Разработка системы высокоплотностного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток

Левенков, Владимир Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка системы высокоплотностного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы высокоплотностного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток"

на правах рукописи

М-

Левенков Владимир Анатольевич

Разработка системы высокоплотностного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток.

03.00.23-Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

на правах рукописи

Левенков Владимир Анатольевич

03.00.23-Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической академии.

Научные руководители:

доктор технических наук

кандидат биологических наук ведущий научный сотрудник

Галынкин

Валерий Абрамович

Миндукшев Игорь Викторович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Яковлева Елена Павловна

Савельев Дмитрий Дмитриевич

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Государственный Технологический институт (технологический университет). (СПбТТИ(ТУ)).

Защита состоится </22 » декабря 2004 года в часов на

заседании диссертационного совета при Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической академии (Россия, 197376, Санкт-Петербург, улица Профессора Попова, дом 14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПХФА.

Автореферат разослан «_

_2004 года

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1. Актуальность темы.

В настоящее время биотехнология является приоритетной наукой, стоящей на стыке микробиологии, биохимии, генетики и других отраслей знаний, способной обеспечить многие насущные потребности человека (продукты питания, лекарственные препараты).

Это тысячелетие будет являться веком биотехнологических инноваций. Благополучие жизни на Земле, развитие и процветание экономики, будут во многом зависеть от отношения государственных структур к биотехнологии как к важнейшей отрасли народного хозяйства.

Актуальной задачей современного производства является повышение его экономической эффективности, что требует системы мероприятий, направленных на оптимизацию различных стадий биотехнологического процесса.

Важнейшим параметром, требующим постоянного контроля при культивировании микроорганизмов, является уровень биомассы. Поэтому оптимизация биотехнологических процессов предусматривает наличие в числе разнообразной контрольно-измерительной аппаратуры анализатора микробных клеток, способного проводить измерения количества биомассы в режиме реального масштаба времени в широком концентрационном диапазоне, не зависящего от физико-химических свойств среды.

Для реализации управляемого биосинтеза, в том числе в режиме высокоплотностного культивирования, требуется непрерывный контроль параметров ферментации, позволяющий оптимизировать способы достижения высокого выхода биологически активного продукта.

Основным приемом, обеспечивающим такую оптимизацию в периодическом культивировании, является введенный в 1973 г. (Yoshida F. et al. 1973) метод fed-batch культивирования (контроль субстратных добавок в периодическом процессе). Предполагается, что субстрат вносится в среду не только в начале, но и по некоторому заранее определенному алгоритму в ходе культивирования. Развитие этого метода дает множество примеров его эффективности, в том числе в режиме высокоплотностного культивирования.

До середины 70-х годов доминирующим являлось мнение о невозможности получения биомассы больше, чем 30-40 г/л. Потребовалось много лет, чтобы понять, что достаточно снять диффузионные ограничения на доставку питательных элементов, убрать токсические продукты через полунепроницаемую мембрану (или не допустить их накопления) и можно достичь выхода биомассы порядка 10% сухого веса на объем, (выше 100г/л). ( Перт С. Дж., 1975)

Реализация режима fed-batch по описанному алгоритму позволила достигнуть значений концентрации клеток выше 100 г/л. Но достижение таких

высоких значений биомассы не является экономической целью. Решающее значение высокоплотностное культивирование приобрело при

культивировании рекомбинантных штаммов продуцентов некоторых БАВ (интерлейкина, интерферона, фактора роста и др.). При этом выход продукта на конечной стадии напрямую зависит от конечной концентрации биомассы.

Таким образом, разработка комплексной системы, способной контролировать процесс ферментации, а также его оптимизировать, является приоритетной. С помощью этой системы можно решать множество задач управляемого биосинтеза. Применение системы, способной контролировать и оптимизировать процесс ферментации, как в научных разработках, так и на производстве позволит оптимизировать способы достижения высокого выхода необходимого продукта.

2. Цели и задачи работы.

Основной целью явилась разработка системы управления ростом дрожжей Saccharomyces cerevisiae в ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток.

При этом были решены следующие задачи.

• Исследования многократного светорассеяния для разработки метода измерения концентрации микробных клеток.

• Разработка газоотделительного резервуара.

• Создание макетного образца анализатора концентрации микробных клеток.

• Создание ферментационной интегрированной системы.

• Адаптация системы для мониторинга дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

• Разработка системы управляемого роста дрожжей на пилотном ферментационном комплексе в режиме высокоплотностного культивирования.

• Изучение возможности внедрения системы в реальном производстве.

3. Научная новизна.

На основе проведенного анализа светорассеяния разработан метод многократного светорассеяния для расчета концентрации микробных клеток, а также разработан и применен алгоритм обработки индикатрис (угловых диаграмм рассеяния света) микробных клеток.

диапазоне от 0.01 до 100 г/л. При высоких значениях концентрации биомассы (от 2 до 100 г/л) фотодетектор, установленный под углом 150°, регистрирует величину интенсивности светорассеяния, которая монотонно возрастает с увеличением биомассы без предварительного разведения и вне зависимости от состава питательной среды.

Для интегрирования анализатора в ферментационный комплекс, был специально разработан и поставлен перед анализатором газоотделительный резервуар.

На созданном ферментационном комплексе проведены исследования закономерностей роста и развития дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Полученные результаты были использованы для разработки алгоритма процесса ферментации, основанного на дозации источника углерода по показаниям датчика парциального давления кислорода (рОг) и поддержания оптимально больших значений удельной скорости роста в пределах 0,2 - 0,3ч"1 на основе показаний лазерного анализатора.

4.Практическая ценность.

Разработана система управляемого роста дрожжей в режиме высокоплотностного культивирования с достижением конечного выхода биомассы 80 г/л дрожжей за 16 ч культивирования (производственные показатели не превышают значения 40 г/л). В качестве обратной связи использовали показания кислородного датчика и показания биомассомера.

Проведенные исследования ферментации дрожжей на пилотном комплексе, а также оценка производственных условий на Санкт-Петербургском Пищевом комбинате, показывают необходимость и возможность оптимизации процесса роста дрожжей при использовании разработанной системы.

Созданный ферментационный комплекс может быть использован для разработки более эффективных способов достижения высоких выходов биотехнологических продуктов и, соответственно, экономически более выгодных процессов культивирования микроорганизмов, а также для решения разнообразных задач управляемого биосинтеза.

5. Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы доложены на Конференции «Молодые ученые-85- летаю академии», Санкт-Петербургская государственная Химико-Фармацевтическая академия, 2004 г. и на втором съезде биотехнологов России, Москва, 2004 г.

Основные результаты диссертационной работы представлены в 5 публикациях.

6. Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 139 страницах печатного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания применяемых

методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, и списка литературы. Работа иллюстрирована 39 рисунками и графиками, 9 таблицами. Список литературы включает 154 источников, из них 134 на иностранных языках.

7. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработка макетного образца анализатора концентрации микробных клеток.

2. Разработка ферментационной интегрированной системы со встроенной газоотделительной камерой.

3. Адаптация системы для мониторинга концентрации биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

4. Система управляемого роста дрожжей на пилотном ферментационном комплексе с интегрированной системой определения концентрации микробных клеток в режиме высокоплотностного культивирования.

5. Отьемно-доливной способ культивирования дрожжей, выращенных при использовании разработанной системы управления.

6. Исследование возможности внедрения системы в реальном производстве.

8. Объекты и методы исследований.

Биологическим объектом исследований послужили дрожжи пекарские Saccharomyces cerevisiae (производственный штамм АВ-7). Эксперимент проводили в ферментационном комплексе. В состав комплекса входят ферментатор "BioStat" (ФРГ), АЦП-система сбора данных, компьютер Pentium Pro. Ферментатор "BioStat" снабжен датчиками температуры, р Н , термостатом, автоматической системой поддержания рН и уровня пены, блоком подачи растворов, воздушными фильтрами, первичной системой регистрации данных, системой установки и поддержания числа оборотов мешалки. Общий объем ферментатора 2 литра. Рабочий объем 1.8 литра.

Для исследований был использован электрохимический датчик разработанный в лаборатории прикладной микробиологии Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург). Существенным отличием этого датчика является его низкое входное сопротивление (10 кОм). Поэтому на этапе исследований его подключение возможно на любых типах вольтметров и не требует постановки первичного преобразователя непосредственно около ферментера.

Для проведения культивирования в ферментаторе BioStat использовали питательную среду следующего состава (г/л):

Глюкоза -5, дрожжевой экстракт -5, NaCl -1, КС1 -1, MgSO4 - 1, NH4HPO4- 5, вода питьевая - до 1200 мл.

В процессе ферментации поддерживали следующие технологические параметры.

Температура: 28°С. Начальная скорость работы мешалки: 400 об/мин. При большом уровне пены в начале ферментации, можно начинать процесс с 300 об/мин. Скорость расхода воздуха: 0.2 л/мин.

Подачу стерильного раствора глюкозы осуществляли на основании показаний датчиков, рН и показаний анализатора концентрации клеток.

Измерение концентрации микробных клеток в процессе ферментации проводили с помощью лазерного анализатора концентрации микробных клеток ЛАСКА разработанного на основе лазерного анализатора микрочастиц.

Лазерный анализатор микрочастиц «ЛАСКА-1 К» предназначен для измерения угловой диаграммы рассеяния лазерного света (в дальнейшем индикатриса) от микрочастиц широкого класса природных (в том числе биологических) и технических материалов после переведения их в суспензию или непосредственно без пробоподготовки в соответствии с методикой выполнения измерений. На основании данных индикатрисы численными методами проводится определение распределения частиц по размерам -гранулометрический анализ.

Область применения анализатора: лабораторный и технологический контроль объектов в химико-фармацевтической, пищевой, нефтехимической промышленности, в медицинской диагностике, и в научных исследованиях.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка лазерного анализатора концентрации микробных клеток

в режиме реального времени.

Ключевым параметром в контроле, регулировании и оптимизации микробиологических процессов является непрерывный контроль концентрации биомассы в биореакторе.

На основе серийно-выпускаемого анализатора микрочастиц ЛАСКА-1К разработан опытный образец лазерного анализатора, способного вести непрерывный контроль концентрации биомассы в диапазоне 0.01 - 100 г/л в режиме реального времени с системой сбора данных и последующим выводом полученных результатов на компьютер. В составе анализатора применяется специально разработанная проточная измерительная ячейка, которая помещается в специальное кюветное отделение.

