Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологическая переработка отходов производства гречихи и получение ценных продуктов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологическая переработка отходов производства гречихи и получение ценных продуктов"

На правах рукописи

ГНЕУШЕВА ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ПЕРЕРАБОТКА ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА ГРЕЧИХИ И ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕННЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 03.01.06 — Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук

Воронеж-2014

005557027

005557027

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный Университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Павловская Нинэль Ефимовна

Официальные оппоненты: Канарский Альберт Владимирович,

доктор технических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет», профессор кафедры пищевой биотехнологии

Ухина Елена Юрьевна,

кандидат технических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет имени Петра I», доцент кафедры технологии переработки животноводческой продукции

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский химико-

технологический университет имени Д. И. Менделеева»

Защита диссертации состоится «22» октября 2014 года в 15 ч 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.035.06 на базе ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, г. Воронеж, просп. Революции, 19, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» (ФГБОУ ВПО ВГУИТ) (http://www.vsuet.ru).

Автореферат разослан г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Шуваева Галина Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В настоящее время актуальными являются научные исследования по разработке технологий рационального использования возобновляемых источников растительной биомассы, позволяющих наиболее полно использовать исходное сырье с получением ценных продуктов.

Гречиха посевная (Fagopyrum Esciilentum Mill.) — важная продовольственная, лекарственная и медоносная культура. Благодаря короткому вегетационному периоду (от 64 до 120 суток) может возделываться в занятых парах, в послеукосных и пожнивных посевах, а также использоваться для пересева погибших озимых и яровых культур. В большинстве сельхозпредприятий России гречиха занимает крайне небольшие площади и не играет заметной роли в экономике зернового хозяйства. Лимитирующим фактором формирования сырьевой базы гречневого зерна является низкая урожайность (в среднем 7,9 ц/га).

Большой интерес гречиха представляет собой как источник биофлавоноидов, являющихся биологически активными соединениями полифункцнонального действия. Среди них особенно востребованным на рынке является рутин, широко используемый в медицинской практике, но не имеющий промышленного производства в России и странах Ближнего Зарубежья.

В настоящее время основным источником получения рутина в мире являются бутоны софоры японской (Sophora japónica L.), сырьевая база которой в России отсутствует. Потребность отечественной фармакологической отрасли в рутин-субстанции удовлетворяется за счёт импорта из Бразилии, Германии, Китая. Производство препарата из гречихи посевной является перспективным с экономической и экологической точки зрения (Анисимова, 2011; Клыков, 2013).

Известны различные способы получения рутина из цветков и листьев гречихи посевной, основанные на экстракции сухого сырья водно-спиртовыми растворами или водой с последующей выкристаллизацией при низких температурах и очисткой перекристаллизацией. Степень извлечения соединения составляет 50-70% (Баландина и др., 1982; Heywang, 1992; Huo, 1999).

При этом остаётся нерешённой проблема утилизации отходов от производства биологически активных соединений растительного сырья, которые представляют собой целлюлозосодержащий материал, вследствие своей грубой текстуры не находящий должного применения (Комисаренко, 1994; Федоров, 2004).

Степень разработанности темы. При переработке целлюлозосодержащего сырья, значительный опыт, накопленный в России, показывает эффективность применения методов

микробиологического синтеза в решении этой проблемы с конечным получением кормовых продуктов для животноводства, обладающих высокой биологической ценностью (Эрнст, 1988; Шакир, 1995; Касаткина, 2008).

Научных исследований по биоконверсии целлюлозосодержащих отходов от производства рутина из гречихи посевной в рамках комплексной технологии в литературе нет.

Цель и задачи исследования. На основании вышесказанного цель диссертационного исследования состояла в экспериментальном обосновании возможности использования гречихи посевной (Fagopyrum Esculentum Mill.) для получения биологически активных соединений (в частности рутина) и дальнейшей переработки отходов от их производств в кормовые дрожжи.

Для достижения данной цели были поставлены следующие

задачи:

• разработка технологии получения биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса гречихи сорта Дикуль, широко распространенного в Центральных регионах России;

• исследование химического состава отходов от производства биологически активных соединений гречихи как сырья для культивирования микроорганизмов;

• определение оптимальных параметров предобработки, ферментативного гидролиза отходов от производства биологически активных соединений гречихи и культивирования микроорганизмов с целью получения кормовых дрожжей;

• разработка технологии получения кормовых дрожжей с использованием методов интенсификации роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae стимулятором из соломы гречихи;

• проведение первичной токсико-биологической оценки кормовой биомассы;

• определение технико-экономической оценки комплексной биотехнологической переработки гречихи в биологически активные продукты.

Работа проводилась в соответствии с Федеральной Целевой программой и Перечнем Критических Технологий РФ, подготовленным в соответствии с результатами долгосрочного прогноза научно-технологического развития Российской Федерации до 2030г., утверждённым Указом Президента РФ от 7 июля 2011 г. № 899 (пункт №8 «Нано-, био, информационные, когнитивные технологии».

Научная новизна результатов исследовании. В результате проведенных исследований показана возможность использования всей вегетативной массы гречихи посевной (цветки, листья, стебель) сорта

Дикуль в качестве сырья для получения рутина с извлечением целевого продукта 84%.

Впервые определены оптимальные параметры кислотного и ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего отхода от производства рутина из гречихи посевной, при которых получен ферментолизат с оптимальным составом Сахаров для инокуляции дрожжей БассЪаготусез сегехчьгае.

Разработан и экспериментально обоснован способ получения кормовых дрожжей на ферментативных гидролизатах отхода от производства рутина из гречихи посевной методом глубинного гетерофазного культивирования дрожжей БассИаготусея сеге\чх1ае с применением способов интенсификации роста микробных клеток стимулятором из соломы гречихи.

Практическая и теоретическая значимость работы. Разработан способ получения рутина из вегетативной массы и стимулятора роста дрожжей Ъасскаготусек сеге\ч.Ч1ае из соломы гречихи. Получены патенты на изобретение «Способ получения рутина», «Способ получения стимулятора роста дрожжей Басскагатусе.ч сеге\181аеу>.

Предложены способ получения кормовых дрожжей на ферментативных гидролизатах отхода от производства рутина из гречихи посевной и метод интенсификации роста дрожжевых клеток БассИаготусея сегеу1з1ае стимулятором из соломы гречихи.

Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций по специальности 240700 «Биотехнология» в ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет».

Положения, выносимые на зашнту:

• методологические подходы к переработке вегетативной массы и соломы гречихи в биологически активные ценные продукты;

• технологические схемы получения рутина, стимулятора роста дрожжей Яасскаготусех cerevisiae, кормовых дрожжей.

Апробация результатов исследовании. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на XI Международном симпозиуме по гречихе (г. Орел, Россия, 2010); VI Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2011 г.); Международной научно-практической конференции молодых учёных «Животноводство России в условиях ВТО: от фундаментальных и прикладных исследований до высокопродуктивного производства» (Орел, 2013), на отчётных конференциях в ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет» (с 2009 по 2013 гг.).

Апробирование технологий работы осуществлялась в полупроизводственных условиях на базе ООО «Биосинтез» (г. Орёл).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура II объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследований, четырех экспериментальных глав, выводов, библиографического списка и приложений. Работа содержит 143 страницы машинописного текста, 16 таблиц и 20 рисунков, 7 приложений. Библиография включает 199 наименований, из них 48 зарубежных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика работы, обоснована актуальность научного направления, показана практическая значимость и новизна полученных результатов, определены основные направления исследования.

Глава 1. Состояние вопроса. Представлен анализ литературных данных о гречихе посевной (Fagopyrum Esculentum Mill.). Описаны существующие физико-химические и биотехнологические методы переработки отходов её производства. Рассмотрены способы интенсификации процессов микробной конверсии целлюлозосодержащих отходов с использованием предварительной обработки субстратов. На основании анализа литературного обзора обоснована необходимость разработки технологических решений комплексной переработки гречихи в ценные биологически активные продукты.

Глава 2. Объекты и методы исследований. Исследование проводилось в лаборатории биотехнологии и молекулярной экспертизы ЦКП «Орловский региональный центр сельскохозяйственной биотехнологии», в Инновационном научно-исследовательском испытательном центре на базе ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет».

Основные объекты исследования: вегетативная масса и солома гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Mill.) районированного сорта Дикуль урожая 2009-2013 гг., предоставленные ООО «Биосинтез» (г. Орёл); биологически активные продукты: рутин; стимулятор; отход от производства рутина из вегетативной массы гречихи; ферментолизат отхода, полученного при использовании промышленного фермента Целловиридин Г20х (ТУ 9291-008-05800805-93) (ОАО «Восток», Россия); кормовые дрожжи, полученные при культивированин на исследуемом ферментативном гидролизате производственного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII (предоставленные ОАО «Этанол», г. Орёл).

Экстракцию биологически активных веществ гречихи из высушенного до влажности 6-8% и предварительно измельченного до 5 мм сырья проводили с использованием водно-спиртовых растворов. Подлинность полученных соединений подтверждали качественными и количественными характеристиками.

Предобработку целлюлозосодержащего сырья от производства рутина из вегетативной массы гречихи проводили поэтапно:

• термореагентную обработку - при варьировании показателей рН среды, температуры гидролиза и времени экспозиции в автоматическом вертикальном автоклаве «Бета-25»;

• ферментативный гидролиз - при оптимальных условиях действия целлюлаз (рН 5,0, t - 50°С).

Эффективность процессов предобработки определяли по накоплению редуцирующих веществ (PB) в ферментативном гндролизате.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивировали в глубинных условиях в ферментере Biostat A plus (У3л) при t-30-34°C, рН 6,0, перемешивании 500 об./мин, аэрации.

Для стимулировании роста дрожжевых клеток использовали метод направленной адаптации в процессе выращивания посевного инокулята стимулятором (из соломы гречихи), с последующим культивированием на ферментационной среде, содержащей отработанную культуральную жидкость (рецикл) от выделения целевого продукта.

Биомассу кормовых дрожжей отделяли от жидкой фазы декантацией, подвергали термолизу (75°С, 30 мин.). Сушили полученный продукт при комнатной температуре до остаточной влажности 7-8%.

Токсико-биологическую оценку кормовой биомассы по органолептическим и физико-химическим показателям оценивали по ГОСТ 20083-74 «Дрожжи кормовые. Технические условия» и ГОСТ 2817889 «Дрожжи кормовые. Методы испытания».

Исследования проводили в трёхкратной повторности и в трёх сериях экспериментов. Статистическая обработка данных выполнена с использованием программы Microsoft Office Excel 1 8. Данные в таблицах -среднее значение ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3. Технология получения биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса гречихи посевной. При

изучении динамики накопления биофлавоноидов (в том числе рутина) в процессе роста гречихи посевной, показано, что их содержание существенно различается по фазам вегетации растения (таблица 1).

Таблица 1 — Содержание биофлавоноидов (в том числе рутина) в вегетативной массе гречихи в зависимости от фазы вегетации

время сбора сырья фаза вегетации содержание биофлавоноидов (%) содержание рутина (%)

30.05 всходы 4,76±0,02 1,92±0,06

8.06 ветвление 4,92±0,03 2,12±0,19

14.06 бутонизация 5,08±0,12 2,33±0,04

15.07 начало цветения 5,12±0,11 2,44±0,17

21.07 массовое цветение-начало плодоношения 5,57±0,12 3,30±0,09

31.07 плодоношение 5,52±0,20 3,04±0,25

12.08 солома после обмолота зерна 2,43±0,18 1,10±0,11

Большее содержание целевых веществ наблюдается в фазу массового цветения-начала плодоношения и составляет 5,57% суммы биофлавоноидов, 3,30% рутина, что обосновывает срок переработки этого вида сырья в биологически активное соединение - рутин. Содержание биофлавоноидов в соломе гречихи составляет 2,43% (в том числе рутина 1,10%) и является достаточным для получения биологически активных соединений.

Подбор оптимальных технологических параметров экстракции биологически активных соединений гречихи. Влияние температуры экстракции 70%-ным этиловым спиртом и степени измельчения вегетативной массы гречихи (цветки, листья, стебли) на выход биофлавоноидов представлено на рисунке 1.

Полученные данные свидетельствуют, что при экстрагировании исследуемого сырья количественное содержание биофлавоноидов пропорционально увеличению температуры экстрагента. Оптимальным параметром экстракции является применение кипящего 70%-ного этилового спирта и сырья со степенью измельчения до 5 мм. При таких условиях выход биофлавоноидов на 15,84-28,41% выше, чем при других температурных режимах (40-60°С).

Зависимость соотношения сырья:экстрагента от продолжительности экстракции биофлавоноидов представлена на рисунке 2.

50 60 78,9

температура экстракции, °С

Рисунок 1 - Влияние температуры экстракции и степени измельчения сырья на выход биофлавоноидов из вегетативной массы гречихи (70%-ный этиловый спирт, 60мин., соотношение сырьё :экстрагент 1:100)

4

■а .3

из

а>

ЗЕ

X 2

эе

£Х

<Ь> СС 1

О

и

О

п 1 :30

а 1 :50

□ 1 :70

я 1: ЮО

30 бО 120 240

врелпя экстракции, мин

Рисунок 2 - Влияние продолжительности экстракции и соотношения сырьяэкстрагента на выход биофлавоноидов из вегетативной массы гречихи, % (70%-ный этиловый спирт, температура экстракции 78,9°С, средний размер

частиц до 5 мм)

Показано, что на общий выход биофлавоноидов существенно влияет изменение количественного соотношения сырья:экстрагента. Оптимальной продолжительностью процесса экстрагирования биологически активных соединений при соотношении сырьё:экстрагент 1:100 является 60 мин. При этом, выход экстрагируемых веществ составляет 3,66% (степень извлечения целевого продукта 65,7%), что на 19,12-36,88% выше, чем при использовании других исследуемых соотношений. Проведение экстракции при однократном контакте фаз более 60 мин не является рациональным.

С целью повышения выхода целевого продукта из вегетативной массы гречихи посевной было проведено исследование повторного экстрагирования 70%-ным этиловым спиртом при Ь78,9°С в течение 60 мин. в соотношении сырья: экстрагента 1:100, 1:70, 1:50, 1:30. На основе полученных данных построен график зависимости кратности и продолжительности экстракции сырья от степени извлечения целевого продукта (рисунок 3).

30 60 120

время экстракции, мин

В однократно 1:100

□ двукратно -1:100 и 1:100

■ двукратно -1:100 и 1:70

□ двукратно -1:100 и 1:50

■ двукратно -1:100 и 1:30

Рисунок 3 — Зависимость продолжительности экстракции вегетативной массы гречихи от степени извлечения биофлавоноидов

При проведении повторного экстрагирования сырья, степень извлечения биофлавоноидов составляет 90,48%, что на 27,38% больше, чем при проведении экстракции в одноконтактной фазе.

Технологические параметры экстрагирования биологически активных соединений гречихи посевной (экстрагент 70%-ный этиловый спирт, температура экстракции 78,9°С, средний размер частиц до 5 мм, соотношение сырьё:экстрагент при первом контакте фаз 1:100, при втором - 1:50, экспозиция по 60 мин) легли в основу способов получения биофлавоноидов гречихи.

Получение рутина из вегетативной массы гречихи посевной. В лабораторных условиях из вегетативной массы гречихи (цветки, листья, стебли), собранной в фазу массового цветения-начала плодоношения, водно-спиртовой экстракцией с дополнительным последовательным очищением рутина-сырца растворителями с возрастающей полярностью был получен рутин, подлинность которого установлена методом ВЭЖХ (рисунок 4).

Сопоставление времени удерживания, высоты пика и его площади с аналогичными показателями стандарта рутина позволяют полученное вещество идентифицировать как рутин, не содержащий посторонних примесей. Выход продукта из вегетативной массы составляет 84%.

Рисунок 4 - Хроматограммы: а) ГСО рутина, б) рутина из вегетативной массы

гречихи

При достаточно невысоком содержании целевого продукта (рутина) в гречихе посевной - его получение при использовании методов исчерпывающей (полной) экстракции обеспечивает высокий выход биологически активного соединения.

Получение биологически активных соединений из соломы гречихи. Избирательной экстракцией из соломы гречихи был получен биологически активный продукт, содержащий в своём составе цианидин и кверцетин, которые будут использоваться в дальнейших исследованиях в качестве стимулятора роста дрожжей.

Глава 4. Исследование способов предобработки целлюлозосодержащего отхода от производства рутина из вегетативной массы гречихи посевной как сырья для получения кормовых дрожжей. Эффективная биологическая конверсия субстратов, содержащих лигноцеллюлозу, в значительной степени зависит от реакционной способности сырья.

Химический состав целлюлозосодержаицих отходов от производства биологически активных соединений биофлавоиоидного комплекса гречихи посевной как сырья для культивирования микроорганизмов. Изучение химического состава исследуемых отходов показало, что лимитирующим фактором их биоконверсии микроорганизмами является достаточно высокое содержание целлюлозы и лигнина, биополимеров, устойчивых к действию ферментов (таблица 2).

Ферментативный гидролиз целлюлозы тормозится

экранирующим действием лигнина, что делает необходимым использование физико-химических методов предварительной обработки растительного сырья (Роговин, 1972; Duff and et., 1996; Мамыкин и др., 1998).

Таблица 2 - Химический состав отходов производства биологически активных соединений гречихи посевной

определяемые показатели содержание в исследуемых отходах. % в а.с.с.

из вегетативной массы из соломы

влажность 8.35±0,08 7,89±0,03

«сырой» протеин 4,06±0,32 2,95±0,08

«сырая» клетчатка 39,89±0,12 44,95±0,28

«сырой» жир 1,84±0,05 1Д8±0,04

«сырая» зола 6,25±0.19 2.19±0,12

сухие вещества, нерастворимые в воде 68,88±0,08 74,62±0,11

целлюлоза 26,56±0,24 34,59±0,36

гемицеллюлоза 9,40±0,58 12.69±0.36

лигнин !6,54±0,09 23,56±0,25

вещества, экстрагируемые горячей водой, в том числе 20,89±0,34 12,36±0,06

- моносахаров 2,44±0,36 0,96±0,03

- олигосахаров 0.21±0,04 0,14±0,12

сумма биофлавоноидов 0,52±0,12 0.94±0.23

Для получения кормовых дрожжей в дальнейших исследованиях использовали целлюлозосодержащий отход от производства рутина из вегетативной массы гречихи.

Оптимальные технологические параметры предобработки целлюлозосодержащего отхода от производства рутина из вегетативной массы гречихи посевной. Результаты химического состава исследуемого отхода, наличие в его составе полисахаридов с разной реакционной способностью, определяют проведение кислотного гидролиза субстрата путём многоступенчатого процесса. В первой стадии необходимо создание условий деструкции основной массы легкогидролизуемых полисахаридов и разрушения лигнина механохимическим способом, во второй — гидролиза целлюлозы до гексозных Сахаров, усваиваемых продуцентами белка. Эффективность предобработки определяется температурой, концентрацией катализатора и продолжительностью процесса.

На первом этапе с целью разрушения гемицеллюлозы осуществлялся мягкий гидролиз при рН 3,0 и жидкостном модуле 1:15. В качестве катализатора использовали серную кислоту (в концентрации 0,5-3 моль/л). После окончания гидролиза гидролизат сливали, субстрат высушивали и подвергали дополнительному механическому измельчению (до 0,1-0,2 мм). Эффективность щадящего кислотного гидролиза экспериментального субстрата по отношению концентрации катализатора,

температуры гидролиза и продолжительности процесса к выходу редуцирующих веществ представлена на рисунке 5.

а)

чр

т"

а. 4

ш г

I

го 2

о. ш

■ 0,5 моль/л □ 0,7 моль/л В 1,0 моль/л

■ 3,0 моль/л

100 120 145 160 температура гидролиза, °С

б)

са а.

х

го

о. ш сС

О

□ 120°С

30 45 60 120

продолжительность гидролиза, мин

Рисунок 5 - Эффективность щадящего кислотного гидролиза исследуемого отхода

(по содержанию редуцирующих веществ) в зависимости: а) от концентрации катализатора и температуры гидролиза; б) от температуры и продолжительности

гидролиза

Оптимальным является использование 3,0 моль/л раствора Н2804. При температуре 100°С в течение 60 минут содержание редуцирующих веществ в гидролизате составляет 5,12%. При увеличении продолжительности (до 120 мин) и температуры гидролиза (от 100°С до 160°С) происходит снижение РВ на 5,27-13,02%.

При повышении температуры гидролиза скорость реакции образования РВ больше скорости их распада, что обусловливает подбор режима термогидролиза исследуемого отхода с таким расчётом, чтобы распад Сахаров был наименьшим. Эффективность процесса термогидролиза при разных температурных режимах представлена на рисунке 6.

Рисунок 6 — Эффективность процесса термогидролиза по отношению температуры гидролиза к фракционному составу Сахаров в конечном гидролизате

При повышении температуры в процессе термогидролиза происходит увеличение содержания поли- и олигосахаридов (от 18 до 45%) и снижение моносахаридов (очевидно за счет их реверсии). Оптимальная температура термогидролиза (120°С) обеспечивает наименьшую потерю Сахаров.

Таким образом, оптимальными параметрами двухступенчатого процесса кислотного гидролиза являются: при щадящем — катализатор 3,0 моль/л раствор Н2804, рН 3,0, жидкостной модуль 1:15, Ы00°С, время экспозиции 60 минут, измельчение до 0,1-0,2 мм; при термогидролизе -катализатор 3,0 моль/л раствор Н28 04, рН 3,0, жидкостной модуль 1:10, I-120°С, давление 1,5 атм., время экспозиции 30 мин. Содержание РВ в конечном гидролизате (9,94%) недостаточное для инокуляции дрожжами, что подтверждает необходимость проведения ферментативного гидролиза субстрата.

При обработке результатов экспериментальных данных по подбору фермент-субстратного соотношения по методу наименьших квадратов, получены регрессионные зависимости показателей концентраций ферментного препарата Целловиридин Г20х (продуцент ТпсЪос1егта гее^ег) и субстрата (гидролизата) к выходу редуцирующих веществ (рисунок 7).

у = 5,0408х3 - 15,647х2 + 16,953х + 12,029

тгщдгп—

"у^ЭЫУх1 - 4, А4Ьх^ + Ю.ЬЬЬх + 10,169 __В1= £19936

♦ 5% (масс.) ■ 10% (масс.)

* 15% (масс.)

у = 9,2657х3 - 25,334х2 + 24,144х + 8,3157

„^ _ 09939

О 0,5 1 1,5

концентрация Целловиридина Г20х, % (масс.)

Полиномиальная (5% (масс.))

■ Полиномиальная (10% (масс.))

Полиномиальная (15% (масс.))

Рисунок 7 - Регрессионные зависимости концентрации препарата Целловнридин Г20х и субстрата к выходу редуцирующих веществ

Показано, что оптимальным фермент-субстратным соотношением является концентрация Целловиридина Г20х 1,0% (масс.) (10 ед/гр. ЦА) и 10% (масс.) суспензия исследуемого гидролизата (РВ 18,27%). Однако, при введении ферментного препарата в дозе 0,5% (масс.), уровень прироста редуцирующих веществ тоже является достаточно высоким (17,38%). Но повышение дозы фермента до 1,0% не является целесообразным, так как не обеспечивает адекватного прироста Сахаров (на 4,8%). Увеличение концентрации субстрата до 15% (масс.) приводит к снижению Сахаров на 10,75%.

Зависимость концентрации ферментного препарата в 10%-ной суспензии исследуемого гидролизата от продолжительности ферментолиза (по выходу редуцирующих веществ) представлена на рисунке 8.

Корреляция между концентрациями ферментного препарата от 0,5% (масс.) до 1,0% (масс.) при всех четырёх обозначенных границ продолжительности процесса ферментолиза незначительна, что подтверждает нерациональность использования большей концентрации фермента. При использовании Целловиридина Г20х в концентрации 0,5% (масс.), в сравнении с другими концентрациями, наблюдается снижение продолжительности ферментолиза до 110 мин.

со о.

<и

о

5 о

100 110 120 время ферментолиза, мин

1! 0,5% (масс.)

□ 0,6% (масс.) «0,7% (масс.)

□ 0,8% (масс.) В 0,9% (масс.)

□ 1,0% (масс.)

Рисунок 8 - Влияние концентрации Целловиридина Г20х и продолжительности ферментолиза 10% (масс.) суспензии исследуемого гидролизата на выход редуцирующих веществ

Таким образом, оптимальными параметрами ферментативного гидролиза являются: 10% (масс.) суспензия гидролизата, концентрация Целловиридина Г20х 0,5% (масс.), рН 4,5,1-50°С, 110 мин.

Полученный ферментолиза г отхода от производства рутина из вегетативной массы гречихи посевной содержит в своём составе гексозных Сахаров 61,9% (масс.) и непроферментированную полисахаридную фракцию, представленную остаточными содержаниями целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина (таблицы 3, 4).

Таблица 3 — Фракционный состав Сахаров в ферментолизате

углеводы содержание, % (масс.)

пентозы 0,Ь-арабиноза 16,8±0,14

Б-ксилоза 12,1 ±0,09

гексозы В-глюкоза 20.8±0,62

Б-галактоза 18,7±0,21

Б-манноза 12,6±0,20

О-фруктоза 9.8±0.13

смесь поли- и олигосахаридов 9,2±0,36

Таблица 4 - Содержание нерастворимых сухих веществ (легко- и грудногидролизуемых полисахаридов) в ферментолизате

нерастворимые сухие вещества содержание. % в а.с.с.

целлюлоза 5.44±0.11

гемицеллюлоза 1,92±0,06

лигнин 11,05±0,25

В целях комплексной безотходной переработки целлюлозосодержащего сырья использование полученного двухкомпонентного ферментолизата для получения дрожжевой биомассы является перспективным. Полисахаридная фракция в составе кормовых дрожжей будет обеспечивать энергией организм животного.

Глава 5. Способ получения кормовых дрожжей на ферментолизате отхода от производства рутина из вегетативной массы гречихи посевной. Выбор производственного штамма дрожжей ЯассИаготусех cerevisiae расы XII для получения кормовых дрожжей на исследуемом двухкомпонентном ферментолизате обусловлен скоростью роста данного штамма и способностью ассимилировать питательные вещества субстрата.

Применение способов интенсификации роста дрожжей Басскаготусев сеге\>'тае при получении кормовых дрожжей на исследуемом ферментолизате. Выбор стимулятора роста дрожжей, полученного из соломы гречихи и представленный кверцетином и цианидином, обусловлен действием биофлавоноидов в качестве активных катализаторов окислительно-восстановительных реакций фенольных соединений, использование которого не только защищает дрожжевую клетку от фенолов сырья, стимулируя тем самым их рост, но и обогащает микробную биомассу биологически активными соединениями.

Показана целесообразность использования стимулятора на стадии подготовки посевного материала дрожжей БассИаготусез се/-еушае, подверженных многократному (до 5 пассажа) воздействию биологически активными соединениями соломы гречихи (рисунок 9).

пассажи

Рисунок 9 — Характеристика процесса накопления биомассы культурой БассИаготусея сегеу1$1ае при введении стимулятора в разных концентрациях на стадии подготовки посевного материала микроорганизма в каждом последующем пассаже (контроль — без введения стимулятора)

При гетерофазном глубинном культивировании дрожжей Басскаготусеъ сегем1$1ае, подверженных воздействию стимулятором в каждом последующем пассаже в концентрации 10"9%, наблюдается увеличение концентрации биомассы микроорганизма на 42,8%, при использовании концентраций 10"8 и 10"9% - соответственно на 31,1 и 32,5%.

Для повышения выхода микробной биомассы рассмотрена возможность использования отработанной кулътуральной жидкости от выделения целевого продукта (рецикла) при добавлении в разных объёмах в ферментационную среду культивирования адаптированного посевного материала дрожжей 1-5 пассажей (стимулятором в концентрации 10"9%) (рисунок 10).

о <0

ю ет: х 3" го о. )-I <11 =г

I

о -х.

35 30 25 20 15 10 5 О

1 г 2 3 ............1

5

. 1б|

1Ш......... и

: 100% 70% ; 50% \ 30% : 10% 5%

1 Шконтроль

3

пассажи

Рисунок 10 - Характеристика процесса накопления биомассы культурой Засскаготусея сегеУ1$1ае при добавлении рецикла в ферментационную среду при использовании адаптированного посевного материала 1-5 пассажей (контроль — без

введения рецикла)

При использовании в культивировании адаптированного посевного материала дрожжей 1-5 пассажей при добавлении в ферментационную среду культивирования рецикла в объёме от 30 до 100% показано значительное снижение концентрации микробной биомассы (до 30,8-77,3%).

Оптимальным является применение 10% объёма рецикла, позволяющего повысить накопление биомассы адаптированными дрожжами (стимулятором в концентрации 10"9%) 5 пассажа на 53,53%. (рисунок 11).

£ 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12

о продолжительность ферментации, ч

—♦—без стимулирования - с применением стимулирования

Рисунок 11 - Характеристика процессов накопления биомассы адаптированной и неадаптированной культурой ЗассИаготусе5 сегеУ151ае в зависимости от продолжительности ферментации

Использование в качестве посевного инокулята дрожжей БассИаготусея сегеУ1Я1ае 5 пассажа, адаптированных к специфическому субстрату стимулятором, позволяет на 19% сократить время наступления стационарной фазы роста микроорганизма, фазы, в которой биомасса и продукты её биосинтеза обладают наибольшей биотехнологической ценностью. Получена биомасса дрожжей, содержащая 38,95% «сырого» протеина. Токсико-биологическая оценка которой (по ГОСТ 28178-89 «Дрожжи кормовые. Методы испытания») показала биологическую полноценность и безвредность продукта.

Глава 6. Технико-экономическая оценка комплексной биотехнологической переработки гречихи посевной в ценные биологически активные продукты. На основе проведенных исследований разработана совмещённая технологическая схема комплексной биотехнологической переработки гречихи посевной сорта Дикуль в ценные биологически активные продукты (рисунок 12).

растительное сырье ч т.п.1. экстрагирование рецикл т.п.1.

/

этиловый спирт 70°С 1 т.п.2. фильтрация >• т.п.З. упаривание

* +

ЦС отход < т.п.5. сушка отхода т.и.4. получение БАС

-----*

вода

т.п.6. 10% (масс.) суспензия отхода

Рисунок 12 - Совмещённая технологическая схема биотехнологической переработки гречихи посевной сорта Дикуль в ценные биологически активные продукты

Общий экономический эффект, полученный при производстве биологически активных продуктов из гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Mill.) сорта Дикуль (рутина, стимулятора и кормовых дрожжей), составил 25,62%. Себестоимость продуктов в 1,0-1,3 раза меньше, по сравнению со средними рыночными ценами. Что и определяет перспективу использования данного рода возобновляемого сырья в обеспечении фармацевтической отрасли и животноводства ценными продуктами. При этом успешно решаются экологические проблемы трудногидролизуемых целлюлозосодержащих отходов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. На основании анализа динамики накопления биологически активных соединений гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Mill.) сорта Дикуль обоснованы оптимальные технологические параметры экстракции биофлавоноидов сырья. Из вегетативной массы гречихи получен рутин со степенью извлечения целевого продукта 84%, из соломы цианидинкверцетинсодержащий продукт.

2. Показано, что отход от производства рутина из вегетативной массы гречихи может быть использован для получения дрожжевой биомассы.

3. Определены технологические стадии получения ферментолизата отхода от производства рутина: щадящий кислотный гидролиз (рН 3,0, жидкостной модуль 1:15, t-100°C, время экспозиции 60 минут, измельчение до 0,1-0,2 мм), термогидролиз (рН 3,0, жидкостной модуль 1:10, t-130°C, давление 1,5 атм., время экспозиции 30 мин.), ферментолиз (10% (масс.) суспензия гидролизата, концентрация Целловиридина Г20х 0,5% (масс.), рН 4,5, t-50°C, 110 мин.).

4. С целью увеличения накопления дрожжевой биомассы доказана эффективность направленной адаптации дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII на стадии подготовки посевного материала до 5 пассажа стимулятором (цианидинкверцетинсодержащим продуктом из соломы гречихи) в концентрации 10"9% и культивировании продуцента белка на ферментационной среде, содержащей 10% рецикла. Получены кормовые дрожжи с содержанием «сырого» протеина 38,95%.

5. Показана экономическая целесообразность и социальная значимость предложенных технологий производства ценных биологически активных продуктов из гречихи посевной (рутина, стимулятора и кормовых дрожжей).

6. Научная новизна и практическая значимость работы подтверждены патентом №2505307 РФ, МПК А61К36/70, А61К31/352, B01D11/02 «Способ получения рутина», опубл. 27.01.2014, Бюл. №3 и патентом на изобретение №2483105 РФ, МПК C12N 1/18, C12R 1/85

21

«Способ получения стимулятора роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae», опубл. 27.05.2013, Бюл. №15.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ: Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Павловская, Н.Е. Технология создания биологически активных добавок для животноводства [текст] / Н.Е. Павловская, И.В. Горькова, И.Н. Гагарина, И.А. Гнеушева, АЛО. Гагарина // Вестник Орел ГАУ. —

2011. - №6 (33). - С.29-32. - 0,35 п. л. (лично автором - 0,07 п. л.).

2. Гнеушева, И.А. Фотосенсибилизирующее действие гречихи и продуктов ее биотехнологической переработки [текст] / И.А. Гнеушева, И.Ю. Солохина, И.В. Горькова, Н.Е. Павловская // Вестник Орел ГАУ. —

2012. - №2 (35). - С.45-47. - 0,35 п. л. (лично автором - 0,09 п. л.).

3. Гнеушева, И.А. Кормовые биологически активные добавки для промышленного животноводства [текст] / И.А. Гнеушева, И.Ю. Солохина, H.H. Полехина, Н.Е. Павловская // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2012. -№3. - С. 30-32. - 0,35 п. л. (лично автором - 0,09 п. л.).

4. Полехина, H.H. Токсикологическая оценка кормовой биологически активной добавки для промышленного животноводства [текст] / H.H. Полехина, И.Ю. Солохина, И.А. Гнеушева, Н.Е. Павловская // Вестник Орел ГАУ. - 2013. - №1(40). - С. 111-115. - 0,52 п. л. (лично автором - 0,13 п. л.).

Публикации в других изданиях и материалах конференций

5. Гнеушева, И.А. Биотехнологические методы обработки растительного сырья [текст] / И.А. Гнеушева И.А., Н.Е. Павловская // Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященной 35-летию Орловского государственного аграрного университета «Инновационный потенциал молодых ученых — АПК Орловской области»: [сборник]. Орел: Изд-во Орел ГАУ, 2010. - С. 66-68. - 0,17 п. л. (лично автором - 0,09 п. л.).

6. Павловская, Н.Е. Создание оптимальных условий для экстрагирования биофлавоноидов из соломы гречихи [текст] / Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, И.В. Горькова, И.Н. Гагарина // Материалы III Международной интернет-конференции «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству»: [сборник]. Орел: Изд-во Орел ГАУ, 2010. - С. 21-23.-0,14 п. л. (лично автором - 0,04 п. л.)

7. Павловская, Н.Е. Антиоксидантная активность продуктов биотехнологической переработки гречишного производства [текст] / Н.Е. Павловская, И.Ю. Солохина, И.А. Гнеушева, И.В. Яковлева // Тезисы докладов VIII Международной конференции «Биоантиоксидант». Москва,

4-6 октября 2010 г.: [сборник]. М.: РУДН, 2010. - С.117-118. - 0,12 п. л. (лично автором — 0,03 п. л.)

8. Pavlovskay, N. Manufacture of secondary valuable products of the basic of waste products of cultivation and processing of buckwheat [text] / N. Pavlovskay, I. Gorkova, I. Gagarina, I. Gneusheva // «Advances in buckwheat research» Proceeding of the 11th International Symposium on Buckwheat (July 19-23, 2010, Orel, Russia) - Orel, «Kartush», 2010. - P.736-743. - 0,93 п. л. (лично автором - 0,23 п. л.).

9. Гнеушева, И.А. Биотехнологические подходы для получения белково-углеводных кормовых добавок для животноводства [текст] / И.А. Гнеушева, И.В. Горькова, В.Н. Дедков // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Развитие инновационного потенциала агропромышленного производства» 24 ноября 2010 года: [сборник]. Орел: Изд-во Орел ГАУ, - 2010. - С.45-48. - 0,23 п. л. (лично автором - 0,08 п. л.).

Ю.Гнеушева, И.А. Биотехнологическая переработка отходов производства гречихи [текст] / И.А. Гнеушева, Н.Е. Павловская // Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых «АПК в современном мире: взгляд научной молодежи» (19-22 апреля 2011): [сборник]. Орел: Изд-во Орел ГАУ. - 2011. - С.24-28. - 0,29 п. л. (лично автором — 0,15 п. л.).

П.Парахин, Н.В. Биологическая ценность продуктов биоконверсии соломы злаковых [текст] / Н.В. Парахин, Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, В.Н. Дедков, И.Ю. Солохина, И.В. Яковлева // Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 21-25 марта 2011 г., г. Москва: [сборник]. М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2011. -С.50-51. — 0,23 п. л. (лично автором - 0,04 п. л.).

12. Гнеушева, И.А. Исследование биологически активного полифенольного комплекса сухого экстракта соломы гречихи [текст] / И.А. Гнеушева // Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Пути повышения устойчивости растениеводства к негативным природным и техногенным воздействиям» (21-25 марта 2011 г.): [сборник]. Орел: Изд-во Орел ГАУ, 2011. - С.72-74. - 0,12 п. л. (лично автором - 0,12 п. л.).

13. Павловская, Н.Е. Получение Б AB из соломы гречихи биотехнологическим методом [текст] / Н.Е. Павловская, И.В. Горькова, И.А. Гнеушева, В.Н. Дедков // Материалы Международной научно-практической конференции «Инновации аграрной науки и производства» (14-15 декабря 2011 г.): [сборник]. Орел: Изд-во Орел ГАУ. - 2011. -С. 124-127. — 0,17 п. л. (лично автором - 0,04 п. л.).

14. Гнеушева, И.А. Биотехнологическая переработка отходов производства гречихи в биологически активные продукты / И.А. Гнеушева, М.В. Старицкова [текст] // Материалы региональной

научно-практической конференции молодых ученых «Современный агропромышленный комплекс глазами молодых исследователей» (17-18 апреля 2012 г.): [сборник]. Орел: Изд-во Орел ГАУ. - 2012. - С.44-48. -0,29 п. л. (лично автором — 0,15 п. л.).

15.Полехина, H.H. Флавоноиды гречихи - биостимуляторы роста Saccharomyces cerevisiae [текст] / H.H. Полехина, И.А. Гнеушева, Н.Е. Павловская // Материалы Международной научно-практической конференции молодых учёных «Животноводство России в условиях ВТО: от фундаментальных и прикладных исследований до высокопродуктивного производства» (9-11 апреля 2013 г.): [сборник]. Орел: Изд-во Орел ГАУ. — 2013. - С.312-315. - 0,23 п. л. (лично автором -0,08 п. л.).

Патенты РФ на изобретения

16. Патент - 2505307 РФ, МПК А61К36/70, А61К31/352, B01D11/02. Способ получения рутина / Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, H.H. Полехина, И.Ю. Солохина, И.В. Горькова; Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Орловский государственный аграрный университет». — № 2012122119/15; Заяв. 29.05.2012; Опубл. 27.01.2014, Бюл. №3. -4 с.

17. Патент - 2483105 РФ, МПК C12N 1/18, C12R 1/85. Способ получения стимулятора роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae / Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, H.H. Полехина; Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Орловский государственный аграрный университет». — № 2012124264; Заяв. 13.06.2012; Опубл. 27.05.2013, Бюл. №15.-4 с.

Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность профессору Павловской Н.Е. за помощь на всех этапах выполнения научной работы и коллективу кафедры биотехнологии за понимание и поддержку.

Подписано в печать 11.07.2014 г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0. Заказ 81. Тираж 100 экз. Отпечатано в издательстве Орел ГАУ, 2014, Орел, бульвар Победы, 19