Разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов и применения их для интенсификации процессов культивирования дрожжей

Максимова, Екатерина Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов и применения их для интенсификации процессов культивирования дрожжей
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов и применения их для интенсификации процессов культивирования дрожжей"

На правах

Максимова Екатерина Вячеславовна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТИНОВЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ И ПРИМЕНЕНИЯ ИХ ДЛЯ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОЦЕССОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ

Специальность 03.00.23 - Биотехнология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2009

003460901

На правах рукописи

Максимова Екатерина Вячеславовна

Специальность 03.00.23 - Биотехнология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Открытом акционерном обществе «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (ОАО «ГосНИИсингезбелок»)

Научный руководитель:

доктор биологических паук, профессор Воробьева Галина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович

кандидат технических наук, Оверчепко Марина Борисовна

Ведущая организация: Российский химико-технологический

Университет им. Д.И. Менделеева (РХТУ им. Д.И. Менделеева) кафедра биотехнологии

Защита состоится 20 февраля 2009 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу. 14U42, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, ВНИТИБП, E-mail: vnitibp @ mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности.

Автореферат разослан 19 января 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последние годы во всем мире пристальное внимание уделяется биотехнологическим процессам, в которых целевые продукты синтезируются в ходе жизнедеятельности клеток микроорганизмов. В этом плане значительный интерес представляют дрожжи, поскольку для них характерны достаточно высокие темпы роста, быстрое накопление биомассы и белка, а в связи с достаточно большими размерами их клеток они удобны для использования в промышленных масштабах. Дрожжи можно рассматривать также как источник для получения таких целевых продуктов, как этанол.

Одной из предпосылок разработки интенсивных технологических процессов получения биомассы и целевых продуктов метаболизма является обеспечение максимальной скорости роста культуры при минимальном содержании субстрата на выходе из ферментера, т.е. максимальная продуктивность ферментера должна коррелировать с полнотой исчерпания субстрата и минимальным накоплением в среде побочных продуктов метаболизма. Интенсификации процесса биосиитеза биомассы и целевых продуктов при использовании дрожжей способствует введение в питательную среду биостимуляторов.

В настоящее время разработка технологий получения и применения высокоэффективных биостимуляторов чрезвычайно актуальна, главным образом, для крупнотоннажных производств. Это объясняется тем, что использование их позволяет получать значительный экономический эффект без каких-либо затрат на введение дополнительного оборудования и изменения технологических схем производства. При этом было выявлено, что наиболее эффективно использование композиционных биостимуляторов, включающих ряд биологически активных компонентов, синергически усиливающих действие друг друга. В этом плане оказалось перспективным включение в состав таких композитов водорастворимых хитиновых олигосахаридов (ХОС) со степенью полимеризации 3-8, получаемых прямой деполимеризацией хитина. В связи с этим разработка методов их анализа, оптимизация технологии их получения и использование для интенсификации биотехнологических процессов представляет научный интерес и имеет важное практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов, научное обоснование их включения в состав композиционных биостимуляторов для создания высокопроизводительных биотехнологических процессов культивирования дрожжей ЗассИаготусеБ сегеу1$!ае на гидролизатах зерносырья.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- разработка новой, упрощенной методики анализа водорастворимых продуктов, образующихся в результате деградации хитина;

- проведение исследований по разработке эффективной технологии получения олигосахаридов хитина (хитодекстринов - ХД) на основе сернокислотной деградации хитина крабов и разработка принципиальных схем получения различных продуктов на основе получаемого гидролизата;

- наработка в камеральных условиях партий хитиновых олигосахаридов и проведение испытаний на их безвредность, безопасность и биологическую активность;

- исследование влияния хитиновых олигосахаридов на процессы генерации дрожжей ЗассЬагошусев сегеу1$1ае и сбраживания зернового сусла, а также на рост овощных культур;

- разработка высокоэффективных композиционных биостимуляторов роста дрожжевых клеток и спиртообразования, включающих биологически активные хити-

новые олигосахариды;

- апробация и внедрение основных результатов исследований в промышленных условиях культивирования дрожжей ЗассЬаготусез ссгеу|51ае.

Научная новизна работы заключается в создании нового направления в исследованиях, касающихся интенсификации процессов получения биомассы дрожжей ЗассЬаготусез сегеуЫае повышенной биологической ценности, а также продукта жизнедеятельности дрожжевых клеток - этанола, с использованием композиционных биостимуляторов (КБС). При этом в процессе исследований получены новые научные результаты.

Разработана новая упрощенная методика оценки содержания водорастворимых хитиновых продуктов, получаемых в результате как кислотного, так и ферментативного гидролиза хитин- хитозанов. Показана принципиальная возможность получения в одну стадию водорастворимых биологически активных олигосахаридов хитина с оптимальной степенью полимеризации (3-8),- хитодекстринов (ХД) с широким спектром биологической активности. Установлено стимулирующее действие ХД на рост дрожжевых клеток, спиртообразование, а также на рост овощных культур и прорастание семян. Научно обоснована необходимость разработки и состав композиционных биостимуляторов роста клеток на основе отобранных в процессе скрининга биологически активных соединений, способных интенсифицировать метаболизм дрожжевых клеток. Впервые выявлено стимулирующее действие высокоэффективных КБС на процессы дрожжегенерации и спиртового брожения при культивировании дрожжей ЗассЬаготусез сегеу151ае на средах с зерновым суслом; показано, что использование КБС в сверхмалых дозах оказывает стимулирующее действие на физиологическую активность, морфофизиологическое состояние, рост и размножение, продуктивность и бродильную способность этих дрожжей. Установлено существенное увеличение общей активности КБС по сравнению с суммарной активностью отдельных компонентов при значительном снижении удельного расхода последних за счет их синерги-ческого действия.

Практическая ценность работы заключается в разработке и практической реализации высокопроизводительных, энерго- и ресурсосберегающих биотехнологических процессов получения высококачественной биомассы дрожжей ЭассЬаготусез сегеуЫае и этанола с использованием композиционных биостимуляторов роста клеток:

Разработана эффективная технология прямой деполимеризации хитина панцирей крабов действием на него концентрированной серной кислотой. Разработаны технологическая схема получения на основе гидролизага хитина водорастворимого биологически активного препарата - хитодексгрин-1 (ХД-1) и безотходная технологическая схема, позволяющая создать экологически чистое производство с ресурсосберегающей технологией частично растворимого биологически активного препарата - хи-тодекстрип-2 (ХД-2, или солихит).

Выявление значительной биологической активности хитиновых олигосахаридов позволило широко рекомендовать их использование в различных областях народного

хозяйства в качестве активного стимулятора роста и развития растений, молодняка животных и птицы, бифидобактерий, дрожжевых клеток, процессов спиртообразова-ния.

Использование КБС в условиях крупнотоннажных производств получения биомассы и этанола позволяет получать значительный экономический эффект без каких-либо затрат для введения дополнительного оборудования и изменения технологических схем производства. Так, внедрение КБС при производстве кормового белкового продукта «Провита» на Новополоцком заводе БОК (Республика Беларусь) позволило

существенно улучшить все технологические показатели производства, улучшить качество биомассы дрожжей-сахаромицетов и получить годовой экономический эффект от использования КБС-1 в размере 352 млн. руб./год, а от КБС-2 - 645 млн. руб./год.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: IV Всероссийской конференции «Производство и применение хитина и хитозана», ВНИРО, Москва, 25-28 апреля, 1995, 57-59; IV съезде общества биотехнологов России, Пущино, 6-7 декабря, 2006; Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва, Россия 11-13 марта 2008.

Публикации. Материалы диссертации отражены в 9 печатных работах, в том числе получен патент РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, экспериментальной части, изложенной в 5 главах; выводов и списка литературы, включающего 239 работ, том числе 181 отечественных и 58 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 5 рисунками, изложена на 143 страницах машинописного текста.

Глава 1. Обзор литературы.

В обзоре литературы отражены публикации по компонентному составу и проницаемости клеточных стенок дрожжей, интенсификации роста дрожжевых клеток с использованием биостимуляторов, а также по биологически активным препаратам на основе хитина панцирей ракообразных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. «Материалы и методы исследования»

Объекты исследования - дрожжи Saccharomyces cerevisiae; хитин морских крабов.

Культивирование дрожжей осуществляли в лабораторных условиях (качалоч-ные колбы объемом 750 смЗ со 100 см3 стерильной питательной среды), камеральных условиях - при периодическом и непрерывном режимах в аппаратах интенсивного массообмена объемом 5 и 10 дм3, снабженных системами автоматического поддержания и регистрации 02 и СОг, системами автоматического дозирования среды и системой измерения подачи воздуха. Промышленные испытания вели в соответствии с действующими регламентами, как в контрольный, так и опытный периоды.

Для анализа субстратов, промежуточных и целевых продуктов использовали общепринятые химико-аналитические и биохимические методы анализа. Для характеристики хитиновых олигосахаридов использовали метод гель-хроматографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Разработка метода измерения гексозаминов в хитиновых гидролизатах для химической характеристики их качества

В традиционных химических анализах хитиновых продуктов обычно используют две стадии: гидролиз до мономера и измерение мономера подходящим методом. Условия обработки материала на обеих стадиях анализа могут сильно различаться, из-за чего вводят дополнительные операции (выпаривание, разбавление и др.), делающие его громоздким и трудно реализуемым при массовых анализах. Цель данного исследования состояла в создании упрощенного метода анализа гексозаминов. Для приспособления известных колориметрических методов (Моргана-Элсона; Элсона-

Моргана) к решению задач первичной оценки качества кислотного гидролизата хитина потребовалось внести в методику анализа ряд изменений, которые были направлены на упрощение процедуры анализа и на обеспечение надежности результатов. Это стало возможным при осуществлении обеих стадий в одной и той же пробирке, благодаря использованию одинаковых малых объемов (по 0,2 мл) всех растворов, азео-тропной смеси HCL, в которой концентрация HCL равна 6 М, а также применению приема неполной нейтрализации кислотного гидролизата водорастворимых хитиновых соединений вследствие пониженной концентрации раствора NaOH (5,5 вместо 6,0).

Время гидролиза (3 часа при 100°С) достаточно для максимального образования глюкозамина (ГА). Рабочий интервал количества аминосахара составляет 20-200 мкг (рис. 1). Относительная ошибка ± 5% при малых величинах.

На основании проведенных исследований разработана методика колориметрического анализа гидролизатов хитина для химической характеристики их качества.

МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ ГЕКСОЗАМИНОБ

Рисунок 1. Калибровочные графики, полученные с использованием колориметрии по Элсону-Моргану (а) и по Шомоди-Нельсону (б) для ГА (1), АГА (2) и -изопроиилового гликозида АГА (3) при проведении анализа по полной двухстадий-ной схеме (гидролиз и колориметрия). Точки, обозначенные треугольниками, соответствуют анализу ГА без стадии гидролиза, т.е. нагревания в растворе кислоты.

Глава 4. Исследование процессов глубокой деградации хитина с целью получения новых олигосахаридных препаратов на основе его гидролизатов

Хитин обладает очень прочной структурой, а потому получение из него ценных продуктов и применение их в здравоохранении и народном хозяйстве может оказаться рентабельным лишь при наличии следующих условий: 1 Использование достаточно эффективной технологии для их получения, 2)проявление ими значительной биологической активности и 3)практически полная их безопасность.

Впервые способ деполимеризации хитина с использованием концентрированной серной кислоты, позволивший получать фракцию биологически активных водорастворимых хитиновых олигосахаридов (ХОС) был предложен Максимовым В.И. (Максимов В.И., 1990;1993). В соответствии с этим способом гидролиз хитина проводили 65%-ной серной кислотой при весовом соотношении хитина и кислоты 1 : 2,7 -10, при 40-50°С в течение 90-120 мин. Недостатком этого способа были большой расход реактивов и, прежде всего, серной кислоты, а также трудности в процессе ней

трализации (образование объемного осадка, появление устойчивой пены и др.) и последующем выделении готовых продуктов. При снижении объема кислоты снижался выход растворимого продукта при увеличении выхода нерастворимого материала. В связи с этим в дальнейшем с целью снижения расхода серной кислоты для получения ХОС способ деполимеризации хитина был нами модифицирован (патент № 2126012), в результате чего была разработана новая, более экономичная и эффективная технология получения биологически активных олигосахаридов хитина.

Сущность разработанной новой технологии заключается в том, что р способе получения ХОС, включающем обработку хитина раствором концентрированной серной кислоты при нагревании и выделение целевого продукта, хитин в реакционную смесь вносят частями, добавляя каждую последующую часть после разжижения предыдущей при 40-50°С в течение 90-105 мин. (рис. 2), при весовом соотношении хитина и кислоты 1 : 1,1-2,5.

Растворимые ХОС, %

№

40 30 20 10 0

\ А

О 6| 12| 18| 24| 301 36| 42| 48| 54| 60| 66\ 72| 78| 84| 90| * Дополнительная подача хитина время,мин.

Рисунок 2. Гидролиз хитина 65%-ной серной кислотой при поэтапной его подаче в процесс; *- дополнительная подача хитина; " - динамика изменения температуры; л - образование растворимых ХОС.

При увеличении температуры или времени сверх указанных пределов меняется структура осадка, получаемого при добавлении ацетона к гидролизату хитина (осадок становится рыхлым, некомкующимся), что затрудняет его отделение от ацетоново-сернокислотной смеси, а, главное, ухудшается качество продуктов гидролиза, т.к. в них начинают преобладать моносахарид и низкомолекулярные олигосахариды.

В соответствии с этой технологией исчезло появление устойчивой пены и образование объемного осадка при нейтрализации, существенно облегчалось пере

мешивание гидролизата и последующее выделение готовых продуктов (олигосахари-дов).

Для определения степени полимеризации получаемых хитиновых олигосахари-дов использовали метод гель-хроматографии (рис. 3).

Анализы гидролизатов хитина проводили по разработанной методике измерения гексозаминов; количество гексозамина в препарате выражали в ацетилглкжоза-миновых эквивалентах.

мм

Рисунок 3. Гель-хроматография солянокислого гидролизата хитина на акрилексе Р-2 (3,2x16 см) Внизу - график зависимости объемов элюирова-ния от логарифма молекулярных масс для фрак-ци гидролизата.

На рис. 3 приведена хроматография гидролизата хитина, концентрация гексозаминов в котором составляла 1,1%. Для последних пяти пиков получена линейная зависимость логарифма молекулярной массы оли-госахаридов от объема элюирования. Экстраполяцией этой прямой найдены объемы элюирования для олигомет-ров со степенью полимеризации 6, 7 и 8. Отсутствие четких пиков в этой части хроматограммы может быть следствием их агрегации. Суммарное количество последних трех фракций (тримера, димера и мономера) не превышало 40% от суммарного количества полученных после хроматографии олигосахаридов.

На основе хитинового гидролизата, получаемого по нашей технологии, были отработаны 2 технологические схемы, одна из которых имеет стадии фракционного разделения реакционной смеси, другая представляет собой получение смеси продуктов реакции без их разделения. При этом для выделения целевых продуктов по-разному проводятся отделение кислоты или её нейтрализация.

В соответствии с первой схемой (рис. 4) значительная часть кислоты удаляется декантацией после расслаивания при добавлении ацетона к реакционной смеси. Отделяется также коллоидный хитин из оводненной смеси. Продукт, получаемый после нейтрализации раствора олигосахаридов и удаления сульфата кальция, называется хитодекстрин - 1 (ХД-1), который на 60% состоит из растворимых аминосахаров с низким содержанием (7-8% в расчете на аминосахара) мономера, И-ацетил-Д-глюкозамина. Общий выход хитодекстрина, рассчитанный по растворимым аминоса-харам, - 35% от взятого хитина краба.

Значительно более высокий выход вещества получается по второй схеме (рис. 5), которая представляет собой упрощенный вариант переработки хитина. Получаемый по этой схеме без фракционирования реакционной смеси продукт называется хи-тодекстрин-2 или солихит (ХД-2). Условия гидролиза остаются те же, что и при получении хитодекстрина-1. Для обработки реакционной смеси кислоту нейтрализуют добавлением СаС05 в количестве 1 г на 1 мл 65%-ной серной кислоты.

Отличием схемы производства «Солихита» является лишь то, что не производится отделение коллоидного хитина и центрифугирование с целью выделения сульфата кальция.

При необходимости из солихита экстракцией в воду и последующей сушкой можно получить смесь продуктов неполной деполимеризации хитина в сухом виде, которая подобна ХД-1 по растворимости, по расщепляемости хитиназой и кислотой. Солихит, как и ХД-1, обладает биологической активностью.

При реализации этого способа оказалось, что при добавлении воды к хитину, обработанному кислотой в соответствии с этой технологией, почти весь хитиновый материал остается водорастворимым. Растворимость его в воде сохранилась и после нейтрализации кислоты и высушивания. О сохранении степени растворимости судили по количеству хитинового материала, перешедшего в воду.

Выход водорастворимой части хитина оказался выше 75% по сравнению с хи-тодекстрином - 1 (30 - 50%). Очень важным преимуществом является полное отсутствие твердых и жидких отходов от производства. Присутствие сульфата кальция в солихите не отражается на его биологической активности, о чем свидетельствуют, например испытания по бифидостимулирующему действию его на микрофлору кишечника животных и ростстимулирующему действию на дрожжи.

65%-ный водный раствор

серной кислоты --►

6-7 объемов ацетона на I объем р-ра кислоты

Хитин

Смесь I .Деполимеризация ингредиентов

Кислый гидр оли чат

2. Расслаивание

Ацетон в п. Ке 2

Осветленный р-р ацетона + кислоты

Вода

Раствор олигосахарндов с осадком хитина

3. Перемешивание

Раствор кислоты в п.№ I

4.Центрифугирования

Оводнеиная смесь

№алок коллоидного хитина /отход № 1/

Готовый «Хитодекстрин» на склад

5. Нейтрализация

Раствор б.Фильтрация олигоса-ридов с осадком

Са504

осадок /отход № 2/

Расфасованный препарат 9. Упаковка

7. Высушивание

^ Раствор

олигосахаридов

_Сухой

препарат

8. Расфасовка

Рисунок 4. Принципиальная технологическая схема производства хитодекстрина-1.

65%-ный водный раствор серной кислоты

. Деполимеризация

Смесь ингреди-

Вода

СаС03

Кислый 2. Нейтрализация гидроли-

Нейтра- 3. Высушивание лизованный гидролизат

Сухой 4. Измельчение препарат

Сухой 5. Расфасовка порошок или таблетки

Расфасо- 6. Упаковка

ванный

препарат

Сухой ((Солихит» на склад готовой продукции

Рисунок 5. Принципиальная технологическая схема производства препарата ХД-2 («Солихит»),

Оба продукта (ХД-1 и ХД-2) различались как по способу их получения, так и по химическому составу (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика основных показателей хитодскстринов (ХД-1 и ХД-2)

Показатель Состав ХД, %

1 2 (солихит)

Насыпная масса хитина, см3/г 4,5 4,5

Выход растворимых аминоса-

харов, от массы хитина, % 30-35 63-65

Содержание в продукте, %:

водорастворимые

аминосахара 60-70 14-15

мономер

(ацетилглгокозамин) 4-6 1,4-1,5

коллоидныи хитин 0 12-13

сульфат кальция 3-5 57-60

вода 20-25 15-16

В зависимости от необходимости решения поставленных перед нами задач получали либо препарат хитодекстрин-1, либо хитодекстрин-2 (солихит).

Установлено значительное снижение расхода реактивов при получении обоих продуктов на основе новой технологии (табл. 2).

Таблица 2. Удельный расход реактивов при поэтапной подаче хитина _в процесс его гидролиза_^_

Получаемый продукт Использованы реактивы Получено Водорастворимых ХОС, г Расход реактивов (на 1 г водорастворимого материала) Соотношение: хитин/ кислота, г/г

хитин, г Н2804, г ацетон, см3 Н2504, г ацетон, см3 хитин, г

ХД-1 3 9 48,6 1,06 8,5 46 2,83 1:3

хд-1 3 +3 9 45 1,56 5,8 29 3,8 1:1,5

ХД-2 3 +3 9 - 2,1 4,3 - 2,9 1:1,5

Таким образом, по предложенному ранее способу в расчете на 1 г получаемого водорастворимого хитодекстрина расход 65%-ной серной кислоты составлял 8,5 г, ацетона - 46 см3; по новой технологии соответственно - 5,8 г и 29 см3, т.е. экономия кислоты и ацетона составляет 39 и 33% соответственно. Расход кислоты на получение 1 г солихита составил 4,3 г. Снижается и количество карбоната кальция (СаСОз), который расходуется для нейтрализации раствора.

Глава 5. Характеристика биологической активности хитиновых олигосахаридов (хитодекстрина)

Хитиновые олигосахариды, получаемые по разработанной нами технологии, относятся к натуральным продуктам, поскольку их получают непосредственно из животного сырья. Соединения глюкозамина являются естественными компонентами реакций обмена веществ человека, т.е. они являются биосовместимыми и биодегради-руемыми. В то же время они являются оригинальными препаратами, не имеющими аналогов за рубежом. В связи с этим препарат Хитодекстрин подвергся испытаниям

в большом объеме на биологическую активность и, прежде всего, на безвредность и безопасность, для чего был привлечен ряд специфических лабораторий в различных институтах: НПО «Биотехнология» - лаб. «Фармакологии»; лаб. «Токсикологии»; лаб. «Оценки репродуктивной безопасности лекарственных средств»; лаб. «Прикладной иммунофармакологии»; Ивановский гос. Медицинский институт; Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского; детская клиническая больница (Центральная медсанчасть - ЦМС -119) и другие. На основании проведенных исследований, исходя из классификации токсичности веществ, ХД отнесен к веществам «относительно безвредным». Были сделаны следующие выводы: не выявлено ни острой, ни хронической токсичности, местного раздражающего действия, местного действия на слизистые глаз и носа, а также кожно-раздражающего действия; ХД не обладает способностью сенсибилизировать организм животного; не выявлено эмбриотоксического и тератогенного действия (общее состояние животных не отличалось от контрольных, а прибавление массы тела было более значительным). Экспертизой комитета по канцерогенным веществам при Гос-комсанэпиднадзоре России дано разрешение на клинические испытания хитодекстри-на без изучения его канцерогенных свойств (>1К 16а/93 от 8.04.93).

Полученные результаты позволили научно обосновать области применения хитодекстрина (табл. 3).

Таблица 3. Основные области применения хитодекстрина

Препарат вещество Биологическая эффективность Области применения

Хитиновые олигосахариды (хитодекстрин). Стимуляция иммунитета. Нормализация кишечного микробиоценоза 1. Противоопухолевое действие. 2. Противоинфекционное действие. 3.Стимуляция устойчивости растений (повышение урожайности). 4. Дисфункция кишечника. 5. Опухоль толстой и прямой кишки. 6. Инфекционные заболевания (пневмония и др.). 7. Геронтологические заболевания (гиперам-монизация и др.). 8. Аллергия. 9. Болезни животных. 10.Противоожоговое и противораневое действие (хирургия, дерматология, косметика и др.)- 11. Источник N-АГА в организме. 12. Профилактическое средство от остеопоро-за. 13. Снижение уровня холестерола в крови. 14. Бифидогенная активность (in vitro достигнуто 100-кратное увеличение биомассы бифи-добактерий; in vivo - высокая эффективность в нормализации кишечного микробиоценоза).

__ 13_

15. Оздоровительная кормовая добавка в животноводстве и птицеводстве (при добавлении к композиционным кормовым добавкам ХД усиливал действие витаминов группы В, что проявлялось в достоверном увеличении привеса цыплят, снижении падежа молодняка с/х животных и цыплят и др.).

16. Биостимулятор роста растений (ХД превосходил гетероауксин и оксигумат торфа,

__взятые в качестве эталона)._

Механизмы действия биологически активных препаратов на основе хитина ракообразных.

Хитодекстрины, получаемые по разработанной нами технологии, принципиально отличаются от хитозана по следующм показателям: 1) они практически не имеют заряженных групп и растворяются в воде без добавления кислоты; 2) они не относятся к полимерам, т.к. в молекулах хитодекстрина остается от 2 до 8-9 мономерных звеньев.

Молекулярные механизмы действия ацетилированных (хитодекстрины) и не-ацетилированных хитиновых соединений (хитозаны) могут различаться принципиально (Шэеп, 1989; ОгоэзкоГ^ 1991); для хитозана: 1 -поликатионный и 2-взаимодействие его фрагментов, получаемых, например, ферментативным гидролизом хитозана, с рецепторами клетки; для хитодекстринов. 1 - взаимодействие с рецепторами клеток (результат - активация метаболизма клеток). 2 - использование 14-ацетил - Д - глюкозамина в качестве структурообразующего элемента (результат -ускоренный биосинтез основных структур клетки).

Глава 6. Интенсификация биотсхнологических процессов культивированя дрожжей ЗассИаготусея сеге\Т81ае с использованием композиционных биостимуляторов роста клеток

6.1. Исследование влияния хитиновых олигосахаридов на процессы генерации дрожжей ЗассЬаготуссэ сегеу1$1ае и сбраживания зернового сусла

6.1.1. Действие солихита на рост дрожжей. Поскольку был выявлен широкий спектр активностей, которые проявляли хитиновые олигосахариды, представлялось интересным испытать их стимулирующее действие в биотехнологических процессах культивирования дрожжей ЗассЬаготусев сегеу1$1ае. В этом плане наиболее перспективным с точки зрения последующего использования в условиях крупнотоннажного производства является хитодекстрин-2 или солихит, получаемый по экономичной и безотходной технологии. Как видно из таблиц 4 и 5, солихит оказывает стимулирующее действие на рост биомассы дрожжей как на среде с мелассой, так и с гидролиза-тами зернового сырья, что проявляется в увеличении концентрации биомассы, повышении содержания в ней белка и более глубоком снижении РВ.

Максимальное действие ссшихита наблюдается при подаче его в количестве 5 ' 10"3 "5 10'5% к объёму питательной среды.

Таблица 4. Влияние солихита на рост дрожжей ЗассЬаготусев сегеуЫае сНа51аИси8 ВКПМ-у-1218 в лабораторных условиях (среда с мелассой, 45

г/л)

Концентрация солихита, % Биомасса Сырой протеин

% % отн. % % отн.

- 1,78 . 25,3 -

5 10"3 2,12 19,1 26,4 4,3

5 10" 2,11 18,0 26,9 6,3

5 10"5 2,08 16,8 26,7 5,5

5 10"6 1,81 1,7 26,2 3,5

Таблица 5. Действие солихита на рост дрожжей вассЬаготусез ссгел^ае <На$1а1ки$ ВКПМ-у-1218 в лабораторных условиях на среде с зерновым сырьем (дерть + пшеничные отруби 70:30, г/м 1:7,)

Концентрация солихита, % Биомасса РВ Сырой протеин

% % отн. г/100 г % отн. % % отн.

- 5,18 - 0,43 - 27,1 -

Г Ю"4 5,48 5,7 0,31 -27,9 29,0 7,0

1 Ю'5 5,34 3,1 0,32 -25,6 28,4 4,8

6.1.2. Действие солихита на процесс спиртообразования

Повышение эффективности спиртообразования в процессе сбраживания сусла дрожжами связано с интенсификацией развития и размножения дрожжевых клеток. Это может быть достигнуто как за счет усиления глубины ферментативного расщепления полисахаридов зерносырья, так и за счет значительного повышения физиологической активности и бродильной способности дрожжевых клеток при использовании биостимуляторов.

Как видно из таблицы 6., солихит проявляет биологическую активность, оказывая стимулирующее действие на процесс спиртообразования на среде с зерновым суслом (увеличивается концентрация спирта, снижается содержание несброженных углеводов, отмечается тенденция к увеличению выхода спирта).

Таблица 6. Влияние солихита на бродильную активность дрожжей ВассЬаготусея сегеушас ОН-1 ВКПМ-у-2492 в лабораторных условиях на среде с ржаным суслом

Показатели Контроль Опыт

Время брожения, час.

48 72 48 72

Концентрация спирта, об.% 7,2 7,32 7,33 7,46

Выход спирта, (см3/100г крахмала) 63,91 65,0 65,01 65,4

% увеличения - - 1,10 0,62

Несброженные углеводы - РВ (г/100 см3) % отн. 0,637 0,506 0,608 -4,6 0,493 -2,6

6.2. Действие солихита на рост растений и прорастание семян

Результаты испытаний солихита, проведенных совместно с лабораторией агрохимии ВНИИовощеводства, свидетельствуют о его положительном влиянии на рост растений, что проявилось в 66%-ной прибавке биомассы таких овощных культур, как салат, (учет урожая через месяц) (рис. 6) и увеличении прорастания семян столовой свеклы на 57-60% (учет через 7 дней от начала засева) (рис. 7).

Прирост, % 20 60 50 40 30 20

Прирост, %

Шт.

40 40

30 30

20 20

10 10

Рисунок 6. Вегетационный опыт с сала- Рисунок 7. Энергия прорастания семян том столовой свеклы

контроль; Солихит- 0,01% Солихит-0,Г/о

контроль;

Солихит-0,0 Г/о

Солихит -

0,005%

Солихит

0,001%

6.3. Научное обоснование разработки композиционных биостимуляторов роста клеток

Таким образом, в результате проведенных исследований было сделано заключение, что хитиновые олигосахариды проявляют значительную биологическую активность и могут интенсифицировать биотехнологические процессы выращивания и спиртообразования при биоконверсии зернового сырья дрожжами Saccharomyces сеге-visiae. Однако для достижения максимальной производительности в условиях крупнотоннажных производств при использовании лишь хитодекстринов потребуется огромный его расход, а получение их в настоящее время налажено лишь в камеральных условиях. В связи с тем, что подавляющее большинство публикаций касалось интенсификации роста дрожжей Candida на сравнительно бедных синтетических средах, для разработки интенсивных технологических процессов культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на значительно более богатых средах, был проведен дополнительный широкий скрининг биологически активных соединений, оказывающих стимулирующее действие на рост дрожжей. Отобранные в процессе скрининга биостимуляторы отвечали практически всем требованиям, предъявляемым к стимуляторам (отсутствие токсичности; высокая эффективность; стабильность при хранении; относительно невысокая стоимость, транспортабельность; экологический аспект).

В то же время стало очевидно, что в условиях крупнотоннажного производства недостаточно было использовать данные, полученные с отдельными стимуляторами, поскольку расход отдельных компонентов был достаточно велик, а улучшение технологических показателей было не столь значительным. В связи с этим, мы поставили перед собой задачу разработать такие многокомпонентные биологически активные препараты синергического действия на клетки - композиционные биостимуляторы (КБС), которые представляли собой композиты, составленные из биологически активных соединений на молекулярном уровне, активирующих метаболизм дрожжевых клеток.

Разработанные нами КБС оказались достаточно высокоэффективными и очень ценными с точки зрения использования их в условиях крупнотоннажных производств биомассы и этанола. При добавлении КБС в сверхмалых дозах в состав питательных сред при культивировании дрожжей ЗассЬагошусев сегеУ1$1ае на средах с зерновым суслом отмечалось их стимулирующее действие на рост, размножение и бродильную способность этих дрожжей, что давало значительный экономический эффект. Остановимся на основных этапах по их разработке и теоретических предпосылках включения в их состав наиболее значительных компонентов.

1) В основу разработки таких КБС были положены известные данные, в которых выявлено, что среди стимуляторов видное место занимают прежде всего те, которые оказывают влияние на метаболизм клеточных стенок (КС) дрожжей. Это, по-видимому, связано с тем, что в процессе роста клетки для увеличения её размеров и интенсивности почкования требуется частичный распад КС и последующий их биосинтез. В связи с частичным (в силу малой дозы стимулятора) разрушением КС дрожжей (КСД), последние утоньшаются, становятся в целом более проницаемыми для компонентов питания.

2) Поскольку одним из наиболее «узких мест» в биосинтезе КС является биосинтез достаточно прочного ригидного глюкан-хитинового комплекса (ГХК), т.е. распад и биосинтез ГХК в значительной мере должен регулировать процесс размножения дрожжей, мы полагали, что для ускорения биосинтеза КСД в состав КБС желательно включать такие аминосахара, как глюкозамин (ГА) или ацетилглюкозамин (14-АГА), которые в богатой глюкозой углеводной питательной среде часто оказываются минорными, или эссенциальными компонентами. Однако оба моносахарида не обладают достаточной биологической активностью. В связи с этим, по всей вероятности, Наиболее «достойным кандидатом» на включение в состав КБС оказались биологически активные водорастворимые хитиновые олигосахариды (хитодекстрины), тем более, Что была выявлена их способность значительно усиливать биологическую активность других биологически активных соединений, в частности, витаминов группы В.

3) Введение в состав КБС антиоксидантов (АО) органической и неорганической

природы было обусловлено тем, что обычные промышленные культуры микроорганизмов в условиях интенсивной аэрации оказываются в угнетенном состоянии из-за перекисных соединений, образующихся в липидах при соприкосновении с кислородом воздуха. Этот факт имеет общебиологическое значение. Введение в питательную среду АО снимает это угнетенное состояние.

4) Учитывая, что дрожжи рода ЗассЬаготусев относятся к ауксогетеротрофным оргапизмам, для получения высоких технологических показателей необходимо было вводить, в частности, такие факторы роста, как витамины группы В.

5) И, наконец, очень важными компонентами КБС являются также фитогормо-ны, в частности, гиббереллиновые кислоты, основная функция которых заключается в регулировании очень малыми дозами основных метаболических процессов,

в которые входят различные ферменты, принимающие участие в регуляции обмена веществ на генном уровне.

На основании наших исследований был создан высокоэффективный композиционный биостимулятор (КБС), который состоял из разных биологически активных компонентов, синергически усиливающих действие друг друга, нами было установлено, что биологическая активность КБС существенно выше суммы активностей каждого из препаратов. Концентрация же каждого из стимуляторов в композите по сравнению с количеством, необходимым для достижения максимального эффекта при их раздельном применении резко снижается. Так, например, отдельно задаваемые фито-гормоны оказывали стимулирующее действие на рост дрожжей в концентрации I 10"7%, а хитиновые олигосахариды - в концентрации 1 10"3 - 1 10"!% к объему питательной среды. В составе КБС оптимальная концентрация для фитогормонов соответствовала 1 ' Ю"10 - 1 1 10"'2%, а для олигосахаридов хитина снизилась до 1 10"я%. При этом высокая активность КБС проявляется лишь при определенном количественном соотношении входящих в него компонентов; соотношение этих компонентов может несколько изменяться в зависимости от решения различных задач (такие КБС были названы нами КБС), КБС2 и др.).

6.4. Исследования влияния КБС на процессы выращивания и спиртообра-зования дрожжами ЗассЬаготусея ссгсушас на средах с зерноматериалами

6.4.1. Изучение действия КБС на рост дрожжей в лабораторных условиях Технология применения КБС была сначала отработана в лабораторных условиях. Как видно из таблицы 7., при введении композиционных биостимуляторов в питательную среду, содержащую в качестве субстратов различные зерноматериалы и их смеси, выявлено стимулирующее действие КБС на рост биомассы и её качество. При этом результаты существенно различались как в зависимости от состава питательных сред, ферментных препаратов, используемых для ферментативного гидролиза, так и условий ферментации. Различным было и время выращивания. Общим для всех вариантов культивирования дрожжей в присутствии КБС отмечается снижение рН, более глубокое снижение РВ, увеличение концентрации биомассы, увеличение содержания белка в биомассе.

Таблица 7. Получение белковых продуктов при выращивании дрожжей $ассЬагошусе$ ссгсушае сНа$1а^си$ ВКПМ-у-1218 в лабораторных условиях на гидролизатах зерносырья _с использованием КБС._

Питательная среда Вр е-мя вы ра-щн вами я (час) Стн-му-ЛЯ'ГО -ры Культуральная среда Биомасса

рН РВ остат. АСВ Сырой протеин

% % отн. % % отн. % % отн.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Измельченная рожь + пшеничные отруби (70:30), г/м 1: 7; ФП-0,05% глюкава-морин ГЗХ + 0,05 % пектофое-тидина П10Х 22 контроль КБС-1 4,63 4,2 0,32 0,16 -50 8,1 8,6 + 6,2 24,6 28,3 + 15,0

Дерть + кон- 4,4 0,9 - 5,66 - 28,4 -

пшеничные отруби троль

(30:70) г/м 1:7; 19

ФП-Сан-Ультра КБС-2 3,86 0,14 -84,9 6,64 + 17,3 34,0 + 17,9

ГЮ"5%

Рисовая мука + кон- 3,72 0,13 - 4,68 - 28,0 -

пшеничные отруби троль

(50:50) 15

ФП-0,2 глюкава- КБС-] 3,63 0,11 -15,3 4,98 + 6,3 32,9 + 17,5

морин ГЗХ

Ржаная мука; г/м 1:8; кон- 4,4 0,5 - 5,46 - 36,2 -

ФП-0,2% гл>ркава. 24 троль

морин ГЗХ КБС-2 4,36 0,4 -20 5,77 + 5,6 37,9 + 4,6

6.4.2. Испытания и внедрение КБС в промышленных условиях. Как видно из таблицы 8., в промышленных условиях введение в питательную среду с гидролиза-том зерносырья КБС|, позволяет существенно интенсифицировать процесс выращивания дрожжей, что проявляется в увеличении протока на 13 м3/час (24% отн.), увеличении суточной выработки дрожжей на 26 т/сутки (32% отн.). При этом улучшается качество готового продукта.

Введение в питательную среду в промышленный аппарат КБС2 приводит к дополнительному существенному улучшению всех технологических показателей и качества биомассы: проток возрастает на 21 м3/час, суточная выработка дрожжей увеличивается на 33 т/сутки, т.е. на 40%.

Таблица 8. Технологические показатели работы промышленного аппарата Ураб.= 495м3 при выращивании дрожжей 8асс11аготусе8сегеуЫлси1а5«а1ки5ВКПМ-у-1218 с использованием КБС в условиях РУП Новополоцкий завод БВК

Ва-рияит Проток Время выращивания АС В Расходный коэффициент по сырью Сырой протеин Белок по Барнштсйну Выработка дрожжей лев

М'/час Часы */. от. •/. % оти. V. % отн. % % отн. Т/сутки % отн.

г 3 4 5 6 7 8 9 10 13 14 15 16

Контроль 54 8,0 8.2 1,55 39,8 29 80,7 -

КБС, 67 7,2 -10 8,9 1,42 -8,4 41,2 +3,5 30,8 +6,2 106,7 +32.2

КБСг 75 6,6 17.5 8,6 1,37 11,6 42,1 +5,8 30,6 +5,5 113,7 +40,9

6.5. Исследование интенсификации процесса спиртообразования дрожжами ЗассЬаготусев сегеу!$1ае на средах с зерноматериалами с использованием КБС.

6.5.1. Испытания в лабораторных условиях.

Как видно из таблиц 9 и 10 и рис. 8., введение композиционного биостимулятора в концентрации 1 • 10""% к объему питательной среды приводит к интенсификации процесса спиртообразования дрожжами ЗассИагошусев сегеУ151ае на среде с пшеничным суслом.

Таблица 9. Испытание действия КБС в лабораторных условиях на процесс спиртообразования дрожжами 8ассЬаготусс^ ееге\'Ыае (Иа^аГкиг ОН-1 ВКПМ-у-2792

Вариант Дрожжи млн/мл СО; РВ 1-/1001 Спирт Спирт

% об. Выход спирта (см3/1(Юг крахмала) % об. Выход спирта {см3/Ю0г крахмала)

Время контроля, час

20 40 20 ■10 60 20 40 60 40 40 60 60

Контроль 43 80 6,02 10,5 10,9 4,7 0,38 0,24 7,91 65,77 8,23 68,03

КБС 110'% 130 132 8,61 10,9 11,0 0,78 0,36 0,21 8,32 66,56 8,33 68,05

% отн. 202,3 (в 3 раза) 65,0 13,0 3,81 0,01 -83,4 -5,26 -12,5 0,79 0,0

Таблица 10. Испытание действия КБС на процесс спиртообразоваиия в лабораторных условиях. Сырье - пшеница, гидромодуль 1:4; дрожжи ХП расы; температура брожения = 30°С; НКСВ=16,8; Аминосубз илнн 1,5 ед; Глюкаваморин 6 ед.

КБС Карбамид Дрожжи млн/мл СО„. РВ 1/100 см1 ОРВ 1/100 ем1 Спирт %о6. Выход спита см3/100 [ крахмала

Время контроля, час

18 43 18 43 66 18 43 66 43 66 45 66 45 66

40 82 5,83 10,65 11,0 5,37 0,415 0,23 0,74 0,30 8.2 8,36 67,2 68,2

0,07% 44 94 6,33 10,9 11,0 5,0 0,395 0,23 0,67 0,29 8,11 8,25 67,4 68,25

110 119 8,8 10,95 11,0 1,3 0,395 0,21 0,59 0,275 8,28 8,39 67,9 68,3

+ 0,07% 140 136 9,66 11,2 1 1,4 0,9 0,38 0,195 0,46 0,24 8,5 8,36 68,0 68,3

Дрожжи млн/мл

, ,3

СО,, г

РВ, г/100 см

ОРВ, г/100

м м

ОД 02

контроль;

ЕЗ -

Рисунок 8. Изменение основных показателей в процессе спиртообразования дрожжами БассЬаготусез сегеу1$1ае ХП расы на среде с пшеничным суслом в лабораторных условиях (время - 18 часов)

Наиболее отчетливо стимулирующее действие проявилось в начале процесса, а именно через 20 часов количество клеток увеличивалось более, чем в 3 раза, т.е. отмечена интенсификация процесса генерации дрожжей, при этом клетки отличались большей упитанностью и размерами. Относительное количество РВ в опытных вариантах снижалось резко (на 83%). Через 40 часов различия по этим же показателям были не такими разительными, однако концентрация несброженных углеводов в опытных вариантах снижалась по сравнению с контрольными более, чем на 50%. Содержание этанола (крепость бражки), наоборот, существенно возрастало. Через 60 часов брожения все показатели практически сравнивались, хотя в опытных вариантах крепость бражки оставалась выше, а РВ ниже, чем в контрольных вариантах.

Таким образом, результаты, полученные в лабораторных условиях, свидетельствуют об интенсификации процесса спиртообразования в присутствии КБС, что проявилось как в увеличении количества образующегося спирта, так и в ускорении процесса его образования.

6.4.2. Испытания в промышленных условиях

В результате промышленных испытаний на ряде заводов отрасли было подтверждено стимулирующее действие КБС на процессы дрожжегенерации и спиртового брожения, что проявилось в улучшении морфофизиологического состояния дрожжевых клеток и увеличении их количества в дрожжегенераторах; в значительном сокращении времени спиртообразования; в более глубоком и ускоренном потреблении сухих веществ; снижении количества недоброженных углеводов бражки. Выявлена тенденция к увеличению выхода спирта от потребленного крахмала зерносырья. Концентрация спирта в бражке существенно возрастала.

** 12

I1 §10

I ' £ 8 7 6 5 4 3

■/ \

О 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 35 42 45 48 51 54 57 ¿0 63 66 69 72 75 78

дрем/1 Ъракския, "

Раса XII; Гя-466 — 5.2 ед.; термамал Т-Бс — 6,25 ед.; карбамид — 700 г/т X — время досткжск«? лаке, крепости бражки

Рисунок 9. Усредненные показатели процесса брожения, (спиртовой завод Ядринский) ...................опыт с КБС

контроль

Как видно из рис. 9, интенсификация спиртового брожения наиболее чегко отмечена в первые 20 - 30 часов, что проявлялось в более быстром нарастании крепости бражки и более глубоком сбраживании в ней сухих веществ (отброд). После 40 часов брожения показатели (крепость бражки, отброд) изменялись плавно; при этом до конца процесса в опытных вариантах крепость бражки оставалась более высокой, а отброд - более низким, чем в контрольных (содержание несброженных углеводов в опытных вариантах было на 15-20% (отн.) ниже, чем в контрольных). Сокращение времени брожения так же важно, как и увеличение выхода спирта с единицы затраченного сырья, поскольку в промышленных условиях сокращение времени брожения позволяет увеличить коэффициент использовапя оборудования; а следовательно, общую мощность завода.

Испытания показали перспективность использования КБС в спиртовой промышленности, поскольку они позволяют снижать время сниртообразования, увеличивать выпуск спирта и улучшать его качество за счет снижения в нем примесей.

Таким образом, создание и использование в сверхмалых количествах высокоэффективных композитов, включающих на молекулярном уровне ряд биологически активных соединений, синергически усиливающих их интенсифицирующее действие па рост дрожжевых клеток, можно рассматривать как внедрение методов нанобчогех-нологии в крупнотоннажное производство дрожжевой биомассы и этанола.

ВЫВОДЫ

Разработка научных основ получения и практическая реализация в промышленных условиях композиционных биостимуляторов позволили создать высокопроизводительные ресурсосберегающие биотехнологические процессы получения высококачественной биомассы дрожжей-сахаромицетов и такого целевого продукта, как этанол.

В процессе исследований:

1. Разработана колориметрическая методика, позволяющая осуществлять массовые анализы как общего количества всех водорастворимых хитиновых продуктов, так и отдельно мономера Ы-ЛГА для характеристики эффективности кислотного гидролиза хитина и качества получаемого гидролизата.

2. Разработана новая, эффективная технология получения в одну стадию водорастворимых фракций биологически активных хитиновых олигосахаридов из хитина ракообразных животных прямой деполимеризацией его концентрированной серной кислотой.

3. Разработаны 2 технологические схемы, позволяющие получать биологически активные продукты па основе хитина ракообразных животных:

- водорастворимый препарат - хитодекстрип - 1 (ХД-1), представляющий собой смесь мономера ^ - ацетил - Д - глюкозамина) и нескольких хитиновых олиго-меров со степенью полимеризации 3-8;

- частично растворимый препарат - хитодекстрин-2 (ХД-2, или солихит), получаемый по безотходной технологии и содержащий, наряду с водорастворимыми хитиновыми олигосахаридами, коллоидный хитин и сульфат кальция.

4. Выявлена высокая биологическая активность хитиновых олигосахаридов в процессах культивирования дрожжей ЗассЬагошусез сегеу1$1ае:

при выращивании дрожжей на среде с мелассой в присутствии 5 ' 10"3 - 5 10"5% солихита к объему питательной среды относительный прирост биомассы составил 17-19%, белка - 4,3 - 6,3%, при выращивании па среде с зерновым сырьем в

присутствии I ■ 10"3- 1 • 1<Г5% солихита относительный прирост биомассы составил 3 - 6,5%, белка - 4,8 - 7,0%;

в процессах спиртообразования на средах с зерновым суслом выявлено повышение бродильной активности дрожжей в присутствии 5 ' 10'4% солихита, что проявилось в увеличении крепости бражки, снижении несброжениых углеводов и увеличении выхода спирта на 1,1 - 0,62% по сравнению с контрольными вариантами.

5. Показано, что солихит является активным стимулятором роста и развития растений, что проявилось в 66%-ной прибавке биомассы таких овощных культур, как салат, и увеличении прорастания семян столовой свеклы на 57-60%.

6. Проведенный нами скрининг биостимуляторов, а также отработка технологии получения хитодекстрина и обнаружение его способности синергически усиливать действие других биологически активных компонентов, позволили создать высокоэффективные композиционные биостимуляторы, что позволило значительно повысить биологическую активность и резко снизить удельный расход изученных стимуляторов за счет их синергического действия (синергический эффект) в КБС; при этом наиболее важные показатели биотехнологического процесса культивирования биомассы претерпевали изменения в целом в благоприятную сторону лишь при определенных количественных соотношениях их в композиции.

7. Разработанные нами композиционные биостимуляторы были испытаны как в лабораторных, так и промышленных условиях, в периодическом и непрерывном режимах, для получения биомассы дрожжей ЗассЬаготусея сегсУ151ае на средах с гидро-лизатами зерносырья. Испытания КБС| и КБС2 в лабораторных условиях позволили снизить остаточные РВ на 50-85%, повысить концентрацию биомассы на 6-20%, повысить относительное содержание сырого протеина на 15-20%. Внедрение КБС на Новополоцком заводе БВК позволило существенно интенсифицировать процесс выращивания дрожжей-сахаромицетов, увеличить продуктивность, снизить расходные показатели, улучшить качество готового продукта по содержанию белка и других компонентов. При использовании КБС при производстве кормового продукта «Про-вита» увеличилась скорость выращивания биомассы: время выращивания снижалось с 8 часов лр 6,5 - 7,0 часов (на 10-20%); проток увеличился с 13 до 21 м3/час (24-39% ото.). Расходный коэффициент по зерносырыо снизился на 8,4-11,4% отн. Суточная выработка «Провита» возрастала на 26-33 т/сутки (32-40% отн.); при этом содержание сырого протеина возросло на 3,5%, а белка по Барнштейну - на 5,0-5,2%.

-Годовой экономический эффект при получении провита (биомассы дрожжей ЗассЬаготусеэ сегечч^ае) в условиях РУП Новополоцкого завода БВК составляет:

- от использования КСБ-1 - 352127760 руб./год; от КБС-2 - 645567500 руб./год.

Ускорение брожения в промышленных условиях позволяет увеличить коэффициент использования оборудования, так как увеличивает количество технологических циклов каждого бродильного чана, а, следовательно, общую мощность завода.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Максимов В.И., Максимова Е.В., Родоман В.Е. «Экологические аспекты переработки хитинового сырья //IV Всероссийская конференция «Производство и применение хитина и хитозана», Москва, 25-28 апреля, 1995, 57-59, ВПИРО, Москва.

2.Максимов В.И., Родоман В.Е., Максимова Е.В./ «Метод измерения гексоза-минов в хитиновых гидролизатах» //Прикл. биох. и микробиол., 1999, г. 35, № 2, с. 227-230.

3.Максимов В.И., Родоман В.Е., Максимова Е.В./Способ получения водорастворимых олигосахаридов //Патент РФ на изобретение № 2126012, с.!, 6С07 НЗ/06, COS В37/00, 37/08. Приоритет от 17.03.97. Оиубликовап 10.02.99. Бюл. № 4.

4.Максимова Е.В., Воробьева Г.И./Интенсификация производства спирта на основе применения композиционных биостимуляторов //IV съезд общества биотехнологов России, Пущино, 6-7 декабря, 2006, с. 149 Макс-Пресс, Москва, 2006.

5.Максимова Е.В., Ковылип В.М. /Исследования действия препарата хитодек-стрин-2 (солихит) в качестве биостимулятора роста растений// IV съезд общества биотехнологов России, Пущино, 6-7 декабря, 2006, с. 150. Макс-Пресс, Москва, 2006.

6.Максимова Е.В./Интенсификация производства биомассы с использованием биостимуляторов// IV съезд общества биотехнологов России, Пущиио, 6-7 декабря, 2006, с. 147-148. Макс-Пресс, Москва, 2006.

7.Максимова Г.Н., Воробьева Г.И., Максимова Е.В./ «Белковые корма на основе растительных отходов»//Комбикорма, 2007, № 2, с.69.

8.Максимова Г.Н., Воробьева Г.И., Римарева JI.B., Глухих С.А., Максимова Е.В. /Разработка и внедрение методов нанотехнологии для интенсификации спиртового нроизводства//Международная научно-практическая конференция. «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». Москва, Россия, 11-13 марта, 2008.

9.Максимова Г.Н., Воробьева Г.И., Римарева JI.B., Глухих С.А., Максимова Е.В. /Интенсификация процессов культивирования дрожжей с использованием методов панобиотехнологии //Храпение и переработка сельхозсырья (теоретический журнал), 2008г., Ха 9.

Список сокращений и условных обозначений

АСВ - абсолютно сухой вес

К-А ГА - N - ацетил - Д - глюкозамин

АО - аитиоксидант

БАВ - биологически активные вещества

БВК - белково-витаминный концентрат

БО - белок одноклеточных

ВЖК - высшие жирные кислоты

ГА - глюкозамин

- ГА - - глюканазная активность

Г/М - гидромодуль

ГХК - глгокан-хитиновый комплекс

ЖК - жирные кислоты

КЖ - культуральная жидкость

КС - клеточные стенки

КСД - клеточные стенки дрожжей

ПА - протеолитическая активность

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РВ - редуцирующие вещества

СА - степень ацетилирования

СП - степень полимеризации

ФАВ - физиологически активные вещества

ФП - ферментный препарат

ХД - хитодекстрин

ХОС - хитиновые олигосахариды

Отпечатано в ООО "Мещера" М.О., г. Щелково, ул.Свирская, д.8а зак. № 12 тир. 120 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Максимова, Екатерина Вячеславовна

1. Стр.

ВВЕДЕНИЕ.5

- актуальность проблемы; 5

- цель работы; 7

- научная новизна; 8

- практическая ценность и промышленная реализация результатов исследований; 10

- объем и структура работы;

- основное содержание работы. 12-

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 14

1.1.Компонентный состав и проницаемость клеточных стенок дрожжей.14

1.2.Интенсификация роста дрожжевых клеток с использованием биостимуляторов. 21

1.3.Биологически активные материалы на основе хитина панцирей ракообразных.31

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов и применения их для интенсификации процессов культивирования дрожжей"

Актуальность проблемы. В последние годы во всем мире наблюдается значительный интерес к биотехнологическим процессам, в которых целевые продукты синтезируются в ходе жизнедеятельности клеток микроорганизмов. Клетки при этом растут, развиваются, потребляют питательные вещества и энергию. При решении проблемы удовлетворения потребности населения в полноценном белке мы обратили внимание на то, что многие микроорганизмы обладают высокими скоростями синтеза биомассы и белков. В этом плане значительный интерес представляют дрожжи, поскольку для них характерны достаточно высокие темпы роста, быстрое накопление биомассы и белков, а в связи с достаточно большими размерами их клеток они удобны для использования в промышленных масштабах. Белки дрожжей по аминокислотному составу соответствуют белкам животных. Дрожжи можно также рассматривать как: источник для получения ряда очень ценных препаратов медицинского и ветеринарного назначения, а также для получения таких целевых продуктов, как этанол. Основной стадией получения биомассы является стадия выращивания дрожжей, в процессе которой создаются условия для накопления максимального количества биомассы требуемого качества. Одной из предпосылок разработки интенсивных технологических процессов получения биомассы является обеспечение максимальной скорости роста культуры при минимальном содержании субстрата на выходе из ферментера, т.е. максимальная продуктивность ферментера должна коррелировать с полнотой исчерпания субстрата и минимальным накоплением в среде побочных продуктов метаболизма [23], что достигается при точном соответствии скорости подачи субстрата предельной способности клеток утилизировать его в данных условиях культивирования [178].

Питательные среды и источники энергии в крупномасштабном производстве могут оказывать серьезное тормозящее влияние на ход биотехнологических процессов. Интенсификации процесса биосинтеза биомассы и целевых продуктов при использовании дрожжей способствует введение в питательную среду биостимуляторов. При этом интенсификация биотехнологических производств осуществима путем ускорения метаболических процессов, включающих десятки и сотни ферментных реакций, устранения всякого рода «узких мест», приводящих к ингибированию ферментативных реакций, снижению скоростей массопереноса субстратов и продуктов и т.д.

Следует учитывать, что потребность микроорганизмов в биостимуляторах не абсолютна и может меняться в зависимости от состава питательной среды и условий культивирования (рН, температура и др.). В связи с этим выявление стимуляторов и условий их действия на популяцию чрезвычайно важно для достижения максимальной продуктивности, при минимальных затратах.

В процессе их использования, помимо интенсифицирующего рост клеток действия, следует учитывать и другие показатели: качество получаемого продукта и затраты на применение стимулятора. В затраты прежде всего входят стоимость самого стимулятора, стоимость его транспортировки, дозировки и длительность его воздействия на технологический процесс, т.е. необходимо учитывать экономическую эффективность использования тех или иных стимуляторов.

Применение биостимуляторов приводит к более полному потреблению компонентов питательной среды, что позволяет организовать технологический процесс по замкнутому циклу, снизить нагрузки на очистные сооружения и тем самым повысить экологическую чистоту производства. Больше того, они, как правило, повышают качество биомассы, что проявляется в увеличении содержания белка в биомассе и улучшении других показателей, а также позволяют увеличивать выпуск целевых продуктов, образующихся в процессе жизнедеятельности дрожжей, в частности, этанола.

В настоящее время разработка технологий получения и применения высокоэффективных биостимуляторов при культивировании клеток для осуществления биотехнологических процессов синтеза, гидролиза, окисления, перегруппировок и др., чрезвычайно актуальна, главным образом, применительно к крупнотоннажным производствам. Это объясняется тем, что использование их позволяет получать значительный экономический эффект без каких-либо затрат для введения дополнительного оборудования и изменения технологических схем производства. При этом было выявлено, что наиболее эффективно использование композиционных биостимуляторов, включающих ряд биологически активных компонентов, синергически усиливающих действие друг друга. В этом плане оказалась перспективным включение в состав таких композитов водорастворимых хитиновых олигосахаридов (ХОС) со степенью полимеризации 3-8, получаемых прямой деполимеризацией хитина. В связи с этим разработка методов их анализа, оптимизация технологии их получения и использование для интенсификации биотехнологических процессов представляет научный интерес и имеет важное практическое значение.

Следует отметить, что исследования проводились с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, выращиваемых на зерновом сусле. Однако как методические подходы, так и полученные нами результаты могут быть использованы при конверсии различных субстратов, т.е. при решении общих вопросов, относящихся к крупнотоннажной биотехнологии, в медицинской и микробиологической промышленности.

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов, научное обоснование их включения в состав композиционных биостимуляторов для создания высокопроизводительных биотехнологических процессов культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на гидролизатах зерносырья.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: -разработка новой, упрощенной методики анализа водорастворимых продуктов, образующихся в результате деградации хитина;

-проведение исследований по разработке эффективной технологии получения олигосахаридов хитина (хитодекстринов - ХД) на основе сернокислотной деградации хитина крабов и разработка принципиальных схем получения различных продуктов на основе получаемого гидролизата;

-наработка в камеральных условиях партий хитиновых олигосахаридов и проведение испытаний на их безвредность, безопасность и биологическую активность;

-исследование влияния хитиновых олигосахаридов на процессы генерации дрожжей Saccharomyces cerevisiae и сбраживания зернового сусла, а также на рост овощных культур;

-разработка высокоэффективных композиционных биостимуляторов роста дрожжевых клеток и спиртообразования, включающих биологически активные хитиновые олигосахариды;

-апробация и внедрение основных результатов исследований в промышленных условиях культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Научная новизна работы заключается в создании нового направления в исследованиях, касающихся интенсификации процессов получения биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae повышенной биологической ценности, а также продукта жизнедеятельности дрожжевых клеток - этанола, с использованием композиционных биостимуляторов (КБС). При этом в процессе исследований получены новые научные результаты методического, теоретического и прикладного характера:

1. Разработана новая упрощенная методика оценки содержания водорастворимых хитиновых продуктов, получаемых в результате как кислотного, так и ферментативного гидролиза хитин-хитозанов. В соответствии с этой методикой весь анализ от внесения раствора вещества до колориметрирования проводят в одной и той же пробирке, благодаря использованию на стадии гидролиза малых объемов (0,2 мл) всех растворов, азеотропной смеси HCL и неполной нейтрализации кислотного гидролизата, что обеспечило значительную точность и воспроизводимость получаемых результатов. Впервые проведено комбинирование двух методов анализа хитиновых продуктов, из которых один позволяет оценивать общее содержание водорастворимых компонентов хитина, а другой его мономер, N - АГА. Это позволило охарактеризовать эффективность кислотного гидролиза хитина и качество гидролизата.

2. Показана принципиальная возможность получения в одну стадию водорастворимых биологически активных олигосахаридов хитина с оптимальной степенью полимеризации (3-8), - хитодекстринов (ХД) с широким спектром биологической активности.

3. Установлено стимулирующее действие ХД на рост дрожжевых клеток, спиртообразование, а также на рост овощных культур и прорастание семян.

4. Научно обоснована необходимость разработки и состав композиционных биостимуляторов ростка клеток на основе отобранных в процессе скрининга биологически активных соединений, способных интенсифицировать метаболизм дрожжевых клеток.

5. Впервые выявлено стимулирующее действие высокоэффективных КБС на процессы дрожжегенерации и спиртового брожения при культивировании дрожжей Saccharomyces cerevisiae на средах с зерновым суслом; показано, что использование КБС в сверхмалых оказывает стимулирующее действие на физиологическую активность, морфофизиологическое состояние, рост и размножение, продуктивность и бродильную способность этих дрожжей. Впервые показано, что КБС в периодических и непрерывных режимах, в лабораторных и промышленных условиях способны в значительной степени интенсифицировать рост дрожжевых клеток, что проявлялось в улучшении основных технологических показателей производства (увеличение продуктивности культуры, снижение расходных коэффициентов по субстрату) и качества получаемого продукта. В процессах спиртообразования стимулирующее действие высокоэффективных КБС проявлялось в улучшении морфо-физиологического состояния дрожжевых клеток и увеличении их количества [в дрожжегенераторах;] в значительном сокращении времени спиртообразования, в более глубоком и ускоренном потреблении сухих веществ, снижении количества недоброженных углеводов бражки, увеличении выхода спирта от потребленного крахмала зер-носырья при соответствии качества спирта марке «Люкс».

6. Установлено существенное увеличение общей активности КБС по сравнению с суммарной активностью отдельных компонентов при значительном снижении удельного расхода последних за счет их синергического действия.

Практическая ценность работы заключается в разработке и практической реализации высокопроизводительных, энерго- и ресурсосберегающих - биотехнологических процессов получения высококачественной биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и этанола с использованием композиционных биостимуляторов роста клеток:

1. Разработана эффективная технология прямой деполимеризации хитина панцирей крабов действием на него концентрированной серной кислотой, которая позволяет не только получать в одну стадию биологически активные хитиновые олигосахариды с оптимальной степенью полимеризации (3-8) и выпускать два новых продукта, но и избежать многих экологических проблем, связанных с необходимостью утилизации больших количеств едких отходов, образующихся при получении БАВ на основе хитина в соответствии с другими известными технологиями.

2. Разработаны технологическая схема получения на основе гидролизата хитина водорастворимого биологически активного препарата - хитодекстрин-1 (ХД-1) и безотходная технологическая схема, позволяющая создать экологически чистое производство с ресурсосберегающей технологией частично растворимого биологически активного препарата - хитодекстрин-2 (ХД-2, или соли-хит).

3. Выявление значительной биологической активности хитиновых олиго-сахаридов позволило широко рекомендовать их использование в различных об ластях народного хозяйства в качестве активного стимулятора роста и развития растений, молодняка животных и птицы, бифидобактерий, дрожжевых клеток, процессов спиртообразования.

4. Использование КБС в условиях крупнотоннажных производств получения биомассы и этанола позволяет получать значительный экономический эффект без каких-либо затрат для введения дополнительного оборудования и изменения технологических схем производства. Так, внедрение КБС при производстве кормового белкового продукта «Провита» на Новополоцком заводе БВК (Республика Беларусь) позволило существенно улучшить все технологические показатели производства, улучшить качество биомассы дрожжей-сахаромицетов и получить годовой экономический эффект от использования КБС-1 в размере 352 млн. руб./год, а от КБС-2 - 645 млн.руб./год.

Более полное потребление субстрата и продуктов метаболизма в кулыу-ральной жидкости в присутствии биостимуляторов позволяет значительно снижать сброс загрязнений на очистные сооружения и тем самым достигать существенного улучшения экологической обстановки на заводах по производству БВК на основе зерносырья. Сокращение времени брожения в условиях спиртовых заводов позволяет увеличить коэффициент использования оборудования, так как увеличивает количество технологических циклов каждого бродильного чана, а, следовательно, и общую мощность завода.

Публикации. Материалы диссертации отражены в 9. печатных работах, в том числе получен патент РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложенной в 5 главах; выводов и списка литературы, включающего 239 работ, в том числе 181 отечественных и 58

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Максимова, Екатерина Вячеславовна

ВЫВОДЫ.

В процессе исследований:

1 .Разработана унифицированная колориметрическая методика, позволяющая осуществлять массовые анализы как общего количества всех водорастворимых хитиновых продуктов, так и отдельно мономера N - АГА для характеристики эффективности кислотного гидролиза хитина и качества получаемого гидролизата.

2.Разработана новая, экономичная и эффективная технология получения в одну стадию водорастворимых фракций биологически активных хитиновых олигосахаридов из хитина ракообразных животных прямой деполимеризацией его концентрированной серной кислотой. Установлено, что разработанная технология не только обеспечивает значительное снижение расхода реактивов, но и позволяет устранять многие экологические проблемы, связанные с необходимостью утилизации больших количеств едких отходов, образующихся при получении БАВ на основе хитина в соответствии с другими известными технологиями.

3. Разработаны 2 технологические схемы, позволяющие получать следующие биологически активные продукты на основе хитина ракообразных животных:

-водорастворимый препарат - хитодекстрин-1 (ХД-1), представляющий собой смесь мономера (N - ацетил - Д - глюкозамина) и нескольких хитиновых олигомеров со степенью полимеризации 3-8;

-частично растворимый препарат - «хитодекстрин-2» (ХД-2, или солихит), получаемый по безотходной технологии и содержащий, наряду с водорастворимыми олигосахаридами, коллоидный хитин и сульфат кальция.

4. Выявлена высокая биологическая активность хитиновых олигосахаридов: в процессах культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae при выращивании дрожжей на среде с мелассой в присутствии 5 ■ 10"3 -5 ■ 10"5 % солихита к объему питательной среды относительный прирост биомассы составил 17-19%, белка - 4,3-6,3%, при выращивании на среде с л г зерновым сырьем в присутствии 1-10" 1 * 10" % солихита относительный прирост биомассы составил 3 - 6,5%, белка - 4,8 - 7,0%; в процессах спиртообразования на средах с зерновым суслом выявлено повышение бродильной активности дрожжей в присутствии 5 • 10"4 % солихита, что проявилось в увеличении крепости бражки, снижении несброжен-ных углеводов и увеличении выхода спирта на 1,1 - 0,62% по сравнению с контрольными вариантами: токсикологические исследования выявили полную безвредность и безопасность хитодекстрина для использования как в медицинской практике, так и в животноводстве, птицеводстве и растениеводстве; выявлена значительная бифидогенная активность препарата для преодоления дисбиоза кишечника и стимуляции иммунитета (при выращивании некоторых штаммов бифидобактерий in vitro достигнуто 100 - кратное увеличение биомассы; в условиях in vivo показана высокая эффективность в нормализации кишечного микробиоценоза, нарушенного введением антибиотиков); показано, что введение незначительных количеств ХД в рацион цыплят позволяет создавать высокоэффективные композиции и тем самым снижать дозировки и расходы наиболее дорогостоящих добавок.

5.Показано, что солихит является активным стимулятором роста и развития растений, что проявилось в 66%-ной прибавке биомассы таких овощных культур, как салат, и увеличении прорастания семян столовой свеклы на 57-60%.

6. Проведенный нами скрининг биостимуляторов, а также отработка технологии получения хитодекстрина и обнаружение его способности синер-гически усиливать действие других биологически активных компонентов, позволили создать высокоэффективные композиционные биостимуляторы, что позволило значительно повысить биологическую активность и резко снизить удельный расход изученных стимуляторов за счет их синергического действия (синергический эффект) в КБС. Выявлено, что в композициях стимуляторов природа и концентрации отдельных компонентов оказывали существенное влияние на технологические показатели процесса выращивания качество биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae; при этом наиболее важные показатели биотехнологического процесса культивирования биомассы претерпевали изменения в целом в благоприятную сторону лишь при определенных количественных соотношениях их в композиции. Установлено, что в зависимости от необходимости решения различных задач можно изменять биологическую активность композиционных биостимуляторов, изменяя состав и соотношение отдельных компонентов.

7.Разработанные нами композиционные биостимуляторы были испытаны как в лабораторных, так и промышленных условиях, в периодическом и непрерывном режимах, для получения биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae на средах с гидролизатами зерносырья. Испытания KBCi и ЬСБСг в лабораторных условиях позволили снизить остаточные РВ на 50-85%, повысить концентрацию биомассы на 6-20%, повысить относительное содержание сырого протеина на 15-20%. Внедрение КБС и КБС2 на Новополоцком заводе БВК (Республика Беларусь) позволило существенно интенсифицировать процесс выращивания дрожжей-сахаромицетов, улучшить технологические показатели, увеличить продуктивность, снизить расходные показатели, улучить качество готового продукта по содержанию белка и других компонентов. При использовании КБС при производстве кормового продукта «Прови-та» увеличилась скорость выращивания биомассы: время выращивания снижалось с 8 часов, до 6,5-7,0 часов (на 10-20 %); проток увеличился с 13 до 21 м3/час (24-39% отн.). Расходный коэффициент по зерносырью снизился на 8,4-11,4% отн. Суточная выработка «Провита» на одном аппарате возрастала на одном аппарате на 26-33 т/сутки (32-40% отн.); при этом содержание сырого протеина возросло на 3,5%, а белка по Барнштейну на 5,0-5,2% .

-Годовой экономический эффект при получении провита (биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae) в условиях РУП Новополоцкого завода БВК составляет:

- от использования КБС-1 - 352127760 руб./год; от КБС-2 -645567500 руб./год.

8.В лабораторных и промышленных условиях выявлено стимулирующее действие КБС на процессы дрожжегенерации и спиртового брожения, что проявлялось в улучшении морфофизиологического состояния дрожжевых клеток и увеличении их количества в дрожжегенераторах, сокращении времени спиртообразования на 10-18 часов; более глубоком и ускоренном потреблении сухих веществ; снижении количества недоброженных углеводов бражки; увеличении выхода спирта от потребленного крахмала зерносырья на 0,6-2%. Ускорение брожения (сокращение времени брожения) в условиях спиртовых заводов позволяет увеличить коэффициент использования оборудования, так как увеличивает количество технологических циклов каждого бродильного чана, а, следовательно, и общую мощность завода. Испытания показали перспективность использования КБС в спиртовой промышленности, поскольку позволяют снижать время спиртообразования, увеличивать выпуск спирта и улучшать его качество.

Таким образом, использование композиционных биостимуляторов в условиях крупнотоннажных производств как получения биомассы, так и спирта позволяет получать значительный экономический эффект без каких-либо затрат для введения дополнительного оборудования и изменения технологических схем производства как за счет увеличения скорости роста культуры, так и увеличения выхода целевого продукта от используемого субстрата, при одновременном улучшении качества получаемых целевых продуктов.

1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате изучения патентных и научно-технических литературных сведений отечественных и зарубежных ученых установлена возможность использования разнообразных биологически активных соединений в качестве стимуляторов роста микроорганизмов, в частности, дрожжей. Однако, при этом было выявлено, что подавляющее большинство публикаций касалось интенсификации роста дрожжей рода Candida на сравнительно бедных синтетических средах и прежде всего дрожжей парафинокисляющих, крупнотоннажное производство биомассы которых (БВК, или «Паприн») бурно развивалось в нашей стране в течение 30 лет. Интенсификация процесса получения паприна с использованием биостимуляторов позволяла получать значительный экономический эффект.

К началу нашей работы на территории бывшего СССР производство паприна было практически полностью ликвидировано, а заводы уничтожены, за исключением завода БВК в г. Новополоцке (Республика Беларусь). На этом единственном, неразрушенном заводе БВК было организовано производство биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae на гидролизатах зерно-сырья - «Провита». На территории России в настоящее время имеется значительное количество биотехнологических производств, связанных с культивированием дрожжей Saccharomyces cerevisiae на таких углеводсодержащих средах, как меласса или гидролизаты растительного сырья, главным образом, зерносырья. Эти производства направлены либо на получение биомассы, либо таких целевых продуктов, как этанол. Однако технология получения этих продуктов на большинстве заводов остается еще не совершенной, она нуждается в значительной интенсификации, поскольку время культивирования дрожжей остается достаточно продолжительным, расходные коэффициенты велики, а качество биомассы часто не соответствовало предъявляемым требованиям. Кроме того, в связи с резким повышением цен на зерносырье и электроэнергию, интенсификация таких производств для улучшения технологических показателей становится особенно актуальной.

Анализ двух метаболических систем, а именно культивирования дрожжей-сахаромицетов на средах с мелассой и зерносырьем и парафино-кисляющих дрожжей рода Candida на синтетических средах с очищенными жидкими парафинами, показал, что технологические приемы, разработанные ранее для получения паприна, не могли быть использованы непосредственно для решений поставленных перед нами задач. Это было обусловлено целым рядом отличий, связанных прежде всего со спецификой углеводородного типа питания. Особенностью биохимии таких дрожжей является стадия первичного окисления н-алканов, которые относятся к инертным химическим веществам, а именно, первичное окисление парафинов осуществляется содержащей цитохром Р-450 монооксигеназной системой в микросомальной мембранной фракции. Найдено, что цитохром Р-450 индуцируется лишь у алканокисляющих дрожжей; при росте на интермедиатах максимальное его содержание в клетках в 3-4 раза меньше, чем при росте на гексадекане. При выращивании дрожжей-сахаромицетов на этаноле и глюкозе Р-450 не индуцировался совсем.

Это оказывает существенное влияние на технологические показатели роста и компонентный состав биомассы и клеточных стенок дрожжей. Кроме того, состав синтетических питательных парафин- или углеводсодержащих сред несопоставимо более бедный по сравнения со средами с мелассой и зерносырьем. В связи с этим многие из тех компонентов, которые могли бы стимулировать рост парафинокисляющих дрожжей, уже входят в состав мелассы или гидролизатов зерносырья.

Для эффективного решения возникших проблем был необходим новый комплексный подход с использованием экологически безопасных технологий и натуральных биорегуляционных средств.

Нами разработаны новые, более совершенные технологические решения интенсификации процессов культивирования микроорганизмов с использованием композиционных биостимуляторов (КБС).

Выявление в процессе скрининга стимуляторов значительной биологической активности различных соединений, полученных на основе хитина, и обнаружение способности хитиновых олигосахаридов синергически усиливать действие других ценных биологически активных компонентов послужили обоснованием необходимости проведения углубленных исследований по отработке методов анализа и технологии получения этих соединений.

Отработана технология получения в одну стадию водорастворимых хитиновых олигосахаридов действием на хитин ракообразных животных концентрированной серной кислотой. На основе этой технологии разработаны технологические схемы для получения двух продуктов: полностью растворимого хитодекстрина-1 и частично растворимого хитодекстрина-2, которые различались как по способу их получения, так и по составу.

В результате проведенных наукоемких экспериментально-практических работ, медицинских, биологических и клинических исследований и наблюдений в стационарных условиях выявлены высокая эффективность, безопасность и целесообразность широкого применения новых натуральных препаратов-хитиновых олигосахаридов- для людей, животных, растений и микроорганизмов.

ХД обладают полифункциональными свойствами и широким спектром практического применения. Их использование, в частности, дает возможность предотвратить и снизить загрязнение среды обитания вредными веществами и токсичными для живых организмов соединениями.

С целью интенсификации биотехнологических процессов нами были разработаны методы нанобиотехнологии, заключающиеся в том, что сконструированные композиции из отдельных, наиболее перспективных биологиче ски активных соединений на молекулярном уровне - композиционные биостимуляторы (КБС) - при использовании в сверхмалых дозах (1-10"8-1-10"10%) позволяют целенаправленно управлять биохимическими процессами различных организмов и регулировать состав и свойства получаемых продуктов. Выявлена хорошая воспроизводимость результатов в лабораторных и промышленных условиях, соответствие проведенных исследований мировому уровню и современным научным тенденциям. Использование КБС приводит к существенному увеличению рентабельности действующих заводов. Так, в промышленных условиях (Новополоцкий завод БВК, республика Беларусь) интенсификация процесса получения дрожжевой биомассы («Провита») позволила получить экономический эффект от использования КБС-1-352127760 руб./год; КБС-2-645567500 руб/год. При этом существенно улучшалось качество готового продукта, что проявлялось прежде всего в увеличении содержания как сырого протеина, так и истинного белка. Использование КБС в промышленных условиях на 16 спиртовых заводах позволило получить значительный экономический эффект, поскольку приводило к увеличению выхода спирта от крахмала зерносырья на 1,5-2,0%, и существенному увеличению производства спирта в опытных вариантах (чанах) по сравнению с контрольными. Существенный экономический эффект дает также сокращение времени брожения, поскольку при этом увеличивается коэффициент использования оборудования, так как увеличивается количество технологических циклов каждого бродильного чана, а, следовательно, общая мощность завода. При этом также улучшается качество получаемого этанола, поскольку в нем снижается количество нежелательных примесей.

Универсальная, доступная и малозатратная нанобиотехнология основана на новых принципах революционной значимости для биотехнологической промышленности.

От известных в мире и применяемых в промышленных условиях технологий разработанная нами технология отличается простотой, дешевизной, высоким ресурсосберегающим эффектом, экологической безопасностью для обслуживающего персонала, потребителей и окружающей среды.

Технологические процессы исключают длительные многоступенчатые операции, дополнительный ввод дорогостоящего оборудования и изменения технологических схем.

В результате исследований получены новые научно-обоснованные, достоверные выводы и практические рекомендации, которые имеют огромное теоретическое и прикладное значение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Максимова, Екатерина Вячеславовна, Москва

1. 22. А.с. 1084298. 1984. - кл. С12 1/38; С12 1/22; БИ 13.2. 23. А.с. 1113405. кл. С12. - 1/16, С12 1/26, С12Р, 1/72-БИ 34.- С.70.3. 31. А.с. 1641021. 1994. - кл. С12 1/38. - БИ 13.

2. Бабенко Ю.С., Кукушкина Н.В., Гниломедова Л.Е., Черногор Н.П. Применение комплекса литических ферментов Streptomyces recifensis subs-lyticus 2435 для гидролиза биомассы и стимуляции роста// Биотехнология. -1990. № 1. - с.52-55.

3. Барахтенова Л.А., Николаевский B.C. Влияние сернистого газа на фотохимическую активность и фотофосфорилирование у Сг и С4 растений// Изв. АН СССР. сер. биол. - 1983. - № 1. - с. 90-99.

4. Баталкин Г.А.//Влияние физиологически активных веществ гумусовой природы на рост продуцентов микробного белка. Автореф.канд.дисс., Киев-1987.

5. Белов А.П., Рачинский В.В. «Роль глюканов и маннанов клеточной стенки дрожжей рода Candida в морфогенезе клетки. // Тезисы VII съезда Всесоюзного микробиологического общества. — 1985. т.2. - «Физиология, биохимия и организация микроорганизмов.» - с. 20.

6. Белов А.П., Каменев А.С. Роль компонентов клеточной стенки дрожжей рода Candida в морфологии клетки// Микробиология. 1986. - т.55. - вып.З - с.473-476.

7. Белозерский А.Н., Проскуряков Н.И. // Практическое руководство по биохимии растений. М.; Советская наука. 1951.

8. Беляева М.И., Куприянова Ф.Г., Ульянова М.Н. Влияние нуклеазы Serratia marcenscens на размножение Candida tropicalis //Микробиология. -1977. т.46. - вып.2. - с.300.

9. Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока. Мат-лы науч. конф. Владивосток, (ред. Стонск В.А. Владивосток; Дальнаука, 2001. - с. 241.

10. Брагинцева JI.M. /Грибы источник биологически активных ве-щестъ//Успехи мед. микологии, т.1. Мат. Первого Всероссийского конгресса по мед. микологии, Москва, 2003. - с. 24-44.

11. Бурлакова Е.Б., Эмануэль Н.М. Роль антиокислителей в физико-химических процессах регулирования роста клеток.//В кн.: Физико-химические основы авторегуляции в клетках. М.: Наука. 1968. - с.44-45.

12. Бурлакова Е.Б. //Тез. докл. V Всес. биохим. съезда. Киев 1986. -М.: Наука. - 1985. - т.2. - с.110.

13. Бурлакова Е.Б. //Биохим. механизмы действия АО. Тез. докл. V Всес. биохим. съезда. 1986. - т.1. - с.85.

14. Бурлакова Е.Б., Кондаров А.А., Худяков И.В. Воздействие химических агентов в сверхмалых дозах на биологические объекты// Изв. АН СССР, сер.биол. 1990. - « 2. - с. 184-193.

15. Бурлакова Е./Сверхмалые дозы большая загадка природы//Наука в технологии и промышленности// 2002 (3(10) - Щ1), - с.24-27.

16. Вагабов В.М.//Биосинтез углеводных компонентов клеточной стенки дрожжей. Пущино. 1988.

17. Ванюшин Б.Ф. Молекулярные механизмы действия фитогормо-нов.//Сельскохозяйственная биология. —1985. № 5. - с. 110-112.

18. Винаров А.Ю. Применение поверхностно-активных веществ в процессах ферментации.//Биотехнология. 1986. - № 5. - с.39-45.

19. Винаров А.Ю. Исследование структуры потоков и математическое моделирование промышленного биореактора.//Биотехнология. 1987 г. - том 3. - № 5. - с.667-674.

20. Воробьева Г.И., Сушкова В.И., Фелоненко В., Спирина С., Салеева И. /Дрожжи-сахаромицеты в кормопроизводстве//Комбикорма. № 6. - 2005. - с.59.

21. Воробьева Г.И. с соавт./ штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ОН-1 BKIIM-y-2492//RU 2039813 CI, 20.07.1995. др. 10225289. 25.08.1998.

22. Галаев Ю.В., Кибальникова П.И. Исследование влияния органических перекисей на рост дрожжей, культивируемых на основе н-парафинов.// Рукопись депонирована в ВНИТИ 4 января. 1985. - № 136. - с.85.

23. Галынкин В.А., Аак О.В., Хадеева В.В. Связывание высокомолекулярных сланцевых кислот дрожжевой клеткой.// В сб. Получение и применение регуляторов роста. Межвуз.сб.научн. тр. JI.: ЛТИ им.Ленсовета. 1986. -с.77-79.

24. Гололобов А.Д. Биохимия углеводородного питания дрожжей. Диссертация на соискание ученой степени докт.биол.наук., Москва. - 1973.

25. Горлова И.С. Влияние липидов на рост дрожжей и состав биомассы при ассимиляции углеводородов.//Автореферат канд.дисс.биол.наук 1984. -Ленинград.

26. Государственный стандарт ГОСТ 28179-89. Дрожжи кормовые -паприн.

27. Государственный стандарт ГОСТ 28178-89. Методы испытаний.

28. Градова Н.Б., Диканская Э.М., Михалева В.В.//Использование углеводородов дрожжами. Обзор. М. 1971. - ОНТИТЭИмикробиопром.

29. Градова Н.Б.//Физиологические особенности углеводородокисляю-щих дрожжей рода Candida и селекция производственных штаммов. Авто-реф. на соиск. докт. биол. наук. Москва. - 1976.

30. Грачева И.М., Гаврилова Н.Н., Иванова Л.А.//Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М.: Пищ. пром-сть. 1980. -с.448.

31. Гуринова В.В., Орлова А.И. Влияние гиббереллина на размножение и жизнедеятельность дрожжей.//Прикл.биох. и микробиол. 1974. т. 10. — вып. 1. - с.161-165.

32. Гусельникова Т.В., Павлов А.А., Безруков М.Г., Градова Н.Б. Влияние термообработки на фракционный состав белков дрож-жей.//Биотехнология. —1988. -т.4. № 4. - с.509-511.

33. Гусельникова Т.В., Белов А.П. Содержание белка и свободных аминокислот в утлеводородокисляющих дрожжах в зависимости от азотного пи-тания.//Изв. ТСХА. 1988. - № 6. - с.130-134. Москва. - ВО «Агропромиз-дат».

34. Гусельникова Т.В., Белов А.П., Градова Н.Б. Влияние дрожжевого автолизата на содержание и распределение свободных аминокислот в клетках дрожжей рода Candida . //Микробиология. 1989. - т.58. - вып.2. - с.202-2-5.

35. Давтян М.А., Авакян А.С., Навасардян JI.A. Стимулирование роста дрожжей клеточным экстрактом.//Биол.ж.Армении. 1984.-t.57. ■ № 7. -с.574-577.

36. Дерканосов Н.И., Чувашева К.К., Гарманова Е.Л. Эффективность использования стимуляторов роста в дрожжевом производст-ве.//Хлебопекарная и кондитерская промышленность. —1983. № 10. - с.44-46.

37. Дерканосов А.Н. Об использовании гидролизатов кукурузного экстракта в дрожжевой промышленности.//Хлебопекарная и кондит.пром-сть. -1985. 12. - с.28-29.

38. Дише 3. Цветные реакции гексозаминов.// В кн.: Методы химии углеводов (Под ред. Кочеткова Н.К. М.: Мир. 1967. - с.52.

39. Дурнев А.Д. Серединин С.Б. Антиоксиданты как средства защиты генетического аппарата.//Химико-фарм. журнал. 1990. - № 2. - с.92-100.

40. Егоренкова Г.Н., Белов А.П. Структурная оргнизация клеточных стенок у дрожжей рода Candida.//MHKpo6mxnorM. 1984. - т.53. - вып.2. -с.300-304.

41. Забродский А.Г. Использование мелассной барды в биотехнологии.//Биотехнология. 1989. - т.5. - №3. - с.353-357.

42. Кислухина О.В., Калунянц К.А., Аленова Д.Ж.//Ферментативный лизис микроорганизмов. Алма-Ата. «Рауан». - 1990.

43. Кольцова Э.В., Мальцев Н.И., Гайденко В.П.//Проблемы сырьевого обеспечения микробиологических производств. Обзор. М.: ВНИИСЕНТИ. -1986. - с.32.

44. Конев С.В., Гаврилов В.Б., Орехова Т.А., Матус В.К. «Кооперативная гибель дрожжевых клеток при озон-индуцированном сбросе протонного градиента на мембране .//ДАН СССР. 1985. - т.281. - с.454-457.

45. Конев С.В. Гаврилов В.Б., Шалькевич Л.К.: Матус В.К. Энергозависимая стабилизация протонного градиента на мембране дрожжей при действии низших доз озона.//Биофизика. 1988. -т.ЗЗ. -№1. - с.152-153.

46. Конев С.В., Мельникова A.M., Катус В.К. Молекулярно-мембранные механизмы стимулирования и ингибирования метаболической активности дрожжей озоном//15-ный Междунар.спец.симпозиум по дрожжам: Рига. 30 сент. - 6 окт. 1991. - с. 67.

47. Коновалов С.А., Максимов В.И. Ферменты, катализирующие первичное окисление насыщенных углеводородов.// ЖВХО им.Д.И.Менделеева. 1972. - т.ХУП. - №5. - с.538-544.

48. Коновалов С.А., Максимов В.И. Особенности обмена веществ у микроорганизмов.//Микробиол.синтез (Труды института «ВНИИсинтезбе-лок»), 1974. - вып.7. - с. 18-31.

49. Любецкая и др. /Получение биологически активных веществ с помощью грибных ферментов//Биотехнология 2002. - № 6. - с.68-69.

50. Заключение о клиническом испытании в лаб. иммунологии клинической больницы ЦМСЧ-119 хитодекстрина. 17.01.2001. подп. Клин. Иммунолог д.м.н., Хоробрых В.В.

51. Зайдель А.И.Юлементарные оценки ошибок измерения. 1967. -JL: «Наука».

52. Захарова И.Я., КосенкоЛ.В .//Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наукова думка. 1982. - С.35.

53. Зуев Е.Т., Брагинцева Л.М., Воробьева Г.И. и др./Штамм гриба Fusarium sumbucinum продуцент биол. акт. Веществ//Патент 2259209 Россия, МПК7 А61К 35/84, А234 1/0 54; 27.08.05г. Бюл. 24.

54. Каменев А.С., Белов А.П. Роль глюканов и маннанов в формировании упругих свойств клеточной стенки дрожжей.//Изв. ТСХА. 1986. -вып. 1. - с. 187-190.

55. Колганов А.И. и др./Зав-сть влияния РНКазы Вас. Inter на рост пекарских дрожжей от конц. Экзог. Фермента//Микробиология. 2000. - 69. -№ 4. - с.478 -482.

56. Колпаков А.И./Влияние, рибонуклеазы Bacillus intermedius на свойства дрожжей S. cerevisiaeZ/Прикл. биох. И микроб. 2000, - № 4 - с.479-483.

57. Краузова В.И., Ильченко А.П., Шарышев А.А., Лозинов А.Б. Возможные пути окисления высших спиртов мембранными фракциями дрожжей, выращенных на гексадекане и гексадеканоле.//Биохимия. 1985. - т.50. - №5.-с.726.

58. Ксенофонтов Б.С., Селифонтова В.С.//Способы обработки отходов микробиологических производств и их технико-экономическое обоснование. Москва., ВНИИСЭНТИ. -1989.

59. Кулаева О.Н.//Цигокинины, их структура и функция. Изд-во «Наука», Москва. — 1973. с.264.

60. Кулаева О.Н., Чайлахян М.Х. Тенденции и перспективы развития исследований по фитогормонам (По материалам X Международной конференции по ростовым веществам растений).//Успехи соврем.биологии. -1980. т.90. - № 2(5). - с.308-313.

61. Кулаева О.Н.//Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. 41-е Тимирязевское чтение. М.: Наука. 1982.-с.83.

62. Кулаева О.Н.//Фитогормоны как регуляторы активности генетического аппарата и синтеза белка у растений.//Новые направления в физиологии растений/Отв. ред.Курсанов A.JI. М.: «Наука». 1985. - с.62-84.

63. Куприянова Ф.Г., Давыдова М.Н., Кузнецова Н.Н., Винтер В.Г. Стимуляция размножения дрожжей Candida tropicalis экзогенными нуклеаза-ми.//Биологические науки. 1982. - № 10. - с.91-94.

64. Кузнецов А.Е., Сорокодумов С.Н., Винаров А.Ю. и др./Способ получения биомассы дрожжей//Пат. 2268924 Россия, МПК7 C12N 1/00, C12N 1/16, 27.01.06. Бюл. N03.

65. Лилов Д.Ц., Божинова И.Д., Панделиев С.Г., Христов Х.Д., Андо-нова Т.А., Зозикова Е.И. «Влияние и ингибиторы ростовых процессов у растений, Москва., «Наука». 1988. - с.89-97.

66. Любимова Н.В./Лектины в процессе межклеточного узнавания при фитофторах картофеля.//Автореф. дис. докт.биол.наук. М.: Ин-т биохимии им. А.Н.Баха РАНЕ. 1991. -с.55.

67. Максименко О.А., Зюкова JI.A. и др. Метод одновременного определения различных моносахаридов в биологических объек-тах.//Аналитическая химия. 1971. -т.24. - в.12. - с.2467-2471.

68. Максименко О.А., Зюкова JI.A., Федорович P.M. Определение общего количества углеводов в кормовых дрожжах антроновым мето-дом.//Прикл.биох. и микробиол. —1971. т.УП. - вып.2. - с.139-144.

69. Максименко О.А., Зюкова Л.А., Федорович P.M. Определение общего количества углеводов в сухих дрожжах.//Прикл. Биох. И микробиол. -1975,-№11.-с.127-131.

70. Максимов В.И., Каверзнева Е.Д. О характере действия лизоцима на олигосахариды, являющиеся фрагментами хитина.//Биохимия. 1965. - т.ЗО. - с.1007.

71. Максимов В.И., Каверзнева Е.Д. О характере действия лизоцима на олигосахариды являющиеся фрагментами хит ина.// Микробиол. синтез (Труды института «ВНИИсинтезбелок»), 1974. - вып.7. - с.3-12.

72. Максимов В.И., Мосин В.А. Простой метод обнаружения и выделения олигосахаридов, фрагментов хитозана, после ионообменной хроматографии.// Изв. АН СССР. Сер.хим. 1969. - № 11. - с.2579.

73. Максимов В.И., Зашихина Д.В./Биотехнология. 1994. - 2. - с.2628.

74. Максимов В.И., Каверзнева Е.Д., Кравченко Н.А. /Биохимия 30.-1007.-1965.

75. Максимов В.И., Тепелина О.М./Хитодекстрин как субстрат и затравка в реакции лизоцима с олигосахаридами//Биохимия. 1966.-t.31,-вып.5.-с.918-923.

76. Максимов В.И./Докл. АН СССР. 1967.- с.172-210.

77. Максимов В.А. с соавт. Регулятор роста растений.//А.с. № 1730754.1992.

78. Максимов В.И., Денисов В.М., Макаров М.В./Способ получения водорастворимых олигосахаридов//Авт. св. СССР № 1571047, кл. С08 В 37/08. Приоритет от 24.03.88. опубликовано 15.06.90. Бюл. № 22.

79. Максимов В.И., Смирнова Ю.В., Зашихина Д.В., Савченков С.Н., Мосин В.А./Способ получения водорастворимых олигосахаридов. Патент № 2057761. С08В 37/08 Приоритет от 23.04.93г. Опубликован БИ № 10 за 1996г.

80. Максимов В.И., Родоман В.Е., Максимова Е.В./Способ получения водорастворимых олигосахаридов. Патент на изобретение № 2126012,С1 :С07 Н 3/06, С08 В 37/00, 37/08. Приоритет от 17.03.97. Опубликован 10.02.09. Бюл. №4.

81. Максимов В.И., Родоман В.Е., Максимова Е.В./Метод определения гексозаминов в хитиновых гидролизатах/ЯТрикл. биох. и микробиол. 1999.-т.35.-№ 2.-с.227-230.

82. Максимов В.И., Максимова Е.В., Родоман В.Е./Экологические аспекты переработки хитинового сырья//Тез. IV Всероссийской конференции «Производство и применение хитина и хитозана». ВНИРО, Москва, 25-26 апреля 1995г.

83. Максимов В.И., Родоман В.Е./Хитиновые олигосахариды для преодоления дисбиоза кишечника и стимуляции иммунитета//Тез. VII съезда Всерос. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 1998.-Т.1.-с.271-272.

84. Максимов В.И. Углеводные стимуляторы бифидобакгерий. //Биотехнология, 2991. № 6. с.3-7.

85. Максимов В.И., Смирнова Ю.В. Сернокислотно-ферментативная переработка хитина. //Биотехнология, 1993. № 10. с.26-30.

86. Максимов В.И., Мосин В.А., Максимова Г.Н., Воробьева Г.И. Метод определения {3 глюканазной активности.//Прикл. Биох. и микробиол. 1975. - t.XI. - в.З,- с.455-459.

87. Максимов В.И., Тепелина О.М. Хитодекстрин как субстрат и затравка в реакции лизоцима с трисахаридом.//Биохимия. 1966-Т.31. - с.918.

88. Максимов В.И., Мосин В.А., Максимова Г.Н. /Синергизм действия модельной смеси ферментов//Микробиол. пром.- 1980. № 3. - с.8-10.

89. Максимов В.И., Смирнова Ю.В./Сернокислотно-ферментативная переработка хитина//Биотехнология, 1993. № 10. - с.26-30.

90. Максимов В.И., Родоман В.Е./Хитин как сырье для получения глюкозаминовой добавки к пище//Материалы VI Межд. конф. «Новые перспективы в исслед. хитина и хитозана». Москва-Щелково, 22-24 окт. 2001.-с.208-212.

91. Максимов В.И., Родоман В.Е., Лунцевич В.Г./Фитоактивные хитиновые соединения/ЯТриклад.биохим. и микробиол. 1997. - т.ЗЗ. - №4- с. 355-362.

92. Максимов В.И., Родоман В.Е., Воскун С.Е., Быков В.П., Фурман Д.И./Препарат на основе хитина «солихит» для лечения кишечного дисбакте-риоза у животных//Матер. 5-ой конфер. по хитину и хитозану. Щелково. 2527 мая 1999 г. Изд. ВНИРО. с.164-168.

93. Максимов В.И.//Успехихимии.1973.т.42.-№11.-с.2073-2094.

94. Максимов В.И.//Успехи соврем.биологии.01980.-т.89.-№1.-с.41-57.

95. Максимов В.И.//Прикл. биохимия и микробиология. 1988.-т.24,-b.3.c.291-304.

96. Максимов В.И.//Прикл. биох. микробиол. 1982.-т.18.-с.659-663.

97. Максимов В.И.//Биотехнология, 1989. т.5.-с.607-611.

98. Максимов В.И., Крушев Л.Г., Савченков С.М. / Биотехнология, 1992. № 4. - с.60-62.

99. Максимова Г.Н., Винаров А.Ю./Использование биостимуляторов в процессе получения биомассы кормовых дрожжей: Микробиологическое производство: Обзоры. Информ. М.:ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1990.-Вып. 3.

100. Максимова Г.Н./Интенсификация биотехнологических процессов получения дрожжевой биомассы повышенного качества.//Диссертация, д.б.н. 1995.

101. Максимова Г.Н., Мосин В.А., Максимов В.И., Воробьева Г.И. Глюкан-хитиновый комплекс клеточных стенок парафинокисляющих дрож-жей//Прикл.биох. и микробиол.-1982.-т.18.-В.4.-с.529-534.

102. Максимова Г.Н./Действие сульфита на клетки микроорганизмов (обзор)//Биотехнология. 1994.-№2- с.19-22.

103. Максимова Г.Н., Винаров А.Ю., Казанцев Ю.Е., Воронова Е.А., Гаврилов В.Б./Исследование действия полигиббереллинового препарата и его композиции с сульфитом натрия на рост парафинокисляющих дрож-жей.//Биотехнология.-1994.-№ 3. —с. 17-23.

104. Максимова Г.Н., Галдина JI.B., Сергеева JI.M., Воробьева Г.И., Григорьева С.П. Динамика роста дрожжей на средах с компонентами окисленных парафинов.//Микробиол. пром. 1979. - № ЗА. - с.4-7.

105. Максимова Г.Н., Винаров А.Ю.//Использование биостимуляторов в процессе получения биомассы кормовых дрожжей. Обзорная информация. ВНИИСЭНТИ НП «Медбиоэкономика». М., 1990. Вып.З.

106. Малек И., Фенцл ЗУ/Непрерывное культивирование микроорганизмов. Теоретические и методические основы./Пер. с англ. М.: Пищевая промышленность. - 1968. - 544с. - с.68-75.

107. Мелконян А.Б.//Роль аминокислот семейства глутаминовой кислоты в метаболизме различных источников углерода дрожжами. Диссертация на соиск.уч.ст. канд.биол.наук. Москва. - 1980.

108. Морозова К.А./Разработка биотехнологии препаратов кислых про-теаз на основе высокоактивного мутантного пггамма aspergillus oiyzae 107 для использования в производстве спирта//Диссертация на соиск.к.т.н. М.-2006.

109. Мшпке И.В.//Микробные фитогормоны в растениеводстве. 1988. - Рига. «Зинатне».

110. Муромцев Г.С., Агнистикова В.Н.//Гормоны растений гиббереллины. М. - 1973. - с.269.122122. Муромцев Г.С., Агнистикова В.Н.//Гиббереллины.-М. 1984. -с. 207.

111. Наумова Г.В., Кособокова Р.В., Райцина Г.И., Лях В.В., Кореневич Н.Л. Биологически активные препараты из торфа.//Получение и применение регуляторов роста; межвуз. сб. науч.трудов.-Ленинград. 1968.

112. Отчет «Экспериментальное изучение аллергенных свойств хито-декстрина». Лаб. прикладной иммунофармакологии, зав.лаб.Е.Р.Рубцова.

113. Отчет лаб. прикл. иммунофармакологии (зав.лаб. «Биотехнология» Е.Р.Рубцова) «Исследование влияния хитодекстрина на реакции клеточного иммунитета 1992. НПО «Биотехнология».

114. Отчет по теме: «Исследование активации хитодекстрином клеточного иммунитета» НПО «Биотехнология», науч.рук. Виха Г.В.

115. Отчет по теме: «Исследование бифидогенного действия хитодекстрина» Ивановский гос.мед.ин-т. Науч. исслед. Центр. Утв.-проректор по науч.работе проф. Р.Р.Шилаев. 1992.

116. Отчет «Испытания высокоэффективных композиций при кормлении цыплят на Марьинской птицефабрике». 1992.

117. Отчет об экспериментальном исследовании общетоксического действия хитодекстрина. Рук. лаб. токсикологии лек. препаратов ВНИИ Биотехнологии д.б.н. Г.Г. Порошенко. Утв. Зам. дир. ВНИИ Биотехнологии М.Р. Мукумов. 7.10.1991г.

118. Отчет по доклинической оценке безопасности препарата «Хито-декстрин». Рук-ль зав.лаб. «Оценки репродуктивной безопасности лекарственных средств» АО «Биотехнология», к.м.н. Скосырева A.M. Утв. Зам.директора АО «Биотехнология» М.Р. Мукумов 12.12.1992г.

119. Отчет по х/д № 646 (1990): «Разработка экспериментального образца хитодекстрина и изучение его в качестве регулятора роста и иммуностимулятора» Утв. Зам.Ген. директора НПО «Биотехнология» Ю.А. Белогор-цев.

120. Отчет «Медико-биологические исследования хитодекстрина»

121. Проверка влияния ХД на клеточный иммунитет.

122. Определение антителообразующих клеток (АОК).

123. Изучение адьювантного действия ХД.

124. Отчет «Заключение о клиническом испытании в лаборатории иммунологии клинической больницы ЦМСЧ-119 хитодекстрина.

125. Решетник О.А., Ежкова Г.О., Каневская Е.Г., Кирпичников П.А./Регуляция антиоксидантом роста, состава и физико-химических характеристик липидов Saccharomyces cerevisiae//Доклады Акад.наук (ДАН) -1996.-т.346.-№5.-с.705-707.

126. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова Н.И., Кадиева

127. A.Т./Мультиэнзимные системы для повышения эффективности спиртового производства/ТМикробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК.-М.: Пищепромиз-дат, 2004. С.209-215.

128. Римарева Л.В., Оверченко М.Б. Роль протеаз в спиртовом броже-нии//Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК.-М.: ВНИИПБТ.2006.-с. 127-137.

129. Патент ГДР №205695.- 1982, кл.С12, 1/28.

130. Петрухина М.Е., Максимов В.И., Лунцевич В.ГУ/Достижения био-технологии-аграрнопромышленному комплексу. Черновцы: Черновицкий го-суд.университет им. Ю.Федьковича.-1991.-т.1.-с.76.

131. Петрухина М.Т., Максимов В.И., Бордак М.Н., Лунцевич

132. B.Г.//Хитодекстрин-перспективный регулятор роста растений. Экологически безопасные и беспестицидные технологии получения растениеводческой продукции: Пущино.-1994.-с.229-231.

133. Петрухина М.Т., Максимов В.И., Лунцевич В.Г., Бордак М.Н./Перспективы использования хитодекстрина в растениеводстве//Матер. 5-щй конфер. по хитину и хитозану. Щелково. 25-27 мая 1999г. Изд. ВНИРО. -с.98-101.

134. Победимский Д.Г., Решетник О.А., Шишкина Л.Н., Ершов В.В., Бурлакова Е.Б. Антиоксиданты как стимуляторы роста промышленных микроорганизмов.//Биоантиоксидант; Ш Всесоюзная конференция, 27-29 июня 1989, Москва, т.1. с.87-88.

135. Полевой В .В .//Фитогормоны. Л., 1982. - с.248.

136. Покровский А. А. Медико-биологический аспект исследования углеводородных дрожжей.//Медико-биологические исследования углеводородных дрожжей (1964-1970гг.) М.: Наука. 1972. - с.59-70.

137. Павловец Н.М., Яковлев В.И., Старикова Е.К., Станчинскене Э.С., Исаев В.А. Влияние стимуляторов из оксидата сланцев на биосинтез амила-зы.//Получен, и применен, регулятор.роста». Л.,-1986.-е.59-62.

138. Павловец Н.М., Сухаревич В.И., Яковлев В.И. и др. Влияние Лен-технина на биосинтез гидролитических ферментов.//Микробиол.пром-сть,-1983.-№ З.-с.П.

139. Петрова И.С., Винцюнайте М.М. Определение протеолитической активности ферментных препаратов микробиологического происхожде-ния.//Прикл. биох. и микроб. 1966. - т.2. - в.З. - с.322-327.

140. Перт С.Д.//Основы культивирования микроорганизмов и клеток. -М.: Мир. 1978. - с.103-104.

141. Работнова И.Л.//Роль физико-химических условий (рН и гНг) в жизнедеятельности микроорганизмов. 1957. -Изд-во АН СССР, Москва.

142. Работнова И.Л. и Позмогова И.Н.//Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. «Наука», М,- 1979.

143. Решетник О.А., Мингалеева З.Ш., Победимский Д.Г.Влияние панкреатической дезоксирибонуклеазы на рост дрожжей рода Candida при различных способах культивирования./ЛГр.хим.-техн.ин-та,-1985. № 135. -с.33-36.

144. Решетник О.А., Мингалеева З.Ш., Победимский Д.Г. Влияние ан-тиоксиданта на рост дрожжей рода Candida при различных способах культи-вирования.//Биотехнология. 1986. - № 2. - с.60-63.

145. Римарева JI.B., Войнарский И.Н., Устинников Б.А., Яровенко B.JL, Коновалов С.А. Влияние протеолитических ферментов на физиологическое состояние и размножение дрожжей.//Ферм. и спиртовая пром-сть. 1983. - № 2. - с.36-39.

146. Решетник О.А., Киселева З.Ш., Ежкова Г.О./Интенсификация процесса выращивания пекарских дрожжей на мелассе//Межд. конф. «Науч.-техн.прогресс в перерабатывающих отраслях АПК», Москва 16-18 мая. 1995.-с.136.

147. Щз Э. Химическая микробиология. Издательство «Мир», Москва.-1971.

148. Рухлядева А.П., Горячева М.Г. Метод определения активности амилолитическихферментов.//Ферм. и спирт.пром-сть, 1966,-№ 1.-С.9-12.

149. Рябчук В.А., Помазкова В.А., Федорович Р.М. Аминокислотный состав кормовых дрожжей, выращенных на углеводородах.// Приклад.биох. и микроб.-1971. т.7.-вып.2.-с. 134.

150. Самойлов П.М. Энергетические процессы при окислении н-алканов у микроорганизмов.//Успехи биолог.химии. 1978. -т.19.-с.130-150.

151. СанПин 2.3.2.560-96. Москва-1997. Код 516.-c.260.

152. Саубенова М.Г. Полисахариды дрожжевых организмов.-Алма-Ата: Наука. 1976.

153. Соболева И.С., Крицкий М.С. Низкомолекулярные соединения нуклеотидной природы в регуляции онтогенеза грибов.//Успехи микробиоло-гии.-1987.-№ 21.-C.59-87.Москва «Наука».

154. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот.//Биохимия.-1958.-т.23.-№ 5.-е.656-661.

155. Сухаревич В.И. Научные основы использования синтетических углеводов и продуктов окисления горючих сланцев в процессе микробиологического синтеза. Автореф.докт.дис. Jl.-1984.-c.378.

156. Теодозакис Д., Эддерли Б., Фокс Б. Лечение артрита и артроза.-СПб' Питер Ком. 1999.-c.256.

157. Торев А.К.//Промыпшенная технология за производство на мицел от висши гръби. София, 1973., Издательство на Българската Академия на наукате. Селскостопанска Академия «Георги Димитров», Лабортория по микология и биохимия Пловдив.

158. Тулякова Т.В. и др./Способ производства хдебопекарских дрож-жей//А.с. СССР 2016896, 5 С 12 N 1/16; 28.01.92.

159. Феофилова Е.П. Образование хитина микроскопическими гриба-ми.//Биол.науки.-1981 .-№ 6. -с.5-20, № ll.-c.5-26.173/а. Феофилова Е.П.//Клеточная стенка грибов. М.: Наука.-1983.с.248.

160. Фостер Дж.//Использование углеводородов для роста и развития микроорганизмов. Доклад на заседании Моск.отдел.Всес.микробиол.об-ва при АН СССР, 6-7 января 1964.

161. Хавезов И., Зецалев Д.//Атомно-адсорбционный анализ.-JI.: Химия. 1983.

162. Хорушкин В.В. Интенсификация процесса выращивания кормовых дрожжей добавлением частичноокисленного н-парафина.//Микроорганизмы-продуценты биологически активных веществ. Тезисы докладов конференции молодых ученых.-Рига,-1984.-с. 102.

163. Шеламова С.А., Дерканосова Н.М., Янышева Н.В./К вопросу о влиянии липидов на жизнедеятельность дрожжей//Биотехнол.на рубеже двух тысячелетий: Мат.межд.науч.конф., Саранск, 12-15 сент., 2001, с.155-156.

164. Шкидченко А.Н. Физиологическое состояние дрожжей при кинетическом, физиологическом и метаболическом типах лимитирования .//В сб.: Рост микроорганизмов. Пущино.-1984.-с.118.

165. Штрейблова Е. Архитектоника клеточных стенок дрожжей. //Изв. АН СССР, сер.биол. 1977.-№ 3.-С.410-421.

166. Юрьев Д.Н., Квасенков О.И., Ратников А.Ю./Способ получения хлебопекарных дрожжей// А.С. № 2119951, 6 С12 N 1/18., 03.07.97г.

167. Яковлева Е.П., Алексеева Л.Е., Кузнецова О.С., Корнилов А.И., Сухаревич В.И. Природа стимулирующих веществ, содержащихся в продуктах жизнедеятельности дрожжеподобных грибов .//Микробиология, 1986.-т.55.-в.2.-с.198.

168. Bartnicki-Garcia S., //Cell wall chemistry. Morphogenesis and Taxonomy of fungi.-Ann.Rev. Microbiol.-1968-p.87-108.

169. Bartnicki-Garcia S., Lippman E.//Inhibition of mucor rouxii by polyoxin D: effect on chitin synthetase and morphological development//-J.Gen.Microbiol.-1972,-71,-p.301-309.

170. Beattie B.S., Finzi E.//Proc. 5th INT, Symp. Yeast.Toronto,-1981,-p.351-355.

171. Bell D.Y., Northcote D.H.//Y.Chem.Soc.//,-1950„ N 3- p.1944.

172. Boiler T.//Chitin in NatureTechol. N.Y.: Plenmn Press.-1986.-p.223230.

173. Boot R.G., van Acterberg T.A.E., van Aken B.E. et al Strong induction of members of the chitinase family of proteins in atherosclerosis.//Arterioscler. Tromb. Vase Biol., 1999. V. 19. P. 687-694.

174. Cabib E. //The synthesis and degradation of chiiIrt//Adv.Enzymology-1987.-V.59-p.59-101.

175. Chaplin M.F., Kennedy J.F.//Carbohydrate Analysis, a practical Approach. Oxford-Washington: JRL. Press.-1986.P.174-176/

176. Chitin and chitosan: Speciality Biopolymers for Foods, medicine, and Industry.-1989.-N5A.

177. Chitin: Natyral for the 21th Centyru//Atlanta: Peachtree-Dunwoody Road, 1995.-20 p.

178. Decleire M.-, De Cat W., Van Huynh N.,//Enzyme and mikrobiol Technol.//-1987.-V.9.-N5-p.300-302.

179. De Nobel Y.G., Dijkers C., Hooijbegg E. and Klis F.M.// Increased cell Wall porosity in Saccharomyces cerevisiae after Treatment with Dithiotheitol or EDTA//J.Gen.Microbioi.-1989.-N 135.-p.2077-2084.

180. Doyle R.Y., Chaloupka Y., Y. Vinter V., Turnover of cell wall in Microorganisms//Microbiological Reviews. Dec.-1988.-p.554-567.

181. Duffus Y.H., Levic., Manners D.Y. Yeast cell wall glucans Adv.Nficrobiol. Physiol.-1982.-V.23.-p. 151-181.

182. Farkas V. Biosynthesis of cell walls of fungi //Microbiol.Rev.-1979.-V.43.-p.l 17-144.

183. Farkas V. Fungal cell walls; tneir structure biosynthesiss and biotechnological aspects .//Acta Biotech.-1990.-V.20.-p.225-238.

184. Fa. Y.-H.P.,Demain A.L. Dependence of betaine stimulation of vitamin B12 overproduction on protein synthesis//Appl.Env/MICR.-1984.-N 47.(3)-p.l067-1069.

185. Folch Y., Less V., Stanley G.H., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues//Y. Biol. Chem.-1957.-V.226.-p.497-501.

186. Grosskoff D.J., Felix J., Boiler T.// Plant Phusiol.-1991.-V.138.-N 6,-p/741-746.

187. Hackman R.H.//Austral.j. Biol.Sci.-1962.-V.12.- N 3.-p. 526-537.

188. Hadwiger L.A., Eristensky В., Rigglema R.C.//Chitin, chitosan, and Related Enzymes N.Y.; Acad/P^ess 1984, p. 291-302. //Bioprocess Fechnol. 1987-V.9.-N 7.-Р.4-6.

189. Jakubowski \\^йо1с!//Действие окислительного стресса на Sac. Cerevisiae/Post.boil.komorki, 1998/-25, N 3.-C.429-447 (Обзор).

190. Jicku V., Ludvik J., Cejkova A., Krumphanzi V.Biotin dificincy in yeast electron microscopic analysis//Zeitschr.allg.Mikrob. 1982.-V. 22 (6)- p/389-393.

191. Kauss H., Jeblick W., Domard A.//Planta.-1989.-v.l78/-N 3/-P.385392.

192. Kendzo L.F., Hadniger LA.//Exp. Mycol. 1984.-vol.8.-N 3, c. 276-281.

193. R. Lambert, F. Zilliken//ABB.-1965.vol.ll0, N 3.-p.544-550.

194. Lehle L. Biosynthesis pf mannoprotein in fungi//Encyclopedia of plant physiology. Berlin: Springer Verlag. 1981-v. 133.-p. 459-483.

195. Lowry O.M., Rosebrough H.Y., Fars A.D.,Randal R.L. Protein measarment with the Folin phenol reagent//J.Biol.Chem.-1951.-v.l93.-p.265-270.

196. McCarty M.F. Glucosamine may retard atherogenesis by promoting endothelial production of heparan sulphate proteoglycans. //Med. Hypotheses, 1997. V. 48, N2. p. 245-251.

197. Menshov V.A., Shishkina L.N./Механизм действия H202 на активность винных дрожжей/ZVitis: Vitienlat. and Enol. Absir. 1999.-38.-N 4.-c. 29.

198. Muzzarelli R.A.A., Chitin, 1977. Pergamon Press.

199. Muzzarelli R.A.A., Biagini G., 1993. Role and fate of exogenous chitosans in human wound tissues.//Chitin enzymology, Eur. Chitin Soc., Ancona, 1993. P. 187-196.

200. Nelson N. 1944 J.Biol. Chem., 153,375.

201. Nortcote D.H. The structure and organization of the poll saccharides о yeast// in Proc. Symp. Chem. and Biochem. of fungi and yeast. Butter. Worths., London, Pure Appl. Chem.-1963.-7-p.669.

202. Olsen R., Schwartzmiller D., Weppner W., Winandy R. Biomedical application of chitin and its derivatives.// Chitin, Chitosan, Int. Conf., 4th, Trodheim, Norway, 1988,-London, N.Y., 1989. p.813-828.

203. Panjo L.K., Zhang J.J.// j.Nematol.-l993.-v.25.-N 4.-p.526-540.

204. Parodi AJ.Biosynthetic mechanisms for cell envelope polysaccharides// Yeast cell envelopes; biochistry, biophysics and ultrastructure. Boca Ratonadaton: CRC Press.- 1982.-V.2.-p.47-77.

205. Patil S.G., Patil B.G//Chitin supplement speeds up the ethanol production in cane melasses fermentation/ZEnzyme Microbiol. Technol.-1989.-vol.ll.-N l.-p.38-43.

206. Patil S.G.,Gokhale D.V. and Patil B.G./Novel supplements enhance the efeancl production in cane molasses fermentation by recycling yeast cell/ZBiotechnology Letters, V.l 1/-N 3.-1989.-p.2/3-216.

207. Phaff H.I.ImThe Yeast.Physiology and bijchemistry (pf yeast:2.-New Yjrk,-1971.-p.l35.

208. Rising F.Y., Strominger F., Zelors L.F.//F/ Biol.Chem.-1955.-V.217.-p. 959.

209. Robert N.K., Selitrennikoff C.P.//J.Gen.Microbiol. 188.-V. 134.-N l/-p. 169-176.

210. Rut M., Stros F. Stimulace rustu Candida utilis amoniakalnum ekstraktem ziskanym pri shizovani obsahu nukleinovyck kyselin//Kvasny Prum.-1980.-26.(3).-p.57-64.1. V/

211. Rybarova J., Cerny V., Reisinger J.Kultivace Kvasinky Candida utilis na etanolovem substratu. 4.1 dace stimulujicich latek z melasovych vypalku/ZKvansky prumysl.-1979.-r.25.-c.9.s.200-202,207-209.

212. Salyers A.A. Activities of polysaccharide-degrading bacteria in the human colon.// In: Dietary Fiber: Chemistry, Physiology, and Health Effects (Eds. D. Kritchevsky, C. Bonfield, J.W. Anderson). Plenum Press, N.Y. and London, 1990. P. 187-194.

213. Sentandreu R., Herrero E., Martines-Garcia J.P., Larriba G. Biogenesis of the yeast cell walI//Subcellular Biochemistry. N.y.: Plenum Press.-1984.-V.10.-p.193-235.

214. Spreen K.A., Zikakis J.P., Austin P.R.//Chitin, chitosan/ Relat. Enzymes.-1984.-P.57-75. Acad. Press. Jnc., Orlando E.L. 1984.

215. Suzuki S., Watanabe Т., Mikami Т., Matsumoto Т., Suzuki M.//Adv. In Chitin and Chitosan, Eds. Brine С J. et ai, Elsevier Sci. Publ., 1992. p. 96-105.

216. Ulsen R., Schwartzniller D., Weppner W., Ninandy R.// Chitin and chitosan-N.Y.: Acad. Press.-1989.-p.813-828.

217. Vojtkova-Lepsikova Anna, Kossaczka Zuzana, Machova//Vitamin effects on yeast growth utilizing sugar mixture from xylose residual//Biologia-1987.-V.42.-N 3.-p.259-265.

218. Weiner M.L.//Adv. Chitin Chitosan.-London.-N.y-. Elsevier appl. Sci. 1992. P. 663-670.

219. Yeast cell envelopes, biochemistry, biophysica a. ultrastructure, V.l, CRG Press, Fla.-1981.

220. Zabrodskij A.C., OsoVik A.U., Psevorskaya V.J., Kaljuznyi Farosjuk D.D. Ferment. Spirt. Prum.-1975.b.20 c.3.

221. Zlotnik H., Fernandez M.P., Bowers В., Cabib E. Saccharomyces cerevisiae mannoproteins from an external cell wall Layer that determines wall porosity//J.Bacteriol.-1984.-V. 159.-p. 1018-1026.

222. Zeichmeister L., Toth U. Zur Kenntnis der hydrolyse von Chitin mit salzsaure (I. Mitteil).-Ber. Deutsch. chem. Qes.-l 93 l.-b.64.-s.2028-2035.

223. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ '

224. Белорусский' научно-исследовательский санитарно-гигиенический -. , : • ИНСТИТУТ ~ ••• • ^fr^s. УТВЕРВДАЮ , • • Директор .Белорусского. .• ;•; -/J "

225. Кого санитарно-гигие-- •• 1 ического-:института;, i ; 'ОшаЯ В. А. Стельмах"' марта 1996 года ! \

226. Токсиколога-гигиеническая "оценка препарата Хитодекстрин включала экспертизу имеющейся научно-технической литературы , а также экспериментальные исследования на лабораторных животных.

227. Хитодекстрин получают из хитина панцырей ракообразных животных !чкрабоЕ и креветок; путем обработки серной кислотой,.

228. ЛД50 для белых мышей и крыс при внутрижелудочном введении более 25000 мг/кг. Клиническая картина интоксикации характеризовалась гиподинамией и нарушениями со стороны желудочно-кишечного тракта. Гибели ливотных не отмечено.

229. ЛДзо хитодекстрина при внутрибрюшинном введении белым крысам составляет 1т/кг массы тела.

230. При трехкратном нанесении хитодекстрина на неповрежденную кожу белых крыс в дозе 5000 мг/кг не наблюдалось гибели животных и раздра

231. Следовательно,'; хитодекстрин.в.'условиях: многократного воздействия > нахвосты бельк крыс не обладает обще токсическим и раздражающим дейс-^твием.'/: " ' " ' '•.-•

232. Изучение ингаляционного воздействия хитодекстрина

233. Ингаляционное воздействие хитодекстрина изучали в .'условиях' ежед- . невной -в течение месяца затравки белых крыс в концентрации 160,2 мг/м3 Контрольные животные получали в;эквивалентных объемах воду.

234. Ингаляционное воздействие хитодекстрина не вызывает проявления признаков интоксикации и гибели подопытных животных.

235. Не обнаружена статистически достоверных изменений.показателей . выделительной■системы почек (табл. 5).

236. Не■зарегистрировано изменений изученных биохимических показателей: содержания в'крови глюкозы, в сыворотке■крови-общего белка, общих липидоз, общего .холестерина, активности лактатдегидрогеназы, каталазы, фруктоза-!,5-дкфосфатальдолаз (табл.6).

237. Л|||Щ}ка^ывает' общетоксичеокого действия.

238. Р ЕКО'МЕ н-д А Д ИИ "•-,;•:;•.'.:

239. К-работе допускаются лица, достигшие 18-летнего.возраста, проще дшие инструктаж по технике безопасности,, промышленной санитарии, противопожарной профилактике, обученныебезопасным методам работы.

240. Ведущий научный сотрудник, " канд.мед.наук

241. Старший научный сотрудник, канд. мед. наук.

242. Старший научный сотрудник, ■f;' канд. биол. наук • •

243. А.Алексашина Н.А.Каган А.И,Крысанова'1. ПРОТОКОЛ

244. Результатов исследования по определению токсичности композиционного биостимулятора (КБС)

245. Организация исполнитель: ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиеныи экологии.

246. Аттестат аккредитации № РОСС RU. ООО 1.21 .П040 от 25 октября 2001 г.

247. Объект исследования: композиционный биостимулятор (КБС),состоящий из отдельных биостимуляторов, оказывающих синергический эффект на рост ^ развитие дрожжей при концентрациях 10 -10 от каждого исходного.

248. Препарат получен в ФГУП ГосНИИсинтезбелок.

249. Вид животных: белые мыши с массой тела 18-20г

250. Результаты исследований: За период наблюдений отклонений отфизиологической нормы не наблюдали при максимально вводимой дозе 20 г/кг массы тела. Клиническая картина не выражена. Патологических изменений во внутренних органах не обнаружено.

251. Заключение: На основании проведенных исследований установлено,что композиционный биостимулятор (КБС) НЕ ТОКСИЧЕН.1. В.Г. Иванов1. В.И.Дорожкин

252. Гл. научный сотрудник лаборатории Токсикологии и санитарии кормов, Доктор ветеринарных наук

253. Зав. Лаборатории токсикологии и санитарии кормов, профессорктораяополоцкий завод БВК |йг Э.Э.Сандар W // 2005 г.и1. АКТиспытаний по интенсификации процесса биоконверсии зерносырья в промышленном биореакторе

254. Работа проводилась в соответствии с договором №18-228/05-06 по теме "Интенсификация процесса биоконверсии зерносырья культурой S.cerevisiae diastaticus ВКПМ-У-1218 в условиях промышленного производства".

255. В период испытаний использовали культуру S.cerevisiae diastaticus ВКПМ-У-1218.

256. Испытания биостимулятора в условиях Новополоцкого завода проводили в несколько этапов, каждый из которых различался способом подачи и количеством подаваемого стимулятора.

257. В качестве контрольного периода был взят период с 01.09. по2009.2005.

258. На первом этапе композиционный биостимулятор подавали в виде водного раствора (t° = 60-70°С) в ферментеры ФО-2/1 и ФО-3/2 после подачи в них инокуля. ,та (в соответствии с технологической инструкцией по применению биостимулятора роста клеток).

259. Активированная суспензия из аппарата ФО-2/1 передавалась в аппарат ФО-3/2, в который также подавали биостимулятор. Активированная культура из ФО-3/2 передавалась в промышленный аппарат.

260. Анализ работы аппаратов чистой культуры выявил существенное снижение длительности ферментации в присутствии биостимулятора (см.табл.1).

261. В процессе испытаний в отделении чистой культуры проведен анализ работы промышленного ферментера ФО-4/Ю.

262. Основные усредненные технологические показатели процесса ферментации в период испытаний представлены в табл. 2.

263. В период испытаний состояние культуры в промышленном ферментере также оценивалось как хорошее по состоянию цитоплазмы и количеству почкующихся клеток.

264. Наблюдали некоторое улучшение работы очистных сооружений, что проявилось в снижении сбрасываемых на биопруды ХПК, фосфатов, сульфатов, азота и взвешенных веществ.

265. Это позволило рекомендовать внедрить разработанную технологию для получения "Провита" в условиях РУП "Новополоцкий завод БВК".

266. От ФГУП ТосНИИсинтезбелок": От РУП "Новополоцкийзавод БВК":д.б.н., профессор зав.лаб. с/х биотехнологии ^ Г.И.Воробьева1. Главный технологд.б.н., вед.науч.сотр. лаб.с/х биотехнологии ФГУП 'ТосНИИсинтезбелокк1. Ведущий инженер1. SI

267. Анализ работы ферментеров ОЧК в присутствии биостимуляторов

268. Период Ферментер Кратность Длительность Снижениеп/п накопления ферментации длительностичасы) часы % отн.

269. Контроль ФО-2/1 10 14 ч. 10 мин.

270. Опыт 1 ФО-2/1 2 8 ч. 30 мин. 5 ч. 40 м. (-43 %) (21.09)

271. Опыт 2 ФО-2/1 1 8 ч. 15 мин. 6 ч. (-43 %) (11.10.05)1. Контроль1. ФО-3/12514 ч.1.я ферментация) 11 ч. (последующие)1. Опыт 1 (23.09-26.09)1. ФО-3/2106 часовснижение на 5-8 часов6. Опыт 21. ФО-3/2 118 часовснижение на 3-6 часов

272. Анализ работы промышленного ферментера в контрольный (01.09.05 20.09.05) и опытные периоды испытания стимуляторов2109. 26.09 и 11.10. - 21.10.05)

273. РВ общ./своб. Время выращивания Расчетная Расх. коэф-ициент по зерно -сырьюп/п Вариант Вход Выход % утилизации Проток м /час АСВ % производительность ТАСВ сут.

274. Контроль (01.09-20.09) 41/7,5 6,7 83,7 58,9 7,8 8,1 114,5 1,548

275. Опыт 1 (21.0926.09.05) 39/9,3 6 84.7 59,0 7,6 8,4 118,9 1,48

276. Опыт 2 (11.1020.10.05) 39/7,9 7,8 80.0 62,3 7,7 8,4 125,6 1,475

277. Качество готового продукта в период испытаний по интенсификации процесса биоконверсии зерносырья в промышленном биореакторе (октябрь 2005 г.)п/п Наименование показателей Ед. изм. Контроль 1.09 20.09 Опыт 1 21.09-25.09.05 Опыт 2 11.10-20.10.05

278. Гран. Пор. Гран. Пор. Гран. Порош.

279. Мае. доля влаги % П,4 10,5 10,75 10,25 10,05 10,3

280. Мае. доля сырого протеина % 41,2 41,7 39,8 40.7 42,5 42

281. Мае. доля по Барнштейну % 28,8 29.4 30,8 30,8 31,6 32,3

282. Мае. доля золы % 4,1 4,12 4.1 4,16 4,1 4,0

283. Мае. доля сырого жира % 6,2 6,8 7,0 7Д 6,7 6,7

284. Контроль 54 8 - 8,2 - 1,48 - 39,8 - 29 - 80,7 -

285. КБС1 67 24 7,2 -10 8,9 8,5 1,42 -8,4 41,2 3,5 30,8 6,2 106,7 32,2 352 127 760з: КБС2 75 38,9 6,6 -17,5 8,6 4,9 1,37 -11,6 42,1 5,8 30,6 5,5 113,7 40,9 645 567 560

286. Плановый выпуск провита 31000 тонн

287. Расходный коэффициент по зерносырью на производство провита 1,48 т/т Стоимость 1 тонны зерносырья 189 316 руб.

288. Вариант с использование КБС 1. 1,48 -1,42 = 0,06 * 189 316 * 31 000 = 352 127 760 руб. Вариант с использование КБС 2. 1,48- 1,37 = 0,11 * 189 316*31 000 = 64^ 1 Главный эконол1. Заместитель на11. Платонова Е.В.

289. СОГЛАСОВАНО» Заместитель директора ШНИИПБТ» фофессор дерева 2008г.

290. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ

291. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ КОМПОЗИЦИОННЫХ БИОСТИМУЛЯТОРОВ-КБС (КОМПОЗИЦИОННЫХ АКТИВАТОРОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ КАБС) НА СПИРТОВЫХ ЗАВОДАХ .1. Москва 20081. АКТ №2.

292. Промышленных испытаний по интенсификации производства спирта.

293. Краткая характеристика Дубровского спиртового завода:

294. Производственная мощность составляет 2500 дал. спирта в сутки.

295. В период испытаний завод работал на зерновом сырье рожь. Средний показатель крахмала составлял в период испытаний 54,8%.

296. В качестве производственной культуры на заводе используются сухие дрожжи компании «Фермиол», Франция.

297. Производство спирта осуществляется по классической технологии: подготовка крахмалсодержащего сырья; разваривание; осахаривание разваренной массы; приготовление дрожжей; сбраживание осахаренного сусла; выделение спирта из бражки и его ректификация.

298. На заводе используется 2-х ступенчатая Мичуринская схема высокотемпературного (138-140 град. С) разваривания измельченного сырья.

299. Применяемые ферментные материалы:- Диазим Х4 (11,4 литра на т/уел. крахмала);- Глюкозим JI400 (1,15 литра на тонну крахмала);- Амилекс JIT (0,4 литра на тонну крахмала);- Брюзайм -целюлаза (0,07 литра на тонну крахмала);

300. Кроме того, в дрожжанку дополнительно подаётся Протеаза 106 (0,1 литра на дрожжанку).

301. На заводе применяется периодический способ брожения. Время брожения в среднем составляет 60 64 часа.

302. Бродильное отделение оборудовано 9 бродильными чанами с рабочим объёмом бражки 100 куб.м. Геометрический объём чанов 130 куб.м.

303. Для борьбы с инфекцией применяется средство «Фриконт», который задаётся в дрожжанки при их складке в количестве 10 грамм на дрожжанку.

304. Выделенный на бражной колонне спирт подаётся на ректификацию.

305. Анализ качества спирта осуществляется:- физико-химический (типовыми растворами) лабораторией филиала;- газохроматографический в Центральной лаборатории ОАО «Брянскспиртпром».

306. Технология и цель испытаний.

307. КАБС при испытаниях подавался в виде раствора в дрожжанку перед подачей дрожжей из неё в бродильный чан.

308. Испытания проводились в один этап:

309. Контрольные шесть чанов (без КАБС) закладывались по два чана в начале, середине и в конце испытаний.

310. Параметры процессов сведены в Таблицу №1.

311. В таблице 2 приведены усреднённые параметры брожения по каждому виду КАБС и контролю.

312. Динамика процессов (кривые отброда и крепости) приведены на Рис. 1. для каждого из видов КАБС и контроля как усреднённые.

313. Начальные условия: сырьё, ферменты, объёмы дрожжей и сусла, концентрации, температура, начальная кислотность и другие параметры контрольных чанов аналогичны чанам с КАБС.

314. В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

315. Выбор оптимального варианта КАБС;

316. Анализ результатов испытаний:

317. Начиная с 24 час. брожения, через каждые 4 часа определялись показатели крепости и отброда.

318. В конце процесса брожения для каждого чана определялись следующие параметры:- не гидролизованный крахмал;- не сброженные углеводы;- выход спирта;

319. Объём бражки после залива определяется с помощью мерной линейки.

320. Чаны с КАБС VI и КАБС - V , начиная с 40 часов брожения показали более высокую крепость как в процессе брожения, так и в конце его.

321. Выход спирта (См. Таблицу 2) в чанах с КАБС в среднем выше контроля в зависимости от вида активатора в диапазоне от 8 до 47,4 дал, или от 0,85 до 6,69 %.

322. Проведенные испытания показали проявление интенсифицирующих свойств на всех видах КАБС.

323. Наиболее эффективным оказался КАБС -VI, применение которого способствует увеличению выхода спирта на 6,7% относительно контроля.fjq

324. Применение КАБС способствует улучшению качества спирта, снижая концентрацию примесей уже на этапе зрелой бражки, что облегчает работу ректификационного оборудования и способствует более высоким потребительским свойствам готовой продукции.

325. Считаем целесообразным применение КАБС VI для интенсификации процесса спиртового брожения с целью увеличения выхода спирта и улучшению его качества.

326. О г ОАО «БРЯНСКСПИРТПРОМ»:1. От ООО «ФЕРМАТА»:1. Главный технолог:д. б. н., профессор:

327. Боброва»ковц М.И. Начальник Центральной лаборатории:1. Воробьёва Г.И.д. б. н.1. Максимова Г.Н.

328. Зав. произволе 1вом ф-л «Дубровский»

329. Макарова Е.А. Начальник лаборатории ф-л «Дубровский»1. Казакова Л.Д.1. Директор1. Глухих С.А.

Информация о работе

Максимова, Екатерина Вячеславовна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов и применения их для интенсификации процессов культивирования дрожжей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов и применения их для интенсификации процессов культивирования дрожжей - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы