Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии получения препарата микробной ассоциации рубца обладающей целлюлолитической активностью

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии получения препарата микробной ассоциации рубца обладающей целлюлолитической активностью"

гоошрствнишЯ кошт роосийсжой «дврации

ПО ВЫСШЕМ? ОБРАЗОВАНИЮ

тстрствишАя академия пшдаа отсияздста

Ts Oí

На прамд досоаяон

Sip«rod Натмм Юрьим

m в77.ш.з»«етв.».о»в.ш.?

МЯРАБОПЦ ШЮХОШ НОШЕНИЯ ПРЕПАРАТА

leoœoraott Ассошлда ргбца обшавдвй

ПШШОЛШГШОКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Отциымост» 03.00.29 - Йотвхнодогея

Автореферат

диоо«ртад«» ва ооаокмм учввоЯ отвввнш каздвдата твкмчвомх наук

Москва 1994

Pa0oiа вшолвеня яа кафедре "Баотахнологмя, а оартафакацая пвцевы* продуктов "Московской Гооу- ' дарстваивоВ Академн пацевых проваводотн

Научны! руководаталы доктор бвологачеоквх шауа

Б.В. Тараканов Коаоулмаят» Доктор технических наук,

профессор Богатырев А.И.

ООмцзадыам®

оплоиевти! доктор «вхнвчаоквх наук

Т.А. Нутавова доктор техначасках наук, профессор С.К. Траубеяберг Ведущая оргаяваадо( ГосНИИ Сантавбелок

8ацвта- даосертацав ооотоатся * /0 часов на ваоедавав Спацаалваарованиого Совета К 063,61.04 Московской ГооударотвапноЛ Академ» па«а-вих ороааводотв по адресу: 125080, г.Москва А-80, Волоколамское нооое, II, 1ШШП.

С диссертацией ыокио ознакомиться в ОаОлвотекв

МГАШ1

Автореферат разослан " 1991г.

И.О. Ученого секретаря Спациаявзвропанного Совета кандидат технических неук, доцент

0.11. 'ilUbMHllJii-

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема повышения эффективности ^пользования кормов в животноводстве тесно связана о введшем новых высокоэффективных препаратов, повышающих коэф-тиент трансформация питательных веществ рациона животных, зобенно увеличивающих перевариваемое» целлюлозы - основ-зго Компонента грубых кормов.

Препарат на основе целлюлолитической ассоциации бактерий гбца - Целлобактерин предназначен для использования в сель-сом хозяйстве для скармливания молодняку крупного рогатого tora с целью более раннего его перевода на безмолочные щионы и повышения эффективности использования корма. Эффект ? применения препарата обусловлен наличием жизнеспособных теток в спор естественной ассоциации рубцовоЙ микрофлоры, го способствует более быстрому формированию в предаелудках молодняка микрофлоры "взрослого типа".

Цель и задачи исследований. Цель работы заключается в )зработке технологии производства микробного препарата на знове целлюлолитической ассоциации бактерий рубца, адап-зрованной к использованию высоколигнифицарованной клетчат-

i Дли достижения поставленной целя решались следующие " »дачи: подбор производственной питательной среды и условий гльгивирования ассоциации, исследование свойств целлюло-лическогя ферментного комплекса ассоциации, разработка радии концентрирования я получения готовых форм препарата, i работка опытной партий препарата s олытно-промшлешшх злойаях и его характеристика.

Научная новизна .Впервые изучены основные закономерно* оги роста-ассоциации двллюлолвтрче.еких бактерий рубца на подобранном-варйайе: пр.мэйойстеечноЙ питательной среда при различных усляадях культивирования (температура культивирования, начальное рН среда), выяснено влияние лозы в возраста посевного материала на процесс биосинтеза ферментов целлилолвтического комплекса ассоциацией бактерий рубца, определена термостабильнооть, рН-стабильность цел-люлолитического комплекса ферментов ассоциации бактерий рубца, а также влияние на его активность добавок ионов одно- и двухвалентных металлов, предложены эффективные режимы распылительной оушкя препарата Целлобактерин и установлено влияние стабилизаторов на выход сухого готового препарата.

По результатам проведенных исследований получено ав-ч торское свидетельство на "Способ получения препарата цел-люлолягической ассоциации бактерий рубца" № 1781297.

Практическая ценность. В результате проведенных исследований на основании лабораторной и опытно-продашленвой апробации разработаны все этапы технологии получения препарата микробной ассоциации рубца, обладающей комплексом целлплолитических ферментов (Целлобактерин). Разработан опытно-промышленный регламент, по которому наработаны опытные партии препарата. Разработаны и утверждены технические условия на препарат микробный - Целлобактерин. Применение полученного препарата в сельском хозяйстве дало положительный результат.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на Всесоюзной конференции "Микроорганизмы - стимуляторы в ингибиторы роста растений и животных" (Ташкент, Ь)Ь9),

на Всесоюзной' научно-практической конференции "Фермента -народному хозяйству" (Черновцы,1990), на Всесоюзной конференции "Микробиологический в биотехнологические основы интенсификации Ьастениеводсгва и кормопроизводотва" (Алма-ата,1990), на Международной конференции "Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных" (Калуга,1990), на 3-ей Всесоюзной конфе- ' ренции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки" (Казань,1990), на Научной конференции, посвященной 60-легию МТИПП, по проблеме "Научное обеспечение хранения я переработки растительного сырья в пищевой промышленноета" (Москва,1991).

Публикации. По результатам диссертационной работы получено авторское свидетельство на "Способ получения препарата целлюлолитической ассоциации бактерий рубца" и опубляков-вано' 7 печатных работ.

¡Объем и'структура работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного, мнота, содержит 16 рисунков и 27 таблиц. Список литературы включает 144 наименований, в том числе 63 работы зарубежных авторов. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей главу о материалах и методах, экономической части,

выводов и приложений.

I ■■

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2. Объекты в методы исследований Объектом исследования являлась целладалягяческая ассо-

I

циацяя бактерий рубца (ЦАБР), выделеяшя из рубца крупного рогатого скота во ВНИШБяЯ с.-х. животных (г.Боровск).

I

Ассоциация включает три культуры: Clostridium termooeljuloli ticuro шташ 17 (ß-429I), Ruminocoocue albua шгамл 37 j (B-4292) И Clostridium Iochheedii штамм 8 (B-4290).

Ассоциация поддерживалась на питательной среде Хангей-та с фильтровальной бумагой (Бри&нт,1972). Оптимизацию соотношения компонентов в питательной среде установили в результате реализации трех серий экспериментов по ортога~ нальному плану (Грачев,1979). Условия культивирования изучали, выращивая ассоциацию на ореде с свекловичный комом в пробирка* на 40 wji с коэффициентом заполнения 0,8 в анаэробных условиях. Влияние дозы и возраста посевного материала на процесс биосинтеза целлюшолитическнх ферментов Ш>Р изучали выращивая ассоциацию на среде с свекловичным жомом в колбах на 250 т с коэффициентом заполнения 0,8 в анаэробных условиях. Для приготовления питательных сред использовали свекловичный жом (ГОСТ 13456-83), дрожжевой акстракт (ТУ 6-09-3462-73), дрожжевой автолиэат БВК (ТУ-0Л64-13-115-67), пептон бактериологический { ТУ I0U-375-63), минеральные и органические соли марки Ч, травяную муку I класса.

Испытание технологии в опытно-промышленных условиях проводили в аппаратах объемом I и 16 м3 с коэффициентом заполнения 0,8, на Унгенском биохимическом заводе (Молдова),

Для изучения,свойств целлщолитического ферментного комплекса ЦАБР использовали культуральнув жидкость 72-часового возраста после отделения остатков питательной среды и биомассы центрифугированием.

Активность целлшаз определяли по накоплению редуцирующих веществ при гидролизе карйаксиматилцеллишози (ШО я фильтровальной бумаги (АФБ).

За единицу активности принято такое количества фер-

мента, которое способно гвдроляэовать I мкМоль гликозид-них связей субстрата в минуту при температуре 45^ и рН 6,5 (фосфатный буфер). В работе принаняли I% раотвор натри евой соли карбоксиметилцеллюлозы со степенью расщепления 0,7 я степенью полимеризации 450, производимой Намааган-

ским заводом, и фильтровальную бумагу Ватман М1. Коли»

чество редуцирующих веществ определяли по методу Шомодьа-Нельсона (¡(лесов,1980).,

Титр бактерий рубца, входящих в ассоциацию, определяли методом высева на плотную ореду в анаэробных условиях (Бриант,19?;;).

Анализ летучих кирных кислот (ЛЖК) проводили в культу ральной жидкости, после осаждения остатков питательной среды и биомассы центрифугированием. Анализ проводили на газовом хроматографе о пламенно-ионизационным детектором.

Отработку температурных режимов сушки осуществляли на лабораторной сушилке М1то А^ш1вег .

Для определения целлюлолитической активности препарата бил использован метод Хендерсона в модификации Чюрлиса (Чюрлиса,135Ь).

Влажность препарата определяли по ГОСТ 134%73-ъи. Величину рН растворов определяли погенциометрическ« на универсальном иономере ЭВ-74.

Эксперименталыше данные получены не менее, чем в повторностях. Статистическую обработку проводили общепри-' пятыми методами (Грачев,1Э79). Во всех прзве^е.ч.шх эго-!1ериментах уговень значимости, показывающий вероятно-гь ошибки в данном опыте, равняется и,о5.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЙ ¡

3.1 Особенности культивирования ЦАБР I

Культивирование Рубцовых бактерий и в частности ЦАБР подразумевает создание анаэробных условий путем внесения в среду восстановителя в вытеснения кислорода инертными газами, а также обеспечение сложных пищевых потребностей бактерий.

Считается, что на синтез бактериями рубца целлюлолити-чвскях ферментов и их активность в значительной мере влияют ЛЖ-конечные продукты брожения углеводов, а также другие большей частью не идентифицированные бвологическиактивиые вещества, входящие в состав рубцовой жидкости. Поэтому при культивировании An vitro эти компоненты вносятся в чистом виде или о рубцовой жидкостью.

В состав среды, предложенный ВШШБиЛ с.-х. животных, в качестве таких добавок предложены соли ЛЖК (мг/л): натрий уксуснокислый - 3,6; натрий изомвслянокислый 82,0; натрий изовалериановокислый - 96,0; натрий валериановокислый - 96,0. В качестве восстановителя используется цистеин гидрохлорид -0,2 г/л. Помимо »того в состав среды входят (г/л): травяная цука - 10,0; (АЖ^ЗД - 0,5; КН2Р04 - О,Я; К2НР04 - 0,5; Мв304*7Н20 - 0,1; СаС12'2Н20 - 0,01; WaCl - 0,1; дгаНСОу - <¡,U дрожжевой экстракт - 1,0; пептон - 2,0.

Процесс культивирования ЦАБР характеризуется как по нарастанию концентрации ЦАБР, так и по накоплению активности целлплолитических ферментов. Кроме того, анализ состава ЛЖ в культуральноЛ жидкости по окончини/ процесса дает возможность судить о 'стабильности. ЦАБР в процессе {-асденлопая' клегчагкй, ¡¡оскадьку при правильной'ьедешы технологического процесса Uíoaaitcapo ванная пег составу с рода, <к: тональные

условия, соотношение видов) состав ЛЖ по окончания культивирования должен быть близок по составу ЛМ рубцовой жидкости. Особо оледует о?мегягь, что количество масляной

I

кислоты не должно превышать 34$ от общего количества МК в среде, поскольку чрезмерное ее накопление ухудшает качеотво продукта.

Данные по культивированию ЦДБР на среде о травяной мукой приведены на риоунке I и в таблице I.

3.2 Конструирование технологичной питательной среды

Чтобы решить основную технологическую задачу настоящей работы создание эффективной технологии получения препарата ЦАБР - в первую очередь необходимо было подобрать простую, доступную, технологичную питательную среду для выращивания ассоциации, поскольку базовая бреда о травяной мукой сложна по составу и содержит дорогостоящие компоненты (г/л): КЙ2Р04- 0,2; КзНРОд - 0,5; Мв304'2Н20 -0,1; СаС12.2Н^,0 -0,01; NаС1 - I, ; (та4)2 04 -0,5; цистеин гидрохлорид - 0,2; /гаНС03 2,0; дрожжевой экстракт - 1,0; травяная мука - 10,0; (мг/л) натрий уксуснокислый - 3,6; натрий язомаслянокислый -82,0; .натрий изовалервановокислый - 96,0; натрий валериановокис-| лый - 96,0.

Решение этой задачи проводили в четыре этапа: замена ! источника углерода - травяной муки - на более доступный и дешевый, с одновременной коррекцией соотношения углерода й азота в среде, замена минерального состава ореды, уточнение состава солей ЯШ в среде.

В качестве альтернативы травяной муке мы предлагаем свекловичный жом, который широко используется в микробиологической промиюлеяносги при производстве целлшолитичес-

ких ферментов. В процессе предварительных исследований свекловичник ком был выбран как источник углерода в наибольшей степени стймуларупций образование целлвлаз ЦДБР. Сравните чьный ооатав основных компонентов травяной муки в свекловичного жома приведен по данным Шебеки (1982), Порка (Т982), фирмы ШйЙШ (1987) (таблица 2).

Замену других компонентов среды проводили исходя из элементарного состава среды: источники органического азота дрожжевой вкотракг и пептон заменили на дрожжевой автолизах, источники фосфора - фосфаты калия - Ha/VagHFC^'l^HgO, вместоtfaCI в среду вносили KCl для сохранения баланса К+ и /Уа+ в среде , в качестве вооотановителя вместо цистерна солянокислого использовали ла^'9HgO , для стабилизации pH вносили в среду CaCO-j, иоключив/faHGOg и CaCIg'^HgO. Таким образом, при сохранении общего элементарного состава

к л/ т

хЮВ

2.0

qo9o

am-

ара-

гч чб у г зь ч

Рио. I Ооновные характеристики процесса культивирования ЦАБР на среде с травяной мукой: 1-КМЦ-осахприва-ющая активность, 2- АФБ, 3-титр жизнеспособных клеток

исходной ореда били вспользованы менее дорогие и более доступные компоненты

Таблица I

Содержание ЛЖК в культу радььой жидкости при культивирование ЦАБР на орэда о травяной ..............мукой

Часы Относительное содержание ЯЖ,% Общее коли»

. чеотво ЛИС,

роста ■ С2 Сз С4 яэо-С4 С5 иэо-С5 мг/100шг

24 39,8 7,4 14,5 17,6 .8,7 12,0 120,0

48 66,8 9,6 17,2 1,0 2,6 3,5 210,3

96 76,0 4,7 18,2 - 1,9 0,8 .489,1

(66,2) (17,5)(Ю,2) (2,4) (1.2) (1,2) (500,0)

В скобках приведены показатели рубцовоЙ жидкости (Форсберг, Ши)

. Таблица 2 Состав основных компонентов свекловичного жома и травяной муки, %

Показатели - Свекловичный жом Травяная мука

Целлюлоза 20-34 22-35

Гемвцедявдюза 22-35 43-50

Лигнин 3-4 7-10

Белок 8-10 4-7

Фактором оптимизаций состава среды была выбрана КЫЦ-осахаривающая активность, определяемая в культу ральн ой

У

нйдкостй по окончании 72 ч культивирования.

На первом этапе работы необходимо было скорректировать в среде соотношение органического а минерального азота, а также определить соотношение С:М в среде, что я было осуществлено путем реализации вксперимента по ортоганальному плану для трех факторов на пяти уровнях (ГрачевД979). Иооледованные диапазоны концентраций свекловичного лома, дрожжевого автолвзата и (гШ^^О^ (таблица 3) позволили одновременно изучить влияние на накопление КЫЦ-осахаривающей активяоо« соотношения С:Мв питательной среде от 72:1 до 1:1. Установлено, что оптимальным для ЦАБР является соотношение С:М равное 11:1, что соответствует содержанию (г/л): свекловичного жома - 30„0г дрожжевого автолизата - 2,0; (МН4)2504 - 3,5. Прв этом соотношении углерода к азоту проявляется максимальная целлюлолитв-ческая активность в рубце (Курилов,Кроткова,1971),

Для уточнения оптимальных концентраций минеральных солей в конструируемой среде был поотавлен эксперимент по ортогональному плану для пяти факторов на пяти уровнях. Прв этом диапазон исследуемых концентраций составил (г/л): «а2НР04'12Н20 - 2,0*6,0 (^О^^'ЭНзО - 0+2,4 (Л=0,6); Мв304.7Н20 - 0+0,4 (7ЫЭД); КС1 - 0*3,5 (Л=0,5+1,0); СаСОд -1,0+5,0 (Л=1,0). В результате реализации плана по величинам относительных эффектов установлены концентрации солей (г/л): №2НР04'12Н20 - 5,0; Уа^'Э^О - 0,6; Ме504'7Н20 -0,1; КС1-0,5; СаС03 -2,0.

Помимо минеральных солей в состав питательной среда входят ЛГО. При культиварований Рубцовых микроорганизмов она являются обязательным компонентом питательных сред а вносятся в виде свободных кислот, их натриевых солей ялв добавляются с рубцовоЙ жидкостью. Уточнение состава солей

Ю-

ЛЖ осуществляла в опытах, проводимых по ортоганальному плану для четырех факторов на пяти уровнях. Пряуотановлешш диапазонов концентраций исследуемых факторов исходили из содержания ЛЖК в исходной среде (г/л): натрий укоуонокислый 0*0,144 (Л =0,036); натрий изомаслянокислый - 0 ♦ 0,164 (Л=0,041); натрий валериановокислый - 040,128 (А =0,032), натрий изова-лериановокислый - 0*0,128; (Л=0,032). В результате реализации плана по величинам относительных эффектов из состава среды были исключены натрий уксуснокислый и натрий иэо-маолянокислый, для натрия иэовалериановокислого и вале-риановокислого ковдентрации в питательной сраде составили 0,096 г/л, что соответствует содержанию этих солей в исходной среде.

По окончании всех трех этапов плана по конструированию технологичной питательной среды из ее состава были исключены дорогие и дефицитные компоненты, в результате чего состав ее значительно упростился и цена значительно снизилась . Сравнительные данные по составу базовой и сконструированной сред представлены в таблице 3.

Результаты культивирования на сраде с травяной мукой и среде с свекловичным жомом представлены на рисунке 2. Анализ их выявляет некоторое превосходство среды с свекловичным жомом при накоплении целлюлолитической активности культурой: КМЦ-осахаривающая активность к 72 ч на 16$ превосходит подобный показатель на среде с травяной мукой и составляет 8,50*10"*^ Ед/мл, показатель АФБ к 72 ч роста на среде о свекловичным жомом на 30 % превосходит подобный показатель на среда с травяной мукой и составляет 3,2 •Ю""2 Ед/мл, Тигр жизнеспособных бактерий в процессе роста на обеих средах изменяется синхронно и практически одинаково.

. Таблица 3

бастав сред о травяной мукой (исходной) и свекловичным жомом (сконструированной)

Компоненты •. Содержание компонентов, г/л

среда о травяной среда о свеклович-мукой вым хомом

Травяная мука 10,0 -

Свекловичный жом - 30,0

(nh4)2SO4 0,5 3,5

Дрожжевой ексгракт 1,0

Дрожжевой автолазат - 2,0

Пептон 2,0 - ,

кн2ро4 0,2 -

к2нго4

rfä2fiF04'I2H20 - з„о

Цисгенн солянокислый 0,2 -

ffe^'SHgO - 0,6

MgSO^HgO 0,1 • 0,1

CaCI2'2H20 0,01 -

СаС03 - 2,0

f*aНС03 2,0 ' -

KCl - 0,5 ■

IteCI 0,1 -

натрий укоуснокислый 0,0036 -

изобутират катран •0,0820 -

изовалериат натрия 0,0960 0,0960

валеряат натрия 0,0960 0,0960

вания ЦАБР на среде с травяной мукой: 1-КМЦ-осахариваюцая акгавность,2-АФБ, 3-титр жизнеспособных клеток; на среде с свекловичным жомом: 4-КМЦ-осахаривавдая активность, 5-АФБ, 6-титр жизнеспособных клеток

Следует отметить,- что соотав и содержание ЛШ в куль-туральной жидкости по окончании культивирования близки к ооотаву и содержанию ЛЖ в рубцовоЯ жидкости. Накопление масляной кислоты как на среде о свекловичным жомом, так и на ореде о травяной мукой на превышает М% от общего количества Л1К и составляет 20,4 и 19,7 % соответственно.

3.3 Условия культивирования В лабораторных условиях исследована зависимость КМЦ-осахаривающей активности от температуры культивирования микробной аосоцаации (рио. 3) и начального рН питательной среда (рио. 4). Результаты экспериментов показали, что наиболее эффективным режимом культивирования являетоя температура 37°С и рН = 7,0, что соответствует условиям микробиологических процесоов, происходящих в рубце жвачных животных. Соблюдение данных условий позволяет вести процеоо о максимальным накоплением укоуоной кислоты и'с минимальным образованием масляной кислоты.

При проведении исследований влияния дозы и возраста посевного материала на процесс культивирования ЦАБР было испытано три возраста : 24, 48, 72 ч. Исследуемые дозы: 1,5,10,15 %, Сравнивая полученные данные по величине КМЦ-осахариваюцеЙ активности культуральной жидкости, можно сделать вывод, что для получения более активной ЩБР необходимо использовать посевной материал в возрасте 48 ч, в количестве 5*10$. При атом КМЦ-осахаряваодая активность культу ральной жидкости

о

максимальна в составляет к 72ч Ю.бО'Ю-" Ед/мл (рио.5).

3.4 Свойства целлшолитического комплекса ЫБР Основной задачей стадии высушивания препарата является возможно более полное сохранение целлюлолитической актив-

14.

нооти и тигра жизнеспособных клеток в препарате. Поэтому следующим этапом работы было изучение температурной и рН-ста-бильности целладолитического комплекса ЦАБР, а также влияние на его активность добавок солей металлов.

Данные по термос табельное тя цвллвдолитического комплекса ЦАБР представлены на рисунке 6, из которого видно, что при 20, 30,и 40°С в течение 3-х часов КМЦ-осахаривающая активность сохраняется практически на 93-100 %, через 5 ч она снижается на 2-14$ и через сутки составляет соответственно 83,70 и 58 % . При 50°С характер изменения КЩ-осахаривавдеЙ активности иной: через 2 ч она возрастает на 50 % от исходной, а затем снижается и через Зч она составляет уже 94 %, а через сутки лишь 35 % от исходной. При 60 и 70°С КМЦ-осахаривающая активность нестабильна: через 1,5 ч она составляет 20 и 15 % ооответотвенно.

АФБ при 20 , 30, 40 , 60 , 70°С имеет сходные с КЩ-осахари-вающей вкгивноотыо характеристики, однако при 50°С АФБ не активируемся, через 2 ч она составляет 90 % от исходной, а через сутки остаточная активность составляет 21 %. Подобное различие термосгабильности КМЦ-осахаривакцей активности и АФБ при 50°С возможно объясняется диссоциацией целлшосом, когда о потерей молекулярного веса теряется способность гид-роли зова ть нерастворимые формы целлюлозы, но сохраняется КМЦ-осахаривающая активность.

Характеристика рН-стабильносги целлшолитического комплекса ЦАБР представлена на рисунке 7. Данные свидетельствуют

р максимальной активности и стабильности целлшазного комп-

/

лекса ЦАБР при рН среды равном 6,0*6,5.

Наш исследовалось влияние иолов металлов на активность

ВД/МА.

0,090

0,060

ЦОЫ)

г г

24 чв п 96 ч

Рио.З Влияние температура культивирования на изменение КМЦ-осахариваадей активности: I - приЗО°С; 2 - при 37°С; 3 - ир«40°С; 4 - при 50°С

0,Ю0 0,080 орьо о,очо оого

ВД/МА

З.о

6.0

7.0

8,0

90 рН

Рис. 4 Влияние начального значения рН среди на КМЦ-осахарв-вающую активность ЦАБР (температура культивирования - 37°С, длительность культивирования - 72 ч)

КМЦ-соаяарвваищуо акяявнооть культурадьяой яйдксстм при длятельяосм культивирования 72 ч • I - возраст 24 ч„ 2- возраст 48 ч, 3.- возраст 72ч

тивяость целлшазного комплекса ЦАБР: 1-20°С; 2-30°С; 4-40°С; 5-60°С; 6-70°С

Вд/ю

0 400

1,0 '5,0 6,0 7.0 Ь,0 9,0 рН Рио.7 Влияние величины рН среды на целлюдолитическую

активность ЦАБР:- 1-КМЦ-осахаривающая активность

сразу после изменения рН; 2-КМЦ-осахариваодая

активность через 5 ч выдерживания при 50°С;

3-АФБ сразу после изменения рН; 4-АФБ через 5 ч .

выдерживания рпи 50°С .

и стабильность ферментов целлшазлого комплекса ЦАБР. Выбор солей металлов был обусловлен данными литературы о влиянии ионов металлов ка активность бактериальных целлшаз, а.также составом микроэлементов рубцовой жидкости.

Било исследовано влияние CoGI^, MnS04, %S04, С и 50^, 2а304, CaCI2> «iCI2, Fe504, KCl, HaCI в диапазоне концентраций М при температуре 50°С. Установлено, что симулирующее влияние на целлюдолитическую активность (АФБ) оказывают Ма504, CaCI^, FeS04, CoCI, и ZnS04 в концентра -Цви Ю Ы. При атом необходино отметить, что время

актавацаа для !%S04, CaCI2 я FeSO^ составляет ке более I ч„ а для CoCIg я ZnSO^ около 3-х часов АФБ за этот период возрастает на 115, 9?, 83, 54 ш 26 % соотзетотвенио (рао.8).

Соля MnS04, М£С12, NaCI я KCl практически ке влияли на актив-

т

кость, a Ся$04 в концентрации ЮМ подавляла ее на 51$.

Рис. 8 Влияние ионов металлов на АФБ целлилолатического комплекса ЦАБР при температуре 50°С

3.5 Разработка стадии сушки препарата Поскольку активным началом препарата Целлобактерин явля-тся жизнеспособные клетки ЦАБР, обладающие достаточной цел-аполитической активностью, при разработке стадии сушка пре-зрата был выбран э качестве контрольного показателя титр

аианеспоообных клеток ЦАБР. Снижая потере жизнеспособных бактерий в процессе обработке, одновременно учитывали свой- , отва цвллвдолятйческого кодалекое ЦАБР, изученные ранее, в данные термограммы ЦЛБР (рио.9), полученные методом Стерна и Проктора о использованием запаянных капиляров (Тутова,1987).

ко 30 60 то во Рис.9 Термограша ЦАБР. Время выдерживания: I- 10 о; 2- 60 с; 3- 300 о

*ос

Для сушки препарата бил использован метод распылительного высушивания. При оушке этим методом длительность сушке мала, пребывание препарата в сушильной камере ограничивается 5-8 с , несмотря на высокие температуры препарат не нагревается более 35-40°С» .

На потери активности в процессе сушки препарата оказывает влияние ряд факторов. Наиболее существенные- рН среды, температурный режим сушки, наличие стабилизаторов и наполнителей, исходная концентрация сухого вещества в высушиваемой жидкости. Наиболее оптимальна концентрация сухих ве.цоств-10? (Тутова,198?;Карпов,19ъ2). Исходя из этого, и учитывая то, что готовая культуральаая жидкость-имеет содержание сухих ведеств 4,4 % , предлагается внести'в культуральную

жидкость перед высушиванием наполнитель- кукурузную муку в количестве по сухим веществам, что обеспечит содержание сухих веществ в культуральной жидкости перед сушкой 101. ! ■' На лабораторной распылительной сушилке были проанализированы три температурных режима сушки препарата: 120/60, 135/70, и 150/80. Величина рН среда нагрева варьировалась в диапазоне 4,5+7,0. В качестве стабилизаторов для сушки бактерий использовали KCI, WaCI, СаС^ и MgS04 в концентрации КГ3* Ю-1 U.

На основании проведенных исследований предлагаются следующие уоловия сушки препарата Целлобактерин: температурный

режим сушки - 135/70°С, рН среда нагрева - 6,5, стабили за—?

тор - MjS04 в концентрация 10 М, наполнитель - кукурузная мука - 5,6^, приэтом выход жизнеспособных клеток в препарате составит 6В%, выход КМЦ-осахарявающеЙ активности-180$, выход АФБ-163? от исходных в культуральной жидкости.

Подобное увеличение целлюлолитической активности в процессе суш. , препарата может быть вызвано рядом причин: активацией ферментного комплекса ионом , вносимым в качестве стабилизатора; освобождением молекул фермента, связанным с разрушением клеточных стенок бактерий, а также |частйчноЙ диссоциацией целлюлосом в процессе сушки.

Разработанная аппаратурно-технологическая схема производства препарата Цедаобактерян включает: приготовление питательной среды и посевного материала, ферментацию, внесение стабилизатора и наполнителя, высушивание, стандартизацию и фасовку готового препарата (рис..10).

Испытание технологии проводилось в условиях биохимического завода г. Унгены (Молдова). Ферментация проводилась в аппаратах объемом 16 м с коэффициентом заполнения

Рис.10. 1-9 - бункеры дозаторы дня компонентов питательной среды; 10 - транспортер;

II - дробилка; 12ДЗ сборник смеситель; 14 греющая колонка; 15 - видерживатедь; 16 - теплообменник; 17 инокудятор; 18 - ферментер; 19 - сборник-смеситель для КЖ; 20 - распылительная сушилка; 21,22 - бункер-дозатор; 23 - смэсатвдь; ¿А - бункер-доаатор для готового продукта; 25 - фасовочное оборудование.

0,8, Выход готового препарата после стандартизация ооотавил 828 кг с I м3 культуральной жидкоотя. Препарат имеет оледую-

о

вде характеристики: титр жвзнеопособных бактерий - 4,2*10 кл/г, целлюлолнтическая активность по Хендерсону - влажность -8,4 %. Препарат также обладает пектолитичеокой и пектинвстераз-ной активностями.

Эффективность применения Целлобактерина изучена в опытах на молодняке крупного рогатого скота. При ежедневном скармливании препарата увеличивается потребление и усвояемость животными грубого корма в рубце, повышается количества бактерий, гидролвзующих целлюлозу, гемицвллюлозу я пектиновые вещества, возрастает общая целлюлолитическая активность рубцовой микрофлоры, понижается уровень пропионовой и масляной кислот. При нормах скармливания препарата телятам при доращивании и откорме - 30 г/сутки на одну голову, прибыль /и одну голову составила 3638 рублей.

В процессе хранения препарата при комнатной температуре в течение 6 месяцев происходит снижение титра жизнеспособных клеток на 27,3% , целлшолитйческой активности по Хевдерсону - на 21,0£.

ВЫВОДЫ

1. Изучены основные закономерности роста ЦАьР при культивировании 1п iMtro .

2. Разработан состав технологичной питательной среды для культивирования ЦА6Р, позволяющий получить ассоциацию с более высокой способностью к синтезу целлшолитическиж ферментов при сшленив затрат на реактивы в 3,5 раза.

3."Выбран элективный режим культивирования ЦШ>: перагура культивирования - 37°С, pli среда - 7,0, дмтель-

' * 23

ность культивирования - 72 часа, посевной материал в возрасте 48 часов, в количестве 5Я.

4. Изучены основные свойства целлшаэного комплекса ЦАБР. Установлено, что целлшолитический комплекс ассоциации

наиболее стабилен при рН 6,0+6,5 и температуре ниже 50°С; комплекс активируется ионами Са+^, Ре+2, Со+2, Zn¥'¿

в концентрации 10~2 М и ингибируерся ионом Си*г в концентрации КГ* М.

5. Получены характеристики термоустойчивости ЦАБР в различных температурных режимах.

6. Выбран эффективный режим распылительной суши препарата ЦАБР- Целлобактерина: температурный режим - 135/70°С,

рН среды нагрева-6,5, стабилизатор в концентрации

о

10 Ы, наполнитель - кукурузная мука в количестве 5,6$ по сухим веществам.

7. На основании проведенных исследований подготовлена научнотехническая документация, разработан опытно-промышленный регламент, разработаны и утверждены технические условия на препарат микробный - ЦеллоЗакгсрии.

В. Технология получения препарата апробирована в опыгно-промшшюшшх условиях Унгенского биохимического завода и подтверждена актом испытаний.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы следующие лестные раЛоты:

1. Грачева И.М.,Каптере В.М..Гаврилова H.H., Рождественская М.В., Князева Н.Ю., Быстрова И.А.., Тараканов Б,В., Николичева Т.А. Способ получения препарата целлюлолитичес-кой ассоциация бактерий рубца.- а.о. # I78I297 (29.08.91)

2. Гаврилош H.H., Рождественская М.В., Быотрова H.A., Князева Н.Ю, Влияние температуры и pH на метаболизм цел-люлолаэйческих бактерий рубца жвачных животных.// Рукопиоь деп. во ВН№СЭНТИ НПО Ыедбиоекономяка.-Указатель деп. рукописей I990,-^,-o.I06

3. Гаврилова H.H., Быотрова H.A..Князева Н.Ю.,Рождественская М.В. Препарат Цвдлобактериа - стимулятор роста молодняка крупного рогатого скота.// Тез. докл. Всес. конф.

" Микроорганизмы - стимуляторы и ингибитора роста растений и животных". Ташкент, 3-5 октября 1989.-о.40

4.. Гаврилова H.H., Князева Н.Ю..Быотрова H.A., Навмятул» лина Г.А., Тараканов Б.В., Никшшчещ Т.А. Перспективы использования целладаз бактерий симбионтов желудочно-кишечного тракта жвачных живогныху/Гез. докл. Всес. научно-практической конференции "Ферменты - народному хозяйству", Черновцы,12-16 ноября 1990.-о.18

5. Гаврилова H.H., Князева Н.Ю., Быстрова ¿i.A., Тараканов Б.В., Николичева Т.А. Новый микробный препарат пробио-тического действия// Тез. докл. Всес. конф. "Микробиологические и биогехяологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства".- Алма-ата .ноябрь 1990.•■c.Id

6. Князева Н.Ю., Гаврилова H.H.,Быстрова Л.к,, Тараканов Б.В., Николичева i'.A. Технологические ириеш иолученаа

25

[фанарата Цвллобактерий// Тез, докл. международной конф.

%аологвчвские основы выоокЪй продуктивности сельскохозяй-v h • ' • cTfeçnnux животных.-Калуга,сентябрь 1990,-с.121

7. Гаврилова H.H., Князева Н.Ю., Быстрова И.А. Влияние природы и концентрации источника углерода на активность ферментного кймплекса цвллшолитичеоких бактерий рубца.// Tes. докл. 3-еЙ Всесоюзной конф."Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточйой отенки',-Казань,1990.-о.110

8. Грачева И.М., Гаврилова H.H., Князева Н.Ю., Быотро-ва H.A., Невмятуллина Г.А. Разработка технологии производства препарата Целлобактеряв для молодняка сельскохозяйственны} животных.// Тез. докл. научной конф., посвященной 60-летию MTKffl по проблеме "Научное обеопечение хранения и парерабош растительного оырья в пищевой промышленностиМосква Д991.-оЛО