Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии изготовления, методов контроля и исследование свойств сыворотки крови плодов овец

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии изготовления, методов контроля и исследование свойств сыворотки крови плодов овец"

Ч'б оа

МИНИСТЕРСТВО СЕШЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НМЧНО4$ССЩОВАТЕШ;КИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРШЖАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ (ВГНКИ)

На правах рукописи

ХШШК ЛШСВЬ ИВАНОВНА

УДК 619.578.60933

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ, ШЯОДОй КОНТРОЛЯ И ИССЛЕДОВАШЕ СВОЙСТВ СЫВОРОТКИ КРОВИ ГИОДОВ ШЕЦ

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995 г.

Работе выполнена в лаборатории культур тканей,питательных сред и растворов Всероссийского государственного иауаю-изсхедо-вагельского института контроля,стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГШЮ .Среднеазиатском филиале ВНИЯЧ я НПО "Согдиана" .

Научные руководители -доктор биологических наук

В.Т.Ночевный

- кандидат ветеринарных наук И. П. йдаешфский

Официальные оппоненты - доктор ввтеркнаршх наук

В.И.Уласов

- доктор медицинских наук Р.Я.Подчернявв«

Ведущее учреждение - Всероссийский институт зш^ита

животннх

Защита диссертации состоится 199б* Г.

в " " часов на заседании Диссертационного совета Д.120.85.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля,стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022, г.Москю .Звенигородское шоссе,5,ВГНКИ).

С диссертацией моейо ознакомиться в библиотеке ВГНКИ.

Автореферат разослан " 195<Г г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,кандидат ветеринарных наук

Ю. А.Козырев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблей». Одакл из валких условий успешного производства культур клеток а противовирусных препаратов (ЕЛ) является псысканид ноетх видов питательных срод (ПС) и сыворотки крови (GO sir.OTts.ix КЕМ.и^нкацнн "для культур клеток". Несмотря ка определенные успехи о разработке бессьгаороточншс ерэд, сыворотки крови все еще остаются незаисшашм компонентом ростовых ПС и s Tcjie преыя, являются наибояеэ вероятшш фактором контаминации и нестабильности результатов получения культур клеток.

В практика пригоняется, в основной, ОС крупного рогатого скота, которая но стандартна, характеризуется низкой ростстзаулирующэй активностью, содержит з споем состз^е кзгпбиторы к специфические антитела, а технология оа производства не позволяв? получать ега-бильниЯ no pocTor.bti сээйзтвпи препарат. В поелэдние года по постановлений Совета Глашсгроз СССР за Р 877 от 26 anryeva IG87 г. по биотехнологии ергаинзог&но серийноо прогиводство и изучение свойсгз сыворотки плодов короэ, телят, суягных овец, северных олзной, новорожденных безмолозивкых телят, свиней, лопадой и некоторых других г<здов енвотиых. Необходимо однако отнетить, что максимально высокими ростонлш свойствами характеризуете»! СК плодов хоров, ко зэ пшрояоо пргагисиме в практике ограничено из-за дефицита с-грья и '.резшчайко внсокоП стоимости готового продукта. Эхо положение пос^угиво осио-санкем для разработки технологии изготовления и изучения свойств альтернативного препарата - СК плодов овец ксаяяфнкзцш "для ¡гуль-тур клеток".

Крупный вклад в решение вопросов получение, методов контроля и применения СК хивотннх внесли отечественно к иностранные авторы (Нам e-i- «¿^ 1976; А.С.Новохатский, 1982; Я ddiUl P. J., 1937; Л.И.Игудон, 1988)

труды которых во многом определили направленна и перспективы дальнейшего научного поиска. Многие вопросы данного направления не решены и нуждаются в теоретическом обосновании^дальнейшей разработке и внедрении в практику. Этим определились цель и задачи наших исследований.

Цель работы. Разработать технологию взятия крови и получения СК плода овец, изучить физико-химические и биологические свойства, отработать методе контроля, определить сферу и эффективность применения препарата в вирусологической практике.

Задачи исследований:

- разработать опытно-промышленную технологию забора и обработки крови, получения полуфабриката и стерилизующей фильтрации СК плодов овец;

- изучить физико-химические, биохимические и биологические свойства СК плодов овец, выбрать критерии и определить предельно допустимые показатели качества готового продукта;

- исследовать контаминацию СК плодов овец;

- отработать количественный метод биологического контроля препарата;

- оценить пригодность СК плодов овец для выращивания вирокого спектра культур клеток, гибридом, РНК- и ДНК- содержащих вирусов;

- разработать нормативно-техническую документацию (ШД) на получение, контроль и применение (К плодов овец в вирусологической практике.

Научная новизна. Впервые получены экспериментальные данные, положенные в основу опытно-промышленной технологии производства СК плодов овец, изучены ее физико-химические и биохимические показатели. Определены ростстинулирующие свойства и оптимальные кон-

центрацм! СК плода овгц в состава ростоклс пэтатольшх сред.

Влсркгэ разработана яруписг гасатабтя тезпгояогля получения СК плода 022Ц, позволяющая производить оа с условиям >:лсокомбгкята, но нарушая процессов планового убоя суяггагх овец ия иясо г: каракульчу •

Шяопеко влияние рззяглзапс факторов (отбор суягных овцематок, способ забора крови, кзтоди отделения к.че-гечшх олзкагеоз *.фови и стгрклизецих полуфабрикат! па гачеегго стерильной СК плода овец.

Показакл возцозяоеть пркмекоиия СК плодя озед для культивирования пирокого елгхтрэ порюпкгях, перзпмггптех и диплоидных пульту а гтс.8 гнбрвдох и рнрусоз.

Прпкттг^счдя пгшгееть работа.Разузботак a опытго-ярсоддоздш а а т'-лгног.огия получения, ллггрэлл хсчзстпа я причинения С7С плодол ОЧСД.

РаэриСотаил ;7тззр:'.дг,:а иг.р*ати«здо-,те:а1пчзс:а,.л KOVQiimiouyji па проязгод-яхо, /.оитоогл .¿s пргг.зненао СК пгодоз оыщ. Орган:» э-взяо cep'iSüoe произао.цс?зо пр-зпарата кг НПО "Взгстор4 и опытно-крпаззодегзоге:?! аоторгпзрноП лаборатория г. Оренбурга,

Изyvsia фпико-хкмвчзекко rt биологически«) е?:о.1ства CÁ плодов огсц и пэказака пригодность препарата два получения с^рокого спектра культур пясток :i '.•'.гоусов.-

Лгтобяция тгеботи.Осяо$яз:э nososaarrz дгссгуч'ацяк долонэчу и получмлн поло^:ггеяьнуо оцзнву m зпеедгщ« Учз:*»зго со:-ля ЕГЙХЧ ззттфэяарйтоп па отчетах за 1991* 1993 эт», ч Ие^кбот-атогном совещании 16 фвпроля 1925 г.

Публикации. По ыатераалаы диссертации опублииздано 3 пзчатшдх работы, подготовлена я утвер-депы ГУБ 3 нор'глтшулз-техшп'есхпгс документа.

Работа шпояюиа в соответствия с I?iP ч граду слатрчзащими

разработку и получение вакцинных в диагностических препаратов, а также в производстве других биологически активных веществ.

Объем и стуктура диссертации. .Диссертация изложена на /¿¿"стра ницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 8 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 178 работ, из которых 98 отечественных авторов, 80 зарубежных. Экспериментальные данные иллюстрированы I рисунком и 19 таблицами.

2. С О В С Т В Е Н Н Н Е И С С.Я Е Д О В А Н И Я

2.1. Материалы и методы исследований

В работе использовали:

- питательные среда ИГЛА, 199, РШ1-1640, на основе гидролиза-та дактальбуыина, ГЛА; растворы Хенкса и Эрла;

- культуры клеток: первичные тестикулы быка (ТВ), фибробласты куриных (ФЭК) и перепелиных (ФЭП) эмбрионов, клетки почки поросенка (ПП), почки ягненка (ПЯ), почки эмбриона коров (ГШ), почки свиней (ПС), почки крольчат (ISO; перевиваемые (ЩЕК, ВДСК, Уего СПЭВ, SFFR); диплоидные (ЛЭЧ-240); люфобластоидная Ж»"»" ** и гибрадомная линия Краснодар I0I/3, продуцирующая антитела к виру су гриппа; культуры готовили общепринятыми методами;

- вирусы "пневмоэнтеритов" KFC (штамм MBA 1/80 вируса инфек-ционного|)инотрахеита, ИРГ; штамм 1/77 вируса парагриппа-3, ПГ-3; штамм Орегон С-24У вируса диареи, Д; штамм В-10 аденовируса, АД; штамм БУК-628 вирусе болезни Ауески, ВБА; штамм Голландский вирус) оспы кур, ВОК; штамм 1ГНКИ вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, ТГЭ; штамм Д-I парвовирусного энтерита собак, ВПЭС; штаммы поддерживали и титровали на наиболее чувствительных тест-культурах;

- сввортки кроки плодов овец (ПО), плодов коров (ПК), крупного рогатого скота (КРС), телят, северных оленей (СО) и суягных овец (СУО),

Контроль овцематок-доноров СК на наличие инфекционных и инвазионных заболеваний проводили в соответствии с требованиями "Методических указаний по проведению обязательного минимума исследований в ветеринарно-бактериологических даборвтриях при диагностике заразных болезней сельскохозяйственных гнЕОтных к птиц", утвержденных УСХ СССР 10 сентября 1980 г.

Разработка способа изготовления СК плодов оеоц проведена на базе Катта-Курганского мясокомбината Самаркандской области с участием В.Т.Ночевного, Л.И.Игудина, И.П.&гаемирского, Л.Г.Репиной и З.П.Кондрашовой. Забор крови, получение полуфабрикат» СК осуществляли пр плановом убое овцематок 132-135 дневной суягности на мясо и кара-гульчу без нарушения основного технологического процесса. Стерилизацию полуфабриката СК проводили через фильтр-пластиш "Миллипор" с диаметром пор 0,22 мкы и ЕК.5 -2.

физико-химические, биологические свойства и контаминации серий СК ПО контролировали по 2С-42-7ВС-85 и методическим указаниям РД 42-88-14-68, а наличие антител я вирусам медленных инфекций определяли с Б.Ф.Шуляг и Г.И.Врап-шш с учетом требований "Методических указаний по лабораторной диагностика Еясна-Маедл овец" к "Временных методических указания по лабораторной диагностика аденоызтоза овец и коз".

Статистическую обработку результатов проводил?-; с использованием общепринятых методов по И.П.Ашмарину, Л.Л.Воробьеву (19625.

2.2, Отбор и контроль донорос СК плодов овец

В Узбекистане, в зоне развитого корану,?-водства, производят большое количество каракульчи. При этом кровь гыесте с туе кой пло-

_ б -

да используют для производства мясокостной муки.

Была поставлена задача разработать способ получения СК плодов овец квалификации "для культур клеток". С этой цель® из каракулеводческих хозяйств, благополучных по инфекционным и инвазионным заболеваниям, отбирали животных 1,5-5 летнего возрабта, средней упитанности и живым весом не менее 40 кг. Затем овцематок отделяли от общего поголовья, ставили на карантин и проводили комплекс диагностических исследований на бруцеллез, туберкулез, паратубер-кулез, сальыонеллез, листерисз, вирусный (энзоотический аборт)и виб-риоз, а также на гельминтоза. При получении отрицательных результатов по всем диагностическим тестам овцематок доставляли в научно-производственный комплекс "Согдиана", где проводили горемную случку маток с племенными баранами, проверенными на качество спэрмы и потомства.

В качестве доноров.СК отбирали клинически здоровых овцематок, не содержащих антител к бруцеллам и лептосшрам, о также к вирусам ящура, аденоматоза, висна-маеди, ПГ-З, ИРТ, диареи и респираторно-синцитиальному вирусу. Содержание гемоглобина (80-100 г/л), лейкоцитов (8-10 тыс/ и общего белка (6,0-7,2 ) находилось в пределах физиологической нормы. Рацион кормления суягных овцематок в этот перкод был сбалансирован по питательным и биологически активным веществам.

Проведенные исследования позволили определить общие требования к животным-донорам, условия кормления и содержания, а также наметить перечень диагностических исследований. Наполнение указанных рекомендаций обеспечивало повышение выхода ягнят и улучшение качества СК и каракульчи.

2.3. Разработка способа получения СК плодов овец

Сыворотки гфови яивопта квалификации "для культур клеток"

характеризуются чрезвычайно сложным составом, многообразием функций, стерильностью и максимальными ростовыми свойствами. Получение такого препарата существенным образом зависит от технологии изготовления. В условиях мясокомбината отрабатывали методы забора крови от плода, без повреждения шкурки, отделения сыворотки от форменных элементов крови и стерилизации конечного продукта фильтрованием.

Опытно-промышленная технология получения СК плодов овец предусматривала забой овцематок 132-135 дневной суягности, извлечение маткк из брюшной полости без нарушения плодных оболочек, подачу ее на манипуляционный стол, вскрытие оболочек, зажим пуповины "артериальным" жомом ближе к плаценте, ее дезинфекцию 5/5-ным раствором настойки иода и отсечение канатика. Забор крови осуществляют из культи пупочного канатика, помещенной в цилиндр через бортовой вырез в столе при механическом надавливании или путем подачи воздуха под кожу плода не позднее 10-12 мин после забоя овцематки. Собранную кровь разливали в центрифужные стаканы и двухкратно центрифугировали при 5000 об/ыин в. течение 20-30 и 15-20 мин соответственно. По сравнению с методом отстоя предложенный способ оказался более производительным и более экономичным. Полученная СК была прозрачной, соломенно-желтого цвета и без признаков гемолиза. Выход конечного продукта составил 50-55$ от объема кпови. Осветленную СК фасовали во флаконы, укупоривали резиновыми пробками, замораживали и хранили при температуре не выше шнуе 30°С. .После накопления необходимого объема (£0-30 л) СК оттаивали, осветляли через марлевый фильтр, стерилизовали через, пакет пластин фирмы "Мнлдипор", затем фасовали во флаконы, в ламинарном боксе, укупоривали резиновыми пробками, обкатывали алюминиевыми колпачками и контролировали в соответствии о требованиями норыативно-техничгсгэй документации.

Разработанная технология получения СК плодоз овец была апро-

-

бярована и успешно применяется да «»стоящего времени на экспериментальной научно-производственной база Катта-Курганского спецкомплекса по откорму овец и производству каракульчи "Согдиана".

Таким образом, проведенные исследования позволили разработать упрощенный способ забора крови без поврездения шкурки плода и при минимальных затратах труда и времени метод отделения форменных элементов крови центрифугированием, позволяющие осуществлять заготовку СК плодов овец в условиях мясокомбината по безотходной технологии»

2.4. физико-химические и биологические свойства СК плодов овец

Сыворотки крови животных представляют собой слоаную белково-каллоиднув систему} в которой в растворенном или связанной с белками состоянии содержатся минеральные соединения, углеводы, кири, ферменты, гормоны, нуклеиновые кислоты и пептиды,соотношений которых зависит от мночисленных факторов, в том числе от метода получения, что свидетельствует о нестандартности ггрепаратов и предполагает обязательный контроль конечного продукта.

Сравнительные испытания показали, что образцы 24 серий СК плодов овец представляли собой прозрачную,слегка опалесцирущую кидкость соломенно-желтого цвета, без запаха, рН 7,3-7,6, содержали белка 20-50 г/л, альбумина 30,3-37,956, свободного гемоглобина не более 50 мг/л и оптическая плотность была на уровне 0,111-0,142 ед. В образцах СК плодов овец установлен моральный характер распределения белковых фракций: альбумин от 51,7 до 56,7%; ^-глобулины колебались в пределах от 8,6'до 12,35«; о62-гл0бУлшы от 20»° до 23,7%; уЗ -глобулины от 10,0 до 14,9% и ^ -глобулины практически отсутствовали (до I%), что имеет огромное значение в вирусологической практике.

- 9 -

Было также отмечено, что серии СК плодов коров (контроль) отличались от СК плодов овей по содержанию холестерина (0,45 и соответственно 0,2(3 ммоль/л), глюкозы (2,8 и 5,7 ммоль/л), мочевой кислоты (247 и 71 ммоль/л), П-изоинзиыа лактатдегидрогеназы (88-и 45 и/л), количеству гормонов: тестостерона (1,0-1,32 и 2,33), прогестерона (5,75-15,11 и 20,94 ымоль/л) и кортизола (9,2-25,1 и 376,9), но в то же время содержали лишь следа глобулинов и были равноценными по осыотичности (482 и 475-496 ммоль/кг) и содержанию общего белка (42 и 39 г/л).

Контроль 10 серий СК проведенный еоамсстно с В.И.Диевым, Г.И.Брагинш, Э.Ф.Богаутдиновкм и НЛ'.Осидзе, не выявил антител к бруцеллам и лептоспирам, аденоматозу и висна маеди, вирусу ящура, рота- и коронавирусам, а также к зирусаы ИРТ, Ш'-З, ДД и диареи.

По требованию ВОЗ (1983) все компоненты ростовых питательных сред, используемые для изготовления иммунобиологических препара-

I

тов должны быть стерильниш. Контроль (Ж плодов овец на контшина-ты показал, что все исследуемые серии препарата не были контеминк-рованы банальной микрофлорой, не содержали вирусных агентов, а такие микоплазм.

По данньы Руе (1975) о полноценности и пригодное?1! СК животных квалификации "для культур клеток судят по ростовкм свойствам

I

и токсичности. В отношении СгС плодов овец чувствительной тест-культуры и метода биологического контроля не разработано.

Бкли испытаны простые по технике изготовлена,' доступные и широко применяемые в вирусологической практике первичные культуры клеток ФЭК, ПО и ТБ, и перевиваемая линия клеток СПЗВ.Установлено, что все испытанные тэст-яул&туры адекватно реагировали на действие ростовых факторов СК плодов овец и плодов коров (контроль). Существенных различий в сроках формирования монослоя,УК н морфо-

логии клеток в культуре не отмечено. Поэтому допустимо использование испытанных клеточных культур с целью качественного контроля биологических свойств СК плодов овец.

Известно, что качественные методы контроля несовершенны и, вследствие этого,затруднена объективная оценка уровня ростовой активности (РА) ПС и СК животных (Л.И.Игудин, 1990). В последние годы предложен целый ряд количественных методов биологического контроля (КМЕК) ГС и СК животных, которые однако не нашли широкого применения в практике (А.Витакер, 1972; А.Балах, И.Блажзк, 1982; Л'А-у-«/<?-1965; -¿'У,1985).

В.Т.Ночевным и др. (1992) предложен доступный, простой в исполнении и учете результатов количественный метод биологического контроля, позволяющий в баллах оценить уровень РА коммерческих серий ПС и СК животных. В основу метода контроля положен общеизвестный биологический принцип, согласно которому потребности клеточных культур и ывдфоорганиэмов возрастают при уменьшении посадочной концентрации клеток (Л.В.Багоров, 1972).

Испытания показали, что КМШ позволяет в течение 7 дней определить не только уровень РА, но и токсичность серий СК плодов овец. Практически равноценными ростовыми свойствами характеризовались 26 серий СК плодов овец (84-92 балла) и 14 серий СК плодов коров (84-96 баллов). Нестандартными по РА были СК КРС (52-84 балла). Количество баллов адекватно отражало ростовые возможности СК животных. Снижение уровня РА СК в баллах проявлялось в снижении проли^еративной активности первичных и перевиваемых культур клеток, увеличении сроков образования монослоя и изменении морфологии клеток в культуре.

Достоверность и перспективность КМШ была подтверждена в сравнительных опытех с использованном радиоактивной метки (ЗН-тимидина)

Результата опытов (табл. I) свидетельстуют о прямой связи моаду уровнем РА в баллах и величиной рккумилирования радиактивной метки проли$ерирупцими клетками тест-системы ФЭК. В тоже гремя ИП и урожай клеток (Ж) не отражали количественно уровня РА серий СК плодов овец и но коррелировали с показателя« РА (в баллах) и данными регистрации включения ЗН-тимидина в ДНК клеток.

Таблица I

Сравнительная оценка биологических методов контроля сыворотки крови плода овец

Состав ИЕ . Показатели ростовой активности

СК '.Урожай ;клеток •тыс/мл :Ростовая:Интенсивность ;актив- ;излучения ¡ность : имп/мин : баллы :

Наи- "Серия ненова-: нив :Наиме-:Серия :нова- : :нив : : ип

б 0,63 380 92 19899+303

ПО ^ Г1А 21 0,57 0,55 340 330 82 16740+375 74 14472+721

32 0,57 340 66 10822+439

5 0,55 330 56 5209+386

Сравнительное изучение физико-химических, биохимических и биологических показателей не выявило достоверных различий мевду СК плодов овец и коров, что указывает на возможность взаимозаменяемости препаратов. Показано также, что КМЕК объективно отражает уровень РА СК животных. С учетом экономичности, простоты исполнения и регистрации результатов}КМШ следует признать достаточно объективным, доступным и перспективным.

2.5. Использбкаяие СК плодов овец-для получения культур

тканей и вирусов Изучали пригодность СК плодов овец для получения широкого спектра культур клеток и вирусов.

- 12 -

СК плодов овец были пригодными для получения первичных («К, ФЭП, [ГЭС, ТБ, ГС, ПЯ), перевиваемых (МДВК, ВДСК, Hela, ШК 21/13, Уего, СПЭВ, Леч-240, ПО), лиифобдастоидной ¿W)

к диплоидных (151!, П5М, 4647, ¡¿-22, Л-68) культур, но клетки Сила более крупными, о хорошо выраженными границами, не содериа-тл зернистости, а УК бил в 1,5-2 раза выше, чем в опытах с контрольной СК крупного рогатого скота. С СК плодов коров получены сопоставимые результаты как по УК, так и по срркаы образования моносяоя. Исследуемые серии СК плодов овец и плодов коров в концентрации 10% обеспечивали очень интенсивный рост культуры и образование очень плотного ыонослоя, который отслаивался от стекла на 3 сутки наблюдения. При уменьшении объема СК до 3-7% не было отмечено существенной разницы в прояиферативной активности клеточных культур. Необходимо отметить, что в присутствии СК плодов овец лишь клетки ПЕК агглютинировали и обеспечивали островковый рост культуры, но УК соответствовал контролю. Этот факт свидетельствует о видовой специфичности СК плодов овец в отношении ¡слеток 1Ш.

Совестно с й.Г.Нагиевой показана возможность использования СК плодов овец для серийного пассирования гибридомноЯ линии KP/I0I-3, продуцирующей моноклональные антитела изотипы ¿7 2а к гемагглв-тинину вируса гриппа Л/Краснодар ( ^Л^) в титре 1:2000, в контроле 1:2000.

Сравнительные испытания различных видов СК животных в ЕГШИ, . МНИИВП и ГИСК им. 1.Б.Тарасовича показали, что СК плодов овец обладает равноценной или несколько более высокой ростстиыулирую-щеЯ активность» по сравнению с СК плодов коров при получении культур клеток НДЕК, Нер-»2, Уего, ПО и ^ *»^'«-(1 культур составил 3,2-5,5 в контроле ¿,6-5,2; для культуры клет'к ЛЭЧ-24 соответственно 2,3 и 3,2). Полученные результаты указывают на

возмокиость применения СПС плодов овец взамен эмбриональной сыворотки кровя плодов коров.

I

Устпнсвлено такзв, что культуры клеток, полученные с использованием СК плодов овец были пригодными и обеспечивали максимальнее накопления целого ряда РШ- и ДШ-содераащнх вирусов. В частности било показано, что СК плодов овец в концентрации 3-7$ не влияла на репродукцию вирусов ВБА, ЕСК, ИРГ, ПГ-3, АД, РС-вируса, Д и парвовирусного энтерита собак. В тоЬа гремя следует отметить, что давя следы СК КРС ингибпровали репродакцюо вкусов ПГ-3 и парвовирусного энтерита собак. Одной из причта повышения чувствительности культур клеток является то, чт^ СК плоди овец но содоргкт пнтитол п ингибиторов.

Полученшэ серии СК плодов овзц не уступали по ростстнмулируп-щзй активности СК плодов коров и обеспечивали равноценную или более шеокуп эффективность производства первичных, пэревиваешх и диплоидных культур клеток. В течение 1988-1990 гг изготовлено 42 серии СК плодов овец в объеме 387 л. Все серии СК плодов овец были стерильными, безвредными, характеризовались высокими ростсти-иуяирукпщши свойствами и были использованы для НИР и производства вакцин. По результатам исследований разработана нормативно-техническая документация. Технология получения полуфабриката СК плодов овец внедрена на Катта-Курганском мясокомбинате, а готового продукта-на НПО "Вектор".

Обожая результаты исследований, представляется возможным заключить, что выполненная работа дала возможность:

- определить общие требования к донорам СК, перечень диагностических исследований и условия кормления и содержания животных;

- разработать способ получения СК плодов овец;

- разработать физико-химические и биологический методы конт-

- 14-

роля и определить показатели качества препарата;

- определить условия и сроки гранения сыворотки;

- показать пригодность и перспективность применения СК плодов овец для получения первичных, перевиваемых, диплоидных культур клеток и гибридом;

- показать чувствительность культур клеток, подученных с использованием СК плодов овец для накопления РНК- н ДНК-содерхащих вирусов и производства противовирусных препаратов.

Проведенные исследования я анализ полученных данных позволили сделать следующие выводы.

ВЫВОДЫ

1. Определены общие требования к отбору, подготовке и перечень обязательных диагностических исследований ливотных-доноров сыворотки крови плодов овед.

2. Разработана технология получения сыворотки крови плодов овец, предусматривахщая:

- забой овцематок 132-135 дневной суягнсстм и извлечение плода на конвейере;

- вскрытие оболочек плаценты на специально« столе, зажим, дезинфекции и отсечение пуповины;

- забор крови из сосудов пупочного канатика при механическом надавливании на плод или подачей сжатого воздуха под козу, не позднее 10-12 мин посла убоя овцематок;

- двухкратное центрифугирование крови в течение 20-30 мкн при 5000 об/мин;

- сбор и замораживание сыворотки крови при температура не вазе - 80°С;

- осветление и стерилизация сыворотки крови йияь"пованием.

3. Установлены оптимплышв значения критериев оценки качества сыворотки крови плодов овец квалификации "для культур клеток". Препарат представляет собой прозрачную,слегка опалосцирующую жидкость соломенно-желтого цветя без запаха, рН 7,3-7,6 и содержит белка 33-45 г/л, альбуминов 51,6-56,7% и свободного геиоглобина не более 50 мг/л.

4. Сыворотка крова плодов коров отличается от сыворотки ггро-ви плодов овец по количеству холестерина (0,45 и 0,26 ммоль/л соответственно), глюкоза (12,8 и 5,7 кмоль/л), мочевой кислота (247 и 71 ююль/л), 1-нзознзкиа лактатдсгидропзнвзы (88 и 45 г/л), тестостерона (1,0-1,32 и 2,33), прог стеронз (5,75-15,11 и 20,94 мыоль/л), кортизола (9,2-25,1 и 376,9) и равноценная по оетотич-ности (380 и 378-388 нмоль/кг), содержанию общего белка (42 а 3944 г/л) и наличию лишь следов фракции ^ -глобулинов.

5. Сорил сыворотки крови плодов овец не контаигатровякы бактериями, вирусами, микоплазмами и не содержат антител к бруцеллам, лоптоспирам п вирусам ящура, яденоматозо, виенв-ыаеди и "пиеадо-энтеритов" 1фупного рогатого скота.

6. Установлено возможность применения количественного метода контроля ростовой активности (баллы) и токсичности сыворотки крови плодов овец с использованием: референс-прэпарагов на основе ферментативного гидролизата ¡шиц сухого; контрольной сыворотки крови крупного рогатого скота с ростовой активностью 64-80 баллов и тест-культуры ФЭК или ФЭП с посевной концентрацией клеток О,Г, 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 и 0,6 млн/мл. Уровень ростовой активности коммерческих серий сыворотки крови плодов овец в баллах коррелирует с величиной аккумулирования радиоактивного предшественника нуклеиновой кислота ЗН-тимидина пролиферирующими клетками тест-культуры.

7. Сыворотка крови плодов овец не уступает по ростовым свойствам фетальной сыворотке кровк плодов коров и в составе питательных сред в концентрациях 3-7% пригодна для получения первичных {Ш,*аП,ПЭС,ТБ,Ш,ПС), перевивавши (Щ^К, УЩСК, Ке1а, ВШ£ 21/13, Уего.СПЭВ, Леч-240, ДО), димфобалстсидной { ).диплоидных (Л5И, ПШ1,4647,Ы-22,Д-68) культур клеток и гибридами (Кр/Ю1-3), продуцирующей ыоноколональные антитела к гемагглвтину вируса гриппа А/Краснодар в титре I : 2000.

8. Сыворотка крови плодов овец в концентрации 3-7$ не огт-эвэает ингмбвдируюцего воздействия на репродукции вирусов ост; голубей, и болезни Ауески, парагршша-3, диареи, аденовируса, рес-пираторно-синицитального вируса крупного рогатого скота и парво-вируса собак.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЩОШИЯ

1. По результатам исследований сомесгно с сотрудниками ВГНКИ ветпрепаратов, ГКСК-иы. Д.Б.Тарасевича, САФ ВШИ и ЭНПБ "Согдиаиа" разработана и утверждена ГУБ 14СХ России нормативно-тех-ничесхая документация: Сыворотка кропи плодов овац нативная стерильная без консерванта (ТУ 10-07-150-89; продлена до 15.11,94); временная инструкция по изготовление; временное наставление по применению... .

2. Серийное производство СК плодов овец организовано на НЛО

"Вектор" и САФ ВШЯИ. Препарат рекомендуется для получения широко»

го спектра культур клеток ~ и вируссодерващих иатерлалов в производстве противовирусных препаратов.

СПИСОК работ, опубликование по теме диссертации

I. И.П.Вишсиирский,' С.И.Назаренкс, О.Г.Решша, Л.И.Хигня;:

В.Ф.Иваиоэ, В.В.Сокова. "Пояучштз сыворотки крова одиодновншс' ягнят". I съезд эпидемиологов и гигиенистов Таджидастана. Душанбе, 1935. с. 52.

2. И.П.Вышеимрский, С.Й.Назаронко, Л.И.Хизняк. "Пролиферация клеток коки эмбрионов овцы в среде с пониженным содержанием сыворотки однодневных ягнят". Цитология. 1987. т.29. Р 9. с.1094.

3. В.Г.НочевкыП, Л.И.Хихняк. Сыворотка кропи плодов овец квалификации "для культур клеток". В кн.:"Успехи современной вирусологии". 1995. Екатеринбург (в печати).

- 18 -УСЛОВНЫЕ ССКРАЩЙШ ПС - питательная среда СК -• сыворотка крови Ш - вирусные препарата СК ПО - сыворотка крови плодов овац СК Ш - сксоротка КрОВИ плодов коров

- урокдй клеток

- индекс пролиферации

- крупный рогатый скот

- нормативно-техническая документация

- технические условия

- диплокднзя линия клеток

- перевиваемая лмш: клеток

- гвдролаэот локтальбум»н.з

- фабробйести оибрионов з-7р

- фйЯробласти змбриокоь парэяодоз

- почка ипшт

- почка амбриона коровы почка эмбриона сз.шы:

- почка крольчонка

- почка овцы

- ростовая активность

К1Ш - количественный метод биологичоского контроля В5А -- вирус болезни Ауески ¡Ш - вирус оспы кур ВПЭС - парвовкрускый энтерит собак ИРГ - инфекционный ринотрахеит ПГ-3 - парагсц.г.-З Д - диарея АД - аденовирус

УК

ш

КРС

шя

ТУ Д5С

шк ш

шп

пя

так

гос

ш

цо

Ра