Разработка средств специфической профилактики и лечения вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае

Зеркалев, Дмитрий Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка средств специфической профилактики и лечения вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка средств специфической профилактики и лечения вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае"

На правах рукописи

Зеркалев Дмитрий Юрьевич

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар - 2004

Работа выполнена в Кубанском государственном аграрном университете на кафедре микробиологии и вирусологии, и ФГУ «Краснодарская государственная биофабрика»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Шевченко А.А.

Официальные оппоненты: д.с/х.н., профессор Петенко А. И.

к .6 .н., Олиферова Э. В.

Ведущая организация Ставропольский госагроуниверситет

Защита состоится "01 " июня 2004 года в "13 " часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.09 при Кубанском государственном аграрном университете по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного университета..

Автореферат разослан " 04 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук доцент

Чернышева Н.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Кролиководство является важной отраслью животноводства, поставляющей диетическое мясо и ценное сырье для меховых изделий: Кроликов используют в качестве лабораторной модели при изучении различных вопросов физиологии, иммунологии в медицине, в ветеринарии, как продуцентов при изготовлении и контроле биологических препаратов. Разведением - кроликов занимаются общественные и частные хозяйства, многие питомники медицинских и научно-исследовательских учреждений страны.

Для успешного разведения кроликов и получения от них высокой продуктивности важное значение имеет защита, их от различных заболеваний (И.А. Бакулов и соавт., 1996; А.А. Шевченко, Л.В. Шевченко 2002, 2003). Помимо применяемых ветеринарно-санитарных мероприятий по профилактике заболеваний у кроликов необходимо разрабатывать специфические биопрепараты для профилактики и лечения инфекционных болезней. Кролики болеют многими инфекционными болезнями, наиболее опасными являются вирусная геморрагическая болезнь (ВГБК), миксоматоз и пастереллез кроликов, которые наносят офомный экономический ущерб кролиководству, связанный с массовой гибелью этих животных (И.А. Бакулов и соавт., 1988; 1992; 1996; В.В. Гуненков, 1987; А.Ф. Евтушенко, 1992; А:А. Шевченко, Л.В. Шевченко 2002,2003).

В 1984 г. в Китае была зарегистрирована вспышка болезни кроликов, вызывающая большую смертность этих животных. В связи с тем, что у павших кроликов в паренхиматозных органах наблюдали геморрагические изменения, эта болезнь была названа «вирусная геморрагическая болезнь, кроликов», которая широко была распространена в Китае, затем появилась в нашей стране и Европе (Н. Liu et.al.,1984; F. M. Cancellotti, 1985; И.А. Бакулов и соавт., 1988; 1992; 1996). В 1987 г. были поражены кролики 31 административной территории, где зарегистрировано 75 вспышек ВГБК. К 1994 году неблагополучными по ВГБК являлась 51 административная территория Российской Федерации. Наибольшее распространение ВГБК отмечали в Московской, Тверской, Владимирской, Смоленской и Тульской областях, Краснодарском крае и других регионах. В нашей стране, там где не вакцинируют кроликов, регистрируются случаи заболевания и гибели кроликов от ВГБК. Самой надежной защитой кроликов от ВГБК является вакцинация этих животных. Для специфической профилактики ВГБК в нашей стране разработана жидкая инактивированная вак-

РОС НАЦИОНАЛЬНА»

БИБЛИОТЕКА

impfi i 3

цина (В.Ш Жестерев, 1998). Однократная иммунизация кроликов в дозе 0,5 мл формирует иммунитет, обеспечивающий защиту от вирулентного вируса на 7-е сутки продолжительностью не менее 6 месяцев. У кроликов на месте введения вакцины возникали воспаление, раздражение, абсцессы, хромота и др. осложнения.

В Краснодарском крае в хозяйствах, где не вакцинируют кроликов, ежегодно регистрируются случаи заболевания и гибели этих животных. Вакцина, имеющаяся в стране, выпускается только во Владимирской области, которую владельцы кроликов не всегда могут срое-временно приобрести и вакцинировать кроликов. Нами в 2000 г. в одном из хозяйств в пригороде Краснодара в период эпизоотии был выделен вирус ВГБК. Это позволило нам изучить биологические свойства вируса и разработать препараты для профилактики и лечения ВГБК.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлось разработка технологии изготовления инактивированной вакцины и иммунной сыворотки для профилактики, лечения и диагностики ВГБК.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи:

1. Изучить, основные биологические свойства изолята вируса ВГБК «Краснодар-2000».

2. Разработать технологию изготовления инактивированной вакцины против ВГБК и технологическую линию для производства вакцины'в условиях ФГУ Краснодарская биофабрика.

3. Разработать технологию изготовления иммунной сыворотки для лечения и профилактики ВГБК.

4. Изучить иммунобиологические свойства инактивированной вакцины и иммунной сыворотки в экспериментальных и производственных условиях.

5. Разработать проект нормативно-технической документации на изготовление и «контроль инактивированной вакцины и специфической сыворотки для профилактики и лечения ВГБК.

6. Разработать рекомендации по профилактике, ликвидации и диагностике ВГБК.

Научная новизна работы. В первые в Краснодарском крае выделен изолят «Краснодар-2000» возбудителя ВГБК, изучены вирулентность, патогенность, иммуногенность.

Определены основные принципы конструирования новой инакти-вированной тканевой вакцины против ВГБК с разными адъювантами и инактиваторами (теотропин квасцовая, теотропин гидроокисьалюми-ниевая, формолквасцовая, теотропинглицеринизированная, формолг-лицеринизированная, формолгидроокисьалюминиевая).

Установлена высокая специфичность, иммуногенность и безвредность опытных образцов инактивированной вакцины против ВГБК в экспериментальных и производственных условиях.

Показана высокая специфичность иммунной сыворотки для диагностики, лечения и профилактики ВГБК.

Установлена высокая лечебно-профилактическая эффективность специфической иммунной сыворотки против ВГБК в экспериментальных и производственных условиях.

' Новизна полученных результатов подтверждена положительным решением на получение патента №2002130881 от 18.11.02. «Вакцина инактивированная тканевая против вирусной геморрагической болезни кроликов», патента № 2002130880 от 18.11.02. «Способ изготовления инактивированной тканевой вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов».

Теоретическая и практическая значимость. При разработке технологии изготовления инактивированной вакцины и иммунной сыворотки для профилактики и лечения ВГБК учитывали основные принципы конструирования инактивированной вакцины, влияние разных адъювантов и инактиваторов на иммунобиологические свойства вируса, сохранения активности и специфичности лечебно-профилактической сыворотки.

Разработана технология изготовления инактивированной теотро-пин квасцовой, теотропин гидроокисьалюминиевой, теотропин глиие-ринизированной, формолквасцовой, формолглицеринизированной, формолгидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК из нового изо-лята «Краснодар-2000» возбудителя ВГБК и технология апробирована на ФГУ Краснодарская биофабрика.

Разработана технология изготовления специфической иммунной сыворотки для диагностики, лечения и профилактики ВГБК.

Новые инактивированные образцы вакцины против ВГБК и лечебно-профилактическая иммунная сыворотка для лечения и профилактики ВГБК с положительными результатами испытаны в производственных условиях.

Разработан проект нормативно-технической документации на изготовление и контроль ииактивированной вакцины и специфической иммунной сыворотки против ВГБК (ТУ, инструкция по изготовлению и контролю инактивированной вакцины против ВГБК; ТУ, инструкция по изготовлению и контролю специфической сыворотки против ВГБК, утвержденные директором ФГУ Краснодарская биофабрика в 2003 г.; наставление по применению инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов, утвержденное Департаментом ветеринарии РФ 13.11.2002 г.; наставление по применению специфической сыворотки против вирусной геморрагической болезни кроликов, утвержденное Департаментом ветеринарии РФ 13.11.2002

г.)

На основании результатов исследований разработаны «Рекомендации по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае» (2003 г.), «Рекомендации по профилактике и ликвидации вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае» (2004 г.).

Результаты наших исследований используются в учебном процессе при изучении курса «Ветеринарная вирусология» в Кубанском государственном аграрном университете.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета факультета ветеринарной медицины Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2002 г., 2003 г., 2004 г.).

Материалы диссертации доложены на международной научно-практической конференции «Успехи современного естествознания» (Египет, г. Хургада, 2003 г.).

На 4-ой региональной научно-практической конференции молодых ученых, к 80-летию Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2002 г.).

Научно-практической конференции Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2004 г.).

По материалам исследований опубликовано 4 научных работы, в том числе 2 статьи в центральных научных журналах.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Изучение биологических свойств изолята • «Краснодар-2000» возбудителя ВГБК.

2. Разработка технологии изготовления новой инактивированной вакцины против ВГБК.

3. Результаты изучения иммунобиологических свойств инактивированной теотропин квасцовой, теотропин гидроокисьалюминиевой, тео-тропин глицеринизированной, формолквасцовой, формолглицерини-зированной, формолгидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК в экспериментальных и производственных условиях.

4. Разработка технологии изготовления специфической иммунной сыворотки для диагностики, лечения и профилактики ВГБК в экспериментальных и производственных условиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические предложения и приложения. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 8 рисунками. Список используемой литературы включает 125 наименований, из них 83 работ зарубежных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2000 по 2004 годы на кафедре микробиологии и вирусологии Кубанского государственного аграрного университета (КГАУ), на Краснодарской государственной биофабрике, племзверосовхозе «Северинский» Тбилисского района и кролиководческих хозяйствах Краснодарского края.

Вирусы.

В работе были использованы штамм «Воронежский -87» (В-87) и изолят «Краснодар-2000» вируса ВГБК, выделенный из эпизоотического очага в 2000 г.

Рис 1. Схема проведения исследований

Опытные образцы инактивированной вакцины против ВГБК, изготовленные в экспериментальных условиях и на Краснодарской государственной биофабрике в 2001 - 2003 гг.

Животные: кролики различного возраста, породы шиншилла, массой 1,5-5,0 кг, 5500 голов.

Реактивы: формалин технический 37% с конечной концентрацией 0,1-0,2 % формальдегида; теотропин (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетраазациклодекан); глицерин обычный; алюмокалиевые квасцы; 1 М метабисульфит натрия (натрий сернокислый пиро); гидроокись алюминия (ГО А).

Сыворотки: сыворотка крови кролика от не вакцинированных животных;

иммунная сыворотка крови кролика от вакцинированных кроликов против ВГБК.

Эритроциты человека О (1) группы.

Питательные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), агар и бульон Сабуро, физиологический раствор на 0,01 М фосфатном буфере рН 6,6-6,8; 7,2-7,4, дистиллированная вода.

Аппаратура и оборудование: мясорубка, гомогенизатор, закаточная машина, стеклянные 3, 5, 10,20 литровые бутыли.

При разработке технологии изготовления вакцин определяли биологическую активность производственных штаммов, иммунизирующую дозу антигенов, схему и режим инактивацик вируса, подбирали адъюванты и инактиваторы.

Изготовленные серии биопрепаратов проверяли на контаминацию бактериальной и грибковой микрофлорой по ГОСТ 28085-89.

Безвредность и остаточную вирулентность антигенов выявляли в опытах на кроликах, которым вводили препарат разными методами и в различных дозах.

Определение летальной дозы вируса ВГБК проводили титрованием на кроликах общепринятыми методами. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в

Гемагглютинирующую активность вируса и антигена ВГБК определяли в реакции гемагглютинации (РГА) согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов», утвержденным ГУВ Госагропрома СССР 28.12.88т.

Реактогенность вакцины оценивали в течение 5-7 суток после иммунизации кроликов в 5-ти кратной прививочной дозе по наличию поствакцинальных осложнений (воспалительные явления, абсцессы, хромата и др.)

Уровень вирусспецифических антител против ВГБК и активность сыворотки определяли в реакции задержки гемагглютинации (РЗГА) по общепринятой методике. .

Профилактическое и лечебное действие иммунной сыворотки против ВГБК оценивали на кроликах, свободных от антител к вирусу ВГБК, путем введения сыворотки до заражения животных вирулентным вирусом и после заражения, в период развития первичных клинических признаков и последующим наблюдением за животными в течение 30 суток.

Продолжительность иммунитета, создаваемого вакцинами, проверяли на кроликах различного возраста через 3, 5, 180, 270, 360 суток после иммунизации.

Длительность хранения биопрепаратов изучали через 6, 12, 24 месяцев после изготовления при хранении их в сухом месте при температуре от 4 до 6°С.

Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики по общепринятой методике (И.П. Ашмарин, АЛ. Воробьев, 1962; В.Ю. Урбах, 1975).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ:

3.1. Эпизоотологические особенности распространения вирусной геморрагической болезни кроликов в Российской Федерации.

До 1986 года в популяции домашних кроликов в стране отмечали относительное благополучие по инфекционным болезням. И вот неожиданно возникла новая ранее неизвестная болезнь, сопровождающаяся опустошительными эпизоотиями с массовой гибелью кроликов (100%-ная летальность). Эта инфекционная болезнь была впервые описана в 1984 году в Китае и получила название «вирусная геморрагическая болезнь кроликов». Возможно, мы никогда бы не узнали о существовании этой болезни в Китае, если бы она не вышла за его пределы в 1986 году, появившись среди кроликов приграничного с Китаем совхоза «Дальневосточный» Еврейской АР Хабаровского края. Диагноз не был поставлен, кроликов убили на Биробиджанском мясокомбинате, а шкурки отправили на Воскресенскую фетровую фабрику Московской области. Вскоре болезнь широко распространилась по

районам Московской области и другим регионам страны. В 1987 г. были поражены кролики 31 административной территории, где зарегистрировано 75 вспышек ВГБК. К 1994 году неблагополучными по ВГБК являлась 51 административная территория Российской Федерации, количество вспышек снизилось по сравнению с предыдущими годами в 1,5-2 раза. Наибольшее распространение ВГБК отмечали в Московской, Тверской, Владимирской, Смоленской и Тульской областях, Краснодарском крае и других регионах.

Появление и стремительное распространение ВГБК сказалось существенными последствиями для нашей страны: большие потери в меховом сырье для предприятий легкой промышленности, уменьшение поставок диетического мяса для населения, остановка отдельных предприятий биологической промышленности и прекращение выпуска некоторых медицинских и ветеринарных препаратов.

До установления первичного диагноза на ВГБК для борьбы с ней применяли мероприятия, разработанные для искоренения других инфекционных высококонтагиозных болезней этого вида животных (пас-тереллез, миксоматоз). Однако они оказались не эффективными. Только благодаря изучению зарубежной литературы, проведенной за 20 лет, изучение эпизоотологии, клинических и патоморфологических признаков удалось во ВНИИВВиМ изучить это новое заболевание кроликов, разработать и предложить для специфической профилактики новые инактивированные тканевые жидкую и лиофилизированные вакцины против ВГБК, а также ассоциированную вакцину против миксоматоза и ВГБК (Шевченко А.А. с соавт.1990, 1991,1992, 1993, 1994, 1995). Применение новых вакцинных препаратов позволило значительно снизить напряженную эпизоотическую ситуацию в стране по ВГБК и с 1995 по 1996 годы не было ни одного случая заболевания кроликов этой болезнью. Практика последних лет показала, что только своевременная вакцинация кроликов в хозяйствах и частном секторе позволяет предотвратить появление и распространение ВГБК. Однако там, где не вакцинируют кроликов против ВГБК, это заболевание встречается. Проведенный анализ официальных отчетов Департамента ветеринарии МСХ РФ с 1997 по 2003 годы показал, что ВГБК в 1997 г. была зарегистрирована в Курской области, в 1998 г. в Рязанской области, в 1999 г. в Приморском крае и республике Дагестан, в 2000 г. в Брянской и Смоленской областях, в 2001 по 2003 г. в Краснодарском крае и других регионах у не вакцинированных кроликов. В Краснодарском крае лабораторная диагностика не проводится, хотя необходимость в этом имеется, по данным отчетов Государственного управления ветеринарии края, ежегодно более 150 тыс. кроликов вакциии-

руют против ВГБК, однако не известно сколько остается не вакцини-розанных, которые могут быть потенциальными источниками инфекции.

Эпизоотологический анализ показывает, что самой надежной защитой кроликов от ВГБК является своевременная вакцинопрофилак-тика. Важное место в системе мероприятий по профилактике и ликвидации ВГБК занимает своевременная диагностика заболевания. Поэтому необходимо разрабатывать, и совершенствовать лабораторную диагностику и специфическую профилактику ВГБК в Краснодарском крае.

3.2. Изучение вирусной геморрагической болезни

кроликов в фермерском хозяйстве.

В марте 2000 г. в одной из фермерских кролиководческих ферм г. Краснодара отмечали массовую гибель кроликов. Хозяин фермы обратился на кафедру микробиологии и вирусологии КГАУ за помощью. При обследовании фермы установлено, что кролики заболели внезапно, наблюдается массовая гибель. Кролики перед смертью вскрикивают, делают несколько судорожных движений и погибают. Другие виды животных не болели. Неконтролируемый обмен кроликами приводит к появлению и распространению ВГБК в кролиководческих хозяйствах, что мы и наблюдали. Динамика эпизоотического процесса у кроликов развивалась быстро, наблюдали не четкие клинические признаки болезни. У больных животных отмечали угнетение, отсутствие аппетита, вялость, взъерошенность шерстного покрова, за 1-2 часа до гибели истечения из носа в виде кровянистой или пенистой жидкости, повышение температуры тела до 41°С. В естественных условиях у кроликов наблюдали сверх острое и острое течение болезни, заканчивающееся гибелью животных. Так, из 167 кроликов на ферме в течение 3-5 -ти дней пало более 117 голов. Кролики в первые дни развития эпизоотии ВГБК погибали от 10 до 25 голов в сутки, максимальную гибель животных отмечали на 4 - 5 сутки наблюдения. Инфекционная болезнь развивалась быстро с массовой гибелью кроликов.

3.3. Изучение вирусной геморрагической болезни кроликов в экспериментальных условиях.

Исследования по изучению биологических свойств вируса ВГБК разных штаммов проводили в виварии ФГУ Краснодарская биофабрика. Для этого взяли две группы кроликов, не привитых против ВГБК, в возрасте 3,5 - 4 месяцев и заразили первую группу вирусом ВГБК штамм «Воронеж - 87», а вторую группу животных заразили свеже-

приготовленной 10%-ной суспензией печени павшего кролика в эпизоотическом очаге на кролиководческой ферме г. Краснодара в марте 2000 г. изолят «Краснодар - 2000». Вируссодержащую суспензию вводили по 0,5 мл внутримышечно. Наблюдение за клиническим состоянием кроликов вели в течение 5 дней.

В результате установлено, чтоДб кроликов пало через 48 часов после заражения вирусом ВГБК штамм «Воронеж-87» («В-87») из 20 зараженных, летальность составила 80%. Во второй группе животных из 20 зараженных кроликов вирусом ВГБК изолят «Краснодар-2000» («К-2000») через 48 часов пало 5 голов,через 72 часа - 3 головы и через 96 часов - 5 голов, летальность составила 65%.

У кроликов, зараженных штаммом «В-87» вируса ВГБК болезнь развивалась молниеносно, без видимых клинических - признаков, внешне здоровые животные вскрикивали перед смертью и погибали, у отдельных особей наблюдали кровянистые или пенистые истечения из носовой полости. При внешнем осмотре трудно было отличить кролика, больного ВГБК, даже за несколько минут до гибели от других клинически здоровых кроликов. Через 48 часов пало 80% зараженных кроликов, что характерно для молниеносного течения болезни. В опыте два кролика не пали, так как у них выработались специфические антитела к вирусу ВГБК. При исследовании сыворотки крови от этих животных, титр специфических антител составил 1:32- 1:64.

Динамика развития эпизоотического процесса ВГБК у кроликов, зараженных изолятом «К -2000» несколько отличалась, болезнь развивалась быстро с массовой гибелью, гибель первых 5-ти кроликов наблюдали через 48 часов, у больных животных наблюдали угнетение, отказ от корма, вялость, взъерошенность шерстного покрова, опускание ушей, температура тела повышалась до 41°С, перед гибелью животные резко вскрикивали, подпрыгивали, за 1 — 2 часа до гибели наблюдали пенистые и кровянистые истечения из носовой„полости. Падеж кроликов наблюдали в течение 3 — 4 дней после заражения по 3 — 5 голов в день, через 96 часов пало 13 голов из 20 зараженных, что составляет 65% . В опыте 7 кроликов из 20 зараженных остались живыми, так как у них выработались вирусспецифические антитела против ВГБК. При исследовании сыворотки крови от этих кроликов в РЗГА титр специфических антител к вирусу ВГБК составлял от 1:32 до 1:128.

Таким образом, при экспериментальном изучении эпизоотического процесса ВГБК у кроликов, зараженных изолятом «К - 2000» вируса ВГБК наблюдали быстро и динамически развивающиеся периоды эпизоотического процесса, характерные для сверх острого и острого

течения, в отличие от молниеносного течения эпизоотического процесса после заражения штаммом «В - 87» вируса ВГБК. Изолят «К -2000» вируса ВГБК относится к слабовирулентному штамму.

3.4. Разработка технологии изготовления вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов.

Для изготовления инактивированной тканевой вакцины необходимо иметь высоко активное биосырье. Учитывая, что вирус ВГБК может накапливаться только в организме кроликов, нами были проведены исследования по определению накопления вируса в органах этих животных. В результате было установлено, что максимальное накопление инфекционной активности (4,0-4,5 ЛД50/СМ3) происходит в печени, минимальное в почках и мышцах (1,0 ЛДбО/см1)! В связи с тем, что легкие, селезенка, почки, мышцы и лимфатические узлы кроликов, павших после заражения вирусом ВГБК, постоянно обсеменены бактериальной микрофлорой и в этих органах вирус накапливается в малом количестве, а также учитывая сложность процесса обработки указанных органов, нами в качестве вирусного сырья для изготовления инактивированной вакцины была выбрана ткань печени кроликов.

3.4.1. Получение и оценка качества вирусного сырья.

Вирусное сырье получали от кроликов массой 1,5 — 2,0 кг и выше, свободных от антител к возбудителю ВГБК. Для этого кроликов заражали вирулентным вирусом ВГБК изолятом «К-2000» по 1 мл внутримышечно. После их гибели через 48 - 96 часов трупы животных дезинфицировали путем погружения в раствор фурацилина или риванола 1:5000, затем на операционном столе разрезали брюшные мышцы по белой линии, извлекали печень и отделяли желчный пузырь. Печень в целофановых пакетах помещали в морозильную камеру с температурой не менее минус 10-20°С. После замораживания вируссодержащую печень взвешивали, измельчали ножницами, размалывали в гомогенизаторе при малых оборотах, готовили 10 - 20%-ную суспензию на физиологическом растворе рН 7,2, центрифугировали при 3000 об/мин 10 - 20 минут, из надосадка брали пробу и проверяли сырье на бактериальную стерильность высевом на бактериальные питательные среды по ГОСТ 28085-89. Гемагглютинирующую активность вирусного сырья проверяли в РГА с 1%-ной взвесью эритроцитов человека 0 (1) группы крови. Специфичность вирусного сырья проверяли в РЗГА со

специфической иммунной сывороткой против ВГБК в титре не менее 1:32. Активность сырья должна быть не менее 1:512.

3.4.2. Отработка инактивации вирусного сырья.

Для получения инактивированного вирусного сырья необходимо подобрать эффективные препараты, позволяющие подавить патоген-ность и вирулентность вируса, но сохранить иммуногенность. При отработке параметров инактивации вируса брали вирусное сырье в виде10-20%-ной вируссодержащей суспензии печени кроликов, павших после заражения их вирулентным вирусом и проверки на бактериальную стерильность и вносили формалин в 0,1%-ной конечной концентрации формальдегида и теотропин в концентрации 0,001% при комнатной температуре. Вируссодержащую суспензию печени после добавления инактиваторов ставили при температуре 37°С, 22-24°С в течение 5 суток. Остаточный формалин в суспензии нейтрализовали 1М раствором мета- или пиро бисульфитом натрия или калия. Наличие остаточного вируса определяли путем введения инактивированной суспензии печени кроликам в объеме 1,0 см3 и наблюдали за ними в течение 10-20 суток. Затем кроликов, привитых инактивированными препаратами, заражали вирулентным вирусом ВГБК. В результате установлено, что формалин в 0,1%-ной концентрации формальдегида и теотропин в 0,001%-ной полностью инактивируют вирус ВГБК в течение 48 часов независимо от температуры инактивации. Все кролики, которым ввели инактивированный материал, не заболели и остались живы и после заражения их вирулентным вирусом ВГБК, что свидетельствует о высокой иммуногенности инактивированных материалов.

На основании полученных результатов нами были предложены два химических препарата для инактивации вируса ВГБК: формалин и теотропин, а также режимы инактивации вируссодержащей печени. Для изготовления инактивированной тканевой вакцины необходимо использовать формалин в 0,1%-ной концентрации формальдегида или теотропин в 0,001%-ной концентрации при комнатной или при 37°С в течение 2-3 суток. При указанных режимах инактивации вируссодер-жащего сырья вирус ВГБК полностью теряет вирулентность, но сохраняет иммуногенность.

3.43. Технология конструирования вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов.

В связи с тем, что вакцину изготавливают из инактивированного вирусного сырья необходимо для усиления иммунного ответа абсорбировать антиген с помощью адъюванта. Поэтому были испытаны различные адъюванты. Варианты вакцины конструировали тю разработанной нами технологии. Первый вариант: после инактивации вирус -содержащей суспензии в емкость добавляли гель гидрата окиси алюминия (ГОА) 6%-ного раствора-при рН 7,2-7,4 до концентрации 20 -30% к объему и проводили сорбцию в течение 10-12 часов при комнатной температуре и при периодическом перемешивании, затем фасовали в стерильные флаконы по 10-20 мл, укупоривали стерильными резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.

Второй вариант: в инактивированную вируссодержащую суспензию добавляли 0,1% алюмокалиевых квасцов и проводили сорбцию в течение 10-12 часов при комнатной температуре при периодическом перемешивании, а затем также фасовали. '

Третий вариант: в инактивированную вируссодержащую суспензию добавляли 30%-ный раствор глицерина до 10-20% к объему, выдерживали в течение 1-2 Часов при комнатной температуре при периодическом перемешивании и фасовали во флаконы. ' '

Таким образом, для изготовления инактивированной тканевой вакцины против ВГБК были выбраны два инактиватора (формалин и теотропин), в качестве адъювантов взяли (гидрат окиси алюминия, алюмокалиевые квасцы, и глицерин).

Для изготовления инактивированной тканевой вакцины против ВГБК нами разработана технологическая схема, включающая заражение кроликов вирулентным вирусом ВГБК, получение 10-20%-ной суспензии печени, инактивирование вирусного сырья, адсорбция антигена адъювантом, фасовка, укупорка и этикетировка. Принципиальная технологическая схема изготовления инактивированной тканевой вакцины против ВГБК представлена на рис. 2.

Рис. 2. Принципиальная технологическая схема изготовления инакти-вированной тканевой вакцины против ВГБК.

3.4.4. Изучение иммунобиологических свойств вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов.

По разработанной технологии было изготовлено по две экспериментальных серии вакцины, инактивированных формалином с различными адъювантами (формолквасцовая, формолгидроокисьалюминие-вая, формолвакцина с глицерином), теотропином (теотропингидро-окисьалюминиевая, теотропинквасцовая, теотропинвакцина с глицерином) и изучили иммунобиологические свойства.

Для изучения иммунобиологических свойств вакцины с разными адъювантами, кроликов свободных от антител против ВГБК, иммунизировали в дозе 0,5 мл внутримышечно однократно и оставляли контрольных животных (не привитых против ВГБК), через 6 дней всех заражали вирулентным вирусом. Наблюдение за клиническим состоянием кроликов вели в течение 10 дней.

Для выявления срока наступления иммунитета и его длительности взрослых кроликов, проверенных на отсутствие специфических антител к вирусу ВГБК, заражали вирулентным вирусом в различные сроки после иммунизации экспериментальными вакцинами.

Напряженность иммунитета изучали через 9 и 12 месяцев после однократной вакцинации кроликов в дозе 0,5 мл разными вариантами инактивированной вакцины путем заражения их вирулентным возбудителем вируса ВГБК.

В результате установлено, что однократное введение формолвакцины с гидроокисью алюминия, формолквасцовой, формолвакцины с глицерином и теотропингидроокисьалюминиевой, теотропинквасцовой, теотропинвакцины с глицерином в дозе 0,5 однократно у привитых кроликов формирует напряженный иммунитет, обеспечивающий 100%-ную защиту животных через 3-е суток после вакцинации продолжительность иммунитета не менее 12 месяцев (срок наблюдения). Вирусоспецифические антитела выявляли на 5-е сутки в титре от 1:32 до 1:128, через 180-270 суток повышался до 1:512— 1:1024 и через 360 суток титр антител был в пределах 1:32 -1:128. Титр вирусспецифических антител, образовавшийся после вакцинации у привитых кроликов, коррелировал с устойчивостью животных к заражению вирулентным вирусом. Однако после иммунизации кроликов формолгидроокисьалюминиевой вакциной у кроликов на месте введения образовалось незначительное воспаление, что приводило к беспокойству животного.

Опытные образцы формолквасцовой, формолгидроокисьалюми-ниевой, формолвакцины с глицерином, теотропингидроокисьалюми-ниевой, теотропинквасцовой, теотропинвакцины с глицерином сохраняли гемагглютинирующую активность и иммугоыенные свойства в течение 12 месяцев хранения при температуре 4-8°С (срок наблюдения). В коммерческой вакцине активность снижалась на один порядок.

3.4.5. Изучение вакцины в производственных условиях.

С 2002 по 2003 годы было изготовлено по две серии формол-квасцовой и теотропин гидроокисьалюминиевой и теотропинквасцовой вакцины против ВГБК и две на Краснодарской государственной биофабрике, проверены в соответствии с техническими условиями и по разрешению Департамента ветеринарии Российской Федерации проходили испытания в неблагополучных регионах Краснодарского края, в частности в племзверосовхозе «Северинский» Тбилисского района на поголовье 5000 кроликов.

В результате установлено, что опытные серии тканевой формол-квасцовой, формолглицеринизированной, теотропин гидроокисьалюминиевой, теотропинквасцовой, теотропинглицеринизированной вакцины против ВГБК были безвредны и не вызывали поствакцинальных осложнений у вакцинированных кроликов (воспаление, припухлость, абсцессы, хромату и др). Однако после вакцинации коммерческой формолгидроокисьалюминиевой, изготовленной на Покровском заводе биопрепаратов, на месте введения вакцины у 25 кроликов наблюдали поствакцинальные осложнения.

От вакцинированных кроликов выборочно отбирали пробы крови и через 6,9, 12 месяцев после иммунизации и сыворотки исследовали в РЗГА на содержание вирусоспецифических антител.

В результате установлено, что уровень специфических антител к вирусу ВГБК у кроликов, привитых формолквасцовой, формолгидроокисьалюминиевой, формолглицеринизированной, теотропин гидроокисьалюминиевой, теотропинквасцовой, теотропинглицеринизированной, вакциной против ВГБК, через 6-12 месяцев в РЗГА колебался в пределах от 1:32 до 1:512, причем максимальное накопление антител отмечали через 6 месяцев, а затем наблюдали закономерное снижение уровня антител на одно разведение. Следует отметить, что в период проведения испытаний в частном секторе ст. Тбилисской в это время наблюдалась массовая гибель от ВГБК.

Однако привитые кролики в племзверосовхозе «Северинский» опытными образцами вакцин не заболели, прорыва иммунитета не было.

Таким образом, испытания формолквасцовой, формолглицеринизированной, теотропин гидроокисьалюминиевой, теотропинквасцовой, теотропинглицеринизированной вакцины против ВГБК в производственных условиях показали, что после прививки кроликов у них не возникали поствакцинальные осложнения, препараты были безвредны, высокоиммуногенны, прорыва иммунитета не наблюдали. Результаты исследований подтверждены актами комиссионных испытаний в хозяйстве. Однако, у кроликов привитых коммерческой формолгидроокисьалюминиевой вакциной, наблюдали поствакцинальные осложнения (воспаление, припухлость, абсцессы, хромату

ИДР)

.3.5. Разработка т против вирусной геморрагической болезни кроликов.

При ряде инфекционных болезней животных для лечения используют гипериммунные сыворотки, сыворотки реконвалесцентов, а также гамма-глобулины, выделенные из этих сывороток.

С целью получения специфической иммунной сыворотки для профилактики и лечения больных ВГБК животных нами были испытаны различные схемы иммунизации.

По первой схеме для получения иммунной сыворотки использовали клинически здоровых кроликов массой не менее 2,5 кг любой породы, полученных из благополучных хозяйств по инфекционным и инвазионным болезням. Животных вакцинировали в дозе 0,5 подкожно или внутримышечно однократно коммерческой вакциной против ВГБК, через 14 дней кроликов заражали вирулентным вирусом ВГБК и через 10-15 дней после этого проводили тотальное обескровливание животных.

По второй схеме иммунную сыворотку получали от кроликов, иммунизированных коммерческой вакциной против ВГБК в дозе 0,5 см1 двукратно с интервалом 10-15 дней и через 10-15 дней после ревакцинации животных обескровливали.

По третьей схеме иммунную сыворотку получали от вакцинированных кроликов в дозе 0,5 подкожно или внутримышечно однократно теотропин гидроокись алюминиевой вакциной или теотропин квасцовой вакциной против ВГБК после забоя животных на мясо. Обескровливание кроликов проводили с соблюдением правил асептики по общепринятой методике. Иммунную сыворотку обрабатывали и

инактивировали по разработанной нами «для вакцины технологии -формалином.

Принципиальная технология изготовления иммунной сыворотки против ВГБК приведена на рис. 3.

Однократная иммунизация кроликов теотропин гидроокись алюминиевой вакциной или теотропин квасцовой _вакциной против ВГБК в дозе 0,5 см3_

Забой и получение крови, путем обескровливания кроликов с соблюдением асептики в стерильные стеклянные цилиндры

Получение иммунной сыворотки (постановка при комнатной температуре в течение 30-40 мин, обводка стерильной спицей, постановка при температуре 4-6°С в течение 20-30 мин, декантирование, центрифугирование 2000-3000 об/мин 20-30 мин или фильтрование через 2-3-х слойный ватно-марлевый фильтр в стерильные _емкости)_

Консервирование иммунной сыворотки путем внесения формалина в 0,2%-ной концентрации или теотропина в 0,01%-ной _концентрации_

Контроль на бактериальную стерильность, активность в РЗГА

Розлив и фасовка во флаконы, Контроль на

укупорка резиновыми пробка- бактериальную

ми, закатка алюминиевыми стерильность, ак-

колпачками, этикетировка тивность и

1 специфичность в

РЗГА,

безвредность

Рисунок 3. Принципиальная технологическая схема изготовления иммунной сыворотки против ВГБК Нами было получено три серии иммунной сыворотки против ВГБК с активностью 1:128-1:512.

В результате установлено, что предложенные схемы позволяют получать активную специфическую иммунную сыворотку против

ВГБК. Однако наилучшим вариантом по технологичности и безопасности является получение сыворотки после однократной иммунизации кроликов в дозе 0,5 см' теотропин гидроокисьалюминиевой вакциной или теотропин квасцовой вакциной против ВГБК и обескровливание после забоя животных на мясо. По первой схеме можно получать сыворотку при наличии инфекционного вивария для содержания зараженных кроликов, а по второй схеме проводить повторную вакцинацию кроликов, что экономически невыгодно. Получение сыворотки по третьей схеме позволяет в условиях хозяйства, без лишних экономических затрат, при убое на мясо получать иммунную сыворотку против ВГБК.

3.5.1. Изучение лечебного и профилактического действия иммунной сыворотки.

Для изучения лечебного действия иммунной сыворотки против ВГБК брали взрослых кроликов, свободных от антител к вирусу ВГБК, заражали вирулентным вирусом в дозе 1000 ЛД5о/см3 и через 24-30 часов, в период развития клинических признаков вводили иммунную сыворотк по 0,5 подкожно однократно, контрольным кроликам вводили нормальную кроличью сыворотку.

В результате установлено, что однократное введение кроликам нативной иммунной сыворотки с активностью в РЗГА от 1:64 до 1: 256 через 24-30 часов после заражения их вирулентным вирусом ВГБК позволяет сохранит всех кроликов при полной гибели животных в контроле.

Для изучения защитного и профилактического действия иммунной сыворотки против ВГБК предварительно кроликам, свободных от антител к вирусу ВГБК, вводили иммунную сыворотку против ВГБК по 0,5 подкожно однократно, контрольным кроликам вводили нормальную сыворотку без антител. Затем через 2 часа после введения сыворотки всех кроликов заражали вирулентным вирусом ВГБК в дозе 1000 , За животными вели наблюдение в течение 20 суток.

В результате установлено, что однократное введение иммунной сыворотки против ВГБК в дозе 0,5 см' за 2 часа до заражения вирулентным вирусом ВГБК защищает кроликов от возбудителя ВГБК.

Таким образом, иммунная сыворотка против ВГБК позволяют вылечить 80-90% больных кроликов вирусной геморрагической болезнью и защитить животных от вирулентного возбудителя ВГБК, обеспечить профилактику заболевания. Защитное действие иммунной сыворотки сохраняется в течение 30 дней. После хранения иммунной

сыворотки при температуре 4-6°С в течение 12 месяцев (срок наблюдения) эффективность лечебного и защитного действия не изменяется.

Испытание специфической сыворотки провели в производственных условиях. На частной кроликоферме г. Краснодара с поголовьем 167 кроликов, в период эпизоотии ВГБК (на 5-е сутки), когда отмечался падеж кроликов с 2-х месячного возраста по 15 - 25 голов в сутки была применена специфическая сыворотка против ВГБК с активностью в РЗГА 1:64 в дозе 0,5 см5 однократно внутримышечно. Специфическую сыворотку вводили всем кроликам независимо от возраста и пола, не разделяя традиционно поголовье на явно больных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении. После введения сыворотки падеж прекратился. Всего обработали 30 кроликов и все они выжили, при гибели 20 контрольных животных (сыворотку им не вводили).

В результате установлено, что лечебная эффективность иммунной сыворотки против ВГБК в эпизоотическом очаге составила 100%.

В августе 2002 г. в виварии КГАУ во время заболевания кроликов ВГБК (эпизоотия ВГБК), диагноз был поставлен на кафедре микробиологии и вирусологии КГАУ, применили иммунную сыворотку против ВГБК с активностью в РЗГА 1:64 по схеме описанной выше. В результате применения сыворотки против ВГБК удалось спасти 96,6%.

Таким образом, на основании результатов исследований разработана иммунная сыворотка против ВГБК, обладающая высоким лечебно-профилактическим действием. Производственные испытания иммунной сыворотки против ВГБК показали ее высокую эффективность в период эпизоотии ВГБК.

3.5.2. Изучение иммунной сыворотки в серологических реакциях при диагностике.

Диагноз на ВГБК ставят на основании эпизоотологических, клинических,- патоморфологических данных и результатов лабораторных исследований.

Так, при эпизоотологическом обследовании фермерского кролиководческого хозяйства в результате установлено, что в пригороде г. Краснодара эпизоотическая обстановка по ВГБК остается напряженной, ежегодно кролиководы-любители проводят вакцинацию кроликов против ВГБК и там где проводится вакцинация кроликов против ВГБК, это опасное заболевание не возникает. Из специфических факторов учитывали следующее: массовая, внезапная гибель кроликов, быстрое распространение болезни и широкий охват поголовья; живот-

иые других видов не болеют. В результате установлено, что на исследуемой кроликоферме в период эпизоотии ВГБК наблюдали массовую и внезапную гибель кроликов, не вакцинированных против ВГБК (погибало от 10 до 30 голов в день), а животные других видов не болели. В течение пяти дней развития эпизоотии пало 117 из 167 кроликов, что составило 70% поголовья.

При клинической диагностике учитывали клинические симптомы болезни, периоды и течение болезни, динамику проявления эпизоотического процесса. В результате установлено, что инкубационный период болезни составлял 32 -48 часов, у кроликов наблюдали клинические симптомы болезни: угнетение, отказ от корма, взъерошенность шерстного покрова, опускание ушей, повышение температуры тела до 41°С, за 1 - 2 часа до гибели отмечали кровянистые или пенистые истечения из носа.

На основании эпизоотологических и клинических данных, выявленных у кроликов на исследуемой ферме, был поставлен предварительный диагноз — вирусная геморрагическая болезнь кроликов.

При патологоанатомическом вскрытии трупов павших кроликов разного возраста установлены основные изменения в печени, легких, почках, сердце: при макроскопическом исследовании значительные изменения отмечали в органах дыхания. Легкие были кровенаполнены, интенсивно отечны и неравномерно окрашены, имели серовато-розовый цвет с единичными или множественными точечными и пятнистыми кровоизлияниями под плеврой. С поверхности их разреза стекала красная или почти бесцветная жидкость, из бронхов при надавливании выделялся пенистый экссудат.

Стенки трахеи, носовых полостей резко геморрагичны. Просвет трахеи и гортани заполняла красноватая или бесцветная пенистая жидкость

В печени изменения были постоянны, но не всегда однотипны и обусловлены степенью ее кровенаполнения, что вызывало изменение цвета, объема и консистенции. В первые часы после гибели животного печень обычно была резко кровенаполнена, увеличена в объеме, легко рвалась, имела красновато-коричневый цвет с желтоватым оттенком в центральных участках долей. Капиллярная сеть органа была резко инъецирована, имела вид красных черточек и точек неправильной формы, особенно отчетлива на периферии. Поверхность разреза печени была зернистой, под капсулой органа наблюдали точечные геморрагии. Спустя несколько часов после гибели кролика печень имела светло-коричневый цвет, плотную консистенцию, заостренные края, орган напоминал «вареную» печень.

Селезенка в 1,5-3 раза увеличена в объеме, набухшая, темно-вишневого цвета с характерным лиловым оттенком.

Почки резко кровенаполнены, красно-коричневого цвета и увеличены а несколько раз. Наблюдали геморрагии на поверхности почек, капсула легко снималась.

Таким образом, при патологоанатомическом вскрытии установлено, что самые тяжелые поражения наблюдали в печени, возбудитель накапливается в ней в наибольшем титре, чем в других органах и там развивались несовместимые с жизнью патоморфологические изменения, этим и объясняется ее скоротечность и летальный исход.

3.6. Изучение методов лабораторной диагностики.

В нашей стране во ВНИИВВ и М разработаны и испытаны, на практике методы лабораторной диагностики ВГБК с помощью реакции гемагглютинации (РГА), реакции, длительного связывания комплемента (РДСК), реакции задержки гемагглютинации (РЗГА), реакции иммуноферментного анализа (ИФА). Однако в Краснодарском крае лабораторная диагностика ВГБК не разработана. и поэтому не применяется как метод диагностики. Лабораторную диагностику ВГБК проводили на кафедре микробиологии и вирусологии Кубанского государственного аграрного университета. В связи с тем, что вирус ВГБК хорошо агглютинирует (склеивает) эритроциты человека О (1) группы, поэтому использовали метод агглютинации- Для постановки лабораторного диагноза испытали реакцию гемагглютинации (РГА) Для постановки РГА отбирали-кусочки печени павших кроликов от ВГБК, затем измельчали их ножницами и тщательно растирали в ступке со стерильным стеклянным порошком. Полученный гомогенат разводили стерильным физиологическим раствором до 20% -ной концентрации, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут. Надо-садочную жидкость осторожно отсасывали и использовали в качестве испытуемого антигена в РГА. Постановку РГА осуществляли в обычных пластинках из плексиглаза, используемые широко в лабораториях для постановки этой реакции. ,

Для обнаружения специфического гемагглютинирующего антигена ВГБК испытуемый материал (суспензия печени) титровали в присутствии специфической сыворотки, нормальной сыворотки и 0,85%-ного раствора хлорида натрия на 0,01 М фосфатном буфере рН 6,6 -6,7 (ФБР). Готовили двукратные разведения специфического антигена на физрастворе с рН 6,6 - 6,7 в объеме 0,5 см5, начиная с разведения

1:10 до 1:2560. Для контроля эритроцитов на спонтанную агглютинацию в 2-3 лунки вносили по 0,5 см3 физраствора. Затем во все лунки вносили по 0,5 с3м 1%-ной суспензии эритроцитов и панели выдерживали при комнатной температуре 40 - 60 минут (до оседания эритроцитов в контроле на спонтанную агглютинацию) и проводили учет результатов. В лунках контроля на спонтанную агглютинацию эритроциты должны оседать в виде компактной «точки» с ровными краями. В лунках со специфическим антигеном эритроциты оседают в виде «зонтика» с неровными краями. За титр гемагглютинации (1ГАЕ) принимали наибольшее разведение антигена, вызывающее полную агглютинацию эритроцитов. По этой методике исследовали патологический материал от 3-х павших кроликов и во всех пробах был обнаружен вирус ВГБК с активностью в РГА 1:1280.

Таким образом, с помощью РГА установили и выделили вирус геморрагической болезни кроликов и поставлен окончательный диагноз на ВГБК.

Для обнаружения антигемагглютининов (вирусоспецифических антител против ВГБК) предварительно титровали специфический антиген в РГА и в РЗГА использовали 4 ГАЕ антигена. РЗГА ставили в объеме 0,5 мл по два ряда двукратных разведений специфической и нормальной сывороток на физиологическом растворе: вносят специфический антиген, затем испытуемые и контрольные (положительная и отрицательная) сыворотки, начиная с 1:16. Одновременно на физрастворе готовили двукратные разведения рабочей дозы антигена (контроль на активность). Панели выдерживали при комнатной температуре в течение 60 минут, затем в лунки вносили по 0,5 см3 1%-ной суспензии эритроцитов. Ставили контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию (0,5 см3 ФБР и 0,5 см3 эритроцитов). Панели выдерживали 40 - 60 минут при комнатной температуре (до оседания эритроцитов в контроле на спонтанную агглютинацию) и проводили учет результатов Титром антител в сыворотке считали наивысшее ее разведение, которое дает полную задержку гемагглютинации. При постановке РЗГА с сыворотками крови, полученных от выживших кроликов после заражения вирусом ВГБК, титр составлял от 1:32 до 1:128, что позволяет защитить кроликов при контакте с вирулентным вирусом.

В результате установлено, что испытуемая иммунная сыворотка против ВГБК в РЗГА имела активность гемагглютининов в титре 1:128 Ранее нами было установлено, что уровень антител 1:8 и выше обеспечивает защиту от вирулентного вируса ВГБК.

Таким образом, с помощью серологических реакций (РГА и РЗГА) можно быстро ставить диагноз на ВГБК и использовать эти ре-

акции в ветеринарных лабораториях, как метод лабораторной диагностики. Для лабораторной диагностики ВГБК разработаны «Рекомендации по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов» и «Рекомендации по профилактике и ликвидации вирусной геморрагической болезни кроликов».

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что эпизоотическая ситуация по ВГБК в Российской Федерации с 1987 по 1994 годы оставалась напряженной, неблагополучными по ВГБК были 51 административная территория Российской Федерации, в последующие годы за счет применения вакцин эпизоотическая обстановка значительно улучшилась. На Северном Кавказе, в том числе Краснодарском крае ежегодно регистрируются случаи заболевания ВГБК среди не вакцинированных против ВГБК кроликов.

2. В период эпизоотии ВГБК в пригороде г. Краснодара выделен слабовирулентный изолят вируса ВГБК, названный «КРАСНОДАР -2000».

3. При экспериментальном изучении изолята «К - 2000» установлено, что он вызывает сверх острое и острое течение болезни, характеризующееся характерными клиническими симптомами и в течение 96 часов после заражения погибает 65%.

4. Патологоанатомические изменения при ВГБК характеризуются кровоизлияниями в легких, печени, почках и других органах. Для острого и сверх острого течения наиболее типичен геморрагический синдром.

5. Разработана технология конструирования тканевой инактивирован-ной вакцины, включающая заражение интактных кроликов, получение 10-20%-ной вирусной суспензии печени от павших животных, инактивацию вирусного сырья формалином 0,1 %-ной концентрации или тео-тропином в 0,001 %-ной концентрации, адсорбирование антигена с помощью адъюванта, фасовка и укупорка.

6. Разработаные инактивированные тканевые варианты формолквасцо-вой, формолвакцины с глицерином, теотропинвакцины с гидроокисью алюминия, теотропинквасцовой, теотропинвакцины с глицерином против ВГБК после однократной иммунизации кроликов в дозе 0,5 , обеспечивают не менее 80 %-ную защиту от вирулентного вируса ВГБК продолжительностью не менее 12 месяцев. Свои иммунобиологические свойства вакцина сохраняют в течение 12 месяцев при температуре 6 ° ± 2 °С (срок наблюдения).

7. Разработана технология получения иммунной сыворотки против ВГБК для диагностики, лечения и профилактики заболевания. Сыворотка сохраняет свое лечебно-профилактическое действие в течение 12 месяцев хранения при температуре 2 - 10 °С.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ:

- Для специфической профилактики ВГБК предложены формол и тео-тропинвакцина с гидроокисью алюминия, алюмокалиевыми квасцами и глицерином к ним разработана нормативно-техническая документация (временное наставление по применению, утвержденное Департаментом ветеринарии РФ 13.11 2002 г., технические условия, инструкция по изготовлению и контролю, утвержденные директором Краснодарской государственной биофабрики).

- Иммунная специфическая сыворотка для диагностики, лечения и профилактики ВГБК, разработана нормативно-техническая документация (временное наставление по применению, утвержденное Департаментом ветеринарии РФ 13.11.2002 г., технические условия, инструкция по изготовлению и контролю утвержденные директором Краснодарской государственной биофабрики).

- Подготовлены и изданы «Рекомендации по профилактике и ликвидации вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае», «Рекомендации по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов».

- Полученные материалы используются на занятиях по курсу «Вирусология»

на факультете ветеринарной медицины Кубанского государственного аграрного университета.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Зеркалсв Д Ю. Изучение методов лабораторной диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов. // Новые методы профилактики и лечения болезней животных. Труды Кубанского госагроуннверси-тста Краснодар, 2003. - 6-8.

2. Зеркалев Д.Ю. Специфическое лечение вирусной геморрагической болезни кроликов. // Новые методы профилактики и лечения болезней

животных. Тр>ды Кубанского госагроуниверситета. Краснодар, 2003. -8-10.

3. Зеркал ев Д.Ю., Шевченко А. А. Диагностика, лечение и профилактика вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае. // Ж. Успехи современного естествознания. -2003. - №4. - с. 46-47.

4. Шевченко А.А., Зеркалев Д.Ю. Диагностика, лечение и профилактика вирусной геморрагической болезни кроликов в условиях Красно -дарского края. // Ж. Кролиководство и звероводство. - 2003. - №6. - с. 28-29.

Лицензия ИД 02334 14.07.2000.

Подписано в печать 27,04.2004. Формат 60 х 84

Бумага офсетная Офсетная печать

Печ.л. 1 Заказ №276 Тираж 100

Отпечатано в типографии КубГАУ, 350044, Краснодар, Калинина, 13

9468

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зеркалев, Дмитрий Юрьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности распространения вирусной геморрагической болезни кроликов.

1.2.Характеристика возбудителя.

1.3 .Основные механизмы передачи возбудителя.

1.4. Диагностика.

1.4.1. Эпизоотологическая и клиническая диагностика.

1.4.2. Патоморфологическая диагностика.

1.4.3. Лабораторная диагностика.

1.5. Специфическая профилактика и лечение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка средств специфической профилактики и лечения вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае"

Актуальность темы. Кролиководство является важной отраслью животноводства, поставляющей ценное диетическое мясо и сырье для меховых изделий. Кроликов используют в качестве лабораторной модели при изучении различных вопросов физиологии, иммунологии в медицине, в ветеринарии, как продуцентов при изготовлении и контроле биологических препаратов. Разведением кроликов занимаются общественные и частные хозяйства, многие питомники медицинских и научно-исследовательских учреждений страны.

Кролики болеют различными незаразными и инфекционными болезнями. Для успешного разведения кроликов и получения от них высокой продуктивности важное значение имеет защита их от различных заболеваний (H.A. Бакулов и соавт., 1996; A.A. Шевченко, JI.B. Шевченко 2002, 2003). Помимо применяемых ветеринарно-санитарных мероприятий по профилактике заболеваний у кроликов необходимо разрабатывать специфические биопрепараты для профилактики и лечения инфекционных болезней. Кролики болеют многими инфекционными болезнями, наиболее опасными являются вирусная геморрагическая болезнь (ВГБК), миксоматоз и пасте-реллез кроликов, которые наносят огромный экономический ущерб кролиководству, связанный с массовой гибелью этих животных (И.А. Бакулов и соавт., 1988; 1992; 1996; В.В. Гуненков, 1987; А.Ф. Евтушенко, 1992; A.A. Шевченко, J1.B. Шевченко 2002,2003).

В 1984 г. в Китае была зарегистрирована вспышка болезни кроликов, вызывающая большую смертность этих животных. В связи с тем, что у павших кроликов в паренхиматозных органах наблюдали геморрагические изменения, эта болезнь была названа «вирусная геморрагическая болезнь кроликов», которая широко была распространена в Китае, затем в нашей стране и Европе (Н. Ali et.al.,1984; F. М. Cancellotti, 1985; И.А. Бакулов и соавт., 1988; 1992; 1996). В нашей стране, там где не вакцинируют кроликов, регистрируются случаи заболевания и гибели кроликов от ВГБК. Самой надежной защитой кроликов от ВГБК является профилактическая вакцинация этих животных. Для специфической профилактики ВГБК в нашей стране разработана жидкая инактивированная вакцина (В.И. Жестерев, 1998). Однократная иммунизация кроликов в дозе 0,5 мл формирует иммунитет, обеспечивающий защиту от вирулентного вируса на 7-е сутки продолжительностью не менее 6 месяцев. У кроликов на месте введения вакцины возникали воспаление, раздражение, абсцессы, хромота и др. осложнения.

В Краснодарском крае в хозяйствах, где не вакцинируют кроликов, ежегодно регистрируются случаи заболевания и гибели этих животных. Вакцина, имеющаяся в стране, выпускается только во Владимирской области, которую владельцы кроликов не всегда могут своевременно приобрести и вакцинировать кроликов. Нами в 2000 г. в одном из хозяйств в пригороде Краснодара в период эпизоотии был выделен вирус ВГБК. Это позволило нам изучить биологические свойства вируса и разработать вакцину.

1. Изучить основные биологические свойства нового изолята вируса ВГБК «Краснодар-2000».

2. Разработать технологию изготовления инактивированной вакцины против ВГБК и технологическую линию для производства вакцины в условиях Краснодарской биофабрики.

3. Разработать технологию изготовления иммунной сыворотки для лечения и профилактики ВГБК.

5. Разработать проект нормативно-технической документации на изготовление и контроль инактивированной вакцины и специфической сыворотки для профилактики и лечения ВГБК.

6. Разработать рекомендации по профилактике, ликвидации и диагностике ВГБК.

Научная новизна работы. Впервые в Краснодарском крае выделен изолят «Краснодар-2000» возбудителя ВГБК, изучены вирулентность, патоген-ность, иммуногенность.

Определены основные принципы конструирования новой инактивированной тканевой вакцины против ВГБК с разными адъювантами (теотропин квасцовая, теотропин гидроокисьалюминиевая, теотропинглицеринизиро-ванная, формолквасцовая, формолглицеринизированная, формолгидро-окисьалюминиевая).

Показана высокая специфичность иммунной сыворотки для диагностики, лечения и профилактики ВГБК.

Новизна полученных результатов подтверждена положительным решением на патент №2202130881 от 27.11.02. «Вакцина инактивированная тканевая против вирусной геморрагической болезни кроликов», патент 2202130882 от 27.11.02. «Способ изготовления инактивированной тканевой вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов».

Теоретическая и практическая значимость. При разработке технологии изготовления инактивированной вакцины и специфической сыворотки для профилактики и лечения ВГБК учитывали основные принципы конструирования инактивированных высокоиммуногенной вакцины и специфической лечебно-профилактической сыворотки.

Разработана технология изготовления инактивированной теотропин квасцовой, теотропин гидроокисьалюминиевой, теотропин глицеринизирован-ной, формолквасцовой, формолглицеринизированной, формолгидроокись-алюминиевой вакцины против ВГБК из нового изолята «Краснодар-2000» возбудителя ВГБК и производство освоено на ФГУ Краснодарская биофабрика.

Новые инактивированные вакцины против ВГБК и лечебно-профилактическая иммунная сыворотка для лечения и профилактики ВГБК с положительными результатами испытаны в производственных условиях.

Разработан проект нормативно-технической документации на изготовление и контроль инактивированной вакцины и специфической сыворотки против ВГБК (ТУ, инструкция по изготовлению и контролю инактивированной вакцины против ВГБК; ТУ, инструкция по изготовлению и контролю специфической сыворотки против ВГБК, утвержденные директором ФГУ Краснодарская биофабрика в 2003 г., наставление по применению инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов и наставление по применению специфической сыворотки против вирусной геморрагической болезни кроликов, утвержденные Департаментом ветеринарии РФ 13.11.2002 г.)

На основании результатов исследований разработаны «Рекомендации по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае» (2003 г.)

Рекомендации по профилактике и ликвидации вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае» (2004 г.).

Научно-практической конференции Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2004 г.).

По материалам исследований опубликовано 4 научных работы, в том числе 2 статьи в центральных научных журналах. Личный вклад

Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по разделу 3.3. оказывал практическую и консультативную помощь главный технолог ФГУ Краснодарская биофабрика кандидат ветеринарных наук, Кружнов H.H. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Распространение вирусной геморрагической болезни кроликов в Российской Федерации.

2. Изучение биологических свойств изолята «Краснодар-2000» возбудите-ы ля ВГБК.

3. Результаты разработки технологии изготовления новой инактивирован-ной вакцины против ВГБК.

4. Результаты изучения иммунобиологических свойств инактивированной теотропин квасцовой, теотропин гидроокисьалюминиевой, теотропин гли-церинизированной, формолквасцовой, формолглицеринизированной, фор-молвакцины, формолгидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК в экспериментальных и производственных условиях.

5. Результаты разработки технологии изготовления специфической иммунной сыворотки для диагностики, лечения и профилактики ВГБК в экспериментальных и производственных условиях.

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Зеркалев, Дмитрий Юрьевич

выводы

5. Разработана технология конструирования тканевой инактивированной вакцины, включающая заражение интактных кроликов, получение 10-20%-ной вирусной суспензии печени от павших животных, инактивацию вирусного сырья формалином 0,1 %-ной концентрации или теотропином в 0,001%-ной концентрации, адсорбирование антигена с помощью адъюван-та, фасовка и укупорка.

6. Разработаные инактивированные тканевые варианты формолгидро-окисьалюминиевой, формолквасцовой, формолвакцины с глицерином, тео-тропинвакцины с гидроокисью алюминия, теотропинквасцовой, теотро-пинвакцины с глицерином против ВГБК после однократной иммунизации кроликов в дозе 0,5 см3, обеспечивают не менее 80 %-ную защиту от вирулентного вируса ВГБК продолжительностью не менее 12 месяцев. Свои иммунобиологические свойства вакцина сохраняют в течение 12 месяцев при температуре 6 0 ± 2 °С (срок наблюдения).

7. Разработана технология получения иммунной сыворотки против ВГБК для диагностики, лечения и профилактики заболевания. Сыворотка сохраняет своё лечебно-профилактическое действие в течение 12 месяцев хранения при температуре 2 - 10 °С.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для специфической профилактики ВГБК предложены формол-, теотро-пинвакцины с гидроокисью алюминия, алюмокалиевыми квасцами и глицерином к ним разработана нормативно-техническая документация (временное наставление по применению, утвержденное Департаментом ветеринарии РФ 13.11.2002 г., технические условия, инструкция по изготовлению и контролю, утвержденные директором ФГУ Краснодарская биофабрика).

2. Иммунная специфическая сыворотка для диагностики, лечения и профилактики ВГБК, разработана нормативно-техническая документация (временное наставление по применению, утвержденное Департаментом ветеринарии РФ 13.11.2002 г., технические условия, инструкция по изготовлению и контролю утвержденные директором ФГУ Краснодарская биофабрика).

3. Подготовлены и изданы «Рекомендации по профилактике и ликвидации вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае», «Рекомендации по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов».

4. Получены положительные решения о выдаче патента на изобретение «Способ получения вакцины против ВГБК», «Вакцина против ВГБК».

5. Полученные материалы используются на занятиях по курсу «Ветеринарная вирусология» на факультете ветеринарной медицины Кубанского государственного аграрного университета.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зеркалев, Дмитрий Юрьевич, Краснодар

1. Бакулов И.А., Вишняков И.Ф., Семенихин А.Л. Вирусная геморрагическая болезнь кроликов (расшифровка этиологии, разработка методов диагностики и борьбы) / Ветеринария. 1992. - ч. 7-8.

2. Вирус геморрагической болезни кроликов / М.С. Малахова, H.A. Власов, И.Ф. Вишняков, В.В.Макаров // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Тез. докл. науч. конф. ВНИИВВиМ / г. Покров, 1990. с.79-81.

3. Вирус геморрагической болезни кроликов: физические и структурные характеристики / В.В.Макаров, И.Ф. Вишняков, H.A. Власов, М.С. Малахова // Вестник РАСХН. 1992. - №4. - с.49-52.

4. Вирусная геморрагическая болезнь кроликов новая патология (обзор иностранной литературы) / И.А. Бакулов, В.А. Балабанов, А.Л. Семенихин, Д.И. Козлова, Н.И. Архипов // Ветеринария. -1988.-№11.-с.71-72.

5. Вирусная геморрагическая болезнь кроликов / И.А. Бакулов, И.Ф.

6. Вишняков, Т.А. Власова, A.A. Шевченко // М.: Центр научнотехнической информации, пропаганды и рекламы. 1994. — 38 с.

7. Власов H.A. Вирус геморрагической болезни кроликов // Общаяэпизоотология: иммунологические, экологические иметодологические проблемы: Матер, международ, науч. конф./ г.

8. Харьков, 1995. с. 322-325.

9. Власов H.A. Геморрагическая болезнь кроликов // Ветеринарная газета. 1994. - №3. - с.2.

10. Гуненков В.В. Вирусная геморрагическая болезнь кроликов // Ж. Ветеринария. 1990. - №5. - с.13-15.

11. Малоголовкин С.А., Черных А.А, Власов H.A. Моноклональные антитела к вирусу // Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней сельскохозяйственных животных и птиц: Тез. науч. конф./ г. Краснодар, 1996. с.73.

12. Методические указания по лабораторной диагностике вируснойгеморрагической болезни кроликов // Утв. ГУВ Госагропрома СССР 28 декабря 1988 г.

13. Оценка эффективности вакцинных препаратов против вирусной геморрагической болезни кроликов / A.A. Шевченко, Г.М. Карпов, Т.А. Власова, М.М. Зубаиров, В.А. Балабанов // Тез. докл. 3-ей Всесоюзной конф. по эпизоотологии. г. Новосибирск, 1991. —с.415-418.

14. Опыт ликвидации эпизоотии вирусной геморрагической болезникроликов / A.A. Шевченко, И.А. Бакулов, В.П. Князев, Ф.А. Бадаев, В.А. Филиппов // Ветеринарная газета. 1994. - №21 (57).

15. Опыт ликвидации эпизоотии вирусной геморрагической болезни

16. Кроликов / A.A. Шевченко, И.А. Бакулов, В.П. Князев, Ф.А. Бадаев, В.А. Филиппов // Ветеринарная газета. 1994. - №21 (57).

17. Патоморфодиагностика и патогенез вирусной геморрагической болезни кроликов / С.А. Аверин, Г.П. Дымина, Н.И. Архипов и др. // Ветеринария. 1992. - №7-8. - с.32-35.

18. Профилактика опасных болезней кроликов / A.A. Шевченко, Н.В. Малоголовкина, А.И. Неверовский, В.П. Князев, В.В.Зиновьев, Л.В. Бузун, JI.B. Шевченко, Т.А. Власова // Ж.

19. Кролиководство и звероводство. — 1995. — №1. — с.20.

20. Специфическая сыворотка против вирусной геморрагической Болезни кроликов / A.A. Шевченко, И.А. Бакулов, В.П. Князев, Ф.А. Бадаев, В.А. Филиппов // Ж. Кролиководство и звероводство. 1994. - №6. - с.23.

21. Шевченко A.A. Совершенствование контроля формол вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: тез. докл. науч. конф. ВНИИВВиМ / г. Покров, 1990. с. 211-213.

22. Шевченко A.A. Эффективность термоинактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов // Ж. Ветеринария. 1994. - №6. - с.29.

23. Шевченко A.A. Сыворотка против вирусной геморрагической болезни кроликов эффективное лечебно-профилактическое средство // Ж. Вестник РАСХН. - 1994. - №4. - с.53-55.

24. Шевченко A.A. Сыворотка против вирусной геморрагической болезни кроликов // Ж. Кролиководство и звероводство. — 1994. -№4. с.24.

25. Шевченко A.A., Шевченко J1.B. Специфическая профилактика опасных инфекционных болезней кроликов // Человек и ноосфера. Матер. Всероссийской науч. практ. конф. академии естествознания. - г. Краснодар - Геленджик, 1999. - с.57-60.

26. Шевченко A.A., Шевченко JI.B. Руководство по инфекционным болезням кроликов. г. Краснодар, 2000. - 81с.

27. Шевченко A.A., Шевченко JI.B. Вирусные болезни кроликов. М., 2000. - 85с.

28. Шевченко A.A., Шевченко JI.B. Профилактика опасных инфекционных болезней кроликов // Профилактика и лечениеболезней животных. Труды КубГАУ. г. Краснодар, 2001. -выпуск 387(415). -с.5-7.

29. Шевченко A.A., Шевченко Л.В., Литвинов A.M. Болезни кроликов. М., 2002. - 222с.

30. Шевченко В.И. Патоморфологические изменения и Дифференциальная диагностика вирусной геморрагической болезни кроликов. // Автореф. дис. . канд. вет. наук. М., 1990. -16с.

31. А new viral disease in rabbits / S.L. Liu, H.P. Xue, B.Q. Pu, N.H. Qiananim. Husb. Vet. Med., 1984. vol.l6, №6. - p.253-255.

32. An inactivated vaccine against haemorrhagic pneumonia in rabbits / Z.D. Gu, X.X. Wang, O.L. Li, F.F. Sun // Chin. J. Vet. Med., 1986.-vol. 12, №2. -p.50-51.

33. Anon. Necrotic hepatitis of rabbit // Asian Livestock, 1990. vol. 15, №5. - p.52-54.

34. An outbreak of rabbit sudden death in Korea suspected of a new viral hepatitis // Japan. J. Vet. Sei., 1990. №52 (5). - p. 1135-1137.

35. A preliminary report on viral haemorrhagic pneumonia (tentative name) in rabbits / S.Z. Gao, S.G. Liu, M.H. Gan et al. //Chin. J. Vet. Med., 1986.-vol. 12,№4.-p. 9-11.

36. Boujon C.E., Gainer F.R., Bestetti G.E. Die «infektiöse nekrotisierende Hepatitis» des Kaninchenserste Falle in der Schweiz

37. Schweiz. Arch. Tierheilk., 1989. -bd. 131. -s. 71-76.

38. Brugere-Picoux J. La maladie hemorragique virale du lapin en Europe

39. Cuniculture, 1990. №9. - p. 86-95.

40. Cancelloti F. M., Renzi M. Epidemiology and current situation of viral

41. Haemorrhagic disease of rabbits and the European brown hare syndrome in Italy // Rev. Sei. Tech. Off. Int. Epiz., 1991. №10 (20. - p. 409-422.

42. Cancelloti F. M., Villeri C. Lie insione della malattia X del coniglio // Rav. conigl., 1988. vol. 25, №9. - p.41-46.

43. Y. Wang, Ch. Ji, Y. Zhou et al. // Sei. agr. sin., 1988. 21, №5. p. 73-79.

44. Diagnostic procedures for European brown hare syndrome (EBHS): Application in Epidemiological surveys in twe Italian regions

45. A. Lavazza, M.T. Scicluna, L. Corradini et al. // 14th Conf. Reg. Comis for Europe OIE, Sofia (Bulgaria) 2-5 oct. 1990.

46. Doenca hemorragica a virus do coelho em Portugal // Rev. Port. Cien. vet., jan./mar. 1989. vol. LXXXIV, №489.

47. Du N.X. Rabbit hemorrhagic disease (RHD) a new disease and its viral etiology // Dt. Tirartl, Wschr., 1990. - vol. 97, №3. p.l 14-116.

48. Du N.X. et al. A preliminary report on the identification of a new virus- rabbit haemorrhagic disease virus //Chin. J. Virol., 1986. №2. - p. -152.

49. Experimentelle Untersuchungen zur hämorrhagischen Septikamie der Kaninchen / H. Schirrmeier, H. Granzow, H. Bergmann, H. Schlüter

50. Mh/ Vet. Med., 1990. bd. 45, №6. - s.193-197.

51. Experimental transmission and electron microscopic demonstration of the virus of haemorrhagic disease of rabbits in Czechoslovakia

52. B. Smid, L. Valicek, J. Stepanek, E. Jurak, L. Rodak // J. Vet. Med. Ser. B, 1989. bd. 36, №3. - s.237-240.

53. F AO-OIE-WHO. Animal Health Yearbook, №№29. 30,31,32. Rome, 1990, 1991, 1992, 1993.

54. Gamberini A. Malattia «X», un flagello per I conigli // Terra Vita, 1988.- vol. 29, №50.-p.53.

55. Gransow H. et al. Hämorrhagische Septikamie der Kaninchen: Erregernachweis und ersts elektronenmikroskopische Charakterisierung // Mh. Vet. Med., 1989. bd. 44, №11. - s. 379-380.

56. Gregg D. A., House C. Necrotic hepatitis of rabbits in Mexico: a parvoviruses // Vet. Ree., 1989. vol. 125, №24. - p.603.

57. Gutirrez J.G. The outbreak of viral hemorrhagic disease of rabbits in Mexico and operation of the National Animal Health emergency system // J. Appl. Rabbit Res., 1990. №13. - p.130-132.

58. Hämorrhagische Septikamie der Kaninchen (RHD) Untersuchungen Zum Quantitativen Antigennechweis / H. Liebermann, H. Bergmann, E.Lange, H.Schizrmeier//J. Vet. Med.B, 1991. bd. 38. -'s. 621-629.

59. Huang H.B. Vaccination against and immune response to viral haemorrhagic disease of rabbits: a review of research in the Peoples Republic of China // rev. Sei. Off. Int. Epiz., 1991. vol. 10, №2. -p.481-498.

60. Investigations on a viral haemorrhagic disease in rabbits in Yunnan Province / J.S. Wei, N.S. Yn, Y. F. Yang et al. // Chin. J. Vet. Sei. Techn., 1987. №8. - p.20-24. 66.Investigations on a viral septicaemia by immunization / J.S. Wei,

61. N.S. Yn, Y. F. Yang et al // Chin. J. Vet. Med., 1987. №13. - p.17. 67.Ji C.Y., Du X., Xu W.Y. Adaptation of the viral haemorrhagic diseasein rabbits to the DJRK cell strain // Rev. Sei. Techn. Off. Int. Epiz., 1991. №10 (2). -p.337-345.

62. Kiepker Ch. Untersuchung über das Vorkommen der viralen haemorrhagischen Erkrankung in Hauskaninchenbe tunden (Schwerpunkt Nicdersachsen) // Diss., Hannover, 1990. 65s.

63. K problematice hynutia domacich kralikov na vychodnom Slovenski / A. Sesevickova, o. Pechac, m. Volosim et al. // Veterinarstvi, 1988. -vol. 39, №6. p.250-251.

64. La methode ELISA et letude serologique de la myxomatose / G. Chatal, G. Gilbert, D. Picavet et al. // Rev. Med. Vet., 1983. vol. 134, №8/9. - p.468-470.

65. Lee C.S., Park C.K. Aetiological studies on a acute fatal disease of Angora rabbits: so called rabbit viral sudden death // Korean J. Vet. Res., 1987. vol. 27, №2. - p.277-290.

66. Lepatite nrcrotica infettiva dei leporidi nuove ricerche sulla pato-genesi della malattia emorragica del coniglio e della leper / P. S. Marcato, C. Benazzi, g. vecchi et al. // Riv. Conigl., 1989. vol. 26, №8. -p.41-50.

67. Liu H.C. et al. Virus isolated, purification and identification from an acuta infecting haemorrhagic disease of rabbit (Oryctolagus cuniculus domestica) // acta boil. exp. Sinica, 1986. vol. 19, №1. - p. 137-141.

68. Loliger H.Ch. Malattia emorragica virale del coniglio (ex malattia «X») // Riv. conigl., 1989. vol. 26, №9. - p.33-35.

69. Loliger H.Ch. Aktuelle Erkrankungen der Hauskaninchen // der prakt. Tierarztl., 1990. bd. 71, №5. - s.42-54.

70. Loliger H.Ch., Matthes S. Akute infektionuskraukheit bei Hauskaninchen // deut. Leflugelwirtrch. Schweinepred., 1988. bd. 40, №47. -s. 13 8.

71. Loliger H.Ch. et al. Uber das Auftreten infektiösen hämorrhagischen Erkrankung bei Hauskaninchen in der Bundesrepublik Deutschland // Tierarztl. Umschau., 1989. bd. 44, №1. - s. 22-25.

72. Ma!attia emorragica virale del coniglio / T. Frescura, L. Gialleti, D. Rutili et al. //ODV Obiettive Doc. Vet., 1989. an. 10, №2. - p.37-40.

73. Malattia emorragica virale del coniglio: epidemiologia e profilassi / D. Galassi, P. Semprini, B. Di Emidio, D. Antonucci // Riv. conigl., 1989.-vol. 26, №9.- p.43-47.

74. Morisse J.P. La maladie hémorragique virale du lapin (VHD). Etat des recherches et evolution de la maladie un an après son apparition en France // Leleveur de lapins, 1989. №28. - p. 18-27.

75. Morisse J.P., Le Gall G., Boilletot E. La maladie hémorragique virale du lapin // Bull. Soc. Vet. Prat. Fr., 1990. vol. 74, №1. - p.31-39.

76. Nachweis der infektiösen hemorrhagischen Erkrankung der Glauskaninchen (Rabbit viral hemorrhagic disease) bei Wildkaninchen (Oryctolagus cuniculus) // Tierarztl. Praxis., 1990. bd. 18, №1. - s.7779.

77. OIE Bulletin, vol. 102-105, 1990-1993.

78. OIE World Animal Health 1988, 1989, 1990, 1991, 1992 (Animal health status and disease control methods in member countries). Item 3. Paris, 1989-1993.

79. Pages Mante A. Aspetti epidemiologici e di laboratorio della malattia emorragica virale del coniglio in Spagna // Riv. conigl., 1989. vol. 26, №9.-p. 19-23.

80. Патоморфологичи изменения при вируснота хеморагична болеет по зайдите / П. Белемезов, А. Петков, Б. Митков, Р. Пешков // Вет. сб., 1989. № 10. - с.17-21.

81. Пешков Р., Иванов Я. Микрореакция связывания комплемента для диагностики геморрагической болезни кроликов // Вет. сб.,1989. №5. - с.30-33.

82. Preparation and application of the tissue inactivated vaccine of rabbit viral hemorrhagic disease / M. C. Li, G. Li, Y. Huang et al. // J. Fu-jian. Agricult. College, 1986. vol. 15, №1. - p.86-90.

83. Проблемы этиопатогенеза, эпизоотологии и профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов / X. Хараламбиев, И. Ангелов, Р. Пешков и др. // Международн. агропромышл. Ж.,1990. -№3.-с.111-115.

84. Prukoz viru akutni nekroticke hepatitidy (ANH) u zojice polnike / L. Valicek, S. Smid, L. Rodak, J. Sevcik // Veterinarastvi, 1992. vol. 42, №l.-p.6-7.

85. Pu B.Q., Qian N.H., Cui S. I. Micro HA and HI tests for the detection at antibody titres to so-called «Haemorrhagic pneumonia» in rabbits //Chin. J. Vet. Med., 1985.-vol. 11,№10.-р.16-17.

86. Purificazione e caratterizzazione dell agente ezilogico della malattia emorragica virale del coniglio / L. Capucci, M. Scicluna, A. Lavazza, E. Brocchi // Selez. Vet., 1990. vol. 31, №3. - p.301-312.

87. Rabbit haemorrhagic disease first outbreak in Israel and review of the literature /Е. S. Kuttin, N. Nowotny, A. Nyska et al. // Isr. J. Vet. Med, 1991.-vol. 46.-p. 119-126.

88. Rabbit haemorrhagic disease in Croatia: first outbreak detected in 1989 /J. Madic, A, Tomac, S, Curie et al. // Vet. Arh, 1992. vol. 62, №5.-p.253-261.

89. Relations etiologiques entre le syndrome du lievre brun europeen (EBHS) et la maladie Hemorragique virale du Iapin (VHD) /1990. -vol. 95, №17 (5). -p.215-220.

90. Reproduction of viral hemorrhagic disease in domestic rabbits from European brown Hare syndrome lesions /J.P. Morisse, J.P. Picoult, E. Boillett, M. Morin //J. Appl. Rabbit Res., 1990. vol. 13, №1. -p.24-25.

91. Schlüter H., Schirrmeier H., Böhme R. Stand der Diagnostik und Bekämpfung der Hamorragisehen Septikamie der Kaninchen in der DDR // Mh. Vet. Med., 1990. bd.45, №8. - s.286-289.

92. Schlüter H., Schirrmeier H. Die Picornavirus Seuche — konkrete Gefahr für die Kaninchenbestande in der DDR // Garten. Kleintier — zucht., 1988.-s. 19021.

93. She R.P., Chen D.W., Gao Q.Y. Obervation on the ultrastructures of host cells in rabbit viral hemorrhagic disease // Chin. J. Vet. Med., 1986.-vol. 12, №9. — p.2-4.

94. Shu Q. A preliminary repert of the effect in immunoserum on viral septicemia of rabbits / Asta Vet. Zootechn. Sin., 1988. vol. 19, №2. — p.108-110.

95. Soike D. et al. Erste Erkrankungen bei der Diagnostic und

96. Bekamfung der Hamorragischen Septikamie der Kaninchen in Bezirk

97. Postdam // Mh. Vet. Agr., 1987. vol. 40, №5. - p. 1283-1293.

98. Studies in viral hemorrhagic disease of rabbit. 2. Purification, electronmicroscopy and nucleic acid of rabbit hemorrhagic virus / X. Shen, H.

99. Peng, Shen et ai. // Chin. J. Virol., 1986. №2. - p.323-328.

100. The control of rabbit viral septicaemia by immunization /G.D. Wu, Q.S. Shu, Z.Z. Lo et al. // Chin. J. Vet. Med., 1987. vol. 13. - p.17.

101. Uber die Immunogenitat einer thekmoinakliviekten Vakzine gegen die virusbedingte Hamorragische Septikamie beim Kaninchen / H. Haralambiev, P. Pexhlejski, M. Jotov et al. // Mh. Vet. Med., 1990. -bd. 45, №22. — s.788-789.

102. Villares G.L. Viral haemorrhagic disease of rabbit: vaccination and immune response // Rev. Sei. techn. Off. Int. Epiz., 1991. vol. 10, №2. — p.471-480.

103. Viral disease kills European rabbits // Vet. Ree., 1989. vol. 125, №3. -p.52.

104. Viral haemorrhagic disease of rabbits // Off. Int. Epiz. Dis. Inform., 1989. №2. - p.6-7.

105. Viral haemorrhagic disease of rabbit in Italy / S. Borrello, M. Renzi,

106. F. Cancellotti et al. // 14th Conf. Reg. Comis. For Europe OIE, Sofia (Bulgaria) 2-5 october 1990.

107. Walla F. Infektiöse haemorrhagische Krankheit der Kaninchen; Einsendung von verdachtigem material an die Bundesanstalt fur Virus-seuchenbekampfung in Hetzendorf. Erlas des Bundeskanzleramtes // Oster. Tierarzt., 1989. bd.42. - s.2-3.

108. Xu F.N., Shen W.P., Liu S.J. Study of the pathology of viral haemorrhagic disease in rabbits // Anim. Husb. Vet. Med., 1985. -vol. 17, №4. p. 153-155.

109. Xu W., Du N., Liu S. A new virus isolated from haemorrhagis disease in rabbits // Proc. Health Congr. World. Rabbit Sei. Ass., 1988.-№3.-456-461.

110. Xu Z.J., Chen W.X. Viral haemorrhagic disease in rabbits, a review //Vet. Res. Commun., 1989.-vol. 13, №3.-p.205-212.

111. Zum Auftreten der Rabbit Haemorrhagic Disease (RHD) in Osterreich. 1. Pathomorphologische und virelogische Untersuchungen / N. Nowothy, A. Fuchs, F. Schilcher, G. Loupal // wien. Tieraaztl. Msch., 1990. bd. 77, №1.- s. 19-23.

Информация о работе

Зеркалев, Дмитрий Юрьевич
кандидата биологических наук
Краснодар, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка средств специфической профилактики и лечения вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка средств специфической профилактики и лечения вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы