±0,06 3,47±0,22 4,69 0,21

V,% 21,55 34,27 16,97

£,% 6,63 9,84 6,34

Линия 819 Х±т 3,22±0,12 1,54±0,11 4,76±0,18 2,09 0,48

V,% 10,81 20,64 11,51

£,% 3,73 7,14 3,78

красноплодные образцы

Загадка, Кармин, Л-38, Новичок Х±т 0,5±0,03 5,8±0,4 6,50±0,3 0,1 11,6

V,% 40,50 35,92 38,15

6,5 6,9 4, 62

Для красноплодных сортов - Загадка, Кармин, Л-38, Новичок, выращенных в разные годы (1991-2010), динамика изменения содержания пигментов в плодах, рассчитанная с учетом всех сортообразцов по всем годам наблюдений, составила 40,50 и 35,92% для Р-каротина и ликопина, соответственно.

Таким образом, изменчивость содержания Р-каротина и ликопина у оранжевоплодных сортов и линий значительно меньше, чем у красноплодных образцов.

Анализ результатов влияния на содержание Р-каротина и ликопина таких параметров, как ПСС и CAT представлен на гистограммах (рис.1 А и Б). Оценку осуществляли по коэффициентам корреляции (г) между ними и содержанием каротиноидов в плодах.

Зависимость содержания каротиноидов в плодах от ПСС и CAT у оранжево- и у красноплодных сортов средняя, слабая или очень слабая (гт[п = 0. Об, гтах = 0.72). Причем, наибольшие значения г наблюдаются между ПСС и CAT за все время и за три месяца вегетации, а наимень-

Рис. 1. Коэффициенты корреляции между содержанием Р-каротина (1-3) и ликопина (4—6) в оранжевоплодных А и красноплодных Б сортах томата (1991-2010 гг.) и ПСС, CAT за один (1,4), за три (2,5) месяца до отбора плодов на анализ и за весь период вегетации (3,6)

шие значения г отмечены за период - один месяц до отбора плодов на анализ.

Такая динамика содержания каротиноидов, по-видимому, обусловлена генетико-физиологическими причинами. То есть, накопление веществ, используемых для дальнейшего синтеза p-каротина и ликопина, происходит в вегетативных органах растений за все время вегетации. А процесс биосинтеза каротинов начинается по команде, поступающей в определенный момент времени от контролирующих эти процессы генетических систем, согласно программе, заложенной в генотипе растения, и слабо зависящей от условий внешней среды. Максимальное влияние на содержание каротина оказывают генетические факторы (Жученко, 1973; Кузёменский, 2008 и др.). Это подтверждено и нашими исследованиями.

Было интересным и важным для сравнения с точностью наших методов определить ошибки определения концентраций Р-каротина и ликопина в растворах из плодов томата при расчете с использованием удельных коэффициентов поглощения, рекомендованных разными авторами (Smakula, 1934; Zscheile, 1942; Zechmeister, 1954; Meredith F.I., Purcell, 1966; Britton, 1995).

Значения концентраций (С) пигментов при Б = 0.5, рассчитанные с использованием коэффициентов поглощения (а ), _рекомендованных разными авторами_

№ п/п Пигмент а , уд С, мг/мл Критерий Стьюдента (1)

1 Р-каротин 265 [2] 1,89 1,2=1,68 ^=0,67

2 Р-каротин 245 [3] 2,04 ^-<=1,01

3 Р-каротин 258 [4] 1,94 Чг0,11

4 Р-каротин 265 [5] 1,89 14.2=0,67

5 р-каротин 250 [6] 2,0 Ц 6=0,56 2=0,45

6 среднее 256,6±4,7 1,95±0,1

7 ликопин 350 [2] 1,43 Ч8=Ь31

8 ликопин 320 [6] 1,56 18.=0,61

9 среднее 335±15 1,5±0,1 1,7=0Л1

коэффициент вариации, % 3,5 3,4 Р-каротин

6,3 6,2 ликопин

2- 2есЬше151ег, 1954; 3- 5таки1а, 1934; 4- гвсЬеПе, 1942; 5- ВпИоп, 1995; 6- МегесНЛ Е1., РигсеН, 1966

Расчеты ошибки определения концентрации или содержания пигментов в плодах томата при использовании разных коэффициентов поглощения проводили как на модели (при Б = 0,5, табл. 4), так и на фактическом материале по результатам определения содержания (3-ка-ротина и ликопина за период с 1991 по 2010 годы (табл. 5). Концентрации Р-каротина и ликопина, рассчитанные с использованием наиболее отличающихся по величине удельных коэффициентов поглощения (ауд), достоверно не отличаются друг от друга.

Коэффициенты вариации концентрации пигментов лежат в интервале от 3,4 для Р-каротина до 6,2 % для ликопина, а относительная ошибка определения концентраций составляет максимум 8% для Р-ка-ротина и 6,7% для ликопина.

Достоверные отличия содержания пигментов в плодах с высоким уровнем вероятности получены для Р-каротина (Р=0,99) и для ликопина (Р=0,93) по результатам многолетних анализов (1999—2010гг.) только для оранжевоплодных томатов (табл. 5). Большие значения критериев Стьюдента обусловлены, в основном, малыми значениями ошибок средних (±Дх), которые, в свою очередь, определяются числом

Достоверность отличий содержания пигментов в плодах томата <Х> ± Ах (мг/100 г), рассчитанных при использовании разных значений а [2, 6]

пигмент а УД N X max X min <Х> ± Дх ^факт Р

1 2 3 4 5 6 7 8

Оранжевоплодные образцы

ликопин 320 174 2,97 0,17 1,26±0,04 1,78 0,93

ликопин 350 174 2,72 0,16 1,16±0,04

Красноплодные образцы

ликопин 320 38 8,28 3,05 5,22±0,23 1,44 0,84

ликопин 350 38 7,57 2,79 4,77±0,21

Оранжевоплодные образцы

р-каротин 250 188 6,6 1,93 2,92±0,05 2,33 0,99

Р-каротин 265 188 6,23 1,82 2,75±0,05

Красноплодные образцы

Р-каротин 250 38 1,04 0,17 0,46±0,03 0,61 0,5

Р-каротин 265 38 0,98 0,16 0,43±0,03

степеней свободы (N). От N зависит и уровень достоверности отличий Р. При малых значениях N для красноплодных образцов достоверных отличий в соержании и ликопина, и, особенно, (3-каротина, как и в случае расчета на модельном объекте, (табл. 4) не установлено.

Таким образом, можно с высокой долей уверенности утверждать, что использование различных коэффициентов поглощения пигментов, рекомендованных разными авторами, не приводит к достоверно отличающимся результатам при определении содержания Р-каротина и ликопина в плодах томата. Относительная ошибка при этом не превышает 6,2% для Р-каротина и 8,6% для ликопина при N равном 188 и 174, соответственно. При уменьшении числа степеней свободы (N=38) относительная ошибка возрастает до 9,4% у ликопина и до 7% у Р-ка-ротина.

Глава IV. Определение концентрации пигментов в растворах без их хроматографического разделения на компоненты

Наиболее сложным и длительным процессом при определении содержания каротиноидов в плодах томата является хроматографическое разделение пигментов. Оно требует высокой квалификации химиков-аналитиков, наличия различных реактивов и оборудования. Его исклю-

чение из классического метода значительно упрощает анализ и увеличивает эффективность селекционной работы.

Глава посвящена разработке спектрофотометрических методов определения в плодах томата содержания ß-каротина и ликопина без их хроматографического разделения.

Для получения системы уравнений, по которым можно было бы определять концентрации пигментов в растворах их смесей без хроматографического разделения, использовали формулы Вирордта. Расчеты концентраций пигментов по полученным уравнениям дали большие ошибки (от 1 до 140%) для разных пар аналитических длин волн, что не позволило рекомендовать метод для практического применения.

При несоблюдении закона Бугера-Ламберта-Бэра или принципа аддитивности количественный спектрофотометрический анализ смесей растворов пигментов может быть осуществлен с помощью различных^номограмм Fred (1946), Sawoia (1969). Для построения номограмм необходима определённая подготовительная работа, заключающаяся в получении данных об оптической плотности смесей растворов исследуемых пигментов. В диссертации приводятся два способа получения такой информации.

Готовили несколько стандартных растворов с известными концентрациями компонентов смесей (табл. 6) и регистрировали спектры этих растворов (рис. 2). Другой, расчетный, способ основан на использовании формулы D=a)d'C. По ней рассчитывали оптические плотности растворов с разным соотношением концентраций пигментов и строили сгтсктрьг D^f(X) (рис. 3).

Таблица б

Исходные данные для построения номограммы

Доля чистых пигментов, % Оптические плотности на длинах волн: Концентрация, мг/мл

ликопина ß-каротина 503 нм 451 нм ликопина ß-каротина

1 2 3 4 5 6

100 0 0,58 0,48 1,83 0

75 25 0,52 0,54 1,37 0,46

60 40 0,46 0,53 1,09 0,73

50 50 0,40 0,55 0,92 0,91

40 60 0,36 0,53 0,73 1,09

25 75 0,26 0,50 0,49 1,37

0 100 0,12 0,45 0 1,82

400 450 500 550НМ

Рис. 2

Рис. 3

Номограммы (рис. 4) строят следующим образом. На горизонтальной оси на некотором расстоянии друг от друга проводят два перпендикуляра, на которых наносят оптические плотности 0451р ка= 0,455 и Ош(1каГ 0,12. Точки В4Щ_Ш и ОжпШ1г соединяют прямой до пересечения с горизонтальной осью (точка О,). Из этой точки восстанавливают перпендикуляр, который будет осью концентраций ликопина.

Рис. 4. Номограмма для определения содержания (3-каротина и ликопина в гексановых вытяжках из плодов томата

Аналогично через точки £>,5№с= 0,485 и £>1М„с= 0,585, соответствующие оптическим плотностям раствора чисто гсГликопина концентрации 1.82 мг/мл, проводят прямую до пересечения с горизонтальной осью в точке О, из которой восстанавливают перпендикуляр. Он будет осью концентраций Р-каротина.

Масштабы на осях концентраций ОА и О,В определяют, исходя из концентраций, использованных для построения номограмм растворов.

Глава V. Разработка методов оценки и определения содержания пигментов в плодах томата по спектрам отражения их поверхности

В главе дано обоснование применения недеструктивных методов определения содержания каротиноидов в плодах томата по спектрам отражения их поверхности. Подтверждена возможность использования дифференциальных спектров отражения для определения селекционной ценности образцов. Получены и проанализированы спектральные кривые отражения поверхности плодов томата разных генотипов, родительских форм и гибридов ?! томата.

Рис. 5. Оценка содержания пигментов в плодах томата по сравнительным коэффициентам отражения их поверхности на фиксированных длинах волн

Показана возможность идентификации гибридов по спектрам отражения плодов. Этот метод модифицирован для определения содержания каротиноидов не только по спектрам сравнения, но и для фиксированных длин волн с использованием фотометров, например, ФМ-58 (рис. 5).

Глава VI. Визуально-фотометрические методы определения степени зрелости плодов томата

В главе теоретически показана возможность разработки визуально-фотометрических методов определения степени зрелости плодов томата с использованием различных светофильтров и даны практические рекомендации их применения. На рисунке 6 приведены спектральные кривые отражения Я=/(Х) поверхности плодов томата красноплод-ного сорта Кармин (кривые 4-6), фотопическая кривая (2) видности человеческого глаза и спектральная кривая пропускания совмещенных светофильтров ПС-11 иЖС-12.

Используя параметр, называемый «уровень зрительного ощущения» СРДЯ), пропорциональный произведению количества спета./, . падающего на сетчатку глаза и создающего ощущение цвета, и площади •V, под кривой видности, то есть

' ¿V; (1)

можно определять степень зрелости плодов томата. В этой формуле " площадь фигуры, ограниченной кривой видности 2 (рис. 6) в этом диапазоне длин волн (АХ), осью абсцисс, и перпендикулярами к этой оси, восстановленными на границах рассматриваемого спектрального диапазона.

длина волны Х,нм

Рис. 6. Спектральные кривые: пропускания светофильтров ПС11+ЖС12 -1; видности человеческого глаза-2; отражения поверхности плодов томата: 3 - зеленых, 4 - молочной степени зрелости, 5 - бурых, 6 - красных

Так, уровень зрительного ощущения при отражении от поверхности зеленого плода (кривая 3) и попавшего в глаз наблюдателя сине-фиолетового света (Д/=400-500 нм), будет определяться фор-

)ъгиппй - Р ~ / Л' для диапазона сине-фи-

мулои Г400_500 ~ ->,00-500 ° 400-А-В-500 13400-М-С-500^ А ^

олетового света. Аналогично для ДА,=500-600 нм и ДА=бии-/ьи нм

Р500-600 ~ 500-600 ^500-В-й-600 ' ^500-С-К-Ь-600' ^600-750 ~ ^600-750 ^600-й-Е-Р-750 ' ^600-1.-0-Р-750'

Эти оценки показывают, что уровень зрительного ощущения от света, отражаемого поверхностью зеленого плода и попадающего в глаз наблюдателя в диапазоне 500-600 нм в 35 и 20 раз больше, чем для оранжево-красного (600-750 нм) и сине-фиолетового (400-500 нм) диапазонов света. Отсюда, видно, что для визуального отбора плодов молочной зрелости надо уменьшить количество света, попадающего в глаз оператора в диапазоне 500-650 нм и увеличить чувствительность глаза к оранжево-красному диапазону (650-750 нм).

Добиться этого можно подбором светофильтров, непрозрачных для сине-зелено-желтого диапазона спектра (500-650 нм). Такими фильтрами являются пары ПС-11 и ЖС-12, а также СС-4 и ЖС-16 из набора «Стекло цветное оптическое ГОСТ 9411-72». При визуальном анализе с помощью светофильтров в параметр «уровень зрительного ощущения» = ./,л • необходимо вводить поправку на вклад, вносимый в него фильтрами. Эта поправка будет определяться площадью фигуры £ , заключенной под спектральной кривой пропускания фильтра в рассматриваемом диапазоне длин волн, т.е.

где 7 - интенсивность света, отраженного от поверхности плода и попадающего в глаз наблюдателя через светофильтр.

Соотношение площадей под кривой 1 (рис. 6) в диапазоне 680-750 нм к диапазону 450-480 нм - 15:1. Приблизительно такое же соотношение и уровней зрительного ощущения для света, проходящего через эти светофильтры в рассматриваемых диапазонах длин волн. Однако это соотношение можно менять, изменяя толщину светофильтров. Цвет плодов, наблюдаемый через эти светофильтры, меняется с зелёного на красный или розовый в зависимости от степени зрелости. Для отбора плодов полной биологической зрелости используются фильтры с соотношением синего к красному: (1,5-1,7): 1. Такие фильтры можно изготовить на основе фотопленок, окрашенных водорастворимыми красителями применяемыми в легкой промышленности для окрашивания тканей. При отсутствии таких красителей фотопленку можно окра-

шивать синими или фиолетовыми чернилами. Контролировать спектры пропускания таких светофильтров нужно с помощью регистрирующих спектрофотометров.

Был сделан анализ изменения цветности плодов томата, и спектральных кривых отражения их поверхности при созревании. Для определения координат цветности (уровня красного, зеленого, синего) в цвете плодов их фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата Canon Power Shot А550, изображения заносили в компьютер и обрабатывали с помощью программы Corel PHOTO-PAINT Х-3. Программа давала возможность разложить цвет плода на составляющие, то есть определить численные значения коэффициентов к,, к2 и к, при красном, зеленом и синем цвете. Зная численные значения этих коэффициентов, можно найти их соотношения и определить долю красного, зеленого, синего в цвете плода.

Результаты анализа цветности плодов томата, изображеных на рис. 7, приведены ниже. Используя результаты средних значений координат цветности, с помощью приложения Paint программы Microsoft Word сформировали цветные образцы (модели цвета плодов), соответствующие окраске каждого плода и разместили их под плодами, из окраски которых составлены эти модели (нижние ряды на рис. 7). Спектральные кривые отражения поверхности этих плодов и их моделей представлены на рис. 8.

Рис. 7. Изменение окраски натурального плода в процессе созревания (вверху), и соответствующей ему цветовой модели (внизу): 1 - зеленый; 2 - молочный; 3 - буреющий; 4 - бурый 1; 5 - бурый 2; 6 - красный

ы К)

550 600 650 700 750 волны, нм Б

400 450 500 550 600 650 Донна волны, нм В

450 500 550 600 650 Длина волны, нм

А 100 -8 80

Рис. 8. Изменение спектров отражения плодов томата-1 и их цветовых моделей -2 при созревании: А - зеленые плоды и бурые 1; Б - молочные плоды и бурые 2; В - буреющие плоды и красные

выводы

1. Разработан номографический метод анализа спектральных кривых оптической плотности растворов каротиноидов для определения содержания Р-каротина и ликопина в плодах томата, который вдвое уменьшая длительность анализов, увеличивает результативность работы по созданию сортов томата с высоким содержанием этих пигментов. Ошибка метода в пределах допустимой (г = 10%).

2. Экспериментально определены аналитические длины волн: 451 и 503 нм, использованные для построения номограмм и для вычисления коэффициентов А, В, Е, Б при расчете концентраций Р-каротина и ликопина в растворе их смесей на основе уравнений Вирордта.

3. Установлено явление усиления цветового контрастирования при дихроматическом анализе окрашенных объектов, использованное для разработки и модификации методов определения степени зрелости плодов томата и содержания каротиноидов в них.

4. На основе использования психофизических постулатов, в частности «уровней зрительной стимуляции» для анализа цветовоспри-ятия, предложена гипотеза, объясняющая явление усиления цветового контрастирования.

5. Спектральные кривые пропускания светофильтров меняются в зависимости от их толщины. С увеличением толщины светофильтров, отношение интенсивности красного к интенсивности сине-фиолетового света, проходящего через фильтр, увеличивается, а при уменьшении толщины - уменьшается. Для сортировки плодов томата на фракции разной степени зрелости, используют стеклянные светофильтры разной толщины или фильтры на фотопленке с разной плотностью красителя.

6. Разработана технология изготовления светофильтров для оценки степени зрелости плодов томата и определения содержания пигментов в них, на основе фотоэмульсионных пленок, окрашенных водорастворимыми красителями.

7. Установлено, что относительная ошибка в расчетах содержания Р-каротина и ликопина в плодах при использовании разных коэффициентов поглощения, рекомендованных различными авторами, не превышает допустимых пределов (е < 10%).

8. Подтверждено, что содержание Р-каротина и ликопина в плодах томата в основном зависит от генотипа. Зависимость содержания каротиноидов от внешних условий является слабой и неоднозначной.

Наибольшая корреляция с ПСС и CAT наблюдается за все время и за три месяца вегетации, а наименьшие значения г отмечены за период - один месяц до отбора плодов на анализ. При этом связь содержания ликопина с ПСС и CAT меняет знак на минус, что указывает на образование Р-каротина через ликопиновую стадию.

9. Применение метода регистрации и анализа спектральных кривых отражения поверхности плодов томата родительских форм и гибридов для определения содержания каротиноидов в них ведет к увеличению результативности селекционной работы, так как позволяет по спектрограммам отбирать формы с более высоким содержанием пигментов в плодах.

10. Метод регистрации дифференциальных спектров отражения модифицирован таким образом, что позволяет проводить оценку каротиноидов на фиксированных длинах волн с использованием светофильтров или портативных визуально-фотоэлектрических фотометров.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендуемых ВАК:

1. Жужа Е.Д. Методы определения содержания каротиноидов в плодах томата / Е.Д. Жужа, Д.А. Выродов, А.П. Выродова // Картофель и овощи. - М, 2009. - № 1. - С. 19-20.

2. Жужа Е.Д. Определение пригодности томатов для хранения, транспортировки и переработки по степени зрелости / Е.Д. Жужа, Д.А. Выродов, А.П. Выродова // Хранение и переработка сельхозсырья. -М., 2009.-№2.-С. 18-22.

3. Жужа Е.Д. Визуально-спектрофотометрические методы оценки и сортировки плодов томата на стадии разной степени зрелости / Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа // Хранение и переработка сельхозсырья. - М., 2010,-№8.-С. 31-37.

Монографии:

1. Жужа Е.Д. Введение в теорию и практику визуально-спектро-фотометрического анализа растений. Часть 1. Теоретические аспекты визуально-спектрофотометрических методов анализа / Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа. - Тирасполь, 2007.-218 с.

2. Жужа Е.Д. Введение в теорию и практику визуально-спектро-фотометрического анализа растений. Часть 2. Введение в практику визуально-спектрофото-метрических методов исследования агробиологических объектов / Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа, А.П. Выродова. - Тирасполь, 2011.- 272 с.

Публикации в других изданиях

1. Жужа Е.Д. Визуально-инструментальная оценка качества плодов томата. Овощеводство. Состояние, проблемы, перспективы / Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа, А.П. Выродова // Научные труды ВНИИО РАС-ХН.-М., 2001.-С. 197-200.

2. Жужа Е.Д. Квазицветовые эффекты зрения человека / Д.А.Выродов, Е.Д.Жужа // Проблемы медицины и здравоохранения ПМР. - Тирасполь: РИО ПГУ, 2002. - С. 13-17.

3. Жужа Е.Д. Явление усиления цветового контрастирования / Д.А.Выродов, Е.Д.Жужа // Проблемы медицины и здравоохранения ПМР. - Тирасполь: РИО ПГУ, 2002. - С. 17-21.

4. Жужа Е.Д. Физико-математические подходы к решению селекционно-генетических задач / В.Ф. Хлебников, Е.Д. Жужа, Д.А. Выродов, А.П. Выродова // Тез. междунар. конф. по пасленовым культурам -Астрахань, 2003. - С. 56-57.

5. Жужа Е.Д. Метод отбора форм томатов с высоким содержанием ß-каротина и ликопина в плодах / Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа // Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства овощных культур: Материалы международного симпозиума - М 2005. Том 1,-С. 186-188.

6. Жужа Е.Д. Метод отбора форм томатов с высоким содержанием ß-каротина и ликопина в плодах / Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа, А.П. Выродова // Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства овощных культур: Материалы международного симпозиума.-М., 2005. Том 1. — С. 186-188.

7. Жужа Е.Д. Содержание ликопина и методы его оценки в плодах томата / А.П. Выродова, O.E. Яновчик, Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа // Инновационные технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур: Материалы Международной научно-практической конференции. - М., 2006. Том 1. - С. 84-86.

8. Жужа Е.Д. Стратегия разработки методов визуально-фотометрического анализа селекционных образцов / Д.А. Выродов, А.П. Выродова, Е.Д. Жужа // Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы: Материалы Международной научно-практической конференции. - М., 2008. Часть 1. - С. 174-177.

9. Жужа Е.Д. Ликопин - важный показатель качества плодов томата / А.П. Выродова., O.E. Яновчик, Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа //Генофонд, селекция и технологии возделывания пасленовых культур: Материалы международной научно-практической конференции. - Астрахань

10 Жужа ЕД Успехи бета-каротииовой селекции томата / А.П. Выродова., O.E. Яновчик, Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Материалы VIII Международного симпозиума. - Том 1. - М., 2009. - С. 262-264.

11 Жужа ЕД Визуально-спектрофотометрические методы анализа растительных объектов / Д.А.Выродов, Е.Д. Жужа // Материалы XXIV съезда по спектроскопии. - Москва; Троицк, 2010. - С. 306-307.

12. Жужа Е.Д. Номограммы для определения содержания ß-кароти-на и ликопина в гексановых вытяжках из плодов томатов / Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа, А.П. Выродова И Овощебахчевые, зерновые культуры и картофель: Доклады научно-практической конференции. - Бендеры:

Полиграфист, 2010. - С. 49-54.

13. Жужа Е.Д. Определение концентрации ß-каротина и ликопина в вытяжках из плодов томата без хромотографического разделения пигментов / Д.А. Выродов, Е.Д. Жужа, А.П. Выродова // Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы: II Международная научно-практическая конференция. -М„ 2010. — Т. 1.-С. 173-183.

Автореферат

Жужа Евгения Дмитриевна

РАЗРАБОТКА ВИЗУАЛЬНЫХ И СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КАРОТИНОИДОВ И СТЕПЕНИ ЗРЕЛОСТИ ПЛОДОВ ТОМАТА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 5.02.2013. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 60 экз. Заказ № 284.

Отпечатано в Изд-ве Приднестр. ун-та. 3300, г. Тирасполь, ул. Мира, 18.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Жужа, Евгения Дмитриевна, Тирасполь

Приднестровский государственный университет им. Т.Г.Шевченко

На правах рукописи

04201355317

Жужа Евгения Дмитриевна

РАЗРАБОТКА ВИЗУАЛЬНЫХ И СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КАРОТИНОИДОВ И СТЕПЕНИ ЗРЕЛОСТИ ПЛОДОВ ТОМАТА

06.01.03 - Агрофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тирасполь, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................5

ГЛАВА I. КАРОТИНОИДНЫЕ ПИГМЕНТЫ ПЛОДОВ ТОМАТА И

МЕТОДЫ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ...............................................16

1.1 .Физико-химические свойства каротиноидов..................19

1.2. Биологическая ценность каротиноидов.............................21

1.3. Синтез каротиноидов...................................................25

1.3.1. Влияние экологических факторов на...........................

накопление каротиноидов....................................................26

1.3.2. Генетические факторы, контролирующие......................

содержание каротиноидов и окраску плодов томата...................29

1.4. Классические методы определения содержания пигментов в... сельскохозяйственной продукции.............................................32

1.5. Использование спектров отражения для определения содержания

пигментов в растениях............................................................33

ГЛАВА II. УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..37

2.1. Агроклиматическая характеристика района исследований;......

способы выращивания, условия произрастания растений...............37

2.2. Объекты исследования...................................................38

2.3. Методы оценки качества растительного материала с помощью... спектров пропускания, отражения и оптической плотности............39

ГЛАВА III. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ (3-КАРОТИНА И

ЛИКОПИНА В ПЛОДАХ ТОМАТА ПО СПЕКТРАМ..................

ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ.................................................47

3.1. Влияние генотипа и внешних условий на содержание

каротиноидов в плодах томата.................................................47

3.1.1. Влияние генотипа......................................................47

3.1.2. Влияние внешних условий (места и года выращивания) на

содержание каротиноидов в плодах томата.....................................52

3.1.3. Динамика содержания (3-каротина и ликопина в зависимости от продолжительности солнечного сияния (ПСС) и суммы активных температур (CAT).....................................................................54

3.2. Оценка погрешностей определения содержания пигментов в плодах томата для разных коэффициентов экстинкции.....................57

ГЛАВА IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПИГМЕНТОВ.. .5..... /

РАСТВОРАХ БЕЗ ИХ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО......................

РАЗДЕЛЕНИЯ НА КОМПОНЕНТЫ...........................................60

4.1. Определение концентрации пигментов в смеси растворов......

без их хроматографического разделения...................................61

4.2. Проверка применимости полученных формул для...............

определения содержания каротиноидов в плодах томата...............62

4.2.1. Выбор аналитических длин волн.........................................66

4.3 Определение содержания (3-каротина и ликопина..................

в плодах томата номографическим методом..............................70

4.3.1 Подготовка растворов |3-каротина и ликопина для.............71

построения номограмм.....................................................

ГЛАВА V. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ И.......................

ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ПИГМЕНТОВ В ПЛОДАХ...........

ТОМАТА ПО СПЕКТРАМ ОТРАЖЕНИЯ ИХ ПОВЕРХНОСТИ........77

5.1. Использование дифференциальных спектров отражения.........

для определения селекционной ценности образцов томата............77

5.2. Спектральные кривые отражения поверхности плодов............

родительских форм и гибридов Fi томата ..............................84

5.3. Определение содержания каротиноидов в плодах..................

томата по спектральным кривым сравнения...................................87

ГЛАВА VI. ВИЗУАЛЬНО-ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.......

ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ЗРЕЛОСТИ ПЛОДОВ ТОМАТА.........92

6.1. Биофизические основы зрительной рецепции.......................92

6.1.1. Относительная спектральная чувствительность глаза........93

6.2. Психофизические подходы к объяснению явления.................

увеличения цветовой чувствительности глаза............................95

6.2.1. Явление усиления цветового контрастирования при..........

дихроматическом анализе окрашенных объектов..........................97

6.2.2.Оценка степени зрелости по уровню зрительной стимуляции..99

6.2.3. Зависимость коэффициентов пропускания........................

стеклянных светофильтров от их толщины.................................105

6.2.4. Создание светофильтров на основе окрашенных.................

фотоэмульсионных пленок.......................................................107

6.3. Анализ цветности плодов томата, и изменение........................

спектральных кривых отражения их поверхности при созревании.......109

6.3.1. Отбор плодов в полной биологической спелости..................113

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................117

ВЫВОДЫ..............................................................................119

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................122

БЛАГОДАРНОСТИ..................................................................123

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК............................................124

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................139

ВВЕДЕНИЕ

Развитие селекционно-генетических, физиологических и биохимических разделов биологии растений в значительной степени обеспечивается разработкой и применением новых принципов и методов физико-химического анализа (Ермаков, 1972; Ляликов, 1973). Прогресс в этой области связан не только с массовым внедрением довольно сложной стандартной физической аппаратуры, но и с разработкой новых, часто уникальных методов и установок, специально разработанных для решения частных агробиологических проблем (Родиков, 2010). Решение таких задач, наряду с глубоким пониманием природы биологических явлений, требует хорошего знания основ современных физических спектральных методов исследования, устройств и принципов работы оптических приборов (Владимиров, Литвин, 1964; Физические методы исследования..., 1967; Практикум по физико-химическим методам..., 1981; Современные методы..., 1988 и др.) и тех специфических требований, которые диктуются особенностями агробиологического объекта (Брандт, Тагеева, 1967).

Для многих областей естествознания большое значение имеет изучение электромагнитных спектров. Например, линейчатые атомные спектры испускания сыграли решающую роль в становлении квантовой механики - важного раздела современной физики (Фейнман, 1969). Не меньшую роль в становлении современной физиологии, биохимии и биофизики играют спектры поглощения (Фейнман 1969 а; Белл, 1963). Электронные спектры поглощения, как и другие методы молекулярной спектроскопии, применяются для решения самых разнообразных задач при исследовании строения и свойств органических соединений и их количественном анализе. С их помощью оп-

ределяют структуры и идентифицируют вещества (Ермаков, 1972; Васильева, 1978), контролируют чистоту исследуемых молекул, изучают кинетику и механизмы биохимических реакций, биофизических процессов (Методы биохимического анализа..., 1978).

С помощью спектрофотометрии можно получить значительно больше сведений о биологических объектах, о содержании в них биологически активных соединений. Например, качество овощной продукции во многом определяется содержанием в съедобных частях растений Сахаров, пектинов, органических кислот, витаминов, пигментов и т.п. Методы определения вышеназванных веществ в большинстве своем основаны на спектрофотометриче-ском анализе их содержания в растительных объектах, в частности, в продукции овощеводства.

Овощеводство является важной отраслью сельского хозяйства. Томаты относятся к числу наиболее ценных овощей, богатых витаминами и необходимыми для человека минеральными солями. Биологическую ценность томата составляет наличие в его плодах растворимых Сахаров, органических кислот, клетчатки, пектиновых веществ, белков, жиров, минеральных веществ. Плоды томата являются также существенным источником витамина С (аскорбиновой кислоты), провитамина А ((3-каротина), фолиевой кислоты, В1 (аневрина), В2 (рибофлавина), Е (токоферола), В3 (пантотеновой кислоты), К (филлохинона), РР (никотиновой кислоты). Во многих странах томаты используют в качестве лекарственного средства, главным образом, как диетический продукт, который можно употреблять при всех болезнях, особенно -при диабете. Большое физиологическое значение придается каротину в связи с его важной самостоятельной ролью в функции надпочечников и образовании гормона коры надпочечников (Петровский, 1968).

Качество продуктов растительного происхождения, употребляемого как в свежем виде, так и после хранения, частичной или полной переработки, всегда было важным критерием для потребителя. Это относится и к плодам то-

мата, а также вырабатываемым из них сокам, кетчупам, пастам и т.п. Постоянное употребление этих продуктов оказывает регулирующее действие на организм в целом и на его определенные системы и органы (Донченко, На-дыкта, 2005).

Установлено, что плоды разных сортов томата содержат от 4 до 7% сухих веществ, в состав которых входят углеводы, азотистые и минеральные соединения, органические кислоты и некоторые витамины (Жученко, Анд-рющенко, Король и др., 1973; Петенко, 1993). Витаминная ценность плодов томата, в первую очередь, обусловлена наличием в них каротиноидов, функции которых чрезвычайно разнообразны.

Наиболее детально исследована роль (3-каротина в качестве провитамина А (Карнаухов, 1986), а в последнее время обнаружены и антиоксидантные свойства ^-каротина и ликопина (Костров, Горлов, 1996; Armstrong, Hearst, 1996; Goulinet, Chapman, 1997; David Heberi and Qing-Yilu, 2002; Goñi, Serrano, Saura-Calixto, 2006). Кроме пищевой ценности каротиноидов, их наличие в плодах томата определяет степень зрелости плодов и товарные качества при хранении и транспортировке.

Одной из важных задач селекции овощных культур является создание форм с высокими вкусовыми качествами и питательной ценностью плодов, корнеплодов, листовой массы. Они обусловлены содержанием в съедобной части культивируемых растений Сахаров, кислот, микроэлементов, пигментов, ароматических веществ, пектинов, витаминов, в частности провитамина А - p-каротина и ликопина. Поэтому нужно уметь определять их содержание в сельскохозяйственной продукции эффективными недеструктивными методами.

Основные растительные пигменты, которые содержатся в плодах, корнеплодах и листьях растений - это хлорофиллы, каротиноиды, флавонои-ды, антоцианы, фикобилины, ксантофиллы. Содержание некоторых из перечисленных компонентов обуславливает хозяйственную и пищевую ценность

культивируемых растений. Поэтому разработка методов определения их содержания всегда была важной задачей сельскохозяйственных науки и производства.

Содержание вышеназванных веществ в плодах и корнеплодах определяют в химических лабораториях специалисты-химики с использованием лабораторного оборудования, химреактивов, которые не только дорогостоящи, но и вредны для здоровья. Классические способы отбора форм томата с высоким содержанием (3-каротина в плодах с использованием жидкостной хроматографии имеют низкую производительность, требуют дорогостоящих реактивов, длительных химических анализов. Это естественно замедляет процесс селекционной работы по данному признаку.

Современная селекция растений «... выступает в качестве синтетической дисциплины, широко использующей достижения физиологии, биохимии, почвоведения, микробиологии, цитогенетики, экологии и других наук...» (Жученко, 2003). Как видно, в этом перечне нет, к сожалению, ни физики, ни биофизики. И не только теоретики агробиологической науки, но и практики-селекционеры часто недооценивают важность, значимость и эффективность использования биофизических, физических, в частности, спектрофотометри-ческих методов в селекционном процессе.

Однако есть немногочисленные примеры того, как некоторые исследователи, использовавшие спектрофотометрические методы в селекции (Малько, Грабовец, 1986; Васильчук, 2004) или для оценки качества сельскохозяйственной продукции (Alley, Watada, Norris, Worthington, 1976), достигли положительных результатов. Так, Васильчук (1989, 2004) разработал спектрофо-тометрический метод определения степени желтизны крупки и муки у разных форм пшеницы по отражению, без использования химических методов. Метод позволил целенаправленно вести селекцию яровой твердой пшеницы на высокое содержание каротиноидов в зерне более дешевым и производительным методом во многих селекционных учреждениях России. В.А. Ку-

бышев, В.И. Никулин, B.C. Гаршин и др. (1983) разработали и применяли в своей работе способ оценки степени зрелости зерна пшеницы, семян петрушки и плодов лимона по спектральным кривым отражения поверхности зерна, семян или плодов. Е. Alley, А. Watada, К. Nortis, J. Worthington (1976) определяли содержание каротиноидов в плодах томата по спектральным кривым отражения их поверхности, но сложность и большая погрешность метода не позволила авторам рекомендовать его для использования.

С 1969 года в Приднестровском НИИ сельского хозяйства (бывший МНИИОЗиО), проводится работа по изучению изменчивости и наследования ß-каротина в плодах томата и по селекции сортов и гибридов томата с высоким содержанием ß-каротина и ликопина (Выродова, 1975).

В последние годы и в ПГУ им. Т.Г. Шевченко проводятся исследования по разработке экспресс-методов оценки содержания этих пигментов в плодах и корнеплодах. Методы основаны на использовании спектрофотомет-рических приборов разной степени сложности - от стационарных регистрирующих (например, СФ-14 или СФ-18) или портативных (ФМ-58) до простых светофильтров, выполненных в виде очков.

Существенных успехов в области спектрофотометрии отражения добились на кафедре физиологии микроорганизмов МГУ им. Ломоносова (Мерзляк и др., 2003). Ими показано, что для анализа пигментов достаточно измерения коэффициентов отражения всего на нескольких определенных длинах волн.

Интенсивные сорта и гибриды оказались более урожайными лишь при условии внесения значительных доз удобрений, применения пестицидов, орошения и современных сельскохозяйственных машин и орудий (Жученко, 2005). При использовании интенсивных сортов особенно важными становятся проблемы оптимальной водообеспеченности растений. Для решения этих проблем в вегетационных опытах широко используются гидростатические и гидроаэродинамические принципы регулирования влажности почвы и поч-

венных субстратов, и разработанные на их основе устройства для полива растений (Выродов, 2006).

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение и модификация классических и разработка новых экспресс-методов определения содержания (3-каротина и ликопина в плодах томата, применяемых для оценки селекционных образцов, или для определения степени зрелости плодов томата с целью выяснения пригодности к длительному хранению, транспортировке или промышленной переработке.

Исходя из выше изложенного, в задачу наших исследований входило:

1. Провести регистрацию спектральных кривых поглощения и оптической плотности гексановых и ацетоновых растворов [3-каротина и ликопина, приготовленных из плодов томата, сделать анализ динамики временных изменений этих кривых у генотипов с разной окраской плодов (желтых, оранжевых и красных).

2. Оценить эффективность метода определения содержания каротиноидов в плодах томата по дифференциальным спектрам отражения их поверхности и модифицировать его для определения этих пигментов по коэффициентам отражения плодов на фиксированных длинах волн с помощью светофильтров или фотометрических приборов, например ФМ-58.

3. Определить коэффициенты корреляции между содержанием р-каротина и ликопина в плодах различных генотипов и условиями внешней среды [место, годы выращивания, продолжительность солнечного сияния (ПСС), сумма активных температур ( CAT)].

4. Вывести формулы для определения концентрации пигментов в смеси растворов без их хроматографического разделения на компоненты и дать рекомендации по их применению.

5. Приготовить смеси растворов (З-каротина и ликопина с разными соотношениями концентраций для построения номограмм.

6. Построить номограммы и дать рекомендации по определению содержания Р-каротина и ликопина по ним.

7. Провести регистрацию спектральных кривых отражения поверхности плодов томата родительских генотипов и гибридов Б].

8. Определить содержание (3-каротина и ликопина в плодах томата с использованием разных коэффициентов удельного поглощения и дать оценку погрешностей при расчете с коэффициентами, приведенными в разных литературных источниках.

9. Сделать анализ механизмов цветовосприятия человеческого глаза, спектральных характеристик фоторецепторов сетчатки глаза и рекомендовать использовать эти результаты для разработки визуально-фотометрических методов оценки качества плодов томата.

10. Определить и рекомендовать параметры используемых для анализа приборов и материалов (фотометров, светофильтров и т.п.).

11. На основе психофизиологических подходов определить возможности оценки степени зрелости плодов томата по сил