Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Флавоноиды растений Fagopyrum sagittatum Gilib. (гречихи посевной) и Serratula coronata L. (серпухи венценосной)

ВАК РФ 03.02.14, Биологические ресурсы

Автореферат диссертации по теме "Флавоноиды растений Fagopyrum sagittatum Gilib. (гречихи посевной) и Serratula coronata L. (серпухи венценосной)"

На правах рукописи

Мягчилов Алексей Викторович

Флавоноиды растений Fagopyrum sagШalum СШЬ. (гречихи посевной) и БеггаМа согопШа Ь. (серпухи венценосной) (методы выделения, идентификация веществ, перспективы использования)

03.02.14 - биологические ресурсы

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАР 2015

005559901

Владивосток-2015 г

005559901

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном автономном учреждении высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет»

Научные Горовой Петр Григорьевич

руководители: доктор биологических наук, профессор,

академик РАН

Соколова Лариса Ивановна кандидат химических наук, доцент

Официальные Зориков Петр Семенович

оппоненты: доктор биологических наук, профессор, ФГБУН

Горнотаежная станция им. В.Л. Комарова Дальневосточного отделения РАН, директор

Рыбин Вячеслав Григорьевич

кандидат биологических наук, ФГБУН Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный университет», I". Барнаул

Защита состоится «10» апреля 2015 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.02 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Тел.: 8(423) 231-14-09, факс 8(423) 231-40-50, al_xv@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН) и на сайте: www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан « » февраля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

A.B. Салохин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Растения издавна являются основным постоянно возобновляемым источником биологически активных соединений. Региональная сторона проблемы викариантов Дальнего Востока России состоит в рациональном использования местных видов лекарственных растений. Актуальность этой проблемы объясняется географической и климатической спецификой региона и, как следствие, большим количеством местных видов, замещающих применяемые в официальной медицине лекарственные растения.

Несмотря на значительное и всем известное разнообразие дальневосточной флоры, использование ее видового состава в официальной медицине составляет 1,5 %. Для Приморского края известно лишь 77 видов растений, разрешенных Минздравом России для медицинского использования. Это объясняется слабой изученностью дальневосточных лекарственных растений [Степанова, 1997; Воробьева, 2004].

Особое место в лекарственной флоре Дальнего Востока России занимают растения богатые флавоноидами (шлемник байкальский, володушка козелецелистная, зверобой большой, тысячелистник благородный, ромашка дисковидная) [Максимов, Кулеш, Горовой, 2002]. Многие из них представляют собой резерв для расширения лекарственной сырьевой базы региона.

Одним из малоизученных и распространенных на всей территории Дальнего Востока и Сибири растений, является серпуха венценосная - Serratilla coronata L.s.l. Препараты серпухи венценосной (настои и отвары) в основном находят применение только в народной медицине как вяжущее, желчегонное, противовоспалительное и седативное средство [Серпуха венценосная, электронный ресурс]. Серпуха венценосная, произрастающая в Приморском крае, может являться и перспективным источником для выделения биологически активных веществ (в частности флавоноидов), необходимых для фармацевтической промышленности.

Помимо поиска источников биологически активных соединений не менее актуальной является задача рационального использования растительных ресурсов, поиск путей внедрения в значительной степени безотходных технологий, позволяющих избегать проблем утилизации опасных отходов, образующихся в результате переработки растительного сырья. Гречиха наиболее популярное сельскохозяйственное растение, давно вошедшее в практику пищевого использования. Популярность этого растения обусловлена не только его высокими вкусовыми качествами, но и ценными свойствами, благодаря высокому содержанию флавоноидов, в первую очередь рутина [Клыков, 2000; Determination

of optimised......, 2008; Comparison of phenolic...., 2008; Анисимова, 2010; Клыков,

2014]1.

1 Библиографическая ссылки оформлены в соответствии с ГОСТ Р 7.0.5-2008 БИБЛИОГРАФИЧЕСКАЯ ССЫЛКА. Общие требования и правила оформления.

Однако большое количество отходов (шелуха семян2, трава3), остающихся после переработки, делают ее использование малоэффективным. Из отходов гречихи получают полисахариды, целлюлозу, красители и пищевые добавки, фурфурол, лекарственные препараты и антиоксиданты [Возобновляемые

источники химического сырья...... 2004]. Шелуха гречихи используется в

основном в качестве топлива, наполнителя для подушек, упаковки фруктов и хрупких товаров [Каминский, Карунский, Бабич, 2000; Возобновляемые источники химического сырья......2004].

Извлечение биологически активных соединений их отходов гречихи позволяет решить проблему комплексного использования этого растения.

Цели и задачи исследований. Целью работы являлось исследование состава флавоноидов отходов производства гречихи посевной (Fagopyrum sagittatam Gilib.) и флавоноидов серпухи венценосной (Serratilla coronata L.s.l.), произрастающих на российском Дальнем Востоке.

Задачи исследований:

1) исследовать оптимальные условия выделения флавоноидов из растения (шелухи, травы) гречихи посевной и надземных органов (соцветия, листья, стебли) серпухи венценосной;

2) разработать схему выделения и очистки флавоноидов из этанольных экстрактов (шелухи, травы) гречихи посевной и надземных органов (соцветия, листья, стебли) серпухи венценосной;

3) установить химическое строение выделенных соединений;

4) оценить общее содержание флавоноидов и массовую долю индивидуальных соединений в исходном растительном сырье.

Научная новизна. Впервые из шелухи гречихи количественно выделены биологически активные соединения ситостеролин, относящийся классу фитостеролов и флавоноид витексин. Определена массовая доля этих веществ в траве и шелухе гречихи посевной.

Количественное содержание флавоноидов в надземной части дальневосточных популяций серпухи венценосной (Serratula coronata) оценено впервые.

Методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) проведено разделение флавоноидов гречихи посевной (шелухи, травы) и надземных органов (соцветия, листья, стебли) серпухи венценосной.

Впервые показано, что доминирующим флавоноидом в шелухе гречихи является ориентин.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведено исследование химического состава флавоноидов в отходах (траве, шелухе) производства гречихи посевной - Fagopyrum sagittatum и в надземной части (соцветия, листья, стебли) серпухи венценосной — Serratula coronata.

2 Шелуха - кожура семян некоторых растений.

3 Трава - надземная часть растений (стебли и листья с соцветиями).

4

Разработаны методики количественного анализа флавоноидов в исследуемых растительных объектах.

Исследованы оптимальные условия (температура, соотношение сырье : экстрагент, время экстракции, соотношение компонентов экстрагента) выделения флавоноидов из отходов производства гречихи (шелухи, травы) и надземной части растения серпухи венценосной для комплексной переработки исходного растительного сырья при получении веществ для фармацевтической промышленности.

Предложена упрощенная схема выделения и очистки флавоноидов из исходного растительного сырья без освобождения экстракта от липидов и последующей избирательной экстракции флавоноидов органическими растворителями.

Предложенная схема комплексной переработки шелухи и травы гречихи позволяет выделять из исходного сырья (биологических ресурсов) флавоноиды и ценное биологически активное соединение класса фитостеролов - ситостеролин.

Методология и методы исследования.

При проведении исследований использованы современные методы анализа состава смесей веществ и их количественного содержания в исследуемых растительных объектах: дифференциальная спектрофотометр™, обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ). Строение индивидуальных соединений изучено методами ультрафиолетовой (УФ)-, инфракрасной (ИК)-, ядерно-магнитнорезонансной (ЯМР)- спектроскопии и масс-спектрометрии с различными способами ионизации.

Положения, выносимые на защиту.

1. Условия выделения флавоноидов из отходов гречихи посевной (травы, шелухи) - Fagopyrum sagittatum и из надземной части (соцветия, листья, стебли) серпухи венценосной - Serratilla coronata.

2. Упрощенная схема выделения и очистки флавоноидов из экстрактов исследуемых растительных объектов без освобождения флавоноидов от липидов и последующей избирательной экстракции органическими растворителями.

3. Состав и количественное соотношение флавоноидов в отходах производства гречихи (травы, шелухи) и в надземной части (соцветия, листья, стебли) серпухи венценосной.

4. Ситостеролин - биологически активное соединение класса фитостеролов, впервые выделен из отходов производства гречихи (шелухи).

Степень достоверности и апробация работы.

Достоверность полученных результатов подтверждена привлечением современных физико-химических и физических методов анализа и сравнением их с опубликованными данными.

Основные результаты работы доложены на XX Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии», посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. А.М. Горького (Екатеринбург, 2010 г.), на XXI молодежной научной конференции «Проблемы теоретической экспериментальной химии», посвященной 150-летию

5

со дня рождения академика Н.Д. Зелинского (Екатеринбург, 2011 г.), V Международном симпозиуме «Химия и химическое образование» (Владивосток, 2011 г.), Международной молодежной научно-практической конференции «Альфред Нобель и достижения мировой науки и цивилизации за 110 лет» (Казань, 2011 г.), V Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2012 г.), на II Международной виртуальной интернет конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2013 г). Результаты исследований отражены в 9 печатных работах (3 статьи и б тезисов докладов).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выбор оптимальных условий выделения флавоноидов из отходов гречихи посевной - Fagopyrum sagittatum Gilib. и из надземной части серпухи венценосной - Serratilla coronata L.s.l.

Для практического применения того или иного сырья при получении биологически активных соединений необходимо оценить их содержание в исследуемых объектах.

Для объективной оценки большую роль играет выбор способа выделения, который должен отвечать следующим критериям:

1)выделение максимально возможного количества целевых соединений;

2) экономическая целесообразность;

3) минимальное содержание балластных веществ;

4) использование для целей выделения соединений и растворителей, не представляющих серьезной опасности окружающей среде;

5) возможность осуществления контроля за процессом.

Для выделения флавоноидов и других биологически активных соединений из растительного сырья обычно качестве экстрагента используют водные растворы низших спиртов: этанола или метанола. Степень извлечения флавоноидов из растительного сырья зависит не только от природы экстрагента, но и от других условий: размера частиц исходного сырья, соотношения сырье :экстрагент, кратности экстракции, времени и температуры экстракции.

Для оптимизации процесса извлечения флавоноидов из отходов производства семян (травы, шелухи) гречихи посевной - Fagopyrum sagittatum и надземной части серпухи венценосной (стеблей, листьев, соцветиев) - Serratilla coronata исследовано влияние различных параметров процесса на выход флавоноидов из исходного растительного сырья: а) природы и концентрации экстрагента; б) времени и кратности экстракции; в) температуры; г) соотношения сырья и экстрагента.

В качестве объектов исследования использовали растения, произрастающие в Приморском крае: гречиха посевная (шелуха и трава) - Fagopyrum sagittatum Gilib., урожай 2004-2010 гг.; серпуха венценосная (надземная часть растения:

б

соцветия, листья, стебли) - Serratilla coronata L.s.l., собранная в период 2009-2010 гг.

В таблице 1 представлены результаты, полученные при варьировании параметров экстракции флавоноидов из шелухи и травы гречихи посевной. Таблица 1 - Условия извлечения флавоноидов из шелухи и травы гречихи посевной

Исследуемый параметр Массовая доля флавоноидов в сырье, % в пересчете на рутин Исследуемый параметр Массовая доля флавоноидов в сырье, % в пересчете на рутин

Экстрагент Шелуха гречихи Трава гречихи Соотношение сырье:экстрагент (этанол) Шелуха гречихи Трава гречихи

Вода дистиллированная 0,07±0,03 0,10±0,03 1:10 0,09±0,02 0,20±0,14

Спирт этиловый 1:30 0,14±0,01 0,27±0,07

20% 0,14±0,03 0,20±0,06 1:50 0,14±0,01 0,89±0,07

40% 0,20±0,03 0,81±0,21 1:70 0,14±0,01 0,42±0,07

60% 0,19±0,03 0,99±0,21 1:100 0,14±0,01 0,42±0,07

80% 0,17±0,01 0,27±0,07

96% 0,06±0,01 0,27±0,07

Время экстракции, мин Температура экстракции,°С

30 0,09±0,01 0,33±0,07 20 0,04±0,01 0,27±0,07

60 0,13±0,01 0,89±0,07 40 0,08±0,01 0,33±0,07

90 0,14±0,01 0,99±0,07 55 0,11 ±0,01 0,75±0,07

120 0,14±0,01 0,99±0,07 65 0,13±0,01 0,99±0,07

240 0,15±0,01 0,99±0,07 Кипящая водяная баня 130 0,18±0,01 0,17±0,02 0,99±0,07 0,99±0,14

Кратность экстракции, раз Массовая доля флавоноидов в сырье, % в пересчете на рутин (шелуха гречихи) Кратность экстракции, раз Массовая доля флавоноидов в сырье, % в пересчете на рутин (трава гречихи)

1 0,16 1 0,99

2 0,03 2 0,08

3 0,01 3 0,02

Наиболее полное выделение целевых веществ из исходного сырья достигается при экстракции 40%-ым раствором этанола. Флавоноиды из шелухи гречихи извлекаются практически в равных количествах, как 40 % так и 60 %-ым раствором этанола. По-видимому, использование в качестве экстрагента 40 %-ного раствора этанола, экономически более выгодно.

Максимальное извлечение флавоноидов из сырья достигается двукратной экстракцией на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 90 минут (дальнейшее увеличение времени экстракции до 240 минут не приводило к увеличению выхода флавоноидов) и в соотношении сырье:экстрагент 1:30.

Максимальное выделение флавоноидов из травы гречихи посевной достигается при двукратной экстракции с использованием в качестве экстрагента 60 % раствора этанола в течение 90 минут, соотношение сырье:экстрагент 1:50 и при температуре 65° С.

Увеличение температуры экстракции до 100-130 °С не приводит к повышению выхода флавоноидов из сырья. Таким образом, экстракцию флавоноидов из травы гречихи посевной целесообразно проводить в диапазоне температур от 65 до 130 °С.

Содержание флавоноидов в шелухе и траве гречихи посевной, составляет 0,2 и 1,09 % в пересчете на рутин соответственно. Таким образом, предложенные условия извлечения флавоноидов из шелухи и травы гречихи позволяют наиболее полно выделить эти соединения из исследуемых объектов.

Максимальное извлечение флавоноидов из надземной части серпухи венценосной (таблица 2) достигается двукратной экстракцией сырья 70 % этанолом при соотношении сырье:экстрагент: для листьев и стеблей - 1:30; соцветий - 1:50. Дальнейшее увеличение доли экстрагента при выделении флавоноидов из листьев и стеблей приводит к уменьшению выхода флавоноидов из сырья в 1,5-2 раза.

Таблица 2 - Условия извлечения флавоноидов из надземной части серпухи

венценосной

Исследуемый параметр Массовая доля флавоноидов в сырье, % в пересчете на рутин

Экстрагент Листья Стебли Соцветия

Вода дистиллированная 1,53±0,67 0,07±0,01 0,14±0,03

Спирт этиловый

20% 2,84±0,67 0,09±0,01 0,34±0,03

40 % 3,49±0,67 1,19±0,01 0,78±0,03

70% 12,46±2,73 1,79±0,01 1,99±0,03

80% 12,24±2,70 1,79±0,01 1,87±0,01

96% 3,49±0,22 1,79±0,01 1,15±0,01

Продолжение таблицы 2

Исследуемый параметр Массовая доля флавоноидов в сырье, % в пересчете на рутин

Температура экстракции,°С Листья Стебли Соцветия

20 1,31±0,18 0,95±0,12 0,18±0,07

40 6,99±0,58 1,57±0,54 1,56±0,07

55 6,99±0,60 1,76±0,60 2,78±0,07

65 12,46±2,07 1,89±0,65 5,03±0,07

Кипящая водяная баня 12,02±1,92 2,13±0,69 5,03±0,07

130 12,02±1,87 2,13±0,69 5,03±0,14

Соотношение сырьегэкстрагент (этанол)

1:10 1,97±0,14 0,89±0,14 -

1:30 2,84±0,07 1,80±0,07 0,92±0,07

1:50 1,97±0,07 0,90±0,07 2,65±0,07

1:70 1,97±0,07 0,86±0,07 2,65±0,07

1:100 1,97±0,07 0,86±0,07 2,65±0,07

Время экстракции, мин

30 2,18±0,07 1,64±0,07 1,04±0,07

60 2,84±0,07 1,72±0,07 3,12±0,07

90 2,84±0,07 1,87±0,07 3,12±0,07

120 2,40±0,07 2,13±0,07 4,68±0,07

240 2,40±0,07 2,13±0,07 4,68±0,07

Кратность экстракции, раз

1 12,46 2,13 5,03

2 2,24 0,48 0,66

3 0,41 0,06 0,19

Для соцветий при уменьшении соотношения до 1:30 наблюдается уменьшение выхода флавоноидов почти в 3 раза, по сравнению с выходом флавоноидов из стеблей и листьев серпухи венценосной.

Для извлечения флавоноидов из соцветий, листьев и стеблей, оптимальным соотношением сырья и экстрагента является значение - 1:50. Оптимальным временем экстракции флавоноидов из сырья - 120 минут при температуре кипящей водяной бани.

Эффективность экстракции оценивали по количеству выделенных флавоноидов. Содержание флавоноидов в экстрактах определяли методом дифференциальной спектрофотометрии. Определение основано на способности флавоноидов образовывать окрашенный комплекс, со спиртовым раствором хлорида алюминия, который дает основной максимум поглощения для соцветий серпухи венценосной, травы и шелухи гречихи посевной при А.=405 нм, листьев и стеблей - 410 нм, а для государственных стандартных образцов (ГСО) рутина -405 нм, кверцетина и лютеолина - 430 нм (рисунок 1). Спектры поглощения исследуемых экстрактов имеют близкие максимумы поглощения к спектру комплекса рутина с алюминием, поэтому этот флавоноид выбран нами качестве стандартного образца. Использование в качестве раствора сравнения испытуемого экстракта без комплексообразователя позволяет исключить влияние окрашенных и других сопутствующих веществ.

X, нм

Рисунок 1 - Спектры поглощения комплексов флавоноидов с А1С13 (1 - для соцветий серпухи венценосной, 2 - ГСО кверцетина, 3 - ГСО лютеолина, 4 - для травы и шелухи гречихи, 5 - ГСО рутина, 6 - для стеблей и листьев серпухи венценосной)

2. Очистка экстрактов и разделение смеси флавоноидов

Нами предложена упрощенная схема выделения и очистки флавоноидов из исходного растительного сырья. Данный метод не требует освобождения экстракта от липидов и последующей избирательной экстракции флавоноидов органическими растворителями. Схема выделения включает 3 стадии:

1) экстракция исходного сырья этанолом при выбранных оптимальных

ю

условиях;

2) упаривание экстракта досуха при пониженном давлении;

3) разделение полученного остатка методом препаративной колоночной хроматографии на силикагеле Merk (70-230 меш) в режиме градиентного элюирования.

В качестве элюента при разделении флавоноидов на колонке с силикагелем нами использован четыреххлористый углерод с последующей возрастающей добавкой этанола, содержание которого увеличивалось 0 до 100 %.

Методами колоночной хроматографии по предложенной нами схеме из экстракта шелухи гречихи выделено два соединения. При элюировании смесью растворителей четыреххлористый углерод : этиловый спирт в соотношении 80:20 (об./об.) выделили и идентифицировали биологически активное соединение, относящиеся классу фитостеролов - р-ситостерол-З-О-р-О-глюкопиранозид (ситостеролин). Это соединение не относится классу флавоноидов, но обладает ценными физиологическими свойствами. Основное действие соединения основано на снижение сорбции холестерина на стенках кровеносных сосудов, помимо этого ситостеролин обладает иммуномодулирующим действием. При элюировании смесью растворителей четыреххлористый углерод: этиловый спирт в соотношении 40:60 (об./об.) выделили соединение класса флавоноидов — апигенин—б-С-р-П-глгокопиранозид (витексин).

3. Ситостеролин и флавононды гречихи посевной

3.1 Идентификация фитостерола ß~cum0cmep0n—3-O~ß-D-z.4WK0nupaH03uda (ситостеролина)

Идентификацию выделенного соединения проводили методами ИК-, ЯМР-13С, ЯМР-'Н-спектроскопии и масс-спектрометрии в режиме электронной ионизацией при ионизирующем напряжении 70 эВ.

ИК (KBr, v-JJ: 3412 (гидроксигруппы), 2965-2934 (колебания алифатических групп), 1640 (колебания С=С связи) 1166-1024 (колебания С-О углеводного фрагмента).

Масс-спектр (ЭП.70 эВ, m/z): 576,79 [М]'+ (1%); 414,41 [М-С6Ни05]+ (5%); 396,53 [М-С6Н„06 (глюкоза)]+ (100%); 255,15 [М-С,6Н3206]+ (15%).

ЯМР - ,3С (Об-ДМСО, м.д.): 37,5 (С-1), 29,5 (С-2), 77,4 (С-3), 42,5 (С-4), 141,1 (С—5), 120,2 (С-6), 33,9 (С-7), 32,1 (С-8), 50,2 (С-9), 36,9 (С-10), 21,1 (С-11), 39,4 (С—12), 45,8 (С-13), 56,8 (С-14), 28,5 (С-16), 56,1 (С-17), 12,5 (С-18), 19,8 (С-19), 36,2 (С-20), 19,3 (С-21), 26,0 (С-23), 38,8 (С-24), 29,3 (С-25), 23,2 (С-28), 12,2 (С-29), 101,4 (С-1'), 75,0 (С-2'), 78,1 (С-3'), 75,0 (С-4'), 72,8 (С-5'), 62,1 (С-6').

ЯМР - 'Н (П6-ДМСО, м.д.): 0,64 (с, Н-18), 0,79 (д, J= 7,3, Н-21), 0,88 (д, 7=6,4, Н-29), 0,94 (с, Н-19), 2,99-3,00 (м, Н-З', 4 -Н), 4,19 (д, J= 8, Н-1'), 4,87 (м, Н-5), 5,33 (Н-6).

Сравнивая полученные экспериментальные данные с литературными,

11

установили, что выделенное соединение является ß-ситостерол-З-О-р—D-глюкопиранозидом (ситостеролином).

21 22

'20'"' "^-23--

i А

и/ ^l1!'

I 1

" I J,

1 i 5 ____,

ОН —~ J Ь-——

но\, 6'С-Р i L 1

но-3^ Хон

Рисунок 3 - ß—ситостерол-З-О-Р-О-глюкопиранозид (ситостеролин)

Ранее это соединение было выделено из лещины древовидной (орешка древовидного) - Corylus colurna и клевера персидского - Trifolium resupinatum var. microcephalism [Isik, Sabudak, Oksuz, 2007; Phytochemical investigation..., 2010]. Из шелухи гречихи посевной Fagopyrum sagittatum Gilib. ситостеролин выделен и идентифицирован впервые.

3.2 Идентификация флавоноида апигенин-3-0^-Е>-глюкопиранозида (витексана)

Идентификацию выделенного соединения проводили методами УФ-, ИК-, ЯМР-13С, ЯМР-'Н -спектроскопии и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением.

УФ-спектр (С2Н5ОН, нм): 337; 269; 215. Максимумы поглощения характерны для соединений флавоноидной природы.

Масс-спектр (ESI(-), m/z): 431,0999 [М-Н]" (100%), что отвечает брутто— формуле флавоноида C2iH2oOio.

ИК (KBr, v-1): 3350 (фенольные гидроксигруппы), 1657 (карбонильная группа у-пирона), 1614—1570 (скелетные колебания ароматических колец), 11791042 (колебания С-0 углеводного фрагмента).

ЯМР-,3С (Об-ДМСО, M.Ó.): 164,6 (С-2), 103,0 (С-3), 182,8 (С-4), 161,8 (С-5), 98,8 (С-6), 161,8 (С-7), 105,3(С-8), 156,6 (С-9), 105,0 (С-10), 122,3 (С-Г), 129,6 (С-2', С-6'), 116,5 (С-3', С-5'), 161,0 (С-4'), 79,3 (С-1"), 74.0 (С-2"), 71,5 (С-3"), 71,2 (С-4"), 82,5 (С-5"), 61,9 (С-6").

ЯМР - 'Н (D''-ДМСО, M.Ó.): 13,16 (с, 5-ОН), 8,00 (д, J = 12, 2'-Н, Н-6'), 6,89 (д, J= 12, З'-Н, Н-5'), 6,78 (с, 3-Н), 6,26 (с, 6-Н), 4,66 (д, J= 8, Н-1"), 3,51 (м, 4"-Н, Н-5", 6"-Н), 3,74 (м, 6"-Н), 3,82 (т, 2"-Н).

Данные УФ-, ИК-, ЯМР-спектров и сравнение физико-химических констант с описанными в литературе позволили установить, что выделенное соединение является апигенин-8-С-(3-В-глюкопиранозидом (витексином).

он он.

5 1

он /■—-он

:о

1О.1 у

,он

I II он о

Рисунок 4 - Апигенин-З-О^-О-глюкопиранозид (витексин)

Витексин - биологически активное вещество, обладающее сосудорасширяющим действием и способствующее усилению ферментативного метаболизма в сердечной мышце.

Впервые этот флавоноид был выделен и идентифицирован из Vitex lucens (семейство Verbenaceae) [Andersen, Markham, 2006]. Витексин содержится в растениях Acer palmatum, Chrysanthemum fuscatum, Ficus deltoidea, Crataegus monogyna, Cajanus cajan [Flavonoids from Chrysanthemum fuscatum, 2007; Extraction of flavonoids..., 2006; Vitexin and isovitexin..., 2012; . Infiuence of the extraction..., 2008], а также в растении - Fagopyrum esculentum (проростках, семенах, шелухе) [Chromatographie and spectrophotometric...,1967; Hegnauer, 1969; Watanabe, Ohshita, Tsushida, 1997; Dietrychszostak, Oleczek, 1999; Максимов, Кулеш, Горовой, 2002; Клыков, 2014]. Из отходов гречихи этот флавоноид количественно выделен впервые.

Шелуха гречихи является перспективным источником для извлечения витексина, который может быть использован в качестве стандартного соединения для оценки его содержания в других видах растительного сырья.

3.3 Разделение и идентификация флаеоноидов из шелухи и травы гречихи посевной методом обращенно-фазово{1 ВЭЖХ

Разделение и идентификацию отдельных форм флавоноидов из экстрактов травы и шелухи гречихи посевной проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Разделение проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC—6А с УФ-детектором, рабочая длина волны 360 нм. Колонка Zorbax С]8 (4,6 х 50 мм, 5 мкм). В качестве элюентов использовали смеси ацетонитрил : вода в различных соотношениях по объему и содержанием уксусной кислоты до 1%.

Лучшие результаты разделения флавоноидов из экстракта шелухи гречихи достигаются при использовании системы ацетонитрил : вода (15:80) по объему с содержанием 1% уксусной кислоты, а для травы гречихи посевной ацетонитрил : вода (20:80) по объему с содержанием 1% уксусной кислоты.

В выбранных нами условиях разделения и детектирования проведено сравнение хроматограмм индивидуальных соединений (рутина, кверцетина,

ориентина, витексина) и компонентов экстрактов шелухи и травы гречихи посевной.

Идентификацию пиков на хроматограмме проводили сопоставлением времен удерживания компонентов экстракта по отношению к временам удерживания стандартных образцов флавоноидов.

Качественный состав флавоноидов шелухи и травы гречихи практически идентичен, но среди флавоноидов травы гречихи витексин не обнаружен.

Количественное определение отдельных флавоноидов проводили методом сравнения площадей пиков исследуемых и стандартных соединений. В диапазоне исследуемых концентраций площадь пика линейно зависит от концентрации исследуемого соединения. Это позволило применить метод сравнения для расчета содержания флавоноидов в исследуемых объектах.

В таблице 3 представлены результаты определения массовой доли идентифицированных флавоноидов в шелухе и траве гречихи — Fagopyrum sagittatum.

Таблица 3 -Массовая доля флавоноидов (%) в траве и шелухе гречихи посевной -

Флавоноиды Массовая доля флавоноидов, % (относительно суммы флавоноидов) Массовая доля флавоноидов в пересчете на сырье, %

Трава гречихи Шелуха гречихи Трава гречихи Шелуха гречихи

Ориентин 1,45 17.65 0,02 0,04

Витексин - 11.76 - 0,02

Рутин 87,14 11,76 0,95 0,02

Преобладающим флавоноидом в траве гречихи - Fagopyrum sagittatum йШЬ. является рутин, содержание которого составляет 0,95 % в пересчете на сухое сырье (относительно суммы флавоноидов 87,17 %).

По данным М.М.Анисимовой [2011] в траве гречихи, культивируемой в Самарской области, массовая доля рутина составляла 2,5-3,7 % в пересчете на сухое сырье (относительно суммы флавоноидов 47-61 %), что значительно меньше содержания рутина (относительно суммы флавоноидов 87,17 %) выделенного из травы гречихи, произрастающей в Приморском крае. По-видимому, трава гречихи, культивируемая в Приморском крае, может быть перспективным сырьем для получения рутина (витамина Р).

Доминирующим флавоноидом в шелухе гречихи, произрастающей в Приморском крае, является ориентин, массовая доля которого составляет 0,04 % в пересчете на сухое сырье (относительно суммы флавоноидов 17,65 %).

Преобладающим флавоноидом в шелухе гречихи польских сортов является рутин [01е1гус11-82051ак, 2005], массовая доля которого варьирует от 0,05 до 0,08% в пересчете на сухое сырье (относительно суммы флавоноидов 43-53 %). Массовая доля ориентина составляет 0,01 % (относительно суммы флавоноидов 6,0 %), что значительно меньше содержания ориентина (11,65 %) в шелухе гречихи, произрастающей в Приморском крае.

Шелуха гречихи, произрастающей в Приморском крае, может являться источником для выделения флавоноида ориентина и последующего использования его в качестве стандартного соединения.

3.4 Определение ситостеролина в шелухе и траве гречихи посевной методом обращенно-фазовой ВЭЖХ

Анализ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-6A с УФ-детектором при рабочей длине волны 210 нм в изократическом режиме. В качестве подвижной фазы использовали ацетонитрил : метанол в соотношении 20:80 (об./об.). Идентификацию ситостеролина на хроматограмме разделенной смеси экстракта проводили, сравнивая времена удерживания разделенных пиков с временем удерживания стандартного соединения ситостеролина. Количественное содержание определяли методом градуировочного графика.

Массовая доля ситостеролина в шелухе гречихи составила 0,16±0,04 % в пересчете на сухое вещество. В экстракте травы гречихи ситостеролин не обнаружен. По-видимому, это соединение образуется в процессе развития растения лишь в его отдельных органах. Так как, ситостеролин является биологически активным соединением, обладающим ценными физиологическими свойствами, действие которого основано на снижение сорбции холестерина на стенках кровеносных сосудов. Ситостеролин также обладает иммуномодулирующим действием. Использование шелухи гречихи вероятно перспективно как альтернативный источник выделения ситостеролина и последующего использования его в фармацевтической промышленности для получения препаратов, необходимых при лечении сердечно—сосудистых заболеваний.

4. Флавоноиды серпухи венценосной

Методами жидкостной экстракции и препаративной колоночной хроматографии, из экстрактов надземной части растения серпухи венценосной (соцветий, стеблей, листьев) выделено три соединения класса флавоноидов: 1— 5,7,4'-"григидрокси-3-метоксифлавон (изокемпферид), 2 - 5,7,4'-"григидроксифлавон (апигенин), 3 - 5,7,3',4'-^ригидрокси-3^.1етоксифлавон (3-метилкверцетин).

Идентификацию выделенных соединений проводили методами УФ-, ЯМР-13С-спектроскопии и масс-спектрометрии в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (APCI).

4.1 Идентификация флавоноида 5,7,4'—тригидрокси-З-метоксифлавона (изокемпферида)

УФ—спектр (C2HsOH, нм): 349, 267, 218. Максимумы поглощения характерны для соединений флавоноидной природы.

Масс-спектр (APCI, m/z): 301,07 [МН]+ (100 %), что отвечает брутто-

15

формуле Ci6Hi206

ЯМР-'3С (D''-ДНСО, м.д.у, 156,3 (С-2), 138,2 (С-3), 178,6 (С-4), 161,9 (С-5), 99,2 (С-6), 164,8 (С-7), 94,4 (С-8), 157,0 (С-9), 104,9 (С-10), 121,2 (С-Г), 130,8 (С-2'), 116,3 (С-3'), 160,8 (С-4'), 116,3 (С-5'), 130,8 (С-6'), 60,4 (ОСН3).

Таким образом, на основании данных УФ-, ЯМР-С13- спектроскопии и масс-спектрометрии установлено, что выделенный флавоноид является 5,7,4'-тригидрокси-3-метоксифлавоном (изокемпферидом).

з^ ОН

ОСН3

Рисунок 5 - 5,7,4'-тригидрокси-3-метоксифлавон (изокемпферид)

При исследовании химического состава Cirsium setosum (Willd.) Bess. А.И.Сырчиной и др. [2000] выделен ряд биологически активных флавоноидных соединений: сирингин, астрагалин, квсрцетин-З-О-р-О-глгокопиранозид, апигенин, в том числе и изокемпферид, обладающий антимикробной активностью. Из надземной части Serratula coronata изокемпферид выделен количественно в виде индивидуального соединения впервые. Выделенное соединение может быть использовано в качестве стандартного соединения при оценке его содержания в различных видах растительного сырья.

4.2 Идентификация флавоноида 5,7,4'—тригидроксифлавона (апигенина)

УФ-спектр (С2Н5ОН, нм): 339, 267, 215. Максимумы поглощения характерны для соединений флавоноидной природы.

Масс-спектр (APCI, m/z)\ 271,06 [МН]+ (100%), что отвечает брутто-формуле С15Н10О5.

ЯМР-'3С (О6-ДМС0, м.д.): 164,8 (С-2), 103,5 (С-3), 182,4 (С-4), 161,8 (С-5), 99,5 (С-6), 164,4 (С-7), 94,6 (С-8),157,9 (С-9), 104,4 (С-10), 121,8 (С-Г), 129,2 (С-2'), 116,6 (С-3'), 162,1 (С-4'), 116,6 (С-5'), 129,2 (С-6').

На основании данных УФ-, ЯМР-С13 и масс-спектров можно утверждать, что выделенный флавоноид является 5,7,4'- тригидроксифлавоном (апигенином).

он

II

он о

Рисунок - 6 5,7,4 '-тригидроксифлавон (апигенин)

Апигенин обладает противовоспалительным, антигистаминным и спазмолитическим действием на организм. Имеются сведения о содержании этого соединения в других видах рода Serratilla: 5. cichoracea (серпуха цикориевая), S. tinctoria [Yatsyuk, Lyashenko, 1969; Глызин, Баньковский, Мельникова, 1972; Соколов, 1993; Flavonoids of cichoracea..., 2007; Aliouche, 2007; S. tinctoria, a source..., 2009; Буданцев, 2013].

4.3 Идентификация флавоноида 5,7,3',4'—тригидрокси—3-метоксифлавона (3 —

метилкверцетина)

УФ-спектр (С2Н5ОН, нм): 356, 258, 214. Максимумы поглощения характерны для соединений флавоноидной природы.

Масс-спектр (APCI, m/z): 317,07 [МН]+ (100%), что отвечает брутто-формуле Ci6H1207

ЯМР-,3С (Об-ДМСО, м.д.): 155,6 (С-2), 137,7 (С-3), 177,9 (С-4), 161,3 (С-5), 98,6 (С-6), 164,2 (С-7), 93,6 (С-8), 156,4 (С-9), 104,2 (С-10), 120,8 (С-Г), 115,4 (С-2'), 145,3 (С-3'), 148,8 (С-4'), 115,8 (С-5'), 120,6 (С-6'), 59,7 (ОСН3).

Данные УФ-, ЯМР-13С-спектров и сравнение физико-химических величин с описанными в литературе позволили установить, что выделенное соединение является 5,7,3',4'-тригидрокси-3-метоксифлавоном (3-метилкверцетином).

Рисунок 7- 5,7,3',4'-тригидрокси-3-метоксифлавон (3-метилкверцетин)

Это соединение содержится в других видах рода Serratilla: S. cichoracea [Aliouche, 2007], S. tinctoiria [Янюк, Лященко, 1969; Глызин, Баньковский, Мельникова, 1972; Соколов, 1993; S. tinctoria, a source..., 2009; Буданцев, 2013].

ОН

II

ОН О

4.4 Разделение и идентификация флавоноидов из надземной части серпухи венценосной методом обращенно-фазовой ВЭЖХ

Исследована возможность разделения смеси флавоноидов из экстрактов надземной части серпухи венценосной (соцветий, листьев и стеблей) методом ОФ ВЭЖХ. Разделение проводили на жидкостном хроматографе ЗЫтас^и 1Х-6А с УФ-детектором в изократическом режиме, рабочая длина волны 360 нм. Колонка 2огЬах С|8 (4,6 х 50 мм, 5 мкм). В качестве элюентов использовали смеси растворителей ацетонитрил:вода при разных объемных соотношениях и содержанием до 1 % уксусной кислоты.

Оптимальными условиями для разделения флавоноидов из экстрактов надземной части серпухи венценосной является использование в качестве подвижной фазы системы ацетонитрил : вода в объемных соотношениях (20:80) и содержанием до 1% уксусной кислоты при скорости подвижной фазы 2 мл/мин.

В выбранных нами условиях разделения проведено сравнение хроматограмм индивидуальных соединений (рутина, лютеолина, кверцетина, 3-метилкверцетина, апигенина, изокемпферида) и компонентов экстрактов соцветий, листьев и стеблей серпухи венценосной.

Идентификацию сигналов на хроматограмме проводили сопоставлением времен удерживания компонентов экстракта и стандартных образцов.

Количественное определение отдельных флавоноидов проводили методом градуировочного графика.

В таблице 4 представлены результаты определения количественного содержания флавоноидов в надземной части растения серпухи венценосной -БеггаШ!а согопа1а.

Таблица 4 - Массовая доля флавоноидов (%) в надземной части серпухи венценосной - Беггаш1а согопаЮ Ь.бЛ. (1 - Хасанский, 2 - Октябрьский, 3 -Шкотовский районы)

Флавоноиды Массовая доля флавоноидов в се рпухе венценосной, % (от суммы с шавоноидов)

Соцветия Листья Стебли

I 2 3 1 2 3 1 2

Август 2009 Сентябрь 2009 Август 2010 Сентябрь 2010 Сентябрь 2009 Август 2010 Сентябрь 2010 Сентябрь 2009 Сентябрь 2010

Кверцетин 0,75 0,70 1,16 1,02 . 0,58 - 3,97 1,21

3 - метилкверцетин 11,25 8,60 10,44 11,92 5,14 5,17 2,51 2,99 1,21

Лютеолин 3,0 2,09 3,67 2,80 1,50 2,75 1,95 . 0,97

Апигенин 7,13 8,84 3,91 2,59 0,93 0,33 0,97 0.48

Изокемпферид 3,88 3,49 3,39 1,45 0,21 0,25 - 0,85

Массовая доля флавоноидов в серпухе венценосной, % (от массы навески»

Массовая доля флавоноидов, % в пересчете на рутин 5,0 4,84 4,18 5,88 18,50 15,21 14,87 3,44 2,39

Основная доля флавоноидов надземной части растения сосредоточена в листьях и варьирует в зависимости от места произрастания и года сбора (14,8718

18,50 %), значительно меньше в соцветиях (4,18-5,88 %) и минимальное в стеблях (2,61-3,44 %) в пересчете на рутин. По данным А.С. Ангаскиева [2003], в надземной части растения серпухи венценосной, произрастающей на юге Томской области, массовая доля флавоноидов составляет 7,3 %. В надземной части растения, произрастающей в Западной Сибири (Новосибирская область), массовая доля флавоноидов составляет 9,9 % [Flavonoids contení..., 2008]. Данных по содержанию флавоноидов в серпухе венценосной - Serratilla coronata в отдельных ее органах, в литературе не приводится.

Из идентифицированных флавоноидов серпухи венценосной (кверцетин, 3-метилкверцетин, лютеолин, апигенин и изокемпферид) все 5 являются агликонами (в состав молекулы флавоноида не входит углеводный остаток). Наибольшее количество агликонов (около 30 %) содержится в соцветиях серпухи венценосной.

Преобладающим флавоноидом (агликоном) в надземной части растения является 3-метилкверцетин, содержание которого в соцветиях колеблется в пределах от 10,4 % до 11,9 %, в листьях оно составляет 2,5-5,1 % и стеблях - 1,22,9 % (относительно суммы флавоноидов).

Массовая доля флавоноидов апигенина и изокемпферида в растении колеблется в зависимости от места и года его произрастания. Максимальное содержание в растениях, произрастающих в Хасанском районе, в диапазоне (0,97-8,84 % и 0,21-3,88 % соответственно), а минимальное - в растениях, произрастающих в Шкотовском районе (0,48-2,59 % и 1,45 % соответственно). Причем в листьях, собранных в Шкотовском районе (сентябрь 2010 г.), апигенин и изокемпферид не обнаружены. По-видимому, это связано с влиянием сроков сбора образцов (сентябрь).

ВЫВОДЫ

1. Для выделения флавоноидов из отходов производства семян (травы, шелухи) гречихи посевной - Fagopyrum sagittatum Gilib. и из надземной части (соцветия, листья, стебли) серпухи венценосной - Serratula coronata L.s.l. исследованы оптимальные условия (температура, соотношение сырье:экстрагент, время экстракции, соотношение компонентов экстрагента) методом жидкостной экстракции.

2. Максимальный выход флавоноидов из шелухи гречихи 0,20±0,03 % достигается экстракцией сырья 40 % раствором этилового спирта на кипящей водяной бане двукратно в течение 90 минут и в соотношении сырье:экстрагент 1:30; максимальный выход флавоноидов из травы гречихи посевной 1,09±0,21% достигается при экстракцией 60 % раствором этилового спирта при температуре 65 °С в течение 90 минут и в соотношении сырье : экстрагент 1:50.

3. Максимальный выход флавоноидов из листьев серпухи венценосной 15,11±2,07 % достигается экстракцией 70 % раствором этилового спирта при температуре 65 °С в течение 60 минут; соотношение сырье : экстрагент 1:30;

19

максимальный выход флавоноидов из соцветий серпухи венценосной 5,88±0,07 % достигается экстракцией 70 % этиловым спиртом при температуре 65 °С в течение 120 минут; соотношение сырье: экстрагент 1:50.

4. Схема выделения и очистки флавоноидов из отходов производства семян (травы, шелухи) гречихи посевной - Fagopyrum sagittatum Gilib. и из надземной части серпухи венценосной - Serratula coronata L.s.l. включает 3 стадии: экстракция сырья этанолом, концентрирование полученного экстракта при пониженном давлении, разделение исследуемых компонентов методом препаративной колоночной хроматографии.

5. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в шелухе гречихи идентифицировано 3 соединения класса флавоноидов (рутин, ориентин, витексин), в траве - 2 соединения (рутин, ориентин) и показано, что доминирующим флавоноидом в шелухе гречихи является ориентин, а в траве рутин; массовая доля этих веществ составляет 17,65 % и 87,14 % от суммы флавоноидов.

6. Впервые из шелухи гречихи посевной выделено биологически активное соединение ситостеролин, структура которого доказана методами УФ-, ИК-, ЯМР- С, ЯМР- 'Н - спектроскопии и масс-спектрометрии; массовая доля ситостеролина в растении составляет 0,16 % (в пересчете на воздушно-сухую массу).

7. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии исследован состав флавоноидов в надземной части серпухи венценосной - Serratula coronata, и идентифицировано 5 соединений, относящихся к классу флавоноидов (кверцетин, 3-метилкверцетин, лютеолин, апигенин, изокемпферид); флавоноиды в растении представлены агликонами. Доминирующим флавоноидом в надземной части Serratula coronata является 3-метилкверцетин, содержание которого в соцветиях колеблется в пределах от 10,4 до 11,9%, в листьях 2,5-5,1 % и стеблях - 1,2-2,9 % (относительно суммы флавоноидов).

8. Исследованные виды растений являются перспективными биологическими ресурсами - источниками получения флавоноидов рутина, ориентина, витексина, 3-метилкверцетина, изокемпферида и фитостерола ситостеролина.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в научных журналах, рекомендованных ВАК

Минобрнауки РФ:

1. Мягчилов, А.В. Выделение флавоноидов из шелухи гречихи посевной-

Fagopyrum sagittatum Gilib. (Polygonaceae)/ А.В. Мягчилов, Л.И. Соколова//

Химия растительного сырья. - 2011. - №2 - С. 123-126.

2. Мягчилов, А.В. Выделение ситостеролина и витексина из шелухи гречихи

посевной - Fagopyrum sagittatum Gilib. (Polygonaceae)/ А.В. Мягчилов, Л.И.

Соколова, П.С. Дмитренок// Химия растительного сырья. - 2012. - № 3 - С 8992.

Статьи, опубликованные в других периодических изданиях:

3. Выделение и идентификация флавоноидов из соцветий серпухи венценосной-Serratula coronata L. (Asteraceae)/A.B. Мягчилов, О.Э. Гончаренко, Л.И. Соколова, П.Г. Горовой, П.С. Дмитренок// Известия ВУЗов. Прикладная химия и биотехнология. - 2011. - №1.- С. 51-54.

Работы, опубликованные в материалах научных конференции:

4. Мягчилов, А.В. Разработка методики количественного определения флавоноидов в шелухе гречихи посевной — Fagopyram sagittatum Gilib. /Мягчилов А.В.// Проблемы теоретической и экспериментальной химии: Тезисы докладов XX Российской молодежной научной конференции, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. А.М. Горького. - Екатеринбург, 2010- С. 4-5.

5. Мягчилов, А.В. Выделение и идентификация ситостеролина из шелухи гречихи посевной - Fagopyrum sagittatum Gilib. (семейство Polygonaceae) /А.В. Мягчилов, Л.И.Соколова, П.С. Дмитренок/ЛТроблемы теоретической и экспериментальной химии: Тезисы докладов XXI молодежной научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения академика Н.Д. Зелинского. - Екатеринбург, 2011-С. 122-123.

6. Мягчилов, А.В. Количественное определение флавоноидов в отходах производства семян гречихи посевной - Fagopyrum sagittatum Gilib. (Polygonaceae)/A.B. Мягчилов, Л.И. Соколова, П.Г. Горовой// Химия и химическое образование: Тезисы докладов V-ro Международного симпозиума. -Владивосток, 2011. - С. 91-92.

7. Выделение и идентификация флавоноидов из соцветий серпухи венценосной -Serratilla coronata L. (Asteraceae)//A.B. Мягчилов, О.Э. Гончаренко, Л.И. Соколова, П.Г. Горовой//Международная молодежная научно - практическая конференция «Альфред Нобель и достижения мировой науки и цивилизации за 110 лет»: сборник материалов. - Казань, 2011.— С. 123-124.

8. Выделение флавоноидов из надземной части серпухи венценосной Serratilla coronata L./ А.В. Мягчилов, Л.И. Соколова, О.Э. Гончаренко, П.Г. Горовой// V Всероссийская конференция с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» : сборник материалов. -Барнаул, 2012. - С. 266-267.

9. Мягчилов, А.В. Количественное определение флавоноидов в надземной части серпухи венценосной - Serratilla coronata L./ А.В. Мягчилов, Л.И. Соколова, П.Г. Горовой// П-я Международная виртуальная интернет конференция «Биотехнология. Взгляд в будущее»: сборник материалов. - Казань, 2013. -С. 224 -225.

Мягчилов Алексей Викторович

Флавоноиды растений Fagopyrum sagittatum ОШЬ. (гречихи посевной) и 8еггаЫ\а согопМа Ь. (серпухи венценосной) (методы выделения, идентификация веществ, перспективы использования)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 12.02.2015. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 044.

Отпечатано в типографии Дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, Владивосток, ул. Пушкинская, 10