Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка тест-системы ИФА для определения дексаметазона в биологических субстратах
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-системы ИФА для определения дексаметазона в биологических субстратах"
На правах рукописи
Вылегжанина Александра Владимировна
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИФА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕКСАМЕТАЗОНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ
03 00 23 - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2007
003058095
Работа выполнена в отделе безопасности кормов и пищевых продуктов Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору
Научный руководитель- доктор биологических наук, доцент
Комаров Александр Анатольевич
Официальные оппоненты доктор биологических наук, доцент
Букова Наталья Константиновна (ФГУ «ВГНКИ»)
доктор биологических наук, профессор
Тихонов Игорь Владимирович
(ФГОУП ВПО МГАВМиБ им К И Скрябина)
Ведущая организация Московский государственный университет
прикладной биотехнологии
Защита диссертации состоится «17» мая 2007 г в 15 00 час на заседании диссертационного совета Д 220 011 01 при ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»
Адрес Россия, 123022, г Москва, Звенигородское шоссе, д 5, ФГУ «ВГНКИ»
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ» Автореферат разослан апреля 2007 г
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент, Заслуженный ветеринарный врач РФ
Козырев Ю А
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Дексаметазон (ДМ) - синтетический глюкокор-тикоид, который широко используется в ветеринарии в качестве противовоспалительного средства (Reding J et al, 1997, Scippo ML et al, 2002, Van den Hauwe О et al, 2003) ДМ применяется также в качестве стимулятора роста продуктивных животных (Courtheyn D, 1993, De Wasch К et al, 1998, Courtheyn D et al, 2002, Tarantola M et al, 2004, Stoiker A A M , 2005, Contiero L et al, 2006) Остаточное содержание этого глюкокортикоида в животноводческой продукции может оказывать эмбриотоксическое и генотоксическое действие на организм человека (Walker BE, 1971, Singh H, 1994, Hansen DK, 1999) В России и странах Европейского Союза введен запрет на использование гормональных стимуляторов роста, в том числе ДМ, в животноводстве (Council Directive 96/22/ЕС, Указание Главного госветинспектора РФ №13-7-1/900 от 04 10 99г) Терапевтическое применение ДМ регламентировано максимально допустимым уровнем (МДУ), установленным для этого гормона в продукции животного происхождения (Codex Alimentarius, 1998, СанПиН, 2002)
В 2003-2005 годах в Европе были проведены мониторинговые исследования нелегального использования гормональных стимуляторов роста в животноводстве По данным Европейской Комиссии ДМ является гормоном, остатки которого чаще всего обнаруживают в животноводческой продукции В 2003 г было зарегистрировано 130 случаев нелегального применения ДМ в Европе, в 2004 г - 64 случая, в 2005 г - 186 случаев ("Report for 2005 on the results of residue monitoring in food of animal origin in the Member States", 2006)
Возможное негативное влияние ДМ на здоровье людей, а также частое обнаружение остаточных количеств этого гормона в продукции животноводства, сделали актуальным проведение широкомасштабного мониторинга его использования Мониторинг должен основываться на сочетании преимуществ использования быстрых иммунохимических реакций с достоинствами современных арбитражных спектрометрических методов анализа
Для обеспечения в Российской Федерации мониторинга использования ДМ в кормах и продукции животноводства необходимо создание чувствительного и специфичного экспресс-метода Наиболее перспективным для этих целей является использование непрямого твердофазного конкурентного иммуно-ферментного анализа (НТК ИФА), обладающего4следующими преимуществами низкая стоимость, простота проведения анализа и возможность тестирования большого количества образцов за короткий промежуток времени (Van den Hauwe О et al, 2003)
Среди арбитражных методов, используемых для подтверждения остаточного содержания глюкокортикоидов в образцах, показавших положительный результат в ИФА, наиболее перспективным является высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС-МС) (Stoiker A A M , 2000, Antignac J Р , 2004)
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось создание высокочувствительной и специфичной тест-системы на основе непрямого твердофаз-
ного конкурентного иммуноферментного анализа для экспрессного определения ДМ в биосубстратах В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи
• синтезировать карбоксипроизводное ДМ и создать иммуноге-ны путем конъюгации его с белками,
• получить поликлональные кроличьи сыворотки на синтезированные иммуногены,
• провести скрининг полученных сывороток в ИФА с целью выявления наиболее активных и специфичных из них,
• оптимизировать условия постановки непрямого конкурентного твердофазного ИФА для определения ДМ в биосубстратах,
• разработать простые и экономичные способы подготовки биологических образцов для экспрессного определения в них ДМ, оценить чувствительность и специфичность метода,
• провести комиссионные испытания тест-системы ИФА для определения ДМ в биосубстратах, утвердить нормативную документацию на тест-систему и зарегистрировать ее в Российской Федерации,
• подтвердить результаты экспрессного определения остаточного содержания ДМ в биосубстратах арбитражным методом ВЭЖХ-МС-МС
Научная новизна. Впервые в Российской Федерации синтезированы иммуногены путем конденсации ДМ с янтарным ангидридом и конъюгированием дексаметазон-21-гемисукцината с белками, что позволило получить высокоаффинные поликлональные антитела Оптимизированы условия высокочувствительного и специфичного определения ДМ в биосубстратах экспресс-методом ИФА С учетом показателей константы ионизации и липофильности молекулы ДМ выбраны системы органических растворителей, позволившие разработать эффективные способы извлечения этого гормона из биосубстратов Оптимизированы условия арбитражной методики определения ДМ в биологических образцах с использованием ВЭЖХ-МС-МС
Практическая значимость работы. Создана тест-система, предназначенная для определения остаточных количеств ДМ в продукции животноводства после терапевтического применения его в ветеринарии, а также для проведения государственного мониторинга незаконного использования этого гормона в качестве анаболического стимулятора роста На тест-систему утверждена нормативная документация Тест-система «Дексаметазон-ИФА» зарегистрирована в Российской Федерации, налажено серийное производство наборов реагентов для выявления ДМ в биологических образцах методом ИФА
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ВНИиТиБП (Щелково, 2005), конференции молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2005, 2006, 2007), XIV Всероссийском ветеринарном конгрессе (Москва, 2006), 5th International Symposium on Hormone and Veterinary Drug Residue Analysis (Antwerp, Belgium, 2006)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе в рецензируемых научных журналах
Основные положения диссертации, выносимые на защиту: создание иммуногенов, получение и характеристика специфических им-мунореагентов,
разработка эффективных способов экстракции ДМ из биосубстратов и оптимизация условий его определения методом ИФА,
подтверждение результатов экспресс-определения ДМ в биосубстратах арбитражным методом ВЭЖХ-МС-МС
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения Работа иллюстрирована 14 графиками и 25 таблицами Список литературы содержит 184 источника, в том числе 174 иностранных
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы Гаптен (ДМ-21-гемисукцинат) получали конденсацией ДМ с янтарным ангидридом в среде пиридина в течение 3-4 часов при температуре 70-80 °С
Конъюгацию ДМ-21-гемисукцината (карбоксипроизводное ДМ) с молекулами белков (бычьим сывороточным альбумином (БСА), кроличьим сывороточным альбумином (КСА), яичным альбумином (ЯА) и желатиной (Ж)) проводили карбодиимидным методом (Carraway К К , Kosland D Е , 1972) Количество молекул гаптена, связанных с молем белка в конъюгате, контролировали методом УФ-спектроскопии Концентрацию белка в конъюгатах определяли методом Лоури
Специфические поликлональные антитела (AT) к конъюгату БСА-ГсДМ получали путем внутрикожной иммунизации кроликов 100 мкл конъюгата с концентрацией белка 1 мг/мл, разведенного в 1,5 мл стерильного физиологического раствора и эмульгированного в 1,5 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) Раствор конъюгата вводили подкожно в 30-40 точек в область спины Через каждые 4 недели животных реиммунизировали раствором конъюгата без ПАФ с концентрацией 20-100 мкг/мл Определение активности и специфичности полученных сывороток осуществляли с помощью непрямого твердофазного ИФА (НТ ИФА) и НТК ИФА
Отработку условий постановки НТК ИФА проводили, используя в качестве твердофазных антигенов (ТФА) для сенсибилизации лунок планшетов конъ-югаты ДМ-21-гемисукцинат с БСА, КСА, ЯА и Ж При синтезе ТФА и иммуно-гена использовали гомологичный тип связывания гаптена с макромолекулами белков, через активацию карбоксильной группы
Рассчитывали показатель процента связывания AT с ТФА (% САТ) как отношение средних значений ОП450 (оптической плотности, измеренной при длине волны 450 нм) растворов сыворотки с добавлением различных концентраций
ДМ для конкурентного связывания АТ (опыт) к среднему значению ОП45о растворов сыворотки (контроль)
пп.......
Связывание АТ, % = 100 х-
Строили градуировочный график зависимости % САТ от концентрации ДМ в калибровочных растворах С помощью градуировочного графика по значениям % САТ исследуемых проб определяли в них концентрацию ДМ
Константу аффинности антител определяли как величину равную константе ассоциации и обратно пропорциональную константе диссоциации, которая равна ИК50%
Каф =-!-,
ИК„Л
где Каф - константа аффинности, ИК5о% — концентрация АГ, при которой происходит 50%-ное ингибирование связывания антител с ТФА
Содержание ДМ в исследуемой пробе биологического материала определяли по следующей формуле
Сд„, мкг!кг(л) = схК ,
где с - концентрация ДМ в исследуемой пробе, найденная по градуиро-вочному графику в нг/мл, К - коэффициент пересчета нг/г(мл) в мкг/кг(л) исследуемых проб корма, мочи, мышечной и печеночной ткани, учитывающий разведение экстракта и степень извлечения ДМ из образца
Специфичность тест-системы выражали через показатель перекрестной реактивности Для подсчета относительных процентов связывания перекрестно реагирующих гормонов, по сравнению с ДМ, по градуировочным графикам определяли количество каждого гормона в точке, обеспечивающей 50%-ное ингибирование связывания АТ Уровень специфичности АТ рассчитывали по следующей формуле
ИК
Перекрестная реактивность, % = 100 х--—,
\
где ИК50%дм - концентрация ДМ в нг/мл, обеспечивающая 50%-ное ингибирование связывания АТ, ИК^%х - концентрация сравниваемого вещества в нг/мл, необходимая для достижения 50%-ного ингибирования связывания АТ
Оптимизацию способов подготовки проб биосубстратов для скрининг-определения ДМ методом НТК ИФА проводили с использованием контрольных образцов субстратов, не содержащих ДМ, и образцов с внесенными добавками ДМ
Степень извлечения ДМ из образцов с внесенной добавкой рассчитывали по формуле
г^ п/ 1 пп Сли ПРОЭКСТР и ПРОВ ШПОГО
Степень извлечения, % = 100 х- ,
СД\! ДОЕ1В ЧРНПОГО
где С дм - концентрация ДМ в мкг/л
Воспроизводимость результатов анализа оценивали как степень разброса результатов, получаемых анализируемым методом Рассчитывали среднеквадратичное отклонение S и относительный показатель разброса результатов — коэффициент вариации V
Международные параметры эффективности аналитических методик, рекомендованные Codex Alimentarius (1993), представлены в таблице 1
Таблица 1
Параметры эффективности аналитических методов _(Codex Alimentarius, 1993)_
Концентрация, мкг/кг Коэффициент вариации,% Степень извлечения, %
<1 35 не регламентируется
>1<10 30 от 60 до 120
>10<100 20 от 70 до 110
>100 15 от 80 до 110
При обработке результатов использовали стандартные пакеты статистических программ Microsoft Excel и STATISTICA
Экстракциию ДМ из мышечной ткани хлороформом проводили при различных рН (1.0. 5.2, 7,0) исходного образца К 1,0 г гомогената мышечной ткани добавляли 3,5 мл хлороформа, доводили рН до значений 1,0, 5,2 или 7,0, экстрагировали в течение 20 мин на УЗ-бане Центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин Нижний слой отбирали Экстракцию повторяли После центрифугирования нижние слои объединяли и упаривали досуха при 37 °С Перед постановкой ИФА сухой остаток растворяли в буфере с добавлением 20% метанола
Экстракцию ДМ из мышечной ткани осуществляли хлороформом с последующей очисткой экстракта гексаном Экстракцию хлороформом проводили как описано выше Сухой остаток перерастворяли в 3,0 мл смеси метанол/вода (8/2, об/об), добавляли 1,0 мл гексана, встряхивали на «Вортексе» в течение 1 мин Удаляли верхний слой и повторяли процедуру Нижний метанольный слой упаривали досуха при 50 °С Перед постановкой ИФА сухой остаток растворяли в буфере с добавлением 20% метанола
Экстракцию ДМ из мочи и печени проводили хлороформом после предварительного гидролиза конъюгатов с глюкуроновой кислотой ферментами пищеварительного сока моллюска Helix pomatia Смесь 0,5 мл мочи (или 0,5 г печени), 3 мл 0,1 M ацетатного буфера (рН 5,2) и 8 мкл глюкоуронида-зы/арилсульфатазы инкубировали 4 ч при 52 °С Отбирали 3,5 мл гидролизата мочи (или 1 г гидролизата печени) и добавляли 3,5 мл хлороформа Дальнейшую экстракцию проводили хлороформом при различных рН исходного образца (1,0, 5,2, 7,0) как описано выше
Экстракцию ДМ из мышечной ткани и корма осуществляли смесью ацето-нитрил/вода К 2,0 г гомогената мышечной ткани (печени, измельченного корма или 2 мл мочи) добавляли 10 мл смеси ацетонитрил/вода в соотношении 7/3 (об/об) Перемешивали на «Вортексе» в течение 1 мин и экстрагировали в тече-
ние 20 мин на УЗ-бане Центрифугировали 20 мин при 4 °С и 3000 об/мин К 2,5 мл супернатанта добавляли 4,0 мл гексана и 1,0 мл дихлорметана, перемешивали на «Вортексе», центрифугировали 5 минут при скорости 1000 об/мин Отбирали 1 мл средней фазы (соответствует 0,2 г образца) Выпаривали досуха на роторном испарителе в течение 10 минут при 45 °С Перед постановкой ИФА сухой остаток растворяли в буфере с добавлением 20% метанола
Образцы молока анализировали после обезжиривания центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин при 0 °С Верхний слой отбрасывали, белки осаждали, добавляя 150 мкл 0,36 M калия ферроцианата(И) хЗН20 и 150 мкл цинка сульфатах7Н20 Центрифугировали при 5000 об/мин 10 мин при 15 °С Верхний слой отбирали, разводили буфером в соотношении 1 1, добавляли 20% метанола и анализировали методом ИФА
Разработку условий арбитражного метода ВЭЖХ-МС-МС выполняли на хроматомасс-спектрометре «Quattro Micro» с двухстадийным квадрупольным анализатором В систему ВЭЖХ «Alliance» были установлены колонка и пред-колонка Pursuit Cl8, 150 ммх2 мм, 3 мкм (Vanan, США), температура термостата колонки - 40 °С В качестве подвижной фазы использовались следующие растворители фаза А - деионизованная вода с 0,05 % формиата аммония, фаза В - метанол с 0,05 % формиата аммония Были выбраны следующие условия проведения ВЭЖХ с 0,0 по 5,0 мин — градиентное элюирование к 100% фазы В, с 5,0 по 7,0 мин - элюирование в 100% фазы В, с 7,0 по 7,1 мин — переход к элюированию в фазе А/В (1/1, об/об), с 7,1 по 13,0 мин - уравновешивание колонки в фазе А/В (1/1, об/об), скорость потока подвижной фазы - 0,2 мл/мин, объем вводимых проб - 20 мкл Масс-спектрометрические измерения проводили в диапазоне 300 - 500 м/з Условия тандемной масс-спектрометрии оптимизировали с использованием программного обеспечения MassLynx 4 1 Детектирование ДМ выполняли в режиме мониторинга нескольких реакций (МНР)
Условия подготовки проб для дальнейшего определения методом ВЭЖХ-МС-МС разрабатывали, используя образцы печени и мочи (после гидролиза конъюгатов), дальнейшую экстракцию ДМ проводили хлороформом Из образцов мышечной ткани и корма ДМ экстрагировали смесью аце-тонитрил/вода (7/3, об/об) Упаренные экстракты перерастворяли в 5 мл 0,05% уксусной кислоты (с 5% содержанием метанола), помещали в УЗ-баню на 2 мин, центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин При необходимости пробу фильтровали через фильтр (Millipore) с диаметром пор 0,45 мкм После чего пробу очищали методом твердофазной экстракции (ТФЭ)
ТФЭ проводили, используя картриджи «Isolute» с обращеннофазным сорбентом Cl8 Аналиты элюировали 6 мл метанола Элюат упаривали досуха Сухой остаток разводили в 1,0 мл подвижной фазы А/В (1/1, об/об) и использовали для ВЭЖХ-МС-МС анализа
2.2. Результаты исследований 2.2.1. Получение специфических иммунореагентов для определения декса-метазона нммунохимнческим методом
При разработке ИФА наиболее ответственным этапом исследований является получение специфических иммунореагентов, определяющих чувствительность и специфичность анализа В ходе экспериментов были получены специфические иммунореагенты антиген и высокоаффинные поликлональные сыворотки
Поскольку ДМ - это низкомолекулярное соединение (молекулярная масса - 392 Да), не обладающее собственной иммуногенностью, создавали высокомолекулярные конъюгаты ДМ с белками (БСА, КСА, Ж и ЯА) Для получения конъюгатов на первом этапе был синтезирован гаптен (ГсДМ), который присоединяли к белку-носителю пептидной связью Для получения гаптена ДМ (I) обрабатывали янтарным ангидридом (III) (рис 1) в среде пиридина Получали производное ДМ с концевой СООН группой (гемисукцинат-21-ДМ (II))
Рисунок 1 Схема аг1ширования дексаметазона в среде пиридина
На следующем этапе гаптен (гемисукцинат-21-ДМ) ковалентно присоединяли к белку-носителю карбодиимидным методом (рис 2)
О
N0-0 —Гп + МН2БСА О
О
Рисунок 2 Схема конъюгирования гаптена (гемисукцинат-ДМ-21) с БСА карбодиимидным методом
Эпитопная плотность гемисукцинат-21-ДМ в молекуле конъюгата, определенная методом УФ-спектроскопии (Erlanger В F , 1959) (хмакс = 242 им), составила 12 молей на один моль белка (БСА)
На введение конъюгата БСА-ГсДМ было получено 56 специфических по-ликлональных сывороток путем иммунизации кроликов по схеме, описанной в п 2 1
2.2.2. Характеристика поликлональных сывороток и оптимизация условий проведения НТК ИФА для определения ДМ
Определение рабочего разведения сывороток проводили методом HT ИФА Определяли рабочее разведение сывороток, при котором ОП450 = 1,0 ± 0,2 Рабочие титры для ряда сывороток, определенные методом HT ИФА, представлены в таблице 2
Специфичность сывороток определяли в НТК ИФА Основным критерием специфичности служит процент связывания AT с ТФА (% САТ) (см п 2 1 ) Сравнение специфичности сывороток, полученных от кроликов N49, N50, N51 показало, что только для животного N51 специфичность сывороток возрастала в процессе иммунизации В ИФА было определено, что % САТ был наименьшим для AT, полученных после 10 и 11 гипериммунизации, те эти AT наиболее специфичны к ДМ Сравнение специфичности сывороток, полученных от кроликов N4 и N5 показало, что наиболее специфичной была сыворотка N4, полученная после 6-ого введения АГ, а также сыворотка N5, полученная после 5-ого введения АГ
Таблица 2
Активность и специфичность некоторых сывороток, полученных на _конъюгат БСА-ГсДМ, оцененные методом ИФА_
N сыворотки* Рабочее разведение сывороток % связывания АТ
4/5 12800 55
4/6 12800 42
5/5 6400 51
5/6 6400 63
51/8 400 66
51/9 400 55
51/10 800 45
51/11 800 40
51/12 800 47
51/13 800 47
51/14 800 49
50/11 400 47
50/12 400 61
50/13 400 65
* числитель - порядковый номер кролика, знаменатель - номер введения АГ
Для выбранных по показателям специфичности АТ определяли аффинность Аффинность определяется константой аффинности (Каф), которая является важной характеристикой АТ, показывающая степень сродства с АГ (ДМ) Для иммунохимических методов должны использоваться высокоаффинные АТ, Каф которых больше или равна 108 моль'1 Формула для определения Каф при-
ведена в п 2 1 Каф для АТ N51/11, N51/10, N4/5, N4/6, N5/5, N5/6 представлены в таблице 3
Из таблицы 3 следует, что АТ N51/11 обладают наилучшими среди выбранных АТ характеристиками, в первую очередь, самой высокой аффинностью/специфичностью
Таблица 3
Значения ИК50%, Каф и ИКю%, определенные методом _ НТК ИФА для наиболее активных АТ
NAT 51/11 51/10 4/6 5/5
ИК50%, н г/мл 2 7 5 25
Каф, моль"1 2x10s 0,6x1 о8 0,8х Ю8 0,16*Ю8
ИКю%, нг/мл 0,02 0,02 0,02 0,06
АТ N51/11 в рабочем разведении (1/800) использовали для отработки условий постановки НТК ИФА
При выборе ТФА и условий его иммобилизации на полистироле необходимо учитывать, что количественные характеристики метода и возможности его практического применения зависят от стабильности и активности иммобилизованного АГ На эффективность сенсибилизации ячеек полистироловых планшетов ТФА оказывают влияние различные факторы, основными из которых являются структура ТФА, его концентрация, время и температура инкубации, а также, качество полистирола
Для сенсибилизации лунок планшета использовали растворы конъюгатов БСА-ГсДМ, КСА-ГсДМ, ЯА-ГсДМ и Ж-ГсДМ Сравнение результатов проводили по показателю ОП450 конечного продукта реакции Результаты представлены в таблице 4
Таблица 4
Выбор твердофазного антигена для сенсибилизации лунок планшета
ТФА On4so
БСА-ГсДМ 0,858
Ж-ГсДМ 0,085
КСА-ГсДМ 0,098
ЯА-ГсДМ 0,188
Высокие значения показателя ОП450 в НТ ИФА достигаются при использовании конъюгата БСА-ГсДМ в качестве ТФА с рабочей сывороткой На дальнейших этапах анализа в качестве ТФА был использован конъюгат БСА-ГсДМ
При сравнении графиков зависимости % CAT от концентрации ДМ, полученных с использованием разных концентраций ТФА (0,05, 0,1, 0,2, 0,3 мкг/мл) для сенсибилизации лунок планшета, было показано, что при концентрации ТФА 0,05 мкг/мл была достигнута наибольшая чувствительность анализа (рис
Рисунок 3 Градуировочные графики ДМ, построенные с использованием ТФА в различных конг(ентрациях
Для определения оптимального времени и температуры инкубации сенсибилизацию лунок планшета конъюгатом БСА-ГсДМ проводили при различных условиях в течение 1 и 2 часов при температуре 37 °С, и в течение 16 часов при температуре 4 °С Результаты представлены на рисунке 4
Полученные данные позволяют сделать вывод, что оптимальными условиями инкубации ТФА с полистиролом являются 1 час при температуре 37 °С, т к график зависимости % CAT от концентрации ДМ линеен, а чувствитель-
Рисунок 4 Зависимость npoifeHma связывания ATN51/11 от условий сенсибилизации планшета БСА-ГсДМ
НТК ИФА проводили на иммунологических планшетах разного производства «Gramer» (Австрия-Германия) и «Costar» (Дания) Для планшетов фирмы «Gramer» был получен более высокий уровень окраски конечного продукта реакции и меньший коэффициент вариации значений ОП450 по сравнению с планшетами фирмы «Costar» Было показано, что предпочтительней использовать планшеты фирмы «Gramer»
Влияние продолжительности взаимодействия AT с адсорбированным АГ изучали, используя планшеты фирмы «Gramer» Планшеты сенсибилизировали ТФА согласно подобранным выше условиям
AT N51/11 в рабочем разведении с растворенными АГ инкубировали в лунках в течение 1 и 2 часов при температуре 37 °С Дальнейшие операции проводили согласно п 2 1 Полученные результаты представлены на рисунке 5
1одСдм нг/мл
Рисунок 5 Влияние времени инкубации АТ с ТФА на % САТв НТК ИФА
Оптимальными условиями инкубации специфичных АТ с ТФА в НТК ИФА явились 1 час при температуре 37 °С
Чувствительность метода проверяли в условиях, приведенных выше Строили градуировочный график зависимости % САТ N51/11 от концентрации ДМ (п=9) Чувствительность тест-системы НТК ИФА определяли как концентрацию ДМ, необходимую для обеспечения 90% связывания специфических АТ Чувствительность составила 0,02 нг/мл ДМ (рис 6)
Разработанная тест-система дает возможность определять концентрацию ДМ в диапазоне от 0,02 до 62,5 нг/мл
Специфичность тест-системы (степень перекрестной реактивности) оценивали путем сравнения относительных процентов связывания специфических АТ с веществами кортикостероидной природы (флудрокортизона ацетатом, 6а-метилпреднизолоном, бетаметазоном, преднизолоном, триамциналоном, бек-лометазоном, кортизоном, кортизолом), а также с некортикостероидными ана-
болическими гормонами (эстрадиолом, метилтестостероном, 19-нортестостероном, диэтилстильбэстролом) Уровень специфичности AT рассчитывали по формуле, описанной в п 2.1 Результаты представлены в таблице 5
100 —,-----------,-.-,-,—
90 80 70
к 60
<
о
^ 50 40 30 20
10 —I-■-■---.-—-------
0 02 0 10 2 50 62 50
0 05 0 50 12 50 312 50 ^ Mean
_|_ Меап±0 95 Conf Interval
Рисунок 6 Градуировочный график ДМ, полученный при использовании АТ
N51/11
Перекрестная реактивность АТ N51/11 и N4/6 с некортикостероидными анаболическими гормонами (эстрадиолом, метилтестостероном, 19-нортестостероном, диэтилстильбэстролом), оцененная с помощью нашей тест-системы, составила менее 0,001%
Из таблицы 5 видно, что АТ N51/11 обладали значительно большей специфичностью по сравнению с АТ N4/6, которые интенсивно перекрестно реагировали с флудрокортизона ацетатом, ба-метилпреднизолоном, бетаметазоном и преднизолоном, менее интенсивно с триамцинолоном и беклометазоном АТ N51/11 слабо перекрестно реагировали с флудрокортизона ацетатом, триамцинолоном и бетаметазоном
Для производства тест-системы были выбраны наиболее специфичные АТ N51/11 Разработанная тест-система не давала перекрестной реакции с природными глюкокортикоидами (кортизоном и кортизолом)
0 02 0 10 2 50 62 50
0 05 0 50 12 50 312 50
Сдм нг/мл
Перекрестная реактивность AT N51/11 н N4/6
Таблица 5
Гормон Уровень спецш »ичности AT, %
N51/11 (1/800) N4/6 (1/12800)
дм 100 100
Триамциналон 5,6 45
Бетаметазон 9,8 172
Флудрокортизона ацетат 24,4 414
Преднизолон <0,01 110
Беклометазон 0,27 1,33
Кортизон <0,01 <0,01
Кортизол <0,01 <0,01
6а-метилпреднизолон <0,01 309
Эстрадиол <0,001 <0,001
Метилтестостерон <0,001 <0,001
19-нортестостерон <0,001 <0,001
Диэтилстильбэстрол <0,001 <0,001
2.2.3. Разработка способов подготовки биологического материала для определения ДМ методом ИФА
Проводили сравнительное изучение различных видов жидкостно-жидкостной экстракции ДМ органическими растворителями Константа ионизации ДМ, рассчитанная с помощью программы SPARC on-line calculator составила рН 14 Показатель липофильности молекулы ДМ, выраженный как LogP (распределение между фазами октанол-вода), равен 1,8 (ALOGPS 2 1), это значение свидетельствует о невысокой липофильности вещества (Oprea Т et al, 2001) Растворимость ДМ в воде составляет 0,1 мг/мл (Dilova V et al, 2004) Низкая растворимость в воде связана с влиянием гидрофобного эффекта, который сильнее эффекта сольватации (ассоциации функциональных групп вода-ДМ) Область полярной поверхности молекулы ДМ составляет 94,8 Â (www pubchem com), что является промежуточной величиной между 140 Â для полярных молекул и 60 Â для неполярных Таким образом, молекула ДМ не липофильна, но при этом мало растворима в воде, обладает средней полярностью Можно предположить, что ДМ не будет растворяться в сильно неполярных растворителях (типа гексана, степень липофильности logP=3,9) Из литературы известно, что ДМ хорошо растворяется в ацетонитриле (Cerní L et al, 1998), метаноле (Mostl Е et al, 1999) и хлороформе (The Extra Pharmacopoeia, 1989) Хорошая растворимость ДМ в полярных неассоциированных растворителях (кетоны, эфиры, сложные эфиры) и спиртах объясняется тем, что в обоих видах растворителей образование связей между молекулой аналита и растворителем идет в противовес ассоциации молекул между собой в растворе (Ruelle Р , 2000) Учитывая вышеизложенное, были выбраны системы органических растворителей для эффективной экстракции ДМ из биосубстратов хлороформ
при рН 1,0, 5,2 и 7,0, а также смесь ацетонитрил/вода (7/3, об/об) В ходе работы были выбраны эффективные и экономичные способы экстракции ДМ из биологических субстратов, не требующие дополнительной очистки образцов на твердофазных носителях
ДМ из образцов мышечной ткани экстрагировали хлороформом при различных рН Хлороформ, как и любой другой органический растворитель, вызывает денатурацию белков, что способствует лучшему выходу аналита из тканей Проводили экстракцию, используя различные значения рН исходных образцов ткани Изменение рН приводит к сдвигу константы ионизации веществ (рКа), и как следствие, к изменению растворимости и распределения веществ между фазами В связи с тем, что ДМ - вещество слабо ионизирующееся (рКа=14), изменение рН влияет в большей степени на количество коэкстрагирующихся веществ матрицы, вероятно, снижая их растворимость в хлороформе
Пределы определения и эффективность экстракции ДМ, определенные методом НТК ИФА, представлены в таблице 6 Из таблицы видно, что пределы определения ДМ, полученные с применением данной экстракции, не превышают МДУ (0,5 мкг/кг) Достаточная степень извлечения ДМ из мышечной ткани достигается при значениях рН исходного образца 5,2 При значениях рН 1,0 и 7,0 экстракция была или недостаточная, или избыточная (за счет интерферирующих веществ матрицы) При рН 5,2 коэффициент вариации значений степени извлечения ДМ составляет не более 16% В соответствии с международными требованиями, предъявляемыми к эффективности аналитических методов (табл 1), это значение является допустимой величиной
Экстракцию ДМ из образцов мышечной ткани проводили смесью ацетонитрил/вода Экстракт очищали, используя гексан и дихлорметан, при этом получали трехфазную систему верхний слой - гексан, средний - ацетонитрил/вода, нижний - дихлорметан ДМ оставался в среднем слое, т к он практически нерастворим в гексане и дихлорметане, а липиды различной полярности переходили в гексан и дихлорметан, тем самым была достигнута высокая степень очистки экстракта
Таблица 6
Эффективность экстракции ДМ из мышечной ткани различными
растворителями, оцененная методом НТК ИФА
Способ экстракции рН Добавлено ДМ, мкг/кг Определено ДМ, мкг/кг Степень извлечения, % Хср±8, мкг/кг Предел определения (Хер+бст), мкг/кг
Хлороформ (п=10) 1,0 20 35±16 177±81 0,2±0,02 0,26
5,2 20 19±5 97±24 0,2±0,02 0,32
7,0 20 25±8 125±41 0,2±0,02 0,26
Хлороформ/ гексан (п=10) 1,0 20 10±2 52±9 0,2±0,02 0,32
5,2 20 19±3 95±15 0,2±0,02 0,32
7,0 20 35±10 177±49 0,2±0,02 0,26
Ацетонитрил/ вода (п=11) 25 24±4 95±14 0,2±0,05 0,5
Предел определения и эффективность экстракции ДМ из мышечной ткани смесью ацетонитрил/вода, оцененные методом НТК ИФА, представлены в таблице 6 Из таблицы видно, что предел определения ДМ не превышает МДУ (0,5 мкг/кг) Экстракция ДМ выбранным методом эффективна и результаты не завышены Коэффициент вариации для значений степени извлечения ДМ равен 15% и не превышает максимально допустимые значения (табл 1), те воспроизводимость результатов анализа достаточно высока
Учитывая время проведения подготовки образцов мышечной ткани и эффективность извлечения ДМ, была выбрана экстракция смесью ацетонитрил/вода
Экстракцию ДМ из образцов печени и мочи осуществляли хлороформом при различных рН ДМ - вещество, обладающее средней полярностью, в связи с этим в организме млекопитающих в ходе метаболизма образуются конъюга-ты, в основном с глюкуроновой кислотой, способствующие повышению растворимости вещества и быстрому выведению его из организма Основным местом образования конъюгатов является печень и почки, поэтому перед экстракцией проводили этап деконъюгации образцов мочи и печени Р-глюкоуронидазой/арилсульфатазой из пищеварительного сока виноградной улитки Helix pomatia
Дальнейшую экстракцию проводили хлороформом при различных величинах рН (1,0, 5,2, 7,0) Значения пределов определения и эффективности экстракции ДМ представлены в таблице 7
Таблица 7
Эффективность экстракции ДМ из печени и мочи хлороформом и _смесью ацетонитрил/вода, оцененная в НТК ИФА_
Биосубстрат Печень (МДУ = 2,5 мкг/кг)
Способ экстракции рН Добавлено ДМ, мкг/кг Определено ДМ, мкг/кг Степень извлечения, % Xcp±S, мкг/кг Предел определения (Хср+6а), мкг/кг
Хлороформ (п=10) 1,0 20 18±4 90±18 0 2±0 1 08
5,2 20 51±12 255±60 5 0±0 9 10 4
7,0 20 25±3 124±17 3 0±0 1 36
Биосубстрат Моча
Способ экстракции рН Добавлено ДМ, мкг/кг Определено ДМ, мкг/кг Степень извлечения, % Xcp±S, мкг/кг Предел определения (Хср+бо), мкг/л
Хлорформ (п=10) 1,0 20 36±Ю 181±50 0,2±0,5 1,7
5,2 20 153±14 763±72 1,0±0,3 1,9
7,0 20 19±2 97±12 0,2±0,1 0,8
Для печени при значениях рН 1 предел определения, оцененный методом НТК ИФА, ниже МДУ (2,5 мкг/кг), наблюдается хороший уровень извлечения аналита из матриц При рН 5,2 и 7,0 пределы определения превышают МДУ и соответствуют высокому уровню фоновых значений или значительному уровню неспецифического ингибирования связывания антител в контрольных пробах Это приводит к искажению результатов анализа, значительному завышению уровня извлечения ДМ из матриц за счет интерферирующих веществ мат-рикса
Для мочи при рН 7,0 определение ДМ возможно при низких концентрациях аналита в пробе (до 0,8 мкг/л ДМ), эффективность экстракции от 85 до 109% Коэффициент вариации для значений степени извлечения ДМ хлороформом из печени при рН 1,0 и из мочи при рН 7,0 составляет 16% в обоих случаях В соответствии с международными требованиями, предъявляемыми к эффективности аналитических методов (табл 1), это значение является допустимой величиной
Экстракция ДМ из полнорационного комбикорма смесью ацетонит-рил/вода Значение предела определения и эффективность экстракции, оцененная методом НТК ИФА, для разведений экстрактов в 16 и 60 раз, представлены в таблице 8 Уровень добавки рассчитывали, исходя из суточной дозы ДМ, которая вызывает анаболический эффект, количество ДМ в комбикорме при этом около 200 мкг/кг Из таблицы 8 видно, что при разведении экстракта в 16 раз предел обнаружения составляет 4 мкг/кг, при разведении в 60 раз - 1,7 мкг/кг Степень извлечения ДМ при разведении в 16 раз завышена, при разведении в 60 раз находится в диапазоне от 87 до 109% Таким образом, из-за сильных матричных эффектов при анализе образцов корма необходимо разводить экстракт не менее чем в 60 раз В этом случае достигаются приемлемые значения степени извлечения аналита и коэффициента вариации (11%)
Таблица 8
Эффективность экстракции ДМ из полнорационного комбикорма смесью
ацетоннтрил/вода, оцененная в НТК ИФА
Способ экстракции Добавлено ДМ, мкг/кг Определено ДМ, мкг/кг Степень извлечения, % Хср±8, мкг/кг Предел определения (Хср+бст), мкг/кг
Разведение экстракта 1/16
Ацетонитрил/ вода (п=14) 150 >312,5 >208 3,3±0,1 3,9
Разведение экстракта 1/60
Ацетонитрил/ вода (п=14) 150 147±22 98±11 1,6±0,02 1,7
Определение ДМ в молоке проводили после его обезжиривания и осаждения белков, предел определения ДМ в НТК ИФА составил 0,2 мкг/л ДМ Степень извлечения - 85±14% Коэффициент вариации - 16% Комиссионные испытания разработанной тест-системы На основании приказа Департамента ветеринарии Минсельхоза России № 4 от 27 февраля 2004 г на базе ФГУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» (ФГУ «ЦНМВЛ») и ФГУ «ВГНКЙ», в период 19-20 июля 2005 г были проведены комиссионные испытания разработанной тест-системы
В процессе проведения испытаний были выполнены исследования 12 проб, в том числе 3 образца печени, 3 образца мышечной ткани, 3 образца мочи и 3 образца корма Оценивали работоспособность методики, рабочий диапазон определения, сходимость результатов по коэффициентам вариации, а также степени извлечения ДМ из различных биологических образцов Была подтверждена работоспособность методики на всех объектах исследования Чувствительность была достаточной для определения остаточного содержания ДМ в продукции животного происхождения на уровне МДУ в соответствии СанПиН 2 3 2 1078-01 (таблица 9)
Предложенная тест-система может применяться региональными лабораториями Россельхознадзора для контроля использования ДМ в хозяйствах на стадии выращивания животных, а также в продукции животноводства
Таблица 9
Оценка эффективности экстракции ДМ из биологических субстратов
методом НТК ИФА
Тип образца Добавлено ДМ, мкг/кг(л) Определено ДМ, мкг/кг(л) Степень извлечения,% Коэффициент вариации, %
моча 0 0 Контрольный образец
моча 10,0 10,9±0,2 109,0±2,0 1,84
печень 0 0 Контрольный образец
печень 10,0 10,9±0,2 109,0±2,0 1,84
мышцы 0 0 Контрольный образец
мышцы 10,0 9,7±0,2 97,0±2,0 2,06
комбикорм 0 0,6±0,01 Контрольный образец 1,7
комбикорм 150 158,4±8,9 105,6 5,6
2.2.4. Арбитражное определение ДМ в продукции животноводства и кормах методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
Для подтверждения подлинности присутствия остатков гормона в образце, в соответствии с международными требованиями (Official Jornal of the European Commumtes, 2002), должны быть использованы хроматографические методы, совмещенные с масс-спектрометрией (МС) Для определения глюкокор-
тикоидов в различных матрицах наиболее подходящим является метод ВЭЖХ-МС-МС
На этапе подготовки биологических образцов предстояло отработать эффективный и экономичный способ экстракции ДМ из кормов и продукции животноводства, а также способ очистки экстрактов для дальнейшего определения методом ВЭЖХ-МС-МС На первом этапе подготовки образцов экстракцию проводили смесью ацетонитрил/вода (7/3, об/об) для мышечной ткани и корма и хлороформом для печени и мочи (после проведения деконъ-югации), см п 2 1 Далее экстракты концентрировали и проводили ТФЭ Проведение ТФЭ необходимо, т к в образцах содержится значительное количество неорганических и органических примесей, что может привести к ионной супрессии при проведении масс-спектрометрического анализа При построении градуировочной зависимости методом внутреннего стандарта использовали растворы ДМ, приготовленные на экстрактах исследуемых матриц Для определения степени извлечения в исследуемые образцы вносили стандартные растворы ДМ с известной концентрацией
Оптимизировали условия проведения ВЭЖХ, полученные условия описаны в п 2 1 Время удерживания ДМ на колонке при данных условиях составило 7,7 минут На рисунке 7 представлена хроматограмма образца мышечной ткани с добавкой 1 мкг/кг ДМ
Дсксаметазон 0 6 мкг/кг
Экстракт обрата мышечной ткани
Рисунок 7 ВЭЖХ-МС-МС анализ Хроматограмма образца мышечной ткани с добавкой ДМ 1 мкг/кг
Условия проведения масс-спектрометрического детектирования в режиме тандемной масс-спектрометрии (МС-МС) подбирали с использованием растворов стандартных образцов ДМ с концентрацией 10 нг/мл Получили оптимальные параметры диссоциации и МС-МС детектирования для опреде-
ления ДМ в условиях электроспрея с регистрацией отрицательных ионов (ИЭР -) в режиме мониторинга нескольких реакций (МНР) Для ДМ в этих условиях основной пик соответствовал аддукту с формиатом [М + НСОО] ~~ с соотношением массы к заряду (м/з) 437 4 МС-МС условия представлены в таблице 10
Таблица 10
Условия масс-спектрометрического детектирования_
МС-МС параметры
Аналит Поп предшественник, м/з Дочерние ионы, м/з Режим ионизации Напряжение на конусе (Вольт) Энергия диссоциации, (еВольт)
ДМ 437,4 361,3/391,3 ИЭР- 20/20 15/15
Средние значения извлечения ДМ из различных матриц находились в диапазоне от 70-117% (табл 11), при этом предел определения ДМ для всех матриц был менее 0,1 мкг/кг (л) (рис 7)
Таблица 11
Эффективность экстракции ДМ из биологических матриц, _определенная методом ВЭЖХ-МС-МС
Биоматериал Добавлено ДМ, мкг/кг(л) Определено ДМ, мкг/кг(л) Степень извлечения, %
Печень п=3 1,3 1,3±0,3 88±23
п=3 3,0 2,5±0,4 84±13
п=3 5,0 4,7±0,7 93±14
Моча п=3 1,0 0,8±0,2 81±20
п=3 2,0 1,9±0,2 96±10
п=3 4,6 5,9±1,0 128±22
Мышечная ткань п=3 0,3 0,3±0,05 94±17
п=3 0,5 0,5±0,1 99±20
п=3 1,0 0,7±0,1 71±10
Корм п=3 10,0 8,1±2,0 81±20
п=3 20,0 17,2±2,0 86±10
Было показано, что скрининг-метод НТК ИФА и подтверждающий метод ВЭЖХ-МС-МС позволяют получать сопоставимые результаты при определении ДМ в биологических образцах Сравнение результатов определения ДМ в исследуемых экстрактах представлено в таблице 12
Таблица 12
Определение ДМ скрннинг-методом НТК ИФА и подтверждающим _методом ВЭЖХ-МС-МС в различных матрицах
Биоматериал Добавлено ДМ, икг/кг(л) ВЭЖХ-МС-МС ВЭЖХ-МС-МС НТК ИФА НТК ИФА
Определено ДМ, мкг/кг Степень извлечения, % Определено ДМ, мкг/кг Степень извлечения, %
Печень (п=3) 5 4,7±0,7 93±14 4,8±0,7 95±14
Моча (п=3) 2 1,9±0,2 96±10 2,1±0,4 102±19
Мышечная ткань (п=3) 1 0,7±0,1 71±10 0,95±0,2 95±17
Комбикорм (п=3) 20 17,0±4 86±20 19,0±3 94±15
3. ВЫВОДЫ
1 Созданы иммуногены путем конъюгирования ДМ-21-гемисукцината с белками карбодиимидным методом, позволившие получить высокоаффинные поликлональные антитела (Каф = 2*108 моль'1)
2 Оптимизированы условия проведения НТК ИФА (концентрация ТФА — 0,05 мкг/мл, время и температура сорбции его на полистироле - 1час при 37 °С, время инкубации АТ с ТФА - 1 час при 37 °С), обеспечившие специфичное определение ДМ с чувствительностью 0,02 мкг/л
3 Подобраны системы растворителей для эффективного извлечения ДМ из биологических образцов с учетом физико-химических свойств молекулы гормона (константы ионизации, липофильности и площади полярной поверхности)
4 Разработана тест-система ИФА для экспрессного определения ДМ в биосубстратах с пределом определения в мышечной ткани - 0,5 мкг/кг, в печени и моче - 0,8 мкг/кг (л), в молоке - 0,2 мкг/л, в корме - 1,7 мкг/кг Высокая эффективность тест-системы подтверждена в результате комиссионных испытаний
5 Предложены условия арбитражного анализа ДМ в биологических субстратах методом ВЭЖХ-МС-МС (способы извлечения, очистки, хромато-графического разделения и параметры тандемной масс-спектрометрии) Предел определения ДМ в матрицах методом ВЭЖХ-МС-МС составил 0,1 мкг/кг (л)
6 Установлено, что экспресс-метод ИФА и арбитражный метод ВЭЖХ-МС-МС позволяют получать сопоставимые результаты при определении ДМ в кормах, моче, печени и мышечной ткани животных
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Разработана и внедрена в практику тест-система для определения дексаме-тазона в кормах и биосубстратах методом иммуноферментного анализа Тест-система предназначена для экспресс-определения дексаметазона в кормах и
продукции животноводства при проведении государственного ветеринарного мониторинга
Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация
1 Технические условия на тест-систему «Дексаметазон-ИФА» (ТУ 9398-036-11361534-2005)
2 Инструкция по применению тест-системы «Дексаметазон-ИФА», утверждена Россельхознадзором 06 декабря 2005 г, per № ПВР-1-1 5/01487)
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Вылегжанина А В Определение дексаметазона в корме и моче животных методом иммуноферментного анализа / Вылегжанина А В , Комаров А А , Панин АН// Российский Ветеринарный Журнал - 2007 - № 1 - С 8-9
2 Вылегжанина А В Разработка иммуноферментного анализа для определения дексаметазона в биологических субстратах / Вылегжанина А В , Комаров А А // Ветеринарная Практика - 2006/2007 - № 3(34) - С 22-25
3 Комаров А А Скрининг-метод ИФА для обнаружения остаточных количеств дексаметазона в продукции жиотноводства / Комаров А А , Вылегжанина А В // Сб науч тр ФГУ «ВГНКИ» - М ФГУ «ВГНКИ» - 2006 - Т 67 - С 149-161.
4 Komarov A Obtaining of the immunogens for developing ELISA to determine some anabolic residues in livestock products / Komarov A , Vylegzhanina E , Panin A , Latyschev О , Vylegzhanina A // 5 th International Symposium On Hormone And Veterinary Drug Residue Analysis held at the Province of Antwerp House Antwerp, Belgium May 16-19, 2006 Abstract Book - Universiteit Gent -2006 -P -138
5 Komarov A Development and application of an ELISA for dexamethasone detection in livestock products and urine / Komarov A , Vylegzhanina A // 5 ""International Symposium On Hormone And Veterinary Drug Residue Analysis held at the Province of Antwerp House Antwerp, Belgium May 16-19, 2006 Abstract Book -Universiteit Gent - 2006 - P - 140
6 Комаров А А Определение дексаметазона в моче животных методом ИФА / Комаров А А , Вылегжанина А В // Материалы Всероссийского ветеринарного конгресса и XIV Международного Московского конгресса по болезням мелких домашних животных -М -2006 -С 180-181
7 Вылегжанина А В Определение остаточных количеств дексаметазона в мышечной ткани методом НТК ИФА / Вылегжанина А В , Комаров А А // Тезисы докладов всероссийской конференции ФГУ «ВГНКИ» М ФГУ «ВГНКИ» -2005 -С 126-127
8 Комаров А А Разработка тест-сисемы ИФА для определения остаточных количеств дексаметазона в продукции животноводства / Комаров А А , Вылегжанина А В // Материалы международной научно-практической конференции посвященной 35-летию ВНИиТиБП - Щелково -2005 — С 673-677
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ - антиген
АТ - антитело
БСА - бычий сывороточный альбумин
БСА-ГсДМ - конъюгат гемисукцинат-21-дексаметазона с БСА
БСА-ГсЖ - конъюгат гемисукцинат-21-дексаметазона с Ж
БСА-ГсКСА - конъюгат гемисукцинат-21-дексаметазона с КСА
БСА-ГсЯА - конъюгат гемисукцинат-21-дексаметазона с ЯА
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ВЭЖХ-МС-МС высокоэффективная жидкостная хроматография тандемная масс-
спектрометрия
ГХ-МС - газовая хроматография масс-спектрометрия
ДМ - дексаметазон
Ж - желатина
ик50% - концентрация АГ, обеспечивающая 50%-ное ингибирование связывания АТ
ИФА - иммуноферментный анализ
ИЭР - ионизация электрораспылением
Каф - константа аффинности
КСА - кроличий сывороточный альбумин
м/з - соотношение массы к заряду молекулы
МДУ - максимально допустимый уровень
МНР - мониторинг нескольких реакций
НТ ИФА - непрямой твердофазный иммуноферментный анализ
НТК ИФА - непрямой твердофазный конкурентный ИФА
ОП450 - оптическая плотность, измеренная при длине волны 450 нм
ПАФ - полный адъювант Фрейнда
ТФА - твердофазный антиген
ТФЭ - твердофазная экстракция
ЯА - яичный альбумин
% С АТ - процент связывания АТ
Заказ № 112/04/07 Подписано в печать 13 04 2007 Тираж 130 экз Уел пл 1,5
ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www cfr ru, e-mail info@cfr ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вылегжанина, Александра Владимировна
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Стимуляторы роста.
2.2. Кортикостероиды.
2.3. Дексаметазон.
2.4. Фармакокинетика дексаметазона.
2.5. Фармакодинамика дексаметазона.
2.6. Определение приемлемой суточной дозы потребления ДМ.
2.7. Расчет максимально допустимого уровня остатков ДМ.
2.8. Период ожидания после применения ДМ.
2.9. Скрининг-методы.
2.10. Иммуноферментный анализ (ИФА).
2.11. Гетерогенный ИФА.
2.12. Принципы иммобилизации биомолекул.
2.13. Ферментативные метки в ИФА.
2.14. Выбор подходящего субстрата в ИФА.
2.16. Арбитражные методы.
2.17. Предел определения метода.
2.18. Получение иммуногенов и иммунореагентов.
2.19. Иммунная система млекопитающих.
2.20. Синтез АГ.
2.21. Количество АГ для иммунизаций.
2.22. Основные свойства адъювантов.
2.23. Выбор адъюванта.
2.24. Выбор животного для продукции поликлональных AT.
2.25. Пути введения и количество инъекций для первичной иммунизации.
2.26. Повторные поддерживающие иммунизации.
2.27. Программы иммунизаций.
2.28. Определение следов органических соединений.
2.29. Жидкостно-жидкостная экстракция.
2.30. Технология экстракции.
2.31. Методы экстракции дексаметазона.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Используемые реактивы и материалы.
3.2. Методы исследований.
3.2.1. Получение гаптена и конъюгатов дексаметазона с белками.
3.2.2. Получение специфических поликлональных сывороток.
3.2.3. Сенсибилизация лунок планшета.
3.2.4. Определение активности иммунных сывороток.
3.2.5. Определение специфичности и константы аффинности иммунных сывороток.
3.2.6. Определение специфичности тест-системы.
3.2.7. Определение концентрации белка по методу Лоури.
3.2.8. Экстракция ДМ из биологических субстратов.
3.2.8.1. Подготовка образцов мышечной ткани КРС.
3.2.8.2. Подготовка образцов мышечной ткани свиньи.
3.2.8.3. Подготовка образцов печени.
3.2.8.4. Подготовка образцов почек.
3.2.8.5. Подготовка образцов мочи.
3.2.8.6. Подготовка образцов корма.
3.2.8.7. Подготовка образцов молока.
3.2.9. Проведение ВЭЖХ-МС-МС анализа.
3.2.10. Определение концентрации ДМ в исследуемых образцах.
3.2.11. Определение эффективности экстракции ДМ из биологических субстратов.
3.2.12. Расчет метрологических характеристик НТК ИФА.
3.2.12.1. Расчет пределов обнаружения и определения ДМ в образцах.
3.2.12.2. Воспроизводимость результатов анализа.
3.2.12.3. Сходимость результатов анализа.
3.2.13. Обработка данных.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Получение специфических иммунореагентов.
4.2. Отработка условий проведения процедуры НТК ИФА.
4.2.1. Получение специфических иммунных сывороток.
4.2.2. Определение активности иммунных сывороток в НТ ИФА.
4.2.3. Определение специфичности иммунных сывороток в НТК ИФА.
4.2.4. Определение констант аффинности AT в НТК ИФА.
4.2.5. Выбор ТФА для сенсибилизации иммунологического планшета.
4.2.6. Выбор оптимальной концентрации ТФА.
4.2.7. Определение оптимального времени сенсибилизации и оптимальной температуры инкубации ТФА с полистиролом.
4.2.8. Проверка различных иммунологических планшетов в НТК ИФА.
4.2.9. Определение оптимального времени и температуры инкубации ТФА с AT в НТК ИФА.
4.2.10. Определение чувствительности предлагаемого метода для определения ДМ.
4.2.11. Определение специфичности тест-ситемы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка тест-системы ИФА для определения дексаметазона в биологических субстратах"
Актуальность темы
Дексаметазон (ДМ) - синтетический глюкокортикоид, который широко используется в ветеринарии в качестве противовоспалительного средства [128, 137, 164]. ДМ применяется также в качестве стимулятора роста продуктивных животных [43, 48, 44, 150, 18, 39]. Остаточное содержание этого глюкокорти-коида в животноводческой продукции может оказывать эмбриотоксическое и генотоксическое действие на организм человека [168, 169, 140, 82]. В России и странах Европейского Союза введен запрет на использование гормональных стимуляторов роста, в том числе ДМ, в животноводстве [53; 9]. Терапевтическое применение ДМ регламентировано максимально допустимым уровнем (МДУ), установленным для этого гормона в продукции животного происхождения [36, 12].
В 2003-2005 годах в Европе были проведены мониторинговые исследования нелегального использования гормональных стимуляторов роста в животноводстве. По данным Европейской Комиссии ДМ является гормоном, остатки которого чаще всего обнаруживают в животноводческой продукции. В 2003 г. было зарегистрировано 130 случаев нелегального применения ДМ в Европе; в 2004 г. - 64 случая; в 2005 г. - 186 случаев [130].
Возможное негативное влияние ДМ на здоровье людей, а также частое обнаружение остаточных количеств этого гормона в продукции животноводства, сделали актуальным проведение широкомасштабного мониторинга его использования. Мониторинг должен основываться на сочетании преимуществ использования быстрых иммунохимических реакций с достоинствами современных арбитражных спектрометрических методов анализа.
Для обеспечения в Российской Федерации мониторинга использования ДМ в кормах и продукции животноводства необходимо создание чувствительного и специфичного экспресс-метода. Наиболее перспективным для этих целей является использование непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (НТК ИФА), обладающего следующими преимуществами: низкая стоимость, простота проведения анализа и возможность тестирования большого количества образцов за короткий промежуток времени [163].
Среди арбитражных методов, используемых для подтверждения остаточного содержания глюкокортикоидов в образцах, показавших положительный результат в ИФА, наиболее перспективным является высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС-МС) [18, 148,20].
Цель и задачи исследований
Целью работы явилось создание высокочувствительной и специфичной тест-системы на основе непрямого твердофазного конкурентного иммунофер-ментного анализа для экспрессного определения ДМ в биосубстратах. В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
• синтезировать карбоксипроизводное ДМ и создать иммуноге-ны путем конъюгации его с белками;
• получить поликлональные кроличьи сыворотки на синтезированные иммуногены;
• провести скрининг полученных сывороток в ИФА с целью выявления наиболее активных и специфичных из них;
• оптимизировать условия постановки непрямого конкурентного твердофазного ИФА для определения ДМ в биосубстратах;
• разработать простые и экономичные способы подготовки биологических образцов для экспрессного определения в них ДМ; оценить чувствительность и специфичность метода;
• провести комиссионные испытания тест-системы ИФА для определения ДМ в биосубстратах; утвердить нормативную документацию на тест-систему и зарегистрировать ее в Российской Федерации;
• подтвердить результаты экспрессного определения остаточного содержания ДМ в биосубстратах арбитражным методом ВЭЖХ-МС-МС.
Научная новизна
Впервые в Российской Федерации синтезированы иммуногены путем конденсации ДМ с янтарным ангидридом и конъюгированием дексаметазон-21-гемисукцината с белками, что позволило получить высокоаффинные поликло-нальные антитела. Оптимизированы условия высокочувствительного и специфичного определения ДМ в биосубстратах экспресс-методом ИФА. С учетом показателей константы ионизации и липофильности молекулы ДМ выбраны системы органических растворителей, позволившие разработать эффективные способы извлечения этого гормона из биосубстратов. Оптимизированы условия арбитражной методики определения ДМ в биологических образцах с использованием ВЭЖХ-МС-МС.
Практическая значимость
Создана тест-система, предназначенная для определения остаточных количеств ДМ в продукции животноводства после терапевтического применения его в ветеринарии, а также для проведения государственного мониторинга незаконного использования этого гормона в качестве анаболического стимулятора роста. На тест-систему утверждена нормативная документация. Тест-система «Дексаметазон-ИФА» зарегистрирована в Российской Федерации, налажено серийное производство наборов реагентов для выявления ДМ в биологических образцах методом ИФА.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены на: 1. Международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ВНИ ТИБП (Щелково, 2005);
2. Конференции молодых ученых ФГУ ВГНКИ (Москва, 2005);
3. Конференции молодых ученых ФГУ ВГНКИ (Москва, 2006);
4. XIV Всероссийском ветеринарном конгрессе (Москва, 2006);
5. 5th International Symposium on hormone and veterinary drug residue analysis (Antwerp, Belgium, 2006);
6. Конференции молодых ученых ФГУ ВГНКИ (Москва, 2007).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту: создание иммуногенов, получение и характеристика специфических им-мунореагентов; разработка эффективных способов экстракции ДМ из биосубстратов и оптимизация условий его определения методом ИФА; подтверждение результатов экспресс-определения ДМ в биосубстратах арбитражным методом ВЭЖХ-МС-МС.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературных источников и приложения. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 25 таблицами. Список литературы содержит 184 источника, в том числе 171 иностранный.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Вылегжанина, Александра Владимировна
6. ВЫВОДЫ
1. Созданы иммуногены путем конъюгирования ДМ-21-гемисукцината с белками карбодиимидным методом, позволившие получить высокоаффинные поликлональные антитела (Каф = 2*108 моль"1).
2. Оптимизированы условия проведения НТК ИФА (концентрация ТФА -0,05 мкг/мл, время и температура сорбции его на полистироле - 1час при 37 °С, время инкубации AT с ТФА - 1 час при 37 °С), обеспечившие специфичное определение ДМ с чувствительностью 0,02 мкг/л.
3. Подобраны системы растворителей для эффективного извлечения ДМ из биологических образцов с учетом физико-химических свойств молекулы гормона (константы ионизации, липофильности и площади полярной поверхности).
4. Разработана тест-система ИФА для экспрессного определения ДМ в биосубстратах с пределом определения: в мышечной ткани - 0,5 мкг/кг; в печени и моче - 0,8 мкг/кг (л); в молоке - 0,2 мкг/л; в корме - 1,7 мкг/кг. Высокая эффективность тест-системы подтверждена в результате комиссионных испытаний.
5. Предложены условия арбитражного анализа ДМ в биологических субстратах методом ВЭЖХ-МС-МС (способы извлечения, очистки, хромато-графического разделения и параметры тандемной масс-спектрометрии). Предел определения ДМ в матрицах методом ВЭЖХ-МС-МС составил 0,1 мкг/кг (л).
6. Установлено, что экспресс-метод ИФА и арбитражный метод ВЭЖХ-МС-МС позволяют получать сопоставимые результаты при определении ДМ в кормах, моче, печени и мышечной ткани животных.
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Разработана и внедрена в практику тест-система для определения дексаметазона в кормах и биосубстратах методом иммуноферментного анализа. Тест-система предназначена для экспресс-определения дексаметазона в кормах и продукции животноводства при проведении государственного ветеринарного мониторинга.
Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация:
1. Технические условия на тест-систему «Дексаметазон-ИФА» (ТУ 9398-036-11361534-2005).
2. Инструкция по применению тест-системы «Дексаметазон-ИФА», утверждена Россельхознадзором 06 декабря 2005 г, per. № ПВР-1-1.5/01487).
4.5.2. Заключение
Были оптимизированы условия подтверждающего ВЭЖХ-МС-МС метода определения ДМ в различных биосубстратах, чувствительность составила менее ОД мкг/кг(л) для всех исследованных матриц. Было показано, что скрининго метод НТК ИФА и арбитражный метод ВЭЖХ-МС-МС дают сопоставимые ре- v зультаты при определении ДМ в мышечной ткани, печени, моче и комбикорме.
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ДМ широко используется в животноводстве в качестве лекарственного средства, а также нелегально используется в качестве стимулятора роста. Наличие остаточных количеств этого гормона в продукции животноводства может отрицательно сказываться на здоровье потребителей [70].
Для контроля за применением ДМ в качестве нелегального стимулятора • роста необходимо было разработать экспресс-метод определения ДМ, а также оптимизировать условия арбитражного метода - высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС-МС), подтверждающего присутствие вещества в образцах, показавших положительный результат при определении экспресс-методом.
В нашей работе для определения ДМ был выбран метод ИФА, т.к. известно, что этот метод часто применятся для определения стероидов [176]. ИФА обладает рядом преимуществ, по сравнению с другими скрининг-методами (такими как РИА, рецепторный анализ и др.). ИФА - простой в исполнении, безопасный метод, обладающий высокой чувствительностью. Для ИФА характерна легкость способов визуальной и приборной регистрации, простота проведения анализа; доступность оборудования и реагентов [3].
При разработке ИФА, как и любого другого иммунохимического метода, наиболее ответственным этапом исследований является получение специфических иммунореагентов, определяющих чувствительность и специфичность анализа и получение высокотитражных, высокоаффинных антисывороток [81]. В ходе экспериментов были получены специфические иммунореагенты: твердофазный антиген и специфические поликлональные сыворотки.
Молекулярная масса ДМ составляет 392 Да. Т.к. вещество с такой молекулярной массой не обладает собственной иммуногенностью, то в целях создания иммуногена ДМ необходимо было конъюгировать с белками-носителями [63]. Белковые молекулы увеличивают вероятность создания хороших Т-клеточных эпитопов, и с большей вероятностью вовлекаются в процесс представления на поверхности специальных АГ-перерабатывающих/АГпрезентирующих клеток, даже при пороговых концентрациях АГ [81]. Из литературы известно, что БСА является одним из самых распространенных белков-носителей, применяемых для получения иммуногенов. Молекулярная масса БСА составляет 67 кДа, он обладает высокой растворимостью в воде, в молекуле БСА 59 аминокислотных остатков лизина, 30-35 из которых содержат первичные аминогруппы, способные вступать в реакции, например, в реакцию образования пептидных связей [182].
Для создания конъюгата на первом этапе был синтезирован гаптен, который в последствии присоединяли к белку-носителю. Анализ литературных данных показал, что при разработке методов иммуноферментного анализа ДМ (I) в качестве гаптена чаще всего используют эфиры янтарной кислоты (II) по окси-группе в положении 21 [102]. Затруднения, которые возникали при этом, обусловлены тем, что в процессе синтеза возможно образование диацильного производного (IV) по оксигруппе в положении 11 (рис. 18).
IV
Рисунок 18. Диацильное производное по оксигруппе в положении 11.
Обычно это препятствие преодолевают тем, что монооксиацильное производное получают в две стадии. В начале, в относительно жестких условиях, синтезируют диоксиацильное производное типа (IV), которое в мягких условиях (выдержка с разбавленным водноспиртовым раствором углекислого калия при 200 °С) превращают в моноацильное производное.
При проведении конъюгации гаптена с БСА следует отметить, что конденсация идет в водной среде при рН 8-9. Нужные значения рН поддерживают с помощью водных растворов сильных оснований, что не исключает создания более высоких значений рН при их передозировке. Этот фактор не важен при коньюгировании гаптенов, производных уксусной и аминоуксусной кислот. Однако при коньюгировании лабильных гемисукцинатов, это может играть определяющее значение. В этом случае необходимо работать в мягких условиях (рН 7,0-7,2, Т=4-50°С).
Были получены конъюгаты ДМ с высокомолекулярными белками (БСА, КСА, Ж и ЯА). Конъюгат БСА-ГсДМ был использован для получения специфических иммунных сывороток, конъюгаты БСА-ГсДМ, Ж-ГсДМ, ЯА-ГсДМ и КА-ГсДМ использовались как твердофазные антигены при отработке условий постановки ИФА.
Количество молекул гаптена, связанных с белком, можно определить различными методами [65]. Мы использовали в нашей работе метод УФ-спектроскопии. Эпитопная плотность ДМ составила 12 молей на один моль белка (БСА). Эпитопная плотность гаптена, связанного с белком-носителем, может влиять на иммунный ответ [63]. В исследованиях стероид-протеиновых конъюгатов в качестве иммуногенов для продукции анти-стероидных AT было показано, что при низкой плотности гаптенов образуются AT с низкими титрами; умеренная плотность является оптимальной, тогда как высокая плотность может препятствовать образованию AT [63]. Присоединение 10-20 небольших молекул к инородному белку-носителю, типа БСА, может быть эффективно в определенных пределах [81]. В наших экспериментах при эпитопной плотности 12 молекул гаптена ДМ на молекулу БСА был получен приемлемый титр для AT N4, N5, N51 (см. п.4.3.1. табл. 4.).
В целях получения поликлональных сывороток иммунизировали кроликов. Обычно от большинства кроликов можно получить сыворотки с высоким титром к вводимому АГ, однако некоторые кролики не дают необходимого ответа, поэтому для иммунизации использовали несколько животных (2 кролика в первой и 3 во второй серии экспериментов).
Для получения AT был выбран конъюгат ДМ с БСА. На конъюгат КСА-ГсДМ не получали антисыворотки, т.к. известно, что для получения сыворотки с высоким титром необходимо использовать белковый АГ для иммунизации животных филогенетически далекого вида. Это связано с тем, что чем больше различий и, следовательно, эпитопов, тем больше продукция AT [81]. На конъюгат Ж-ГсДМ также не получали антисыворотки, т.к. известно, что желатин не обладает собственной иммуногенностью [138]. Овальбумин обладает несколько меньшим молекулярным весом, чем БСА 45x103 Да, также на поверхности овальбумина меньше реакционноспособных первичных аминных групп - 20 на молекулу [117], он значительно реже чем БСА применяется для создания им-муногенов, хотя вполне применим для этого [135].
Для стимуляции иммунной системы кролика АГ вводят с адъювантом. Наиболее часто в качестве адъюванта используется адъювант Фрейнда [81]. В наших экспериментах для первичной иммунизации был выбран полный адъювант Фрейнда, дальнейшие поддерживающие иммунизации проводились без адъюванта.
Для иммунизации животных был выбран внутрикожный путь введения АГ. Известно, что внутрикожный путь предпочтителен, т.к. сосудистая абсорбция из этой области относительно низкая, а лимфоток относительно быстрый. В коже также находится большое количество дендритных клеток Лангерганса, которые способствуют быстрому переносу АГ к лимфатическим узлам [81].
АГ вводился в 30-40 точек в области спины для снижения риска возникновения патологического воспалительного ответа в областях иммунизации [81].
Для кроликов доза растворимого белка, вводимого вместе с ПАФ, находится в пределах от 50-1000 мкг [83]. В наших экспериментах была предложена концентрация (по белку) АГ 100 мкг (в ПАФ) на кролика для первичной иммунизации, для первой повторной иммунизации также использовали 100 мкг АГ (без адъюванта), дальнейшие поддерживающие иммунизации проводили 20 мкг
АГ (без адъюванта) на кролика (табл. 2). Иммунизации проводили с интервалом в месяц, сыворотку отбирали через неделю после иммунизации.
Цель состояла в том, чтобы получить большое количество высокоаффинных AT в ходе вторичного иммунного ответа, таким образом, высокий титр AT после первичной иммунизации необязателен [81]. Основанием для выбора схемы иммунизации явилась работа Goudie R.B. et al. [74], который в 1966 г предложил стратегию для отбора относительной концентрации АГ для первичной и вторичной иммунизаций. В этом случае применялась большая доза для первичной иммунизации. Возможно, большая первичная доза изначально стимулирует большее количество клонов В-клеток и тем самым дает обширную базу для последующих соматических мутаций. Процесс отбора, при условии снижения доступных АГ, должен обеспечить выживание только высоко-аффинных клонов. Эта стратегия также исходит из того, что клетки памяти стимулируются меньшим количеством АГ, чем нужно для первичной стимуляции В-клеток или Т-клеток [81].
Для определения ДМ был выбран вариант непрямого конкурентного твердофазного ИФА. Гетерогенный ИФА обладает большей чувствительностью, чем гомогенный анализ (чувствительность находится в районе микро-граммов-нанограммов концентраций белка в 1 мл) [11]. Известно также, что по сравнению с прямым методом, непрямой обладает следующими преимуществами:
- повышенная чувствительность, т.к. каждое первичное антитело содержит несколько эпитопов, которые связываются с вторичными антителами, за счет этого происходит усиление сигнала;
- иммунореактивность первичных антител не изменяется из-за присоединения метки [55] и др.
В качестве растворителя для приготовления калибровочных растворов ДМ и экстрактов использовали 20% метанол. Jourdan S.W. et al. [98] установил, что для проведения ИФА метанол является одним из лучших допустимых растворителей. Однако метанол может как угнетать связывание антител с антигенами, так и ускорять связывание (в зависимости от природы аналита). Haasnoot W. et al. [80] исследовал влияние концентрации метанола в различных видах имму-ноанализа. Было показано, что в ИФА для определения стероидов (нортесто-стерона, кортикостероидов, тестостерона и др.) оптимальной является концентрация метанола от 15 до 30% в лунке.
В ходе отработки условий проведения анализа была определена активность AT и установлено их рабочее разведение. Титру AT соответствует конечное разведение, при котором возможно определение активности в предлагаемом варианте ИФА [81]. В наших экспериментах определяли титр AT в непрямом твердофазном ИФА. За титр принимали такое разведение, при котором ОП45о = 1,0 + 0,2.
Для кроликов N4 и N5 характерны более высокие титры AT, чем для кроликов N49, N50, N51, что можно объяснить, в том числе, и индивидуальными особенностями животных. Для животных N4 и N5 максимальные титры AT были получены после 5-ого введения АГ.
Титры AT N49, N50, N51 не превышали 1:1600. Для животного N49 последующие иммунизации не приводили к увеличению титра сыворотки, титр сыворотки снижался, т.е. это животное не дало адекватного антительног ответа на введение АГ. Для животного N50 до шестого взятия титр соответствовал разведению 1:200, после шестого взятия титр увеличился всего в два раза, т.е. антительный ответ был недостаточным. У животного N51 после 10-ой иммунизаций был получен максимальный титр AT (1:800), сохранившийся при последующих иммунизациях.
Далее определяли специфичность иммунных сывороток в НТК ИФА. Из рисунка 7 видно, что для AT N49 при добавлении ДМ в концентрации 12,5 нг/мл процент связывания с ТФА не превышал 80%. В сыворотке N49 обнаруживалось мало высоко-аффинных AT (или много низко-аффинных) . Было показано, что количество AT в сыворотке N49 также невелико (см. пункт
4.3.1.). Можно утверждать, что у животного N49 иммунный ответ был недостаточным, как с точки зрения образования низко-аффинных, так и высокоаффинных клонов В-клеток.
Для AT N50 после второго введения АГ отмечена максимальная специфичность. Анализ специфичности сывороток от животного N50 в НТК ИФА показал, что специфичность уменьшилась после 3-6 введений АГ, тогда как после седьмого введения АГ образование специфических AT несколько увеличилось и вышло на плато. Процент связывания AT для 7-10 взятий в среднем составило 47%. В данном случае, в отличие от сыворотки N49, специфические AT образовывались, однако их количество было недостаточным (титр не более 1:400) (пункт 4.З.1.).
В ходе иммунизаций кролика N51 специфичность AT постепенно возрастала. После первых четырех введений АГ % связывания AT находился в пределах 72%; после пятого и шестого - 52%; после седьмого и восьмого - 64%; после девятого и десятого - 56%, и только после одиннадцатого и двенадцатого введений % CAT снизился до 41%, т.е. специфичность возросла. Титр AT ос-тепенно возрастал в ходе иммунизаций. Можно предполагать, что в течение года у кролика №51 происходило постепенное созревание и отбор высокоаффинных клонов В-клеток.
Аффинность, которая определяется константой аффинности (Каф), является важной характеристикой AT, показывая степень сродства с АГ (ДМ). Для иммунохимических методов наиболее интересны высоко аффинные AT, Каф которых больше или равна 108 моль'1. Для полной характеристики сыворотки оценивают оба значения - титр и аффинность AT, поскольку измерение только титра не полностью характеризует сыворотку [81]. Аффинность AT определяется количеством комплексов антиген-антитело, которые присутствуют в состоянии равновесия. Высокоаффинные AT (Каф = 1012 моль'1) связывают большее количество АГ за более короткий срок, чем низкоаффинные (Каф = 104 моль"1) [80]. Нужно также учитывать, что титр сыворотки находится в прямой зависимости от чувствительности анализа и сравнение титров возможно только для данных, полученных от аналогичных стандартизированных иммунофер-ментных систем.
Для AT N51-11 в НТК ИФА ИК5Ш ДМ сосавляет ~2 нг/мл и Каф = 2х 108 моль"1.
Из таблицы 5 видно, что AT N51-11 являются наиболее высокоаффинными, AT N4-6 обладают аффинностью примерно в три раза меньшей, чем AT N51-11.
Для разработки метода были выбраны AT N51-11 в рабочем разведении 1:800. Их можно считать высокоаффинными, для этих AT были получены лучшие показатели чувствительности и специфичности,.
В ходе работы отбирали ТФА для сенсибилизации иммунологического планшета. Существуют данные, что структурные отличия АГ, применяемых для иммунизации и в качестве ТФА, в некоторых случаях увеличивают чувствительность ИФА [5]. В наших экспериментах большая чувствительность наблюдалась при использовании конъюгата БСА-ГсДМ в качестве иммуногена и ТФА. При этом важно, чтобы иммобилизованные на полистироле молекулы располагались монослоем, что увеличивает точность метода. При образовании монослоя снижается количество пустых областей на поверхности полистирола (которые образуются в случае, если концентрация слишком мала), или нестабильных многослойных образований, из-за взаимодействий между молекулами белков (при слишком высокой концентрации) [57]. В нашем случае, оптимальной концентрацией оказалась концентрация 0,05 мкг/мл.
Время и температура инкубации ТФА также имеют большое влияние на процесс иммобилизации белков на полистироле. Так, при 37 °С связывание белка примерно вдвое больше, чем при 4 °С [4]. Было показано, что наилучшими условиями инкубации для первичной иммобилизации являются 16 ч при 4 °С. Эти условия являются наиболее стабильными, длительное время инкубации способствует установлению равновесия между связавшейся и свободной формами белка [57]. В наших экспериментах для у инкубации в течение 16 ч при 4
С калибровочная кривая не была линейна. Это может быть связано с изменениями концентраций за счет испарения реагентов, особенно по краям планшета, что обычно значительно снижает точность измерений [57]. Для 2 часов при 37 °С также наблюдается некоторая нелинейность, что также может быть связано с «краевыми эффектами». График зависимости %САТ от концентрации ДМ был линеен для условий инкубации 1 час при 37 °С (рис. 12), эти условия являются оптимальными с точки зрения стабильности получаемых результатов. Было отмечено, что инкубация на верхней полке термостата дает более стабильные результаты, что согласуется с литературным данными о том, что в случае поступления тепла снизу планшета (в большей степени, чем с боков), возможно избежать краевых эффектов, вызванных температурным градиентом [57].
Установили чувствительность реакции НТК ИФА для определения ДМ. Она составила 0,02 мкг/л. График зависимости логарифма концентрации ДМ от % CAT линеен в области от 0,02 до 62,5 мкг/л Определение ДМ возможно в широком диапазоне концентраций (рис. 16).
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вылегжанина, Александра Владимировна, Москва
1. Байерман К. Определение следовых количеств органических веществ / Байерман К. М.: Мир, 1987. - 462 с.
2. Будников Г.К. Определение следовых количеств веществ как проблема современной аналитической химии / Будников Г.К. // Химия. 2000. -28с.
3. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. М.: Высшая школа, 1991.-251 с.
4. Иммуноферментный анализ // Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхофф. М.: Мир, 1988.- 173-243 с.
5. Кононенко Г.П. Применение твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа для определения фумонизинов группы В / Кононенко Г.П., Буркин А.А., Зотова Е.В., Соболева Н.А. // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т. 35. №2. - С. 206-211.
6. Кольман Я. Наглядная биохимия / Кольман Я., Рём К.-Г. М.: Мир.,2000.-366 с.
7. Коренман Я.И. Экстракция органических соединений / Коренман Я.И. // Химия. 1997. -http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/239.html
8. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. / Машковский М.Д. -14-е изд. М.: ООО «Издательство Новая Волна»: Издатель С.Б. Дивов,2001.-Т. 2.-31 с.
9. Правила по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения, № 604. 18.08. 1999.
10. Розен В.Б. Основы эндокринологии / Розен В.Б.; Под ред. Смирновой О.В. Издательство Московского Унверститета, 1994. - 115 с.
11. П.Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ / Самуилов В.Д. // Соросов-ский журнал, http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/896.html. 1999.
12. СанПиН 2.3.2.1078-01, М: ФГУП «ИнтерСЭН». - 2002. - 155 с.
13. Химическая информационная сеть. Физическая химия. Московский Университет // http://www.chem.msu.su/rus/olimpiad/russia/2006/reshvyb-phys.pdf
14. Abraham G. Possible role of dexamethasone in sensitizing the beta-adrenergic receptor system in vivo in calves during concomitant treatment with clenbuterol / Abraham G., Gottschalk J., Ungemach F. // Pharmacology. -2004. Vol. 72 №3. - P. 196-200.
15. Abraham G. Solid-phase radioimmunoassay of estradiol-17 / Abraham G. // J Clin Endocrinol Metab. 1969. - Vol. 29. - P. 866-870.
16. Allison A.C. Immunological adjuvants: Desirable properties and side-effects / Allison A.C., Byars N.E. // Molec. Immunol. 1991. - Vol. 28. - P. 297-384.
17. Altman A. Immunomodifiers in vaccines / Altman A., Dixon F.J. // Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine. 1989. - Vol. 33. - P. 301343.
18. Analitical strategies for residue analysis of veterinary drugs growth-promoting agents in food-producing animals a review / Stolker A.A.M., Brinkman U.A.Th. // J. Chromotogr. A. - 2005. - Vol. 1067. - P. 15-53.
19. Antignac J.P. Analytical strategies for the direct mass spectrometric analysis of steroid and corticosteroid phase II metabolites / Antignac J.P., Brosseaud A., Gaudin-Hirret I., Andre F., Bizec B.L. // Steroids. 2005. - Vol. 70 №3. - P. 205-216.
20. Antignac J.P. Study of natural and artificial corticosteroid phase II metabolites in bovine urine using HPLC-MS/MS / Antignac J.P., Bizec B.L., Monteau F., Andre F. // Steroids. 2002. - Vol. 67. №10. - P. 873-82.
21. Asensio C. Role of glucocorticoids in the physiopathology of excessive fat deposition and insulin resistance / Asensio C., Muzzin P., Rohner-Jeanrenaud F. // Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2004. - Vol. 28 - P. 45-52.
22. Australian Government, Dep. Of Agric., Fisheries and Forestry http://www.affa.gov.au/corporatedocs/publications/pdf/animalplanthealth/nrs/ international/ pigmrlsaug06.pdf
23. Bennett B. A comparison of commercially available adjuvants for use in research / J. Immunol. Methods // Bennett В., Check I.J., Olsen M.R., Hunter R.L.- 1992.-Vol. 153.-P. 31-40.
24. Bevalot F. Analitical strategies for the screening of veterinary drugs and their residues / Bevalot F., Gaillard Y., Lhermitte M.A., Pepin G. J. // Chromatogr. В.-2000.-Vol. 740.-P. 227.
25. Caloni F. Determination of dexamethasone in milk of dairy cows by immuno-enzymatic assay / Caloni F., Belloli C., Crescenzo G., Ormas P., Archimbault P. // Vet. Hum. Toxicol. 2000. - Vol. 42. №6 - p. 345-348.
26. Carraway K.K. Carbodiimide modification of proteins / Carraway K.K., Kosland D.E. // Methods Enzymol. 1972. - Vol. 25. - P. 616.
27. Cartmill J.A. Effect of dexamethasone, feeding time, and insulin infusion on leptin concentrations in stallions / Cartmill J.A., Thompson D.L., Storer W.A., Crowley J.C., Huff N.K., Waller C.A. // J. Anim. Sci. 2005. - Vol. 83.-P. 1875-1881.
28. Cerni L. Dexamethasone and clenbuterol detection by enzyme immunoassay in bovine liver tissue: a new multiresidue extraction procedure / Cerni L., Bian-cotto G., Tondolo A., Bogoni P. // Food Agr. Immun. 1998. - Vol. 10 - P. 307-315.
29. Clemons D.J. Evaluation of the subcutaneous chamber as an alternative to adjuvant immunization for antibody production in rabbits. / Clemons D.J., Besch-Williford C., Riley L.K. // Lab. Anim. Sci. 1992. - Vol. 42. - P. 307311.
30. Codex Alimentarius Commission. Joint FAO/WHO Food Standards programme, 1993.
31. Codex Alimentarius Commission. Joint FAO/WHO Food Standards programme, 1998.
32. Contaminants and Target Biological Matrices // School of Advanced Residue Analysis in Food. http://www. saraf-educ. org. 2003. - P. 51.
33. Contiero L. Detection of dexamethasone residue in bovine livers and urines when used as growth promotoring agent / Contiero L., Neri В., Giannetti L., Bagnati R., Pozza G., Angeletti R. // 5th Int. Symp. Hormone And Veterinary
34. Drug Residue Analysis held at the Province of Antwerp House Antwerp, Belgium May 16-19, 2006. Abstract Book. Universiteit Gent. - 2006. - P. 71.
35. Coons A.H. Demonstration of pneumoccocal antigen in tissues by use of fluorescent antibody / Coons A. H., Creech H.J., Jones R.N., Berliner E. // J. Immunol. 1942.-Vol. 45.-P. 159-170.
36. Cooper P.D. The selective induction of different immune responses by vaccine adjuvants / Cooper P.D. // Strategies in Vaccine Design (by ed. Ada G.L.), Austin: R.G. Landes Company. 1994. - P. 125-158.
37. Cooper P.D The adjuvanticity of Algammulin, a new vaccine adjuvant / Cooper P.D., McComb C., Steele EJ. // Vaccine. 1991. - Vol. 9 - P. 408-415.
38. Courtheyn D. Misuse of growth promoters in livestock production / Courtheyn D., Vercammen J., Logghe M., Seghers H., De Wasch K., De Brander H. // Analytica Chimica Acta. 2002. - Vol. 473. - P. 71-82.
39. Current Protocols in Immunology / By eds. Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M., Strober W. New York: John Wiley & Sons, 1995.-P. 144.
40. Czock D. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Systemically Administered Glucocorticoids / Czock D., Keller F., Rasche F.M., Haussler U. // Clinical Pharmacokinetics 2005. - Vol. 44. № l. - p. 61-98.
41. De Wasch K. Detection of corticosteroids in injection sites and cocktails by MSn / De Wasch K., De Brabander H., Courtheyn D., Van Peteghem C. // Analyst. 1998. - Vol. 123 №12. - P. 2415-2422.
42. Dighe K.K. A solid phase radioimmnoassay for plasma progesterone / Dighe K.K., Hunter W.M. // Biochem. J. 1974. - P.143,219-231.
43. Dowling P. CgFARAD the Canadian Food Animal Residue Avoidance Database / Dowling P., Doucet M., Fortier S., Clark C. // www.canadianveterinarians.net /larounds.
44. Dray S. Allotype suppression / Dray S. // Ontogeny of Acquired Immunity, A Ciba Foundation Symposium. Amsterdam: ASP, Elsevier, North Holland. -1971.-P. 87-103.
45. Edwards R.W.H. The extraction and oxidation of urinary steroids conjugate / Edwards R.W.H., Kellie A.E., Wade A.P. // Memoirs of the Society for Endocrinology. 1953. - Vol. 2. - P. 53-63.
46. EEC Council Regulation 508/99/CCE // Off. J. Eur. Commission, L60 of 9-3.1999.
47. Eisen H.N. Variations in affinities of antibodies during the immune response / Eisen H.N., Siskind G.W. // Biochemistry. 1964. - Vol. 3. - P. 996-1008.
48. ELISA and ELISPOT Products Handbook and Technical Guide // http://www.piercenet.com/files/ELISAHB 1601158ptl.pdf
49. ELISA Technical Bulletin No. 1 // http://www.corning.com/lifesciences/ technicalinformation/techdocs/elisal.pdf
50. ELISA Technical Bulletin No. 2 // http://www.corning.com/lifesciences/ technicalinformation/techdocs/elisa2.pdf
51. ELISA Technical Bulletin No. 5 // http://www.corning.com/lifesciences/ technicalinformation/techdocs/elisa5.pdf
52. Elliott C. Screening Methods / Elliott C. // School of Advanced Residue Analysis in Food. http://www. saraf-educ. org. 2003.
53. English J. The metabolism of dexamethasone in the rat effect of phenytoin / English J., Chakraborty J., Marks V. // J. Steroid Biochem. - 1975. - Vol. 6. -P. 65-68.
54. Engvall E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immuno-globulin G / Engvall E., Perlmann P.O. // Immunochemistry. -1971.-Vol. 8.-P. 871-875.
55. Enzyme-irnmunoassay / By ed Maggio E.T. Boca Raton, FL: CRC Press. -1980.-P. 105-34.
56. Erlanger B.F. The preparation of antigenic hapten-carrier conjugates: A survey / Erlanger B.F. // Methods Enzymol. 1980. - Vol. 70. - P. 85-104.
57. Erlanger B.F. Principles and methods for the preparation of drug protein conjugates for immunological studies / Erlanger B.F. // Pharmacol. Rev. 1973. -Vol. 25.-P. 271-280.
58. Euro-Diagnostica B.V. Corticosteroid EIA, The Netherland // 5081CORlp6.08.05
59. European Medicines Agency Veterinary Medicines and Inspections // http://www.emea.eu.int/pdfs/vet/mrls/087403en.pdf. London. - 2004.
60. Fanger M.W. The oligosaccharide units of rabbit immunoglobulin G. Asymmetric attachment of C2-oligosaccharide / Fanger M.W., Smyth D.G. // Bio-chem. J. 1972. - Vol. 127. - P. 767-774.
61. Fearon D.T. The CD 19/CR2/TAPA-1 complex of В lymphocytes: Linking natural to acquired immunity / Fearon D.T., Carter R.H. // Annu. Rev. Immunol. 1995.-Vol. 13.-P. 127-149.
62. Food and Agriculture organization of the United Nation. 2006. -www.fao.org/docrep/meeting/005/X0203E/x0203e0e.htm
63. Fuentes M. Optimization of the modification of carrier proteins with aminated haptens / Fuentes M., Palomo J. M., Mateo C., Venteo A., Sanz A., Fernandez-Lafuente R., Guisan J.M. // Journal of Immunological Methods. 2005. - Vol. 307. № 1-2.-P. 144-149.
64. Gaignage P. Dexamethasone bovine pharmacokinetics / Gaignage P., Lognay G., Bosson D., Vertongen D., Dreze P., Marlier M., Severin M. // Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokinet. 1991. - Vol. 16 № 3. - P. 219-221.
65. Goidl E.A. The effect of antigen dose and time after immunization on the amount and affinity of anti-hapten antibody / Goidl E.A., Paul W.E., Siskind G.W., Benacerraf B. // J. Immunol. 1968. - Vol. 100. - P. 371-375.
66. Goudie R.B. A simple method for producing antibody specific to a single selected diffusible antigen / Goudie R.B., Home C.H.W., Wilkinson P.C. // Lancet. 1966. - Vol. 2. - P. 1224-1226.
67. Great Plains Veterinary Educational Center // http://gpvec.unl.edu/files/feedlot/internettempfiles/ResidueInfo-MRL/MRLVetDrugsJpEuUSJune2006DG-Pnt.htm.
68. Greco D.S. Dexamethasone pharmacokinetics in clinically normal dogs during low- and high-dose dexamethasone suppression testing / Greco D.S., Brown S.A., Gauze J.J., Weise D.W., Buck J.M. // Am. J. Vet. Res. 1993. - Vol. 54. №4.-P. 580-585.
69. Grossman C.J. The regulation of the immune system by sex steroids / Grossman C.J. // Endocr. Rev. 1984. - Vol. 5. - P. 435-455.
70. Grossman C.J. Possible underlying mechanisms of sexual dimorphism in the immune response, fact and hypothesis / Grossman C.J. // J. Steroid. Biochem. -1989.-Vol. 34.-P. 241-251.
71. Haasnoot W. Residue Analysis in Food: Principles and Applications. Immunochemical and receptor technologies / Haasnoot W., Schilt R.; By ed. O'Keeffe M. Harwood Academic Publishers, The Netherlands, 1999. - P. 109-144.
72. Hanly W.C. Review of Polyclonal Antibody Production Procedures in Mammals and Poultry / Hanly W. C., Artwohl J.E., Bennett T.B. // ILAR Journal. -1995-Vol. 37. №3.
73. Hansen D.K. Pharmacokinetic considerations of dexamethasone-induced developmental toxicity in rats / Hansen D.K., LaBorde J.B., Wall K.S., Holson R.R., Young J.F. // Toxicological Sciences. 1999. - Vol. 48. - P. 230-239.
74. Harlow, E. Antibodies: A Laboratory Manual / Harlow E., Lane D. // Cold Spring Harbor, N.Y. 1988. - P. 215.
75. Herbert W.J. The mode of action of mineral-oil emulsion adjuvants on antibody production in mice / Herbert W.J. // Immunology. 1968. - Vol. 14. - P. 301-318.
76. Hirokawa K. Understanding the mechanism of the age-change of thymic function to promote T cell differentiation / Hirokawa K., Utsuyama M., Kasai M., Kurashima C., Ishimima S., Zeng Y-X. // Immunol. Lett. 1994. - Vol. 40. -P. 269-277.
77. Horbett T.A. Proteins at Interfaces: An overview, in Proteins at Interfaces II: Fundamentals and Applications (by ed. Horbettand T.A., Brash J.L.) / Horbett T.A., Brash J.L. // ACS Symposium Series, ACS Books, Washington, D.C. -1995.-P. 1-23.
78. Horbett T.A. The role of adsorbed adhesion proteins in cellural recognition of biomaterials / Horbett T.A. // BMES Bulletin. 1999. - Vol. 23 № 2. - P. 5-9.
79. Hu J-G. Studies on the optimal immunization schedule of the mouse as an experimental animal. The effect of antigen dose and adjuvant type / Ни J-G., Ide A., Yokoyama Т., Kitagawa T. // Chem. Pharm. Bull. 1989a. - Vol. 37. - P. 3042-3046.
80. Huetos O. Determination of dexamethasone in feed by TLC and HPLC / Hue-tos O., Ramos M., Martin de Pozuelo M., San Andres M., Reuvers M. // Analyst. 1999.-Vol. 124. №11. -P. 1583-1587.
81. Hum B.A.L. Production of reagent antibodies / Hum B.A.L., Chantler S.M. // Methods Enzymol. 1980. - Vol. 70. - P. 104-142.
82. Introduction of antibody Enzyme-Linked Immunosorbent assay // http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp
83. Janeway C.A.Jr. Immunobiology. / Janeway C.A.Jr., Travers P. New York: Garland Publishing Inc. - 1994. - IX. - P. 152.
84. Jones G.L. Peptide vaccines derived from a malarial surface antigen: Effects of dose and adjuvants on immunogenicity / Jones G.L., Spencer L., Lord R., Mol-lard R., Pye D. // Saul. Immunol. Lett. 1990.- Vol. 24. - P. 253-260.
85. Kenney J.S. Influence of adjuvants on the quantity, affinity, isotype and epitope specificity of murine antibodies / Kenney J.S., Hughes B.W., Masada M.P., Allison A.C.//J. Immunol. Methods- 1989.-Vol. 121.-P. 157-166.
86. Kundu N. Production of antisera against contraceptive steroids / Kundu N., Keenan S, Slaunwhite W.R. // Steroids. 1977. - Vol .30. - P. 85-96.
87. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Practice and theory of enzyme immunoassay / By eds. Burbon R.H., Knippenberg van P.H. Elsevier, Amsterdam. - 1985. - P. 1-549.
88. Leish Z. Studies on intravenously infused dexamethasone in sheep / Leish Z., Panaretto B. A. // Aust. J. biol. Sci. 1978. -Vol. 31. - P. 373-383.
89. Luo Y. Simultaneous analysis of twenty-one glucocorticoids in equine plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry / Luo Y., Uboho С. E., Soma L. R., Guan F. Y., Rudy J. A., Tsang D. S. // J. Agric. Food Chem. 2003. -Vol. 51.-P. 326-30.
90. Maletto B. Aging: The cellular immune response against autologous and foreign antigens is affected before the humoral response / Maletto, В., Pistoresi-Palencia M.C., Gruppi A. // Immunol. Lett. 1994. - Vol. 40. - P. 243-250.
91. Mallinson E. T. Determination of Dexamethasone in Liver and Muscle by Liquid Chromatography and Gas ChromatographyMass Spectrometry / Mallinson E. Т., Dreas J. S., Wilson R. Т., Henry A. C. // J. Agric. food Chem.1995.-Vol. 43.-P. 140-145.
92. Manne S. Kinetics of antigen-antibody reactions at solid-liquid interfaces / Manne S., Nygren H. // Journal of Immunological Methods 1988. - Vol. 113. -P. 3-15.
93. Maurer P.H. Protein and polypeptides as antigens / Maurer P.H., Callahan H.J. // Methods Enzymol. 1980. - Vol. 70. - P. 49-70.
94. Mayumi S. Correlation between plasma leptin concentration and body fat content in dogs / Mayumi S., Nakadomo F., Honjoh Т., Ishioka S., Saito M.// Am. J. Vet. Res. 2002. - Vol. 63. - P. 7-10.
95. MedecineNet // http://www.medicinenet.com/elisatests/article.htm
96. McCoy K.L. Tolerance defects in New Zealand Black and New Zealand Black and New Zealand White F1 mice / McCoy K.L., Kendrick L., Chused T.M. // J. Immunol. 1986.-Vol. 136.-P. 1217-1222.
97. Miller R.A. Aging and immune function: Cellular and biochemical analyses / Miller R.A. // Exp. Gerontology. 1992. - Vol. 29. - P. 21-25.
98. Mostl E. Measurement of glucocorticoid metabolite concentrations in faeces of domestic livestock / Mostl E., Messmann S., Bagu E., Robia C., Palme R. // Zentralbl Veterinarmed A. 1999. - Vol. 46. - P. 621-631.
99. Nisbet A.D. The complete amino-acid sequence of hen ovalbumin / Nisbet A.D., Saundry R.H., Moir A.J., Fothergill L.A., Fothergill J.E. // European Journal of Biochemistry. 1981 -Vol. 115.-P. 335-345.
100. Oka H. Chemical analysis for antibiotics used in agriculture / By eds. Oka H., Nakazawa H., Harada K-I., Macnel J.D. AOAC international, VA . - 1995. -P. 215.
101. O'Keeffe M.J. Supercritical fluid extraction of veterinary drug residues from meat / O'Keeffe M.J., O'Keeffe M. // The national food center. Research report No 19. Dublin. 1999 - ISBN I 841700762. - P. 18.
102. Official Jornal of the European Communites L221, 8-36, Commission Decision (2002/657/EC) of 12 August 2002. Brussels, Belgium, 2002.
103. Paganelli R. Humoral immunity in aging /Paganelli, R., Scala E., Quinti I., Ansotegui I.J. // Aging Clin. Exp. Res. 1994. Vol.6. - P. 143-150.
104. Pagano G. An in vivo and in vitro study of the mechanism of prednisone-induced insulin resistance in healthy subjects / Pagano G., Cavallo-Perin P., Cassader M., et al. // J Clin Invest. 1983. - Vol. 72. - P. 1814-1820.
105. Peets E.A. Plasma binding of betamethasone-3H, dexamethasone-3H, and Cortisol-14C a comparative study / Peets E.A., Stam M., Symcowicz C. // Bio-chem. Pharmacol. - 1969.-Vol. 18.-P. 1655-1663.
106. Passingham B. Application of high-performance liquid chromatography to the measurement of Cortisol secretion rate / Passingham B. J.,Barton R. // Journal of Chromatography: Biomedical Applications. 1987. - Vol. 416. - P. 25-35.
107. Pham-Huu-Trung M.T. A direct determination of plasma aldosterone / Pham-Huu-Trung M.T., Corvol P. // Steroids. 1974. - Vol. 24. - P.587-598.
108. Philippe J. Cyclic adenosine monophosphate prevents the glucocorticoid-mediated inhibition of insulin gene expression in rodent islet cells / Philippe J., Giordano E., Gjinovci A., Meda P. // J. Clin. Invest. 1992. - Vol. 90. - P. 2228-2233.
109. Ramos M. Determination of dimetridazole residues in bovine tissue by liquid chromatography / Ramos M., Aranda A., Reuvers Th., Jimenez R. // Analytica Chimica Acta. 1993. - Vol. 275. - P. 317-321.
110. Reding J. Dexamethasone and flumethasone residues in milk of intramuscularly dosed cows / Reding J., Sahin A., Schlatter J., Naegeli H. // J. Vet. Pharmacol. Ther. 1997. - Vol. 20(3). - P. 198-203.
111. Report for 2004 on the results of residue monitoring in food of animal origin in the Member States // European Commission Health And Consumer Protection
112. Derictorate-General, Annex I (SANCO/3400/2005). http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/residues/workdoc2004en.pdf. -2004.
113. Report for 2005 on the results of residue monitoring in food of animal origin in the Member States // European Commission Health And Consumer Protection Derictorate-General, Annex I (SANCO/3635/2006. http://ec.europa.eu/)
114. Rice M.J. The metabolism of dexamethasone in the rat / Rice M.J. Tredger J.M., Chakraborty J., Parke D.V. // Biochem. Soc. Transact., 53rd Meeting, Bristol. 1974.-Vol. 2.-P. 107-109.
115. Rubenstein K.E. Homogeneous enzyme immunoassay. A new immunochemical technique / Rubenstein K.E., Schneider R.S., Ullman E.F. // Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 1972. - Vol. 47. - P. 846-51.
116. Schnibbe T. Effectiveness of Different Common Carriers for the Immuno-genicity of Synthetic Peptides. 2000. - http://www.diss.fu-berlin.de/2000/148/indexe.html
117. Scippo M.L. Primary Extraction Technologies in : Residue analysis in Food -Principles and Applications / Scippo M.L., Maghuin-Rogister G.; by ed. O'Keefe M. Harwood Academic Publishers, Amsterdam. - 2000.
118. Scippo M.L. Detection of illegal growth promoters in biological samples using receptor binding assays / Scippo M.L., Weerdt C.V.D., Willemsen P., Francois
119. J.-M., Rentier-Delrue F., Muller M., Martial J.A., Maghuin-Rogister G. // Analytica Chimica Acta. 2002. - Vol. 473. № 1. - P. 135-141.
120. Sela M. Studies on the chemical basis of the antigenicity of proteins. 1. Antigenicity of polypeptidyl gelatins / Sela M., Arnon R. // Biochem J. 1960. -Vol. 75.-P. 91-102.
121. Seuter E. Metabolism of systematically given corticosteroids / Seuter E. // Dermatologica. 1975-Vol. 151.-P. 129-134.
122. Singh H. In vitro and in vivo genotoxicity evaluation of hormonal drugs. II. Dexamethasone / Singh H., Singh J.R., Dhillon V.S., Bali D., Paul H. // Mutat Res. 1994. - Vol. 308. - P. 89-97.
123. Siskind, G.W. Studies on the control of antibody synthesis: II. Effect of antigen dose and of suppression by passive antibody on the affinity of antibody synthesized / Siskind, G.W., Dunn P., and Walker J.G. // J. Exp. Med. 1968. -Vol. 127.-P. 55-66.
124. Snapper C.M. Fundamental Immunology. Immunoglobulin class switching / Snapper, C.M., Finkelman F.D.; dy ed. Paul W.E. New York: Raven Press., 1993.-P. 837-863.
125. Strategies in Vaccine Design. The generation and maintenance of antibody and В cell memory: The role of retained antigen and follicular dendritic cells / by ed.Ada G.L. Austin Burton Tex.: R.G. Landes Company, 1994. - P. 35-49.
126. Stills, H.F. The Biology of the Laboratory Rabbit. Polyclonal antibody production / Stills, H.F. // By eds. Manning P.J., Ringler D.H., Newcomer C.E. San Diego: Academic Press., 1994. - P. 435-448.
127. Stills, H.F. The use of Freund's complete adjuvant / Stills, H.F., Bailey M.Q. // Lab. Anim. (US) -1991. Vol. 20. - P. 25-30.
128. Stolker A. A.M. Analysis of corticosteroids / Stolker A. A.M., Schwillens P.L., Ginkel L.A., Brinkman U.A.T. // J. Chromotogr. A. 2000. - Vol. 893 №1. - P. 55-67.
129. Surface Characterization of Biomaterials, Book Review / by ed. Ratner B. D. -Elsevier Science Publishers, 1988.-P. 124.
130. Tarantola M. Effects of low doses of dexamethasone on productive traits and meat quality of veal calves / Tarantola M., Schiavone A., Preziuso G., Russo C., Biolatti В., Bergero D. // Animal Science. 2004. - Vol. 79. - P. 93-98.
131. Tecna S.r.l. Kit ELISA per corticosteroidi, Italy // Cat N FA679.
132. The Europen Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Veterinary Medicines Evaluation Unit, Commettee for Veterinary Medicinal Products, Approach Towards Harmonization of Withdrawal Periods EMEA/CVMP/36/95.
133. The Extra Pharmacopoeia / By ed. Reyonolds J.E.F. Martindale: The Pharmaceutical Press, London, 1989. - P. 1895.
134. The Japan Food Chemical Research Foundation http://www.m5.ws001 .squarestart.ne.jp/foundation/search.html
135. Touma C. Measuring Fecal Glucocorticoid Metabolites in Mammals and Birds: The Importance of Validation Ann / Touma C., Palme R. // N.Y. Acad. Sci. -2005.-Vol. 1046.-P. 54-74.
136. Toutain P.L. Dexamethasone in cattle: pharmacokinetics and action on the adrenal gland / Toutain P.L., Brandon R.A., Alvinerie M., Garcia-Villar R., Ruckebusch Y // J. Vet. Pharmacol. Ther. 1982. - Vol. 5. - P. 33-43.
137. Toutain P.L. Pharmacokinetics of dexamethasone and its effect on adrenal gland function in the dog / Toutain P.L., Alvinerie M., Ruckebusch Y. // Am. J. Vet. Res. 1983. - Vol. 44. - P. 212-217.
138. Toutain P.L. Dexamethasone and prednisolone in the horse: pharmacokinetics and action on the adrenal gland / Toutain P.L., Brandon R.A., de Pomyers H., Alvinerie M., Baggot J.D. // Am. J. Vet. Res. 1984. - Vol.45. - P. 1750-1756.
139. Tsuei S.E. Disposition of synthetic glucocorticoids I. Pharmacokinetics of dexamethasone in healthy adults / Tsuei S.E., Moore R. G., Ashley J. J., McBride W.G. // Journal of Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 1979. -Vol. 7№3.
140. U.S. Government Printing Office // http://www.access.gpo.gov/nara/cfr/waisidx06/21cfr55606.html.
141. Vaccine Biotechnology / By eds. Bittle J.L., Murphy F.L. New York: Academic Press. - 1999.-P. 151.
142. Van den Hauwe 0. Simultaneous determination of betamethasone and dexamethasone residues in bovine liver by liquid chromatography/tandem mass spectrometry / Van den Hauwe 0., Castro Perez J., Claereboudt J., Van Peteghem C.
143. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2002. -Vol. 15. - P. 857 -861.
144. Varma D.R. Anti-inflammatory and ulcerogenic effects and pharmacokinetics of dexamethasone in protein-deficient rats / Varma D.R., Mulay S. // J. Phar-maco. Exp. Ther. 1980. - Vol. 214. - P. 197-202.
145. Vranic M.L. Estimation the withdrawl period for veterinary drugs used in food producing animals / Vranic M.L., Marangunich L., Fernandez Courel H., Fernandez Saurez A. // Analytica Chimica Acta. 2003. - Vol. 483. - P. 251-257.
146. Walker B.E. Induction of cleft palate in rabbits by several glucocorticoids / Walker B.E. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1967. - Vol. 125. - P. 1281-1284.
147. Walker B.E. Induction of cleft palate in rats with anti-inflammatory drugs / Walker B.E. // Teratology. 1971. - Vol. 4. - P. 39-42.
148. Warr G.W. IgY: Clues to the origins of modern antibodies / Warr G.W., Mator K.E., Higgins D.A. // Immunol. Today. 1995. - Vol. 16. - P. 392-398.
149. Warren, H.S. Future prospects for vaccine adjuvants / Warren, H.S., Chedid L.A. // CRC Critical Reviews Immunol. 1988. - Vol. 8. - P. 83-101.
150. Weller Т.Н. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster, propagated in vitro / Weller Т.Н., Coons A.H. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954. - Vol. 86. - P. 789-794.
151. Wikipedia on-line encyclopedia//http://146.107.217.178/lab/alogps/start.html.
152. Wikipedia on-line encyclopedia // http://en.wikipedia.org/wiki/Corticosteroids.
153. Wikipedia on-line encyclopedia // http://ibmlc2.chem.uga.edu/sparc/
154. Wikipedia on-line encyclopedia // http://en.wikipedia.org/wiki/ELISA.
155. Wikipedia on-line encyclopedia // http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/
156. Wikipedia on-line encyclopedia // http://en.wikipedia.org/wiki/Liquid-liquidextraction.
157. Wikipedia on-line encyclopedia // http://en.wikipedia.org/wiki/Polarsurfacearea.
158. Wikipedia on-line encyclopedia // http://en.wikipedia.org/wiki/Steroid.
159. Wisdom G.B. Peptide Antigens / Wisdom G.B. // Oxford University Press, Oxford.- 1995.
160. Woodard, L.F. Bacterial Vaccines. Surface chemistry and classification of vaccine adjuvants and vehicles / Woodard, L.F.; by ed. A. Mizrahi. New York: Alan R. Liss., 1990. - P. 286-306.
-
Вылегжанина, Александра Владимировна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.23
- Разработка и применение экспериментальных и промышленных иммуноферментных тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций
- Совершенствование методов диагностики инфекционного бронхита кур
- Использование метода гомологичного иммуноферментного анализа для изучения и количественного определения олигомерных форм цитокинов
- Разработка и сравнительное изучение различных вариантов иммуноферментного анализа для детекции антигенов вируса гриппа типа А
- Изучение токсинопродуцирующей способности штаммов Vibrio cholerae 01 и Vibrio cholerae 0139 с помощью иммуноферментного анализа и культуры клеток
