Совершенствование промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов и оценка их эффективности

Павленко, Игорь Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов и оценка их эффективности
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов и оценка их эффективности"

На правах рукописи

Павленко Игорь Викторович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОМЫШЛЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА СУХИХ ЖИВЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Щелково - 2013 г.

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный консультант:

академик РАСХН, академик НААН Украины, доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат Государственной премии РФ,

Заслуженный деятель науки РФ Анатолий Яковлевич Самунленко

Официальные оппоненты:

Любовь Вячеславовна Римарева - доктор технических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН, Заслуженный деятель науки РФ, заместитель директора по научной работе ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии» Россельхозакадемии

Владимир Андреевич Гаврилов - доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, профессор кафедры биотехнологии ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Илья Артемьевич Буреев - доктор технических наук, профессор, Заслуженный изобретатель РФ, ведущий научный сотрудник лаборатории конструирования препаратов Г НУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадемии

Ведущая организация:

Ф1 ВОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Защита состоится 18 октября 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область. Щелковский район, пос. Биокомбината, д.17, ГНУ ВНИТИБП РАСХН, e-mail: vnilibp@mail.in

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности» Россельхозакадемии.

Автореферат разослан 16 августа 2013 г.

Автореферат 10 июля 2013 г. размещен на сайте ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии www.vnilibp.ru и на официальном сайте ВАК 1щр://\у\у\у.vak.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Фролов Юрий Дмитриевич

РОСПИМСКАЯ г-0СУ/1А1'С10ЬНИАй

библиотека

2013 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Обеспечение населения России продовольствием и биологическая защита людей и животных в стране являются основной задачей АПК на современном этапе, что делает актуальными научные исследования в области биотехнологии, направленные на решение этих проблем.

В настоящее время техническая микробиология является активно развивающимся научным направлением, использующим биотехнологические процессы при разработке и производстве широкого спектра биопрепаратов (вакцин, сывороток, диагно-стикумов, пробиотиков), биологически активных веществ (ферментов, антибиотиков, пребиотиков и др.), добавок к кормам (белков и аминокислот). Их применение в животноводстве и птицеводстве способствует повышению продуктивности животных и птицы, обеспечению ветеринарного благополучия хозяйств, гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.

Вступление России в ВТО повышает требования к конкурентоспособности отечественной продукции, что делает необходимым реконструкцию (реинжиринг) производств многих предприятий биологической, химической и пищевой промышленности и разработку новых или усовершенствование традиционных промышленных технологий производства препаратов.

Основы разработки, оптимизации, моделирования технологий микробиологических производств и процессов микробиологического синтеза отражены в работах В.М. Кантере, В.В. Бирюкова, И.М. Грачевой, Ю.П. Грачева (1979 - 1990 г.г.). Эти разработки актуальны и для предприятий, выпускающих лекарственные средства для животных, в том числе и иммунобиологические препараты, с точки зрения обеспечения их безопасности и качества.

Исследования по разработке управляемых режимов культивирования вакцинных штаммов микроорганизмов и режимов сублимационного высушивания проводили А.Я. Самуйленко, Б.А. Никаноров, Е.А. Рубан, A.A. Раевский, М.Я. Ярцев, Э.Ф. Токарик, A.A. Нежута и др. Технология промышленного производства вакцин для ветеринарии с использованием глубинного культивирования микроорганизмов была разработана Н.Д. Скичко, А.Я. Самуйленко, Н.В. Мельником, B.C. Павленко (1980 -1990гг.).

В настоящее время в области разработки новых и усовершенствования существующих промышленных технологий производства сухих живых бактериальных препаратов не существует единого методологического подхода, основанного на использовании методов системного анализа.

Традиционные технологии разработаны на основе эмпирических подходов и зачастую не удовлетворяют современным национальным и международным требованиям, предъявляемым к технико-технологическим характеристикам (ТТХ) производства и обеспечивающим качество продукции. Поэтому остается много нерешенных технических и технологических проблем совершенствования существующих и создания новых технологий промышленного производства бактерийных препаратов.

Одними из самых сложных объектов с точки зрения технологии изготовления являются вакцины против листериоза и сальмонеллеза. Актуальность производства и применения этих вакцин обусловлена тем, что листериоз и сальмонеллез являются широко распространенными инфекционными болезнями, наносящими значительный ущерб животноводству и представляющими серьезную угрозу здоровью людей. Важ-

ное место в борьбе с листериозом и сальмонеллезом занимает специфическая профилактика с помощью инактивированных и живых вакцин. С этой целью наиболее эффективны живые вакцины, изготовленные из авирулентных штаммов бактерий.

Экономический ущерб от листериоза связан с большой летальностью, снижением продуктивности животных (овцы, свиньи и крупный рогатый скот), абортами, а также затратами на ветеринарно-санитарные ограничительные мероприятия. Летальность при нервных формах листериоза может достигать 98 - 100 %, а при септических - 50 %. Листериоз животных зарегистрирован в 82 странах мира, в том числе и в РФ.

Работы видных российских ученых И.А. Бакулова, А.Н. Панина, В.И. Белоусо-ва, В.М. Котлярова, А.Г. Гаврилова, С.П. Карпова, В.Л. Адамовича и др.( 1961 -2008 г.г.) посвящены изучению биологии возбудителя листериоза, путей выделения листе-рий во внешнюю среду, способов заражения, эпизоотологии заболевания, иммунитета, изысканию высокоэффективных средств профилактики заболевания и разработке технологии производства вакцин.

Семейство энтеробактерий объединяет обширную группу грамотрицательных бактерий, к которым относятся роды Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella и др. Сальмонеллы патогенны для животных многих видов, наиболее часто сальмонеллезы регистрируют у свиней и птиц. Сальмонеллезы имеют большое эпидемиологическое и эпизоотологическое значение. Возбудителями, в основном, являются S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. typhisuis, значительно реже обнаруживают S. gleser, S. dublin, S. voldagsen.

Первая вакцина против сальмонеллеза поросят в нашей стране была изготовлена М.М. Ивановым (1948), против сальмонеллеза телят - А.Г. Малявиным и И.И. Архангельским (1950-1960), усовершенствованием технологии производства вакцин во ВНИИТИБП и на Щелковском биокомбинате занимались Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник,

A. А. Раевский, Е.Э. Школьников и др.

Группа бактерий, включенная в род Escherichia, насчитывает большое число разновидностей, отличающихся между собой по ферментативным и серологическим свойствам, подвижности, по чувствительности к бактериофагам и колининам, по степени антагонистической активности и патогенности. Непатогенные виды колибакте-рий традиционно используются для изготовления пробиотических препаратов (А.Н Панин, 2008; А.Я. Самуйленко, 2010; Н.И. Малик, 2009; В.И. Еремец, 2008 с соавт.).

Симбиоз животных и полезных микроорганизмов играет важную роль в нормальном функционировании организма животных и птицы, а так же реализации их генетического потенциала продуктивности. В настоящее время активно развивается использование симбиотиков не только как антагонистов патогенной микрофлоры, но и как продуцента лизина - незаменимой аминокислоты, которая входит в состав структурных тканевых белков и белковых ферментов, является важным фактором биологически полноценного кормления, способствует улучшению пищеварения, играет важную роль в формировании костяка, повышении продуктивности сельскохозяйственных моногастричных животных (птицы и свиней). Такие симбиотики используются в качестве альтернативы дорогостоящему синтетическому лизину (моно-гидрохлорид лизина), в основном, импортного производства. Поэтому разработка новых препаратов такой группы и технологии их производства является актуальной проблемой. Начало решения этого вопроса было заложено Л.К. Эрнстом (1985, 2007),

B.И. Фисининым (2007), А.Я. Самуйленко (2007), А.А. Раевским (2007), А.А. Нежу-той (2009), И.И. Чеботаревым (2007), Е.Э. Школьниковым (2007) и др.

В связи с вышеизложенным, научно обоснованное решение проблемы совершенствования технологий промышленного производства бактерийных препаратов и до настоящего времени является актуальной задачей, имеющей практическую ценность.

1.2. Цель и задачи исследований. Цель работы - усовершенствовать промышленную биотехнологию производства сухих живых бактериальных препаратов и оценить эффективность их применения в АПК РФ на моделях сухих вакцин против лис-териоза, сальмонеллеза и симбиотического препарата (продуцента лизина).

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. научно обосновать и разработать алгоритм усовершенствования промышленной технологии изготовления сухих бактериальных препаратов;

2. усовершенствовать промышленную технологию производства сухих вакцин против листериоза и сальмонеллеза, согласно разработанного алгоритма: оптимизировать составы питательных сред на основе перевара Хотгингера для глубинного управляемого процесса культивирования бактерий; оптимизировать управляемый процесс глубинного культивирования листерий и сальмонелл; оптимизировать защитные среды высушивания, используемые при изготовлении сухих вакцин против листериоза и сальмонеллеза.

3. усовершенствовать технологию производства симбиотического препарата «Пролизэр» на основе E.coli по разработанному алгоритму: оптимизация состава питательной среды на основе перевара Хоттингера для глубинного управляемого процесса культивирования E.coli; концентрирование бактериальной массы E.coli; оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовление симбиотического препарата на основе E.coli; провести доклинические испытания;

4. изготовить опытно-промышленные образцы препаратов;

5. определить их эффективность применения в бройлерном птицеводстве и животноводстве;

6. разработать нормативную документацию на препараты и освоить их промышленный выпуск.

1.3. Научная новизна. Разработан единый подход к усовершенствованию промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов. Научно обоснован алгоритм разработки и совершенствования промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов. Эффективность его использования экспериментально подтверждена на сложных биотехнологических моделях. Применение математических методов планирования эксперимента позволило определить оптимальные, с точки зрения накопления листерий, сальмонелл и эше-рихий, значения концентраций компонентов питательных сред и параметры управляемого режима культивирования бактерий, оптимизировать состав защитных сред для сублимационного высушивания. С использованием разработанного алгоритма усовершенствована технология промышленного производства вакцин против листериоза (патент РФ № 2053790 от 10.02.96 г., в соавторстве), сальмонеллеза сельскохозяйственных животных (патент РФ № 2129016 от 01.10.96 г., в соавторстве) и симбиотического препарата «Пролизэр» (патент RU № 2450051 от 18.08.2010 г., в соавторстве).

Определены эффективные дозы симбиотика для применения в бройлерном птицеводстве и свиноводстве, разработан способ применения симбиотического препарата «Пролизэр» на основе штамма Е. coli для бройлеров высокопродуктивных

кроссов (положительное решение о выдаче патента по заявке № 2012I05907RU от 21.02.2012 г.).

1.4. Практическая ценность работы. Использование предложенного алгоритма позволяет разрабатывать и совершенствовать технологию промышленного производства сухих бактерийных препаратов. Использование алгоритма в научных экспериментах и практике позволяет снизить количество опытов, затрат на эксперименты, что ведет к снижению себестоимости разработки технологических процессов и технологии в целом.

По усовершенствованной технологии на Ставропольской биофабрике изготовлены опытно-промышленные серии вакцины против листериоза, которые испытаны в хозяйствах Ставропольского края, ранее неблагополучных по листериозу, на овцепо-головье (16034 голов). Случаев заболевания листериозом, иммунизированных данной вакциной и поствакцинальных осложнений, не наблюдалось.

По разработанной технологии изготовлены опытно-промышленные серии вакцины против сальмонеллеза животных на Сумской и Ставропольской биофабриках. Вакцины успешно прошли испытания в свиноводческих хозяйствах Костромской области, в течение 6 месяцев случаев заболевания поросят, иммунизированных данной вакциной и поствакцинальных осложнений не зафиксировано.

Промышленный выпуск вакцин на ФГУП Ставропольской биофабрике по усовершенствованной технологии за 2008 - 2012 гг. составил: против листериоза 4115624 дозы, против сальмонеллеза - 15848360 доз и на ФГУП Щелковский биокомбинат против сальмонеллеза - 5 млн. 440 тыс. доз.

Оптимизация технологических этапов производства симбиотического препарата «Пролизэр» позволила сократить время культивирования Е. coli, повысить накопление жизнеспособных клеток, стабильность биологических свойств препарата и сохраняемость его в процессе длительного хранения.

По данной технологии изготовлено 58 серий симбиотического препарата. В производственных испытаниях подтверждена их безопасность и эффективность. В хозяйствах проведено 19 испытаний на цыплятах-бройлерах высокопродуктивных кроссов и поросятах.

Использование симбиотического препарата при выпаивании бройлерам и даче свиньям с кормом позволяет полностью заменить использование синтетического лизина, увеличить усвояемость корма, что ведет к снижению его потребности на весь цикл выращивания, повысить продуктивность выращиваемых животных и птицы, увеличить среднесуточный привес бройлеров и поросят послеотъемного периода, а также повысить выход мяса 1-й категории и снизить выход мяса на промышленную переработку.

Применение симбиотического препарата при выращивании бройлеров и свиней позволило получить экономический эффект:

- дополнительная прибыль от применения симбиотика на цыплятах-бройлерах кросса «Смена-7» в расчете на 1000 цыплят-бройлеров составила 652,83 рублей, а экономический эффект в расчете на 1000 цыплят-бройлеров составил 8765,25 рублей.

- дополнительная прибыль от применения симбиотика на поросятах послеотъемного периода в расчете на 1000 поросят составила 446620,0 рублей, а экономический эффект в расчете на 1000 поросят послеотъемного периода составил 1271400,0 руб.

Результаты исследований включены в 7 методических положений, утвержденных на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии академиком-секретарем A.M. Смирновым.

Результаты исследования и методология может быть использована разработчиками и производителями лекарственных средств для ветеринарии, а так же в качестве учебного пособия студентов - биотехнологов.

Результаты работы легли в основу для разработанной во ВНИТИБП «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации» и одобренной Президиумом Россельхозакадемии, протокол №4 от 21.04.2011г.

1.5. Основные положения диссертационной работы, которые выносятся на защиту

1. Алгоритм усовершенствования промышленной технологии получения сухих живых бактериальных препаратов.

2. Усовершенствованные технологии получения сухих вакцин против листе-риоза и сальмонеллеза, согласно разработанного алгоритма:

2.1. Оптимизированные составы питательных сред для глубинного управляемого процесса культивирования листерий и сальмонелл;

2.2. Оптимизированные управляемые процессы глубинного культивирования листерий и сальмонелл;

2.3. Оптимизированные защитные среды высушивания, используемые при изготовлении сухих живых вакцин против листериоза и сальмонеллеза.

3. Оптимизированная промышленная технология получения симбиотического препарата на основе E.coli:

3.1. Оптимизированный состав питательной среды для глубинного управляемого процесса культивирования E.coli;

3.2. Режим концентрирования бактериальной массы E.coli;

3.3. Оптимизированная защитная среда высушивания, используемая при изготовление симбиотического препарата на основе E.coli;

3.4. Эффективность применения симбиотического препарата на основе E.coli при выращивании бройлеров и свиней.

1.6. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены:

- в виде ежегодных отчетов по темам государственных заданий на заседаниях ученого совета и методической комиссии ГНУ ВНИТИБП РАСХН (1992 - 2012 гг.);

- на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2009-2012 гг.);

- на Международных конгрессах («Биотехнология-2010, 2011», Москва, 2010, 2011 гг.);

- на Всероссийских и Международных конференциях, проводившихся в Москве, Санкт-Петербурге, Омске, Краснодаре, Курске, Сергиевом Посаде, Покрове, Омске, Тюмени, Щелково, Харькове, Ялте, Минске, Витебске, Алматы (1992 - 2012 гт.).

Разработки удостоены: золотой медали и Диплома I степени Международной выставки «Лаборатория Экспо», Москва (2010 г.); золотой медали и Диплома I степени Российской агропромышленной выставки «Золотая осень», Москва (2011 г.); персонального диплома Российской агропромышленной выставки «Золотая осень», Мо-

сква (2011 г.); медали «Лауреат ВВЦ» (2011 г.); золотой медали выставки-конференции «Биоиндустрия 2012», Санкт-Петербург (2012 г); серебряной медали Российской агропромышленной выставки «Золотая осень», Москва (2012 г.), за монографию «Энтеробактерии в животноводстве».

1.7. Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 57 научных работах, в том числе в 1 монографии и 25 статьях в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований получено 4 Патента РФ.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 471 страницах машинописного текста и состоит из введения; обзора литературы; собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований; обсуждения результатов; выводов; практических предложений; списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 66 таблицами и 30 рисунками. Список литературы включает 411 источников, из которых 302 отечественных и 109 зарубежных авторов. В приложении представлены таблицы расчетов коэффициентов уравнений, копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.9. Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач исследований, методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов, разработке нормативной документации. Автор принимал личное участие в изготовлении и контроле опытных серий препаратов, в подготовке научных публикаций и разработке нормативных и методических документов.

1.10 Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ВНИТИБП, академику РАСХН, академику НААН Украины А.Я. Самуй-ленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники института Е.Э. Школьников, В.И. Еремец, A.A. Раевский, Т.А. Скотникова, Л.Б. Соловьев, Л.В. Анисимова, Л.А. Коротеева, Н.Д. Скичко, A.A. Нежута, Л.А. Неминущая, Е.П. Сапегина, а также И.И. Чеботарев ООО «Биореактор», сотрудники ВНИТИП: И.А. Егоров, E.H. Андрианова, И.П. Салеева и сотрудник «Института экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» (Беларусь, г. Минск) П.А. Красочко - за что выражаю им сердечную благодарность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в отделе противобактерийных препаратов и отделе технологии сушки биопрепаратов ГНУ «ВНИТИБП» РАСХН, согласно планам НИР и ОКР института. Опытно - промышленные серии препаратов, изготовленные на Ставропольской и Сумской биофабриках, испытывали в животноводческих хозяйствах Ставропольского края, Ульяновской, Костромской областей и в Белоруссии.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.1. Объекты исследований. При исследовании и разработке технологических процессов промышленного производства сухих живых вакцин против листерио-за, сальмонеллеза использовали производственные штаммы L.monocytogenes: АУФ. УСХИ-19 и УСХИ-52, Sxholeruesuis штаммы ТС - 177 и 370, S.dublin 160 и S.typhimurium № 415, для производства симбиотического препарата - штамм Е. coli VL-613.

