Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК

Баурина, Марина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК"

и03063381

Баурина Марина Михайловна

РАЗРАБОТКА ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ГИДРОЛИЗАТА ДРОЖЖЕВОЙ РНК

03 00 23 -биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 4 МАЙ 2007

Москва - 2007

003063381

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им Д И Менделеева

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Крылов Игорь Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Коваленко Леонид Владимирович

кандидат химических наук, доцент, Позмогова Галина Евгеньевна

Ведущая организация ОАО ГосНИИсинтезбелок

Защита диссертации состоится " t/ШЯЛ_2007 г в -/У часов на

заседании диссертационного совета ДМ 212 204 13 в РХТУ им Д И Менделеева (125047, Москва, Миусская пл , д 9) в 443 ауд

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им Д И Менделеева

Автореферат диссертации разослан Л4^1^^ 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета ДМ 212 204 13 Jf^feut/L^ И В Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время разработка недорогих эффективных лекарственных средств отечественного производства является одной из актуальных задач сохранения здоровья, продолжительности и качества жизни людей, решаемых современной российской фармацевтической промышленностью Препараты нуклеиновой природы находят широкое применение в качестве лекарственных средств Отечественный фармакопейный препарат - панкреатический гидролизат РНК, известный под названием Энкад, представляет собой смесь олигорибонуклеотидов и пиримидиновых нуклеозид-3'-фосфатов Препарат регулирует обмен нуклеотидов в тканях, обладает иммуномодулирующими свойствами, способствует улучшению функций клеточных мембран, проведению импульса по двигательным нервам, уменьшению миодистрофических процессов и оптимизации биоэнергетики мышц Препарат применяется для лечения наследственных тапеторетинальных абиотрофий - заболеваний, приводящих к слабовиденгао и слепоте До настоящего времени не существует эффективных методов лечения этой группы болезней в мире Препарат также разрешен к применению при болезни Шегрена, при дегенеративных заболеваниях нервно-мышечной системы наследственных формах миопатай (ранние стадии), врожденном и приобретенном миопатическом синдроме, различных формах невраль-ных абиотрофий, последствиях нейроинфекций, спинальных амиотрофиях Показана клиническая эффективность применения препарата Энкад при ряде других социально значимых заболеваниях (язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, псориаз, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз)

Ранее сухая субстанция Энкада выпускалась на предприятии НПО «Биолар» (г Олайне, Латвия) при использовании в качестве сырья РНК дрожжей р Тоги1а, производства которых прекращены Лекарственная форма препарата, выпускаемая в настоящее время на Харьковском предприятии по производству бактерийных препаратов (Украина), поставляется в Россию в ограниченных количествах, не удовлетворяющих потребности РФ В связи с этим организация производства субстанции Энкад и его инъекционной формы на территории РФ является актуальной Наиболее перспективным сырьем получения РНК в настоящее время для России являются хлебопекарные дрожжи Басскаготусев сегеутае, которые не требуют организации специального производства, так как выпускаются промышленностью в больших объемах и также образуются в значительных количествах в качестве отходов спиртового производства

Для получения панкреатического гидролизата РНК используется рибонук-леаза, выделяемая из бычьей поджелудочной железы - отхода мясоперерабатывающей промышленности Известно, что себестоимость большинства биологически активных веществ, получаемых с использованием ферментов, в значительной степени зависит от стоимости последних. Существующие технологии получения рибонуклеазы многостадийны, длительны и характеризуются низким выходом фермента В настоящее время накоплен огромный опыт переработки и

выделения различных комплексов ферментов из поджелудочной железы В связи с этим актуальным является совершенствование технологии получения ферментного препарата рибонуклеазы для создания эффективного и малоотходного производства Рибонуклеаза помимо этого широко используется в медицине в качестве противовирусного средства и применяется в области молекулярной биологии

Таким образом, современные потребности РФ в лекарственных препаратах отечественного производства настоятельно требуют разработок технологий на основе дешевого и доступного сырья в условиях комплексного производства

Цель исследований. Разработать научные основы технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК, а также ферментного препарата рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы, соответствующих требованиям фармакопеи Для достижения этой цели поставлены следующие задачи: 1) Разработать технологический режим получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК как субстанции препарата Энкад, обеспечивающий повышение выхода целевого продукта- изучить возможность использования нового источника сырья натриевой соли низкомолекулярной РНК из хлебопекарных дрожжей для получения панкреатического гидролизата требуемого качества

- разработать условия повышения стабильности состава панкреатического гидролизата

2) Разработать режим основных технологических стадий извлечения рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы- экстракции, концентрирования, осаждения и очистки фермента с целью повышения выхода целевого продукта Научная новизна.

Впервые разработана технология получения препарата панкреатического гидролизата РНК из хлебопекарных дрожжей БасскаготусвБ сегехтае, отвечающего требованиям, предъявляемым к субстанциям лекарственных форм

Впервые показана возможность применения миндальной кислоты на стадии ультрафильтрации в качестве ингибитора рибонуклеаз микроорганизмов, что позволило стабилизировать состав готового продукта с сохранением качества и увеличить его выход.

Проведено количественное изучение процессов гидролиза полирибонуклео-тидов дрожжей, отделения от высокомолекулярных компонентов продуктов гидролиза и осаждения их из водно-спиртового раствора, что позволило разработать алгоритм управления технологическим процессом

Проведено количественное изучение процессов извлечения рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы водными растворами серной кислоты, ультраконцентрирования экстракта, осаждения фермента в изоэлектрической точке из водных растворов и спиртового осаждения, что позволило разработать алгоритм управления технологическим процессом

Практическая значимость. Разработана технология получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты из хлебопекарных дрожжей с увеличением выхода продукта на 10-12% по сравнению с известными технологиями Показано, что применение ингибитора рибонуклеаз - миндальной кислоты на стадии ультраконцетрирования позволило повысить стабильность состава готового продукта при сохранении его нетоксичности и апирогенности

Разработаны основные стадии технологического процесса получения ферментного препарата рибонуклеазы (из бычьей поджелудочной железы) и условия их проведения, обеспечивающие увеличение выхода продукта до 0,5% мае от сухой железы, что в 4,2 раза выше по сравнению с существующими технологиями

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на III Международной конференции "Окружающая среда для нас и будущих поколений Экология, бизнес и экологическое образование" (Самара, 1999), XIV Международной конференции «Успехи химии и химической технологии» (Москва, 2000), Международной конференции "От фундаментальной науки к новым технологиям Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок Экологически безопасные технологии" (Тверь, 2001), научно-технической конференции "Технологии живых систем" (Москва, 2003), 1-м, 2-м и 3-м Международных конгрессах «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003 и 2005 гг), XII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Ст -Петербург 2003), Международной конференции "Биотехнология и медицина" (Москва, 2006), 4-ой Российской конференции «Нейроиммунопатология» (Москва, 2006)

Публикации. По материалам работы опубликовано 3 статьи, 10 тезисных сообщений в материалах научных конференций, получено 3 патента РФ

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2 глав, включающих описание результатов и их обсуждение, выводов, списка литературы наименований, в том числе .29 на иностранных языках) и 4 приложений Работа изложена на /// стр машинописного текста и содержит /У таблиц, % рисунков ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Обзор литературы.

В обзоре литературы приводятся данные по исследованию процесса гидролиза дрожжевой РНК, механизму действия панкреатической рибонуклеазы, а также анализу способов получения, области применения и характеристике продуктов гидролиза нуклеиновой природы - панкреатического гидролизата дрожжевой РНК Рассмотрены структура, способы выделения и область применения рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы

2. Материалы и методы.

В работе использовали натриевую соль РНК дрожжей р Candida (р Torula) и Saccharomyces cerevisiae (тип VI), содержащую не менее 70% нуклеиновых кислот, а также химические реактивы квалификации не ниже "чда", растворы для

проведения анализов готовили на дистиллированной воде Объектом изучения явилась бычья поджелудочная железа производства ОАО Раменсюш мясокомбинат, содержащая 20% воздушно-сухих и 25% белковых веществ в пересчете на воздушно-сухое вещество

Содержание суммарных рибонуклеиновых компонентов определяли методом Спирина, белковых веществ - методом Лоури Определение удельной активности рибонуклеазы в растворах и готовом продукте проводили методом Калницкого, удельной активности дезоксирибонуклеазы — методом Кунитца, активности протеолитических ферментов - методом Ансона

Процесс гидролиза полирибонуклеотидов изучали по изменению содержания нуклеиновых кислот в низкомолекулярной (НМ) и высокомолекулярной (ВМ) фракциях при разделении их 50% трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и изменению содержания НМ компонента в НМ фракции методом ТСХ

Исследование процессов экстракции рибонуклеазы, гидролиза РНК и осаждения проводили в лабораторных реакторах емкостью до 1 л, снабженных рубашкой для подвода низкотемпературного теплоносителя, мешалкой, термометром и устройством для отбора проб

Для исследования процессов микро- и ультрафильтрации использовали аппарат марки ФМ02-1000 с рабочим давлением до 0,2 МПа, оснащенный мембранами УПМ-450 или УАМ-100 российского производства, позволяющий вести отбор проб образующихся ретанта и пермеата

Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки «Бресогс! М-40»

Экспериментальные данные обрабатывали, используя стандартные программы интегрирования дифференциальных уравнений и оптимизации их параметров с последующим сопоставлением результатов расчета с экспериментом по критерию Фишера при уровне значимости 0,05 для проверки адекватности разработанных математических зависимостей эксперименту 3. Экспериментальная часть и обсуждение результатов.

3.1. Разработка основ технологии получения панкреатического гидроли-зата дрожжевой рибонуклеиновой кислоты

3.1.1. Ферментативный гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты. Количественные закономерности процесса

Основным процессом получения панкреатического гидролизата является гидролиз дрожжевой РНК бычьей панкреатической рибонуклеазой На первом этапе изучали закономерности процесса, сформировав массив экспериментальных данных из серии опытов, где изучали влияние следующих параметров на скорость гидролиза температуры, рН среды, содержания ферментного препарата, начальной концентрации полирибонуклеотидов, которые меняли соответственно в интервалах 35-80°С, 4,5-8,0, 0,25-2,00 тыс ед/мл, 25,0-100,Ог/л Ферментативный гидролиз РНК дрожжей изучали с позиций формальной кинетики по кривым расходования ВМ фракции и накопления НМ фракции и НМ компонентов Экспериментальные кривые являются типичными для ферментативных ре-

акций (рис 1), что позволило предположить схему превращений (1) с образованием комплекса фермент-субстрат (ЕБ), распадающегося до низкомолекулярных продуктов гидролиза(Р) К к2

ЕЯ.

Р+Е

100

Время, ч

Рис.1. Изменение концентрации 1-ВМФ, 2-НМФ и 3-НМК в ходе гидролиза дрожжевой РНК Концентрация субстрата - 100г/л, температура - 65°С, рН 5,5, концентрация фермента -2,0 тыс ед/мл

(О

В ходе дифференциальной обработки данных по начальным участкам соответствующих кривых в координатах Лайнуивера-Берка определили значения эффективных констант К и к2 в схеме превращений (1) Рассчитанные кривые гидролиза полирибонуклеоти-дов дрожжей адекватно описывали лишь начальные участки кинетических кривых, что можно объяснить ингибирова-нием фермента низкомолекулярными продуктами реакции или его инактивацией Была проведена серия опытов по гидролизу РНК при различных концентрациях ингибитора и установлено наличие ингибирования продуктом гидролиза Полученные данные подтвердили процесс ингибирования конечным продуктом, что соответствует литературным данным Таким образом, схему превращений (1) дополнили уравнением (2) Обработка вышеуказанной серии экспериментов позволила найти численное значение константы ингибирования Ки Ки

Е + Р , * ЕР (2) Значение константы Ки составило 0,40±0,03 л/моль

Предложенная модель не дала адекватного описания конечных участков кинетических кривых, что может быть связано с инактивацией свободного фермента или в составе фермент-субстратного комплекса Линейная зависимость в координатах [1п(80/8)]/Дг - 1/80 (рис 2) свидетельствовала о наличии инактивации свободного фермента и позволила определить величину константы инактивации Схему превращений дополнили уравнением (3) кин

Е -► Ен/акт (3)

Константы к2 и кин зависят от рН среды и температуры гидролиза Поэтому, следующим этапом стало изучение влияния этих параметров на процесс ферментативного гидролиза полирибонуклеотидов дрожжей

0,03 0,04 1/8,л/г

Рис.2. Обработка экспериментальных данных по гидролизу РНК в координатах [1п (80/8)]/Дго - 1/8, необходимая для расчета константы инактивации Концентрация субстрата - 100г/л, температура 65°С, рН 5,5 концентрация фермента - 2,0 тыс ед/мл

По результатам обработки соответствующих серий кинетических кривых были определены значения эффективных констант к2 и кин, отвечающие различным значениям рН и температурам процесса Полученные значения констант были использованы для расчета параметров уравнения зависимости эффективной константы скорости ферментативной реакции от рН среды и уравнения Аррениуса Рассчитанные значения параметров данных уравнений приведены в табл 1 Предложенная кинетическая схема адекватно описывает весь массив экспериментальных данных

Таблица 1.

Значение эффективных констант и энергий активации процесса гидролиза

Эффективная константа Е, кДж/моль Ка, моль/л к*, с"1

К 14,9 ± 1,2 (2,2±0,2) 10"4 (9,8±0,7) 10"2

кин 10,6 ±0,9 (5,9±0,5)-10"7 (1,2±0,1) 10"4

Степень чистоты препарата панкреатического гидролизата определяется по соотношениям оптических плотностей (А ) и ( А ), которые зависят от содержания НМ компонентов продуктов гидролиза и возможных белковых примесей Из литературы известно, что препарат должен удовлетворять определенным показателям качества Ашш [2,5 - 4,5], А260/230 [1,5 - 1,74] Во-вторых, значение поглощения при длине волны 400 нм не должно превышать 0,5, а при длине волны 520 нм — 0,1 при концентрации нуклеиновых компонентов 35 г/л Эти показатели характеризуют наличие примесей, которые могут оказать токсическое действие

На следующем этапе исследований было изучено влияние условий гидролиза на соотношения поглощений при длинах волн А260'230, А2б0/28 Из данных, любезно предоставленных к б н М Е Шабановой, одним из авторов препарата Эн-кад, видно, что препарат панкреатического гидролизата содержит низкомолекулярные компоненты (НМК) Доля НМК в препарате составляет 15,96% масс , из них 93,2% представлено компонентами нуклеиновых кислот (НК), полученными в результате гидролиза урацил- и гуанинсодержащих, а 6,8 % - цитозин- и аде-нинсодержащих фрагментов РНК, то есть их соотношение составляет 13,7 1,0 Из рис 3 видно, что именно при содержании НМК до 20% препарат панкреатического гидролизата удовлетворяет необходимым показателям качества

-с о

№ г»

чо

------+ 2

.........

15 20 25 Доля НМК,%

Рис.3. Влияние доли НМК в препарате Энкад на соотношение оптических плотно-

стей

1 - А

260/280

и 2 - А

При дальнейших исследованиях были изучены количественные закономерности процесса гидролиза РНК с точки зрения влияния их параметров на показатели А260*80 и А26(Ш0 Было показано, что на исследуемые показатели А260/280 и А260'230 наибольшее влияние оказывает время гидролиза Результаты исследований свидетельствуют, что изменение величины максимума поглощения при 260 нм связано с накоплением в гидролизате аденина и других оснований и нуклеозидов вследствие неспецифических ферментативных процессов Из рис 3 видно, что содержание НМ компонентов превышает 20% после 5-6-ти часового гидролиза, при этом расходование ВМ фракции прекращается Таким образом, критерием окончания процесса гидролиза с целью получения препарата необходимого качества можно считать момент окончания расходования ВМ фракции

Изучено влияние рН среды и температуры на показатели соотношений поглощений По максимальному и минимальному допустимым значениям показателей качества определили возможно допустимые отклонения значений рН и температуры от оптимальных Данные рис 4 и 5 позволяют сделать вывод о том, что гидролиз РНК панкреатической рибонуклеазой необходимо проводить при температуре 62-65°С и рН среды 5,05±0,45

На следующем этапе исследований была изучена кинетика накопления окрашенных соединений в ходе процесса гидролиза РНК В результате обработки экспериментальных данных были найдены значения эффективных констант скорости накопления окрашенных соединений, которые составили к520Эфф=(11,0±0,5) 10'5 с"1 и к400эфф= (7,1 ± 0,3) 10'5 с1 На основе полученных данных было определено, что показатели цветности раствора олигонуклеотидов после 5-ти часового гидролиза не превышают В400 = 1,45 и Оз2о =

оо С? о

52 2

------- У

2 ш

2,8

23 |

1,8 3

1,3

3,5

4,5

5,5

6,5

рН

Рис. 4. Влияние рН среды на показатели соотношений длин волн Условия концентрация субстрата - 100г/л, температура 65°С, концентрация фермента - 2,0 тыс ед/мл, время гидролиза -5 ч 1. д260/230 и 2 - д260/2«°

55 60 65 70 Температура,°С

Рис.5. Влияние температуры на показатели отношений длин волн Условия концентрация субстрата - 100г/л, концентрация фермента - 2,0 тыс ед/мл, рН

5,5, время гидролиза -5 ч 2 - а260/23°

1 - А

260/280

0,35 при проведении процесса при температуре 53-73°С и рН 5,3-5,7

Данные показатели превышают показатели, предъявляемые к фармакопейному препарату в 3-4 раза Поэтому при разработке стадий выделения и очистки конечного продукта необходимо добиться их снижения

Таким образом, режим проведения гидролиза, который обеспечивает максимально возможную (70,0±2,5%) степень гидролиза дрожжевой РНКпри содержании НМК не более 20% НК 62-65°С и рН среды 5,05±0,45 при времени гидролиза 5-6 часов

3.1.2. Отделение продуктов гидролиза от ВМ фракции рибонуклеоти-дов ультрафильтрацией.

Следующей стадией технологического процесса получения панкреатического гидролизата РНК является ультрафильтрация, целью которой было отделение НМ от ВМ фракции Для этого была исследована возможность применения отечественных мембран УАМ с диаметром пор 50-150 Ä при давлении 0,150,4 МПа и температуре 20-30°С При исследовании зависимости производительности мембран от концентрации рибонуклеотидов в ретанте было найдено значение концентрации гелеобразования, которое составило 187±8 г/л При исходной концентрации дрожжевой РНК 100 г/л это позволяет получать пермеат при 3-х кратном изменении объема с выходом НМ фракции до 65% Возможна двойная промывка в режиме диафильтрации При этом в пермеате концентрация moho- и олигорибонуклеотидов составляет 78,3±3,1 г/л, что позволяет проводить эффективное осаждение их спиртом

Результаты эксперимента показали, что при проведении ультрафильтрации панкреатического гидролизата РНК, содержание спирторастворимой фракции возрастает в 1,3 раза Причиной наблюдаемого явления может быть наличие посторонней ферментативной активности, так как процесс происходит в нестерильных условиях То есть полностью управлять процессом ультрафильтрации из-за наличия посторонней микрофлоры невозможно Это приводит к снижению выхода готового продукта Проведение же процесса в стерильных условиях требует высоких энергозатрат на стерилизацию и сложную обработку оборудования с целью удаления посторонней ферментативной активности

Поэтому представляется целесообразным разработать способ снижения содержания спирторастворимой фракции в пермеате Был изучен процесс ультра-

фильтрации панкреатического гидролизата при добавлении к раствору Ь-миндальной кислоты (а-гидроксифенил-уксусной кислоты), ингибитора нуклеаз микроорганизмов, широко известного и применяемого в промышленности при производстве РНК Преимуществом миндальной кислоты является то, что она сама не ухудшает качество готового продукта, так как является лекарственным препаратом Результаты экспериментов использования в процессе ультрафильтрации миндальной кислоты в количестве 0,10-0,30 мг/л гидролизата представлены в табл 2

Таблица 2.

Влияние использования миндальной кислоты в процессе ультрафильтрации на выход панкреатического гидролизата дрожжевой РНК__

Содержание миндальной кислоты, мг/л Концентрация спирто-растворимой фракции в пермеате Выход готового продукта, %

0,00 27,5 51,2±2,3

0,03 24,8 58,3±2,5

0,15 25,5 63,3±3,1

0,20 21,7 63,2±3,4

Из приведенных в табл 2 и 3 данных следует, что применение в процессе ультрафильтрации миндальной кислоты в количестве 0,15 мг/л приводит к снижению посторонней ферментативной активности посторонних рибонуклеаз, что обеспечивает увеличение выхода продукта в 1,2 раза за счет снижения спиртора-створимой фракции в пермеате Применение миндальной кислоты также приводит к повышению стабильности состава целевого продукта Это количество миндальной кислоты было принято в качестве оптимального

Таблица 3.

Влияние использования миндальной кислоты в процессе ультрафильтрации на состав панкреатического гидролизата __

Состав панкреатического гидролизата, (% мае.) Миндальная кислота, мг/л

0,0 0,15

Нуклеозиды и основания 1,5±0,1 1,1±0,1

мононуклеотиды 27,4±1,2 19,1±1,4

ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100% 70,9±3,5 79,6±3,4

Результаты исследований показали, что в ходе ультрафильтрации также происходит осветление гидролизата, поскольку селективность по окрашенным соединениям с максимумом поглощения при 400 и 520 нм составляет соответственно 87 и 93 % Таким образом, после ультрафильтрации показатели цветности пермеата снижаются в 1,5-2 раза Ретант дважды промывали водой в режиме диафильтрации Полученные пермеаты объединяли

3.1.3. Осаждение спиртом и получение готовой лекарственной формы.

Из объединенного пермеата панкреатический гидролизат осаждали этиловым спиртом с гидромодулем 1 10 при температуре 4-8 °С в течение 4 часов Осадок отделяли фильтрованием (выход - 95±2%), промывали также этиловым

спиртом и высушивали в вакуум-сушильном шкафу Сухую смесь олигорибо-нуклеотидов растворяли в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия до конечной концентрации 3,3-3,7%, фильтровали через фильтр с диаметром пор 2000-2200 А при давлении 87±8кПа Раствор стерилизовали при температуре 119-122С0 в течение 34 мин и ампулировали Были получены панкреатические гидролизаты из дрожжей р Candida и Saccharomyces cerevisiae Проведенные испытания показали, что оба препарата соответствуют требованиям, предъявляемым к субстанции лекарственной формы

3.2. Разработка основ технологии получения панкреатической РНК-азы.

3.2.1. Экстракция рибонуклеазы из поджелудочной железы.

На первом этапе исследования было изучено влияние концентрации серной кислоты на скорость накопления извлекаемой из ПЖ рибонуклеазы в объеме су-пернатанта Контроль процесса экстракции осуществляли по накоплению активности рибонуклеазы в экстракте На рис б приведены типичные кривые накопления фермента в жидкой фазе, полученные при различной начальной концентрации серной кислоты Все кривые имеют экстремум, за которым РНКазная активность монотонно падает С увеличением исходной концентрации серной кислоты в среде растут скорости извлечения РНКазы в объем жидкой фазы, причем максимум выхода РНКазы наблюдается при содержании серной кислоты в экст-рагенте 0,125±0,005 моль/л, что согласуется с литературными данными

Время, ч Время, ч

Рис.7. Влияние температуры на активность РНК-азы в объеме жидкой фазы при обработке 6,7 %-ной суспензии ПЖ 0,125 М раствором серной кислоты, (°С) 1 - 0, 2 - 5, 3 - 10 и 4 - 20

Рис.6. Влияние концентрации серной кислоты в экстрагенте на скорость накопления РНК-азы в объеме жидкой фазы Условия температура - 4-6°С, ПЖ (СВ) - 6,7 % мае Обозначение начальная концентрация серной кислоты в экстрагенте (моль/л) 1 -0.031.2-0 062 3 — 0.125 и 4 - 0 156

Типичные кривые накопления фермента в супернатантах, полученных при обработке отличающихся содержанием биомассы ПЖ в одном объеме раствора серной кислоты заданной концентрации указывают на то, что в пределах точности измерений доля извлекаемой РНКазы не зависит от исходного содержания биомассы ПЖ в суспензии Следовательно, исследуемый процесс может быть описан уравнением кинетики 1-ого порядка по массе обрабатываемого биомате-

риала в суспензии Отсутствие точек перегиба на начальных участках кривых рис 6 и 7 позволило предположить для обработки экспериментальных данных следующую схему последовательных превращений (путь 1) к! к2 (путь 2)

А8 -► Аь -Аш, (4),

где А5, Аь , Ам - соответственно РНКазная активность внутри клетки, в объеме жидкой фазы и инактивированная форма фермента, а к] и к2 - соответственно некие эффективные константы исследуемого процесса, зависимые от температуры и концентрации серной кислоты

Обработку экспериментальных данных проводили с использованием уравнения Аррениуса и уравнения кислотно-основного катализа Полученные значения эффективных констант приведены в табл 5

Таблица 5.

Значения эффективных констант и энергий активации отдельных стадий процесса экстракции РНКазы из клеток ПЖ КРС_

Путь Ка, л моль'1 k'YC 10\с" Е, кДж моль-1

путь 1 2,03±0,1 9,6±0,4 15±1

путь 2 50,±2,5 1,7±0,1 30±1

В сочетании со схемой превращений (4) и уравнением Аррениуса они определяют математическую модель процесса выделения РНКазы из ПЖ Ее адекватность подтверждается выполнением условия Fon = 3,74 < Бтабл = 5,35, где F - соответственно опытное и табличное значение критерия Фишера для уровня значимости 0,05

Предложенная кинетическая схема позволяет дать рекомендации для оптимальных условий реализации процесса выделения РНКазы из ПЖ КРС температура 5±2°С, концентрация серной кислоты в экстрагенте (0,125±0,005)М/л, концентрация биомассы ПЖ в суспензии (6,7±0,3) % мае СВ, при которых степень извлечения фермента достигает 95-97%, но время обработки биомассы составляет 18-20 часов

Для сокращения времени экстракции замороженную и измельченную ПЖ подвергали обработке мембранотропным агентом - этиловым спиртом (0,5% мае) в течение 1-2 ч (рис 8)

Рис 8. Влияние предварительной обработки ПЖ КРС на скорость накопления РНК-азы в процессе экстракции Условия- содержание биомассы ПЖ в суспензии (% мае СВ) - 6,7, начальная концентрация серной кислоты в суспензии - 0,125 моль/л, температура - 4-6°С Обозначение 1 - без предварительной обработки, 2-е предварительной обра-12 18 24 боткой этиловым спиртом в количестве Время, ч 0,5% от массы (2 ч)

8000

« 5

аЦ 6000

ев

= Я 4000 а ? § Й 2000

гГ'

Анализ полученных данных позволяет дать следующие рекомендации для реализации стадии экстракции РНК-азы при обработке биомассы ПЖ раствором серной кислоты целесообразно интенсивное перемешивание среды, рекомендуемые условия обработки предварительно замороженной биомассы ПЖ температура (5±2)°С, концентрация серной кислоты в экстрагенте (0,125±0,005) М, время обработки клеток 6,0-6,5 ч

3.2.2. Количественные закономерности стадии ультраконцентрирования.

Получаемые после отделения шлама растворы РНК-азы содержат ВМ фракции белковых веществ 3,5г/л (суммарного бежа 10,9г/л) и имеют активность РНК-азы 11,5 тыс ед/мл При таких низких концентрациях проводить осаждение, как будет показано ниже, нецелесообразно из-за низкой (около 25%) степени осаждения С целью сокращения энергозатрат и расходных норм реагентов представляется целесообразным провести предварительное концентрирование экстракта

Среди возможных методов концентрирования растворов мы выбрали ультрафильтрацию При этом в рассматриваемом процессе появляется возможность возврата пермеата на стадию экстракции, что позволяет сократить норму расхода серной кислоты Были выбраны широко используемые в промышленности мембраны марки УАМ-100 и марки УПМ-450

На рис 9 показано влияние концентрации РНК-азы (ед/мл) в ретанте на величины удельной производительности мембранного аппарата для обеих мембран Из полученных данных следует, что ультраконцентрированию следует

5 а л «3

те Я £ N §

§ 1 в-25 -

£ О 03

i t=!

Рис. 9. Зависимость удельной производительности мембран УАМ-100 - (1) и УПМ-450 - (2) от концентрации РНК-азы (А) в ретанте (в полулогарифмических координатах)

1п А

подвергать растворы, имеющие начальную активность РНК-азы не ниже 10,6 тыс ед/мл, т е исходное содержание биомассы поджелудочной железы при экстракции должно составлять 6,7% Величина потерь РНК-азы в этом случае составляет около 10-12% (УАМ-100) и 12-13% (УПМ-450) от их начального содержания в экстракте Наблюдаемые закономерности позволили рекомендовать для промышленного концентрирования растворов РНК-азы мембрану УПМ-450 Высокое значение селективности (ф=95-98%) и соответствующая концентрации гелеобразования 108,7 тыс ед/мл (39г/л по белку) позволяет проводить процесс

глубокого ультраконцентрирования (степень концентрирования п=9-10) без дополнительного увеличения энергозатрат при перекачивании больших объемов

3.2.3. Количественные закономерности стадии осаждения рибонуклеазы.

Ранее для осаждения РНК-азы использовали метод высаливания сульфатом аммония, что предполагает высокую расходную норму сульфата аммония Было предложено заменить его осаждением в изоэлектрической точке (рН 7,8) Изучены количественные закономерности процесса и выявлены основные факторы, оказывающие на него наибольшее влияние время образования осадка РНК-азы, ее начальная концентрация в растворе

На рис 10 приведены типичные кривые по осаждению РНК-азы в зависимости от начальной активности РНК-азы Вид полученных зависимостей свидетельствует о том, что основная масса осадка образуется в течение 8-10 ч, и в дальнейшем значение степени осаждения существенно не изменяется Вид полученных зависимостей также свидетельствует о том, что с увеличением времени осаждения, концентрации белковых веществ и РНК-азы в растворе степень осаждения биополимеров растет симбатно концентрации последних и достигает в каждом случае своего квазистационарного значения Для количественного описания данных зависимостей мы воспользовались данными теории осаждения частиц Известно, что индуцированные сдвигом скорости зарождения и начального роста частиц осадка описываются уравнением 2-ого порядка

* 90«

в в

§ 60 -

й я и О

5» 30 -

V С ш

и 0"

В этом случае схему образования осадков можно представить в виде' 2(РНК-аза)° <-> (РНК-аза)°2| (6),

которому отвечает уравнение связи степени осаждения с начачальной концентрацией РНК-азы xs/(l-xs)2=Ks Ао (7)

Схема 6, уравнение 7 и значения констант k.i=9,6±0,4 10"5 с"1, Ks=2,03±0,l л моль"1 определяют кинетическую схему процесса осаждения РНК-азы в изоэлектрической точке и позволяют дать рекомендации по оптимальному режиму процесса температура 4-6 °С, рН 7,8±0,1, начальная активность РНК-азы в растворах не ниже 105 103 ед/мл При таких условиях осаждения и времени отстаивания суспензии - 1,5-2 ч можно достичь степени осаждения РНК-азы 85-90%

10 20 Время, ч

Рис. 10 Типичные кривые осаждения РНК-азы из ретанта с различным содержанием фермента в ИЭТ (рН 7,8) Условия температура - 4-6°С Обозначение начальная концентрация рибонуклеазы в ретанте (тыс ед/мл) 1 - 13,71, 2 - 26,7, 3 - 52,2 и 4- 68,5

3.2.4. Очистка препарата технической РНКазы

Образующийся осадок ФП имеет активность 9000 ед/мг белка, содержание белковых веществ - 65% Однако, наряду с основным веществом он содержит примесь ДНК-аз на уровне 3,8±0,2 ед/мг белка, содержание которых в фармакопейном препарате не допускается Чтобы избавиться от последних и одновременно от протеаз, мы воспользовались известным способом [McDonald, 1955] Для этого осадок технического ФП растворили в подкисленной воде (рН 3,0) до активности 150 тыс ед/мл и добавили тонко измельченный сульфат аммония до концентрации 144 г/л Полученный раствор нагревали при температуре 95°С в течение 10 мин, затем охладили до 5°С, довели рН раствора до 7,8 концентрированным раствором едкого натрия и осадили РНК-азу

Далее РНК-азу освободили от соли гельфильтрацией на сефадексе G-25, переосадили 95%-ным этанолом и высушили Полученный препарат содержал 85% белковых веществ, имел удельную активность (9,6±0,4) тыс ед/мг препарата при практически полном отсутствии ДНК-азной и протеазной активности, что удовлетворяет требованиям ФС Выход технической РНК-азы составил 0,5% от сухой массы железы (в 4,2 раз выше по сравнению с известными технологиями) Расчеты технико-экономических показателей производства панкреатического гидролизата при мощности производства 100 кг/год и рибонуклеазы 2кг/год показали, что себестоимость этих препаратов составляет соответственно 190 руб/г и 2000 руб/г Выводы

1 Разработана технология получения панкреатического гидролизата натриевой соли рибонуклеиновой кислоты из нового источника нуклеината натрия РНК -хлебопекарных дрожжей, обеспечивающая получение фармакопейного препарата

2 Исследовано влияние миндальной кислоты на подавление посторонней ферментативной активности в процессе ультрафильтрации и показано, что введение миндальной кислоты является условием повышения стабильности состава панкреатического гидролизата при сохранении его нетоксичности и апирогенности и повышения выхода продукта на 10-12% по сравнению с известными технологиями

3 Разработаны критерии контроля качества исходного сырья, полупродуктов и самого продукта по содержанию в них низкомолекулярных продуктов глубокого гидролиза РНК для получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК, отвечающего требованиям, предъявляемым к субстанциям лекарственных форм

4 Разработана технология получения ферментного препарата рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы с активностью 8500-14000 ед/мг препарата, в которой за счет введения ультраконцентрирования и осаждения рибонуклеазы в ИЭТ, обеспечивается выход продукта до 0,5 % мае от поджелудочной железы, что в 4,2 раза выше по сравнению с существующей технологией

5 Проведены расчеты технико-экономических показателей производства панкреатического гидролизата дрожжевой РНК мощностью 100 кг/год и рибонук-

леазы бычьей поджелудочной железы - 2 кг/год Показано, что применение разработанной технологии рибонуклеазы, обеспечивающей ее себестоимость не более 2000 руб/г, приводит к снижению себестоимости панкреатического гид-ролизата на 30% по сравнению с препаратом, полученным с использованием импортного фермента

Список публикаций по теме диссертации:

1 Красноштанова А А, Баурина М М, Крылов И А Пути интенсификации процесса получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК // Тез докл П1 Межд конф «Окружающая среда для нас и будущих поколений Экология, бизнес и экологическое образование» - Самара, 1999 - С 28

2 Крылов И А , Красноштанова А А , Рукинова Т А , Баурина М М, Шабанова М М , Эль-Регистан Г И, Кухаренко А А. Способ получения низкомолекулярных фракций биологически активных веществ из клеточных биополимеров Патент РФ № 2179579 от 24 02 2002

3 Коротун И В , Баурина М М , Яковлева Н В , Красноштанова А А Исследование количественных закономерностей процесса получения панкреатического гидролизата РНК // Тез докл. XIV Межд конф по химии и химической технологии - Москва, 2000 - С 9

4 Красноштанова А А , Баурина М М , Кашкина Е А, Крылов И А Способ получения панкреатической рибонуклеазы Патент РФ № 2180918 от 27 03 2002

5. Красноштанова А А , Рукинова Т А , Кашкина Е А , Баурина М М, Крылов И А , Эль-Регистан Г И Интенсификация ферментативных процессов гидролиза биополимеров // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья -2000 -№6 - С. 59-60

6 Баурина М М, Красноштанова А А , Крылов И А Изучение количественных закономерностей процесса получения панкреатического гидролизата РНК // Тез докл Межд конф «От фундаментальной науки к новым технологиям Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок Экологически безопасные технологии» -Москва - Тверь, 2001 -С 2223

7 Эль-Регистан Г И, Карпекина Т А , Степаненко И Ю , Крылова Е И , Ша-ненко Е Ф , Крылов И А , Красноштанова А А , Баурина М М, Будран Ж Стабилизация индивидуальных ферментов и ферментных систем алкилоксибензолами // 1-ый Межд конгр "Биотехнология - состояние и перспективы развития" -Москва, 2002 - С 195-196

8 Баурина М М , Красноштанова А А , Шабанова М Е , Крылов И А Получение очищенного препарата панкреатического гидролизата дрожжевой РНК // 1-ый Межд конгр. "Биотехнология - состояние и перспективы развития" - Москва, 2002 - С 245

9 Баурина М М , Красноштанова А А , Крылов И А Разработка ресурсосберегающей технологии получения панкреатической рибонуклеазы // 2-ой Межд Конгр "Биотехнология - состояние и перспективы развития" - Москва, 2003 -С 296

10 Баурина ММ, Красноштанова АА, Шабанова ME, Крылов И А, Краснопольский Ю М Способ получения и характеристика иммунокорректора нуклеинового ряда//Нейроиммунология -2003 -Т1,№2 -С.18-19

11 Баурина М М, Красноштанова А.А, Крылов И.А Разработка основ технологии получения пищевкусовой добавки на основе олиго-3 ',5 '-циклофосфатов // Тез докл научно-техн конф "Технологии живых систем" - Москва, 2003 -С 79-82.

12 Баурина М М , Красноштанова А А, Крылов И А , Шабанова М М Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты Патент РФ № 2274658 от 20 04 2006

13 Шабанова М Е, Баурина М М, Красноштанова А А, Крылов И А Применение лекарственного препарата Энкад в качестве средства, стимулирующего гемопоэтическую функцию костного мозга // Тез докл Межд конф "Биотехнология и медицина" - Москва, 2006 - С 142-143

14 Шабанова М Е , Казаньев В В , Баурина М М , Красноштанова А А, Крылов И А Способ усиления пролиферативной активности костного мозга // Патогенез -2006 -Т 4,№1 -С 71

15 BaunnaM М, Krasnoshtanova A A, Krylov I A Development of Resourse-Savrng Technology of Bovine Pancreatic Ribonuclease Manufacture // Industrial Application of Biotechnology - New York, 2006 -P. 55-61

16 Dudnikova E A., Baurina M M, Krasnoshtanova A A, Krylov IA Elaborating Bases of Technology of Isolation of Amylase, Lipase and a Complex of Proteases from Cattle Pancreas // Industrial Application of Biotechnology - New York, 2006 -P 28-37

17 Баурина M M , Красноштанова A A , Крылов И А Разработка ресурсосберегающей технологии получения рибонуклеазы из поджелудочной железы КРС//Химическая технология -2007 -Т8,№4 -С 185-190

Список сокращений: СВ-сухие вещества, ФС — фармакопейная статья, ТУ - технические условия, НК-нуклеиновые компоненты, РНК - рибонуклеиновая кислота, ВМФ - высокомолекулярная фракция, НМФ - низкомолекулярная фракция, НМК - низкомолекулярные компоненты, НМ - низкомолекулярные, ВМ - высокомолекулярные, РНК-аза - рибонуклеаза, ПЖ - поджелудочная железа, ФП - ферментный препарат

Подписано в печать 18 04 07 Формат 60x90 1/16 Гарнитура Тайме Печать офсетная Бумага тип Услпечл 1,5 Тираж 100 экз Заказ № 4137

Отпечатано в типографии ООО «Мультипринт» 121360 г Москва, ул Верейская,д 29 Тел. 978-85-03; 518-76-24;

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Баурина, Марина Михайловна

Введение.

Список принятых в работе сокращений.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Нуклеиновые кислоты и их производные. Метаболизм рибонуклео-тидов. Характеристика, способы получения и применение панкреатического гидролизата дрожжевой РНК.

1.2. Панкреатическая рибонуклеазы, характеристика, применение и способы выделения.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Реагенты.

2.3. Методы анализа.

2.4. Методы исследования.

2.4.1. Методика проведения гидролиза дрожжевой РНК панкреатической рибонуклеазой.

2.4.2. Отделение моно- и олигорибонуклеотидов от высокомолекулярной фракции дрожжевой РНК ультрафильтрацией.

2.4.3. Методика проведения стерилизации раствора панкреатического гидролизата РНК.

2.4.4. Методика проведения опытов по экстракции рибонуклеазы из поджелудочной железы КРС.

Глава 3. Основные экспериментальные данные и обсуждение результатов.

3.1. Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК.

3.1.1. Ферментативный гидролиз дрожжевой РНК. Количественные закономерности процесса.

3.1.2. Разделение ВМ и НМ фракций продуктов гидролиза ультрафильтрацией. Количественные закономерности процесса.

3.1.3. Осаждение смеси моно- и олигорибонуклеотидов из водноспиртовых растворов. Количественные закономерности процесса.

3.2. Разработка основ технологии получения панкреатической рибонук-леазы.

3.2.1. Исследование количественных закономерностей экстракции рибо-нуклеазы из поджелудочной железы КРС.

3.2.2. Количественные закономерности стадии ультрафильтрации.

3.2.3. Количественные закономерности стадии осаждения рибо-нуклеазы.

3.2.4. Очистка препарата технической рибонуклеазы.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК"

Актуальность работы. В настоящее время разработка недорогих эффективных лекарственных средств отечественного производства является одной из актуальных задач сохранения здоровья, продолжительности и качества жизни людей, решаемых современной российской фармацевтической промышленностью. Препараты нуклеиновой природы находят широкое применение в качестве лекарственных средств. Отечественный фармакопейный препарат - панкреатический гидролизат РНК, известный под названием Энкад, представляет собой смесь олигонуклеотидов и пиримидиновых нуклеозид-3'-фосфатов. Препарат регулирует обмен нуклеотидов в тканях, обладает имму-номодулирующими свойствами, способствует улучшению функций клеточных мембран, проведению импульса по двигательным нервам, уменьшению миодистрофических процессов и оптимизации биоэнергетики мышц. Препарат применяется для лечения наследственных тапеторетинальных абиотрофий - заболеваний, приводящих к слабовидению и слепоте. До настоящего времени не существует эффективных методов лечения этой группы болезней в мире. Препарат также разрешен к применению при болезни Шегрена, при дегенеративных заболеваниях нервно-мышечной системы: наследственных формах миопатий (ранние стадии), врожденном и приобретенном миопатическом синдроме, различных формах невральных абиотрофий, последствиях нейро-инфекций, спинальных амиотрофиях. Показана клиническая эффективность применения препарата Энкад при ряде других социально значимых заболеваниях (язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, псориаз, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз).

Ранее сухая субстанция Энкада выпускалась на предприятии НПО «Био-лар» (г.Олайне, Латвия) при использовании в качестве сырья РНК дрожжей p.Torula, производства которых прекращены. Лекарственная форма препарата, выпускаемая в настоящее время на Харьковском предприятии по производству бактерийных препаратов (Украина), поставляется в Россию в ограниченных количествах, не удовлетворяющих потребности РФ. В связи с этим организация производства субстанции Энкад и его инъекционной формы на территории РФ является актуальной. Наиболее перспективным сырьем получения РНК в настоящее время для России являются хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые не требуют организации специального производства, так как выпускаются промышленностью в больших объемах и также образуются в значительных количествах в качестве отходов спиртового производства.

Для получения панкреатического гидролизата РНК используется рибо-нуклеаза, выделяемая из бычьей поджелудочной железы - отхода мясоперерабатывающей промышленности. Известно, что себестоимость большинства биологически активных веществ, получаемых с использованием ферментов, в значительной степени зависит от стоимости последних. Существующие технологии получения рибонуклеазы многостадийны, длительны и характеризуются низким выходом фермента. В настоящее время накоплен огромный опыт переработки и выделения различных комплексов ферментов из поджелудочной железы. В связи с этим актуальным является совершенствование технологии получения ферментного препарата рибонуклеазы для создания эффективного и малоотходного производства. Рибонуклеаза помимо этого широко используется в медицине в качестве противовирусного средства и применяется в области молекулярной биологии.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи: 1) Разработать технологический режим получения панкреатического гидро-лизата дрожжевой РНК как субстанции препарата Энкад, обеспечивающий повышение выхода целевого продукта:

- изучить возможность использования нового источника сырья натриевой соли низкомолекулярной РНК из хлебопекарных дрожжей для получения панкреатического гидролизата требуемого качества.

- разработать условия повышения стабильности состава панкреатического гидролизата.

2) Разработать режим основных технологических стадий извлечения рибо-нуклеазы из бычьей поджелудочной железы: экстракции, концентрирования, осаждения и очистки фермента с целью повышения выхода целевого продукта.

Научная новизна. Впервые разработана технология получения препарата панкреатического гидролизата РНК из хлебопекарных дрожжей Saccharo-myces cerevisiae, отвечающего требованиям, предъявляемым к субстанциям лекарственных форм.

Проведено количественное изучение процессов гидролиза полирибонук-леотидов дрожжей, отделения от высокомолекулярных компонентов продуктов гидролиза и осаждения их из водно-спиртового раствора, что позволило разработать алгоритм управления технологическим процессом.

Практическая значимость. Разработана технология получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты из хлебопекарных дрожжей с увеличением выхода продукта на 10-12% по сравнению с известными технологиями. Показано, что применение ингибитора рибонуклеаз - миндальной кислоты на стадии ультраконцетрирования позволило повысить стабильность состава готового продукта при сохранении его нетоксичности и апирогенно-сти.

Разработаны основные стадии технологического процесса получения ферментного препарата рибонуклеазы (из бычьей поджелудочной железы) и условия их проведения, обеспечивающие увеличение выхода продукта до 0,5% мае. от сухой железы, что в 4,2 раза выше по сравнению с существующими технологиями.

Список принятых в работе сокращений:

РНК - дрожжевая рибонуклеиновая кислота - гетерогенный полирибонукле-отид;

ПГ РНК - панкреатический гидролизат дрожжевой РНК;

ПЖ - поджелудочная железа;

КРС - крупный рогатый скот;

ФП - ферментный препарат;

СВ - сухое вещество;

УФ - ультрафильтрация;

ФРПФ - 5-фосфо-рибозил-1-пирофосфат;

АТФ - аденозинтрифосфат;

ГТФ -гуанозинтрифосфат;

СТФ - цитидинтрифосфат;

УМФ - уридинмонофосфат;

ИМФ - инозинмонофосфат;

АДА - аденозиндезаминаза;

ПНФ - пуриннуклеозидфосфорилаза;

МПА - мясопептонный агар;

СА - сусло-агар;

ФС - фармакопейная статья.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Баурина, Марина Михайловна

Выводы:

1 .Разработана технология получения панкреатического гидролизата натриевой соли рибонуклеиновой кислоты из нового источника нуклеината натрия РНК - хлебопекарных дрожжей, обеспечивающая получение фармакопейного препарата.

2.Исследовано влияние миндальной кислоты на подавление посторонней ферментативной активности в процессе ультрафильтрации и показано, что введение миндальной кислоты является условием повышения стабильности состава панкреатического гидролизата при сохранении его нетоксичности и апирогенности и повышения выхода продукта на 10-12% по сравнению с известными технологиями.

3.Разработаны критерии контроля качества исходного сырья, полупродуктов и самого продукта по содержанию в них низкомолекулярных продуктов глубокого гидролиза РНК для получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК, отвечающего требованиям, предъявляемым к субстанциям лекарственных форм.

