Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции для мониторинга вируса гриппа А

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции для мониторинга вируса гриппа А"

КИРЕЕВ ДМИТРИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ МОНИТОРИНГА ВИРУСА ГРИППА А

03.00.03. - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва, 2007

003066840

Работа выполнена в НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Забережный Алексей Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Иванова Валерия Тимофеевна кандидат биологических наук Шмаров Максим Михайлович

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет Прикладной Биотехнологии

Защита состоится « 2007 г

на заседании диссертационного Совета Д 001 020 01 при ГУ НИИ вирусологии им Ивановского РАМН (адрес 123098, Москва, ул Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Вирусы гриппа А распространены по всему миру, заражают многие виды диких и домашних птиц, большое количество различных видов млекопитающих и человека Вирусам гриппа А свойственна чрезвычайно высокая изменчивость вследствие особенностей генома Это позволяет им вызывать сезонные эпидемии среди людей, вспышки с высоким процентом смертности среди животных и птиц и регулярно являться причиной пандемий [WHO/CDS/2005 29]

Вирусы гриппа А согласно номенклатуре представлены сочетаниями 16 подтипов гемагтлютинина (НА) и 9 подтипов нейраминидазы (NA) [Fouchier et al, 2005]

Естественным резервуаром вирусов гриппа А считаются птицы водного и околоводного комплексов От птиц изолированы вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков. НА и NA Среди людей обычно циркулируют вирусы, имеющие подтипы гемагглютинина (Н1-НЗ) и нейраминидазы (N1, N2) В последние годы отмечены случаи заражения людей вирусами гриппа А других подтипов (H5N1, H7N3, H7N7, H9N2)

В настоящее время существует серьезная угроза возникновения новой пандемии среди людей, которая может быть вызвана вирусом гриппа А/Н5 По данным ВОЗ на 12 января 2007 года, с 2003 года в мире зарегистрировано 265 случаев заболевания людей из которых 159 человек умерли, вызванных вирусом гриппа птиц A/H5N1 В результате панзоотии, обусловленных этим вирусом, только в 2004 году были уничтожены 150 миллионов домашних птиц В настоящее время высокопатогенный вирус А/Н5 обнаруживается в странах Европы, Ближнего Востока, Кавказского региона [WHO, 12 January 2007]

Необходимость мониторинга вируса гриппа А у птиц, человека и животных чрезвычайно велика Вирусологические методы обнаружения вируса гриппа А (пассирование на куриных эмбрионах или на культуре клеток с последующей идентификацией в реакции гемагтлютинации или реакции торможения гемагглютинации) надежны и чувствительны, однако они довольно трудоемки и на их выполнение требуется от 1 до 2 недель

За последнее десятилетие широкое распространение получили молекулярные методы диагностики гриппа А Наиболее известные и эффективные - это методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) Их принцип основан на многократном умножении участка генома инфекционного агента с последующей его идентификацией Время анализа инфекционного материала такими методами снижается до одного дня, их чувствительность не уступает чувствительности традиционных методов [Quihvan et al, 2000] В рекомендациях Всемирной Организации Здравоохранения о диагностике

гриппа А метод полимеразной цепной реакции приравнен к традиционным методам и рекомендован для использования

В настоящее время уже имеются публикации, посвященные разработке праймеров для обнаружения вирусов гриппа на основе метода полимеразной цепной реакции. Однако вариабельность генома вируса гриппа вызывает серьезные проблемы при диагностике и иногда является причиной появления ложно отрицательных результатов В связи с этим для нас важной задачей явилось создание чувствительных тестов, позволяющий выявлять все вирусы гриппа, относящиеся к типу А, а также выявлять и дифференцировать вирусы подтипов Н5 и Н7, как наиболее значимые Цель и задачи исследования.

Целью работы являлась разработка на основе полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени диагностических наборов для выявления и идентификации вирусов гриппа А и апробация их с образцами, полученными от различных видов птиц, животных и человека Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи

1 Разработать детекционную систему ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена нуклеопротеина

2 Разработать детекционную систему ОТ-ПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина

3 Разработать систему ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 с режимом получения результатов в реальном времени

4 Сравнить чувствительность разработанных детекционных систем с традиционными методами обнаружения вируса гриппа и провести их тестирование с использованием эталонных штаммов вируса гриппа А и полевых образцов от птиц

5 С помощью разработанных тест-систем выявить распространение вирусов гриппа А на территории Российской Федерации в период с 2003 по 2006 гг

Научная новизна и практическая значимость.

1 Разработана и внедрена в практику детекционная система на основе "гнездовой" ПЦР (ТУ 9388-004-42418073-05 от 06 декабря 2005 г), позволяющая обнаруживать вирусы гриппа А любого подтипа и дифференцировать их от вирусов гриппа В и С, а также других патогенов

2 Разработана и внедрена в практику детекционная система на основе множественной дифференцирующей "гнездовой" ПЦР, позволяющая обнаруживать вирусы гриппа А подтипов Н5 и Н7 (ТУ 9388-002-4241807305 от 06 декабря 2005 г).

3 Разработана и внедрена в практику детекционная система на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая обнаруживать вирусы гриппа А подтипа Н5 (ТУ 9388-003-42418073-05 от 06 декабря 2005 г)

4 Показано успешное использование разработанных тест-систем для быстрого обнаружения вирусов гриппа А как в культуральном материале, так и в полевых образцах от птиц

5 Выявлено распространение вируса гриппа А на территории Российской Федерации и определена значимость вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н7 в период с 2003 по 2006 гг

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Разработанный тест на основе "гнездовой" ПЦР позволяет выявлять вирусы гриппа А как в культуральном материале, так и в полевых образцах от птиц

2 Разработанный тест на основе "гнездовой" ПЦР позволяет выявлять и типировать вирусы гриппа А подтипов Н5 и Н7

3 Разработанный тест на основе ПЦР в реальном времени позволяет выявлять вирусы гриппа А подтипа Н5, сокращено время анализа по сравнению с "гнездовой" ПЦР при сохранении необходимой чувствительности для детекции вирусов в образцах от клинически больных птиц

4 Чувствительность разработанных тестов на основе ПЦР соответствует чувствительности методов изоляции вирусов гриппа, возможность применения разработанных тестов для выявления вирусов гриппа А в полевых образцах от диких и домашних птиц

5 Возможность использования детекционных систем на основе "гнездовой" ПЦР для мониторинга вируса гриппа А с определением доли вирусов гриппа подтипов Н5 и Н7

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной биологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН 21 июня 2007 г Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 4 тезисов Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного тескта Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 119 источников Работа содержит 10 таблиц и 12 рисунков

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве исследуемого материала были использованы эталонные штаммы вируса гриппа А, любезно предоставленные руководителем лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН, академиком РАМН, проф НВ Кавериным, и штаммы вируса гриппа В, любезно предоставленные ведущим научным сотрудником лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа НИИ вирусологии им

Д И Ивановского РАМН, доктором биологических наук В Т Ивановой Штаммы, использованные в данной работе, перечислены в таблице 1

Таблица 1

Характеристика эталонных штаммов вируса гриппа А и В, _использованных в данной работе__1

Вирусы гриппа типа А

№ Штамм Подтип

1 A/WSN/33 H1N1

2 A/USSR/90/77 H1N1

3 A/Puerto Rico/8/34 H1N1

4 A/Brazil/11/78 H1N1

5 A/Pmtail Duck/Pnmone/695/76 H2N3

6 A/Laughmg gull/New Jersey/75/85 H2N9

7 A/Victona/3/75 H3N2

8 A/England/42/72 H3N2

9 A/Udorn/307/72 H3N2

10 A/duck/Ukrame/1/63 H3N8

11 A/Duck/Czechoslovakia/56 H4N6

12 A/Mallard/Pensylvanxa/l 0218/84 H5N2

13 A/RuddyTurnstone/DE/244/91 H5N2

14 А/Duck/ Ho Chi Minh/14/78 H5N3

15 A/FPV/Rostock/34 H7N1

16 A/FPV/Weybndge/34 H7N7

17 A/Swine/Hong Kong/9/98 H9N2

18 A/Chicken/Germany/49 H10N7

19 A/Pilot whale/Mame/328/84 H13N2

Вирусы гриппа типа В

20 В/Виктория/2/87

21 В/Москва/1/04

22 В/Москва/8/06

23 В/Гонконг/330/01

24 В/Шанхай/3 61/02

Исследованные в работе полевые образцы от птиц были собраны в Новосибирской, Астраханской, Иркутской, Волгоградской областях, республиках Калмыкия, Бурятия, Тыва, Приморском крае и Еврейской административной области с конца 2003 по 2006 гг. (табл. 2).

Таблица 2

География и место сбора полевых образцов_

Дата Место сбора полевого материала Количество образцов

04-10.10 2003 Новосибирская область 62

31 07-18.08 2004 Астраханская область 249

17-30 09.2004 Приморский край 180

28 07 05 Новосибирская область 76

Í1-22 08 2005 Еврейская АО 223

02 09 2005 Республика Калмыкия 64

15-2009 2005 Иркутская область 81

22 10-13 11 2005 Приморский край 206

02 11 2005 Республика Бурятия 25

25-26 11 2005 Астраханская область 10

18-21 03 2006 Республика Калмыкия 55

29-31 03 2006 Астраханская область 29

17 04 2006 Волгоградская область 15

24 06 2006 Республика Тыва 20

30 06 2006 Республика Калмыкия 50

01-02 07 2006 Республика Калмыкия 64

08 07 2006 Республика Калмыкия 20

08 2006 Еврейская АО 75

ИТОГО 1504

Полевые образцы от птиц представляли собой клоакальные и трахеальные смывы и 10%-ные суспензии внутренних органов (мозг, печень, селезенка) Клоакальные и трахеальные смывы экстрагировались в растворе гуанидин тиоцианата и замораживались в жидком азоте

Нуклеотидные последовательности генов гемагглютинина и нуклеопротеина были получены из банков данных GenBank (www nebí nlm mh gov) и ISD (Influenza Sequence Database, www flu lanl gov) Анализ последовательностей производился с помощью программ AssemblyLign, Oligo 4 0-s, Amplify 1 0 (Accelrys Inc, США), BioEdit 7 0 1 [Hall Т А, 1999]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка детекционной системы ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А на основе "гнездовой" ПЦР

Наши исследования по разработке теста для обнаружения вируса гриппа А включали следующие этапы

1 Подбор специфических праймеров для амплификации РНК вируса гриппа А

2 Выбор оптимальных условий проведения ПЦР и оценка специфичности теста

3 Определение чувствительности разрабатываемой тест-системы

4 Конструирование рекомбинантного положительного контроля Для подбора олигонуьслеотидов, специфических гену NP вирусов

гриппа А, были использованы нуклеотидные последовательности различных подтипов вирусов, размещенные в банке данных www flu lanl gov Ген белка NP является типоспецифичным [Fauquet С М et al, 2005], и праймеры, специфичные данному гену, позволяют обнаруживать вирусы гриппа А любого происхождения, дискриминируя вирусы гриппа типов В и С

Всего было использовано около пятисот последовательностей гена NP вирусов гриппа А, относящихся ко всем 16 подтипам по гену гемагглютинина Анализировались по 50 последовательностей вирусов гриппа с гемагглютининами HI, Н2, НЗ, Н5, Н7, Н9 Среди вирусов гриппа с гемагглютининами Н4, Н6, анализировались по 30 последовательностей для каждого подтипа У вирусов гриппа А с гемагглютининами Н8, Н11-Н16 для анализа были использованы все доступные последовательности гена NP Данные вирусы гриппа были выделены от человека, диких и домашних птиц, свиней, лошадей, тюленей, китов, норок, леопардов Диапазон времени изоляции штаммов вирусов гриппа А, последовательности которых были взяты для анализа, был максимально широким от 1918 до 2005 года

Далее были созданы "консенеусные" последовательности для каждого подтипа Затем был проведен сравнительный компьютерный анализ полученных последовательностей между собой При анализе полученных данных были выбраны наиболее консерватиные участки гена NP К ним были подобраны специфические олигонуклеотиды для проведения "гнездовой" ПЦР (рис 1 и 2)

Для оценки специфичности были использованы эталонные штаммы вируса гриппа А, а также ряд штаммов вируса гриппа В (табл 1)

Н а -|[7: " I)

1с «лч.

МаУ- -¿(иг

: ю й - а* ■;'

Л

фм!Ж т

Сопэепэиэ Н1

Сопзепзиа Н2

Сопзепзиз КЗ

Сопаапэиа Н1

Сопзепэиз Н5

Сопзепзиа Кб

Н7

Сопзепзиз1 не

Сопэвйяиа Н5>

Сопзепзиз НЮ

Сопзепзиз Н11

Сопзепзиз Н12

Сепаепаиа Н13

Сопэепзиз Н14

Сопзепзиз М15

Сопзепзиз Н16

область гибридизации

пряного пранмера для первой внплнфикацни

область гибридизации

пряного праймера для второй лмпянернкацин

Рис. 1. Области гибридизации прямых праймеров при амплификации гена \Р.

На рисунке изображены выровненные между собой "консенсусные" последовательности гена нуклеопротеина 16 различных подтипов. Серыми полупрозрачными прямоугольниками обозначены области гибридизации прямых праймеров при амплификации гена N Р.

о

а а г*-"-

тл^ЗшТ&лГЗ € I в X I %

српэег.зиз Сопэег-аия Сопзепзиз Сопзепзиз Сопзепзиз Сопзепзиз Сопаапаиз Сопзепзиз Сапзвпзиэ Сопзепзиз Сопзепэиз Сопзепзиз Сопаепзив Сопзепзиз сопявпвио Содэепэиэ

область гибридизации

обратного п рай мер а ляп второй амплификации

____

область гибридизации обратного пранмера для первой амплификации

Рис. 2. Области гибридизации обратных праймеров при амплификации гена ]\Р.

На рисунке изображены выровненные между собой "консенсусные" последовательности гена нуклеопротеина 16 различных подтипов. Серыми полупрозрачными прямоугольниками обозначены области гибридизации обратных праймеров при амплификации гена ЫР

Во всех образцах, содержащих вирус гриппа А, при проведении электрофореза были обнаружены специфические фрагменты, что соответствовало положительному результату. Все образцы, содержащие вирусы гриппа В, были отрицательны. Ну клеотидные последовательности разработанных праймеров были также проверены с помощью программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.njm.nih.gov/BI.AST/). П рай меры оказались специфичными только последовательностям гена ну клео протеи на различных штаммов вируса гриппа А.

Рис. 3. Чувствительность тест-системы на основе "гнездовой" ПЦР для обнаружения вируса гриппа Л.

Треки М — маркер молекулярного веса. Верхний ряд. Треки 1-16 -результаты анализа образцов, содержащих пятикратные разведения препарата вируса А/Ма11аг<1/Рсп5у1уата/10218/84(Н5Ы2). Нижний ряд. Треки 1-16 - результаты анализа образцов, содержащих пятикратные разведения препарата вируса А/РРУ/Яоз1оск/34(Н7Ы1).

Далее определялась чувствительность разработанного теста с использованием эталонных штаммов вируса гриппа А А/Ма11ага/Решу1уаша/10218/84(Н5№) и АЛ^/Яо81®сШ4(Н7№) После культивирования вирусов в 10-дневных куриных эмбрионах, была определена их активность в реакции гемагглютинации Вирусный титр вычислялся при помощи усовершенствованного метода Рида и Менча Р?оис1иег К. А. М е! а1, 2000] Титр вируса гриппа А/Ма11аг<1/Решу1уап1а/10218/84(Н5№) оказался равен 108 ЭИД50/мл, а вируса гриппа А/РРУЛ1о81оск/34(Н7Н 1) - 107 ЭИДзо/мл Затем были приготовлены пятикратные разведения препаратов вирусов в физиологическом растворе Для выделения РНК было использовано 200 мкл каждого разведения Пределом чувствительности теста считалось последнее разведение препарата вируса, в котором после проведения ПЦР при поставке электрофореза обнаруживался специфический фрагмент ДНК Пределом чувствительности тест-системы для обнаружения вируса гриппа А на основе метода "гнездовой" ПЦР оказалось 102 ЭИД5о/мл для обоих использованных вирусов (рис 3).

Как показали дальнейшие результаты, полученные при анализе полевых образцов от птиц, такая чувствительность соответствует чувствительности вирусологических методов

2. Разработка детекционной системы ОТ-ПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 на основе "гнездовой" ПЦР

Для подбора олигонуклеотидов, специфических гену НА вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н7, были использованы нуклеотидные последовательности различных подтипов вирусов, размещенные в банке данных \vw\v Аи 1ап1 §оу Всего было использовано около 1400 последовательностей гена НА вирусов гриппа А, относящихся ко всем 16 подтипам по гену гемагглютинина Анализировались по 500 последовательностей вирусов гриппа с гемагглютинином Н1, по 250 последовательностей - НЗ и Н5, по 100 последовательностей - Н6, Н7, Н9 и по 50 последовательностей - Н2 и Н4 Также для анализа было использовано около 50 последовательностей вирусов гриппа А с гемагглютининами, относящимися к подтипам Н8, Н10-Н16

Затем для каждого подтипа были созданы "консенсусные" последовательности Далее был проведен сравнительный компьютерный анализ этих последовательностей между собой После этого осуществляли поиск участков гена НА, где последовательности подтипов Н5 и Н7 были достаточно консервативны для создания специфических олигонуклеотидов и одновременно были отличны от последовательностей других подтипов Такие последовательности были найдены (рис 4)

различных подтипов. Серыми полу л розрачными прямоугольниками обозначены области гибридизации прямого и обратного праймеров при первой амплификации гена IIА подтипов 115 и

Н7. Синими полупрозрачными прямоугольниками обозначены области гибридизации праймеров при амплификации

гепа НА подтипа Н7, красными при амплификации гена НЛ подтипа Н5.

Рис. 4. Области гибридизации праймеров при амплификации гена НЛ подтипов Н5 и Н7.

На рисунке изображены выровненные между собой "конеенсусные" последовательности гена

гемагтлютииииа 16

С целью повышения специфичности и удобства для проведения первого раунда ПЦР была разработана одна пара праймеров, с помощью которой успешно амплифицнровались фрагменты гена НА подтипов Н5 и Н7. Для проведения второго раунда ПЦР были разработаны две различные пары праймеров, где одна пара была специфична вирусам подтипа Н55 а вторая - вирусам подтипа Н7. Вследствие большой вариабельности вирусов внутри подтипа Н7 один из праймеров для второй амплификации имел вырожденную последовательность.

Рис, 5. Чувствительность тест-системы на основе "гнездовой" ПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7.

Треки M — маркер молекулярного веса. Верхний ряд. Треки 1-16 — результаты анализа образцов, содержащих пятикратные разведения препарата вируса A/Mallard/Pensylvama/10218/84(H5N2), с праймерами для обнаружения РНК вируса гриппа А/Н5. Нижний ряд. Треки 1-16 -результаты анализа образцов, содержащих пятикратные разведения препарата вируса A/PPV/Rostock/34(H7N 1), с праймерами для обнаружения РНК вируса гриппа А/Н7.

Специфичность разработанных праймеров была проверена с помощью панели, содержащей эталонные штаммы вирусов гриппа А и В

(табл 1), а также с помощью программы BLAST В обоих случаях праймеры оказались достаточно специфичными

Затем была определена чувствительность разработанного теста Были использованы эталонные штаммы вируса гриппа А A/Mallard/Pensylvania/10218/84(H5N2) и A/FPV/Rostock/34(H7Nl) Пределом чувствительности тест-системы при обнаружении вируса гриппа А подтипа Н5 оказался титр вируса 101,5 ЭИД5о/мл, а при обнаружении вируса гриппа А подтипа Н7 - 102 ЭИД5о/Мл (рис 5)

Чувствительность теста для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 оказалась выше чувствительности тестов для обнаружения вируса гриппа А и вируса гриппа А подтипа Н7 Вероятно это связано с тем, что последовательности праймеров для последних содержали вырожденные нуклеотиды

3. Разработка детекционной системы ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 с режимом получения результатов в реальном

времени

В настоящем исследовании был разработан тест на основе ПЦР в реальном времени для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5.

Для подбора олигонуклеотидов, специфических гену НА вирусов гриппа А подтипа Н5, были использованы те же нуклеотидные последовательности вирусов различных подтипов, размещенные в банке данных ISD, что и для разработки тест-сиетемы для обнаружения и дифференциации вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н7 (рис 6)

Для определения специфичности разработанных праймеров и зонда были использованы вирусы гриппа типов А и В, указанные в табл 1 По результатам исследования только образцы, содержащие вирусы гриппа А подтипа Н5, оказались положительны, остальные были отрицательными

Затем была определена чувствительность разработанного теста Для этого использовался эталонный штамм вируса гриппа А A/Mallard/Pensylvama/10218/84(H5N2). Определение инфекционного титра препарата вируса и его разведение описано выше. Пределом чувствительности разработанного теста оказался титр вируса 103 ЭИД50/Мл (рис 7)

В дальнейшем, результаты, полученные при анализе полевых образцов от птиц, показали что возможности тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 методом ПЦР в реальном времени ограничены в случае отсутствия симптомов болезни у птицы Однако ее применение возможно при анализе образцов, собранных во время вспышек болезни, вызванных высокопатогенным вирусом гриппа А/Н5

NGAVD

NCCAAMA]

ТСССАВч

т sat ntjj itgatatti

ЮТВТАААСТА!

IagMattaaac! UgIaatcaay! UgIaagactaI Lagcaaattdi Ip.g1aatgcaa| ¡ggItaaacta: UtIaagacta: rgmtcttytgS

sttbc a attcc igagg gcagp. A AATAC a gagca acaga

actga]

ccag-3j

acagaI

RCAP.d

Uagcaaaatc: IrtBaaarttpJ UGIcatcaac] UGICTTACAM rtiacarttg!

GATAATt RCARGfll

angdgndtnI atgggggtt gtcaggaI ycaf.gga] atgggMH

CTTGGTGTG] cagcggn1 AACACCACT

gaaggaactI

ttcgggsl

icagnt

Ictctt

catya

Itattt

gstagggctgafcatt caajgggtc

Itctdgccattgcaatg G"i"|tGTVT

iaatcctga btgct sagstttaa

tgcaatggggtmtgct c'' -icttgt

tctrgccgytgmyatg GVi -itettt

ggcagcactcaIcatg gg (catgt GCTCAT6A li ATTB>R!GGT" ГСА RGTAGGACTCAMaCTYK "• íyatha cgtggcactgaJtytgBgat|tgttc t с ТАвССАТТ go TATGBsT cItATTT ggtaggwc tca>act yicat|t а гам

cabaGATG gatac t ggtttagct

саяла 'tc tagca t acagtacag

саяаагсс cacca t attcgactg

IyaIaSaca catwc t ggtttagct

ItaIaatac gtcaa t acagctgca

тлЯаа гтс gagca с acagcagtg

cabagtat rtc ra w acagytgca

c-aBggaca аатсс g ggatttctt

Icabagatg gat ac a ggtttagct к 'ag i . l'.'ayjgt с p-jtbayagc tgca

|стсатсгсттсште gv

¡ggmatca.tgct tg гс

laagcag tc tg ¡it

ctcaagcttag tc ac

[aagyag tr tg rm [catgtcatgct tg ct ¡ggcatcatgtg aa so

[aagcag геЩтсщкм

GATGGGt TRGTGGI GACAATGT]

1740 1750

2HCflGАгTNBggcgaMC atccItgccaIt agahtggatccIn

1730

TAGCp

CACCA CATWC GTCAA GAGCA RTCRA

SGGAATG?

AATTCTAC

gayaaygtt

• I " 1760

ANTCAACTG ATGCTACAi GGATTTCCT 'TCCT ■CAG ATAGTACGG A' GGTTTAGCT CAGTACAi ATTCGACTi GGTTTAGCT ACAGCTGCA ACAGCAGTG ACAGYTGCA GGATTTCTI GGTTTAGCT

1770 1780

|CAGTTCANV№ OGTT O Yi

icatatcatgc' catatcatgc

IGAGTTC С

.gcagtgtbi ¡ggcatcatgt'

iggccagpctttgctlggcaatcctga

1800

'I""!"

1790 |ncínttd«tctcc< tcac§ggcaatcatg. tgtgttgtt gt tgc ac та' ¡ci

it agggctg. |t с tdgccattgc aat'

LBIO

U g, |Ccuer Mew

Mo<Je| Select/Side Tj

rf I К I и •(

16 total sequences

Cons HI aa

Cons H2 ar

Cons из ga

Cons H4

Cons h5 ;4

Cons H6

Cons h7 gr

Cons H8 ag

Cons h9

cons H10

Cons hll ga

Cons h12 ga

cons h13 ga

Cons hi 4 ga

Cons hi 5 gp

Cons h16 ga

shade (NeshofcJ 81'/. rJ-тЧ

- и

Sequence Hast N one NixnbefinQ Mast None

selection 0

Pcsil'Mi

ruto a!

- Sciol -LJ_I

T speed slow ц, fail

I

1700 1710

^lliff«*

MI в f

1650

167 0

1680

1.6 90

1720

gndngaatcaa gagc arca ggaa g ac

1 о о J

TCAA raacgadaacc g ag

agaa gag a ggga atctg Г TC

\GATTCTAGTG Г GAG gag a aAARTCAGAMG g ac t ag

raagactgaag

Cons HI Cons H2 Cons H3 Cons h4 Cons H5 Cons H6 Cons H7 Cons H8 Cons H9 Cons H10 Cons Hll Cons H12 Cons H13 Cons HI4 Cons HI5 Cons H16

Рис. 6. Области гибридизации праймеров и зонда при амплификации гена НА подтипа Н5.

На рисунке изображены выровненные между собой "консеисуспыс" 11 осл едовагел ь н ости гена гемагглютинина 16 различных подтипов. Серыми полупрозрачными прямоугольниками обозначены области гибридизации праймеров и зонда при амплификации гена НА подтипа Н5.

...

— ... ■А ■ л К

У >* Г -

ni н» вв Н 1Ш г1 У J .J - г- г

- г -- - г

J

1 2 3 4 4 в 1 В 9 1D 11 11 13 14 ЛЬ 1« tí гв 19 Л) Í1 12 гз 34 2Í 36 2Т 20 М ЭЧ 31 мои ер цикл в 32 И и и 36 V 3« 39 40

Рис. 7. Чувствительность тест-системы па основе 11ПР в реальном времени для обнаружения вируса гриппа Л подтипа Н5.

Кривые 1-8 соответствуют разведениям препарата вируса от I0S до 10 ЭИДн1 цп соответственно. Кривая 3 (количество вируса составляет 10 ЭИДи/нл) соответствует последнему раз веден и к? вируса, при котором был зарегистрирован положительный результат.

4. Определение распространения вируса гриппа А на территории Российской Федерации

За период с конца 2003 года разработанными тест-системами было проверено более 1500 образцов от диких и домашних птиц на наличие РНК вируса гриппа А. Основная часть исследуемых проб была собрана во время отсутствия эпизоотических вспышек гриппа А. Остальные образцы были собраны во время эпизоотий, вызванных вирусами гриппа А подтипа 115, в июле 2005 года в Новосибирске, осенью 2005 года в Астраханской области и в июне 2006 года в республике Тыва, сопровождавшихся падежами дикой и домашней птицы.

Пробы, собранные в отсутствие эпизоотии, были получены от диких птиц водного (51К образцов), о кол о полною (35 I образец) и наземного (1 55 образцов) комплексов. Среди домашних птиц исследовались утки (103 образца), гуси (53 образца), куры (219 образцов) и голуби (10 образцов), lío всех случаях пробы отбирались у клинически здоровых птиц.

Тестом для обнаружения вируса гриппа А на основе "гнездовой" ПЦР было проверено 760 образцов, собранных в отсутствие эпизоотий, причем !45 из них оказались положительными, что составило 19,1%. Во время эпизоотических вспышек было собрано и проверено 86 образцов. Среди них от клинически здоровых птиц было проверено 68 образцов (16

положительных), от птиц с признаками болезни - 9 образцов (9 положительных), от свежепогибших - 9 (8 положительных)

С помощью теста для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 на основе "гнездовой" ПЦР было проанализировано 638 образцов, отобранных в отсутствие эпизоотий Среди них было 60 (9,4%) положительных образцов. Данным тестом было также проверено 106 образцов, собранных во время возникновения эпизоотических вспышек Среди них от клинически здоровых птиц было проверено 84 образца (36 положительных), от птиц с признаками болезни - 11 образцов (10 положительных), от свежепогибших - 11 (9 положительных)

При исследовании образцов, собранных во время эпизоотий, от птиц без признаков болезни тестом для обнаружения вируса гриппа А/Н5 на основе "гнездовой" ПЦР был получен более высокий процент положительных проб при сравнении с тестом для обнаружения вируса гриппа А. Такие результаты вероятно можно объяснить более высокой чувствительностью теста для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5

Тестом для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н7 на основе "гнездовой" ПЦР анализировались пробы, собранные только в отсутствие эпизоотий Из 298 исследованных проб положительными были 22 (7,4%)

Меньше всего образцов было исследовано тестом для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 на основе ПЦР в реальном времени Не было обнаружено положительных проб среди 180, собранных во время отсутствия эпизоотий Однако из 20 образцов, собранных во время вспышки гриппа в республике Тыва, 5 оказались положительными

В таблицах 3 и 4 представлены результаты, полученные при анализе образцов методами изоляции вирусов с последующим типированием в реакциях гемагтлютинации и торможения гемагглютинации и полимеразной цепной реакции

С 2003 года методом пассирования на куриных эмбрионах было выделено 8 различных изолятов вируса гриппа А, относящихся к группе ЬРА1 (таблица 3) При анализе полевых проб, из которых позднее были выделены вирусы гриппа, с помощью тест-системы для обнаружения вируса гриппа А 5 образцов оказались положительными При повторном анализе после выделения вирусов с помощью куриных эмбрионов остальные 3 образца были подтверждены как положительные При анализе данных образцов другими тест-системами результаты в обоих случаях оказались отрицательными

Кроме того, при анализе образцов, собранных во время эпизоотий, вирусологическими методами были выделены 23 изолята, относящиеся к группе НРА1 и имевшие подтип Н5Ш (таблица 4) Все полевые образцы, содержащие эти вирусы, были положительны при первичном тестировании тест-системой для обнаружения вируса гриппа А, тест-системой для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 методом "гнездовой" ПЦР и

тест-системой для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 методом ПЦР в реальном времени

Таблица 3

Результаты тестирования полевых образцов, содержащих низкопатогенные изоляты вируса гриппа А, молекулярными и традиционными методами

Штамм источник Результаты обследования полевого материала (клоакальные смывы) Результаты иденти фикации подтипа (вирусологическими методами) Результаты обследования вируссодержащего материала после изоляции

"гнездовая" П1(Р ПЦР-РВ "гнездовая" ПЦР ПЦР -PB

NP Н5 Н7 Н5 NP Н5 Н7 Н5

А/Теа1/Рптопе/ Ргт04-36/04 Чирок-клоктун Anas Formosa + - - - H3N8 + - - -

А/Теа1/Рптопе/ Ргт04-123/04 Чирок-клоктун Anas Formosa + - - - H6N2 + - - -

A/Anas/Primorie Ргт04-130/04 Широконоска Anas clypeata + - - - H10N4 + - - -

А/Теа1/Рптопе/ Ргт04-142/04 Чирок-трескунок Anas querquedula + - - - H4N8 + - - -

А/Теа1/Рптопе/ Prm04-178/04 Чирок-свистунок Anas crecca - - - - H3N8 + - - -

A/Teal/Primorie/ Prm04-179/04 Чирок-свистунок Anas crecca + - - - H4N8 + - - -

А/Teal/Pnmorie/ Prm04-180/04 Чирок-свистунок Anas crecca - - - - H4N8 + - - -

А/Teal/Pnmone/ Prm04-181/04 Чирок-свистунок Anas crecca - - - - H3N8 + - - -

NP - детекция гена нуклеопротеина вирусов гриппа А, Н5 - детекция гена гемагглютинина вирусов гриппа А/Н5, Н7 - детекция гена гемагглютинина вирусов гриппа А/Н7, ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени

Таблица 4

Результаты тестирования полевых образцов, содержащих высокопатогенные изоляты вируса гриппа А/Н51Ч1, методом ПЦР и выделением вируса в культурах клеток и с помощью куриных

эмбрионов

Условия изоляции штамма Результаты обследования

Изоляты полевого материала (КС и ВО)

Источник Модель "гнездовая" ПЦР ПЦР-РВ

СПЭВ MDCK кэ NP Н5 Н7 Н5

Большая поганка

6 изолятов из Новосибирской области (Podiceps cristatus) Домашняя утка (Anas platyrhynchos dorn) Домашняя курица (Gallus gallus dorn ) КС, во КС, во н д + + - нд

10 изолятов из Астраханской области Лебедь-шипун (Cygnus olor) КС, во КС, во н д + + - н д

Большая поганка

(Podiceps cristatus)

7 изолятов из республики Тыва Большой баклан (Phalacrocorax carbo) Лысуха (Fúlica atra) Речная крачка (Sterna hirundó) КС, во КС, во КС, во + + - +

ВЫВОДЫ

1 Разработан и внедрен в практику тест на основе "гнездовой" ПЦР для выявления вируса гриппа А Данный тест апробирован на 846 образцах от диких и домашних птиц в исследованиях по мониторингу за вирусами гриппа А в период с 2003 по 2006 гг

2 Разработан тест и внедрен в практику тест на основе "гнездовой" ПЦР для выявления и типирования вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н7 Тест для обнаружения вируса гриппа А/Н5 апробирован на 744, а тест для

обнаружения вируса гриппа А/Н7 - на 298 образцах, собранных в 9 различных областях Российской Федерации в период с 2003 по 2006 гг

3 Разработан и внедрен в практику тест для выявления вирусов гриппа А подтипа Н5 методом ПЦР в реальном времени, повышена экспрессность проведения анализа в сравнении с "гнездовой" ПЦР Чувствительность теста на основе ПЦР в реальном времени уступает чувствительности тестов на основе "гнездовой" ПЦР, однако достаточна для выявления вируса в образцах от клинически больных птиц

4 Установлено, что чувствительность разработанных тестов на основе "гнездовой" ПЦР соответствует чувствительности вирусологических методов и позволяет выявлять вирусы гриппа А, содержащиеся в исследуемых образцах от 101'5 ЭИД5о/мл

5 При помощью разработанных тест-систем выявлено распространение вирусов гриппа А в 9 областях Российской Федерации в период с 2003 по 2006 гг Определена значимость вирусов гриппа А/Н5 и А/Н7 в период исследования

Список сокращений

ВО - внутренние органы

КС - клоакальные смывы

КЭ - куриные эмбрионы

ОТ-ПЦР - реакция обратной транскрипции, совмещенная с

полимеразной цепной реакцией

ПЦР — полимеразная цепная реакция

СПЭВ - перевиваемая клеточная линия почки эмбриона свиньи

ЭИД50 - эмбриональная инфекционная доза

НА - гемагглютинин

HP AI - highly pathogemc avian influenza

LPAI - low pathogemc avian influenza

MDCK - перевиваемая клеточная линия почки эмбриона собаки

NA - нейраминидаза

NP - нуклеопротеин

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Киреев Д Е, Гребенникова Т В , Забережный А Д., Алипер Т И, Непоклонов Е А, Руднева И А, Каверин Н В , Львов Д К Создание тест-системы на основе метода полимеразной цепной реакции для детекции вируса гриппа типа А//Материалы ХЙ Российского национального конгресса "Человек и Лекарство", 18-22 апреля 2005 г, Москва. - С 138

2. Львов Д К, Щелканов М Ю , Власов Н А , Дерябин П Г , Гребенникова Т В , Прилипов А Г , Непоклонов Е А, Онищенко Г Г, Алипер Т И, Забережный А Д, Киреев Д Е, Крашенинников О П, Кирюхин С Т, Бурцева Е И, Федякина И Т, Слепушкин А И Изоляция

вируса гриппа А/Н5Ш от домашних и диких птиц в период эпизоотии в Западной Сибири (июль 2005 г ) // В сб Генодиагностика инфекционных болезней Материалы Российской научно-практической конференции (Сосновка, Новосибирская область, Россия, 25-27 октября 2005 г) — Новосибирск,ЦЭРИС,2005 -С 133-136

3. Щелканов М Ю , Власов Н А, Киреев Д Е , Славский А А, Гребенникова Т В , Прилипов А Г, Забережный А Д, Алипер Т И, Кирюхин С Т, Петренко М С , Крашенинников О П, Непоклонов Е А, Онищенко Г Г, Дерябин П Г , Львов Д К Клинические признаки заболевания у птиц, вызванного высокопатогенными вариантами вируса гриппа А/Н5Ы1, в эпицентре эпизоотии на юге Западной Сибири (июль

2005 г) // Журнал инфекционной патологии - 2005 - Т12 -№3-4 -С 121-124

4. Львов Д К , Щелканов М Ю , Дерябин П Г , Гребенникова Т В , Прилипов А Г, Непоклонов Е А, Онищенко Г Г, Власов Н А , Алипер Т.И, Забережный А Д, Киреев Д Е , Крашенинников О П, КирюхинС.Т., БурцеваЕИ, СлепушкинАН Изоляция штаммов вируса гриппа А/Н5Ш от домашних и диких птиц в период эпизоотии в Западной Сибири (июль 2005 г) и их депонирование в Государственную Коллекцию вирусов РФ (08 августа 2005 г ) // Вопросы вирусологии - 2006 - Т 51 -№ 1 -С 11-14

5. Львов Д К, Щелканов М Ю , Дерябин П Г, Федякина И Т, Бурцева Е И, Прилипов А Г, Киреев Д Е, Усачев Е В , Алипер Т И, Забережный А Д, Гребенникова Т В , Галкина И В , Славский А А, Литвин К Е , Донгур-оол А М, Медведев Б А, Докпер-оол М Д, Монгуш А А , Арапчор М Ш, Кенден А О, Власов Н А, Непоклонов Е А, Биагег Б Изоляция высокопатогенных (НРА1) штаммов вируса гриппа А/Н5Ш от диких птиц в очаге эпизоотии на озере Убсу-Нур (июнь 2006 г ) и их депонирование в Государственную коллекцию вирусов РФ (3 июля 2006 г) // Вопросы вирусологии -2006 -Т 51 -№6 - С 14-18

6. Хомик Д С , Киреев Д Е Разработка положительного контроля к тест-системе для определения РНК вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 // ВестникРГМУ -2006 -Т 49 -№2 -С 432

7. Хомик ДС., Киреев ДЕ Мониторинг полевых образцов методом ПЦР на наличие вируса гриппа А подтипа Н5 // Материалы конференции "Клинические и теоретические аспекты современной медицины", 17-19 апреля 2006 г, Москва - С 93-94

8. Киреев Д Е, Верховский О А, Гребенникова Т В., Забережный А Д , Алипер Т И, Заерко В И Современные методы диагностики и профилактики гриппа птиц//Вестник ветеринарии -2006 —Т 3 -№38 -С 24-28

9. Гребенникова Т В., Киреев Д Е., Забережный А Д, Алипер Т И Разработка средств молекулярной диагностики гриппа А // Ветеринария -

2006 - №5 -С 30-33

10. Киреев Д Е, Аканина Д.С , Гребенникова Т В , Забережный А Д., Щелканов М Ю, Львов Д К Разработка тест-систем для выявления и типирования вируса гриппа А на основе полимеразной цепной реакции // Вопросы вирусологии -2007.-Т. 52 -№4 - С 17-22

Подписано в печать 11 09 2007 г Исполнено 11 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 694 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Киреев, Дмитрий Евгеньевич

ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Характеристика вирусов гриппа

1.1.1. Классификация

1.1.2. Организация вириона и функции вирусных белков

1.1.3. Клинические признаки и патогенез

1.1.4. Эпизоотология и эпидемиология гриппа А

1.2. Диагностика гриппа А

1.2.1. Вирусологичекая диагностика

1.2.2. Серологическая диагностика

1.2.3. Обнаружение вирусного антигена

1.2.4. Молекулярная диагностика

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции для мониторинга вируса гриппа А"

Актуальность темы.

Вирусы гриппа А распространены по всему миру, заражают многие виды диких и домашних птиц, большое количество различных видов млекопитающих и человека. Вследствие особенностей генома вирусам гриппа А свойственна чрезвычайно высокая изменчивость. Это позволяет им вызывать сезонные эпидемии среди людей, вспышки с высоким процентом смертности среди животных и птиц и иногда являться причиной пандемий [107].

Вирусы гриппа А согласно номенклатуре представлены сочетаниями 16 подтипов гемагглютинина (НА) и 9 подтипов нейраминидазы (NA) [34]. Естественным резервуаром вирусов гриппа А считаются птицы водного и околоводного комплексов. От птиц изолированы вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков: НА и NA. Среди людей обычно циркулируют вирусы с 3 подтипами гемагглютинина (Н1-НЗ) и двумя нейраминидазы (N1, N2). Иногда возникают случаи заражения вирусами гриппа А других подтипов (H5N1, H7N3, H7N7, H9N2) [108].

В настоящее время существует серьезная угроза возникновения новой пандемии среди людей, которая может быть вызвана вирусом гриппа А подтипа H5N1. В 1997 году в период вспыхнувшей эпизоотии в Гонконге впервые были зафиксированы случаи заражения человека вирусом гриппа подтипа H5N1, сопровождаемые высоким уровнем летальности: из 18 зараженных погибло 5 человек. Этот вирус, так называемый вирус "птичьего гриппа", в 2004 году стал причиной новых случаев заболевания в странах Азии, гибели 60 человек во Вьетнаме, Таиланде, Камбодже, Индонезии, и уничтожения 150 миллионов домашних птиц. В 2005 во время миграции диких птиц он распространился в северный Китай, Монголию, Тибет, Казахстан и Россию. В настоящее время вирус "птичьего гриппа" обнаруживается в странах Европы (Румыния, Греция), Ближнего Востока, Кавказского региона [108].

Необходимость мониторинга вируса гриппа А у птиц, человека и животных чрезвычайно велика. Вирусологические методы обнаружения вируса гриппа А (пассирование на куриных эмбрионах или на культуре клеток с последующей идентификацией в реакции гемагглютинации (РГА) или реакции торможения гемагглютинации (РТГА)) надежны и чувствительны, однако они довольно трудоемки и на их выполнение требуется от 1 до 2 недель [112].

За последнее десятилетие широкое распространение получили молекулярные методы диагностики гриппа А. Наиболее известные и эффективные - это методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции в реальном времени. Принцип их работы основан на многократном умножении части генома инфекционного агента с последующей его идентификацией. Время анализа инфекционного материала такими методами снижается до одного дня, их чувствительность не уступает чувствительности традиционных методов [75]. В рекомендациях Всемирной Организации Здравоохранения о диагностике гриппа А метод полимеразной цепной реакции приравнен к традиционным методам и рекомендован для использования [113].

В настоящее время в мире существует ряд диагностических систем для обнаружения и типирования вирусов гриппа типа А на основе метода полимеразной цепной реакции. Недавно и в России начали появляться подобные наборы [7]. Однако вариабельность генома вируса гриппа вызывает серьезные проблемы при диагностике и иногда является причиной появления ложно отрицательных результатов. В связи с этим увеличение количества разработанных диагностикумов для обнаружения РНК вируса гриппа А увеличивает вероятность правильной и надежной диагностики.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлась разработка на основе полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени диагностических наборов для обнаружения и типирования вируса гриппа А и апробация их с образцами, полученными от различных видов птиц, животных и человека. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать детекционную систему ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена нуклеопротеина.

2. Разработать детекционную систему ОТ-ПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина.

3. Разработать систему ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 с режимом получения результатов в реальном времени.

4. Сравнить чувствительность разработанных детекционных систем с традиционными методами обнаружения вируса гриппа и провести их тестирование с использованием имеющихся эталонных штаммов вируса гриппа А и полевых образцов от птиц.

5. С помощью разработанных тест-систем выявить распространенность вируса гриппа А на территории Российской Федерации в период с 2003 по 2006 гг.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Разработана и внедрена детекционная система на основе ПЦР (ТУ 9388-004-42418073-05 от 06 декабря 2005 г.), позволяющая обнаруживать вирусы гриппа А любого подтипа и дифференцировать их от вирусов гриппа В и С, а также от других патогенов.

2. Разработана и внедрена детекционная система на основе множественной дифференцирующей ПЦР, позволяющая обнаруживать вирусы гриппа А подтипов Н5 и Н7 (ТУ 9388-002-42418073-05 от 06 декабря 2005 г.).

3. Разработана и внедрена детекционная система на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая обнаруживать вирусы гриппа А подтипа Н5 (ТУ 9388-003-42418073-05 от 06 декабря 2005 г.).

4. Сравнительные результаты использования тестов для обнаружения вируса гриппа А методом ПЦР с вирусологическими методами свидетельствуют о возможности использования разработанных тест-систем для быстрого обнаружения вирусов гриппа А как в культуральном материале, так и в полевых образцах от птиц.

5. Выявлена распространенность вируса гриппа А на территории Российской Федерации и определена доля вирусов гриппа подтипов Н5 и Н7 в период с 2003 по 2006 гг.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Возможность обнаружения вируса гриппа А с помощью разработанного теста на основе ПЦР.

2. Возможность обнаружения вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 и одновременной их дифференциации с помощью разработанного теста на основе ПЦР.

3. Возможность обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 с помощью разработанного теста на основе ПЦР в реальном времени; повышение экспрессности метода по сравнению с "гнездовой" ПЦР при сохранении достаточной чувствительности для детекции вируса в образцах от клинически больных птиц.

4. Чувствительность разработанных тестов на основе ПЦР соответствует чувствительности методов изоляции вируса гриппа; возможность применения разработанных тестов для обнаружения вируса гриппа А в образцах от диких и домашних птиц.

5. Возможность использования детекционных систем на основе "гнездовой" ПЦР для мониторинга вируса гриппа А с определением доли вирусов гриппа подтипов Н5 и Н7.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной биологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 21 июня 2007 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 4 тезисов.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного тескта. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 119 источников. Работа содержит 10 таблиц и 12 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Киреев, Дмитрий Евгеньевич

V. ВЫВОДЫ

1. Показана эффективность разработанного теста на основе "гнездовой" ПЦР для выявления вируса гриппа А в образцах диких и домашних птиц. При исследовании полевых образцов от птиц, собранных с 2003 по 2006 гг. в девяти областях Российской Федерации, процент положительных проб составил 19,1% в отсутствие и 38,4% во время эпизоотий, вызванных вирусами гриппа А.

2. Установлена эффективность разработанного теста на основе "гнездовой" ПЦР для обнаружения и дифференциации вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н7. Распространенность вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н7 в отсутствие эпизоотий за период исследования составила 9,4% и 7,4% соответственно. Во время возникновения эпизоотических вспышек, вызванных вирусами гриппа А/Н5 положительные пробы составили 51,9% от общего числа исследованных.

3. Установлено, что чувствительность разработанных тестов на основе "гнездовой" ПЦР соответствует чувствительности вирусологических методов.

4. Разработан тест для выявления вирусов гриппа А подтипа Н5 методом ПЦР в реальном времени; повышена экспрессность проведения анализа в сравнении с "гнездовой" ПЦР.

5. Чувствительность теста на основе ПЦР в реальном времени уступает чувствительности тестов на основе "гнездовой" ПЦР, однако достаточна для обнаружения вируса в образцах от клинически больных птиц.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киреев, Дмитрий Евгеньевич, Москва

1. Всемирная Организация Здравоохранения. Грипп // Информационный бюллетень №211, пересмотренный бюллетень за март 2003 г. Документ доступен по адресу http://www.who.int/rnediacentre/factsheets/fs211/ги/.

2. Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф / сб. статей. / Рос. акад. мед. наук; [редкол.: акад. РАМН В. И. Покровский и др.]. Препринт. СПб.: Росток, 2006. - 270 е.: ил. - (Эпидемии XXI века).

3. Грипп: Руководство для врачей / под ред. Г. И. Карпухина. СПб.: Гиппократ, 2001. - 360 с.

4. Деева Э. Г., Еропкин М. Ю., Григорьева В. А. и др. Эпизоотии гриппа птиц как манифестация пандемии // Журн. микробиол. 2006. - №1. - С. 81-87.

5. Каверин Н. В., Смирнов Ю. А. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемий // Вопросы вирусологии. 2003. - № 3. - С. 4-10.

6. Сюрин В. Н., Самуйленко А. Я., Соловьев Б. В., Фомина Н. В. Вирусные болезни животных // Москва, ВНИТИБП, 928 с, ил.

7. Шипулин Г. А., Обухов И. JI., Панин А. Н. Разработака и апробация ПЦР-тест-систем для выявления вируов гриппа птиц // Рос. Мед. Вести. -2006.-№1.-С. 60-61.

8. Avian Influenza A (H5N1) Infection in Humans. The Writing committee of the WHO Cunsultqtion on Human Influenza A/H5 // The New England J. of Medicine. September 29, 2005. - Vol. 353. - P. 1374-1385.

9. Banks J., Speidel E. C., McCauley J. W., and Alexander D. J. Phylogenetic analysis of influenza H7 haemagglutinin subtype influenza A viruses // Archives of Virology.- 2000. -Vol. 145.-P. 1047-1058.

10. Banks J., Speidel E. S., Moore E., et al. Changes in the haemagglutinin and the neuraminidase genes prior to the emrgence of highly pathogenic H7N1 avian influenza viruses in Italy // Arch, of Virol. 2001. - Vol. 146. - P. 963-973.

11. Bean W. J., Kawaoka Y., Wood J. M. et al. Characterization of virulent and avirulent A/Chicken/Pensylvania/83 influenza A viruses: potential role of defective interfering RNAs in nature // J. Virol. 1985. - Vol. 54. - P. 151-160.

12. Beare A. S. and Webster R. G. Replication of avian influenza viruses in humans // Archives of Virology. 1991. - Vol. 119. - P. 37-42.

13. Beattie K. L. Microfabricated, flowthrough porous apparatus for discrete detection of binding reactions // U.S. patent 5,843,767. 1998.

14. Bellau-Pujol S., Vabret A., Legrand L., et al. Development of three multiplex RT-PCR assays for the detection of 12 respiratory RNA viruses // J. of Virol. Methods. 2005. - Vol. 126. - P. 53-63.

15. Brown I. H. Advances in molecular diagnostics for avian influenza // Dev. Biol. (Basel). 2006. - Vol. 124. - P. 93-97.

16. Bui M., Whittaker G. and Helenius A. Effect of Ml protein and low pH on nuclear transport of iinfluenza virus ribonucleoproteins // J. Virol. 1996. - Vol. 70.-P. 8391-8401.

17. Campbell С. H., Webster R. G. and Breese S. S. Fowl plague virus from man // J. of Infect. Diseases. 1970. - Vol. 122. - P. 513-516.

18. Capua I., and Alexander D. J. Avian influenza: recent developments // Av. Pathol. 2004. - Vol. 33. - P. 393-404.

19. Cattoli G., Drago A., Maniero S., et al. Comparison of three rapid detection systems for type A influenza virus on tracheal swabs of experimentally and naturally infected birds // Avian Pathology. August 2004. - Vol. 33(4). - P. 432-437.

20. Chan К. H., Maildeis N., Pope W., et al. Evaluation of the Directigen Flu A+B test for rapid diagnosis of influenza virus type A and В infections // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40(5). - P. 1675-1680.

21. Chan P. К. Outbreak of avian influenza A(H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997 // Clin. Infect. Dis. 2002. - Vol. 34, suppl. 2. - P. S58-S64.

22. Chizhikov V., Wagner M., Ivshina A., et al. Detection and genotyping of human group A rotaviruses by oligonucleotide microarray hybridization // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - P. 2398-2407.

23. Chotpitayasunondh Т., Ungchusak K., Hanshaoworakul W., et al. Human disease from influenza A (H5N1), Thailand, 2004 // Emerg. Infect. Dis. 2005. -Vol. 11.-P. 201-209.

24. Cross K. J., Burleigh L. M., Steinhauer D. A. Mechanism of cell entry by influenza viruses // Expert review in molecular medicine. http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk.

25. Donofrio J. C., Coonrod J. D., Davidson J. N., and Betts R. F. Detection of influenza A and В in respiratory secretion with the polymerase chain reaction // PCR Methods Appl. 1992. - Vol. 1. - P. 262-268.

26. Ellis J. S., Zambon M. C. Combined PCR-Heteroduplex Mobility Assay for Detection and Differentiation of Influenza A Viruses from Different Animal Species // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39(11). - P. 4097-4102.

27. Ellis J. S., Zambon M. C. Molecular diagnosis of influenza // Rev. Med. Virol. 2002. - Vol. 12. - P. 375-389.

28. Englund L., Klingeborn В., Mejerland Т. Avian influenza A virus causing an outbreak of contagious interstitial pneumonia in mink // Acta Vet. Scand. -1986. Vol. 27(4). - P. 497-504.

29. Fauquet С. M., Mayo M. A., Maniloff J., et al. Virus taxonomy, eighth report // Elsevier. 2005. - P. 681-693.

30. Fouchier R. A. M., Bestebroer Т. M., Herfst S., et al. Detection of influenza A viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 40964101.

31. Fouchier R. A. M., Munster V., Wallensten A., et al. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (HI6) obtained from black-headed gulls // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 2814-2822.

32. Garcia M., Crawford J. M., Latimer J. W., et al. Heterogeneity in the haemagglutinin gene and emergence of the highly pathogenic phenotype among recent H5N2 avian influenza viruses from Mexico // J. of Gen. Virol. 1996. -Vol. 77.-P. 1493-1504.

33. Gavin P. J., Thompson R. B. Jr. Review of Rapid Diagnostic Tests for Influenza// Clin. And Appl. Immunol. Reviews. -2003. Vol. 4. - P. 151-172.

34. Geraci J. R., St. Aubin D. J., Barker I. K., et al. Mass mortality of harbor seals: pneumonia associated with influenza A virus // Science. 1982 Feb. 26. -Vol. 215(4536).-P. 1129-1131.

35. Guo Y., Wang M., Kawaoka Y., et al. Characterization of a new avian-like influenza A virus from horses in China // Virology. 1992 May. - Vol. 188(1). -P. 245-255.

36. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids. Symp. Ser. 1999. -Vol. 41.-P. 95-98.

37. Heid C.A. Real-time quantitative PCR // Genome Res. 1996. - Vol. 6. -P. 986-994.

38. Hien Т. Т., Liem N. Т., Dung N. Т., et al. Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam // The new England J. of Medicine. 2004. - Vol. 350. - P. 1179-1188.

39. Hinshaw V. S., Bean W. J., Geraci J, et al. Characterization of two influenza A viruses from a pilot whale // J. Virol. 1986 May. - Vol. 58(2). - P. 655-656.

40. Horimoto Т., Rivera E., Pearson J., et al. Origin and molecular changes associated with emergence of a highly pathogenic H5N2 influenza virus in Mexico//Virology.- 1995 Okt. 20.-Vol. 213(1).-P. 223-230.

41. Huang X., Liu Т., Muller J., et al. Effect of influenza virus matrix protein and viral RNA on ribonucleoprotein formation and nuclear export // Virology. -2001.-Vol. 287.-P. 405-416.

42. Hughes M. Т., McGregor M., Suzuki Т., et al. Adaptation of influenza A viruses to cells expressing low levels of sialic acid leads to loss of neuraminidase activity // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P. 3766-3770.

43. Imai M., Ninomiya A., Minekawa H., et al. Development of H5-RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification) system for rapid diagnosis of H5 avian influenza virus infection // Vaccine. 2006. - Vol. 24. - P. 6679-6682.

44. Ito M., Watanabe M., Nakaqawa N., et al. Rapid detection and typing of influenza A and В by loop-mediated isothermal amplification: comparison with immunochromatography and virus isolation // J. Virol. Methods. 2006. - Vol. 135.-P. 272-275.

45. Keawcharoen J., Oraveerakul K., Kuiken Т., et al. Avian influenza H5N1 in tigers and leopards // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol. 10. - P. 2189-2191.

46. Kessler N., Ferraris O., Palmer K., et al. Use of the DNA Flow-Thru chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses // J. Clin. Microbiol. -2004.-Vol. 32.-P. 2173-2185.

47. Klopfleisch R., Werner O., Mundt E., et al. Neurotropism of highly pathogenic avian influenza virus A/chicken/Indonesia/2003(H5Nl) in experimentally infected pigeons (Columbia livia f. domestica) // Vet. Pathology. 2006. - Vol. 43. - P. 463-470.

48. Koopmans M., Fouchier R., Wilbrink В., et al. Update on human infections with highly pathogenic avian influenza virus A/H7N7 during an outbreak in poultry in The Netherlands // Eurosurveillance Weekly. 2003. -Vol. 7.-P. 1-5.

49. Koopmans M., Wilbrink В., Conyn M., et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human beings during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands // Lancet. 2004. - Vol. 363. - P. 582-583.

50. Kurtz J., Manvell R. J. and Banks J. Avian influenza virus isolated from a woman with conjunctivitis // Lancet. 1996. - Vol. 348. - P. 901-902.

51. Lau L. Т., Banks J., Aherne R., et al. Nucleic acid sequence-based amplification methods to detect avian influenza virus // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - Vol. 313. - P. 336-342.

52. Lee C. W., Suarez D. L. Application of real-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus//J. Virol. Methods. 2004. - Vol. 119.-P. 151-158.

53. Leonardi G. P., Leib H., Birkhead G. S., et al. Comparison of rapid detection methods for influenza A virus and their value in health-care management of institutionalized geriatric patients // J. Clin. Microbiol. 1994. -Vol. 32(1).-P. 70-74.

54. Li J., Chen S., and Evans D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 696-704.

55. Lipshutz R. J., Fodor S. P., Ginderas T. R., and Lockhart D. J. High density synthetic oligonucleotide arrays // Nat. Genet. 1999. - Vol. 21. - P. 2024.

56. Li S., Orlich M. A. and Rott R. Generation of seal influenza virus variants pathogenic for chickens, because of hemagglutinin cleavage site changes // J. of Virol. 1990. - Vol. 64. - P.3297-3303.

57. Lodes M. J., Suciu D., Elliott M., et al. Use of semiconductor-based oligonucleotide microarrays for influenza A virus subtype identification and sequencing // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P. 1209-1218.

58. Martin K., and Helenius A. Nuclear transport of influenza virus nucleoproteins. The viral matrix protein (Ml) promotes export and inhibits import // Cell. 1991. - Vol. 67. - P. 117-130.

59. Momose F., Basler C. F., O'Neill R. E., et al. Cellular splicing factor RAF-2p48/NPI-5/BATl/UAP56 interacts with the influenza virus nucleoprotein and enhances virus RNA synthesis // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P. 1899-1908.

60. Moore C., Hibbitts S., Owen N., et al. Development and evaluation of a real-time nucleic acid sequence based amplification assay for rapid detection of influenza A // J. Med. Virol. 2004. - Vol. 74. - P. 619-628.

61. Mosley V. M., and Wycoff R. W. G. Electron microscopy of the virus of influenza//Nature. 1946.-Vol. 157.-P. 263.

62. Munch M., Nielsen L. P., Handberg K. J., and Jorgensen P. H. Detection and subtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA // Arch. Virol. 2001. - Vol. 146. - P. 8797.

63. Nicholson K. G., Wood J. M., Zambon M. Influenza // Lancet. 2003. -Vol. 362.-P. 1733-1745.

64. Onodera K., and Melcher U. VirOligo: a database of virus-specific oligonucleotides //Nucl. Ac. Res. 2002. - Vol. 30. - P. 203-204.

65. Oxburgh L., Hagstrom A. A PCR based method for the identification of equine influenza virus from clinical samples // Vet. Microbiol. 1999. - Vol. 67. -P. 161-174.

66. Patterson S., Gross J., and Oxford J. S. The intercellular distribution of influenza virus matrix protein and nucleoprotein in infected cells and their relationship to hemagglutinin in the plasma membrane // J. Gen. Virol. 1988. -Vol. 69.-P. 1859-1872.

67. Peiris M., Yam Y. C., Chan К. H., et al. Influenza A H9N2: aspects of laboratory diagnosis // J. of Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 3426-3427.

68. Poon L. L. M., Leung C. S. W., Chan К. H., et al. Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 427-430.

69. Puppe W., Weigl J. A. I., Aron G., et al. Evaluation of a multiplex reverse transcriptase PCR ELISA for the detection of nine respiratory tract pathogens // J. of Clin. Virol. 2004. - Vol. 30. - P. 165-174.

70. Quilivan M., Cullinane A., Nelly M., et al. Comparison of Sensitivities of Virus Isolation, Antigen Detection and Nucleic Acid Amplification for Detection of Equine Influenza Virus // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 42. - P. 759-763.

71. Ray C. G., Minnich L. L. Efficiency of immunofluorescence for rapid detection of common respiratory viruses // J. Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25(2).-P. 355-357.

72. Roberts P. C., Lamb R. A., and Compans R. W. The Ml and M2 proteins of influenza A virus important determinants in filamentous particle formation // Virology. 1998.-Vol. 240.-P. 127-137.

73. Rohm С., HorimotoT., Kawaoka Y., et al. Do hemagglutinin genes of highly pathogenic avian influenza viruses constitute unique phylogenetic lineages? // Virology. 1995. - Vol. 209. - P. 664-670.

74. Rott R. The pathogenic determinan of influenza virus // Vet. Microbiol. -1992.-Vol. 33.-P. 303-310.

75. Ruigrok R. W., Barge A., Durrer P., et al. Membrane interaction of influenza virus Ml protein // Virology. 2000. - Vol. 267. - P. 289-298.

76. Saunders N.A. Quantitative real-time PCR // In: Edwards, K., Logan, J., Saunders, N. (Eds.), Real-Time PCR, An Essential Guide, Horizon Bioscence, Wymondham. 2004.

77. Scholtissek C., Bachmann P. A., Hannoun C. Genetic relatedness of hemagglutinins of the HI subtype of influenza A viruses isolated from swine and birds // Virology. 1983. - Vol. 129. - P. 521-533.

78. Sengupta S., Onodera K., Lai A., and Melcher U. Molecular detection and identification of influenza viruses by* oligonucleotide microarray hybridization // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 4542-4550.

79. Senne D. A., Suarez D. L., Stallnecht D. E., et al. Ecology and epidemiology of avian influenza in Northand South America // OIE/FAO Int. Scient. Conf. on Av. Infl., Basel, Karger. 2006. - Vol. 124. - P. 37-44.

80. Soares P. В. M., Demetrio C., Sanfilippo L., et al. Standardization of a duplex RT-PCR for the detection of influenza A and Newcastle disease virases in migratory birds//J. of Virol. Methods.-2005.-Vol. 123.-P. 125-130.

81. Spackman E., Senne D. A., Myers T. J., et al. Development of a Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay for Type A Influenza Virus and the Avian H5 and H7 Hemagglutinin Subtypes // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40(9). - P. 3256-3260.

82. Stallknecht E. D. Ecology and epidemiology of avian influenza virus in wild bird populations: waterfowl, shorebirds, pelicans, cormorants, etc. // Proc.4th intern, symp. on avian influenza. May 29-31, 1997, Athens, USA. - P. 6167.

83. Stamboulian D., Bonvehi P. E., Nacinovich F. M., Cox N. Influenza // Infect. Dis. Clin. North. Am. 2000 March. - Vol. 14. - P. 141-166.

84. Steinhauer D. A., Skehel J. J. Genetics of influenza viruses // Annu. Rev. Genet. 2002. - Vol. 36. - P. 305-332.

85. Stieneke-Grober A., Vey M., Angliker H., et al. Influenza virus hemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin-like endoprotease // EMBO Journal. 1992. - Vol. 11. - P. 2407-2414.

86. Stone В., Burrows J., Schepetuik S., et al. Rapid detection and simultaneous subtype differentiation of influenza A viruses by real time PCR // J. Virol. Methods.-2004.-Vol. 117.-P. 103-112.

87. Sugrue R. J., Bahadur G., Zambon M. C., et al. Specific structural alteration of the influenza haemagglutinin by amantadine // EMBO J. 1990. -Vol. 9.-P. 3469-3476.

88. Takao S., Shimazu Y., Fukuda S., et al. Neuraminidase subtyping of human influenza A virusesby RT-PCR and its application to clinical isolates // Jpn. J. Infect. Dis. 2002. - Vol. 55. P. 204-205.

89. Tam J. S. Influenza A (H5N1) in Hong Kong: an overview // Vaccine. -2002. Vol. 20 suppl. 2. - P. S77-S81.

90. Taylor H. R. and Turner A. J. A case report of fowl plague keratoconjunctivitis // British J. of Ophthalmology. 1977. - Vol. 61. - P. 86-88.

91. Townsend M. В., Dawson E. D., Mehlmann M., et al. Experimental Evaluation of the FluChip Diagnostic Microarray for Influenza Virus Surveillance // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44(8). - P. 2863-2871.

92. Ungchusak K., Auewarakul P., Dowell S. F., et al. Probable person-to-person transmission of avian influenza A (H5N1) // The New England J. of Madicine. 2005. - Vol. 352. - P. 333-340.

93. Wang D., Coscoy L., Zylberberg M, et al. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 2002. - Vol. 99. -P. 15687-15692.

94. Webster R. G., Geraci J. R., Petursson G., and Skirnisson K. Conjunctivitis in human being caused by influenza A virus of seals // New England J. of Medicine. -1981.- Vol. 304. P. 911.

95. Webster R. G. Influenza: an emerging disease // Emerg. Infect. Dis. -1998.-Vol. 4.-P. 436-441.

96. Webster R. G., Yahno M. A., Hinshaw V. S. et al. Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks // Virology. 1978. -Vol. 84.-P. 268-278.

97. Webster R. Influenza: an emerging disease. http://www.cdc.ncidod/eid/vol4no3/Webster.html.

98. Wong S. S. Y., and Yuen K. Y. Avian influenza virus infections in humans //Chest.-2006.-Vol. 129.-P. 156-168.

99. Woolcock P. R., Mcfarland M. D., Lai S., and Chin R. P. Enchanced recovery of avian influenza virus isolates by a combination of chicken embryo inoculation methods // Avian Dis. 2001. - Vol. 45. - P. 1030-1035.

100. World Health Organization. Avian influenza: assessing the pandemic threat // WHO, January, document 2005-WHO/CDS/2005.29 available at http://www.who.int/csr/disease/avianinfluenza/Assessing pandemic threat RU S.pdf.

101. World Health Organization. Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO // 12 January 2007, document available at http://www.who.int/csr/disease/avian influenza/country/casestable200701l 2/en/index.html.

102. World Health Organization. Recommended laboratory tests to identify avian influenza A virus in specimens from humans // WHO, Geneva, June 2005, document available at http://www.who.int/csr/disease/avian influenza/guidelines/avian Iabtests2.pdf.

103. World Health Organization. WHO inter-country consultation: influenza A/H5N1 in humans in Asia // WHO, Manilla, Philippines, 6-7 May 2005, document available at http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHOCDS CSR GIP 2005 7 04.pdf.

104. Wright К. E., Wilson G. A. R., Novosad D. Typing and subtyping of influenza viruses in clinical samples by PCR // J. of Clin. Microbiol. 1995. -Vol. 33.-P. 1180-1184.

105. Yang P., Bansal A., Liu C., et al. Hemagglutinn specificity and neuraminidase coding capacity of neuraminidase-deficient influenza viruses // Virology. 1997. - Vol. 229. - P. 155-165.

106. Yuen K. Y., Chan P. K., Peiris M., et al. Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus // Lancet. 1998. - Vol. 351. - P. 467-471.

107. Zambon M. C. Epidemiology and pathogenesis of influenza // J. of Antimicrobial Chemotherapy. 1999. - Vol. 44. - P. 3-9.

108. Zammatteo N., Hamels S., De Longueville F., et al. New chips for molecular biology and diagnostics // Biotechnol. Annu. Rev. 2002. - Vol. 8. -P. 85-101.

109. Zhirnov O. P. Isolation of matrix protein Ml from influenza viruses by acid-dependent extraction with nonionic detergent // Virology. 1992. - Vol. 186.-P. 324-330.

110. Переплетено ООО «Цифровичок» (495) 778-2220; (495) 797-7576 www.cfr.ru info@cfr.ru