Культивирование листерий, сальмонелл и эшерихий проводили на ПС, основой которых являлись ФГМС, перевар Хоттингера и Аминопептид.

2.1.2. Технологическое оборудование. Культуру листерий. сальмонелл или эшерихий выращивали в пробирках и флаконах на шуттель-аппарате, а также в ферментере АНКУМ-2М емкостью 3 и 10 дм'4, который оснащен системами автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования (температура, pH, рО?, еН, расход воздуха на аэрацию, скорость вращения мешалки и оптическая плотность бактериальной суспензии).

С целью пеногашения при интенсивном росте в ферментере листерий, сальмонелл и эшерихий применяли пеногаситель пропинол Б - 400.

Содержание pH в культуральной жидкости определяли потенциометрически, уровень растворенного кислорода р02 - датчиками изготовленными в СКБ БП (г. Пу-щино), еН - потенциометрически с использованием электродов с ионной проводимостью типа ЭО - 01.

Оптическую плотность культуры листерий и E.coli измеряли на фотоколориметрах ФЭК - 56, ФЭК - 60, КФК - 2 и блоке оптической плотности аппарата АНКУМ - 2М.

Концентрирование бакмассы листерий, сальмонелл и E.coli осуществляли с помощью лабораторных центрифуг К-70Д, S-60 и установки «Сартокон-мини» («Влади-сарт», г. Владимир).

Замораживание готовых препаратов проводили в холодильных установках ЛСШ-28, с последующим высушиванием в сублиматоре ТГ-50.5.

Для характеристики химического состава симбиотика и зерноотходов определяли: массовую долю сухих веществ (по ГОСТ 28561-90); массовую долю золы (по ГОСТ 12572-67); массовую долю жира (по ГОСТ 13496.15-97); общий белок (по ГОСТ 26889-86); общее содержание углеводов (по ГОСТ 26176-91); макро- и микроэлементы методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии (на приборе AAS-IN); органические кислоты методом газо-жидкости ой хроматографии (на хроматографе Хьюлетг - Паккард, колонка -полисорб); витамины (флюорометрическим методом по ГОСТ 29138-91, 19139-91, 29140-91); состав и содержание аминокислот (на аминокислотном анализаторе Биотроник LC-7000).

2.1.3. Методы доклиническнх испытаний. Морфологию бактериальных культур определяли путем микроскопирования мазков, окрашенных по Граму. Культу-ральные свойства - путем высева их на МПА и МПБ. Жизнеспособность определяли методом последовательного десятичного титрования на чашках Петри с мясопептон-ным агаром. Длительность фаз роста, максимальной удельной скорости, минимального времени удвоения культур определяли графическим методом.

2.1.4. Клинические испытания. Образцы сухой живой вакцины против листе-риоза или сальмонеллеза испытывали на безвредность и иммуногенность на морских свинках и кроликах. Вакцина не должна вызывать гибель животных в течение 10 сут. наблюдения. Образцы симбиотического препарата испытывали на безвредность на белых мышах и цыплятах. Препарат считается безвредным, если цыплята опытной и контрольной групп остаются живыми и здоровыми в течение 10 сут.

2.1.5. Статистическая обработка результатов. Для оптимизации технологических этапов производства препаратов, приготовления питательных сред для глубинного культивирования и приготовления защитных сред высушивания, использовали методы математического планирования: метод Гаусса - Зайделя, дробный или полный факторный эксперимент (ДФЭ или ПФЭ) типа 2" и метод «крутого» восхождения, где п - число факторов. Для оптимизации технологического этапа культивирования использовали разработанную математическую модель «управляемых процессов культивирования микроорганизмов при производстве бактериальных препаратов» (А.А. Раевский 2002г.) и метод математического планирования Гаусса - Зайделя. Расчеты и построение технологических графиков осуществляли с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем -с помощью программы Microsoft Office VISIO 2010.

Обработку результатов зоотехнических экспериментов (с числом повторов >3) проводили статистическим методом анализа и обработки данных - методом определения грубых ошибок («промахов»), а для определения эффективных доз симбиотика в бройлерном птицеводстве и свиноводстве использовали метол математического планирования эксперимента Гаусса - Зайделя.

2.1.6. Оценка эффективности. Критериями оценки эффективности применения симбиотнков для цыплят-бройлеров (кроссов «Смена», «Кобб - 500» и «Авиан-48») служат зоотехнические показатели: живая масса; среднесуточный прирост живой массы; сохранность поголовья за период выращивания; потребление корма при выращивании. Затраты корма на 1 кг прироста живой массы рассчитывали по данным учета расхода корма и живой массы. По формуле рассчитывали индекс продуктивности ЕИП (европейский индекс продуктивности):

ЕИП = (AxB/CxD)x 100,

где: А - живая масса, кг;

В - сохранность, %;

С - срок выращивания, сутки;

D - затраты корма на 1 кг привеса, кг.

Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы представлена на рисунке 1.

Этапы разработки

Исследования

Форма завершения

Научная гипотеза н поисковые исследовании

Анализ традиционных технологий промышленного производства сухих живых бактерийных препаратов

Разработка алгоритма усовершенствования промышленных технологии производства сухих живых бактерийных препаратов

■щрищ

Объект ы исследования

Энтеробактер и и

Сальмонеллы Зшернхпи

Доклинические испытания

Клинические испытания

Разработка или усовершенствование ■ ехнологических этапов производства сухих

живых бактериальных препаратов с использованием разработанпо! о а.и ори i ма

II31 отовлеиие опыI но-промышлеппых серII й препарат

Испытании ирепаразов к хозяйствах

Разработка и утверждение ИД

Уеонсршенсншваниам lexno.ioi им примышленною нрои iBo.ici на сухих живых пактерпа.н.ны\ мрепараiов

,\К1 ы пены I aiuiii

Лкчы, справки о внедрение lexno.ioi ни в промышленное

И poll IIIII.1CIBO

Рис.1. Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной

работы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка алгоритма усовершенствования промышленной технологии получения сухих живых бактериальных препаратов

Для производства бактерийных препаратов необходимы культура микроорганизмов, питательная среда, аппаратура для выращивания и концентрирования, сушка микроорганизмов и проведение вспомогательных операций, средств контроля и управления. Для объединения их в биотехнологическую систему, способную эффективно функционировать, нужен алгоритм производства бактериальных препаратов. Технологические процессы, базирующиеся на микробном синтезе, можно представить в виде определенной последовательности стадий, причем большинство из них общие для любого микробиологического производства.

В настоящее время значительно расширился объем научно-исследовательских, опытно-конструкторских и проектных работ по разработке новых микробиологических процессов с применением высокопродуктивных штаммов продуцентов и технологического оборудования нового поколения, по поиску наиболее рациональных режимов технологических этапов производств. Интенсификация промышленной технологии производства биопрепаратов - многоаспектная проблема, ключевым направлением которой на современном этапе наряду со снижением материале - и энергоемкости технологии, с использованием современного оборудования и другими приемами является разработка новых или совершенствование традиционных технологий с переходом на современное оборудование с использованием управляемых процессов биосинтеза при применении компьютерных программ средств измерения, контроля и регулирования технологических параметров и потоков веществ.

Решение поставленных задач по разработке и совершенствованию технологий промышленного производства бактерийных препаратов требует использования математических методов планирования эксперимента при оптимизации технологических процессов. Использование математических моделей при разработке промышленных технологий ведет к сокращению числа дорогостоящих опытов и ускоряет создание оптимальных по составу компонентов питательных и защитных сред высушивания, а также обеспечению оптимизации технологических этапов производства и достижению максимально возможного результата в промышленном аппарате на основе данных, полученных на пилотной установке, что сокращает затраты и уменьшает себестоимость готовой продукции.

Современный подход к разработке и усовершенствованию промышленной технологии получения сухих живых бактериальных препаратов заключается в оптимизации параметров критических этапов производства требует применения математических методов планирования эксперимента в качестве инструмента для создания полного цикла технологии, определения соответствия традиционных технологий требованиям ОМР, предъявляемым к ТТХ производств и оборудованию.

Для создания эффективной промышленной технологии был разработан алгоритм усовершенствования промышленной технологии получения сухих живых бактериальных препаратов, который представлен на рисунке 2.

На рисунке 3 представлена методология оптимизации биотехнологических процессов для сухих живых бактериальных препаратов (на примере ПС и ЗС).

Сушсствуюшаи иромышленнаи гехноло!нн нронзводова сухих бактериальных нрсиараюв

Неудовлетворительные микробиологические показатели Не соответствие ТТХ тсхноло1ий и оборудовании современным требованним производства

Разработка проекта ТТХ производства сухих бактериальных препаратов

Разработка технологической схемы производства сухих бактериальных препаратов

Разработка аннаратурно-тсхнологической схемы произволе!ва сухих бактериальных _препаратов_

НС

Разработка или усовершенствование гехноло! ическнх этапов произволе 1вп сухих живых __бактериальных препаратов_

Пнзательнаи среда для культивировании

Он I н ми шрованнаи нн I а и*.п.нам среди

Режим культивировании микроорганизмов

Он I ими шроваинмн режим к>.п.Iнвиронанни мнкромр! <11111IIIон

Процесс концензрировании микроорганизмов

Он I ими шрониннын

процесс конценIрированнм мнкроор! ИНН шов

—I

Зашитые среды высушивании

Он i ими шровиннме

ПИЦЦ I lll.ll' cpc.ll>!

выс\ шнванни

Режим сублимационно!о высушнвинин

Он I ими шровиннын режим с)б.1нмашнонно1 о ныс\ шиванин

N соисршсис I но нам паи I емю.ин пи промыт.юшки о ирои шок* I на с> \и\ ж иных бак I ерна.и.111.1 \ прснара I он

Разработка НД на оныгно - промышленное производство

Апробации технологии на бнонреднриитинх

ИеныIанис препаратов в хозяйствах 1 ==

Разработка и утверждение НД

чЬ

I сх пологи я промышленного производства сухих живых бактериальных

препаратов

Рис. 2. Алгоритм усовершенствования промышленной технологии получения сухих живых бактериальных препаратов.

Рис. 3. Методология оптимизации биотехнологических процессов для сухих живых бактериальных препаратов.

3.2. Разработка технологической схемы получения сухих вакцин против листериоза, сальмонеллеза н симбиотического препарата

Одной из задач разработки технологии промышленного производства является возможность выпуска различных биопрепаратов на одной технологической линии.

Промышленное производство сухих вакцин против листериоза, сальмонеллеза и симбиотического препарата состоит из следующих стадий: очистка и стерилизация воздуха и других газов; водоподготовка; приготовление питательных и защитных сред; приготовление посевного материала; культивирование микроорганизмов; концентрирование; ресуспендирование; фасовка (розлив) препарата; глубокое замораживание; сублимационное высушивание препарата; укупорка и закатка флаконов с препаратом; этикетирование; контроль на стадиях производства и готового препарата; упаковка готовой продукции; хранение препарата.

На рисунке 4 представлена унифицированная технологическая схема производства сухих живых вакцин против листериоза, сальмонеллеза или симбиотического

Рис. 4. Унифицированная технологическая схема производства сухих живых вакцин против листериоза, сальмонеллеза или симбиотического препарата.

3.3. Разработка унифицированной аппаратурно-технологичсской схемы получения сухих вакцин против листериоза, сальмонеллеза и симбиотического

препарата

На рисунке 5 представлена унифицированная аппаратурно-технологическая схема производства сухих вакцин против листериоза, сальмонеллеза или симбиотического препарата.

сухих вакцин против листериоза, сальмонеллеза или симбиотического препарата. 1-рсактор-гидролизатор; 2-рсактор для хранения осветленного гидролизата; 3-реактор для приготовления питательной среды; 4-мсмбранный фильтр; 5-рсактор для стерилизации питательной среды; 6-биорсактор (ферментер) для культивирования; 7-ультрацснтрифуга; 8-установка для ультрафнльтрации; 9-ампула с лиофильно высушенным штаммом; 10-штамм выращенный на скошенном агаре; 11-штамм выращенный в жидкой питательной среде; 12-штамм засеянный во флаконы 450мл; 13-вырашнванис штамма во флаконах 450 мл на шутгель-аппаратс в тсрмостатирусммом помещении; 14-лабораторный ферментер для инокулята; 15-смкость для смешивания биомассы с защитной средой высушивания; 16-емкость для приготовления защитной среды высушивания; 17-устаиовка для фасовки и предварительной укупорки флаконов; 18-низкотсмпсратурный холодильник; 19-сублимационная установка; 20-полуавтоматическая линия укупорки, закатки флаконов, тгикстировки; 21-упаковочная линия в коробки и этикстнровки коробок: 22-упаковочная линия в гофротару.

При разработке унифицированной аппаратурно-технологической схемы производств учтены следующие технико-технологические варианты: 1) готовит предприятие основы питательных сред само (оборудование 1 и 2); 2) закупает перевар Хот-тингера (тогда исключается оборудование I и 2); 3) использует лабораторный ферментер (14) для приготовления инокулята или засевает из флаконов после выращивания на шуттель-аппарате; 4) использует для концентрирования центрифугу (7) или установку для ультрафильтрации (8) типа «Владисарт», получая в комплексе с ферментером мембранный биореактор); 5) использует сублимационное оборудование с низкотемпературным холодильником (18) или новые сублимационные установки с встроенным низкотемпературным холодильником.

3.4. Усовершенствование технологии производства сухих вакцин против листериоза сельскохозяйственных животных из штамма «АУФ» и бивалентной вакцины из штаммов «УСХИ-19» и «УСХИ-52»

Усовершенствование технологии производства вакцин против листериоза производили согласно разработанного алгоритма по следующим этапам, которые критические для качества продукции:

- оптимизация состава жидкой питательной среды;

- оптимизация управляемого процесса глубинного культивирования листерий;

- оптимизация защитной среды высушивания;

- клинические испытания вакцины, изготовленной по разработанной технологии, в животноводческих хозяйствах.

3.4.1. Оптимизация питательной среды для выращивания листерий

В соответствии с «Инструкцией по изготовлению и контролю вакцины сухой живой против листериоза сельскохозяйственных животных» (1988) в условиях производства используют ПС на основе перевара Хоттингера, гидролизата казеина или лак-тоальбумина. Помимо указанных основ в состав сред входят пептон (1,0-1,5%), дек-стран кислотного автолизата печени крупного рогатого скота (5-10%), натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий лимоннокислый трехзамещенный, магний сернокислый, аммоний сернокислый, железо лимоннокислое. Кроме того, перед засевом вакцинного штамма к средам добавляют смесь водорастворимых витаминов В> и В2.

Для оптимизации состава ПС использовали метод математического планирования эксперимента, в частности план ДФЭ 2'1"1.

Параметром оптимизации (У) служило накопление ж/с листерий в культурапь-ной жидкости. В качестве основных факторов по оптимизации ПС исследовали следующие компоненты: Х1 - концентрация пептона, Х2 - концентрация натрия фосфорнокислого двузамещенного и Х3 - концентрация дрожжевого экстракта.

В таблице 1 представлен план ДФЭ 23"1.

Для культивирования листерий использовали следующий состав ПС: перевар Хоттингера, пептон, натрий фосфорнокислый двузамещенный, дрожжевой экстракт (источник витаминов группы В), глюкоза и дистиллированная вода.

После реализации экспериментов по ДФЭ и статистической обработки данных получили уравнение (1), связывающее накопление жизнеспособных листерий в куль-туральной жидкости и концентрацию основных компонентов ПС, которое адекватно описывает экспериментальные данные (Ррас. = 3,27 < Ргоор = 5,90).

У = 0,68 + 0,7Х, + 0,1Х2 + 0,5Х,. (1)

Таблица 1

План ДФЭ в кодированной и натуральной размерностях

№ п/п Кодированная размерность факторов Натуральная размерность факторов Накопление листерий, У, млрд/см"1

X, х2 X, Концентрация пептона, % Концентрация натрия фосфорнокислого двузамещенного, % Концентрация дрожжевого экстракта, %

1 + + + 0,7 0,7 0,4 1,0

2 - - + 0,5 0,5 0,4 0,6

3 - + + 0,5 0,7 0,4 0,4

4 + - + 0,7 0,5 0,4 0,7

Х(к 0,6 0,6 0,3

ДХ: 0,1 0,1 0,1

На основании уравнения (1) с вероятностью ц = 0,9 можно сделать вывод, что в указанных интервалах варьирования факторов, накопление листерий повышается как при увеличении концентрации пептона, так и при повышении концентраций натрия фосфорнокислого двузамещенного и дрожжевого экстракта, потому что Х|, Х2 и Хз в уравнении (1) имеют положительные коэффициенты.

Для дальнейшего поиска оптимального состава ПС использовали метод «крутого» восхождения.

По результатам опытов крутого восхождения движение по градиенту эффективно, так как достигнутое накопление ж/с листерий 1,4 млрд/см"1 больше накопления в опыте лучшего результата в матрице ДФЭ (1,0 млрд/см3).

По результатам ДФЭ и метода «крутого восхождения» принято решение об окончании процесса поиска оптимальных концентраций компонентов питательной среды.

Разработанная ПС для культивирования листерий на основе перевара Хоттин-гера, имеет следующий состав, мас,%: перевар Хоттингера - 20,0; пептон - 1,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,8; дрожжевой экстракт - 0,5; глюкоза - 0,24; вода дистиллированная до 100; содержит 170 мг % аминного азота и имеет рН 7,4 - 7,6.

Во всех образцах листерий (штаммов «АУФ», «УСХИ-19» и «УСХИ-52»), полученных на оптимизированной ПС, морфология, культуральные и биохимические свойства были типичными для штаммов, выращенных как во флаконах, так и ферментерах - лабораторных и промышленных.

3.4.2. Оптимизация управляемого процесса культивирования листерий

Задача разработки управляемого процесса культивирования листерий заключалась в следующем: подбор оптимальных условий культивирования, с использованием метода математического планирования Гаусса - Зайделя, обеспечивающего достиже-

ние максимально возможного результата в промышленном аппарате на основе данных, полученных на пилотной установке.

На первом этапе разработки провели анализ традиционного способа культивирования бактерий, заложенного в инструкцию по изготовлению этого препарата.

Культивирование листерий по традиционному способу выращивания в питательной среде на основе перевара Хоттингера согласно инструкции осуществляли в лабораторной установке АНКУМ - 2М при температуре 36,0 - 37,0 °С, рН среды 7,4 -7,5 ед. рН, без перемешивания и аэрации в течение двух часов после засева. Засевная доза 16-18-ти часовой культуры листерий составляла 8-10% к объёму питательной среды. Перед внесением культуры листерий в питательную среду добавляли в неё 0,2% глюкозы в пересчете на сухое вещество в виде 40% -го раствора. Культивирование проводили в течение 16-18 часов при постоянной аэрации и расходе воздуха 2 -3 об/об в минуту. Через 6-ть, 10-ть, 14-ть часов роста определяли рН, концентрацию бактерий в культурапьной жидкости и добавляли 0,2 % глюкозы.

Динамика основных параметров (р02, рН, еН, температура и концентрация листерий) при культивировании в лабораторной установке АНКУМ - 2М по традиционной технологии представлена на рисунке 6.

Рис. 6. Динамика основных параметров управляемого культивирования листерий в инструктивном режиме.

Как показали результаты экспериментов, продолжительность фазы приспособления составила 3,9 часа; лог-фазы - 2,3 часа. Максимальная удельная скорость роста популяции листерий составила 1,24 час'1, а время удвоения - 0,56 часа. Продолжительность времени культивирования 16-18 часов, а накопление бактериальной массы - 5,5 млрд/см3.

Анализ традиционного процесса выращивания листерий позволил сделать заключение о необходимости разработки управляемого процесса периодического культивирования листерий по основным параметрам их роста.

Исходя из анализа традиционного процесса культивирования и литературных данных, определили факторы, влияющие на накопление ж/с листерий: рН, р02, еН и концентрация глюкозы в ПС.

После постановки экспериментов по определению оптимальных значений основных параметров выращивания листерий получили следующий алгоритм управляемого культивирования: в установку АНКУМ - 2М с ПС засевали 16-18 часовую культуру листерий, выращенную в жидкой среде того же состава. Засевная доза составляла 8 - 10 % к объёму питательной среды. Листерии культивировали при 36,5 -37,5 С в течение 8 часов. После засева еН снижали до минус 150 - минус 200 мВ путём выдерживания культуры без подачи воздуха на аэрацию и включения мешалки (от 0,5 до 1,5 часов), после чего до конца процесса культивирования с помощью изменения расхода воздуха и скорости вращения мешалки поддерживали р02 на уровне 10 - 20 % от насыщения кислородом воздуха. рН культуральной жидкости регулировали с помощью 10 % -го раствора NaOH. Дробную подачу глюкозы осуществляли дозами до концентрации 0,15 - 0,25% при лимитировании роста листерий глюкозой, характеризующимся резким повышением рСЬ при неизменном расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращении снижения рН культуральной жидкости.

Динамика основных параметров процесса управляемого культивирования листерий в экспериментальном режиме приведена на рисунке 7.

+ + I ♦ U I

рий в экспериментальном режиме.

Как показали результаты опытов, накопление ж/с листерий составило 11,0 млрд/см через 9 часов культивирования. При этом фаза приспособления продолжалась 0,7 часа, а лог-фаза - 4,1 часа. Максимальная удельная скорость роста популяции листерий составила - 0,89 час"1, а время удвоения - 0,78 часа.

Разработанный управляемый режим культивирования листерий позволил увеличить максимальное накопление бактерий с 5,5 млрд/см1 до 11,0 млрд/см3 и сократить время культивирования с 16 - 18 часов до 7 - 9 часов.

3.4.6. Оптимизация состава защитной среды высушивания, применяемой при изготовлении сухих вакцин против листериоэа животных

Эффективность защитной среды при высушивании бактерийных препаратов зависит не только от состава среды, но и от соотношения концентраций её компонентов.

Одной из задач исследований была разработка и оптимизация защитной среды высушивания с целью сохранения максимального количества живых микроорганизмов после сублимационного высушивания в процессе хранения.

Параметром оптимизации «У|» выбрали концентрацию живых микроорганизмов при длительном хранении относительно концентрации листерий после сушки, принятой за 100 % микроорганизмов, где 1 - месяц хранения.

По литературным данным и результатам предварительных опытов выбрали следующие факторы защитной среды для сублимационной сушки листерий: Х| - концентрация желатина; Х2 - концентрация сахарозы; Х3 - концентрация декстрана; X» -вода или калий-фосфатный буфер (КФБ).

Для решения поставленной задачи использовали план ПФЭ типа 24.

В таблице 2 представлен ПФЭ в кодированной и натуральной размерностях.

Таблица 2

План ПФЭ 24 в кодированной и натуральной размерностях

№ опыта Кодированная размерность факторов Натуральная размерность факторов

X, Х2 Х3 X, Желатин, % Сахароза, % Декстран. % Вода или КФБ

1 - - - - 0,5 5 0 Вода

2 - + - - 0,5 10 0 Вода

3 + - - - 1,5 5 0 Вода

4 + + - - 1,5 10 0 Вода

5 - - + - 0,5 5 3 Вода

6 - + + - 0,5 10 3 Вода

7 + - + - 1.5 5 3 Вода

8 + + + - 1,5 10 3 Вода

9 - - - + 0,5 5 0 КФБ

10 - + - + 0,5 10 0 КФБ

11 + - - + 1,5 5 0 КФБ

12 + + - + 1,5 10 0 КФБ

13 - - + + 0.5 5 3 КФБ

14 - + + + 0,5 10 3 КФБ

15 + - + + 1,5 5 3 КФБ

16 + + + + 1,5 10 3 КФБ

Хщ 1,0 7,5 1,5 КФБ

ДХ| 0,5 2,5 1.5 Вода/КФБ

В таблице 3 представлены данные по сохраняемости ж/с листерий на разных ЗС по плану ДФЭ 2 в процессе длительного хранения - с 1 по 10 месяц хранения.

Таблица 3

Сохраняемость ж/с листерий на различных ЗС согласно плану ПФЭ 24 с 1 по 10

месяц хранения.

№ опыта Концентрация ж/с листерий после сушки, млрд/см' Концентрация ж/с листерий в сухой вакцине по срокам хранения, млрд/см'' / %.

Уср„ млрд/ см3 Уср2. млрд/ см3 Уср,, ( млрд/ СМ" Усрю, млрд/ СМ'

1 9,35 7,50/80,21 7,00/74,87 6,17/65,95 8,50/90,91

2 14,47 8,17/56,44 7,00 /48,38 10,20/70,49 2,90 / 20,04

3 16,03 12,33/76,94 15,50/96,69 15,67/97,73 13,53/84,43

4 16,38 8,67/52,91 9.80/59,83 8,75 / 53,42 9,72 / 59,32

5 9,22 8,83 /95,81 7,03 / 76,28 8,83/95,81 7,15/77,55

6 11,65 6,83/58,66 8,17/70,10 6,07 / 52,07 7,55/64,81

7 8,86 8,67 / 99,85 8,67 / 99,85 8,57 / 98,69 8,03 / 92,55

8 13,43 13,17/98,04 8,00/59,57 11,67/86,67 7,97 / 59,32

9 9,37 5,17/55,14 6,17/65,81 7,50 / 80,04 4,82/51,41

10 19.48 13,0/66,74 16,60/85,22 14,50/74,44 16,72/85,81

11 18,87 16,67/88,32 18,00/95,39 16,67/88,34 17,22/91,24

12 15,07 14,50/96,22 11,90/78,96 10,50/69,67 6,07 / 40,26

13 12,18 9,00 / 73,89 12,00/98,52 10,0/82,10 12,17/99,89

14 14,22 12,33/86,73 14,17/99,62 13,17/92,59 12,12/85,21

15 12.78 12,83 /100,43 12,75/99,77 12.80/ 100,16 12.83/100,42

16 9,18 9,17/99,85 7,80 / 84,97 8,92/97,13 8,78 / 95,68

По результатам экспериментов, представленным в таблице 3, получили уравнения регрессий, которые описывают зависимость выживаемости листерий в вакцине от концентраций компонентов защитной среды после 1, 2, 3 и 10 месяцев хранения.

После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработки данных получили уравнение регрессии (2-5), по которому рассчитывается количество жизнеспособных листерий в вакцине через 1, 2, 3 и 10 месяцев хранения, соответственно.

У 1=80,39+8,68Х]-3,44Х2+8,77Хз+3,03Х4+4,11X1X4+7,41X2X4-3,26X1X2X4-4,58X1X3X4 (2) У2=80,86+3,51X |-7,53Х2+5,22Хз+7,67Х4-6,01 Х|Х2-3,56Х|Хз+6,19X2X4. (3)

У з=81,59+4,9 IX, -7,01X2+6.58X3^+3.96X4+4,91X2X4+5,02Х,Х2Хз-5.08Х|Х2Х,Х4 (4)

У,»=74,93+2,97Х,-11,12X2+9,50X3+6.31X4-3,14Х,Х2+2,95Х2Х3+6,62Х2Х4+4,56ХзХ4--6.30Х,Х2Х4+2,50X1X3X4-3,30X2X3X4-10,10Х,Х2ХзХ4. (5)

На основании полученных данных с вероятностью q = 0,9 можно сделать вывод, что уравнение (2 - 5) адекватно описывает экспериментальные данные (Ррас =

1,33 «Р,,.,, »2,35).

При «крутом» восхождении улучшить результаты лучшего опыта по плану ПФЭ (табл. 2, табл. 3 № 15) по накоплению листерий не удалось. Процесс оптимизации защитной среды высушивания на этом закончен.

На рисунке 8 показана зависимость выживаемости листерий в процессе длительного хранения вакцины (срок наблюдения 10 месяцев).

время хранения, плес —контрольная защитная среда —В—разработанная защитная среда

Рис. 8. Выживаемость листерий в процессе длительного хранения вакцины, изготовленной с использованием разработанных питательной среды и управляемого культивирования.

Разработанная ЗС высушивания позволила увеличить сохраняемость ж/с микроорганизмов в вакцине при длительном хранении на 30 + 10% для разных штаммов листерий (АУФ, УСХИ-19, УСХИ-52), по сравнению с традиционной ЗС высушивания.

Наилучшей является среда № 15 таблицы 3 с концентрацией компонентов: желатин-1,5 %; сахароза -5,0%; декстран -3,0%: калий фосфатный буфер до -100%.

Усовершенствованная технология производства вакцины против листериоза работает, как при производстве живой вакцины штамма АУФ, так и для бивалентной вакцины из штаммов УСХИ-19 и УСХИ-52, что и показали испытания на Ставропольской биофабрике при выпуске опытно-промышленных серий вакцины.

Оптимизированная питательная среда и управляемый режим культивирования листерий положены в основу патента РФ № 2053790 от 10.02.96 г. «Способ изготовления вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных».

3.4.7. Клинические испытания сухих живых вакцин против листериоза

По усовершенствованной технологии производства сухой живой вакцины из штамма «АУФ» и бивалентной вакцины из штаммов «УСХИ-19» и «УСХИ-52» против листериоза сельскохозяйственных животных на Ставропольской биофабрике были изготовлены опытно-промышленные серии препарата, которые прошли успешные испытания в хозяйствах.

В хозяйствах Ставропольского края и Ульяновской области ранее неблагополучных по листериозу: ААП «Ярославское», АО «Псебай», ПКЗ «Ставропольское»,

ООО «Садовое», СПК колхоз им. Войтика, СПХ «Калиновское», СПК колхоз «Колос», ЗАО МТС «Александровское», колхоз «Ирек» была проведена вакцинация ов-цепоголовья в количестве 16034 голов вакциной против листериоза животных. Случаев заболевания овец листериозом иммунизированных вакциной и поствакцинальных осложнений не наблюдалось.

Промышленный выпуск вакцин против листериоза сельскохозяйственных животных на ФГУП Ставропольской биофабрике по усовершенствованной технологии за 2008 - 2012 гг. составил 4115624 дозы.

3.5.1. Усовершенствование промышленной технологии получения сухих вакцин против сальмонеллеза

Усовершенствование промышленной технологии производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза проводили на основе разработанного алгоритма, включающего следующие критические для качества продукции этапы:

- оптимизация состава жидкой питательной среды;

- оптимизация защитной среды высушивания;

- клинические испытания вакцины, изготовленной по разработанной технологии, в животноводческих хозяйствах.

3.5.2. Оптимизация питательной среды для глубинного управляемого процесса культивирования сальмонелл

с; и

™ • м

и 5 4

сГ

О.

=; ■ г

¥ ч

х о. _

с о ж

_—_,-„ Время, час

ФГМС И БХ аминопептид

Из литературных данных известны различные составы питательных сред для культивирования сальмонелл (на основе БХ, ФГМС или Аминопептиде).

Перед нами стояла задача оптимизировать питательную среду для выращивания сальмонелл с лучшими ростовыми качествами.

Предварительно работу по оптимизации питательной среды для выращивания сальмонелл проводили в пробирках и флаконах с перемешиванием на шуттель-аппарате. Результаты показали, что рост сальмонелл в питательной среде на основе перевара Хоттингера выше, чем на других средах (см. рис. 9).

Рис. 9. Рост сальмонелл на питательных средах с различной основой сред.

Дальнейшую работу по проверке питательной среды для выращивания сальмонелл на основе перевара Хоттингера осуществляли в ферментере АНКУМ - 2М.

В таблице 4 представлены данные по культивированию сальмонелл различных штаммов в питательной среде на основе перевара Хоттингера.

Таблица 4

Накопление жизнеспособных сальмонелл различных штаммов в питательной среде на основе перевара Хоттингера

№ п/п Время культивирования, ч Накопление сальмонелл, млрд/см'1

З.с1ю1егае81ш штамм ТС-177 З.сЬокгаевшв штамм 370 ЗлурЫтигшт 415 Я.аиЫт 160

1 0 0,25 0,08 0,02 0,15

2 2 0,5 0,25 0,06 0,8

3 4 1,6 1,55 1.1 1,3

4 6 2,7 2,75 2.0 1,4

5 8 3,5 4,77 2.4 1,6

6 10 3,8 4,8 2,9 1,7

7 12 5,2 4,9 4.6 1,7

Из результатов опытов (табл. 4) следует необходимость оптимизировать питательную среду на основе перевара Хоттингера для глубинного культивирования сальмонелл.

Для оптимизации состава питательной среды применяли метод математического планирования эксперимента, типа ПФЭ 23.

На начальном этапе оптимизации питательной среды для сальмонелл была выбрана инструктивная среда для промышленного культивирования сальмонелл на основе перевара Хоттингера.

Жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера, готовили по следующей прописи, масс.%: перевар Хоттингера - 20,0; пептон - 1,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,8; хлористый натрий - 0,8; вода дистиллированная - до 100.

Критерием оптимизации (У) служило накопление жизнеспособных сальмонелл штамма ТС-177 в культуральной жидкости, так как для изготовления вакцины используются живые клетки. В качестве основных факторов по оптимизации питательной среды исследовали следующие компоненты: Х| - концентрация пептона, Х2 -концентрация натрия фосфорнокислого двузамещенного и Хз - концентрация дрожжевого экстракта.

В таблице 5 представлен план ПФЭ 23 в кодированной и натуральной размерностях.

После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработки данных получили уравнение регрессии (6), связывающее накопление ж/с сальмонелл в культуральной жидкости и концентрацию основных компонентов питательной среды, которое адекватно описывает экспериментальные данные (Ррас = 3,73 < Ргсор = 4,10).

У=27,49+3,02Х|+2,81Х2+4,ЗЗХз+0,6Х1Х2+0,32Х1Хз+1,05Х2Х, (6)

Таблица 5

План ПФЭ в кодированной и натуральной размерностях

№ опыта Кодированная размерность факторов Натуральная размерность факторов Накопление сальмонелл (Ус), млрд/см3

X, Х2 Х3 Концентрация пептона. % Концентрация натрия фосфорнокислого двузамещенного, % Концентрация дрожжевого экстракта, %

1 - - 0.5 0,45 2.0 19,8

2 + - - 1,5 0,45 2,0 21,6

3 - + - 0,5 1,15 5.0 23,2

4 + + - 1.5 1,15 5.0 28,3

5 - - + 0,5 0,45 2.0 25.4

6 + - + 1.5 0.45 2,0 31.4

7 - + + 0,5 1.15 5.0 30,4

8 + + + 1,5 1,15 5,0 39,6

X»i 1,0 0,8 3,5

AXi 0,5 0,35 1.5

35 >' ЗО 25 20 15 Ю 5 О

На основании уравнения (6) с вероятностью я = 0,9 можно сделать вывод, что в указанных интервалах варьирования факторов, накопление сальмонелл повышается как при увеличении концентрации пептона, так и при повышении концентраций натрия фосфорнокислого двузамещенного и концентрация дрожжевого экстракта, потому что Хь Х2 и Хз в уравнении (6) имеют положительные коэффициенты.

Для дальнейшего поиска оптимального состава питательной среды использовали метод «крутого восхождения».

На рисунке Ю представлены данные зависимости накопления сальмонелл от состава компонентов питательной среды по плану ПФЭ и крутого восхождения.

О 1 2 3 4 5 6 7 3 9 Ю 11 12

номер питательной среды

Рис. 10. Зависимость накопления сальмонелл штамма ТС-177от состава компонентов питательной среды по плану ПФЭ и крутого восхождения.

По опытам 9-11 рисунка 10 видно, что дальнейшее движение по градиенту малоэффективно, так как достигнутое в опытах 9-11 накопление ж/с сальмонелл (39,6 - 40,3 млрд/см3) равно или незначительно больше накопления в опыте № 8 (39,6 млрд/см3) - лучшего в матрице планирования ПФЭ (таблица 5).

По результатам ПФЭ и крутого восхождения принято решение об окончании процесса поиска оптимальных концентраций основных компонентов питательной среды для культивирования сальмонелл.

Исследования питательной среды для культивирования сальмонелл по накоплению бактериальной массы и концентрации жизнеспособных клеток показали, что разработанная питательная среда имеет высокие ростовые свойства, накопление ж/с сальмонелл на разработанной питательной среде составило 32,6 - 39,6 млрд/см3 по сравнению с контрольной, в которой накопление сальмонелл - не более 5,2 млрд/см3.

На рисунке 11 представлены данные накопления ж/с сальмонелл разных видов в процессе управляемого культивирования на оптимизированной ПС.

Вре íwv», час

• S. cholcracíuRi шт. ТС-177 S.chDlcracsuls iajt. 370

—ri»—S. typhtmuriufn +15 Ш S.dublin Д60

Рис. 11. Данные накопления жизнеспособных сальмонелл разных видов в процессе управляемого культивирования на оптимизированной ПС.

Разработанная с помощью математических методов планирования эксперимента питательная среда для культивирования сальмонелл на основе перевара Хоттинге-ра, имеет следующий состав, мас,%: перевар Хоттингера - 18,0 - 22,0; пептон - 0,4 -0,6; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,3 - 0,6; хлористый натрий - 0,7 - 0,9; дрожжевого экстракта - 3,5 - 5,0; вода дистиллированная до 100,0, содержит 160-180 мг % аминного азота и имеет рН 7,6 - 7,8.

Оптимизированная ПС с управляемым режимом культивирования сальмонелл позволила уменьшить продолжительность фазы приспособления с 0,5 часа до 0,15 часа, увеличить продолжительность логарифмической фазы с 1,4 часа до 4,5 часов, увеличить максимальное накопление бактерий с 5,5 млрд/см3 до 20,0 - 40,0 млрд/см3 и сократить время культивирования с 12 часов до 6 - 8 часов.

Во всех исследованных образцах сальмонелл полученных на оптимизированной питательной среде, морфология, культуральные и биохимические свойства были типичными для этих культур, выращенных как во флаконах, так и ферментерах - лабораторных и промышленных.

Разработанный управляемый режим культивирования сальмонелл вошел в патент № 2129016 «Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных».

3.5.3. Оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовлении сухой живой вакцины против сальмонеллеза

Для решения задачи по оптимизации ЗС для сальмонелл использовали план полного факторного эксперимента (ПФЭ) типа 24.

Критерием оптимизации «У1» для нахождения оптимальной ЗС в процессе длительного хранения выбрали концентрацию живых микроорганизмов при длительном хранении относительно концентрации сальмонелл после сушки, принятой за 100 %, где I - месяц хранения. Критерий оптимизации выбрали в относительных единицах для того, чтобы результаты не зависели от начальной концентрации сальмонелл в препарате после сублимационной сушки.

По данным предварительных опытов выбраны следующие факторы защитной среды для сублимационной сушки сальмонелл: Х| - концентрация желатина; Хг - концентрация сахарозы; Х3 - концентрация тиомочевины; Х4 - вода или калий-фосфатный буфер (КФБ). В таблице 7 представлен план ПФЭ 24 в кодированной и натуральной размерностях.

Таблица 7

План ПФЭ в кодированной и натуральной размерностях

№ опыта Кодированная размерность факторов Натуральная размерность факторов

X, Хг х3 Х4 Желатин, % Сахароза, % Тиомочевина. % Вода или КФБ

1 - - - - 0,2 8,0 0,2 Вода

2 - + - - 0,2 12,0 0,2 Вода

3 + - - - 0,6 8.0 0.2 Вода

4 + + - - 0,6 12,0 0,2 Вода

5 - - + - 0,2 8.0 0,6 Вода

6 - + + - 0,4 12,0 0,6 Вода

7 + - + - 0,6 8,0 0,6 Вода

8 + + + - 0,6 12,0 0,6 Вода

9 - - - + 0.2 8,0 0,2 КФБ

10 - + - + 0,2 12,0 0,2 КФБ

11 + - - + 0,6 8,0 0,2 КФБ

12 + + - + 0.6 12,0 0,2 КФБ

13 - - + + 0.2 8,0 0.6 КФБ

14 - + + + 0.2 12.0 0,6 КФБ

15 + - + + 0,6 8,0 0.6 КФБ

16 + + + + 0,6 12,0 0.6 КФБ

Х<к 0,4 10,0 0,4 КФБ

ДХ| 0.2 2,0 0,2 Вода/КФБ

После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработки данных, получили уравнения регрессии (7), показывающие зависимость сохраняемости сальмонелл от концентрации основных компонентов защитной среды в процессе сушки.

У=66,87+7,16Х1+9,47Х2+7,69Хг4,07Х4+5,89Х1Хг5,37Х|Х4-2,81Х2Х.,-2101Х2Х4-3,66ХзХ4-5,07Х,Х2Х,44,24Х|Х2Х4-2,74Х,Х}Х4-5,86Х2Х3Х4 (7)

Уравнение (6) описывает сохраняемость ж/с сальмонелл в процессе сушки.

На основании полученных данных с вероятностью я = 0,9 можно сделать вывод, что уравнение (7) адекватно описывает экспериментальные данные (Ррас = 2,11 < Ртеор. = 2,18). Это значит, что в указанных интервалах варьирования выживаемость сальмонелл в процессе сушки зависит от концентрации основных компонентов ЗС: Х| - концентрация желатина; Х2 - концентрация сахарозы; Х3 - концентрация тиомочеви-ны; Х4 - дистиллированная вода.

В таблице 8 представлены экспериментальные данные по сохраняемости ж/с сальмонелл на разных ЗС по плану ПФЭ 24 в процессе сушки.

Таблица 8

Сохраняемость ж/с сальмонелл на различных ЗС с 1 по 12 месяц хранения.

№ п/п Уср., до сушки млрд/см3 Усро, млрд/см' ж/с сальмонелл по месяцам хранения

Усрь млрд/ см' Усрз, млрд/см3 Усрб, ^ млрд/см' Уср», млрд/см3 Уср12, млрд/см"

1 15,33 7,33 6,48 5,27 4,47 3,67 2,90

2 16,17 8,07 7,60 6,85 5,40 4,83 3,83

3 17,07 9,30 7,05 6,00 5,17 4,17 3,33

4 20,12 17,33 16,35 14,97 13,10 12,20 10,53

5 16,73 8,25 8,00 6,98 6,58 6,17 5,50

6 24,00 20,78 19,92 18,07 17,43 16,35 15,78

7 25,37 21,87 20,32 18,65 18,37 17,48 16,95

8 26,00 27,83 27,18 26,47 26,00 25,37 23,97

9 14,77 7,63 5,95 4,50 3,50 3,00 2,67

10 19,42 10,67 8,38 7,82 7,08 6,50 5,83

11 24,02 8,07 7,75 7,33 7,15 6,83 6,33

12 18,9 17,93 16,63 16,13 15,20 14,83 14,32

13 25,02 18,93 17,30 16,92 16,05 15,45 14,80

14 25,53 15,77 15,13 14,23 13,63 12,33 11,48

15 19,37 11,70 11,23 10,22 9,50 9,00 7,33

16 20,15 14,00 12,93 11,85 10,00 8,92 8,00

Выживаемость сальмонелл повышается как при увеличении концентрации желатина, сахарозы так и при увеличении концентрации тиомочивины, и при использовании в качестве растворителя воды вместо КФБ, так как Х|, Х1 и X, в уравнение (7) имеют положительные коэффициенты. При использование в качестве растворителя КФБ, вместо воды, выживаемость сальмонелл уменьшается, потому что X« в уравнении имеет знак « - ».

Анализируя полученные данные эксперимента по оптимизации состава защитной среды для процесса сушки сальмонелл можем считать лучший опыт плана ПФЭ 24 (№ 8, табл. 8).

Далее проводили эксперименты по оптимизации ЗС в процессе длительного хранения согласно плану ПФЭ 24 (таблицы 7).

Количество ж/с сальмонелл в процессе длительного хранения определяли через 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения и рассчитывали уравнения регрессии для каждого месяца хранения соответственно.

После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработки данных, получили уравнения регрессии (8 - 12), показывающие зависимость сохраняемости сальмонелл от концентрации основных компонентов защитной среды после I, 3, 6, 9, 12 месяцев хранения, соответственно.

У 1=91,08+ 1,16Х,+ 1,64Х2 + 3,81Х3-0,94X4 + 0,42Х,Х2- 1,31Х,Х3+З.ОХ.Х, -1,06Х:Х,-1,85Х2Х.(-0,7Х|ХзХ,-1,92Х,Х2Х4-2,59Х,ХзХ4+1,51Х2Х3Х4 (8)

У,=82,77+2,74Х|+3,66Х2+5,18Х3^,43Х,Х3 X, (9)

У6=75,6 + 3.72Х, + 3,01Х. + 7,62Х3 - 4,ЗЗХ,Х3 - 2,ЗЗХ2Хз - 1,94Х2Х, - 2,74X3X4-3,45Х|Х2Х4-5,63Х1ХзХ4 (10)

У9=69,86 + 4.43Х, + 3,35Х2 + 8,26Х, - 4,63Х,Х3 - 3,54Х2Х3 - 2,97Х2Х, - 4,16X3X4-3,52Х1Х2Х4-6,17Х,Х,Х| (И)

У12=63,04+4,26Х|+3,81Х2+9,09X3+1,8X4-5,53Х|Хз-2,94Х2Х3-2,54X1X4-6,23X3X4-глвХ^Л-б^бХ^зХ, (12)

Уравнения регрессии (8 - 12) описывают сохраняемость сальмонелл в процессе длительного хранения через 1, 3, 6, 9,12 месяцев, соответственно.

На основании полученных данных с вероятностью q = 0,9 можно сделать вывод, что уравнения (8 - 12) адекватно описывают экспериментальные данные (Рр„с. = 2,09; 1,89; 1,53; 1,37; 1,68 < ^р. = 2,15).

В уравнениях (8 - 12) наряду с линейными значимыми являются эффекты межфакторного взаимодействия. Это означает, что опыты ПФЭ были поставлены в области факторного пространства с высокой кривизной поверхности отклика, т. е. вблизи оптимума.

Окончанием эксперимента по оптимизации состава защитной среды можем считать лучший опыт плана ПФЭ 24 (№ 8, таблицы 7).

Наилучшей защитной средой высушивания является среда (№ 8), в которой концентрация основных компонентов имеет следующие значения: желатин - 0,6 %; сахароза - 12,0 %; тиомочевина - 0,6 %. В качестве растворителя - дистиллированная вода.

Оптимизированная защитная среда высушивания позволила увеличить сохраняемость ж/с сальмонелл в вакцине в процессе длительного хранения на 45 + 10%, для разных штаммов сальмонелл, по сравнению с использованием традиционной защитной среды высушивания.

Разработанный управляемый режим культивирования и защитная среда высушивания сальмонелл вошли в патент РФ № 2129016 от 01.10.96 г. «Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных».

3.5.4. Клинические испытания сухих вакцин против сальмонеллеза

Сухую живую вакцину против паратифа свиней из штамма ТС-177 применяют с профилактической целью в неблагополучных по сальмонеллезу свиней хозяйствах, в которых бактериологически установлен возбудитель 8. с1ю1егае51ш или 8. [урЫвшв. Прививке подлежат все клинически здоровые животные с 2-недельного возраста. Вакцинацию проводят двукратно с интервалом в Ю- 15 суток подкожно. Иммунитет после вакцинации наступает через 10-14 суток и сохраняется в течение 6-8 мес.

во

По разработанной технологии производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных на Ставропольской и Сумской биофабриках были изготовлены промышленные серии препарата.

В хозяйствах Костромской области, ранее неблагополучных по сальмонеллезу, была комиссионно проведена вакцинация поросят вакциной против сальмонеллеза (паратифа) поросят. Случаев заболевания поросят, иммунизированных данной вакциной и поствакцинальных осложнений, не наблюдалось в течение 6 месяцев.

Промышленный выпуск вакцин против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных на ФГУП Ставропольской биофабрике по усовершенствованной технологии за 2008 - 2012 гг. составил - 15848360 доз и на ФГУП Щелковский биокомбинат -5 млн. 440 тыс. доз.

3.6. Усовершенствование технологии производства симбиотического препарата на основе Е. coli

Усовершенствование технологии производства симбиотического препарата на основе Е. coli проводили на основе разработанного алгоритма по критическим для качества продукции этапам:

- оптимизация состава жидкой питательной среды;

- концентрирование бактериальной массы E.coli;

- оптимизация защитной среды высушивания;

- определение оптимальных доз и клинические испытания симбиотика для применения в бройлерном птицеводстве и свиноводстве;

- определение экономического эффекта применения симбиотического препарата на основе E.coli при выращивании цыплят - бройлеров и свиней.

3.6.1. Оптимизация питательной среды для глубинного управляемого процесса культивирования Е. coli

На начальном этапе разработки питательной среды для глубинного управляемого культивирования Е. coli была выбрана среда для выращивания сальмонелл разработанная ГНУ «ВНИТИБП» РАСХН, патент РФ № 2129016 «Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных».

Питательную среду готовили по прописи, масс. %: перевар Хоттингера - 18,0 -22,0; пептон - 0,4 - 0,6; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,3 - 0,6; хлористый натрий - 0,7 - 0,9; вода дистиллированная до 100,0.

Стерильная ПС содержит 160 - 180 мг% аминного азота, pH 7,4 - 7,6 ед. pH.

При проведении культивирования в ферментере на данной ПС было небольшое накопление E.coli., поэтому было принято решение об оптимизации данной ПС.

Предварительно работу по оптимизации ПС для выращивания Е. coli проводили во флаконах с перемешиванием на шуттель-аппарате со скоростью 120 об/мин.

При проведение опыта во флаконах на контрольной ПС взятой за основу, как математическая модель, накопление эшерихий составило 1,8 - 2,2 млрд. м.к. / см1.

Для оптимизации состава ПС использовали ПФЭ 2'\

Критерием оптимизации (У) служило накопление ж/с эшерихий в культураль-ной жидкости, так как для изготовления симбиотического препарата используются живые клетки. В качестве основных факторов по оптимизации ПС исследовали следующие компоненты: Х| - концентрация пептона, Х2 - концентрация натрия фосфорнокислого двузамещенного и X, - концентрация дрожжевого экстракта.

В таблице 9 представлен план ПФЭ 23.

Таблица 9

План ПФЭ в кодированной и натуральной размерностях

№ опыта Кодированная размерность факторов Натуральная размерность факторов Накопление эшерихий (Уср). 3 млрд/см

X, Х2 Х3 Концентрация пептона, % Концентрация натрия фосфорнокислого двузамещен-ного, % Концентрация дрожжевого экстракта, %

1 - - - 0,4 0,5 0,2 1,82

2 + - - 0,8 0,5 0,2 2,33

3 - + - 0,4 0,7 0,2 2,17

4 + + - 0,8 0,7 0,2 2,37

5 - - + 0,4 0,5 0,4 2,42

6 + - + 0,8 0,5 0,4 2,38

7 - + + 0,4 0,7 0,4 3,05

8 + + + 0,8 0,7 0,4 3,28

х,„ 0,6 0,6 0,3

ДХ! 0,2 0,1 0,1

В таблице 10 представлены экспериментальные данные по накоплению эшери-хий по плану ПФЭ 23.

После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработке данных получили уравнение регрессии (13), связывающее накопление жизнеспособных эшерихий в культуральной жидкости и концентрацию основных компонентов питательной среды, которое адекватно описывает экспериментальные данные (Ррас. = 2,25 <Ртсор.= 4,10).

У =2,477 + 0,240X1 + 0,115Х2 + 0,306ХЭ + 0,144Х,Х3 - 0,065Х2Х3 + 0,073 Х,Х2Х3. (13)

Таблица 10

Накопление эшерихий в различных питательных средах согласно ПФЭ 23

№ п/п Количество ж/с эшерихий, млрд./см'1

Накоплении (У) эшерихий в повторностях опытов Уср

1 2,40 1,90 2,10 1,70 1,20 1,60 1,82

2 2,90 2,60 2,80 1,70 2,10 1,90 2,33

3 3,10 2,40 2,50 1,70 1,80 1,50 2,17

4 3,30 2,30 1,90 2,10 2,40 2,20 2,37

5 2,90 3,40 2,70 1,70 2,20 1,60 2,42

6 3,40 3,60 2,20 1,60 1,70 1,80 2,38

7 3,20 3,10 3,50 2,60 3,00 2,90 3,05

8 2,90 3,90 3,40 4,20 2,60 2,70 3,28

2,5 2 1,5 1

0,5

На рисунке 12 представлены данные зависимости накопления Е. coli от состава компонентов питательной среды по плану ПФЭ и крутого восхождения. 4

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ю 11 12 13

номер питательной среды

Рис. 12. Зависимость накопления Е. coli от состава компонентов питательной среды по плану ПФЭ и крутого восхождения.

Результаты опытов 9-13 показали, что движение по градиенту эффективно, так как достигнутое в опытах 9-13 накопление ж/с E.coli VL-613 (3,34 - 3,39 млрд/см3) равно или больше накопления в опыте № 8 (3,28 млрд/см3) - лучшего в матрице планирования ПФЭ (табл. 10).

По результатам принято решение об окончании процесса поиска оптимальных концентраций основных компонентов ПС для культивирования Е. coli.

Исследования ПС для культивирования Е. coli по накоплению бактериальной массы и концентрации ж/с клеток показали, что разработанная ПС имеет высокие ростовые свойства, накопление ж/с эшерихий в разработанной питательной среде составило 3,34 - 3,39 млрд/см3 по сравнению с контрольной, у которой накопление - не более 1,8 - 2,2 млрд/см3.

Разработанная ПС для культивирования E.coli на основе перевара Хоттингера, имеет следующий состав, мас,%: перевар Хоттингера - 18,0 - 22,0; пептон - 0,8 - 1,2; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,7 - 0,9; хлористый натрий - 0,7 - 0,9; глюкоза - 0,15 - 0,25; дрожжевой экстракт - 0,4 - 0,6; вода дистиллированная до 100,0, содержит 160 - 180 мг % аминного азота и имеет pH 7,4 - 7,6.

Предварительно работу по оптимизации основных параметров культивирования эшерихий проводили во флаконах с перемешиванием на шуттель-аппарате и аппарате АНКУМ - 2М. Для определения оптимального значения значимых параметров культивирования (р02, pH, еН) провели эксперименты с использованием метода математического планирования Гаусса - Зайделя.

После оптимизации всех значимых параметров культивирования, алгоритм выращивания Е. coli следующий: в ферментер с ПС инокулируют 18-24-часовую мат-риксную культуру Е. coli, выращенную в ПС по составу, аналогичному со средой культивирования, в соотношении 5-10% от объема питательной среды в ферментере, и культивируют при 37±1 "С в течение 4-6 часов. После засева ферментера еН куль-туральной жидкости снижают до минус 100 - минус 80 мВ, путем выдержки культуры

без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до окончания процесса культивирования с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скоростью вращения мешалки поддерживают рСЬ в культуральной жидкости на уровне 20±5 % от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости регулируют на уровне 7,2-7,4 ед.рН подачей 10% -ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,1-0,2 % при лимитировании роста эше-рихий глюкозой, характеризующимся резким повышением рСЬ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения pH культуральной жидкости.

Динамика основных параметров управляемого культивирования Е. coli, штамма VL-613, на разработанной питательной среде приведена на рисунке 13.

Рис. 13. Динамика основных параметров управляемого культивирования Е. coli на разработанной питательной среде.

Как показали результаты опытов, накопление ж/с Е. coli штамма VL-613, составило 16,6 млрд/см1 через 4-6 часов культивирования. При этом фаза приспособления продолжалась 0,15 часа, а лог-фаза - 2,2 часа. Максимальная удельная скорость роста популяции Е. coli составила - 1,64 час"1, а время удвоения - 0,42 часа.

Во всех исследованных образцах Е. coli, полученных на оптимизированной ПС, морфология, культурапьные и биохимические свойства были типичными для этого штамма, выращенного как во флаконах, так и ферментерах.

3.6.2. Влияние сроков обработки культуры перед концентрированием на сохраняемость жизнеспособности Е. coli в процессе длительного хранения.

В технологии изготовления бактериальных препаратов одной из ключевых стадий технологического процесса является процесс концентрирования микроорганизмов, от которого зависит выход конечного продукта и его стабильность в процессе длительного хранения.

Актуальной задачей при производстве бактериальных препаратов является определение времени прохождения от окончания процесса культивирования до концен-

трирования бактерий без потери жизнеспособности эшерихий в процессе его хранения.

Для решения этой задачи были изготовлены опытные серии препаратов в трех повторностях. Для каждой повторности технология культивирования, концентрирования, сушки и защитная среда (сахарозо-желатиновая на КФБ) была одинаковая.

Серии препарата готовили по следующей схеме: 1 - бактериальную культуру сразу концентрировали;2 - бактериальную культуру концентрировали через один час после культивирования;3 - бактериальную культуру концентрировали через полтора часа после культивирования.

Критерием оценки эксперимента служило количество ж/с эшерихий в изготовленных препаратах «Пролизэр» при длительном хранении.

В таблице 11 представлены данные по сохраняемости ж/с эшерихий от времени начала концентрирования бактериальной культуры после культивирования.

Таблица 11

Зависимость жизнеспособности эшерихий в препарате от продолжительности хранении культуры перед центрифугированием.

№ п/п Культивирование Время после культивирования до концентрирования, ч. Концентрация ж/с эшерихий после сушки, млрд/см' Концентрация ж/с эшерихий в процессе хранения, млрд/см3

1 мес. 2 мес. 3 мес. 6 мес. 12 мес.

1 1 0 5,61 5,52 5,47 5,23 5,06 4,82

2 1 1,0 5,49 5,32 5.28 5,01 4,87 4,67

3 1 1,5 5,52 4,24 3,26 2,07 2,01 1,92

4 2 0 10,20 10,10 10,15 9,95 9,72 9,63

5 2 1,0 10,39 10,29 10,21 10,20 9,81 9,54

6 2 1,5 10,18 9,56 7,89 7,02 6,89 6,47

7 3 0 8,31 8,40 8,30 8,30 8,12 8,01

8 3 1.0 8,30 8,26 8,22 8,16 8,02 7,89

9 3 1,5 8,19 8,00 6,89 5,24 4,98 4,73

Исследования зависимости сохраняемости ж/с эшерихий в процессе хранения препаратов, изготовленных с разным временем подачи бактериальной культуры на центрифугирование показало, что если время превышает 1,5 часа, то у препаратов наблюдается снижение концентраций ж/с эшерихий в процессе длительного хранения в 1,6-2,9 раза (табл! 11).

3.6.3. Оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовлении симбиотического препарата

Из литературных данных известны различные ЗС для сохранения максимального количества живых бактерий рода Е. coli после сублимационного высушивания в процессе хранения.

Перед нами стояла задача разработать более доступную по составу и с лучшими защитными свойствами среду для длительного хранения препарата «Пролизэр» на основе штамма Б. coli.

На начальном этапе разработки ЗС для Е. coli были выбраны 7 различных сред:

1. Сыворотка крови КРС - 75%; мясная вода с 5% сахарозы - 25%.

2. Декстран (1% раствор) - 75%; мясная вода с 5% сахарозы - 25%.

3. Обезжиренное молоко (обрат) - 100%.

4. Обезжиренное молоко (обрат) с 7% сахарозы - 100%.

5. Обезжиренное молоко (обрат) - 50%; сыворотка крови КРС - 50%.

6. СЖС на КФБ, ее состав: сахароза - 8 - 12%; желатин - 0,4 - 0,6%; тиомоче-вина - 0,4 - 0,6%; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 - 0,6%; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,14 - 0,2% и вода до - 100%.

7. СЖС на КФБ ее состав: желатин - 1,5 %; сахароза - 5,0 %; декстран - 3,0%.

Для каждой ЗС были определены физико-химические показатели, как объектов

сушки, проводили сублимационное высушивание по их самым низким значениям, чтобы поставить все ПС в равные условия воздействия физических параметров сушки на выживаемость.

Результаты исследований были переведены в относительные единицы для того, чтобы достоверность выводов не зависела от начальной концентрации эшерихий после сублимационной сушки.

За относительную единицу была выбрана концентрация живых микроорганизмов при длительном хранении относительно концентрации эшерихий после сушки, принятой за 100 %, по месяцам хранения.

В таблице 12 представлены данные по жизнеспособности эшерихий на разных ЗС в процессе лиофильного высушивания и длительного хранения при температурах регламентированных СТО.

Таблица 12

Жизнеспособность эшерихий на разных ЗС в процессе лиофильного высушивания и длительного хранения.

Серия № Количество живых м.к. до сушки, млрд./см3 Количество живых м.к. после сушки, млрд./см3 / % Количество живых м.к. в процессе хранения, млрд./см3 / %

1,0 месяц 2,0 месяца 4 месяца

1 12,9 0,3 / 100 0,23 / 76,7 0,03/13,0 0/0

2 38,3 6,7/100 6,1/91,0 5,9/88,1 5,2/77,6

3 21,0 0,2/100 0,15/75,0 0,06 / 3,0 0/0

4 24,2 9,9/ 100 6,7 / 67,7 4,2/42,4 3,1/31,3

5 17,8 0,06/100 0,01 / 16,7 0/0 0/0

6 33,0 9,9/ 100 6,8 / 68,7 5,7/57,6 4,6 / 46,5

7 29,0 15,7 /100 10,9 / 69,4 10,2 / 65,0 9,5 / 60,5

Из таблицы 12 следует, что лучшими ЗС являются 2, 6 и 7, но так как у второй ЗС после сушки сохраняемость 17,5 % от количества ж/с эшерихий до сушки, а у 6 -30,0 и 7 - 54,1 соответственно, следует, что лучшей является ЗС № 7. дальнейшую работу по оптимизации ЗС для эшерихий вели со средой № 7.

Для решения задачи по оптимизации ЗС для эшерихий использовали план полного факторного эксперимента (ПФЭ) типа 24.

Критерием оптимизации «У,» для нахождения оптимальной ЗС в процессе сушки эшерихий была выбрана концентрация живых м/о после процесса сушки относительно концентрации эшерихий до процесса сушки, принятой за 100 %.

Критерием оптимизации «У;» для нахождения оптимальной ЗС в процессе длительного хранения выбрали концентрацию живых м/о при длительном хранении относительно концентрации эшерихий после сушки, принятой за 100 %, где 1 - месяц хранения.

Критерий оптимизации выбрали в относительных единицах для того, чтобы результаты не зависели от начальной концентрации эшерихий в препарате после сублимационной сушки.

По данным предварительных опытов выбраны следующие компоненты (факторы) защитной среды для сублимационной сушки эшерихий: Х| - концентрация желатина; Х2 - концентрация сахарозы; Х3 - концентрация декстрана; Х4 - вода или калий-фосфатный буфер (КФБ). В таблице 13 представлен план ПФЭ 2*.

Таблица 13

План ПФЭ в кодированной и натуральной размерностях

№ опыта Кодированная размерность факторов Натуральная размерность факторов

X, Х2 X, X, Желатин, % Сахароза, % Декстран, % Вода или КФБ

1 - - - - 1,0 5,0 0 Вода

2 - + - - 1,0 10,0 0 Вода

3 + - - - 2,0 5,0 0 Вода

4 + + - - 2.0 10,0 0 Вода

5 - - + - 1,0 5,0 3 Вода

6 - + + - 1,0 10,0 3 Вода

7 + - + - 2,0 5,0 3 Вода

8 + + + - 2,0 10,0 3 Вода

9 - - - + 1,0 5,0 0 КФБ

10 - + - + 1,0 10,0 0 КФБ

11 + - - + 2,0 5,0 0 КФБ

12 + + - + 2,0 10,0 0 КФБ

13 - - + + 1,0 5,0 3 КФБ

14 - + + + 1,0 10,0 3 КФБ

15 + - + + 2,0 5,0 3 КФБ

16 + + + + 2,0 10,0 3 КФБ

1,5 7.5 1,5 КФБ

дх, 0,5 2,5 1.5 Вода/КФБ

В таблице 14 представлены данные по сохраняемости ж/с эшерихий на разных ЗС по плану ПФЭ 24 в процессе сушки и с 1 по 12 месяц хранения.

После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработке данных получили уравнения регрессии (14), показывающие зависимость сохраняемости эшерихий от концентрации основных компонентов защитной среды в процессе сушки.

у=84,41+1,72Х, +1,91Х2-2,22Х3+1,24X4+1,58Х2Х4+2,46Х1Х2Х4-1,49Х1Х2Х1+ + 1,83X1X2X3X4 (14)

Таблица 14

Сохраняемость ж/с эшерихий в различных ЗС согласно плану ПФЭ 24 в процессе сушки и с 1 по 12 месяц хранения.

№ п/п Уср. до сушки млрд/смЛ Усро, ^ млрд/см' ж/с эшерихий по месяцам хранения

Уср|( млрд/ см3 Уср,, млрд/ см'1 Усрь, млрд/ см3 Уср9, млрд/ см3 УСР)2, млрд/ 3 см

1 10,33 8,50 7,50 7,00 5,67 5,17 4,83

2 9,33 7,50 6,17 5,50 5,00 4,83 4,83

3 9,83 9,00 7,33 6,50 6,17 6,00 5,83

4 8,00 7,00 6,00 5,50 5,45 5,33 5,17

5 8,33 6,00 4,00 3,00 2,50 2,33 2,00

6 7,67 6,67 6,00 4,83 4,50 4,00 3,83

7 9,17 7,83 7,00 6,17 6,17 6,00 5,83

8 10,33 8,17 7,17 5,83 5,33 5,17 5,00

9 9,17 7,67 5,17 4,33 4,00 3,83 3,17

10 7,83 7,17 5,33 3,83 3,33 3,00 2,83

П 9,67 8,00 6,67 6,17 6,00 5,83 5,50

12 12,83 12,00 11,50 10,83 10,50 10,00 9,33

13 9,00 7,50 6,83 6,00 5,17 4,83 4,83

14 6,75 5,50 3,83 3,33 3,17 2,83 2,67

15 10,33 8,17 6,67 6,50 5,67 5,67 5,50

16 10,17 9,17 8,17 7,83 7,50 7,42 7,33

Уравнения регрессии (14) описывают сохраняемость эшерихий в процессе сушки.

На основании полученных данных с вероятностью ц = 0,9 можно сделать вывод, что уравнения (14) адекватно описывают экспериментальные данные (Рр0С = 1,98 <Ртсор. = 2,18).

Выживаемость эшерихий повышается как при увеличении концентрации желатина, так и при увеличении концентрации сахарозы, и при использовании в качестве растворителя КФБ вместо воды, так как Х|, Х2 и Х4 в уравнение (14) имеют положительные коэффициенты. При увеличении концентрации декстрана выживаемость эшерихий уменьшается, потому что X] в уравнении имеет знак « - ».

Анализируя полученные данные эксперимента по оптимизации состава ЗС для процесса сушки эшерихий можем считать лучший опыт плана ПФЭ 24 (№ 12, таблицы 14). Дальше проводили эксперименты по оптимизации ЗС в процессе длительного хранения согласно плану ПФЭ 2 (таблицы 13). Количество ж/с эшерихий в процессе длительного хранения будем определять через 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения и рассчитывали уравнения регрессии для каждого месяца хранения соответственно.

После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработке данных получили уравнения регрессии (15 - 19), показывающие зависимость сохраняемости ж/с эшерихий от концентрации основных компонентов защитной среды после 1, 3, 6, 9, 12 месяцев хранения, соответственно.

Уравнения регрессий принимают вид:

У, =82,74+4,03X1+1.59X2+1,88X1X4+7,41X2X4+3.07X1X3X4-3.21X1X3X4+3,66X1X2X3X4 (15) Уз=77,03+2,13Х1+2,47Х2+4,06Хз+4,64Х4-4.43Х1Хз+8,29ХзХ4-4,17X1X2X3-8,5 IX1X3X4+ + 1,48X1X2X3X4 (16)

Уб=66,98+8,53Х,+1,85Х2+2,54Х,Х4+2.69ХзХ4-2,69Х,Х2Хз+4,49Х,Х2Х4-3,81Х,ХзХ4+ +3,39X1X2X3X4 (17)

У9=63,82+9,83Х|+1,36Х2+2,50Х|Х4+2,94ХзХ4-2,15Х1Х2Хз+4.48Х,Х2Х4-3,35Х1ХзХ4+ +2.89X1X2X3X4 (18)

У,2=60,87+10,14Х,+ 1,96Х2+2,37Х,Х4+4,МХ3Х4+4.71X1X2X4-3.68X1X3X4 +3,54X1X3X3X4 (19)

Уравнения регрессии (15 - 19) описывают сохраняемость ж/с эшерихий в процессе хранения через 1, 3, 6, 9,12 месяцев, соответственно. На основании полученных данных с вероятностью q = 0,9 можно сделать вывод, что уравнения (15 - 19) адекватно описывают экспериментальные данные (FpaC=l,58; 2,12; 1,21; 1,08; 2,04 < FTCOp = 2,15).

Это значит, что в указанных интервалах варьирования выживаемость эшерихий в процессе хранения зависит от концентрации основных компонентов ЗС в течение каждого месяца хранения: Х| - концентрация желатина; Х2 - концентрация сахарозы; Хз -концентрация декстрана; Х4 -КФБ. Причем, выживаемость эшерихий повышается при увеличении концентрации желатина, концентрации декстрана и сахарозы, и при использовании в качестве растворителя КФБ вместо воды, так как X), Х2, Хз и Х4 в уравнениях (15 - 19) имеют положительные коэффициенты.

В уравнениях (15 - 19) значимыми являются эффекты межфакторного взаимодействия. Это означает, что опыты ПФЭ были поставлены в области факторного пространства с высокой кривизной поверхности отклика, т. е. вблизи оптимума.

Окончанием эксперимента по оптимизации состава защитной среды можем считать лучший опыт плана ПФЭ 24 (№ 12, таблицы 13).

Наилучшей защитной средой высушивания является среда (№ 12), в которой концентрация основных компонентов имеет следующие значения: желатин - 2,0 %; сахароза - 10,0 %; декстран - 0 %. В качестве растворителя - калий фосфатный буфер.

Разработанная питательная среда и управляемый режим культивирования E.coli штамма VL-613 положены в основу патента RU № 2450051 от 18.08.2010 г. «Способ получения симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL - 613».

3.6.7. Применение симбиотического препарата «Пролизэр»

3.6.7.1. Клинические испытания симбиотического препарата в бройлерном

птицеводстве

Для повышения полноценности растительных кормов широко используют добавки синтетических аминокислот, так как недостаток лимитирующих аминокислот нельзя восполнить за счет кормов животного происхождения, доля которых в комбикормах для птицы к тому же снижается, а цена на них растет.

Цель исследования - замена в полноценном рационе корма для бройлеров высокопродуктивных кроссов синтетического лизина симбиотическим препаратом «Пролизэр».

На первоначальном этапе исследования определили эффективную дозу дачи препарата на основе Е. coli для бройлеров высокопродуктивных кроссов на весь цикл выращивания одного бройлера в зависимости от кросса.

В таблице 15 представлены данные по влиянию концентрации препарата «Про-лизэр» на эффективность роста в течение всего цикла выращивания бройлеров. Для каждого бройлера рацион во всех опытах один и тот же.

Таблица 15

Влияние концентрации симбиотического препарата на рост бройлеров высокопродуктивных кроссов.

Кросс бройлеров Концентрация препарата Пролизэр, млрд/см' Живая масса в возрасте, гр.

7 дней 14 дней 22 дня 28 дней 37 дней

Бройлеры кросса «Кобб-500» 50 114 292 743 1078 1998

75 122 324 756 1095 2057

100 127 352 754 1095 2058

150 128 356 749 1093 2057

200 126 354 752 1089 2059

Бройлеры кросса «Авиан-48» 50 101 332 748 893 1893

75 107 347 764 993 2084

100 118 358 763 990 2056

150 118 356 760 991 2058

200 112 354 761 989 2054

Бройлеры кросса «Смена-7» 50 132 297 776 1002 2035

75 131 295 776 998 2021

100 130 296 769 997 2017

150 128 293 772 995 2012

200 126 296 770 994 2016

По результатам исследований (см. табл. 15), используя метод Гаусса - Зайделя, определили оптимальные концентрации дачи симбиотического препарата на весь цикл выращивания одного бройлера в зависимости от кросса по дням содержания бройлеров.

На рисунке 14 представлена динамика прироста живой массы бройлеров кросса «Смена-7».

О 7 14 21 28 37 42 дней

□ "Смена-7" с синтетическим лизином ■ "Смена-7" с симбиотическим препаратом

Рис. 14. Динамика прироста живой массы бройлеров кросса «Смена-7»

На рисунке 15 представлена динамика прироста живой массы бройлеров кросса «Авиан-48».

3000

Вес. г

2500 2000 1500 1000 500

00 7 14 21 28 37 42 дней

П" Авиан-48" с синтетическии лизином В9"Авиан-48" без добавки синтетического лизина ■ "Авиан-48" ссимбиотиком Пролизэр

Рис. 15.Динамика прироста живой массы бройлеров кросса «Авиан-48»

Результаты проведенных испытаний, на цыплятах-бройлерах кроссов Кобб-500, Авиан-48 и Смена-7, как на ограниченном поголовье в ВНИТИП, так и на промышленном поголовье птицефабрики «Смена» Сергиево-Посадского района Московской области показали, что использование симбиотического препарата в дозировке 1,75 - 3,05 млрд. микробных клеток на весь цикл выкармливания позволяет полностью заменить синтетический лизин в рационах кормов для бройлеров высокопродуктивных кроссов. Использование препарата не повлияло отрицательно на сохранность бройлеров, понизило расход корма на весь цикл выращивания, а так же повысило среднесуточные привесы бройлеров, увеличило выход мяса 1-й категории и снизило выход мяса на промышленную переработку.

Для оценки зоотехнических показателей рассчитывали ЕИП:

ЕИП для кросса «Смена 7»: ЕИПК0НТ = 276,96; ЕИП0ПЫ1 = = 343,10.

В России ЕИП редко превышает 300 ед., в то время как на предприятиях Западной Европы он составляет более 350 ед. Из расчетов видно, что применение симбиотического препарата «Пролизэр» способствует повышению ЕИП до результатов Европейских стран и превышает контрольные группы на 20 - 25 %.

Получено положительное решение о выдаче патента по заявке № 2012105907RU от 21.02.2012 г. «Способ применения симбиотического препарата Пролизэр на основе штамма Escherichia coli VL - 613 для бройлеров высокопродуктивных кроссов».

3.6.7.2. Клинические испытания симбиотического препарата на основе штамма Е. coli в свиноводстве

На первоначальном этапе исследования, используя Гаусса - Зайделя, определили оптимальную дозу дачи препарата для поросят послеотъемного периода (на дора-щивании с 60 до 120 дневного возраста).

В таблице 16 представлены данные по исследованию влияния концентрации симбиотического препарата на прирост живой массы поросят в течение всего цикла доращивания.

Таблица 16

Влияние концентрации препарата «Пролизэр» на прирост живой массы поросят

№. п/п Схема дачи препарата Концентрация симбиотического препарата, млрд/см' Живая масса в возрасте, кг

60 дней 80 дней 100 дней 120 дней

1 1 раз в 2 дня 300 16,2 24,2 35,6 51,1

2 600 16,1 25,4 38,8 56,9

3 900 16,1 25,1 37,1 54,5

4 1200 16,3 25,0 37,0 53,0

5 1500 16,2 24,9 36,8 53,2

6 1 раз в 3 дня 300 16,2 24,1 35,2 50,9

7 600 16,4 24,9 38,1 55,3

8 900 16,1 25,6 39,1 57,0

9 1200 16,1 25,2 37,9 55,8

10 1500 16,3 25,0 38,0 55,6

Из таблицы 16 видно, что оптимальные концентрации дачи симбиотического препарата получены в опытах № 2 и № 8.

Препарат дается по следующей схеме: поросятам послеотъемного периода (на доращивании с 60 до 120 дневного возраста) вплоть до передачи их на откорм дают из расчета 900 млн. м.к. на одно животное один раз в три дня или 600 млн. м.к. на одно животное один раз в два дня. При использовании рекомендованных доз симбиотического препарата осложнений и побочного действия его на организм животных не обнаружено. Противопоказаний для применения симбиотического препарата не выявлено.

Для определения эффективности применения в рационе кормления поросят симбиотического препарата на основе Е. coli в хозяйствах Белоруссии были проведены опыты на 300 поросятах с 60-го по 120-й день выращивания.

Результаты проведенных испытаний показали, что использование симбиотического препарата в дозировке 18-20 млрд. микробных клеток на весь цикл выкармливания поросят способствовует увеличению среднесуточного прироста их живой массы, и уменьшению затрат кормов. Кроме того, проведенные исследования показали, что из состава постстартерных кормов для поросят, выращиваемых с 2-х до 4-х месячного возраста можно полностью исключить корма животного происхождения, при условии включения в них симбиотического препарата.

3.6.8. Расчет эффективности применения снмбиотического препарата

«Пролнзэр»

3.6.8.1. Расчет эффективности применения снмбиотического препарата в бройлерном производстве.

Данные для расчета экономической эффективности применения снмбиотического препарата на цыплятах-бройлерах кросса «Смена-7» представлены в таблице 18.

Таблица 18

Экономическая эффективность применения симбиотического препарата на цыплятах-бройлерах кросса «Смена-7»

Показатель Ед. Группы

измер. Контрольная Опытная

Принято на выращивание гол. 120 120

Живая масса суточных цыплят г 40,0 40,0

Стоимость всех суточных цыплят руб. 1800,0 1800,0

Срок выращивания сут. 42 42

Пало гол. 3 2

Поголовье на конец выращивания гол. 117 118

Сохранность поголовья % 97,5 98,3

Средняя живая масса 1 головы на конец выращивания г 2065,50 2209,52

Валовая живая масса кг 241,66 260,72

Валовый прирост живой массы кг 236,86 255,92

Расход кормов, всего кг 403,56 380,8

Стоимость кормов, всего руб. 4035,60 3808,0

Стоимость кристаллического лизина или препарата «Пролизэр» на всю группу руб. 480,0 229,2

Затраты корма на 1 кг прироста живой массы кг 2,024 2,169

Производственные затраты:

стоимость суточных цыплят руб. 1800.0 1800.0

стоимость корма руб. 4035,6 3808,0

стоимость препарата руб. 480,0 229,2

зарплата с начислениями руб. 383,0 383,0

Прочие прямые затраты руб. 468,0 468,0

Накладные расходы руб. 348,0 348,0

Всего затрат руб. 7514.6 7036.2

Себестоимость 1 кг прироста живой массы руб. 31,10 26,99

Разница по себестоимости руб. 0 -4,11

Разница по себестоимости % 0 - 13,22

Контрольная группа - кормление на полноценном рационе с синтетическим лизином Опытная группа - кормление на рационе бсч синтетического лизина, но с симбиотиком.

Дополнительная прибыль (ДП= Разница Себестоимости х Разница Валового прироста) от применения симбиотика на цыплятах-бройлерах кросса «Смена-7», в расчете на 1000 цыплят-бройлеров составила - 652,83 руб. Экономическая эффективность (Э = Разница Себестоимости х Вал прирост) применения симбиотика в расчете на 1000 цыплят-бройлеров составил - 8765,25 руб.

3.6.8.2. Расчет эффективности применения симбиотического препарата в

свиноводстве.

Данные для расчета экономической эффективности применения симбиотического препарата «Пролизэр» для поросят послеотъемного периода (на дорашивании с 60 до 120 дневного возраста) представлены в таблице 19.

Таблица 19

Экономическая эффективность применения симбиотического препарата для поросят послеотъемного периода.

Показатель Ед. иэмер. Группы

Контрольная* Опытная**

Принято на выращивание гол. 10 10

Живая масса 60-ти дневных поросят кг 18,4 18,5

Стоимость 60-ти дневных поросят руб. 2208,0 2220,0

Стоимость всех 60-ти дневных поросят руб. 22080,0 22200,0

Срок выращивания сут. 60 60

Пало гол. - -

Поголовье на конец выращивания гол. 10 10

Сохранность поголовья % 100 100

Средняя живая масса 1 головы на конец выращивания кг 43,7 57,5

Валовая живая масса кг 437,0 575,0

Валовый прирост живой массы кг 253,0 390,0

Расход кормов, всего кг 1080,31 1283,1

Стоимость 1 кг корма, руб. руб. 8,5 8,5

Стоимость кормов, всего руб. 9182,64 10906,35

Стоимость препарата «Пролизэр» на 1 -го поросенка руб. - 19,65

Стоимость препарата «Пролизэр» на всю группу руб. - 196,5

Затраты корма на 1 кг привеса живой массы кг 4.27 3,29

Зарплата с начислениями руб. 431,40 431,40

Прочие прямые затраты руб. 455,10 455,10

Накладные расходы руб. 493,50 493,50

Всего затрат руб. 32187,54 36902,85

Себестоимость 1 кг прироста живой массы руб. 127,22 94,62

Разница по себестоимости руб. 0 - 32,60

Разница по себестоимости % 0 - 25,62

Контрольная группа - кормление на полноценном рационе с синтетическим лизином Опытная фуппа - кормление на рационе без синтетического лизина, но с симбиотиком. ДП от применения симбиотического препарата в расчете на 1-го поросенка послеотъемного периода составил - 446,62 руб., а экономическая эффективность на 1 поросенка послеотъемного периода составила - 1271,40 руб.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработан алгоритм промышленной технологии получения сухих живых бактериальных препаратов и на его основе усовершенствованы промышленные технологии производства ветеринарных препаратов из штаммов листерий и энтеробакте-рий, что способствовало повышению эффективности их производства, а в итоге улучшению эпизоотологической ситуации в животноводческих хозяйствах АПК.

2. Усовершенствованная технология промышленного производства вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных, позволила:

- повысить накопление листерий, за счет лучших ростовых качеств разработанной питательной среды в 2,5 раза и сократить время культивирования с 16 - 18 часов до 7 - 9 часов по сравнению с традиционной;

- улучшить условия сохраняемости жизнеспособных листерий в вакцине в процессе длительного хранения с использованием оптимизированной защитной среды высушивания на 30 + 10 % для разных штаммов (АУФ, УСХИ-19, УСХИ-52) по сравнению с традиционной защитной средой.

3. Применение усовершенствованной технологии промышленного производстве вакцин против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных, позволило:

- увеличить накопление жизнеспособных сальмонелл на оптимизированной питательной до 32,6 - 39,6 млрд/см3 по сравнению с контрольной - не более 5,2 млрд/см3;

- уменьшить продолжительность фазы приспособления с 0,5 часа до 0,15 часа, увеличить продолжительность логарифмической фазы с 1,4 часа до 4,5 часов и сократить время культивирования с 12 часов до 6 - 8 часов.

- улучшить условия сохраняемости жизнеспособных сальмонелл в вакцине в процессе длительного хранения с использованием оптимизированной защитной среды высушивания на 45 + 10%, для разных штаммов сальмонелл, по сравнению с традиционной защитной средой.

4. Опытно-промышленные серии вакцин против листериоза и сальмонеллеза, изготовленные по усовершенствованной технологии на Сумской и Ставропольской биофабриках, прошли испытания в животноводческих хозяйствах Ставропольского края, Ульяновской и Костромской областей с положительным результатом.

5. Оптимизация основных технологических этапов производства симбиотиче-ского препарата «Пролизэр» на основе E.coli позволила:

- увеличить в 2,2 раза накопление Е. coli;

- сократить время культивирования с 8 - 24 часов до 4 - 6 часов за счет лучших ростовых качеств разработанной питательной среды;

- улучшить условия сохраняемости жизнеспособных эшерихий в препарате в процессе длительного хранения с использованием разработанной защитной среды высушивания на 35 + 5%.

6. Установлено, что превышение времени подачи бактериальной культуры на центрифугирование больше, чем на 1,5 часа, ведет к снижению концентрации ж/с эшерихий в процессе длительного хранения в 1,6 - 2,9 раза

7. Применение симбиотического препарата в бройлерном птицеводстве и свиноводстве позволило получить экономический эффект, который составляет:

- на цыплятах-бройлерах в расчете на 1000 цыплят - дополнительная прибыль -652,83 рублей; а экономический эффект - 8765,25 рублей.

- на поросятах послеотъемного периода в расчете на 1000 поросят - дополнительная прибыль - 446620,0 рублей, а экономический эффект - 1271400,0 руб.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предложены следующие документы.

Нормативная документация:

- «Инструкция по изготовлению вакцины бивалентной сухой живой против листериоза сельскохозяйственных животных», утверждена директором Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности 26.10.1994 г.;

- Технические условия 080-64-19-48-94 «Вакцина бивалентная сухая живая против листериоза сельскохозяйственных животных», утверждена начальником Департаментом ветеринарии МСХ РФ 01.12.1994 г.;

- «Инструкция по изготовлению вакцины сухой живой против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных», утверждена начальником Департаментом ветеринарии МСХ РФ 10. 02. 1993 г.;

- Технические условия 10-09-129-93 «Вакцина сухая живая против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных», утверждена заместителем начальника Главного управления ветеринарии МСХ РФ 07.04.1994 г.;

- Изменения и дополнения в действующую «Инструкцию по изготовлению и контролю сухой живой вакцины против сальмонеллеза (паратифа) свиней из штамма ТС - 177» и «Инструкцию по изготовлению и контролю сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней из супрессорного ревертанта Salmonella choleraesuis № 9» 18. 10. 2000г.;

- «Опытно - промышленный регламент производства симбиотического препарата «Пролизэр» утвержден директором ГНУ Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности РАСХН 20.10. 2011 г.;

- Стандарт организации (СТО) ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии: «Симбио-тический препарат «Пролизэр» утвержден директором ГНУ Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности РАСХН 20. 10. 2011 г.;

- «Инструкция по применению симбиотического препарата «Пролизэр» утверждена директором ГНУ Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности РАСХН 20. 10. 2011 г.;

- «Инструкция по применению симбиотического препарата «Пролизэр» при до-ращивании поросят послеотъемного периода» утверждена директором ГНУ Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности РАСХН 20. 10. 2011 г.;

Методические положения: «Методические положения по производству симбиотического препарата Пролизэр» 2012г.; «Методические положения по применению симбиотического препарата Пролизэр» 2012г.; «Методические положения по применению симбиотического препарата Пролизэр при доращивании поросят послеотъемного периода» 2012г.; «Методические положения по обоснованию режимов сублимационного высушивания пробиотических препаратов» 2012 г.; «Методические положения по применению компьютерной программы MICROSOFT OFFICE VISIO 2010 для построения технологических схем» 2012 г.; «Методические положения по применению пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010 для построения сложных тех-

нологических графиков (на примере процесса сублимационного высушивания препа-ратов-пробиотиков) 2012 г.; «Методические положения по расчету технологических линий производства пробиотических и симбиотических препаратов» 2012 г. и заслушаны на секции «Ветеринарная биотехнология», утверждены академиком-секретарем A.M. Смирновым Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

6. СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

6.1. Список научных публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

I. Меньшеннн В.В. Вакцннопрофилактнка сальмонеллеэа молодняка свиней. / Меньше-HiiH В.В., Школьников Е.Э., Раевский A.A., Нежута A.A., Павленко И.В. // Свиноводство -2011. -№1 - С. 48-49.

2. Самуйленко А.Я. Перспективные направления в технологии культивирования бактерий при производстве вакцин для ветеринарной медицины. / Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Павленко И.В., Анисимова Л .В., Меньшеннн В.В. // Ветеринария и кормление - 2011. -№ 4 . - С. 8-9.

3. Эрнст Л. Лизинсинтезирующий препарат Пролнзэр при выращивании бройлеров 1 Эрнст Л., Самуйленко А., Школьников Е„ Меньшеннн В., Павленко И., Раевский А., Рахма-нина Е., Егоров И., Андрианова Е., Салеева И. // Птицеводство - 2011. -№ 4 - С. 35-36.

4. Павленко И.В. Оптимизация защитной среды высушивания используемой при изготовлении живой сухой вакцины против листерпоза сельскохозяйственных животных / Павленко И.В., Раевский A.A., Нежута A.A.,. Дадасян А.Я. // Известия Самарского научного центра Российской Академии наук - Самара издательство самарского научного центра РАН -

2011.-Т. 13,-№5(3)-С. 171-174.

5. Раевский A.A. Технология изготовления сухой живой вакцины против лпстериоза животных из штамма АУФ / Раевский A.A., Павленко И.В., Меньшеннн В.В., Нежута A.A. II Ветеринария - 2012. - №1 - С. 55-56.

6. Самуйленко А.Я. Эффективность применения симбнотического препарата на основе штамма Escherichia coli VL-6I3 при доращиванип поросят послеотъемного периода. / Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Раевский A.A., Павленко И.В., Меньшеннн В.В. // Свиноводство-2012.-№ 1 - С. 42-43.

7. Павленко И.В. Применение лизина в бройлерном птицеводстве / Павленко И., Гринь А., Меньшеннн В., Егоров И., Салеева И., Иванов А., Ефимов Д. // Птицеводство - 2012. № 6 -С. 19-22.

8. Павленко И.В. Культивирование в мембранном биологическом реакторе сальмонелл и лнстерий / Павленко И.В., Раевский A.A., Меньшеннн В.В. // Ветеринарный врач -

2012. -№2, - С. 17-18.

9. Самуйленко А.Я. Получение и использование лизина в бройлерном птицеводстве / Самуйленко А.Я., Павленко И.В., Раевский A.A., Гринь С.А., Егоров И.А., Андрианова E.H. // Вестник Российский академии сельскохозяйственных наук - 2012. № 4 - С. 64 - 66.

10. Павленко И.В. Эффективность применения препарата Пролнзэр / Павленко И., Бобровская И., Литвинова Е., Егоров И., Салеева И., Иванов А., Ефимов Д. // Птицеводство -2012. №8-С. 33-36.

11. Павленко И.В. Технология получения симбнотического препарата Пролнзэр на основе штамма Escherichia coli VL-613 / Труды Кубанского государственного аграрного университета - 2012. № 4 (37) - С. 106- 108

12. Павленко И.В. Эффективность применения симбнотического препарата Пролнзэр в бройлерном птицеводстве / Труды Кубанского государственного аграрного университета -2012. №4 (37) -С. 166- 168

13. Павленко И.В. Разработка технологии изготовления сухой живой бивалентной вакцины против листерпоза животных из штаммов УСХИ-19 и УСХИ-52 / Павленко И.В.,

Меньшенин В.В., Нежуга A.A., Гринь A.B.. Лузан Н.С. / Ветеринарный врач - 2Ü12, № 5 - С. 14- 16.

14. Павленко И.В. Технология изготовления вакцины против сальмонеллеза телят из штамма Salmonella dublin № 160 / Павленко И.В., Меньшенин В.В., Гринь A.B. / Ветеринария-2012. №11 -С. 28 - 30.

15. Павленко И.В. Оптимизация технологических параметров производства снмбиотнче-ского препарата Пролшэр на основе штамма Escherichia coli VL-613 / Ветеринария и кормление - 2012. № 6 - С. 34 - 35.

16. Павленко И.В. Эффективность применения кормовой добавки «Пролиээр-БноР» в свиноводстве / Павленко И.В., Л.К. Эрнст, А.Я. Самуйленко, A.A. Раевский, Е.Э. Школьников, A.A. Нежута, В.И. Еремец, Н.Д. Скичко, А.И. Гуславский, A.B. Бобровская // Ветеринария м кормление» - 2012. № 6 - С. 40 -41.

17. Павленко И.В. Применение лизинсинтезируюшего препарата Пролизэр на бройлерах кросса «Кобб-500» / Павленко И.В., Л.К. Эрнст, А.Я. Самуйленко, A.A. Раевский, Е.Э. Школьников, A.A. Нежута, Л.Б. Соловьев, Ю.Д. Фролов, Л.В. Аннснмова, Л.А. Коротеева // Ветеринария н кормление» - 2012. № 6 - С. 41 - 42.

18. Павленко И.В. Определение оптимальной дозы дачи симбнотпческого препарата Пролизэр для бройлеров разных кроссов / Павленко И.В., Л.К. Эрнст, А.Я. Самуйленко, A.A. Раевский, А.А Нежута, Е.Э. Школьников, В.И. Еремец, Л.Б. Соловьев, Ю.Д. Фролов, И.Н. Матвеева // Ветеринария и кормление» - 2012. № 6 - С. 43 - 44.

19. Провоторова О.В. Расчет технологических лпмнй производства пробиотнческнх н снмбиотическнх препаратов / Провоторова О.В.. Павленко И.В., Неминущая Л.А., Нежута A.A., Самуйленко А.Я. / Ветеринарный врач» - 2013, № I - С. 28 - 30.

20. Пявленко И.В. Использование симбнотпческого препарата в кормлении цыплят-бройлеров / Павленко И.В., Бобровская И.В., Меньшенин В.В., Егоров И.А., Салеева И.П., Иванов A.B., Ефимов Д.Н. / Птица и птицепродукты-2013. № I - С. 45-46.

21. Павленко И.В. Оптимизация производства вакцин против листерноза / Павленко И.В., Самуйленко А.Я., Раевский A.A., Еремец В.И., Нежута A.A., Канарская З.А., Канарский

A.B. // Вестник Казанского технологического университета - 2013. № 8 - С. 220 - 226.

22. Павленко И.В. Совершенствование технологии производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят / Павленко И.В., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Бобровская И.В., Нежута A.A., Канарская З.А., Канарский A.B. // Вестник Казанского технологического университета - 2013. № 8 - С. 226 - 232.

23. Самуйленко А.Я. Влияние способов культивирования на выход бактериальной массы и качество вакцин для ветеринарной медицины. / Самуйленко А.Я., Раевский A.A., Павленко И.В., Еремец Н.К., Бобровская И.В., Канарская З.А., Канарский A.B.// Вестник Казанского технологического университета - 2013. № 9 - С. 165- 171.

24. Павленко И.В. Разработка технологии производства симбиотического препарата Пролизэр на основе штамма Escherichia coli VL-6I3. Часть I. Оптимизация технологии культивирования штамма Escherichia coli VL-613 для получения симбиотического препарата Пролизэр / Павленко И.В., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Нежута A.A., Канарская З.А., Канарский A.B. И Вестннк Казанского технологического университета - 2013. № 9 - С. 165 -171.

25. Павленко И.В. Разработка технологии производства симбиотического препарата Пролизэр на основе штамма Escherichia coli VL-613. Часть 2 Оптимизация условий сохранения жизнеспособности штамма Escherichia coli VL-613 / Павленко И.В., Самуйленко А.Я., Еремец

B.И., Нежута A.A., Канарская З.А., Канарский A.B. // Вестннк Казанского технологического университета - 2013. № 9 - С. 171 - 176.

6.2. Монография

26. Л.К. Эрнст Энтеробактерии в животноводстве / Л.К. Эрнст, А.Я. Самуйленко, С.А. Гринь, Е.Э. Школьников, Е.П. Сапегиив, Л. Беро, A.A. Раевский, В.И. Еремец, И.В. Павленко, H.A. Бондарева, И.И. Чеботарев, А.Я. Дадасян, Москва 2011, ВНИТИБП РАСХН - 342 с.

6.3. Список патентов

27. Патент РФ № 2053790 от 19.05.93. Способ изготовления вакцины против лнсгермоза сельскохозяйственных животных. Ярцев М.Я., Шишов В.П., Раевским A.A., Коротеева JI.A., Павленко И.В. - Опубликован 10.02.96. - БИ №4 - С. 154.

28. Патент РФ № 2129016 от 01.10.96. Способ изготовления вакцины против сальмонел-леза сельскохозяйственных жнвотных. Ярцев М.Я., Раевский A.A., Анисимова JT.A., Павленко И.В., Александрова М.Л. - Опубликован 20.04.99. - Бюллетень № 11 - С. 326.

29. Патент RU № 2450051, 18,08,2010 г. Способ получения снмбиотмческого препарата на основе Escherichia coli VL-613. Самуйленко А.Я.. Эрнст Л.К., Школьников Е.Э., Раевский A.A., Эрнст К.Л., Анисимова Л.В., Коротеева Л.А., Павленко И.В., Чеботарев И.И., Грннь С.А., Бондарева H.A. Опубликован 10.05.2012. БИ № 13, ч.2 - С. 318.

6.4. Список научных публикаций в других изданиях

30. Дубинина Г.П. Сохраняемость сухих живых противопастереллёзных вакцин, изготовленных из культур с добавкой ионов магння в процессе культивирования / Дубинина Г.П., Раевский A.A., Яриев М.Я., Галибина Н.В., Павленко И.В. // Сборник научных трудов ВНИТИБП Разработка технологических процессов изготовления биопрепаратов для профилактики и диагностики болезней сельскохозяйственных животных.- М., 1991. - С. 20-26.

31. Анисимова Л.В. Изготовление и испытание сухой живой вакцины против сальмо-неллёза телят из штамма С.Дублин №160 / Анисимова Л.В., Раевский A.A., Ярцев М.Я., Павленко И.В., Воробьёв A.A., БоПченко М.Н. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов: Тезисы докладов V Всероссийской конференции,- Щёлково, 1996. - С. 106-107.

32. Раевским A.A. Усовершенствование технологии изготовления сухом живой вакцины против сальмонеллёза телят из штамма С.Дублин №160 / Раевский A.A., Анисимова Л.В., Ярцев М.Я., Павленко И.В. // Научные основы технологии промышленного производства ветерннарных биологических препаратов: Тезмсы докладов V Всероссийской конференции.-Щёлково, 1996. - С. 96.

33. Раевским A.A. Изготовление и испытание сухой живой вакцины против сальмонеллёза телят из штамма С.Дублин №160 / Раевский A.A., Анисимова Л.В., Ярцев М.Я., Павленко И.В., Воробьев A.A., Бойченко М.Н. // Научные основы технолопш промышленного производства ветеринарных биологических препаратов: Тезисы докладов V Всероссийской конференции-Щёлково, 1996.-С. 106-107.

34. Павленко И.В. Разработка защитной среды высушивания при изготовлении живой сухом вакцины против лмстермоза сельскохозяйственных животных из штамма «АУФ» для сублимационной сушки. / Павленко И.В., Раевский A.A., Шишов В.П., Рубан Е.А., Сербнс Е.С. // Материалы Международной научно-практическом конференции «Научные основы производства ветерннарных биологических препаратов». Щелково, 2003. - С. 95-99.

35. Пявленко И.В. Разработка защитной среды высушивания при изготовлении живой сухой вакцины против листерноэа сельскохозяйственных животных из штамма «АУФ» для длительного хранения. / Павленко И.В., Раевский A.A., Шишов В.П., Рубан Е.А., Сербис Е.С. II Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2003. - С. 99-102.

36. Павленко И.В. Разработка основных технологических процессов промышленного производства сухой вакцины против лмстерпоза сельскохозяйственных жнвотных: Автореферат диссертации кандидата биологических наук. Щелково, 2003,- 24 с.

37. Раевским A.A. Управляемые процессы культивирования микроорганизмов при производстве бактериальных препаратов / Раевский A.A., Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Пявленко И.В. // Материалы VI Московского Международного Конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва 2011, Т. 1 - С. 195-196

38. Самуйленко А.Я. Технология изготовления бивалентной вакцины против лнстерноза животных мз штаммов УСХИ - 19 и УСХИ - 52. / Самуйленко А.Я., Павленко И.В., Раев-

ский А.А, Анисимова Л.В., Соловьев Л.Б., Еремец В.И., Меньшенпн В.В., Нежута А.А. // Ветеринарная медицина 95 Международный тематический научный сборник Харьков 2011 - С. 181 - 182.

39. Самуйленко А.Я. Разработка снмбиотического препарата на основе E.coli VL-6I3 и применение его в бройлерном птицеводстве. / Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Павленко И.В., Раевский А.А, Еремец В.К., Скичко Н.Д., Анисимова Л.В., Андрианова Е.Н. Н Ветеринарная медицина 95 Международный тематический научный сборник Харьков 2011 - С. 183 -184.

40. Школьников Е.Э. Применение симбиотического препарата на основе E.coli VL-6I3 в бройлерном птицеводстве. / Школьников Е.Э., Раевский А.А., Меньшенпн В.В., Нежута А.А., Пявленко И.В., Егоров И.А.. Андрианова Е.Н. // Материалы Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной наукн в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации», Покров 2011 - С. 265-269.

41. Самуйленко А.Я. Применение в бройлерном птицеводстве снмбиотического препарата на основе E.coli VL-6I3. / Самуйленко А.Я., Раевский А.А., Еремец В.И., Павленко И.В., Скичко Н.Д., Анисимова Л.В., Беро И.Л. // Материалы Международной научно-практпческой конференции «Научные исследования - основа модернизации сельскохозяйственного производства», Тюмень 2011 - С. 64-66.

42. Самуйленко А.Я. Изготовление бивалентной вакцины против лнстерпоза животных из штаммов УСХИ-19 и УСХИ-52 / Самуйленко А.Я., Пявленко И.В., Раевский А.А., Анисимова Л.В., Соловьев Л.Б., Еремец В.И., Нежута А.А. // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию СибНИВИ - ВНИИБТЖ «Инфекционная патология животных», Омск 2011, - С. 194-197

43. Самуйленко А.Я. Применение симбиотического препарата Пролизэр при доращнва-нии поросят послеотъемного периода / Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Раевский А.А., Павленко И,В., Анисимова Л.В., Коротеева Л.А. II Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию СибНИВИ - ВНИИБТЖ «Инфекционная патология животных», Омск 2011, - С. 220-223

44. Пявленко И.В. Симбнотический препарат Пролизэр заменитель синтетического лизина в рационах кормления бройлеров. / Павленко И.В., Соловьев Л.Б., Бобровская И.В. // Рационы и ветеринария Информ - Ярославль 2012. - № 3 (127) - С. 17 - 18.

45. Пявленко И.В. Эффективность применения симбнотической лизинсинтезирующей кормовом добавки «Пролизэр - БиоР» на основе штамма Escherichia coll. «BioR. Prolyzer -4L» при доращивании поросят послеотъемного периода» / И.В. Павленко, Е.Э. Школьников // Рационы и ветеринария Информ - Ярославль - 2012. - № 4 (128) - С. 31 - 32.

46. Самуйленко А.Я. Бнотехнологическне аспекты производства нового симбиотического препарата Пролизэр и оценка его эффективности / Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Павленко И.В.. Анисимова Л.В., Еремец В.И., Бобровская И.В. // Сборник научных трудов V Международного научно-практического симпозиума «Перспективные ферментные препараты и биотехнологнческие процессы в технологии продуктов питанпя и кормов» ВНИ-ИПБТ, Москва. 2012-С. 152-154.

47. Павленко И.В. Использование симбиотического препарата Пролизэр в рационах для цыплят бройлеров / Павленко И.В., Соловьев Л.Б., Бобровская и.В., Еремец В.И. // Сборник научных трудов 5-ой международной научно-практической конференции - Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных - Краснодар - 2012. часть 1 -С. 174-175

48. Павленко И.В. Усовершенствование технологии изготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят из штамма Salmonella dublin № 160 / Павленко И.В.. Меньшенпн В.В., Бобровская И.В., Анисимова Л.В., Нежута А.А. И Экология II животный мир -Минск - 2012. № 1 - С. 46-47.

49. Павленко И.В. Технология получения симбиотического препарата Пролизэр / Павленко И.В., A.A. Нежута, Бобровская И.В. // Экология п животный мир - Минск - 2012. № 1 - С. 48-50.

50. Самуйленко А.Я. Технология изготовления сухой живой вакцины против сальмо-неллеза телят из штамма Salmonella Dublin № 160 / Самуйленко А.Я., Бремен В.И., Павленко И.В., Меньшенин В.В., Бобровская И.В. // Ученые записки - Витебск - 2012, Т. 48, выпуск 2 часть 1 - С. 138-140.

51. Павленко И.В. Эффективность применения добавки «Пролизэр - БпоР» при дора-щивании поросят послеотъемышей / Павленко И.В., Школьников Е.Э., Еремец В.И., Меньшенин В.В., Грннь A.B. // Материалы международной научно-практической конференции «Роль ветеринарной науки и практики в эффективном развитии животноводства» - Алматы -2012-С. 408-412.

52. Самуйленко А.Я. Культивирование сальмонелл и эшерихпй в мембранном биологическом реакторе // Самуйленко А.Я., Павленко И.В., Раевский A.A., Еремец В.И., Бобровская И.В., Меньшенин В.В., Самуйленко А.Я. // Материалы международной научно-практнческой конференции «Роль ветеринарной науки и практики в эффективном развитии животноводства» - Алматы - 2012 - С. 457 - 460.