универсального характера, так как регистрация интенсивности светорассеяния основывалась на использовании одного выбранного угла, и поэтому имела ограниченный диапазон в концентрации биомассы. Проведенные нами исследования пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae показали, что в зависимости от угла регистрации интенсивность светорассеяния пропорциональна плотности биомассы в разном диапазоне значений. Для малых углов регистрации до 10 градусов (фотодатчик 1 и 2) наблюдается колоколообразный характер зависимости интенсивности светорассеяния от концентрации биомассы в диапазоне концентрации биомассы от 0.01 г/л до 0.2 г/л. При более высоких значениях плотности биомассы, возникает эффект многократного светорассеяния, и значения интенсивности светорассеяния в малых углах уменьшаются. Наоборот, в дальних углах интенсивность светорассеяния значительно увеличивается при повышении плотности культуры. При выбранной конфигурации расположения датчиков в разных углах возможно перекрытие всей области возможной концентрации биомассы (датчики установлены под углами: 0°, 8°, 30°, 150°.) (Рис.1).

фотодетекторы

30°

Рис. 1 Расположение датчиков в приборе.

Рис. 2. Зависимость интенсивности света в разных углах регистрации от логарифма концентрации дрожжей.

Математическая обработка данных анализатора позволяет измерять биомассу в диапазоне 0.01 - 100 г/л. (Рис. 2).

Предварительно проводится градуировка прибора с использованием взвеси микробных клеток определенного вида с известной концентрацией. После этого, при работе с неизвестной пробой (содержащей клетки того же вида, по которому проводилась калибровка), можно рассчитать их концентрацию.

Реализация предлагаемого метода продемонстрирована при мониторинге дрожжей Saccharomyces сегеу1$1ав. В случае применения устройства для определения концентрации других видов микробных клеток, представленные калибровки некорректны в силу того, что средний размер клеток будет иной. В этом случае для каждого вида клеток проводится своя калибровка, которая далее хранится в памяти электронно-вычислительной системы и, соответственно, выбирается при работе с этим видом клеток.

2. Интеграция анализатора в ферментационный комплекс.

Для проведения исследования на пилотной установке, разработанный анализатор «ЛАСКА» был интегрирован в ферментационный комплекс.

• Разработка газоотделительного резервуара.

Вследствие того, что поступающая в проточную измерительную ячейку клеточная суспензия, отбираемая из биореактора, должна быть отделена от содержащихся в ней пузырей, был разработан газоотделительный резервуар, который в последствии был интегрирован в анализатор.

Рис.3. Схема системы с газоотделительным резервуаром (пояснения в тексте).

Сущность работы системы отделения пузырей представлена на рис 3. Клеточную суспензию отбирают из биореактора 1 и по трубке 2 передают в газоотделительный конусообразный резервуар 3. В резервуаре установлены датчики уровня: датчик нижнего уровня 4а и датчик верхнего уровня 46. Сигналы с датчиков поступают на электронный контролер уровня 5. Электронный контроллер автоматически устанавливает скорость прокачки насоса 6 так, чтобы уровень заполнения резервуара находился между нижним и верхним датчиками уровня. В газоотделительном резервуаре пузыри газа поднимаются вверх, отделяются из жидкости и далее отводятся с воздушным потоком, минуя проточную ячейку. Суспензионная жидкость, из которой удалена газовая фаза, поступает в проточную измерительную ячейку 7. После прохождения ячейки, поток суспензии соединяется с газовым потоком и возвращается в биореактор. Вся система магистралей, включающая проточную ячейку, является замкнутой Это позволяет стерильно отбирать пробу и возвращать обратно в биореактор без изменений, что особенно важно при проведении ферментации

Комплекс обслуживается специальной программой, позволяющей:

• автоматически градуировать анализатор «ЛАСКА» для расчета концентрации микробных клеток;

• непрерывно регистрировать в реальном масштабе времени измеряемые параметры ферментации (рН, рО2 и пр.),

• проводить расчет основных показателей ферментации (удельная скорость роста, дыхательный коэффициент, материальный баланс и пр.);

• вести протокол ферментации.

Рис. 4. Специальное программное обеспечение.

• Сравнение показаний лазерного анализатора с результатами весового метода определения концентрации микробных клеток.

Были проведены исследования по сравнению показаний концентраций микробных клеток лазерным анализатором «ЛАСКА» и традиционным весовым методом на примере ферментации пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в солевой среде с глюкозой. Показана динамика датчиков рН, рО2 и расчетная динамика плотности биомассы (анализатор и весовой метод).

Результаты проведенных опытов (рис.5) показывают совпадения данных, полученных с помощью лазерного анализатора и весовым методом (относительная погрешность данных не превышает 5%).

Рис.5 Протокол эксперимента культивирования дрожжей S. ceгevisiae в солевой среде с глюкозой.

3. Разработка системы управляемого роста дрожжей на пилотном ферментационном комплексе с интегрированной системой определения концентрации микробных клеток в режиме высокоплотностного культивирования.

Были проведены исследования культивирования пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae с использованием пилотного ферментационного комплекса с интегрированным анализатором «ЛАСКА». Начало процесса проводили в режиме обычного периодического культивирования, который сменялся fed-batch стадией (распределенной подачи), при этом уровень биомассы достигает 80 г/л. Регуляция осуществлялась через рО2 -контрольную петлю путем вариации в подаче глюкозы. Необходимым условием было поддержание уровня растворенного кислорода в среде не ниже 20%, так как в противном случае при низких уровнях кислорода даже оптимизация подачи субстрата не позволяет избежать накопления этанола, ацетата и др. органических кислот в среде (эффект Пастера).

Среди параметров, отражающих кинетику роста дрожжей на сахаросодержащей среде, наиболее информативными являются значение рО2 , определяемое с помощью мембранного датчика, и концентрация биомассы, определяемая с помощью лазерного анализатора.

Было отмечено, что исчерпание субстрата в среде приводит к резкому снижению интенсивности дыхания (субстратный контроль дыхания) и, следовательно, к быстрому повышению уровня рО2 Такое исчерпание субстрата соответствует содержанию в среде углеводов менее 0.1 г/л, что позволяет точно знать, когда необходимо произвести добавку питательного вещества, в нашем случае - это добавки глюкозы.

Би-кЛРОг

Рис.6 Поведение измерительной системы "датчик р(>2 - ферментер" при различных режимах введения субстрата 8.

На рис.6 показано кинетическое поведение измерительной системы "датчик рО2 - ферментер". После начальной добавки субстрата наблюдается снижение величины рОг, и при достижении концентрации глюкозы менее ОД г/л система приобретает чувствительность к субстрату. Если добавки субстрата в этот момент не происходит, наблюдается резкое падение удельной интенсивности дыхания до 20 М О2 (Г. МИН), ЧТО И определяет повышение уровня рО2 . (На рис.6 прерывистая кривая.)

Это состояние при ферментации определяется как критический режим. Увеличение времени пребывания клеток в этом состоянии (при 8~0) приводит к увеличению времени релаксации после добавки глюкозы до нескольких часов. Естественно, такой режим не допустим в процессе управления.

С другой стороны, если компенсационная величина концентрации субстрата 8Н будет очень большой, то наблюдается замедление и, даже, остановка роста, что связано с тем, что избыточный поток данного субстрата вызывает накопление органических кислот и спирта в среде, останавливающих рост.

Рассматривая метаболическую модель дрожжей 5ассЪаготусг$ сегечЫаг, разработанную Холлом и сотр., обращали внимание на то, что в условиях достижения высоких удельных скоростей роста, требующих высокого потока субстрата, активность ферментов брожения (глутаматдегидрогеназа,

алкогольдегидрогеназа) сильно увеличивается, а активность ферментов дыхания (малатдегидрогеназа и изоцитратлиаза) значительно снижается. В этих условиях наблюдается накопление в среде таких продуктов как ацетат, лактат, пируват, сукцинат, пропионат, изобутират и этанол. Для такого роста введен специальный термин - "аэробный рост с образованием сопутствующих продуктов" (Andersen K.B. et al. 1980). (В условиях лимитирования кислородом накопление этих органических кислот и этанола еще больше). Так продукция ацетата (и соответственно этанола) вызвана тем, что наблюдается феномен "переливания", когда ацетил-КоА возвращается из цикла Кребса в виде ацетил-фосфата, а ацетат образуется в реакции субстратного фосфорилирования со стехиометрией 1 моль АТФ на 1 моль ацетата. Накопление органических кислот в среде способствует внутриклеточному закислению. При этом важным параметром является рН среды, так как обратное проникновение слабых кислот в клетку проходит в протонированной форме. В этих условиях клетка будет испытывать кроме влияния на метаболизм проникающей кислоты и кислотную нагрузку, приводящую к снижению внутриклеточного рН (pHt) и последующей остановки роста. По этим признакам и рО2 следует отнести к группе веществ, влияющих на рН (pHi).

Таким образом, система "датчик рО2 - ферментер" сохраняет управляемость в определенном диапазоне концентраций. Динамическое поведение системы представлено колебательной кривой. Диапазон варьирования АрО2 определяет величину разовой дозы вносимого субстрата Sn и в конечном итоге определяет среднюю концентрацию глюкозы в среде.

Зная оперативные показания концентрации биомассы в режиме реального времени, можно рассчитать количество необходимой добавки субстрата (глюкозы) для оптимального роста и развития микроорганизмов.

В исследованиях количество биомассы оценивали с помощью лазерного анализатора. Все записи проводили в режиме реального времени и выводили на монитор компьютера.

Голландские исследователи (P.V. Hoek, 1998) показали, что удельная скорость роста является ключевым параметром управления в

индустриальном производстве пекарских дрожжей. При удельной скорости роста ниже 0.28 ч"1 метаболизм глюкозы полностью аэробный, и в среде не накапливается этанол. При более высоких значениях удельной скорости роста наблюдается накопление этанола в среде (при D = 0.40 ч скорость образования этанола - 14 М этанола/г.биомассы.час). Возможность утилизации этанола также зависит от протока, при D=0.025 ч 10 mM этанола/г.биомассы.час, при Б=0.28ч - 20 тМ этанола/г.биомассы.час. Дальнейшее увеличение протока (D = 0.40 ч) приводит к несущественному увеличению скорость утилизации этанола (22 тМ этанола/г.биомассы.ч.) При этом оптимальные значения удельной скорости роста дрожжей на углеводном субстрате. (0.2-0.3)ч'\

Исходя из этого, основной трудностью остается только расчет добавки субстрата, обеспечивающей 0,2 - 0,3 (ч) удельной скорости роста. Скорость подачи субстрата ms(t) (г/ч) вычисляли по следующему уравнению:

щ (0 = + МЕ )XFVF exp{fisei (t - tF)) (1)

где Ys — экономический коэффициент (г/г), коэффициент поддержания (г г"1 ч"1), XF, Vp -- концентрация биомассы и рабочий объем ферментера в момент времени - устанавливаемое значение удельной скорости роста. Из всех

величин, входящих в уравнение, только текущая концентрация биомассы требует оперативного контроля (достаточно легко оперативно определяется).

Вышеописанный алгоритм позволил реализовать режим fed-batch с достижением значений концентрации клеток дрожжей 80 г/л, примерно за 16 -17 ч (заводские показатели не превышают значения 40 г/л).

На рис. 7 показан пример реализации описанной технологии для Saccharomyces cerevisiae. Процесс включает две фазы. Вначале реализуется обычное периодическое культивирование (Batch). После исчерпания глюкозы (S), система переводится в режим субстратной подпитки и после популяционной адаптации, устанавливается значение удельной скорости роста (в среднем)

В отличие от датчика рН, наблюдается быстрый и оперативный ответ датчика рО2 (рис.7) на добавку субстрата.

В результате выход дрожжей составил 80 г/л за 17 ч при экономическом коэффициенте 0.7.

В начале процесса культивирования и на его протяжении с интервалом 2 часа отбирали пробы с последующим их микрокопированием.

Определение индекса популяции. Таблица 1,

Клетки, %

Проба № Время ферментации (ч) мертвые делящиеся

1 0 20 2

2 2 21 12.4

3 4 19.7 13

4 6 21 24

5 8 11.2 33.4

6 10 9 38

7 12 9.6 42

8 14 9.2 39

Результаты (табл. 1, рис. 7) свидетельствуют о том, что, оперируя двумя параметрами - показаниями кислородного датчика в комплексе с показаниями биомассомера, можно контролировать и управлять процессом и, соответственно, оптимизировать получение конечного продукта.

{—-рР2 — рН ■*— МбиоваосьигМ«жС1ГДЮютьиг 1

Рис. 7. Культивирование дрожжей на сахаросодержащей среде.

• Отъемно-доливной способ культивирования дрожжей Sacchaгomyces ceгevisiae.

Проведены исследования культивирования пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae на пилотном ферментационном комплексе с интегрированным анализатором ЛАСКА, при достижении необходимого количества биомассы производили отлив части культуральной жидкости с последующим доливом равного объема питательной среды.

Процесс проводили по вышеописанному алгоритму с достижением значений концентрации клеток дрожжей 80 г/л за 16 ч. Отъем разного количества культуральной жидкости с последующим доливом стандартной питательной среды проводили при одинаковом состоянии клеточной биомассы, которая находилась в стадии экспотенциального роста с оптимальными значениями удельной скорости роста \i-0.2- 0.3 ч _1.

Была проведена серия опытов, в которых после достижения значения концентрации биомассы 80 г/л, был произведен отлив культуральной жидкости в объеме от 20% до 60% от основного объема с доливом равного объема питательной среды.

Оптимальные результаты были получены при отливе культуральной жидкости в объеме 20% от основного объема (рис. 8). Результатом проведенных

экспериментов стало достижение биомассы 10 г за 2 ч, с удельной скоростью роста, равной 0.23-0.25 ч.

Экономическая эффективность.

В наших опытах использовался алгоритм, который позволил реализовать режим fed-batch с достижением концентрации клеток дрожжей 80 г/л, примерно за 16 - 17 ч (заводские показатели не превышают значение 40 г/л). Экономический коэффициент составлял 0.6 - 0.7 (теоретически возможный при росте дрожжей на глюкозе равен 0.8). Заводские показатели по экономическому коэффициенту составляют значения ~ 0.3.

Проведенные исследования ферментации на пилотном ферментационном комплексе доказывают возможность оптимизации процесса роста дрожжей при использовании разработанной системы, которая может оказаться полезной на производстве для контроля и оптимизации процессов роста микроорганизмов.

Культивирование дрожжей (отъем но-доливыой способ}.

|-р02-РН-СЛп[

2 3 4 5

7 S 9 10 11 12 13 14 15 18 17 18

С (г/л) - концентрация биомассы.

Рис. 8. Культивирование дрожжей Sacchaгomyces ceгevisiae (отъемно-доливной способ).

Исследование возможности внедрения системы в реальном производстве.

Известно, что для реализации распределенной подачи субстрата существенным условием является необходимость поддержания достаточного уровня кислорода в среде (не ниже 20%), так как в противном случае, при низких уровнях кислорода, даже оптимизация подачи субстрата не позволяет избежать накопления этанола, ацетата и других органических кислот в среде (эффект Пастера). Поэтому были проведены исследования профиля кислорода по высоте ферментера и его динамики в реальных условиях производства с использованием электрохимического датчика рО2 (Пищевой комбинат, Санкт-Петербург)

Рис.9 Профиль кислорода в зависимости от глубины 200м аппарата в процессе культивирования (2, 5, 16 ч). Отсчет глубины начинается от барботера.

Исследования профиля кислорода по глубине в процессе культивирования (рис.9) позволяют обосновать оптимальную точку стационарного установления датчика кислорода. Оптимальным представляется постановка датчика на глубине 4 м (на уровне 2 этажа): в первые часы ферментации (при небольшом расходе воздуха) на этой глубине датчик дает более адекватную информацию о возможном лимитировании по кислороду, в конце же ферментации данные по глубине не сильно различаются, но в более высоких слоях возможно образование пены, что приводит к превышению данных по кислороду.

Проведенные исследования показывают целесообразность проведения мониторинга кислорода в 200 м3 аппаратах на глубине 4 метра.

Динамики кислорода при выращивании дрожжей.

После выбора оптимальной точки постановки датчика была начата работа по регистрации динамики рО2 во время ферментации.

Уровень рО2 в аппарате не опускается ниже лимитирующих рост значений (<20%), что позволяет оптимизировать режимы как по расходу воздуха, так и по подаче мелассы.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана система управляемого роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae в режиме высокоплотностного культивирования с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток.

2. Показана возможность применения метода многократного светорассеяния для определения концентрации клеток.

3. На основе серийно-выпускаемого анализатора микрочастиц разработан опытный образец лазерного анализатора, способного, вести непрерывный контроль концентрации биомассы в диапазоне 0.01 - 100 г/л. с системой сбора данных и последующим выводом полученных результатов на компьютер (в состав входит специальная проточная ячейка, специальный электронно-вычислительный блок).

4. Разработан газоотделительный резервуар, позволяющий подавать освобожденную от газовой фазы суспензию клеток в измерительную ячейку анализатора.

5. Анализатор интегрирован в ферментационный комплекс, который обслуживается специальной программой, позволяющей непрерывно регистрировать и проводить расчет основных показателей биотехнологического процесса. Вся система магистралей, включающая проточную ячейку является замкнутой, что позволяет стерильно отбирать пробу и возвращать обратно в биореактор без изменений.

6. Разработан алгоритм высокоплотностного культивирования, основанный на дозации источника углерода по показаниям датчика парциального давления (рО2 ) и поддержании оптимально больших значений удельной скорости

роста в пределах 0,2 -0,3 ч, оперируя показаниями лазерного анализатора. Способ позволяет получить до 80 г/л биомассы за 16 ч культивирования.

7. Показана возможность применения отъемно-доливного способа культивирования дрожжей, выращенных при использовании разработанной системы управления.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Миндукшев И. В., Аверьянов А. В., Филиппов А. К, Левенков В. А., Галынкин В. А. Технологический мониторинг парциального давления кислорода при ферментации пекарских дрожжей. Тез. 1-ый Международный Конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития»., Москва, 14-18 октября 2002г. с 212.

2. Левенков В. А., Миндукшев И.В., Джагацпанян И. Э., Галынкин В. А., Никаноров П.С. Определения концентрации микробных клеток в on-line режиме с помощью лазерного анализатора микрочастиц ЛАСКА. Материалы международной научно-практической конференции посвященной 85-летию Химико-ФармацевтическвиАкадеми», январь 2004 г.

3. Левенков В. А., Миндукшев И.В., Джагацпанян И. Э., Галынкин В. А., Никаноров П.С. Контроль концентрации микробных клеток в режиме реального времени с помощью лазерного анализатора «ЛАСКА». Материалы второго съезда общества биотехнологов России., Москва 13-15 октября 2004 г. с144.

4. Миндукшев И.В., Джагацпанян И.Э., Левенков В.А. Способ непрерывного определения концентраций микробных клеток и устройство для его осуществления. Патент RU №2004122611, МКИ: G01N 015/02.

5. Миндукшев И.В., Джагацпанян И. Э., Никаноров П.С., Левенков В. А., Галынкин В. A. ON-LINE анализатор мониторинга биомассы в ферментационных системах - «ЛАСКА-БИОТЕХ», предпосылки управляемого биосинтеза. Международная научно-практическая конференция, посвященная 85-летию Химико-ФармацевтическввиАкадемшч, 2004 г. с 306-311.

Левенков Владимир Анатольевич

Разработка системы высокоплостностного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток.

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛР № 021251 от 23.10.97. Сдано в набор 05.11.04. Подписано к печати 12.11.04. Формат 60x90 Vl6. Бумага тип. Гарнитура Тайме. Тираж 100 экз. Заказ 529 Санкт-Петербургская государственная х имико-фармацск ая академия. Издательство СПХФА—член Издательско-полиграфической ассоциации вузов Санкт-

Петербурга,

197376, С.-Петербург, ул. Профессора Попова, 14

»236 0 0

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Левенков, Владимир Анатольевич

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Приборы и методы, используемые для оценки количества микробных клеток.

1.2 Особенности культивирования дрожжей ЗассЬагошусез сегеу1з1ае.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Биологический объект исследований.

2.2 Оборудование для проведения ферментации.

2.3 Описание технологического процесса.

2.4 Лазерный анализатор ЛАСКА - 1К.

Глава 3. РАЗРАБОТКА ЛАЗЕРНОГО АНАЛИЗАТОРА МОНИТОРИНГА КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК И ЕГО ИНТЕГРАЦИЯ В

КОМПЛЕКСНУЮ СИСТЕМУ «ЛАСКА-БИОТЕХ».

3.1 Разработка газоотделительного резервуара.

3.2 Отработка системы расположения датчиков в приборе.

3.3 Градуировка анализатора.

3.4 Интеграция анализатора в ферментационный комплекс. 85 3.4.1 Применение специального программного обеспечения.

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЯ РОСТА ДРОЖЖЕЙ НА ФЕРМЕНТАЦИОННОМ КОМПЛЕКСЕ С ИНТЕГРИРОВАННЫМ

АНАЛИЗАТОРОМ «ЛАСКА-БИОТЕХ».

4.1 Управление процессом через рОг-контрольную петлю совместно с показаниями лазерного анализатора.

4.2 Отъемно-доливной способ культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЯ В РЕАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ ПРОИЗВОДСТВА.

5.1 Исследование профиля кислорода по высоте ферментера в реальных условиях производства.

5.2 Оценка динамики содержания кислорода при выращивании дрожжей в реальных условиях производства.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ. 121 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка системы высокоплотностного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток"

1. Актуальность темы.

Во всем мире биотехнология в настоящее время является приоритетной наукой. Развитие этой науки, стоящей на стыке микробиологии, биохимии, генетики и других отраслей знаний, способно обеспечить многие насущные потребности человека.

Это тысячелетие будет являться веком биотехнологических инноваций. Благополучие жизни на Земле, развитие и процветание экономики, как мировой, так и отдельных государств, будут во многом зависеть от отношения государственных структур к биотехнологии не как к лозунгу -"Биотехнология - приоритетное направление развития экономики", а как к важнейшей отрасли народного хозяйства, и подкрепляться не лозунгами, а конкретными делами.

Важнейшей задачей современного производства является повышение его экономической эффективности, биотехнологическая промышленность здесь не является исключением.

В принципе такую задачу нельзя решать одинаково на разных предприятиях, и если и существуют сходные подходы и решения, то это целая система мероприятий, направленных на оптимизацию различных стадий биотехнологического процесса.

Именно создание "систем" технологического контроля является главным направлением в развитии современных производств.

В связи с тем, что конкуренция на этом рынке растет с каждым днем, перед отечественным производителем возникла необходимость в повышении качества выпускаемого продукта и, одновременно, снижения его себестоимости за счет управления и, соответственно, оптимизации технологических процессов.

Оптимизация биотехнологических процессов возможна только при наличии хорошо оснащенной контрольно-измерительной системы ферментационного блока. Наряду с традиционно используемыми датчиками, такими как датчики рН и температуры, перед разработчиками встает вопрос о необходимости иметь в составе ферментационного комплекса анализатор микробных клеток, способный проводить измерения количества биомассы в режиме реального масштаба времени в широком концентрационном диапазоне, не зависящем от физико-химических свойств среды, так как этот параметр является важнейшим при культивировании клеток микроорганизмов.

Для реализации управляемого биосинтеза, в том числе и методом высокоплотностного культивирования требуется непрерывный контроль различных параметров, в том числе р02 и биомассы в ферментере. В настоящее время концентрацию биомассы, в основном, измеряют off-line, что, в свою очередь влияет на качество производственного процесса. (Mallette 1969; Harris and Kell 1985). Оперативный контроль биомассы позволит оптимизировать разработку способов достижения высокого выхода необходимого продукта.

Основным приемом, обеспечивающим такую оптимизацию в периодическом культивировании, является метод fed-batch cultivation (контроль субстратных добавок в периодическом процессе) (F. Yoshida et al. 1973).

Предполагается, что субстрат вносится в среду не только в начале, но и по некоторому (заранее определенному) алгоритму в ходе культивирования. Последующие четверть века развития этого метода дали множество примеров его эффективности. Метод находит все большее применение при оптимизации процессов биосинтеза ряда продуктов, прежде всего в режиме высокоплотностного культивировании.

До середины 70-х годов доминирующим являлось мнение о невозможности получения биомассы, больше чем 30-40 г/л. В биотехнологии было введено понятие высокоплотностного ингибирования роста. Еще в 1929 г. была постулирована идея о жизненном или биологическом пространстве (С. Дж. Перт. 1978 стр.24). Потребовалось много лет, чтобы понять, что малый выход биомассы, на самом деле, был связан с малыми знаниями в биотехнологии. Следует отметить заслугу С.Дж. Перта, который в 1975 году нашел убедительные слова для опровержения идеи запрета роста с увеличением плотности среды. Достаточно снять диффузионные ограничения на доставку питательных элементов, убрать токсические продукты через полупроницаемую мембрану (или не допустить их накопления) и можно достичь выхода биомассы около 10% сухого веса на объем (выше 100г/л).

Реализация режима fed-batch по определенному алгоритму позволило получить концентрацию клеток выше 100 г/л. Но достижение таких высоких значений биомассы не является экономической целью. Решающее значение высокоплотностное культивирование приобрело при культивировании рекомбинантных штаммов продуцентов интерферона, интерлейкина, факторов роста и т.д. При этом выход продукта на конечной стадии напрямую зависит от конечной концентрации биомассы.

Таким образом, разработка комплексной системы, способной контролировать процесс ферментации, а также его оптимизировать, является приоритетной. С помощью этой системы можно решать множество задач управляемого биосинтеза. Применение системы, способной контролировать и оптимизировать процесс ферментации, как в научной среде, так и на производстве позволит оптимизировать способы достижения высокого выхода необходимого продукта.

-72. Цели и задачи работы.

Основной целью явилась разработка системы управления ростом дрожжей БассЬаготусез сегеу1з1ае в ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток.

При этом были решены следующие задачи.

• Разработка газоотделительного резервуара.

• Создание макетного образца анализатора концентрации микробных клеток.

• Создание ферментационной интегрированной системы.

• Адаптация системы для мониторинга дрожжей 8асс11аготусе8 сегеу1з1ае.

• Изучение возможности внедрения системы в реальном производстве.

3. Научная новизна.

На основе серийно-выпускаемого анализатора микрочастиц ЛАСКА-1К разработан опытный образец лазерного анализатора, способный проводить измерения концентрации микробных клеток в реальном масштабе времени. Доказано, что выбранная конфигурация расположения датчиков в разных углах (датчики установлены под углами: 0°, 8°, 30°, 150°.) дает возможность перекрытия всей возможной области концентрации биомассы, а именно, в диапазоне от 0.01 до 100 г/л. При высоких значениях концентрации биомассы (от 2 до 100 г/л) фотодетектор, установленный под углом 150°, регистрирует величину интенсивности светорассеяния, которая монотонно возрастает с увеличением биомассы без предварительного разведения и вне зависимости от состава питательной среды.

Полученные результаты были использованы для разработки алгоритма процесса ферментации в режиме отъемно-доливного и высокоплотностного культивирования, основанного на дозации источника углерода по показаниям датчика парциального давления кислорода (рСЬ) и поддержания оптимально больших значений удельной скорости роста в пределах 0,2 - 0,3 ч"1 на основе показаний лазерного анализатора.

4.Практическая ценность.

Проведенные исследования ферментаций дрожжей на пилотном комплексе, а также оценка производственных условий на Санкт-Петербургском Пищевом комбинате, показывают необходимость и возможность оптимизации процесса роста дрожжей при использовании разработанной системы.

5. Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы доложены на Конференции «Молодые ученые-85- летию академии», Санкт-Петербургская государственная Химико-Фармацевтическая академия, 2004 г. и на втором съезде биотехнологов России, Москва, 2004 г.

Основные результаты диссертационной работы представлены в 5 публикациях.

6. Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 138 страницах печатного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания применяемых методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, и списка литературы. Работа иллюстрирована 39 рисунками и графиками, 9 таблицами. Список литературы включает 153 источников, из них 134 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Левенков, Владимир Анатольевич

ВЫВОДЫ.

1. Разработана система управляемого роста дрожжей БассЬаготусез сегеу151ае на пилотном ферментационном комплексе с интегрированной системой определения концентрации микробных клеток в режиме высокойлотностного культивирования.

3. На основе серийно-выпускаемого анализатора микрочастиц разработан опытный образец лазерного анализатора, способного вести непрерывный контроль концентрации биомассы в диапазоне 0.01 - 100 г/л. с системой сбора данных и последующим выводом полученных результатов на компьютер (в состав входит специальная проточная ячейка, специальный электронно-вычислительный блок).

5. Анализатор интегрирован в ферментационный комплекс, который обслуживается специальной программой, позволяющей непрерывно регистрировать и проводить расчет основных показателей биотехнологического процесса. Вся система магистралей, включающая проточную ячейку, является замкнутой, что позволяет стерильно отбирать пробу и возвращать обратно в биореактор без изменений.

6. Разработан алгоритм высокоплотностного культивирования, основанный на дозации источника углерода по показаниям датчика парциального давления (рОг) и поддержании оптимально больших значений удельной скорости роста в пределах 0,2 -0,3 ч"1, оперируя показаниями лазерного анализатора. Способ позволяет получить до 80 г/л биомассы за 16 ч культивирования. 7. Показана возможность применения отъемно-доливного способа культивирования дрожжей, выращенных при использовании разработанной системы управления.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Миндукшев И. В., Аверьянов А. В., Филиппов А. Н., Левенков В. А., Галынкин В. А. Технологический мониторинг парциального давления кислорода при ферментации пекарских дрожжей. Тез. 1-ый Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития»., Москва, 1418 октября 2002г. с 212.

2. Левенков В. А., Миндукшев И.В., Джагацпанян И. Э., Галынкин В. А., Никаноров П.С. Определения концентрации микробных клеток в on-line режиме с помощью лазерного анализатора микрочастиц ЛАСКА. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию Химико-Фармацевтической Академии, январь 2004 г.

3. Левенков В. А., Миндукшев И.В., Джагацпанян И. Э., Галынкин В. А., Никаноров П.С. Контроль концентрации микробных клеток в режиме реального времени с помощью лазерного анализатора «ЛАСКА». Материалы второго съезда общества биотехнологов России, Москва 13-15 октября 2004 г. с144.

5. Миндукшев И.В., Джагацпанян И. Э., Никаноров П.С., Левенков В. А., Галынкин В. А. ON-LINE анализатор мониторинга биомассы в ферментационных системах - «ЛАСКА-БИОТЕХ», предпосылки управляемого биосинтеза. Международная научно-практическая конференция, посвященная 85-летию Химико-Фармацевтической Академии, 2004 г. с 306-311.

включения лазера

Панель управления

Рис. I I. Внешний вид анализатора «ЛАСКА» (вид слева).

1. Лазерный диод (670 нм)

2. Кюветное отделение

3. Кювета.

4. Линейка фотодиодов (малые углы рассеяния)

5. Фотодиоды (большие углы рассеяния)

6. Микропроцессорный контроллер

7. Панель управления

Рис.12. Структурная схема анализатора.

Источник света анализатора - лазерный диод работает в непрерывном режиме со стабилизацией интенсивности излучения. Излучение лазерного диода фокусируется на апертуру фотодиода пропускания, соответствующей линейки фотодиодов. Между фокусирующей линзой и измерительной кюветой располагается диафрагма, задающая площадь освещенной зоны в кювете с магнитной мешалкой. Привод мешалки обеспечивает вращение волчка в кювете. (Рис.12).

Индикатриса рассеяния лазерного пучка, прошедшего через измерительную кювету регистрируется линейкой фотодиодов. Линейка состоит из 32 фотодиодов.

Первый фотодиод в линейке является фотодетектором пропускания, остальные 31 фотодиодов являются фотодетекторами индикатрисы.

Фотодиоды пропускания в каждом анализаторе имеют угловую координату О градусов.

Угловые координаты фотодиодов рассеяния даны в паспорте и внесены в программное обеспечение к каждому анализатору.

После первичного аналогового преобразования блоком предусилигелей, электрические сигналы от фотодиодов поступают на плату АЦП и микроконтроллер и далее на выходной разъем и на блок индикации. Прибор подключается к компьютеру посредством, находящегося в комплекте поставки, кабеля. Прибор подключается к одному из разъемов последовательного интерфейса типа RS-232C (COMI, СОМ2, СОМЗ или СОМ4). Этот разъем обычно расположен на задней стенке компьютера.

Ниже представлен пример записи динамики изменения интенсивности светорассеяния в разных углах регистрации при добавлении сухого порошка в кювету с включенной мешалкой Рис.13.

27 23,12й Л

ЧР ПЛ^КА 32 (прибор НЕ но свя.!м| (Окно крмвьм намерений № 4 1JJ

НПО

Координаты маркеров fWK4H | nü шпсА КДОЬМ

Мцкер№1 x-7*ai 1JКривая! Y=84.19

Y*6G.47

J¡ SfMBÍflJ

Y 96 Y-tt.56 V.16.65

IttHMat y-iaw 7

Y-15.36 в] Koueas 6

Y-9.627

Э1КЦНЫЯЭ V-7.4S9

УАЗМ HIKpHmtlI

Y-S.2M 12) K|№w 12

Y-3.129 13(Крмиа13

3.522 ШКоння 14 YJ.Offi

Ц1У--J ff Файл Bvn Pecv Иэг-ирения и *>■: Текст Окна Пймсщ*

-Iffl »1

Рис.13. Динамика изменения интенсивности светорассеяния в разных углах. и пример представления гранулометрического анализа образца, реализованного в программном модуле анализатора. Рис.14.

I частиц по диаметрам

Исходные константы и параметры исполин»»« олгчжов ■

11 .1 Ъ5 Л5,Б,6 5,7.75,8,а 5.5.8.5

Ко&ФЧМШЧНГ рйС*Г4 НтйАМЛ ДОЛврСШ К^ » 10 / Кодпестгошг-ипопоиодАнамггрй гп&хр *

0. г [1 о

I Инамлтрис* |

Результаты расчета

Лйшгчаспш

Щ 0.00405 1.433

7025 сил 001ВЗ 1.7Д

65ЙЭ Н№ <19776 1 765

Свеян*** йиаметр иктт ым Б 633

4 250; 0г -5.5«; Озд .6 50С, О^ -7. ИВ; Й^-вШ

БКО- 174.0

Отчят

Рис. 14. Пример гранулометрического анализа.

Прибор комплектуется оптическим образцом работоспособности (ОПР). ОПР используется при калибровке прибора, процедура которой предполагает размещение ОПР в кюветном отделении вместо кюветы. ОПР представлен специальным светорассеивающим стеклом (изготовленной по технологии производителя), закрепленным на платформе. Платформа по основанию совпадает с основанием кюветы. Индикатриса рассеяния этого стекла приводится в паспорте прибора, где указывается серийный номер ОПР и данные индикатрисы в области углов конфигурации анализатора.

Рис.15. Образец для проверки работоспособности прибора (ОПР).

Перед первым началом работы с анализатором, требуется провести калибровку анализатора.

Для калибровки используется оптический образец для проверки работоспособности прибора (ОПР). (РисЛ5).

После проведения калибровки, в канале 0 град, должны быть значения 100 (допустимо отклонение в 10%), В остальных каналах должны быть значения близкие к нулю. Микропроцессор сохраняет последние калибровочные данные и после выключения анализатора. В течение последующих 2-3 часов работы на анализаторе повторная калибровка не требуется.

Процедуру калибровки следует проводить в случае, если показания в канале 0 град, отклоняются более чем на 10% (т.е. <90 или >110), или показания в остальных каналах превышают более 3 единиц.

Глава 3. РАЗРАБОТКА ЛАЗЕРНОГО АНАЛИЗАТОРА МОНИТОРИНГА КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК И ЕГО ИНТЕГРАЦИЯ В КОМПЛЕКСНУЮ ФЕРМЕНТАЦИОННУЮ СИСТЕМУ «ЛАСКА-БИОТЕХ».

На основе серийно-выпускаемого анализатора микрочастиц ЛАСКА-1К разработан опытный образец лазерного анализатора способного вести непрерывный контроль концентрации биомассы с системой сбора данных и последующим выводом полученных результатов на компьютер. Для контроля процесса выращивания и биосинтеза клеток необходимо определение их количества, т.е. плотности биомассы. Традиционно используется весовой метод. Это метод периодического разрушающего контроля. Для автоматизированного управления ферментацией необходима непрерывная регистрация биомассы в реальном масштабе времени неразрушающим способом.

3.1 Разработка газоотделительного резервуара.

В составе анализатора применяется специально разработанная проточная измерительная ячейка (Рис.16). Проточная измерительная ячейка помещается в соответствующее кюветное отделение.

Вследствие того, что поступающая в проточную измерительную ячейку клеточная суспензия, отбираемая из биореактора, должна быть отделена от содержащихся в ней пузырей, газовой фазы, был разработан газоотделительный резервуар, который впоследствии был интегрирован в анализатор.

Рис.17. Схема системы с газоотделительным резервуаром.

Сущность работы системы отделения газовой фазы поясняется на рис. 17. Клеточная суспензия отбирается из биореактора I и по трубке 2 поступает в газоотделительный конусообразный резервуар 3. В резервуаре установлены датчики уровня: датчик нижнего уровня 4а и датчик верхнего уровня 46. Сигналы с датчиков поступают на электронный контролер уровня

5. Электронный контроллер автоматически устанавливает скорость прокачки насоса 6 так, чтобы уровень заполнения резервуара находился между нижним и верхним датчиками уровня. В газоотделительном резервуаре пузыри газа поднимаются вверх, отделяются от жидкости и далее отводятся с воздушным потоком, минуя проточную ячейку. Суспензионная жидкость, из которой удалены пузыри газовой фазы, поступает в проточную измерительную ячейку 7. После прохождения ячейки, поток суспензии соединяется с газовым потоком и возвращается в биореактор. Вся система магистралей, включающая проточную ячейку является замкнутой. Это позволяет стерильно отбирать пробу и возвращать обратно в биореактор без изменений, что особенно важно при проведении ферментаций.

Проведенные опыты по выращиванию дрожжей показали хорошие результаты, клеточная суспензия поступала в измерительную ячейку полностью освобожденной от газовой фазы.

3.2 Исследование системы расположения датчиков в приборе.

Анализатор «ЛАСКА» предназначен для непрерывного контроля концентрации биомассы в биореакторе. Этот параметр является ключевым в контроле, регулировании и оптимизации микробиологических процессов.

Принцип действия анализатора «ЛАСКА» основывается на непрерывном измерении светорассеяния в широком диапазоне углов. Метод светорассеяния уже применялся для регистрации плотности биомассы, но не носил универсального характера, так как регистрация интенсивности светорассеяния основывалась на использовании одного выбранного угла и поэтому имела ограниченный диапазон в концентрации биомассы. Проведенные нами исследования с пекарскими дрожжами БассИаготусез сегеу1з1ае показали, что в зависимости от угла регистрации интенсивность светорассеяния пропорциональна плотности биомассы в разном диапазоне значений. Для малых углов регистрации до 10 градусов (фотодатчик I и 2) наблюдается нелинейный характер зависимости интенсивности светорассеяния от концентрации биомассы в диапазоне концентрации биомассы от 0.01 г/л до 0.2 г/л. При более высоких значениях плотности биомассы, возникает эффект многократного светорассеяния, и значения интенсивности светорассеяния в малых углах уменьшается. Наоборот, в дальних углах интенсивность светорассеяния значимо увеличивается при повышении плотности культуры. При выбранной конфигурации расположения датчиков в разных углах возможно перекрытие всей области возможной концентрации биомассы (датчики установлены под углами: 30°, 150°.) (Рис. 18). фотодетекторы 30 0 8° j

15 0° к, \ * ч N Ч'М Ы 1 лазер Ч :/ ^ ¥ J 0° проточная измерительная ячейка

Рис. 18. Расположение датчиков в приборе.

Метод непрерывного анализа концентрации микробных клеток в суспензиях, включающий подачу суспензии через проточную измерительную кювету, одновременное освещение измерительной кюветы лазерным лучом и непрерывное фотометрирование пространственного распределения интенсивности рассеянного света в дальнем поле. Отличается следующими особенностями:

• суспензия микробных клеток перед подачей в измерительную кювету в процессе калибровки и измерения предварительно пропускается через газоотделительный резервуар;

• калибровка осуществляется по данным фотометрирования измерительной кюветы с различным содержанием клеток данного вида и заключается в определении рабочих диапазонов измерительных каналов и аппромаксионному расчету уравнений зависимости показаний измерительных каналов от концентрации клеток;

• анализ концентрации микробных клеток осуществляется по данным фотометрирования измерительной кюветы с пробой и заключается в расчете концентрации клеток на основании калибровочных уравнений и рабочих диапазонов измерительных каналов.

3.3 Градуировка анализатора.

Для определения концентрации микробных клеток необходимо провести градуировку анализатора.

Предварительно производятся измерения с использованием суспензии микробных клеток определенного вида с известной концентрацией. После этого при работе с неизвестной пробой (содержащей клетки того же вида, по которому проводилась калибровка), можно рассчитать их концентрацию.

Реализация предлагаемого метода продемонстрирована при мониторинге дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В случае применения устройства для определения концентрации других видов микробных клеток, представленные калибровки некорректны, в силу того, что средний размер клеток будет иной. В этом случае для каждого вида клеток проводится своя калибровка, которая далее хранится в памяти электронно-вычислительной системы и, соответственно, выбирается при работе с этим видом клеток.

На рис. 19,20 представлены данные по экспериментальной проверке способа. В ферментере создавались модельные среды с известным содержанием дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. Фотодетекторы были установлены под углами 0, 8, 30 и 150 градусов. В начале были измерены фоновые показания фотодетекторов на среде без клеток. Фоновые значения в дальнейшем вычитались из показаний фотодетекторов. Затем в ферментере создавались различные концентрации клеток и снимались показания.

Как показано на рис. 19,20 всю область значений биомассы можно условно разбить на 3 диапазона: 0 ^ 0.5 г/л , 0.5-^-2 г/л, 2 100 г/л.

При увеличении биомассы в первом диапазоне показания 0° уменьшаются, а 8, 30 и 150° увеличиваются.

При увеличении биомассы во втором диапазоне показания 0° близки к нулю, показания 8°уменьшаются, 30 и 150° увеличиваются.

При увеличении биомассы в третьем диапазоне показания 0° близки к нулю, показания 8° уменьшаются и достигают нуля, показания 30° уменьшаются, а 150° увеличиваются.

Таким образом, для каждого диапазона концентрации клеток существует фотодетектор, показания которого монотонно возрастают с увеличением биомассы. Следовательно, проведя предварительную калибровку измерительной системы на определенный вид клеток и сняв показания фотодетекторов на неизвестной пробе (но с клетками того же вида, по которому проводилась калибровка), можно рассчитать количество клеток. Для этого необходимо осуществить следующее:

Определение рабочих диапазонов измерительных каналов.

В измерительную кювету последовательно подают суспензии с известной концентрацией клеток в диапазоне от 0 до 100 г/л и регистрируют показания фотодетекторов где 3 - номер фотодетектора, I - показания ^го фотодетектора. Из показаний вычитают фон (10|) - показания фотодетекторов на дисперсионной среде без клеток. Определяют максимумы показаний по каждому фотодетектору (^тах) и находят соответствующие им значения концентрации (С^тах). Определяют границы рабочих диапазонов АС; е [0.9х Снтах - 0.9х С;тах .

Первое значение С устанавливают равным начальной концентрации клеток при калибровке; Последнее значение С (шах]) устанавливают равным 0.9Стах. Таблица 3.

Угол шах ч АС; фотодетектора регистрации, град

1 8 0.5 0.01-0.45

2 30 2 0.45-1.8

3 150 >100 1.8-90

Аппромаксионный расчет уравнений зависимости показаний измерительных каналов от концентрации клеток. Для всех найденных по п.1., находят аппроксимирующее уравнение = ОД) для своего диапазона АСу (См. Таблицу 4).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Левенков, Владимир Анатольевич, Санкт-Петербург

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: В 3 т. 2-е изд., - М.: «Мир», 1993.

2. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: «Мир», 1989.-2т.

3. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. М.: Пранд, 1999.

4. Воюцкий С. С. Курс коллоидной химии, М., 1964.

5. Галынкин В. А. Высокоплотностное культивирование. С-Петербург.: СПХФА, 1997

6. Галынкин В. А., Заикина Н. А., Миндукшев И. В., Юрлова Н. А. Промышленная микология. С-Петербург.: СПХФА, 2003

7. Галынкин В.А., Ганин П.Г., Деркачев Э.Ф., Миндукшев И.В. Альтернативность программ роста и индукции дыхательных систем в процессе ферментации на н-алканах. // «Перспективные направления химии и химической технологии» Л. «Химия», 1991, 113-121стр.

8. Галынкин В.А., Заикина Н. А., Потехина Т.С. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии с основами асептики и биотехнологии. Курск, 2002.

9. Иванов В.Н., Угодчиков Г.А. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций. Киев: «Наукова Думка», 1984.

10. Ю.Лакович Дж. Основы Флуоресцентной спектроскопии М.: «Мир», 1986.

11. П.Ландсберг Г. С. Оптика, 4 изд., М., 1957

12. Лысак В. В., Желдакова Р. А. Микробиология. БГУ, 2002

13. Мюрей Э.Ю., Киршнер М.У. Чем регулируется клеточный цикл., 1991 И.Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.:1. Мир», 1978.

14. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология. АН СССР. Новосибирск: «Наука СО АН СССР», 1978.

15. Работнова И.Л., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. М.: «Наука», 1979.

16. Тагер А. А. Физикохимия полимеров, М., 1963

17. Фараджева Е.Д., Болотов Н.А. Производство хлебопекарных дрожжей. С-Петербург., 2002.19.1Пифрин К. С. Рассеяние света в мутной среде, М. - Л., 1951

18. Юинг Г. Инструментальные методы химического анализа. М.: Мир, 1989

19. Agrawal P., Koshy G. and М. Ramseier. An algorithm for Operating a Fed-Batch Fermentor at Optimum Specific Growth Rate // Biotechnology and Bioengineering, 33, -P. 115 -125., 1989.

20. Alan J. Dickson Apoptosis regulation and its applications to biotechnology Focus. Trends in Biotechnology, 1998, 16:8:339-342

21. Alberghina L, Porro D, Martegani E, Ranzi BM Efficient production of recombinant DNA proteins in Saccharomyces cerevisiae by controlled high-cell-density fermentation // Biotechnol Appl Biochem 1991 Aug 14:1 82-92

22. Alberghina L, Ranzi BM, Porro D, Martegani E Flow cytometry and cell cycle kinetics in continuous and fed-batch fermentations of budding yeast. Biotechnol Prog 1991 Jul-Aug 7:4 299-304

23. Andersson L, Strandberg L, Enfors SO Cell segregation and lysis have profound effects on the growth of Escherichia coli in high cell density fed batch cultures. Biotechnol Prog 1996 Mar-Apr 12:2 190-5

24. Andersson L, Strandberg L, Heggstrum L, Enfors SO Modeling of high cell density fed batch cultivation. FEMS Microbiol Rev 1994 May 14:1 39-44

25. Andersson L, Yang S, Neubauer P, Enfors SO Impact of plasmid presence and induction on cellular responses in fed batch cultures of Escherichia coli // J Biotechnol 1996 May 15 46:3 255-63

26. Andreas Rudolf and John Fredriksson. Probing Control of Glucose Feeding in Saccharomyces cerevisiae Cultivations., Department of Chemical Engineering II, Lund UniversityP.O. Lund, Sweden., 2002

27. Basak S, Velayudhan A, Ladisch MR Simulation of diauxic production of cephalosporin C by Cephalosporium acremonium: lag model for fed-batch fermentation. Biotechnol Prog 1995 Nov-Dec 11:6 626-31

28. Bohren, C. F. and D. R. Huffman. Absorption and scattering of light by small particles. New York, Wiley., 1983.

29. Carr, R. J. G., R. G. W. Brown, et al. Laser light-scattering and related techniques. Biosensors; fundamentals and applications. A. P. F. Turner, I. Karube and G. S. Wilson // Oxford, Oxford University Press: -P. 679-701., 1987.

30. Chan LC, Greenfield PF, Reid S Optimising fed-batch production of recombinant proteins using the baculovirus expression vector system. Biotechnol Bioeng 1998 Jul 20 59:2 178-88

31. Chang CC, Ryu DD, Park CS, Kim JY Improvement of heterologous protein productivity using recombinant Yarrowia lipolytica and cyclic fed-batch process strategy. Biotechnol Bioeng 1998 Aug 5 59:3 379-85

32. Chang CC, Ryu DD, Park CS, Kim JY, Ogrydziak DM Recombinant bioprocess optimization for heterologous protein production using twostage, cyclic fed-batch culture // Appl Microbiol Biotechnol 1998 May 49:5 531-7

33. Chang JS, Chao YP, Law WS Repeated fed-batch operations for microbial detoxification of mercury using wild-type and recombinant mercury-resistant bacteria // J Biotechnol 1998 Oct 8 64:2-3 219-30

34. Chen HC, Hwang CF, Mou DG High-density Escherichia coli cultivation process for hyperexpression of recombinant porcine growth hormone. Enzyme Microb Technol 1992 Apr 14:4 321-6

35. Chen Q, Bentley WE, Weigand WA Optimization for a recombinant E. coli fed-batch fermentation// Appl Biochem Biotechnol 1995 Spring 51-52: 44961

36. Chen W, Graham C, Ciccarelli RB Automated fed-batch fermentation with feed-back controls based on dissolved oxygen (DO) and pH for production of DNA vaccines // J Ind Microbiol Biotechnol 1997 Jan 18:1 43-8

37. Clarke, D. J., Calder M. R., et al. The development and application of biosensing devices for bioreactor monitoring and control.Biosensors 1: P. 213-320., 1985

38. Clarke, D. J., Kell D. B., et al. The role of ion-selective electrodes in microbial process control. Ion-Selective Electrode Rev. 4: P. 75-131., 1982.

39. Davey, C. L., N. M. Dixon, et al. (1990). "FLOWTOVP: A Spreadsheet Method for Linearizing Flow Cytometric Light-Scattering Data used in Cell Sizing." Binary 2: -P. 119-125., 1990.

40. Davey, H. M. and D. B. Kell. Flow cytometry and cell sorting of heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell analysis // Microbiol. Rev. 60: -P. 641-696., 1996.

41. Diener A, Goldschmidt B Suboptimal control of fed-batch bioprocesses using phase properties II J Biotechnol 1994 Mar 15 33:1 71-85

42. Ertugay N, Hamamci H, Bayindirli A. Fed-batch cultivation of bakers' yeast: effect of nutrient depletion and heat stress on cell composition. Department of Food Engineering, Middle East Technical University, Ankara, Turkey., 1997.

43. Fang B Application of a generalized logistic equation to simulate a fed-batch process. Chin J Biotechnol 1994 10:3 179-86

44. Gary L Kleman, William R Strohl Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation Review article. Current Opinion in Biotechnology 1994, 5:180-186.

45. Gomes J, Menawat AS Fed-batch bioproduction of spectinomycin. Adv Biochem Eng Biotechnol 1998 59: 1-46

46. Gordillo MA, Montesinos JL, Casas C, Valero F, Lafuente J, Sola C Improving lipase production from Candida rugosa by a biochemical engineering approach. Chem Phys Lipids 1998 Jun 93:1-2 131-42

47. Gordillo MA, Sanz A, Sönchez A, Valero F, Montesinos JL, Lafuente J, Sola C Enhancement of Candida rugosa lipase production by using different control fed-batch operational strategies. Biotechnol Bioeng 1998 Oct 20 60:2 156-68

48. Gschaedler A, Thi Le N, Boudrant J Glucose and acetate influences on the behavior of the recombinant strain Escherichia coli HB 101 (GAPDH) // J Ind Microbiol 1994 Jul 13:4 225-32

49. Gu MB, Park MH, Kim DI Growth rate control in fed-batch cultures of recombinant Saccharomyces cerevisiae producing hepatitis B surface antigen (HBsAg) // Appl Microbiol Biotechnol 1991 Apr 35:1 46-30

50. Han SJ, Chang HN, Lee J Fed-batch cultivation of an oxygen-dependent inducible promoter system, the nar promoter in Escherichia coli with an inactivated nar operon. Biotechnol Bioeng 1998 Aug 20 59:4 400-6

51. Harding, S. E. Applications of light scattering in microbiology. Biotechnology and applied biochemistry 8: -P. 489-509., 1986.

52. Hardjito L, Greenfield PF, Lee PL Recombinant protein production via fed-batch culture of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb Technol 1993 Feb 15:2 120-6

53. Harris, C. M. and D. B. Kell. The Estimation of Microbial Biomass. Biosensors 1: -P. 17-84., 1985.

54. He RQ, Li CY, Xu J, Zhao XA Estimation of the optimal concentrations of residual sugar and cell growth rate for a fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae // Appl Biochem Biotechnol 1996 Sep 60:3 229-44

55. He RQ, Xu J, Li CY, Zhao XA The principle of parabolic feed for a fed-batch culture of baker's yeast // Appl Biochem Biotechnol 1993 Jun 41:3 145-55

56. Hellmuth K, Korz DJ, Sanders EA, Deckwer WD Effect of growth rate on stability and gene expression of recombinant plasmids during continuous and high cell density cultivation of Escherichia coli TGI // J Biotechnol 1994 Feb 28 32:3 289-98

57. Hensing MC, Rouwenhorst RJ, Heijnen JJ, van Dijken JP, Pronk JT Physiological and technological aspects of large-scale heterologous-protein production with yeasts. Antonie Van Leeuwenhoek 1995 67:3 261-79

58. Hoffman BJ, Broadwater JA, Johnson P, Harper J, Fox BG, Kenealy WR Lactose fed-batch overexpression of recombinant metalloproteins in

59. Escherichia coli BL21 (DE3): process control yielding high levels of metal-incorporated, soluble protein. Protein Expr Purif 1995 Oct 6:5 646-54

60. Hofmann KH, Neubauer P, Riethdorf S, Hecker M Amplification of pBR322 plasmid DNA in Escherichia coli relA strains during batch and fed-batch fermentation // J Basic Microbiol 1990 30:1 37-41

61. Iyer MS, Wiesner TF, Rhinehart RR Dynamic reoptimization of a fed-batch fermentor. Biotechnol Bioeng 1999 Apr 5 63:1 10-21

62. Varner J, Ramkrishna D Mathematical models of metabolic pathways Review article. Current Opinion in Biotechnology 1999, 10:146-150.

63. Jens Nielsen The role of metabolic engineering in the production of secondary metabolites Review article. Current Opinion in Microbiology 1998, 1:330-336.

64. Jin S, Ye K, Shimizu K Efficient fuzzy control strategies for the application of pH-stat to fed-batch cultivation of genetically engineered Escherichia coli // J Chem Technol Biotechnol 1994 Nov 61:3 273-81

65. Jin S, Zhang SL, Yu JT On-line identification of the state and parameters for fed-batch penicillin fermentation process. Chin J Biotechnol 1989 5:4 24151

66. Junker, B. H., J. Reddy, et al. Online and in-situ monitoring technology for cell-density measurement in microbial and animal-cell cultures. Bioprocess Eng 10: -P. 195-207., 1994.

67. Jorgensen H, Nielsen J, Villadsen J, Mollgaard H Analysis of penicillin V biosynthesis during fed-batch cultivations with a high-yielding strain of

68. Penicillium chrysogenum // Appl Microbiol Biotechnol 1995 Apr 43:1 12330

69. Keilmann, F., D. Böhme, et al. Multichannel photometer nephelometer. Environmental microbiology 40(3): -P. 458-461., 1980.

70. Kell, D. B. and B. Sonnleitner (1995). GMP Good Modelling Practice: an essential component of good manufacturing practice. Trends Biotechnol. 13: -P. 481-492., 1995.

71. Kell, D. B. The role of ion-selective electrodes in improving fermentation yields. Process Biochemistry 15(1)., 1980, -P- 18-23, 29.

72. Kell, D. B., Markx G. H., et al. Real-time Monitoring of Cellular Biomass: Methods and Applications. Trends in Analytical Chemistry 9(6): -P. 190194., 1990.

73. Kennedy, M.J., Thakur, M.S., Stephanopoulos, G.N. and Wang, D.I.C. Biotechnol. Bioeng., 40, -P. 875-888., 1992.

74. Kerker, M. Elastic and Inelastic Light Scattering in Flow Cytometry. Cytometry 4: -P. 1-10., 1983.

75. Kem JA, Davis RH Application of a fed-batch system to produce RNA by in vitro transcription. Biotechnol Prog 1999 Mar-Apr 15:2 174-84

76. Khosla C, Curtis JE, Bydalek P, Swartz JR, Bailey JE Expression of recombinant proteins in Escherichia coli using an oxygen-responsive promoter. Biotechnology (N Y) 1990 Jun 8:6 554-8

77. Kim SS, Kim EK, Rhee JS Effects of growth rate on the production of Pseudomonas fluorescens lipase during the fed-batch cultivation of Escherichia coli. Biotechnol Prog 1996 Sep-Oct 12:5 718-22

78. Kleman GL, Chalmers JJ, Luli GW, Strohl WR A predictive and feedback control algorithm maintains a constant glucose concentration in fed-batch fermentations // Appl Environ Microbiol 1991 Apr 57:4 910-7

79. Koch, A. L. Estimation of Size of Bacteria by Low-Angle Light-Scattering Measurements: theory// J. Microbiol. Methods 5; -P. 221-235., 1986.

80. Koch, A. L. Turbidity measurements in microbiology. ASM news 50(10): -P. 473-477., 1984.

81. Konstantinov, K., Chuppa S., et al. Real-time biomass concentration monitoring in animal-cell cultures. Trends Biotechnol. 12: -P. 324-333., 1994.

82. Korz DJ, Rinas U, Hellmuth K, Sanders EA, Deckwer WD Simple fed-batch technique for high cell density cultivation of Escherichia coli // J Biotechnol 1995 Feb 21 39:1 59-65

83. Kovarova-Kovar K., Egli T. Growth Kinetics of Suspended Microbial Cells: From Single-Substrate-Controlled Growth to Mixed-Substrate Kinetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. -P. 646-666, Vol. 62., (1998).

84. Kuppusamy M, Balaraman K Fed-batch fermentation studies with Bacillus thuringiensis H-14 synthesising endotoxin // Indian J Exp Biol 1991 Nov 29:11 1031-4

85. Latimer, P. Light scattering and absorption as methods of studying cell population parameters // Ann rev. Biophys bioeng 11: -P. 129-150., 1982.

86. Lee C., Lim H.New Device of Continuously Monitoring the Optical Density of Concentrated Microbial Cultures: Biotech., 22, 636., 1980

87. Li Y, Chen J, Song Q, Lun S, Katakura Y Fed-batch culture strategy for high yield of baker's yeast with high fermentative activity // Chin J Biotechnol 1997 13:2 105-13

88. Liu G, Zheng Z, Song D, Cen P Kinetic models of batch and fed-batch culture of single-cell protein with double carbon sources // Chin J Biotechnol 1995 11:3 163-70

89. Locher, G., B. Sonnleitner, et al. Online measurement in biotechnology -exploitation, objectives and benefits // J. Biotechnol. 25: -P. 23-53., 1992.

90. Longobardi G. P. Fed-Batch versus Batch Fermentation. Bioprocess Engineering, 10, -P. 185 194., 1994

91. Luli GW, Strohl WR Comparison of growth, acetate production, and acetate inhibition of Escherichia coli strains in batch and fed-batch fermentations // Appl Environ Microbiol 1990 Apr 56:4 1004-11

92. Lynch HC, Bushell ME The physiology of erythromycin biosynthesis in cyclic fed batch culture. Microbiology 1995 Dec 141 ( Pt 12): 3105-11

93. Mallette, M. F. Evaluation of growth by physical and chemical means. Methods in microbiology. J. R. Norris and D. W. Ribbons. London, Academic Press. 1: -P. 521-566., 1969.

94. McNeil B. and L. M. Harvey: Fermentation, a Practical Approach. IRL Press, Tokyo., 1990.

95. Mendoza-Vega O, Hebert C, Brown SW. Production of recombinant hirudin by high cell density fed-batch cultivations of a Saccharomyces cerevisiae strain: physiological considerations during the bioprocess design. J Biotechnol 1994 Feb 28 32:3 249-59

96. Mendoza-Vega O, Sabatiq J, Brown SW. Industrial production of heterologous proteins by fed-batch cultures of the yeast Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol Rev 1994 Dec 15:4 369-410

97. Meszaros A. and V. Bales. A Contribution to Optimal Control of Fed-Batch Biochemical Processes. Bioprocess Engineering, 7, -P. 363 367., 1992.

98. Miao Z, Zhao L, Yuan Y A neural network for the optimization of fed-batch glutamic acid production // Chin J Biotechnol 1998 14:2 125-31

99. Michele B. Kellerhals, Wil Hazenberg, and Bernard Witholt. High cell density fermentation of Pseudomonas oleovorans for the production of mcl

100. PHAs in two-liquid phase media. Institute of Biotechnology. ETH Zurich. Switzerland., 1997

101. Neubauer P, Ahman M, Tijrnkvist M, Larsson G, Enfors SO Response of guanosine tetraphosphate to glucose fluctuations in fed-batch cultivations of Escherichia coli // J Biotechnol 1995 Dec 15 43:3 195-204

102. Nicolan BM, Van Impe JF, Vanrolleghem PA, Vandewalle J Evaluation of two unstructured mathematical models for the penicillin G fed-batch fermentation. Antonie Van Leeuwenhoek 1992 Nov 62:4 273-83

103. Nielsen J, Johansen CL, Jacobsen M, Krabben P, Villadsen J e* Pellet formation and fragmentation in submerged cultures of Pénicillium chrysogenum and its relation to penicillin production. Biotechnol Prog 1995 Jan-Feb 11:1 93-8

104. Nielsen J, Jorgensen HS Metabolic control analysis of the penicillin biosynthetic pathway in a high-yielding strain of Pénicillium chrysogenum. Biotechnol Prog 1995 May-Jun 11:3 299-305

105. Ozadali F, Glatz BA, Glatz CE Fed-batch fermentation with and without on-line extraction for propionic and acetic acid production by Propionibacterium acidipropionici // Appl Microbiol Biotechnol 1996 Feb 44:6 710-6

106. Park Y. S., Dohijima T. and M. Okabe. Enhanced a-Amylase Production in Recombinant Bacillus brevis by Fed-Batch Culture with Amino-Acid Control. Biotechnology and Bioengineering, -P. 49, 36 -44., 1995.

107. Peter E Sudbery The expression of recombinant proteins in yeasts Review article. Current Opinion in Biotechnology 1996, 7:517-524.

108. Pham HT, Larsson G, Enfors SO Growth and energy metabolism in aerobic fed-batch cultures of Saccharomyces cerevisiae: simulation and model verification. Biotechnol Bioeng 1998 Nov 20 60:4 474-82

109. Pirt S. J. The Dynamics of Microbial Processes: a Personal View in Microbial Growth Dynamics (Ed. Poole R., Bazin M. and Keevil C.), IRL Press, Tokyo, vol. 28, -P. 1 -16., 1990.

110. Porro D, Martegani E, Tura A, Ranzi BM Development of a pH-controlled fed-batch system for budding yeast. Res Microbiol 1991 Jun 142:5 535-9

111. Ranmrez OT, Zamora R, Quintero R, Lypez-Mungima A Exponentially fed-batch cultures as an alternative to chemostats: the case of penicillin acylase production by recombinant E. coli. Enzyme Microb Technol 1994 Oct 16:10 895-903

112. Rank M, Gram J, Nielsen KS, Danielsson B. On-line monitoring of ethanol, acetaldehyde and glycerol during industrial fermentations with Saccharomyces cerevisiae. Chemical Centre, University of Lund, Sweden., 1995.

113. Riesenberg D, Menzel K, Schulz V, Schumann K, Veith G, Zuber G, Knorre WA High cell density fermentation of recombinant Escherichia coli expressing human interferon alpha 1 // Appl Microbiol Biotechnol 1990 Oct 34:1 77-82

114. Riesenberg D, Schulz V, Knorre WA, Pohl HD, Korz D, Sanders EA, Ross A, Deckwer WD High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate // J Biotechnol 1991 Aug 20:1 17-27

115. Sabatiq J, Speck D, Reymund J, Hebert C, Caussin L, Weltin D, Gloeckler R, O'Regan M, Bernard S, Ledoux C, et al Biotin formation by recombinant strains of Escherichia coli: influence of the host physiology // J Biotechnol 1991 Aug 20:1 29-49

116. Salzman, G. C. Light Scattering Analysis of Single Cells. Cell Analysis. N. Castimpoolas. New York, Plenum Press., 1982.

117. Sarra M, Pörez-Pons JA, GTdia F, Casas Alvero C Importance of growth form on production of hybrid antibiotic by Streptomyces lividans TK21 by fed-batch and continuous fermentation // Appl Biochem Biotechnol 1998 Nov-Dec 75:2-3 235-48

118. Schroeckh V, Hartmann M, Birch-Hirschfeld E, Riesenberg D Improvement of recombinant gene expression in Escherichia coli for glucose-controlled continuous and fed-batch cultures // Appl Microbiol Biotechnol 1992

119. Sharpless, T. K., M. Bartholdi, et al. Size and Refractive Index Dependence of Simple Forward Angle Scattering Measurements in a Flow System using Sharply-focused Illumination // J. Histochem. Cytochem. 25: -P. 845-856., 1977.

120. Shin CS, Hong MS, Bae CS, Lee J Enhanced production of human mini-proinsulin in fed-batch cultures at high cell density of Escherichia coli BL21(DE3)pET-3aT2M2. Biotechnol Prog 1997 May-Jun 13:3 249-57

121. Shin CS, Hong MS, Kim DY, Shin HC, Lee J Growth-associated synthesis of recombinant human glucagon and human growth hormone in high-cell-density cultures of Escherichia coli // Appl Microbiol Biotechnol 1998 Apr 49:4 364-70

122. Singh, A., Kuhad R. C., et al. Evaluation of biomass. Adv. Biochem. Eng. 51: -P. 47-70., 1994.

123. Sonnleitner, B., Locher G., et al. Biomass Determination // J. Biotechnol. 25: -P. 5-22., 1992.

124. Stefan Marose, Carsten Lindemann, Roland Ulber and Thomas Scheper Optical sensor systems for bioprocess monitoring Reviews. Trends in Biotechnology, 1999, 17:1:30-34

125. Strandberg L, Andersson L, Enfors SO The use of fed batch cultivation for achieving high cell densities in the production of a recombinant protein in Escherichia coli // FEMS Microbiol Rev 1994 May 14:1 53-6

126. Stratton J, Chiruvolu V, Meagher M High cell-density fermentation. Methods Mol Biol 1998 103: 107-20

127. Taherzadeh MJ, Niklasson C, Liden G. On-line control of fed-batch fermentation of dilute-acid hydrolyzates. Department of Chemical Reaction Engineering, Chalmers University of Technology, Goteborg, Sweden., 2000.

128. Tiller V, Meyerhoff J, Sziele D, Schbgerl K, Bellgardt KH Segregated mathematical model for the fed-batch cultivation of a high-producing strain of Penicillium chrysogenum // J Biotechnol 1994 May 15 34:2 119-31

129. Tulin E. E., Ueda S., Yamagata H. Udaka S. and T. Yamane. Effective Extracellular Production of Bacillus stearothermophilus Esterase by pH-Stat

130. Modal Fed-Batch Culture of Recombinant Bacillus brevis. Biotechnology and Bioengineering, 40, -P. 844 850., 1992.

131. Turner C., Gregory M. E. and N. Thornhill. Closed-Loop Control of Fed-Batch Cultures of Recombinant Escherichia coli Using On-Line HPLC. Biotechnology and Bioengineering, 44, -P. 819 -829., 1994.

132. Van der Hülst, H. C. Light Scattering by Small Particles. New York, John Wiley., 1957.

133. Vicik SM, Fedor AJ, Swartz RW Defining an optimal carbon source/methionine feed strategy for growth and cephalosporin C formation by Cephalosporium acremonium. Biotechnol Prog 1990 Sep-Oct 6:5 333-40

134. Wang F, Lee SY High cell density culture of metabolically engineered Escherichia coli for the production of poly(3-hydroxybutyrate) in a defined medium. Biotechnol Bioeng 1998 Apr 20-May 5 58:2-3 325-8

135. Wang F, Lee SY Production of poly(3-hydroxybutyrate) by fed-batch culture of filamentation-suppressed recombinant Escherichia coli // Appl Environ Microbiol 1997 Dec 63:12 4765-9

136. Won J. I., Yang Y. L., Kim B. G. and C. Y. Choi. Adaptive Control of Specific Growth Rate Based on Proton Production in Anaerobic Fed-batch Culture. Biotechnology Letters, 15(5), -P. 511 516., 1993.

137. Wong HH, Lee SY Poly-(3-hydroxybutyrate) production from whey by high-density cultivation of recombinant Escherichia coli // Appl Microbiol Biotechnol 1998 Jul 50:1 30-3

138. Wyatt, P. J. Differential light scattering: a physical method for identifying living bacterial cells. Appl. Opt. 7: -P. 1879-1896., 1986.

139. Wyatt, P. J. Differential Light-scattering Techniques for Microbiology. Methods in Microbiology. J. R. Norris and D. W. Ribbons. London, Academic Press. 8: -P. 183-263., 1973.

140. Xu B, Jahic M, Enfors SO Modeling of overflow metabolism in batch and fed-batch cultures of Escherichia coli. Biotechnol Prog 1999 Jan-Feb 15:1 81-90

141. Yamane T Application of an on-line turbidimeter for the automation of fed-batch cultures. Biotechnol Prog 1993 Jan-Feb 9:1 81-5

142. Yang XM Optimization of a cultivation process for recombinant protein production by Escherichia coli // J Biotechnol 1992 May 23 :3 27189

143. Yeast Metabolism. Bioprocess Engineering, Spring University of Colorado-Boulder, Chemical Engineering Dept. Dhinakar Kompala., 1996.

144. Yee L. and H. W. Blanch: Review/ Recombinant Protein Expression in High Cell Density Fed-Batch Cultures of Escherichia coli. Biotechnology, 10, -P. 1550-1555., 1992.

145. Yuan J, Bellgardt KH Profit optimization for baker's yeast fed-batch fermentation // Chin J Biotechnol 1993 9:3 189-96

Информация о работе

Левенков, Владимир Анатольевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка системы высокоплотностного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы