Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка способа получения аденозинтрифосфата путем микробиологического синтеза

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка способа получения аденозинтрифосфата путем микробиологического синтеза"

МОСКОВСКИЙ ГОЭДАРСТВГЯШЯ УНИВЕРСИТЕТ МНИ М.З.ЛШЗОСОВа Хими«ский факультет

На правах рухопися Ш 575.099.5

СИШЮЗА Нэталя Сеиовоааа

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ДЦЕНОЗШТРЙФХМГА ПУТЕМ ШШЗШйЯОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА

Специальность - 03.00.23 - биотехнэлогы

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

ХОСНВА-1993

-г 1

-' У / '

? ' / / / { Л ' -1 ' Г > 1

V ¡, / V •• ' С/-'

работа выполнена на кефздре химической эн&имологяе Химического Факультета ШРУ иы. N .В.Ломоносова

ч

Научный руководагэль: доктор.химических наух А.П.Синицын

Сфщпальные оппоненты: доктор биологических наук А .М.Безбородов доктор .химических наук: А.Т.Мевх

Ведшая организация: Институт мэсробгологш РАН

Запита соотостсл "dfi 1993 г. в 16 часов на

заседапгот СЕйцаглизкрованного совета Д.С53.05.76 по химическим на?нэм при зганпеском факультете МГУ

С диссертацией иэкю ознакомиться в библиотеке Химического факультета ЫГТ ..- -

Автореферат разослан MafffU—1993 г.

Ученый секретарь специализироназаого совета кздпда? гиыичзсюа наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние года большое внимание привлекают биотегнологические процессы, основанные на использовании микробных клеток, способных синтезировать необходимые человеку химические соединения. Особенно интересным с точки зрения биотехнологии является получение физиологически активных соединений (аминокислот, белков, антибиотиков, витаминов, нуклеотидов и их производных). Из известных в настоящее время методов получения нуклеотидов наиболее перспективным, рентабельным и экологически чистым представляется микробиологический метод. В нашей стране микробиологического производства нуклеозидфосфатов в промышленном масштабе нет. Следовательно, поиск путей создания достаточно простой и недорогой технологии получения нуклеотидов представляется весьма актуальный.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в создании лабораторного способа получения аденозин-трифосфата путем микробной биотрансформации предаественников. а также изучении влияния различных параметров аа эффективность этого процесса. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: -

подбор штамма-продуцента, способного с высокой эффективностью синтезировать АТФ из аденозина; - разработка и оптимизация способа получения АТФ путем био-фосфорилирования аденозина с целью увеличения степени конверсии субстрата в продукт и повышения количественного выхода АТФ;

Научная новизна работы. Впервые предложен способ получения аденозинтрифосфата, позволяющий достичь близкой к теоретически возможной степени конверсии аденозина в АТФ - 985. Показано, что дискретное добавление аденозина позволяет достигнуть высокого конечного выхода АТФ, концентрация которого составляет не менее 47 г/л. Предложен новый способ предобработки дрожжевых клеток, позволяющие изменить их проницаемость, ■'сохранив активность мультиферментной системы, катализирующей биофосфоралирозание аденозина, и заключающийся в высушивании биомассы при зТс. Проведено сравнительное исследование разня способов высушивания и определен оптимальный- Изучено влияние

различных физмо-хшдгаешс фжтерав на эффегашоеть еяефое-

форшмрования. Показано, что концентрация неорганического фосфата и значение рн в реакционной среде могут рассматриваться как регуляторные фактор, ооуслозливащиа нуклеотидный состав продуктов бффосфоршшровашя. Установлено, что инкубация пре-добработанной биомассы в реакционной среде приводит к дезинтеграции полвферментной системы, катализирувдей фосфорили-рование ' ■

Практическая знатамость работы заключается в том, что в результате проведенных исследований рэзрабогел достаточно простой, не трейувдий слоеного аппаратурного обеспечения, экологически чистый способ получения АТФ, который моезт быть легко масштабирован в промышленных условиях. Аденс^штрифосфат находит широкое применение в медицине в качестве эффективного кер-даотропкого средства; лспользуется таюке узк ценный биохимический реактив в нсслгдсвгкиях в области микробиологии, молекулярной биологии, геявок инхеяэряи. Поскольку потребности в аденозинтрифоа^ате в кашек стране нэ удовлетворен::, и АТФ в значительной степени закупается за рубежом, представляется, что использование разработанного способа для получений АТФ в отечественной промышленности, было бы выгодно и перспективно,

Апробация работа. Отделке полозеная диссертации были представлены на 15-м мвгяупародаоы (йгещг^згзроБашгом Дрокке-воя симпозиуме (Рига, 1991) к 7-м Всесоюзное сияюзиуме "Инженерная анаимологяя" (Ксаква, 19Э1).

Публикации По материал® диссертации имеется 5 публикаций.

Структура и объем диссертация. Диссертация состой из введения, обзора лнтерэтуры (3 главы), экспериментальной части, вхслючающеС описание'объектов исследования и методики эксперимента (I глава), изложения результатов исследования и их обсуждения (3 глава), выводов, списка цитируемой литературы, включающей /2С ссылок. Работа изложена на //¿Р страницах машинописного текста, содержит 7- таблиц, рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизм. В рзооте был использован штат пекарских дрожжей Saccharanусеа cerevlslae 125-7/40.

Питательны» среды.

Культуру драпай S.cerevlslae поддерживали на твердой шпательной среде следующего состава (г/л дистиллированной воды): глгасоза-2,5; пептон-2,0; дрожжевой экстракт-2,0; KH2P04-I,0;Nacl-0,5; hgso^t^o-O.S; (MH+)2so4-0.5: агар-20,0. Хранили культуру при 4*с, пересевали I раз в месяц.

Дроиш выращивали на синтетической среде, содержащей указанные выше компоненты, но без пептона и агара, а также на мелассной питательной среде, содержащей мелассу вместо глюкозы.

Процесс биофо сформирования аденозина проводили на среде, которую готовили на основе 0,6 N калий-фосфатного буфера рн 7,2. Состав среды: глюкоза - 0,55 М; аденозин - 20 мМ: MgSQ4x7H2o--i6idí; толуол - 0,35 (по объему).

Условия культивирования.

Культивирование S. cerevlslae проводили в качалочннх колбах объемом 750 мл (объем среди 100 - 150 мл) при температуре ЗСГС и скорости вращения качалки 180 - 200 об/мин. Время культивирования дрожжей ва синтетической среде 18 - 20 часов, на мелассной среде - 48 часов. Выращенную биомассу отделяли центрифугированием в течение 5 минут при 5 тыс.об/мин на вакуумной Центрифуге Вескшап J2-21 (США).

Условия проведения реакции биофосфоршшрования.

полученную биомассу (сырую или высушенную) помешали в реакционную среду (состав - см. выше) в концентрации 80 г/л по влажному весу. Биофосфорилировавие проводила:

а) в колбах объемом 100 мл (объем реакционной среда 25 мл) при температуре 3üt и скорости перемешивания 200 - 220 об/мин;

б) в реакторе объемом 3 л при той ае температуре и скорости перемешивания без дополнительной подачи воздуха.Через 12 - 16

. часов после начала фосфорилирования в реакционную среду вносили дополнительно аденозин в концентрации 10 г/л и продолжали реакцию еще 10-12 часов.

Определение концентрации АГФ и друглх продуктов биофосфо-рилирования. Концентрацию АГФ определяли люциферин-

ладиферазным методом с использованием иммобилизованной лпцифе-разы светляков (Угарова H.H. и др.,1987). Препарат лгцифэразы, иммобилизованный та методу Угаровой-Бровко, oía предоставлен авторами метода. Определение качественного и количественного состава смеси продуктов Сиофосфорилирования проводили с помощью метода высоко эффективной жидкостной хроматографии на хроматографе "Bio-Rad- серии 700 (США) с использованием колонки Silasorb-Jffig данной 250 им и диаметре») сечения 4,5 ш. Детекцию осуществляли спектрсфотоме тршески при длине волны 254 нм. В качестве элюента использовали 0,3 М аммоний-фосфатный буфер pH 5.

Опредзление концентрации глюкозы проводили:а) Глюкозоок-сидазно-пероксидазннм методом (Березин И.В. и др.,1977), б) на ферментном анализаторе "АРФА", который представляет собой проточный даш-реактор с иммобилизованной на силикагеле глюкозооксидазой, снабженный кислородным элекгродрм Кларка.

Рост культы регистрировали по мутности суспензии на спектрофотометре "Beciman"25 (Ш) ирг длине волны 540 т. Количество клеток в единице объема определяли с помощью камеры Горяева.

Метода высушивания биомассы. Перед высушиванием дрожжи осаждали на фштрах "Sinpor" с диаметром нор 0,85 мкм (ЧССР), таким образом получая "прессованные" дрожки. Прессованную биомассу сушли: а) на лиофильной сушке GD-52 фирмы "Heto" (Дания); б) в термостате при 37t; в) в потоке теплого воздуха на лабораторной модели аэрофонтанной сушилки при 37t (конвективная сушка).

Мжсроскошя клеток. При цитологических исследованиях физиологического состояния дрожжевых клеток использовали методы световой, лшшесцентюй и электронной микроскопии. Прижизненное макроскопическое изучение клеток проводилось на неокрашенных препаратах, а также с использованием флуорохрома - при-мулина. Электронноыикроскопические исследования проводились в институте микробиологии им. А.Кирхенштейва (Латвия). При этом применялись метода ультратонких срезов и сканирувдей микроскопии. Электронюиикроскопические препараты изучали в просвечивающем электронном микроскопе JSii-1200 ех фирмы JEOb (Япония), а также в скашруиием микроскопе jsm-t гоо фзрыы. jeol (Япония).

Определение выживаемости клеток дрожжей. Для определения какваемости клеток после высушивания, а также после обработки толуолом использовали лшавесцентао-микроскопнческий метод с применением примулина. Метод основан на том, что крупная молекула флуорохрома не проникает в живые клетки я при люминесцентном микроскопическом исследовании фдуорохромированных при-мулином дрожжей обнаруживается лишь свечение клеточной стенки (Мэйседь М.Н.. 1951). В силы© поврежденных мертвых клетках с нарушенной проницаемостью краситель связывается с цитоплазмой, что обуславливает ярко-зеленое свечение ыихроорганязмов.

Метода иммобилизации дрожжей. Ижюбшшзацню дрожжей осуществляли двумя способами: а) включением клеток в агар (Войивилло Н.Е. .Камерницкий А.В., 1978*; б) включением в крио-гель поливинилового спирта (Лозинский В.И. я др.,1986).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Скрининг микроорганизмов и подбор условий предобработки клеток.

С целы* выявления итамла, обладавшего наибольшей фосфори-лирувдей активностью, нами был проведен скрининг дрожжей рода Saccharanyces. В качестве критериев отбора были использованы: скорость биофосфорилирования аденозина, количественный выход продукта, степень конверсии аденозина в АТФ. Биофосфоршшрова-ние осуществляли в условиях, описанных в работах (Asada к. et. al.,1978; Брод И.И..1978). Результаты этих' исследований представлены в таблице I.

Очевидно, что лучшие результаты были получены для штамма S.cerevislae 125-7/40, при использовании которого практически весь аденозин фосфоршшровался в АТФ за 18 часов. Именно этот пташ и был выбран в качестве объекта исследования.

Нами было показано, что интактные клетки дрожжей не способны биофосфорилировать аденозин. Из литературных данных известно, что для эффективного осуществления синтеза АТФ необходимо повысить проницаемость микробных клеток.

Таблица I. Эффективность синтеза АТФ разными штаммами пекарских дроюкей. •

г.

Название шташа Начальная концентр, аденозина ( г/л ) Концентра цкя образованного АТФ (г/л) Степень конверсии аденозш АТФ Время достижения 100% конверсии

З.сегеиШае 14 5 9,9 98% 24-26 час.

З.сеге»1в1ае ЕЮ1-У~381 5 5.4 542 не имеет места

З.сегеи1а1аг БКМ-У-398 5 2,1 20,8? ' не имеет места

S.cereviзlae 125-7/40 5 9,9 98% 18 час.

5.сетеи1з{ае . 125-7/42 5 9,5 95% не имеет места

Для изменения проницаемости клеточных мембред в реакционную среду вносили толуол или даметклсулвфэксвд (ДМСО). Была оптимизирована' концентрация толуола, которая составила 0,3% и обеспечивала максимальную эффективность биофосфорилировандя (рис.1). Аналогичные результаты бит получены при использовании ДМСО в концентрации 10%. Отметим, что на всех представленных рисунках-100$—ная конверсия аденозина показана пунктирной линией.

Таким образом, использование в данном, процессе штамма пекарских дроггей БассЬагтфез сегег>{Б1<?е 125-7/40 - с одной стороны, и обработка клеток толуолом в оптимальной концентрации, с другой,- обусловили близкую к теоретически еозможеой степень конверсии аденозина в ДТФ, которая составила 982.

Одаако, известно, что толуол - очень токсичное вещество. Кроме того, его использование в производстве АГФ сильно затрудняло техвадогио очистки конечного продукта. В связи с этим представлялось весьма актуальным найти нетоксичный безреагент-ный способ ув&щчения-проннцаемости дрокжзвкх клеток. В качестве такого способа было предложено использовать предвари-

«по гт-ттла пир(Ш1л101ит ттгютатэт* ТЗьтш* *тг»г* ла1гг»оап\т г/плп»

1\>зшифу ит>)шшши1» 4^вдиаклл<.ц шА<1.и<>-<ииг ишш .^икли^Л'.'А'Шш ыли-

[А1Ф], ПОЛЬ

Рис.1. Влияние концентрации толуола в реакционной среде на эффективность синтеза АТФ-

I - О,IX; 2 - 0,3»; 3 - 0,6«; 4-1« {АТФ]. Моль

Рис.2. Синтез АГй клетками дрогжей, предварительно лиофилизованными (I), конвективно высушенными (2) и обработанными толуолом в концентрации 0,3% (3).

ки, высушенные тремя различными способами: а) лиофилизацией; б) в термостате; в) в потоке теплого воздуха на лабораторной модели аэро<1&нтазной сушилки (конвективно), в процессе высушивания варьировали продолжительность и температуру высушивания. Одновременно проводили прижизненные и злектронномикроско-шиеские исследования дрожжевых клеток, оценивали выживаемость культуры. Было установлено, что высушивание в термостате при любых температурных режимах приводит к гибели клеток. Тем не менее, было показано, что высушенные в термостате при 37*с клетки были способны катализировать Сиофосфоршированпе адено-зина. Это означает, что для осуществления синтеза АТФ из аде-нозина, сохранение физиологической жизнеспособности клеток не является необходимым условием и не может рассматриваться как критерий их фосфэршируюцей активности. Вероятно, клетка в таком состояния функционирует только как носитель ферментативных активностей.

На рис.2 представлены сравнительные результаты, полученные при осуществлении синтеза АТФ предварительно лиофилизован-ными клетками, конвективно высушенными и обработанными толуолом в концентрации 0,32. Из рисунка следует, что лиофилизация и конвективная сушка, как способы предобработки биомассы, более эффективна чем использование толуола, так как полная конверсия аденозина в АТФ наблюдается уже через 12-16 часов, в то время как в среде с толуолом такой выход достигается только через 20 часов. Лиофилизация как способ обработки, хотя и высокоэффективна, но, очевидно, что конвективный метод высушивания для прсшвшенного масштаба 'предпочтительнее, т.к. не требует сложного дорогостоящего оборудования и значительно менее энергоемок.

Электрошоыикроскошческие исследования дрохжевых клеток, обработанных толуолом, а также высушенных конвективно, показали:

1).йнкубащя клеток, предобработанннх различными способами, в реакционной среде сопровождается появлением в них липидшпс гранул, которые к концу реакций биофосфоралирования занимают значительную часть объема клеток.

2).По данным сканирующей микроскопии поверхность высушенных клеток имеет характерную складчатость, которая сохраняется в процессе оиофосфоршшровавия.

3).Как показывают данные, полученные методом ультратонких срезов, клеточные стенки высушенных дрожжей, к концу процесса оийфоьфоршшрования практически разрушены, в то время как клеточные стенки толуолышх дрожжей не претерпевают значительных изменений.

Полученные данные свидетельствуют о том, что высушивание является более жесткой обработкой клеток, нежели использование толуола, обеспечивающей эффективное изменение проницаемости. Таким образом, все дальнейшие исследования проводились с использованием высушенных дрожжей.

2.Изучение влияния различных параметров ' ва

эффективность биофосфэрилирования. ' "

При исследовании фосфорилируицей активности клеток, находящихся на разных стадиях роста, было установлено, что начальная скорость фосфорилирования у дрожжей из ранней стационарной фазы роста (18-20 часов) более чем в 10 раз превышает таковую из середины логарифмической фазы (10-12 часов).

Было показано, что в процессе инкубации дрожжевых клеток в реакционной среде не имело места почкование клеток, а их количество в единице объема не изменялось.

Для оптимизации условий синтеза АТФ из аденозина были исследованы зависимости скорости и эффективности этого процесса от концентрации клеток, аденозина, глюкозы и неорганического фосфата. Выло показано, что максимальная скорость и эффективность фосфорилирования аденозина имели место, когда содержание клеток в реакционной среде составляло 40-50 иг/т.

Установлено, что оба параметра процесса (скорость и эффективность) в значительной степени определяются соотношением концентраций клеток и аденозина в реакционной среде. Было показано, что оптимальное соотношение клетки (вл.вес):аденогин -составляло 2:1 соответственно (рис.3). Как следует из рис.3 любое нарушение этого соотношения приводило к катастрофическому срнешю эффективности процессз, пря этом начальные скорости биофосфэрилирования также заметно различались.

lAiej. MOШ

0 5 10 16 20 25

SDOtK.UO

Рес.З. Влияние соотношения концентрации аденозина и клеток на эффективность синтеза ЛТФ

1-концентрация аденозина 20 мМ З-концентрация аденозина 20 мМ концентрация клеток 40 г/л концентрация клеток 80 г/л

2-концентрация аденозина 40 мМ 4-концентрация аденозина 40 мМ концентрация клеток 80 г/л концентрация клеток.40 г/л

Для микробиологического синтеза АТФ из предшественников необходимо присутствие в реакционной среде энергетического источника, в качестве которого чаще всего используется D-глюкоза, которая является легко усвояемым субстратом. Дрожжи Saccharcaycea œrevlalœ утилизирует глюкозу по гликолиги-ческому пути. Поскольку, все реакции фосфоршшрования в живой клетке протекает с поглощением энергии, то, значит, для их осуществления необходимы значительные концентрации соединений, используемых в качестве энергетических субстратоз. При изучении зависимости эффективности синтеза от концентрации глюкозы было показано, что с увеличением концентрации глюкозы до 0,55 M (100 г/л) количественный выход процесса возрастает, при этом начальная скорость образования АТФ не зависит от концентрации глпкози. Была исследована также динамика потребления глюкозы з процессе фосфорялирования. Глюкоза практически исчезает из реакционной смеси уже через 12-14 часов,в то время как синтез АТФ продолжается 18-20 часов. Кроне того, было установлено. что существует. стабильная положительная корреляция между фосфоршшрупцей активностью дрожжей и скоростью потребления глшозы вми. Из pic. 4 следует, что неактивные по тем или иным причинам клети не потребляли гласозу. Это свойство может быть использовано в качестве критерия фосфорилирующей активности биомассы.

рте] .Кош

ГтгаоаадУя

0.01

100

1.000С-03

1.000ЕЧМ)

Рреих.час

Рис.4. Синтез АГФ и потребление глюкозы активными (I) • и неактивными (2) дрокками.

Поскольку дрожжевые клетки обладают инвертазой, в качест ве источника энергии вместо глгкозн использовали сахарозу в концентрации 0,28 Ы или мелассу - отход сахарной промышленности. Меласса является сравнительно дешевым продуктом, и ее применение , в данной технологии приведет к высвобождению значительного количества пищевого дефицитного сырья, которым и являются глюкоза и сахароза.

Была изучена зависимость эффективности синтеза АТФ от начальной концентрации неорганического фосфата в реакционной среде. Диапазон изменения концентрации неорганического фосфата составлял 0,15 - 0,75 Ы. Установлено, что при концентрации фосфата 0,6 М наблюдалась максимальная скорость и эффективность конверсии аденозина в АТФ, которая достигала 988.. Концентрация ниже 0,6 М не обеспечивала эффективной конверсии, а в присутствии 0,75 Ы фосфата хотя и достигался максимально высокий выход АТФ, заметно снижалась скорость реакции. Изучение нуклеогидного состава продуктов реакции при различной исходной концентрации фосфатов показало, что в условиях, когда она составляла 0,6 М через 20 часов инкубации весь аденозин фосфорилировался в АТФ. Количество АМФ и № в конечной смеси не превышаю IX (рис.5). При концентрации 0,3 N через 20 часов все адениловые нуклеотиды детектировались в эквимолярных количествах, аденозин при этом утилизировался на 97% от исходйой

концентрации (рис.6). При снижении концентрации фосфатов до 0,15 Ы аденозин фэсфорилировался только в аденозинмоно- и дифоефат (рие.7). Степень конверсии при этом была равна 94$ (в смеси оставалось 65» неизрасходованного аденозина). В этих условиях скорость потребления аденозина была значительно ниже и 94%-ная конверсия аденозина была достигнута лишь через 30 часов. Возможно, последние условия целесообразно использовать для получения нуклеозидмоно- и дифосфатов.

Было показано танке, что качественные состав продуктов фосфоршшрования аденозина зависит от рН реакционное среды. Установлено, что с уменьшением исходной концентрации фосфата, т.е.- снижением буферной емкости реакционной среды, значительно увеличивалась разность между начальным и конечным значением рН в процессе реакции. Так, если в реакционной смеси в начальный момент реакции было 0,6 К фосфата, то падение рН в процессе биофосфорилирования составляло 0.3 - 0.4 единит (с 7.2 до 6,8). А при концентрации 0,15 Ы рН изменялся с 7.2 до 5.2. т.е. на 2 единицы. Таким образом, зависимость всех параметров процесса биофосфорилирования от концентрации неорганического фосфата в реакционной среде может объясняться несколькими причинами. Во-первых, неорганический фосфат является одним из субстратов реакций фосфорилирования и поэтому определяет их скорость. Во-вторых, рН реакционной среда («7.0-7.2), возможно, является оптимальным для всех ферментов, катализирующих фосфоршщрование аденозина в АТФ. Не исключено также, что кон центрация фосфата регулирует скорость потребления глюкозы клетками, о чем упоминается в литературе.

3. Получение АТФ с помощью иммобилизованных клеток.

Из приведенных результатов следует, что клетки S.cerevlslae 125-7/40 обладают достаточно высокой активностью при биофрсфорилировании аденозина в АТФ. Тем не менее, биотехнологические процессы, связанные с использованием регулярно наращиваемой микробной биомассы, сопряжены с рядом известных недостатков. В связи с этим, многообещающи представлялось использование иммобилизованных клеток, которые являются технологически белее удобной формой биокатглизатора, нежели свободные г.лет;з.

1.00Ж-03

1-ОООЕ-О«.

Рис.5. Изменение содержания аденозина и адениловых нунлеотидов в процессе биофосформирования при концентрации фосфата 0,6 И.

0.01

С, Мот

Изменение нухлеотшдаоро состава смеси в процессе оиофосфоршшрования фи концентрации фосфата 0,3 М.

1-ОООЕ-СЗ

1МХ-

Рис.7. Изменение нуклеотидного состава смеси в процессе Оиофо сформирования при концентрации фосфата 0,15 М

Предварительно нами была проверена возможность повторного использования предобработанных свободных клеток. С этой целью через 4 часа после начала реакции клетки отделяли и переносили в свекую реакционную среду. Кио показано, что эти клетки способны вновь синтезировать АТФ, хотя и с меньшей скоростью. Ыы предположили, что снижение скорости обусловлено негативным влиянием центрифугирования на клетки и. что, в целом, их можно использовать в иммобилизованном виде. Необходимо отметить, что несмотря на обилие результатов по использованию иммобилизованных дрожжевых клеток для получения различных соединений, в литературе отсутствуют какие-либо указания на получение АТФ или других нуклеозидфосфатов при помощи иммобилизованных клеток.

Нами была осуществлена иммобилизация дрожжей Б.сегы1з1ае в агар по методу, описанному в (Бойшвилло Н.Е. .Камерницкий ¿.В.,1978) и в криогель поливинилового спирта (Лозинский В.И. и др...1985).Боло показано, что оба использованных метода иммобилизации позволили сохранить метаболическую активность клеток, которую оценивали по уровню внутриклеточного АТФ.

Сравнительные результаты синтеза АТФ свободными и иммобилизованными в агар клетками представлены на рис.8. Из рисунка следует, что скорость синтеза " АТФ свободными клетками была несколько вше, чем скорость синтеза иммобилизованными клетками, для последних отмечался значительный лаг-период.

(ПФЬНга

. «решдшс

Рис.8. Синтез АГФ свободными (I) и иммобилизованными (2) клетками Б.сегеи1з1ае.

80 S-ная конверсия адеяозина в АТФ была достигнута через 48-50 часов. Однако при повторном использовании катализатора в свежей реакционной среде бнофо сформирования не наблвдалось. Аналогичные результаты получены и для биокатализатора, приготовленного на основе криогехч ПВО. Следует подчеркнуть, что эксперименты с различными модификациями предобработки клеток до и после иммобилизации были проведены многократно, однако все попытки осуществить повторное фосфорилирование приводили к отрицательному результату. Полученные нами данные свидетельствуют о нецелесообразности использования иммобилизованных клеток для получения АТФ из адеЕозина. Тем не менее, представлялось интересным выяснить причины этих неудачных экспериментов, для чего более подробно было исследовано моногократное применение свободных клеток.

Отметим, что в литературе были описаны факты синтеза АТФ из аденозина при помощи ацетонового порошка дрогшей, когда ферменты, осуществляющие фосфорилирование, через 2 часа после начала реакции высвобождаются во внеклеточную среду (Asada М. et.ai.,197в). Данные, полученные нами ранее при повторном использовании свободных клеток, свидетельствовали о том, что в пашем случае не наблюдалось такого эффекта. С другой стороны, отрицательные результаты использования иммобилизованных клеток, мокно было интерпретировать в пользу описанного в литературе явления. Для проверки этого предположения был проведен эксперимент, в котором в хода _ процесса биофосфорилироЕания через 4, 8 и 20 часов отделяли биомассу и переносили в СЕежую реакционную среду. В результате было показано, что клетки, отделенные через 4 часа, способны синтезировать АТФ, хотя и с меньшей скоростью. Биомасса, отделенная через 8 часов, была еще менее активна. Клетки дроагей, ухе один раз осуществившие ~100 з-ное фэсформирование аденозина, при перенесении в свежую среду вообще не способны повторно синтезировать АТФ, как это было и в случае с иммосилизоьавными клетками. Далее был проделан следующий эксперимент. Через 16 часов после начала реакции, когда в реакционной среде практически весь аденозин был исчерпан, а концентрация АТФ составляла 36 мЫ (19 г/л), клетка отделяли от реакционной среды, а в нее вносили дополнительную порцию аденозина (10 г/л). Было показано, что в супер-натанте имеет место повторное образование нужлеозидфосфатов,

однако, нужно отметить, что фосфоршшрование проходило только до образования аденозиндифосфата (рис.9).

Сои

Рис.9. Изменение содержания аденозива к адениловых

нуклеотидов в реакционной смеси при биофосфорили-ровании при помочи дрожжевнх клеток (0-16 часов) исупернатанта (1&-26 часов). { - внесение адевозина и отделение клеток.

Цри этом оказалось,что если внести дополнительную порцию адевозина в реакционную среду, не отделяя биомассу, то через 8-Ю часов наблюдалось полное фосфоршшрование внесенного аде-нозина в АТФ и, таким образом, концентрация АТФ в среде через 24 часа после начала реакции достигла 40 г/л (рис.10).

Таким образом, установлено, что аденозинкиназа и . адени латкиназа в процессе инкубации высвобождаются во внеклеточную среду, г тс время как нуклеозиддвфэсфокиназа, вероятно, остается прочно связайной с клеточной мембраной. Нами было показано , что выход конечного продухта можно еще повысить, если увеличить количество аденозина. вносимого вторично. В результате. максимальный выход аденозинтрифосфата, подученный нами, составлял 47-52 г/л.

С.Г/Л

Рис. 10. Синтез АТФ при двухкратной внесении аденозина без отделения клеток, внесение аденозина.

Необходимо отметать, что вез, представленные вше результаты были получены на малых обгмах. Максимальный объем реакционной смеси составлял 25 мл. Безусловно, представлялось интересным масштабирование данного процесса. Процесс синтеза АТФ из аденозина с помощью дрожжей бвш проведен в реакторе объемом 3 л, при этом было показано, что степень конверсии аденозина в АТФ составляет также 97-982 и за 25-23 часов в смеси накашивается до 40 г/л продукта.

Эксперименты большего масштаба были проведены нами в ШО "Биолар" (Латвия): Процесс проводили в 5- и Ю-литровых реакторах, при этом скорость процесса и степень конверсии аденозина в АТФ не изменялись. Совместно с ШО -Биолар» был разработан лабораторный регламент, который был куплен НПО "Биолар".

выводы

1. Проведен скрининг микроорганизмов и отобран штамм дрожжей Saocharmlces cerevlslae 125 - 7/40, способных с высокой эффективностью синтезировать АТФ из аденозина. Степень конверсии аденозша составляет 98S.

2. Установлено, что нативаые клетки дрожжей не способны биофосфоршшровать аденозин.

3. Предложен новый Способ предобработки дрожжевых клеток, позволяющий изменить их проницаемость без использования токсических агентов, заключаищйся в предварительном высушивании биомассы при 37t.

4. Показано, что существенным факторе«, определяющим скорость процесса и эффективность фосфоршшрования, является соотношение содержания дрожжевых клеток и аденозина в реакционной среде, которое в оптимальных условиях составляет 2:1 соответственно.

5. Показано, что дискретное добавление аденозша в реакционную среду позволяет достигнуть высокого конечного выхода аденозинтрифосфата, который составляет не менее 47 - 50 г/л.

6. Установлено, что концентрация неорганического фоофатв и рН в реакционной среде могут рассматриваться как регуля-торные факторы, поскольку, изменяя концентрацию фосфата и рН среды можно получать разные продукты биофосфорилирования: АТФ; АТФ:АДФ:А№ в соотношении 1:1:1; смесь АДФ:А® в соотношении 1:1,3.

7. Показано, что инкубация предобработанных клеток в реакционной среде приводит к- дезинтеграции полиферыентной системы, обеспечивающей биофосфорилирование аденозина в АТФ, в связи с чем повторное использование клеток невозможно. Получены косвенные доказательства, свидетельствующие о том, что аденозинкиназа и аденилаткиназа выходят в реакционную среду, в то жз время нуклеозиддафосфокиназа остается связанной с клетками.

8. Показано, что при масштабировании процесса получения АТФ из аденозина от 25 мл до 10 л не отмечается каких -либо изменений в скорости образования конечного продукта и степени конверсии аденозина.

СПИСОК раоот. опубликованных по материала диссертации:

ЬСиманова Н.С., Райнина Е.И., Сишцын а.П. Способ получения аденозинтрифосфата. Авт.свид.№ 1740420, Бюллетень изобретений 1822, 1992 г. (приоритет от 26.07.90).

2-Симанова U.C., Райнина Е.и., Раппопорт А.И., Синицын А.П. Способ получения аденозинтрифосфата. Заявка на выдачу патента % 4856563 (приоритет от 01.08.SO), положит.реш. о выдаче патента от 03.01.92.

3.N.3.Symar_ova,. E.Ï.Hainina. Microbiological syntiissis of ATP. - Bussian Biochemistry and Biotechnology, 1991, 7.1, Mo 2/3, p.125.

4.S.I.Eatnina, N.S.Synanova, A.I.Rappoport. Production oi adenyl nucleoside phosphates emplo^ins yoast Sacchar&nyces cerevistae.- Abstracts ci 15-th. International Specialized Symposium on Yeasts. Riga, 1991, p.112.

5.Симакова li.C., РайЕша S.M. Микрогжологический синтез аденоззптрифосфата.- Тезиса докладов 7-го Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология", Москеэ, 19Э1, с.181.