53. И.В.Павленко. Оптимизация технологических параметров культивирования штамма Е. coli VL - 613 при производстве симбиотического препарата Пролизэр / Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» - Щелково -2012 - С.351 - 355.

54. И.В. Павленко Применение симбиотической лнзинсинтезпрующей кормовой добавки «Пролнзэр-БиоР» при доращиванин поросят послеотъемочного периода / Павленко И.В., Л.К.Эрнст, А.Я. Самуйленко, A.A. Раевский, A.A. Нежута, В.И. Еремец, Б.Э.Школьников, И.В.Бобровская, Н.Д. Скичко // Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» - Щелково -2012 - С. 386 - 390.

55. И.В. Павленко Эффективность применения нового препарата «Пролизэр» на бройлерах кросса «Кобб-500» / И.В. Павленко, Л.К.Эрнст, А.Я. Самуйленко, А.А.Раевский, A.A. Нежута, Е.Э. Школьников, И.В. Бобровская, Л.В. Анисимова, Л.А. Коротеева, Ю.Д. Фролов // Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» - Щелково -2012 - С. 390 - 392.

56. И.В. Павленко Контроль м доклинические испытания по определению оптимальной дозы симбиотического препарата «Пролизэр» для бройлеров / И.В. Павленко, Л.К. Эрнст, А.Я. Самуйленко, A.A. Раевский, A.A. Нежута, В.И. Еремец, Е.Э.Школьников, И.В.Бобровская, Л.Б.Соловьев // Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» - Щелково -2012 - С. 393 - 396.

57. Н.Д. Скичко Эффективность применения цеолита в рационе кур СПФ / Н.Д. Скичко, И.В. Пявленко, Л.А. Коротеева, Н.И. Зенов, H.H. Смыслова // Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» - Щелково -2012 - С. 458 - 461.

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АНКУМ - 2М - аппаратура непрерывного культивирования микроорганизмов

ЕИП - европейский индекс продуктивности

ДИ - доклтшческне испытания

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

Ж/С - жизнеспособные микроорганизмы

ЗС - защитная среда высушивания

КЛ - клинические испытания

КФБ - калий-фосфатным буфер

КОЕ - колониеобразующие единицы

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

НД - нормативно - техническая документация

ОР - общий рацион

ПС - питательная среда

ДФЭ - дробный факторный эксперимент

ПФЭ - полный факторный эксперимент

СЖС - сахароза - желатиновая среда

СП - санитарные правила

СТО - стандарт организации

ТП - основные технологические процессы

ТТХ - технико-технологические характеристики

ТУ - технические условия

ФР - физиологический раствор

ЭКЕ - энергетическая кормовая единица

LDm/cm - 50% -ная летальная доза

Е. coli - Escherichia coli (кишечная папочка)

Х(п - координаты центра эксперимента;

AXi - интервал варьирования.

рО: - парциальное давление растворенного кислорода; рН - концентрация водородных ионов; еН - окислительно - восстановительный потенциал; о/п - оптическая плотность; t - время культивирования; | - подача глюкозы.

Подписано в печать 15.07.2013г.

Усл.п.л. - 2.5 Заказ №15135 Тираж: 150 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр. 12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

13-10950

2013074189

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора технических наук, Павленко, Игорь Викторович, Кашинцево

ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РАСХН

052013^1593 На правах рукописи

Павленко Игорь Викторович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРОМЫШЛЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА СУХИХ ЖИВЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация

на соискание ученой степени доктора технических наук

Научный консультант: академик РАСХН и НААН Украины,

доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат Государственной премии РФ,

Заслуженный деятель науки РФ

Анатолий Яковлевич Самуйленко

Щелково - 2013 г.

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВГНКИ - Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

ВНИВИП - Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства

ВНИИГРЖ - Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных

ВНИТИБП - Всероссийский научно-исследовательский технологический институт биологической промышленности

ВНИТИП - Всероссийский научно-исследовательский технологический институт птицеводства

ВНИИП - Всероссийский научно-исследовательский институт птицеводства ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

НС АСИ - Наблюдательный совет Агентства стратегических инициатив

РФ - Российская Федерация

ФО - Федеральный округ

АПК - Агропромышленный комплекс

АНКУМ - 2М - аппарат непрерывного культивирования микроорганизмов

АТФ - аденозинтрифосфат

БАВ - биологически активные вещества

БМ - биомасса

БХ - бульон Хоттингера

ВР - вспомогательные работы

ЕИП - европейский индекс продуктивности

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

Ж/С - жизнеспособные микроорганизмы

ЗР - задержка роста

ЗС - защитная среда высушивания

КЖ - культуральная жидкость

КФБ - калий-фосфатный буфер

КОЕ - колониеобразующие единицы

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

МБР - мембранный биологический реактор

НТД - нормативно - техническая документация

ОБХ - оптимизированный бульон Хоттингера

ОР - общий рацион

ПС - питательная среда

ПФЭ - полный факторный эксперимент

ДФЭ - дробный факторный эксперимент

СЖС - сахароза - желатиновая среда

СП - санитарные правила

СТО - стандарт организации

ТП - основные технологические процессы

ТТХ - технико-технологические характеристики

ТУ - технические условия

ФГМС - ферментативный мышечный гидролизат сухой

ФР - физиологический раствор

ЭКЕ - энергетическая кормовая единица

ЭМС - эозин - метиленовый синий агар

LD50/cm - 50%-ная летальная доза

pH - концентрация водородных ионов

еН - окислительно-восстановительный потенциал

р02 - парциальное давление растворённого кислорода

Е. coli - Escherichia coli (кишечная палочка)

Xoi - координаты центра эксперимента;

AXj - интервал варьирования.

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16

1.1. Состояние отечественного птицеводства и свиноводства 19

1.2. Листериоз 29

1.3. Вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных 35

1.4. Энтеробактерии 38

1.4.1. Escherichia coli 40

1.4.2. Сальмонеллы 42

1.5. Прикладное использование энтеробактерий 45

1.5.1. Вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных живот- 49 ных

1.5.2. Симбиотический препарат на основе Е. coli 53

1.6. Питательные потребности микроорганизмов 55

1.7.Культивирование микроорганизмов 61

1.8. Способы концентрирования бактериальных культур 75

1.9. Методы сушки 81

1.10. Защитные среды высушивания 91

1.11. Способы получения лизина для животноводства и птицеводства 93

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 100 2.1 .Материалы и методы 100 2.2. Усовершенствование промышленной технологии получения сухих 113 живых бактериальных препаратов

2.2.1. Разработка алгоритма усовершенствования промышленной тех- 113 нологии получения сухих живых бактериальных препаратов

2.2.2. Разработка унифицированной технологической и аппаратурно- 122 технологической схемы получения сухих живых вакцин против листериоза, сальмонеллеза или симбиотического препарата

2.3. Усовершенствование промышленной технологии получения сухих 127 живых вакцин против листериоза

2.3.1. Оптимизация питательной среды для глубинного управляемого 127 процесса культивирования листерий

2.3.2. Оптимизация глубинного управляемого процесса культивирова- 132 ния листерий

2.3.3. Оптимизация защитной среды высушивания, используемой при 142 изготовлении сухой живой вакцины против листериоза

2.3.4. Клинические испытания сухих живых вакцин против листериоза 149 животных

2.4. Усовершенствование промышленной технологии получения сухих 149 живых вакцин против сальмонеллеза

2.4.1. Оптимизация питательной среды для глубинного управляемого 150 процесса культивирования сальмонелл

2.4.2. . Оптимизация глубинного управляемого процесса культивиро- 156 вания сальмонелл

2.4.3. Оптимизация защитной среды высушивания, используемой при 164 изготовлении сухой вакцины против сальмонеллеза

2.4.4. Клинические испытания сухих живых вакцин против сальмо- 175 неллеза животных

2.5. Усовершенствование промышленной технологии получения сим- 177 биотического препарата на основе E.coli

2.5.1. Оптимизация питательной среды для глубинного управляемого 177 процесса культивирования E.coli

2.5.2. Оптимизация глубинного управляемого процесса культивирова- 183 ния E.coli, штамма VL-613

2.5.3. Влияние сроков обработки культуры перед концентрированием 188 на сохраняемость жизнеспособных бактерий E.coli в процессе длительного хранения

2.5.4. Оптимизация защитной среды высушивания, используемой при 192

изготовлении симбиотического препарата на основе Е.соН

2.6. Применение симбиотического препарата на основе Е.соН 205

2.6.1. Применение симбиотического препарата в бройлерном птице- 205 водстве

2.6.2. Применение симбиотического препарата в свиноводстве 227

2.7. Расчет эффективности применения симбиотического препарата в 241 бройлерном птицеводстве и свиноводстве

2.7.1. Расчет себестоимости производства симбиотического препарата 244

2.7.2. Расчет эффективности применения симбиотического препарата в 249 бройлерном производстве

2.7.3. Расчет эффективности применения симбиотического препарата в 252

свиноводстве

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 255

4. ВЫВОДЫ 279

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 281

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 283

7. ПРИЛОЖЕНИЯ 327

7.1. Таблицы расчетов коэффициентов уравнений 328

7.2.Паспорта штаммов и СТО на посевной материал 392 7.3 .Нормативная документация 406

7.4.Акты испытаний 416

7.5.Патенты 443

7.6.Методические положения 451

7.7.Дипломы и медали 466

ВВЕДЕНИЕ

Исследования по разработке и обеспечению продовольствием и биологической защиты людей и животных в стране является основной задачей АПК на современном этапе, что делает актуальными научные изыскания, направленные на решение этих проблем [226, 265].

Одним из путей решения задач развития АПК поставленных перед наукой является разработка, производство и применение новых экологически безопасных эффективных препаратов, вакцин способных обеспечить нормальное развитие животных, что способствует получения от них качественной продукции [67, 94, 208, 222, 223, 224, 233, 240, 241, 249, 250, 252, 258, 297].

Этим требованиям соответствуют новые экобиотехнологические препараты, такие как пробиотики, пребиотики, синбиотики (эубиотики) и симбиотики [47, 60, 69, 109, 178, 181, 210, 247, 253, 259, 260, 264, 281, 328, 329, 371], которые применяют как в здравоохранении, так и в ветеринарии. Такие лечебно-профилактические и ростостимулирующие экологически чистые препараты физиологичны по своему действию, безвредны для животных, просты в наработке, дешевы, технологичны для группового применения, что особенно актуально для отечественного птицеводства и животноводства [7, 37].

В настоящее время техническая микробиология является активно развивающимся научным направлением, использующим биотехнологические процессы при разработке и производстве широкого спектра биопрепаратов (вакцин, сывороток, диагностикумов, пробиотиков), биологически активных веществ (ферментов, антибиотиков, пребиотиков и др.), добавок к кормам (белков и аминокислот). Их применение в АПК способствует повышению продуктивности животных и птицы, обеспечению ветеринарного благополучия хозяйств, гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.

Вступление России в ВТО повышает требования к конкурентоспособности отечественной продукции, что делает необходимым реконструкцию (реинжиринг)

производств многих предприятий биологической, химической и пищевой промышленности и разработку новых или усовершенствование традиционных промышленных технологий производства препаратов.

Основы разработки, оптимизации, моделирования технологий микробиологических производств и процессов микробиологического синтеза отражены в работах В.М. Кантере (1990), В.В. Бирюкова (1985), И.М. Грачевой (1980), Ю.П. Грачева (1979). Эти разработки актуальны и для предприятий, выпускающих лекарственные средства для животных, в том числе и иммунобиологические препараты, с точки зрения обеспечения их безопасности и качества [30, 113].

При интенсивном ведении птицеводства и свиноводства в условиях промышленной технологии содержания животных биологически полноценное кормление является решающим фактором получения высокой продуктивности. При этом предусматривается обеспечение кормления птицы и свиней не только качественными белковыми и энергетическими компонентами, но и лимитирующими аминокислотами и другими жизненно необходимыми веществами для их роста.

Известно, что недостаток лимитирующих аминокислот нельзя восполнить за счет кормов животного происхождения, доля которых в комбикормах для птицы и свиней к тому же снижается, а цена на них растет. Для повышения полноценности кормов из растительных компонентов широко используют премиксы, добавки синтетических аминокислот и др.

Среди незаменимых аминокислот лизин занимает особое место. Он входит в состав структурных тканевых белков и белковых ферментов, способствует улучшению пищеварения, играет важную роль в формировании костяка, повышении продуктивности, оказывает благотворное влияние на воспроизводительные функции птицы и свиней.

В настоящее время во многих странах при кормлении продуктивных животных и птицы используют синтетический лизин (моногидрохлорид лизина). Замена синтетического лизина, который в основном импортного производства, на сим-биотические препараты является основной причиной разработки технологии про-

изводства препаратов, которые будучи введенными в желудочно-кишечный тракт продуцируют одну из незаменимых аминокислот - лизин.

Альтернативным подходом к решению проблемы восполнения дефицита незаменимой аминокислоты в рационах кормления бройлеров высокопродуктивных кроссов является использование симбиотических препаратов, которые в тонком отделе кишечника синтезируют достаточное количество необходимого для макроорганизма лизина [183,184].

Листериоз является широко распространенной инфекционной болезнью, наносящей значительный ущерб животноводству, и представляет серьезную угрозу здоровью людей. Сложность борьбы с этой инфекцией обусловлена особенностями биологии ее возбудителя, наличием большого числа как патогенных, так и непатогенных штаммов. Основным источником распространения листериоза являются сельскохозяйственные животные - овцы, свиньи и крупный рогатый скот. Длительное бактерионосительство среди животных приводит к высокому уровню обсеменения листериями пищевого сырья и продуктов его переработки [13, 131, 380]. Экономический ущерб от листериоза связан с большой летальностью, снижением продуктивности животных, абортами, а также затратами на ветеринарно-санитарные ограничительные мероприятия. Листериоз появляется спорадически, реже эпизотически. Летальность при нервных формах может достигать 98 - 100 %,а при септических - 50 % [13, 125]. Листериоз животных зарегистрирован в 82 странах мира, Россия входит в их число [125].

Сальмонеллы патогенны для животных многих видов, в том числе и птиц, но клинически выраженную болезнь обычно вызывают отдельные серологические варианты, адаптировавшиеся к конкретным видам. В неблагополучном по саль-монеллезу хозяйстве заболевает часть молодняка. Большинство же инфицированных молодых и взрослых животных переболевают бессимптомно и остаются длительное время носителями болезни.

Сальмонеллезы имеют большое эпидемиологическое и эпизоотологическое значение, и к настоящему времени науке и практике известны более 1500 их представителей, различных по антигенной структуре. Наиболее часто сальмонел-

лезы регистрируют у свиней. Возбудителями у них в основном являются S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. typhisuis, значительно реже обнаруживают S. gleser, S. dublin, S. Voldagsen.

Важное место в борьбе с сальмонеллезами занимает специфическая профилактика, которую осуществляют инактивированными и живыми вакцинами. С этой целью наиболее эффективны живые вакцины, изготовленные из авирулент-ных штаммов сальмонелл.

Цель и задачи исследований

Цель работы - усовершенствовать промышленную биотехнологию производства сухих живых бактериальных препаратов и оценка их эффективности применения в АПК РФ, на примерах технологии промышленного производства сухих вакцин против листериоза, сальмонеллеза и симбиотического препарата (продуцента лизина).

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

2. усовершенствовать промышленную технологию производства сухих вакцин против листериоза и сальмонеллеза, согласно разработанного алгоритма: оптимизировать составы питательных сред на основе перевара Хоттингера для глубинного управляемого процесса культивирования бактерий; оптимизировать управляемый процесс глубинного культивирования листерий и сальмонелл; оптимизировать защитные среды высушивания, используемые при изготовлении сухих вакцин против листериоза и сальмонеллеза.

оптимизация защитной среды высушивания, используемой для изготовления сим-биотического препарата на основе E.coli; провести доклинические его испытания;

4. изготовить опытно-промышленные образцы препаратов;

5. определить их эффективность применения в бройлерном птицеводстве и животноводстве;

6. разработать нормативную документацию на препараты и освоить их промышленный выпуск.

Научная новизна работы

Разработан единый подход к усовершенствованию промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов. Научно обоснован алгоритм разработки и совершенствования промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов. Эффективность его использования экспериментально подтверждена на сложных биотехнологических моделях. Применение математических методов планирования эксперимента позволило определить оптимальные, с точки зрения накопления листерий, сальмонелл и эшерихий, значения концентраций компонентов питательных сред и параметры управляемого режима культивирования бактерий, оптимизировать состав защитных сред для сублимационного высушивания. С использованием разработанного алгоритма усовершенствована технология промышленного производства вакцин против листериоза (патент РФ № 2053790 от 10.02.96 г., в соавторстве), сальмонеллеза сельскохозяйственных животных (патент РФ № 2129016 от 01.10.96 г., в соавторстве) и симбиотического препарата «Пролизэр» (патент RU № 2450051 от 18.08.2010 г., в соавторстве).

Определены эффективные дозы симбиотика для применения в бройлерном птицеводстве и свиноводстве, разработан способ применения симбиотического препарата «Пролизэр» на основе штамма Е. coli VL - 613 для бройлеров высокопродуктивных кроссов (положительное решение о выдаче патента по заявке № 2012105907RU от 21.02.2012 г.).

Практическая ценность работы

Использование предложенного алгоритма позволяет разрабатывать и усовершенствовать технологию промышленного производства сухих бактерийных препаратов. Использование алгоритма в научных экспериментах и практике позволяет снизить количество опытов, затрат на эксперименты, что ведет к снижению себестоимости разработки технологических процессов и технологии в целом.

Информация о работе

Павленко, Игорь Викторович
доктора технических наук
Кашинцево, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Совершенствование промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов и оценка их эффективности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Совершенствование промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов и оценка их эффективности - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы