Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тест-системы ИФА для определения кленбутерола в кормах и биологических субстратах

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-системы ИФА для определения кленбутерола в кормах и биологических субстратах"

На правах рукописи

Латышев Олег Евгеньевич

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИФА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛЕНБУТЕРОЛА В КОРМАХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕР

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 2006

Работа выполнена в отделе безопасности кормов и пищевых продуктов Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

кандидат биологических наук, Комаров Александр Анатольевич

доктор биологических наук, профессор

Еремец Владимир Иванович

(ГНУ ВНИиТИБП Россельхозакадемии)

доктор биологических наук, профессор

Тихонов Игорь Владимирович

(ФГОУП ВПО МГАВМиБ им.К.И.Скрябина)

Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Защита диссертации состоится <^7»

2006 г. в ' часов на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 при ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

Адрес: Россия, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, ФГУ «ВГНКИ»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ» Автореферат разослан X/ 2006 г.

/ УКозыре!

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент, Заслуженный ветеринарный врач РФ -е*^ ' / ^Козырев Ю.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, ß-адреностимуляторы (ß-агонисты) — группа синтетических фармакологических препаратов, структурных аналогов катехо-ламинов, которые применяются в животноводстве в качестве стимуляторов роста продуктивных животных, так как обладают сильным антикатаболическим и жиросжигающим действием. Наиболее широко применяемым препаратом этой группы является кленбутерол (КБ).

Помимо фармакологического эффекта эти вещества обладают и токсическим действием, проявляющимся в таких симптомах, как нарушение сердечного ритма, мышечный тремор, гипокалиемия, тахифилаксия, головные боли, тошнота, повышение артериального давления. В разных странах зафиксированы случаи массового отравления людей при употреблении в пищу мяса и субпродуктов, содержащих остаточные количества кленбутерола и других ß-адреностимуляторов (G. Boatto et al., 2000; Ruffolo, R.R., 1991; Kuiper H.A. et al., 1998; Neidert E. and Saschenbrecker P.W., 1996; Комаров A.A., 2002; 2003).

В России опубликованы результаты исследований, в которых рекомендуется применять КБ в качестве стимулятора при выращивании крупного рогатого скота. При этом риск воздействий остаточного содержания КБ в продукции животноводства на здоровье потребителей не оценивался (Еримбетов К.Т., 1997; Аитова М.Д. и др., 1993; 1994; Каленюк В.Ф. и др., 1992; Тагиров Н.С., 1993).

Негативные воздействия остаточного содержания ß-адреностимуляторов в продукции животноводства на здоровье людей, особенно наиболее опасного препарата этой группы — кленбутерола, сделали актуальным проведение широкомасштабного мониторинга за их использованием. Такой мониторинг должен основываться на сочетании преимуществ использования экспрессных иммуно-химических реакций с достоинствами современных арбитражных спектрометрических методов анализа (Комаров A.A., 2002; 2003; Панин А.Н., Комаров A.A., 2005).

Для обеспечения выполнения большого объёма работ по мониторингу необходимо создание чувствительной и специфичной методики для оперативного определения остаточного содержания КБ и других ß-адреностимуляторов в объектах ветеринарного надзора. Для решения этой задачи наиболее перспективным является использование иммуноферментного анализа (ИФА), поскольку этот метод обладает высокой чувствительность и позволяет проводить экспресс-анализ большого количества проб в короткий промежуток времени.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в создании тест-системы для контроля за применения КБ в качестве стимулятора роста при выращивании животных и определения его остаточного содержания в продукции животноводства экспресс-методом ИФА.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• получить иммунореагенты: конъюгаты КБ с белкам и-носителя ми и специфичные антитела для определения КБ в биологических образцах иммунохими-ческим методом;

• на основе полученных иммунореагентов оптимизировать условия проведения непрямого твердофазного конкурентного варианта ИФА для определения КБ в биологическом материале. Определить чувствительность и специфичность метода;

• разработать простые и эффективные способы подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА;

• основываясь на данных по фармакокинетике КБ в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных, обосновать выбор биосубстратов для контроля за применением КБ при выращивании животных, а также определения его остаточного содержания в продукции животного происхождения;

• провести комиссионные испытания тест-системы;

• разработать нормативную документацию и зарегистрировать в РФ тест-систему для определения КБ в кормах и биологических субстратах методом ИФА.

Научная новизна. Впервые в Российской Федерации синтезированы иммунореагенты — конъюгаты КБ с белками-нисителями и специфические поли-клональные антитела.

На основе полученных иммунореагентов создана чувствительная и специфичная тест-система для обнаружения КБ в биологических субстратах на основе непрямого твердофазного конкурентного ИФА (НТК ИФА).

Разработаны простые и эффективные способы экстракции КБ из кормов, биологических жидкостей, органов и тканей животных, обеспечивающие высокую чувствительность определения КБ методом ИФА.

Основываясь на данных по фармакокинетике КБ в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных, обоснован выбор органов и тканей для эффективного контроля за применением КБ в животноводстве.

Практическая значимость работы. Создана тест-система для определения КБ в кормах, биологических жидкостях, органах и тканях животных методом НТК ИФА.

Тест-система позволяет определять не только КБ, но и (3-адреностимуляторы фенольного (сальбутамол (СБ)) и резорцинового (тербута-лин (ТБЛ)) типа.

На тест-систему утверждена нормативная документация. Тест-система зарегистрирована в РФ и налажено серийное производство наборов для выявления КБ в биологических образцах методом ИФА.

Тест-система может быть использована для мониторинга за применением КБ в качестве стимулятора роста при выращивании животных и определения его остаточного содержания в продукции животного происхождения.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 11-ом Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2003), 11 -ом съезде «Общества биотехнологов России» (Москва, 2004), 3-ей

Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005), XIV Всероссийского ветеринарного конгресса (Москва, 2006), Международном конгрессе по аналитической химии 1СА8-2006 (Москва, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: получение специфических иммунореагентов и отработка, на их основе, оптимальных условий постановки НТК ИФА для определения КБ;

разработка простых и эффективных способов подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА;

результаты комиссионных испытаний разработанной тест-системы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 24 таблицами. Список литературы содержит 116 источников, в том числе 106 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Конъюгацию КБ с высокомолекулярными белками (БСА, КСА, ЯА и Ж) проводили без предварительной модификации молекулы методом диазотирова-ния (Тзш Р.Т. е1 а1., 1974). Концентрацию белка в конъюгатах определяли методом Лоури.

Специфические поликлональные антитела получали путем иммунизации кроликов массой 2-3 кг конъюгатом КБ-БСА (0,1 мл с концентрацией белка 1 мг/мл), эмульгированного в 1,5 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ). Раствор конъюгата вводили подкожно в 30-40 точек в область спины. Через каждые 4 недели животных реиммунизировали раствором конъюгата без ПАФ с концентрацией 20-100 мкг/мл. Определение активности и специфичности полученных сывороток осуществляли с помощью непрямого твердофазного ИФА (НТ ИФА) и НТК ИФА.

Отработку условий постановки НТК ИФА проводили, используя конъюга-ты КБ с белками в качестве твердофазных антигенов (ТФА) и специфические поликлональные сыворотки.

Иммунологический планшет сенсибилизировали раствором ТФА. Каждый образец анализировали в дублях. В лунки планшета вносили калибровочные и исследуемые растворы, и растворы специфических антител (АТ). Количество связавшихся с твердой фазой АТ, которое обратно пропорционально содержанию КБ в калибровочных или исследуемых растворах, определяли с помощью антивидовых (антикроличьих) АТ меченых пероксидазой хрена. После чего добавляли раствор хромогенного субстрата (ТМБ) и останавливали реакцию 0,5 М серной кислотой. Значения оптической плотности (ОП450) измеряли на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Рассчитывали процент связывания (ПС) АТ с АГ как отношение средних значений ОП450 калибровочной или исследуемой пробы (опыт) к среднему значению ОП450 сыворотки (контроль):

пс = 0поп*100/0пк

Строили градуировочный график зависимости ПС от концентрации КБ в калибровочных растворах. С помощью градуировочного графика по значениям ПС исследуемых проб определяли в них концентрацию КБ.

Содержание КБ в исследуемой пробе биологического материала определяли по следующей формуле:

С = с * К,

где: с — концентрация КБ в исследуемой пробе, найденная по градуиро-вочному графику, нг/мл;

К — коэффициент пересчета в мкг/кг (л) исследуемых проб корма, мочи, мышечной и печёночной ткани, шерсти, сетчатой оболочки глаза, учитывающий разведение экстракта и степень извлечения КБ из образца.

Для определения специфичности тест-системы вычисляли показатель относительного процента перекрестного связывания. Для подсчета относительных процентов связывания перекрестно реагирующих веществ, по сравнению с КБ, по градуировочным графикам определяли количество каждого вещества в точке, обеспечивающее 50 % связывания AT. Количество КБ в этой точке принимали за 100% и вычисляли процент для перекрестно реагирующих соединений по формуле:

% перекрестного связывания = Скб / Сх* 100,

где: Скб — концентрация КБ, обеспечивающая 50% связывание AT, нг/мл;

Сх - концентрация сравниваемого вещества, обеспечивающая 50% связывание AT, нг/мл.

Разработку способов подготовки биологического материала проводили с использованием образцов с искусственной добавкой КБ для определения степени извлечения, и контрольных образцов, не содержащих КБ. Для подтверждения эффективности выбранного способа подготовки анализировали аттестованные стандартные образцы мочи и печени с известным содержанием КБ и образцы мочи, шерсти, сетчатки, мышечной и печёночной ткани бычков и кроликов, получавших КБ с кормом в дозах, соответственно, 1 мг и 0,08 мг в день в течение 7 дней. Содержание КБ в органах и тканях животных определяли методами НТК ИФА и ГХ-МС.

Условия проведения арбитражного метода ГХ-МС

Измерение содержания КБ выполняли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором типа ионная ловушка на хромато-масс-спектрометре SATURN 2000 (Varían, США). Идентификацию КБ в исследуемой пробе проводили с использованием стандартов КБ с учетом критериев идентификации. Количественное определение проводили методом внутреннего стандарта по площади пика идентифицированного соединения относительно градуировочного графика, полученного при анализе в аналогичных условиях стандартных растворов КБ. В качестве внутреннего стандарта использовали дейтерированное производное КБ.

При подготовке мышечной и печёночной ткани образцы предварительно гомогенизировали в 0,2М ацетатном буфере, рН 5,2. Для экстракции КБ гомо-генат ткани обрабатывали неорганическими кислотами с различной нормально-

стью (0,01н НС1, 0,01н НСЮ4, 0,1н НСЮ4) в течение 15 мин на УЗ-бане. После центрифугирования осадок отмывали дистиллированной водой. Надосадочную жидкость объединяли и анализировали в ИФА, или доводили рН надосадочной жидкости выше 9 и экстрагировали КБ смесью этилацетат/изопропанол (3:2, об/об). После упаривания органического слоя, сухой остаток растворяли в дистиллированной воде и анализировали методом ИФА.

Из кормов КБ экстрагировали, используя различные объёмы дистиллированной воды (5, 15, 25 мл), неорганические кислоты (0,01н НС1, 0,01н НСЮ4), а также сочетание экстракции дистиллированной водой, 0,01н НСЮ4 и смесью этилацетат/изопропанол (3:2, об/об).

Навеску шерсти (0,1 или 0,5 г) предварительно подвергали щелочному гидролизу при 95°С в течение 10 или 30 мин с 2,5 или 5,0 мл 5н №ОН. Экстракцию смесью этилацетат/изопропанол (3:2, об/об) или трет-бутилметиловым эфиром (ТБМЭ) проводили дважды после охлаждения гидролизатов.

При подготовке глазного яблока гомогенат сетчатой оболочки и внутриглазной жидкости прогревали 10 мин при 80°С и центрифугировали. Для осаждения балластных белков надосадочную жидкость обрабатывали 0,1н НСЮ4. Центрифугировали. КБ экстрагировали смесью этилацетат/изопропанол (3:2, об/об) или ТБМЭ после доведения рН надосадочной жидкости до 9,8 щелочью. Органический слой упаривали. Сухой остаток растворяли в дистиллированной воде и анализировали методом ИФА.

Образцы мочи смешивали с 0,1М трис-буфером (рН 9,5) и экстрагировали КБ смесью этилацетат/изопропанол (3:2, об/об) или дихлорметан/изопропанол (7:3, об/об). Органический слой упаривали. Сухой остаток растворяли в дистиллированной воде и анализировали методом ИФА.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Получение специфических иммунореагентов для определения клен-бутерола иммунохимическим методом

Важным этапом разработки иммунохимического метода НТК ИФА является получение специфических иммунореагентов и отработка условий проведения реакции, от чего зависят его чувствительность и специфичность. Поскольку КБ является низкомолекулярным соединением, которое не обладает иммуно-генностью, нами были синтезированы высокомолекулярные конъюгаты КБ с белками (БСА, ЯА, КСА, Ж), использованные как для получения специфических поликлональных кроличьих сывороток, так и непосредственно в качестве ТФА.

Для получения конъюгатов использовали КБ без предварительной модификации молекулы. Раствор белка обрабатывали диазосоединением, полученным путём диазотирования исходного ароматического амина в молекуле КБ соляной кислотой и нитритом натрия. Содержание белка в конъюгате доводили до 2 мг/мл и разводили раствор глицерином в 2 раза до конечной концентрации белка 1 мг/мл.

На введение конъюгата КБ с БСА было получено 33 специфические поли-клональные сыворотки путём иммунизации кроликов по схеме, описанной в п. 2.1.

2.2.2. Отработка условий проведения НТК ИФА для определения КБ

Определение активности полученных сывороток проводили методом НТ ИФА. Определяли рабочее разведение сывороток, при котором ОП45о = 1,0 ± 0,2. Наиболее активные сыворотки были получены в течение первого года иммунизации.

Специфичность сывороток определяли в НТК ИФА. Основным показателем специфичности является процент связывания (ПС) АТ с АГ. Этот показатель обратно пропорционален содержанию КБ в исследуемом образце, который конкурирует за участки связывания АТ с ТФА. Мы сравнили ПС и рабочее разведение полученных сывороток. В таблице 1 приведены данные НТК ИФА наиболее активных сывороток, при добавлении раствора КБ с концентрацией 1,0 нг/мл.

Специфичность сывороток нарастала в процессе иммунизации. В результате была выбрана сыворотка от кролика № 12 на 9-15 месяце после начала иммунизации с рабочим разведением 1:4000, специфичность которой составила около 35±3%.

Таблица 1

Активность и специфичность сывороток, полученных при иммунизации кроликов конъюгатом БСА-КБ

№ сыворотки' Разведение оп450 ПС, %

11/3,4 200 0,986 75

11/5, 6 8000 1,025 71

11/7, 8 8000 1,036 66

11/9 8000 1,124 71

12/5, 6 4000 1,008 52

12/7, 8 8000 1,226 43

12/9-11 4000 0,896 38

12/12-14 4000 1,155 35

12/15 4000 1,065 37

* числитель дроби - № кролика, знаменатель - № количество введений антигена.

Выбор твёрдофазного антигена и условий его иммобилизации на полистироле

Иммобилизация ТФА на поверхности лунок иммунологического планшета определяет количественные характеристики метода и возможности его практического применения, и зависит от степени стабильности и активности иммобилизованного АГ. Основными факторами, влияющими на иммобилизацию, являются структура ТФА, его концентрация, время и температура инкубации, а также, качество полистирола.

Нами были синтезированы конъюгаты КБ с высокомолекулярными белками: Ж, КСА, БСА, ЯА, которые мы использовали в качестве ТФА при сенсибилизации лунок планшета. Было установлено (таблица 2), что наилучшие показатели в НТК ИФА (ОП450— 1 »0, ПС=30-40%) достигались при использовании Ж-КБ и БСА-КБ в концентрации 0,05 мкг/мл и выбранной сыворотки в рабочем разведении.

100 90 ■ 80 -70 -

а; 60 "

О 50-

С 40 -30 -20 -10 -0 -■

0,01 0,05 0,25 1,25 6,25

С КБ, нг/мл

Рис.2. Стандартный градуировочный график для определения КБ в ИФА

Специфичность тест-системы была определена в НТК ИФА с использованием ряда веществ, входящих в группу Р-адреностимуляторов. Для этого проводили реакцию, как описано выше. В качестве конкурирующих использовали растворы КБ, СБ, ТБЛ и адреналина (АД). Специфичность выражали как относительный процент перекрёстного связывания АТ с веществом, по сравнению с КБ в точке, обеспечивающей 50% связывания антител (таблица 4).

В результате определили, что разработанная нами тест-система обладала высокой специфичностью в отношении группы Р-адреностимуляторов, и не давала перекрёстной реакции с природным катехоламином — адреналином.

Наряду с КБ, с помощью предлагаемой тест-системы возможно определение СБ (перекрёстная реактивность 20%) и ТБЛ (перекрёстная реактивность 15%). Эти данные превосходят аналогичные показатели для тест-системы, производимой фирмой Ридаскрин (Германия) (таблица 4).

Таблица 4

Перекрёстная реактивность_

Перекрёстное связывание, %

Вещество Разработанная г-ВюрЬагт,

тест-система Германия

КБ 100 100

СБ 20 10

ТБЛ 15 10

Чувствительность определения СБ и ТБЛ с помощью предлагаемой нами тест-системы, составила 0,1 нг/мл (Рис.3,4).

100 90 -80 -70 -

V® 60

и 50-С 40 -

30 -

20 -

10 -

0 -

0,1 1 10 100 200 С СБ, нг/мл

Рис.3. Градуировочный график для определения СБ в НТК ИФА

90 -i 80 -70 -60 -

чО

^ 50 -g 4030 -20 -10 -0 -

0.1 1 10 100 200 С ТБЛ, нг/мл

Рис.4. Градуировочный график для определения ТБЛ в НТК ИФА

2.2.3. Разработка способов подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА

Подготовка образцов мышечной ткани и печени

Исследовали разные способы обработки ткани с целью максимального извлечения КБ.

Гомогенизированные образцы мышечной ткани и печени обрабатывали соляной или хлорной кислотами с различной нормальностью (для осаждения белков) в сочетании с дополнительной экстракцией КБ дистиллированной водой. С целью депротоинизации аминогрупп в молекулах КБ рН экстракта доводили щелочью до 9,8. Применили также дополнительную экстракцию КБ смесью органических растворителей (этилацетат/изопропанол). Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Сравнение эффективности извлечения КБ из мышечной ткани и печени ___различными способами__

№п/п Способ экстракции ПС контроля, % извлечение, %

1 0,01н НС1 107,45±0,9 11 ±3,01

2 0,01н НСЮ4, отмывка осадка Н20, объединение супернатантов 110,2±2,9 23,6±8,2

3 0,1н НСЮ4, отмывка осадка Н20, объединение супернатантов 100,8±1,3 37,7±9,1

4 0,1н НСЮ4, экстракция КБ из супернатанта (рН 9,0) смесью этилацетат/изопропанол, упаривание растворителей, растворение сухого остатка в воде 88,7±4,5 57,9±17,9

5 0,1н НСЮ4, отмывка осадка Н20, экстракция КБ из объединенных супернатантов смесью этилацетат/изопропанол, упаривание растворителей, растворение сухого остатка в воде 93,5±1,8 68,1±9,8

Установили, что при обработке ткани 0,1н хлорной кислотой извлечение КБ проходило эффективнее, чем 0,01н хлорной или 0,01н соляной кислотами при сходных показателях уровня фона в контрольных образцах (ПС).

Для повышения эффективности извлечения КБ из тканей применили методику, сочетающую в себе обработку гомогената 0,1н хлорной кислотой с последующей экстракцией смесью органических растворителей (этилаце-тат/изопропанол). При этом исследовали влияние промежуточного этапа отмывки осадка дистиллированной водой на извлечение КБ. Экстракция смесью этилацетат/изопропанол давала существенное увеличение степени извлечения КБ. Дополнительная экстракция осадка дистиллированной водой также несколько увеличивала степень извлечение КБ, при этом уровень фона в контроле был несколько ниже (ПС контроля >90%), чем в способе №4. Полученные экстракты исследовали двумя независимыми методами: НТК ИФА и арбитражным методом ГХ-МС. Часть образцов дополнительно подвергали очистке методом ТФЭ. Применение предложенного способа пробоподготовки тканей позволило достичь высокой степени извлечения КБ и приемлемой чистоты экстракта для определения скрининг методом НТК ИФА без применения ТФЭ. При этом наблюдалась хорошая сопоставимость результатов в ИФА и ГХ-МС.

Эффективность предложенного способа экстракции КБ была подтверждена на стандартном образце лиофильно высушенной бычьей печени, содержащей аттестованное количество КБ. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6

Определение КБ в аттестованном стандартном образце_'

Стандартный образец Содержание КБ, м кг/кг (при Р=95%) Найдено методом ИФА, мкг/кг

печень 1,2±0,4 0,8±0,3

Было определено содержание КБ в образцах печени бычков, получавших препарат КБ с кормом. Данные определения КБ методами НТК ИФА и ГХ-МС были сопоставимы между собой (таблица 7).

Таблица 7

Экстракция КБ из бычьей печени

Способ экстракции Содержание КБ, мкг/кг

ИФА ГХ-МС

№5 4,8±0,5 5,1 ±0,5

Таким образом, был предложен эффективный способ экстракции КБ из мышечной ткани и печени, заключающийся в обработке гомогената ткани 0,1н хлорной кислотой и дистиллированной водой с последующей экстракцией КБ из жидкой фазы смесью этилацетат/изопропанол (3:2, об/о б). Предложенный способ пробоподготовки обеспечивал извлечение КБ из тканей на уровне 8090%, и позволял не использовать дополнительную очистку экстракта методом ТФЭ.

Подготовка образцов шерсти

Шерсть является оптимальным объектом для эффективного контроля за применением КБ в качестве стимулятора роста на стадии выращивания, поскольку КБ взаимодействует с меланином, накапливается, и длительное время сохраняется в шерсти животных.

Для выбора оптимального способа извлечения КБ использовали образцы шерсти КРС с искусственной добавкой КБ, а также шерсть бычков и кроликов, получавших КБ в эксперименте.

Шерсть предварительно подвергали щелочному гидролизу в течение 10 и 30 мин при температуре 95°С. Далее проводили экстракцию КБ из гидролизата смесью этилацетат/изопропанол (3:2, об/об) или трет-бутилметиловым эфиром (ТБМЭ). Изучали влияние величины навески шерсти и объёма использованной щёлочи на эффективность гидролиза конъюгатов КБ с меланином. Установили, что щелочной гидролиз 0,1 г шерсти в течение 10 мин обеспечивал максимальное извлечение КБ при приемлемых показателях фона в контроле. Экстракция КБ смесью этилацетат/изопропанол проходила более полно, чем ТБМЭ. Увеличение навески шерсти и количества щёлочи приводило к возрастанию фона в контроле при постановке ИФА (таблица 8).

Учитывая то, что КБ хорошо растворяется в воде, мы применили экстракцию КБ дистиллированной водой. КБ экстрагировали из корма различными объёмами дистиллированной воды как отдельно, так и в сочетании с экстракцией смесью этилацетат/изопропанол (3:2, об/об). Экстракция водой в сочетании с отмывкой осадка хлорной кислотой и последующей экстракцией смесью этилацетат/изопропанол давала низкие показатели извлечения КБ. При проведении двукратной экстракции небольшими объёмами воды удалось добиться приемлемых значений уровня фона в контрольных образцах и хороших показателей извлечения КБ из комбикорма (таблица 12).

Таблица 12

Извлечение КБ из комбикорма разными способами_

Способ экстракции ПС контроля, % Извлечение КБ, %

25 мл 0,01н НС1 97,8±4,9 137,5±12,5

25 мл 0,01нНСЮ4 85,6±3,7 131,9±30,9

25мл Н20 84,2±0,6 127,5±17,5

5мл Н20, 1мл 0,01н НСЮ4> экстракция осадка Н20, экстракция смесью этилацетат/изопропанол (3:2, об/об) 96,7±3,8 9,3±0,5

15 мл Н20 + 5 мл Н20 96,8±6,2 73,7±19,8

В результате был выбран способ двукратной экстракции КБ из корма дистиллированной водой, который обеспечивал извлечение аналита на уровне 80% и приемлемые показатели уровня фона в контроле при проведении НТК ИФА. Подготовка образцов мочи

Известно, что вероятность образования конъюгатов КБ с белками в организме животного относительно низка, поэтому определение КБ в моче проводили без предварительного гидролиза образцов.

Были использованы образцы мочи КРС с искусственной добавкой КБ и контрольные образцы без добавления КБ. Исследовали эффективность экстракции КБ смесями органических растворителей: этилацетат/изопропанол (3:2, об/об) и дихлорметан/изопропанол (7:3, об/об). Для увеличения извлечения КБ был использован подход, примененный нами ранее — с помощью 0,1н трис-буфера (рН 9,5) увеличение рН образца (>9) для депротонизации аминогруппы КБ.

Установили, что экстракция КБ из мочи смесью дихлорметан/изопропалон приводила к существенному росту неспецифического фона (ПС контро-ля<90%), что искажало результаты определения содержания КБ в ИФА. Наиболее приемлемые значения фона и содержания КБ в образце получали при использовании смеси этилацетат/изопропанол (таблица 13).

Таблица 13

Эффективность экстракции КБ из мочи КРС_

Способ экстракции ПС контроля, % Извлечение, %

смесью дихлорметан/изопропанол (7:3, об/об) 78,8±6,3 202,3±9,2

смесью этилацетат/изопропанол (3:2, об/об) 95,5±5,0 73±7,5

Эффективность экстракции КБ смесью этилацетат/изопропанол была подтверждена в ИФА на стандартном образце мочи КРС с аттестованным содержа-

нием КБ (таблица 14).

Таблица 14

_Определение КБ в аттестованном стандартном образце_

Стандартный образец Содержание КБ мкг/л Нижний 90% предел, мкг/л Верхний 90% предел, мкг/л

6,01 5,50 6,63

Определено методом ИФА 5,7±0,5

С помощью разработанной тест-системы ИФА и применения данного способа экстракции исследовали мочу бычков, получавших препарат КБ в экспе-

рименте (таблица 15).

Таблица 15

_Эффективность экстракции КБ из бычьей мочи_

Способ экстракции Содержание КБ, мкг/л

ИФА ГХ-МС

смесью этилацетат/изопропанол 3,0±1,1 2,6±0,7

В результате, для определения КБ в моче животных методом ИФА был предложен способ извлечения КБ смесью этилацетат/изопропанол (3:2,об/об), который обеспечивал высокие показатели степени извлечения КБ и приемлемые значения фона, что позволило не использовать метод твердофазной экстракции (ТФЭ) для дополнительной очистки экстрактов.

Определение предела обнаружения

Основным показателем качества предлагаемой тест-системы является предел обнаружения аналита. Это минимальная концентрация КБ в исследуемом образце, которая может быть обнаружена данным методом с заданной довери-

тельной вероятностью. Предел обнаружения КБ в мышечной ткани, печени, сетчатке и моче составил 0,09 мкг/л; в шерсти — 0,8 мкг/кг; в кормах — 1,0 м кг/кг.

Комиссионные испытания разработанной тест-системы

Комиссионные испытания разработанной тест-системы, предназначенной для количественного определения КБ методом ИФА были проведены на базе ФГУ «ВГНКИ» и ФГУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» (ФГУ «ЦНМВЛ»).

В процессе проведения испытаний были выполнены исследования 6 образцов печени, 6 образцов корма и 8 образцов мочи. Оценивали работоспособность методики, рабочий диапазон определения аналита, сходимость результатов, а также степень извлечения КБ из различных биосубстратов.

Таблица 16

Э<] Ьфективность определения КБ в биосубстратах методом ИФА

Образец Добавлено КБ, мкг/кг Найдено КБ, мкг/кг Степень извлечения, % Коэффициент вариации, %

моча 0 не обнаружено 6,8

моча од 0,08 80 6,6

моча 1,0 1,08 108 5,2

моча 3,3 ± 0,3 2,8 85 3,4

печень 0 не обнаружено 6,6

печень 0,4 0,32 80 6,3

печень 1,0 0,98 98 5,1

корм 0 не обнаружено 6,4

корм 150 180,4 120 3,3

корм 300 328 109 2,2

* - аттестованный стандартный образец мочи КРС с содержанием КБ 3,30±0,3 мкг/л.

В результате проведённых испытаний была подтверждена эффективность разработанной тест-системы на всех объектах исследования.

ВЫВОДЫ

1. Получены высокоспецифичные иммунореагенты, обеспечивающие высокую чувствительность определения кленбутерола (0,01 нг/мл) в биосуб-сгратах методом НТК ИФА. Чувствительность определения кленбутерола с помощью разработанной тест-системы существенно превышает показатели зарубежных аналогов. Тест-система позволяет, наряду с Р-адреностимуляторами анилинового типа (КБ), определять препараты фенольного (СБ) и резорцинового (ТБЛ) типа.

2. Оптимизированы условия проведения НТК ИФА для определения КБ в биосубстратах: структура и концентрация ТФА (0,05 мкг/мл), время и

температура сорбции его на полистироле (18 часов при 4°С) и инкубации антител (1 час при 37°С).

3. Разработаны эффективные и экономичные способы извлечения кленбутерола из биосубстратов на основе жидкостной экстракции водой, неорганическими кислотами и органическим растворителями, без использования метода твердофазной экстракции для дополнительной очистки проб. Эффективность разработанных способов экстракции кленбутерола подтверждена путём анализа международных аттестованных стандартных образцов, а так же биологических жидкостей, органов и тканей экспериментальных животных, получавших кленбутерол.

4. Определены пределы обнаружения кленбутерола методом НТК ИФА в мышечной ткани, печени, сетчатке, моче (0,09 мкг/кг(л)), шерсти (0,8 мкг/кг) и кормах (1,0 мкг/кг).

5. Исходя из полученных данных по фармакокинетике кленбутерола в организме сельскохозяйственных и лабораторных животных, обоснован выбор органов и тканей для эффективного контроля за его применением на стадии выращивания животных (шерсть, моча), и в продукции животноводства (глазное яблоко, печень).

6. Высокая эффективность разработанной тест-системы для определения кленбутерола в биосубстратах, кормах и продукции животноводства методом иммуноферментного анализа подтверждена в условиях комиссионных испытаний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предложена тест-система для экспрессного определения кленбутерола в кормах и биосубстратах методом иммуноферментного анализа. Тест-система успешно прошла комиссионные испытания, и организованно её серийное производство в РФ. Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация:

1. Технические условия на опытную партию на тест-систему «КЛЕНБУТЕ-РОЛ-ИФА» (ТУ 9398-001-00494189-2004).

2. Временное наставление по применению тест — системы «КЛЕНБУТЕ-РОЛ-ИФА» для количественного определения кленбутерола методом иммуноферментного анализа, утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 07.05.2004г., № 13-5-02/1060.

3. Технические условия на тест-систему «КЛЕНБУТЕРОЛ-ИФА» (ТУ 9398030-11361534-2005).

4. Инструкция по применению тест — системы «КЛЕНБУТЕРОЛ-ИФА», утверждена Россельхознадзором 30.11.2005 г., рег. № ПВР-1-1.5/01471).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Отработка условий ИФА для определения остаточных количеств ß2-агонистов в кормах и животноводческой продукции / Комаров А.А, Вылегжа-нина Е.С., Крайнюченко Т.В., Латышев O.E. // Материалы 11-го Московского международного ветеринарного конгресса. — М. — 2003. — С. 317-318.

2. Тест-система ИФА для определения кленбутерола / Комаров A.A., Вы-легжанина Е.С., Латышев O.E., Крапивкин Б.А. // Ветеринария. - 2004. - № 12 -С. 49-51.

3. Применение иммуноферментного анализа для обнаружения остаточных количеств кленбутерола в кормах / Панин А.Н., Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E. // Материалы Второго съезда Общества биотехнологов России» / Под ред. Р.Г. Василова. - М.: МАКС Пресс. - 2004. - С. 118-119.

4. Комаров, A.A. Скрининг-метод ИФА для обнаружения кленбутерола и диэтилстильбэстрола в кормах / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E. // Сб. науч. тр. ФГУ «ВГНКИ» /Под ред. Академика РАСХН Панина А.Н.. - М.: ФГУ «ВГНКИ». - 2005. - Т.65. - С. 225-232.

5. Комаров, A.A. Экстракция анаболических синтетических стероидов из органов и тканей животных для определения методом ИФА / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E. // III международная конф.: «Экстракция органических соединений». Каталог докладов. — Воронеж. — 2005. — С. 207.

6. Комаров, A.A. Экстракция кленбутерола и диэтилстильбэстрола из кормов для определения методом ИФА / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E. // III международная конф.: «Экстракция органических соединений». Каталог докладов. — Воронеж. — 2005. — С. 345.

7. Комаров, A.A. Обнаружение остаточных количеств кленбутерола в шерсти и сетчатке животных скрининг-методом ИФА / Комаров A.A., Латышев O.E. // Тезисы докладов Всероссийской конф.: «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы». — М.: ФГУ «ВГНКИ».-2005.-С. 131-132.

8. Обнаружение кленбутерола и диэтилстильбэстрола в кормах с помощью скрининг-метода ИФА / Комаров A.A., Вылегжанина Е.С., Латышев O.E., Панин А.Н. // Доклады РАСХН. - 2005. - № 2. - С. 45-46.

9. Комаров, A.A. Скрининг-определение кленбутерола в сетчатке животных методом иммуноферментного анализа / Комаров А.А, Вылегжанина Е.С., Латышев O.E. // Материалы Всероссийского ветеринарного конгресса и XIV Международного Московского конгресса по болезням мелких домашних животных. - М. - 2006. - С. 181-182.

10. Комаров, A.A. Скрининг-метод ИФА для обнаружения кленбутерола в шерсти и сетчатке глаза животных / Комаров A.A., Латышев O.E. // Сб. науч. тр. ФГУ «ВГНКИ» /Под ред. Академика РАСХН Панина А.Н.. - М.: ВГНКИ. -2006. — Т.67. — С. 141-149.

11. Komarov A. Obtaining of the immunogens for developing ELISA to determine some anabolic residues in livestock products / Komarov A., Vylegzhanina E., Panin A., Latyschev O., Vylegzhanina A. // 5 ,h International Symposium On Hormone And

Veterinary Drug Residue Analysis held at the Province of Antwerp House Antwerp, Belgium May 16-19,2006. Abstract Book. - Universiteit Gent. - 2006. - P. - 138. 12. Komarov A.A. Determination of clenbuterol in animal hair by ELISA / Koma-rov A.A., Vylegzanina E.S., Latyschev O.E., Krapivkin B.A. // Book of Abstracts International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006. Moscow, Russia 25-30 June, 2006. — V.l, P. — 134.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген

АД - адреналин

АТ - антитело

БСА - бычий сывороточный альбумин.

ГХ-МС - газовая хроматография с масс-спектрометрией

Ж - желатина

ИФА - иммуноферментный анализ

КБ - кленбутерол

КРС - крупный рогатый скот

КСА - кроличий сывороточный альбумин

НТ ИФА - непрямой твердофазный иммуноферментный анализ

НТК ИФА - непрямой твёрдофазный конкурентный иммуноферментный анализ

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ПС - процент связывания

СБ - сальбутамол

ТБЛ - тербуталин

ТБМЭ - трет-бутилметиловый эфир

ТФА - твёрдофазный антиген

ТФЭ - твердофазная экстракция

ЯА - яичный альбумин

Заказ N8 282/10/06 Подписано в печать 25.10.2006 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 > ■ www.cfr.ru ; е-тай:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Латышев, Олег Евгеньевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общая характеристика Р-адреностимуляторов.

2.2. Метаболизм кленбутерола.

2.3. Методы определения Р-адреностимуляторов.

2.4. Скрининг-методы.

2.5. Иммуноферментный анализ.

2.5.1. Гетерогенный иммуноферментный анализ.

2.5.2. Получение иммобилизованных антигенов и антител.

2.5.2.1. Носители, применяемые в ИФА.

2.5.2.2. Иммобилизация антигенов.

2.5.3. Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Используемые реактивы и материалы.

3.2. Методы исследований.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Получение конъюгатов кленбутерола с белками.

4.2. Получение специфических иммунных сывороток.

4.3. Отработка условий проведения процедуры НТК ИФА.

4.3.1. Определение активности и специфичности иммунных сывороток

4.3.2. Выбор конъюгата в качестве твердофазного антигена для сенсибилизации иммунологического планшета.

4.3.3. Выбор оптимальной концентрации твердофазного антигена.

4.3.4. Определение оптимального времени сенсибилизации иммунологических планшетов твердофазными антигенами.

4.3.5. Проверка различных иммунологических планшетов в НТК ИФА.

4.3.6. Выбор оптимальных условий инкубации антител с твердофазным антигеном в НТК ИФА.

4.3.7. Проверка чувствительности реакции НТК ИФА для определения кленбутерола.

4.3.8. Определение специфичности тест-системы.

4.4. Разработка способов подготовки биологического материала для определения кленбутерола методом ИФА.

4.4.1. Подготовка образцов мышечной ткани и печени.

4.4.2. Подготовка образцов шерсти.

4.4.3. Извлечение кленбутерола из сетчатой оболочки глаза.

4.4.4. Извлечение кленбутерола из корма.

4.4.5. Подготовка образцов мочи.

4.4.6. Определение оптимального разведения экстрактов.

4.4.7. Определение предела обнаружения.

4.4.8. Комиссионные испытания.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка тест-системы ИФА для определения кленбутерола в кормах и биологических субстратах"

З-адреностимуляторы - группа синтетических фармакологических препаратов, структурных аналогов катехоламинов, которые применяются в качестве стимуляторов роста продуктивных животных, так как обладают сильным антикатаболическим и жиросжигающим действием. Это приводит к увеличению мышечной массы животного, уменьшению количества жировой ткани вследствие ингибирования липогенеза, и, как следствие, получению постного мяса, пользующегося большим спросом на потребительском рынке. Такое действие этих препаратов обуславливает их широкое использование в промышленном животноводстве в качестве стимуляторов роста продуктивных сельскохозяйственных животных. Наиболее широко применяемым препаратом этой группы является кленбутерол (КБ) [3, 7].

Помимо фармакологического эффекта эти вещества обладают и токсическим действием, поэтому, потребление людьми в пищу мяса и субпродуктов животных, получавших такие препараты с кормом для стимуляции роста, может вызвать отравление, проявляющееся в таких клинических признаках, как нарушение сердечного ритма, мышечный тремор, гипокалиемия, тахифилаксия, головные боли, мышечные спазмы, повышение артериального давления. Особенно опасно потребление таких продуктов людьми с заболеваниями сердца и сердечно-сосудистой системы. В различных странах зафиксированы массовые случаи отравления людей при потреблении мяса и говяжьей печени, содержащей остаточные количества этих препаратов[45,46].

В России опубликованы результаты исследований, в которых рекомендуется применять КБ в качестве стимулятора роста при выращивании крупного рогатого скота. При этом риск воздействий остаточного содержания

КБ в продукции животноводства на здоровье потребителей не оценивался [1,2,

3].

Использование Р-адреностимуляторов в качестве стимуляторов роста для повышения продуктивности животных запрещено в Российской Федерации и странах Европейского союза (35, 36). Этот запрет связан с риском негативного воздействия остаточного содержания этих препаратов в продукции животноводства на здоровье потребителей [105].

Негативные воздействия остаточного содержания Р-адреностимуляторов в продукции животноводства на здоровье людей, особенно кленбутерола -наиболее опасного препарата этой группы, сделали актуальным проведение широкомасштабного мониторинга за их использованием. Такой мониторинг должен основываться на сочетании преимуществ использования экспрессных иммунохимических реакций с достоинствами современных арбитражных спектрометрических методов анализа.

Для обеспечения выполнения работ по мониторингу необходимо создание чувствительной и специфичной тест-системы для быстрого определения КБ и других препаратов этой группы в биологических образцах. Наиболее перспективным является использование иммунохимических методов для скрининга препаратов этой группы, поскольку такие методы обладают высокой чувствительностью, простотой проведения анализа, низкой себестоимостью, и позволяют проводить анализ большого количества образцов за короткий промежуток времени [37, 40, 84, 16].

Цель и задачи исследований

Целью нашей работы являлось создание чувствительной и специфичной тест-системы для контроля за применением КБ в качестве стимулятора роста на стадии выращивания животных и определения его остаточного содержания в продукции животноводства экспресс-методом ИФА.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1.Получить иммунореагенты: конъюгаты КБ с высокомолекулярными белками-носителями и специфические антитела для определения КБ иммунохимическим методом.

2.11а основе полученных иммунореагентов оптимизировать условия проведения процедуры непрямого твердофазного конкурентного ИФА (НТК ИФЛ) для определения КБ в биологическом материале. Определить чувствительность и специфичность метода.

3.Разработать простые и эффективные способы подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА.

4.0сновываясь на данных по фармакокинетике КБ в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных обосновать выбор биосубстратов для контроля за применением КБ на стадии выращивания животных, а также определения его остаточного содержания в продукции животного происхождения.

5.Провести комиссионные испытания разработанной тест-системы.

6.Разработать нормативную документацию и зарегистрировать в РФ тест-систему для определения КБ в кормах и биологических субстратах методом ИФА.

Научная новизна работы

Впервые в Российской Федерации получены высокоспецифичные иммунореагенты - конъюгаты КБ с белками-нисителями и специфические антитела.

На основе полученных иммунореагентов создана чувствительная и специфичная тест-система, для обнаружения КБ в биологических субстратах на основе НТК ИФА.

Разработаны простые и экономичные методы экстракции КБ из кормов, биологических жидкостей, органов и тканей животных, позволяющие не применять дополнительную очистку экстрактов методом твердофазной экстракции (ТФЭ) и обеспечивающие высокую чувствительность определения КБ методом ИФЛ.

Основываясь на данных по фармакокинетике КБ в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных, обоснован выбор органов и тканей для эффективного контроля за применением КБ в животноводстве.

Практическая значимость работы

Впервые в Российской Федерации создана тест-система для определения КБ в кормах, биологических жидкостях, органах и тканях животных методом НТК ИФЛ.

Тест-система позволяет определять не только кленбутерол, но и адреностимуляторы фенольного (сальбутамол ) и резорцинового (тербуталин) тина.

На тест-систему утверждена нормативная документация. Тест-система зарегистрирована в РФ и налажено серийное производство наборов для выявления КБ в биологических образцах методом ИФА.

Тест-система может быть использована для мониторинга за применением КБ в качестве стимулятора роста на стадии выращивания животных и определения его остаточного содержания в продукции животного происхождения

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на:

1. 11-ом Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2003).

2. 11 -ом съезде «Общества биотехнологов России» (Москва, 2004).

3. 3-ей Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005).

4. XIV Всероссийского ветеринарного конгресса (Москва, 2006).

5. Международном конгрессе по аналитической химии 1СА8-2006 (Москва, 2006).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Получение специфических иммунореагентов и подбор, на их основе, оптимальных условий проведения НТК ИФА для определения КБ.

2. Разработка простых и эффективных способов подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА.

3. Результаты комиссионных испытаний разработанной тест-системы.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ в различных изданиях с изложением основных положений и выводов диссертационной работы, в том числе в ведущих научных журналах и изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературных источников и приложения. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 24 таблицами. Список литературы содержит 117 источников, в том числе 109 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Латышев, Олег Евгеньевич

6. ВЫВОДЫ

1. Впервые в РФ были получены высокоспецифичные иммунореагенты, обеспечивающие высокую чувствительность определения кленбутерола (0,01 нг/мл) в биосубстратах методом непрямого твердофазного конкурентного ИФА. Чувствительность определения кленбутерола с помощью разработанной тест-системы существенно превышает показатели зарубежных аналогов. Тест-система позволяет, наряду с Р-адреностимуляторами анилинового типа (кленбутерол), определять препараты фенольного (сальбутамол) и резорцинового (тербуталин) типа.

2. Па основе полученных иммунореагентов были оптимизированы условия проведения процедуры непрямого твердофазного конкурентного ИФА для определения кленбутерола в биосубстратах: подобрана структура и концентрация твердофазного антигена (Ж-КБ, 0,05 мкг/мл), время и температура сорбции его на полистироле (18 часов при 4°С) и инкубации антител (1 час при 37°С).

3. Разработаны эффективные и экономичные способы экстракции кленбутерола из биосубстратов на основе жидкостной экстракции водой, неорганическими кислотами и органическим растворителями, без использования метода твердофазной экстракции для дополнительной очистки проб. Эффективность разработанных способов экстракции кленбутерола подтверждена путём анализа международных аттестованных стандартных образцов, а так же биологических жидкостей, органов и тканей экспериментальных животных, получавших кленбутерол.

4. Определены пределы обнаружения кленбутерола методом НТК ИФА в мышечной ткани, печени, сетчатке, моче (0,09 мкг/кг(л)), шерсти (0,8 мкг/кг) и кормах (1,0 мкг/кг).

5. Исходя из полученных данных по фармакокинетике кленбутерола в организме сельскохозяйственных и лабораторных животных, обоснован выбор органов и тканей для эффективного контроля за его применением на стадии выращивания животных (шерсть, моча), и в продукции животноводства (глазное яблоко, печень).

6. Высокая эффективность разработанной тест-системы для определения кленбутерола в биосубстратах, кормах и продукции животноводства методом иммуноферментного анализа подтверждена в условиях комиссионных испытаний.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана и внедрена в практику тест-система для экспрессного определения кленбутерола в кормах и биосубстратах методом иммуноферментного анализа. Тест-система успешно прошла комиссионные испытания, организованно и налажено её серийное производство в РФ. Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация:

1. Технические условия на опытную партию на тест-систему «КЛЕНБУТЕРОЛ-ИФА» (ТУ 9398-001-00494189-2004).

2. Временное наставление по применению тест - системы «КЛЕНБУТЕРОЛ-ИФА» для количественного определения кленбутерола методом иммуноферментного анализа, утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 07.05.2004г., № 13-5-02/1060.

3. Технические условия на тест-систему «КЛЕНБУТЕРОЛ-ИФА» (ТУ 9398-030-11361534-2005).

4. Инструкция по применению тест - системы «КЛЕНБУТЕРОЛ-ИФА», утверждена Россельхознадзором 30.11.2005 г., per. № ПВР-1-1.5/01471).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Латышев, Олег Евгеньевич, Москва

1. Иммуноферментный анализ. Под ред. Т.Нго и Г.Ленхоффа / Пер. с англ. -М.: Мир, 1988.-446 с.

2. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д Машковский. 14-е изд. Т. 1. - М.: ООО «Издательство Новая Волна», 2001. - С.230-243.

3. Рактопамин: Оценка остаточных количеств некоторых ветеринарных препаратов в пище / Сороковой доклад Объединенного комитета экспертов ФАО/ВОЗ ио пищевым добавкам. Серия технических докладов ВОЗ. 1994. № 832. - С.56-68.

4. Тагиров, Н.С. Гормональный статус у бычков в переходный период выращивания и при применении кленбутерола: Автореф. дис. Канд.биол.наук: 03.00.13 / Н.С.Тагиров; Боровск. ВНИИ физиологии, биох. и пит. с-х жив-ых. Боровск, 1994. - 25 с.

5. Теория и практика иммуноферментного анализа / В.Т. Егоров, А.П Осипов, Б.Б Дзантиев, Е.М Гаврилова. М.: Высш. Шк., 1991.

6. Тернон М. Новые методы иммуноанализа / Тернон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. // Пер. с англ.; Под ред. А.М.Егорова. М.: Мир, 1991. - 280 с.

7. Указание Главного государственного ветеринарного инспектора по организации Государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения № 13-7-1/900 от 04.10.99г.

8. Adam, A. Detection of clenbuterol residues in hair / Adam A., Gervais N., Panoyan A. // The Analyst. 1994. - Vol.119. - P.2663-2666.

9. Ansari, A.A. ELISA solid phase: stability and binding characteristics / Ansari A.A., Ilattikudur N.S., Joshi S.R., Medeira M.A. // J. Immunol. Meth. 1985. -Vol.84.-P. 117-124.

10. Avrameas, S. Enzyme Immunoassays and related techniques: Development and limitations / Immunochemistry. 1969. - V.6 - P.43-52.

11. Baker, P.K. Phenylethanolamine derivatives and acid addition salts thereof for enhancing the growth rater of meat-producing animals and improving the efficiency of feed utilization thereby / Baker P.K., Kiernan J.A. // U.S. Patent 4,404,222. -1983.

12. Bosh, A.M.G. Specificity, sensitivity and reproductibility of enzyme immunoassays. In: Enzyme labeled immunoassay of hormones and drugs / Bosh A.M.G., Van Hell H., Brands J. et al // S.B.Pal, ed., Water de Gruyter. Berlin. -1978. - P. 175-187.

13. Boyd, D. Matrix solid phase dispersion linked to solid phase extraction for beta agonists in liver samples: An update / Boyd D., O'Keeffe M., Smyth M.R. // Analytical Proceedings. 1995. - Vol.32. - P.301-303.

14. Boyd, D. Matrix solid phase dispersion linked to immunoassay techniques for the determination of clenbuterol in bovine liver samples / Boyd D., Shearan P., IIopkins J.P. et al. // Anal. Proc. 1993. - Vol.30. - P. 156-157.

15. Boyd, D. Application of matrix solid-phase dispersion for the determination of clenbuterol in liver samples / Boyd D., Shearan P., Hopkins J.P. et.al. // Analytics Chimica Acta. 1993. - Vol.275. - P.221-226.

16. Boyd, D. Methods for the determination of p-agonists in biological matrices / Boyd D, O'Keeffe M., Smyth M.R. // The Analyst. 1996. - Vol.121. - P.1R-10R.

17. Boyd, D. Matrix solid phase dispersion (MSPD) as a multiresidue extraction technique for P-agonists in bovine liver tissue / Boyd D., O'Keeffe M., Smyth M.R. // Analyst. 1994. - Vol. 119. - P. 1467-1470.

18. Cantarero, L.A. The adsorptive characteristics of protein for polystyrene and their significance in solid phase immunoassays / Cantarero L.A., Butler J.E., Osborne J. W. // Anal.Biochem. 1980. - Vol. 105. - P.375-382.

19. Collins, S. Multi-residue analysis for P-agonists in urine and liver samples using mixed phase columns with determination by radioimmunoassay / Collins S., O'Keeffe M., Smyth M.R. // The Analyst. 1994. - Vol.119. -P.2671-2674.

20. Courtheyn, D. Multiresidue enzyme immunoassays for screening beta-agonists in faeces and feeds / Courtheyn D., Bakeroot V., de Voider F. et al. // Food Agric. Immunol. 1994. - Vol.6. - P. 131 -139.

21. Cristino, A. Control of the illegal use of clenbuterol in bovine production / Cristino A., Ramos F., da Silveira M.I.N. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2003. - Vol.32. - P.311 -316.

22. Degand, G. Determination of clenbuterol in bovine tissues and urine by enzyme immunoassay / Degand G., Bemes-Duyckaerts A., Maghuin-Rogister G. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1992. - Vol.40. - P.70.

23. Dcgroodt, J.M. Immunoaffinity chromatography purification of salbutamol in liver and HPLC-fluorometric detection atrace residue level / Degroodt J.M., Wyhowski-de-Bukanski B., Srebrnik S. // Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1992. -Vol.195.-P.566-568.

24. Delahaut, Ph. Development of a specific radioimmunoassay for the detection of clcnbuterol residues in treated cattle / Delahaut Ph., Dubois M., Pri-Bar I. et al. // Food Additives and Contaminants. 1991. - Vol.8. - P.43-53.

25. Detection of clenbuterol residues in bovine liver, muscle, retina and urine using gas chromatography/mass spectrometry / Blanchflower W.J., Hewit S.A., Cannavan A., et al. // Biol. Mass Spectrom. 1993. - Vol.22. - P.326-330.

26. Determination of beta agonists in tissue / Canadian Food Inspection Agency. Centre for Veterinary Drug Residues. Health of Animals Laboratory. 2000. -Version BAGS-SP01. - 13p.

27. Dutch consumer orgahisation, Consumentengids, February. 1995. - P. 104107.

28. Dutch consumer organisation, Consumentengids, June. 1993. - P.348-352.

29. Elliott, C.T. Observations on the effects of long-term withdrawal on carcass composition and residue concentrations in clenbuterol-medicated cattle / Elliott C.T., Crooks S.R.H., McEvoy J.D.G. et al. // Vet. Res. Commun. 1993. - Vol.17. -P.459-468.

30. Elliott, C.T. Effective laboratory monitoring for the abuse of the beta-agonist clenbuterol in cattle / Elliott C.T., Mc Evoy J.D.G., McCaughey W.J. and Shortt II.D. // The Analyst. 1993. - Vol.118. - P.447-448.

31. Elliott, C.T. Improved detection of the P-agonists clenbuterol by analysis of retina extracts / Elliott C.T., McEvoy J.D.G., McCaughey W.J., Crooks S.R.H. and I lewitt S.A. // Veterinary record. 1993. - Vol. 132. - P.301 -392.

32. Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitatie assay for immunoglobulin G / Engvall E., Perlmann P. // Immunochem. 1971. - Vol.8 -P.871-874.

33. Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA.III. Quantitation of specific antibodies by enzyme-linked antiimmunoglobulin in antigen-coated tubes / Engvall E., Perlmann P. // J. Immunol. 1972. - Vol. 109. - P. 129-135.

34. Food poisoning following consumption of clenbuterol-treated veal in Italy / Brambilla G., Loizzo A., Fontana M. et al. // Journal American Med. Assoc. 1997. - Vol.278.-P.635.

35. Gaillard, Y. Detection of illegal clenbuterol use in calves using hair analysis / Gaillard Y., Balland A., Doucet F. et al // Application in meat quality control. Journal of Chromatography B. 1997. - Vol.703. - P.85-95.

36. Gleixner, A. Einmalapplikation, Mehrfachapplikation und Metabolitenmuster von Clenbuterol beim Menschen / Gleixner A., Sauerwein H., and Meyer H.H.D. // Archiv fUr Lebensmittelhygiene. 1996. - Vol.47. - P. 131 -135.

37. Haasnoot, W. A fast immunoassay for the screening of p-agonists in hair / I Iaasnoot W., Stouten P., Schilt R. et al // Analyst. 1998. - Vol. 123. - P.2707-2710.

38. Haasnoot, W. Fast clenbuterol residue analysis in urine by HPLC with on-line automated sample processing using immunoaffinity chromatography / Haasnoot W., Ploum M.E., Paulussen R.J. A et al. // Journal of Chromatography. 1990. - Vol.519. -P.323.

39. Hahnau, S. Evaluation of commercially available ELISA test kits for the detection of clenbuterol and other P-agonists / Hahnau S., Julicher B. // Food additives and contaminants. 1996. - Vol.13. - P.259-274.

40. Harry, J. Mersmann. Overview of the effects of p-adrenergic receptor agonists on animal growth including mechanisms of action / American Society of Animal Science. 1998. - Vol.76. - P. 160-172.

41. Hawkins, D.R. The disposition of the combination product 14C-NAB 365 CL/trimethoprim/suIphadiazine in dairy cows / Hawkins D.R., Elsom L.F., de-Salis

42. C.M. et al // Unpublished report No. HRC/BOI 111/84680A from Huntingdon Research Centre. Submitted to WHO by Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany. 1985.

43. Hernandez-Carrasquilla, M. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of ß-agonists compounds in bovine hair: evaluation of hair extraction procedures // Analytica Chimica Acta. 2001. - Vol.434. - P.59-66.

44. Hernandez-Carrasquilla, M. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of ß2-agonists in bovine retina // Analytica Chimica Acta. 2000. - Vol.408. -P.285-290.

45. Hernandez-Carrasquilla, M. External contamination of bovine hair with ß2-agonists compounds: evaluation of decontamination strategies // Journal of Chromatography. 2002. - Vol.767. - P.325-243.

46. Howard, C.B. The effect of surface charge on non-specific binding of rabbit immunoglobulin G in solid-phase immunoassays.// Journal of Immunological Methods 1988. - Vol. 111. - P. 157-166.

47. Intoxicación por Clenbuterol. Datos clinicos y analiticos en un brote en Mostoles / Bilbao-Garay J., Hoyo-Jimenez J.F., Lopez-Jimenez M. et.al. // Rev. Clin. Esp.- 1997.- Vol.197. -P.92-95.

48. Jimenez-Carmona, M.M. Ion-pair/supercritical fluid extraction of clenbuterol from samples / Jimenez-Carmona M.M., Tena M.T. // Journal of Chromatography. -1995.-Vol.711.-P.269-276.

49. Kopitar, Z. Pharmacokinetic investigations with 14C.-N-AB 365 CL in rats. / Unpublished report No. U69-0109. Submitted to WHO by Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany. 1970.

50. Kopitar, Z. Pharmakokinetik und Metabolitenmuster von Clenbuterol bei der Ratte / Kopitar Z., Zimmer A. // Arzneim. Forsch. Drug Res. - 1976. - Vol.26. -P.1435-1441.

51. Kuiper, H.A. Illegal use of ß-adrenergic agonists / Kuiper H.A., Noordam M.Y., van Dooren-Flipsen M.M.H. et al. // European Community. Journal of Animal Science. 1998. - Vol.76. - P. 195-207.

52. Meyer, H.H.D. The pharmacokinetics and residues of clenbuterol in veal calves / Meyer H.H.D., Rinke L.M. // Journal of Animal Science. 1991. - Vol.69. -P.4538-4544.

53. Mitchell, G.A. Illegal use of ß-adrenergic agonists in the United States / Mitchell G.A., Dunnavan G. // Journal of Animal Science. 1998. - Vol.76. - P.208-211.

54. Monroe, D. Enzyme Immunoassay. / Anal. Chem. 1984. - Vol.56. - P.921A-931 A.

55. Morgan, D.J. Clinical pharmacokinetics of ß-agonists. Clin. Pharm. 1990. -Vol.18. -P.270-294.

56. O'Keeffe, M.J. Supercritical fluid extraction (SFE) as a multi-residue extraction procedure for P-agonists in bovine liver tissue / O'Keeffe M.J., O'Keeffe M. and Glennon J.D. // The Analyst. 1999. - Vol. 124. - P. 1355.

57. O'Keeffe, M.J Supercritical fluid extraction of veterinary drug residues from meat / O'Keeffe M.J., O'Keeffe M. // The National Food Centre. Research report No. 19. -Dublin.- 1999. 18p.

58. Ostrowski, J.M. Mutagenesis of the (32-adrenergic receptor: How structure elucidates function / Ostrowski J.M., Kjelsberg A., Caron M.G. and Lefkowitz R.J. / Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1992. - Vol.32. - P. 167-183.

59. Polettini, A. Determination of p2-agonists in hair by gas chromatography/mass spectrometry / Polettini A., Montagna M., Segura J. // Journal Mass Spectrom. -1996.- Vol.31. -P.47-54.

60. Polettini, A. Clenbuterol and beta-adrcnergic drugs detected in hair of treated animal by ELISA / Polettini A., Segura J., Gonzalez G. et al. // Clin. Chem. 1995. -Vol.41.-P.945-946.

61. Rang, H.P Adrenergic transmission / Rang 11.P., Dale M.M. // Pharmacology, Churchill Livingstone. Edinburgh. - 1987. - P.6-176.

62. Rubenstein, K.E. «Homogeneous» enzyme immunoassay / Rubenstein K.E., Schneider R.S. et al // New Immunochemical technique, Biochem., Biophes. Res. Commun. 1972. - Vol.81. - P.846-851.

63. Ruffolo, R.R. Chirality in a- and 0- adrenoceptor agonists and antagonists // Tetrahedron. 1991. - Vol.47. - P.9953-9980.

64. Salbutamol radioimmunoassay: synthesis and properties of the benzylic succinate of salbutamol / Beaulieu N., Charette C., Loo J.C.K., et al. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 1985. - Vol.3. - P.575-579.

65. Sauer, M.J. Determination of clenbuterol residues in bovine liver, urine and eye be enzyme immunoassay / Sauer M.J., Pickett R.J.H., MacKenzie A.L. // Anal. Chim. Acta. 1993. - Vol.275. - P. 195-203.

66. Schmid, J. Plasma levels and residue analysis in cows and calves / Unpublished report No. U90-0092. Submitted to WHO by Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany. 1990.

67. Schmid, J. CL in the cows milk after oral and intramuscular administration / Unpublished report No. U90-0099. Submitted to WHO by Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany. 1990.

68. Schmid, J. Biotransformation of clenbuterol / Schmid J., Prox A., Zimmer Z. et al. // Fresenius J. Anal. Chem. 1990. - Vol.337. - P. 121.

69. Screening and confirmatory method for the determination of 3-agonists in retina with GC-MSD. / EU Reference Laboratory for Residues of Veterinary Drugs. -2000. Version 2. - 24p.

70. Shelver, W. Evaluation of commercial immunoassays for cross-reactivity to clenbuterol stereoisomers and bovine metabolites / Shelver W., Smith J.D. // Food Additives and Contaminants. 2000. - Vol.17. - P.837-845.

71. Shepherd, M.J. Analysis of Veterinary Drug Residues in Edible Animal Products / Shepherd M.J., C.S. Creaser and R. Purchase. / Food Contaminants. Sources and Surveillance, The Royal Society of Chemistry, Cambridge. 1991. -P. 176.

72. Simultaneous determination of Zilpaterol and other ^-agonists in calf eye by gas chromatography/tandem mass spectrometry / Bocca B., Fiori M., Cartoni C. et al. // Journal of AOAC International. 2003. - Vol.86. - P.8-14.

73. Smith, D.J. Distribution, Elimination, and Residues of 14C.Clenbuterol HCL in Holstein Calves / Smith D.J., and Paulson G.D. // Journal of Animal Science. -1997.- Vol.75. -P.454-461.

74. Stoffel, B. Effects of the (^-adrenergic agonist clenbuterol in cows: lipid metabolism, milk production, pharmacokinetics and residues / Stoffel B., Meyer H.H.D. // Journal of Animal Science. 1993. - Vol.71. - P. 1875-1881.

75. Urbanek, R. Use of the enzyme linked immunosorbent assay for measurement of specific antibodies / Urbanek R., Kemeny D.M., Samuel D. // J. Immunol. Meth. -1985.-Vol.79.-P. 123-131.

76. Van Ginkel, L.A. New Trends in Veal Calf Production / Van Ginkel L.A., Stephany R.W., van Rossum I I.J. // In: (by ed. J.II.M. Metz and C.M. Groenestein). EAAP publication. 1991. - Vol.52. - P. 192-197.

77. Sawaya, W. N. Screening for p-agonists in sheep urine and eyes by an enzyme-linked immunosorbent assay in the state of Kuwait / Sawaya W.N., Lone K., Husain A. // Food Control 2000. - Vol. 11. - P. 1 -5.

78. Wood, W.G. Polystyrene coated with poly(phenylalanine/lysine) and chemically activated with glutaraldehyde / Wood W.G., Gadow A. // J. Clin. Chem. Biochem. 1983. - Vol.21. - P.789-797.

79. Yalow, R.S. Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods / Yalow R.S., Berson S.A. // Nature. 1959. - Vol. 184. - P. 1648-1649.

80. Yamamoto, I. Enzyme immunoassay for clenbuterol, a p2-adrenergic stimulant / Yamamoto I., Iwata K. //Journal of Immunoassay. 1982.-Vol.3 - P. 155-171.

81. Yang, Y.T. Multiple action of ^-adrenergic agonists on skeletal muscle and adipose tissue / Yang Y.T., McElligott M.A. // Biochem. J. 1989. - Vol.261. - P.l-10.

82. Zalko, D. Metabolic fate of clenbuterol in calves / Zalko D., Bories G. and Tulliez J. // Journal Agnc. Food Chemistry. 1998. - Vol.46. - P. 1935-1943.

83. Zalko, D. Proceedings of the EuroResidue III Conference on Residues of Veterinary Drugs in Food / Zalko D., Debrauwer L. and Tulliez J. ( by ed. N. Haagsma and A. Ruiter). Veldhoven, The Netherlands. - 1996. - P.367-371.

84. Zalko, D. Comparative Metabolism of Clenbuterol by Rat and Bovine Liver Microsomes and Slices / Zalko D., Perdu-Durand E., Debrauwer L. et al. // Drug Metabolism and Disposition. 1998. - Vol.26. - P.28-35.

85. Zalko, D. Evidence for a New and Major Metabolic Pathway of Clenbuterol Involving in Vivo Formation of an N-IIydroxyarylamine / Zalko D., Debrauwer L., Bones G. and Tulliez J. // Chcm. Res. Toxicol. 1997. -Vol. 10. - P. 197-204.

86. Zimmer, A. Einmalapplikation, Mehrfachapplikation und Metabolitenmuster von Clenbuterol beim Menschen // Arzneim. Forsch./Drug Res. - 1976. - Vol.26. -P. 1446-14550.

87. Zimmer, A. Pharmakokinetik und Metabolitenmuster von Clenbuterol beim Kaninchen und bein Hund // Arzneim. Forsch./Drug Res. - 1976. - Vol.26. -P. 1442-1445.