4.Разработана технология получения ферментного препарата рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы с активностью 8500-14000 ед/мг препарата, в которой за счет введения ультраконцентрирования и осаждения рибонуклеазы в ИЭТ, обеспечивается выход продукта до 0,5 % мае. от поджелудочной железы, что в 4,2 раза выше по сравнению с существующей технологией.

5.Проведены расчеты технико-экономических показателей производства панкреатического гидролизата дрожжевой РНК мощностью 100 кг/год и рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы - 2 кг/год. Показано, что применение разработанной технологии рибонуклеазы, обеспечивающей её себестоимость не более 2000 руб/г, приводит к снижению себестоимости панкреатического гидролизата на 30% по сравнению с препаратом, полученным с использованием импортного фермента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Баурина, Марина Михайловна, Москва

1. Ленинджер А. Основы биохимии. -М.:Мир. 1985.Т.-1-3. С1056

2. Элиот В. Биохимия и молекулярная биология. М.МАИК «Наука/Интерпериодика». - 2002. - С.446.

3. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. -Т.2. М. Мир,- 1993.-С. 415

4. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М. -Мир, -1986. -Т. 1-5.

5. Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У .Я. Низкомолекулярная РНК получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне,- 1985,С. 191

6. Машковский М.Д. Лекарственные средства М.: ООО «Изд-во Новая Волна», 2001.-С. 540

7. Авцын А.П., Фукс Б.Б., Шабанова М.Е., Терещенко О.Д. Наследственные дистрофии сетчатки у человека в связи с результатами их патегенетической терапии // Вестник Акад. Мед. наук СССР, 1971. Медицина, №7. - С. 63-69

8. ГОСТ 12.0.003 74 ССБТ. Опасные и вредные производственные факторы. Классификация.

9. Фукс Б.Б., Шершевская С.Ф., Попова Л.М., Шнапер А.Л. Заместительный лечебный эффект рибонуклеотидов при некоторых болезнях. // Бюлл. эксп. биол. и медицины, 1969, - № 9. - С. 23-26

10. Young Richhard W. The renewal of photoreceptor cell outer segments J. Cell Biol. Apr 1967. v.33. (1) P.61-72

11. И. Фукс Б.Б., Шершевская С.Ф., Левина Ф.Г. Шабанова М.Е. О специфическом лечебном эффекте рибонуклеотидов при тапеторетинальных дистрофиях //Вестник Акад. Мед. наук СССР, «Медицина» - Москва. - 1971. - № 7.- С. 63-68

12. Трутнева К.Б., Кацнельсон Н.А., Богословский Н.И., Фукс Б.Б., Милев-ская Т.И., Авербах В.М., Шабанова М.Е., Шамшинова A.M. Препараты РНКи рибонуклеотидов в лечении тапеторетинальных дистрофий. Вестник офтальмологии. - №2. - С. 68-77. - 1972

13. Шершевская С.Ф., Левина Ф.Г. Клинический опыт применения препаратов РНК при лечении тапето-ретинальных дистрофий. Вестник Акад. Мед. наук СССР. - «Медицина» - М., - 1978.-№10.-С 40-43.

14. Кацнельсон Л. И., Богословский Н. Е., Трутнева К. В. Результаты лечения препаратом Энкадом периферической пигментной абиотрофии сетчатки. Вестник АМН СССР. 1978, №10-С.36-40

15. Кацнельсон Л.И., Трутнева К.В., Богословский Н.Е. и др. Результаты длительного динамического наблюдения за применением препарата Энкад при пигментной тапеторетинальной абиотрофии // Вестник офтальмологии, 1982. -№ 2.-С. 28-29

16. Шабанова М.Е. Регенерация родопсина при наследственной дистрофии сетчатки. // Дисс. канд. биол. наук. -М., 1982 Рукопись.

17. Коновалова Н.В. Экспериментальное обоснование фонофореза препарата энкад и его клиническое использование при лечении больных пигментной дегенерации сетчатки. Канд. Дис. - Одесса 1988 С. 140

18. Багров С.Н., Шабанова М.Е. Механизм лечебного воздействия препарата энкад. - Нейроиммунология на пороге XXI века. - С-Петербург-1992 С. 120

19. Гринио Л.П., Агафонов Б.В. Миопатии. М. - Медицина, - 1997 - С. 213

20. Шабанова М.Е., Гринио Л.П., Корабельников Н.И., Фукс Б.Б. Лекарственный препаратдля лечения дегенеративных заболеваний нервно-мышечной системы. Материалы симпозиума М. ИБХ РАН - Изд-во РУДН. - 2005. С. 108

21. Пожарицкая М.М., Копьева Т.Н., Клиническая С.С. Цитологическая и иммунологическая характеристика действия препарата Энкад на слизистую оболочку полости рта при болезни Шенгрена Тер. архив.- 1988.- №4. -С. 7577

22. Бунина Т. Л., Хондкариан О. А., Коршунова Т. С. и др. Лечение бокового амиотрофического склероза рибонуклеотидами // Журнал Невропаталогии и психиатрии им. С.С. Корсакова, 1976. t.LXXV1, С. 166-174

23. Гринио Л. П., Фукс Б. Б., Шабанова М. Е. и Корабельникова Н. И. Лекарственный препарат для лечения дегенеративных заболеваний нервно-мышечной системы,-А. с. 1703113, А 61 К 31/52, 35/72. Опубл. 24.06.1985

24. Макаров С.В., Липина Л.Н., Вологдина Н.Н., Шабанова М.Е. Применение препарата Энкад в терапии демиелинизирующего процесса. Нейроиммуноло-гия на пороге XXI в. С-Петербург-1992. - С.43-44.

25. Маркушева Л.И., Тихонов Ю.В., Тогузов Р.Т. Метаболический пул пуриновых соединений в эпидермисе и крови больных псориазом с применением препарата Энкад. Клиническая лабораторная диагностика. 1998 -№8. -С. 43.

26. Саруханова А. Г. Препарат дрожжевой РНК (Энкад) в терапии больных псориасом. // Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем и хронических дерматозов. Тез. науч. раб. Науч. практ. конф. -Екатеринбург, 2002.-С. 183

27. Патент№ 2016579 РФ Рясина Т.В., Коршунова Т.С., Шабанова М.Е., Ко-шелев В.Б., Крушинский A.JL, Ларский Э.Г., Озереденко В.Г. Антигипокси-ческое средство для лечения ишемических нарушений мозгового кровообращения

28. Кольцов П.А., Шабанова М.Е. Энкад в лечении язвенной болезни 1-й Российский конгресс «Человек и лекарство». М. 1992. -С. 36

29. Серебряков С.Н. Опыт клинического применения препарата Энкад в лечении больных язвенной болезнью желудка и 12-типерстной кишки. Актуальные проблемы гастроэнтерологии и сочетанной патологии в геронтологии.-1995. С. 136-137

30. Vasiliyeva E.F., Kolyaskina G., Tsutsulovskaya M., Kaleda V., Shabanova М.Е. Effect of Encad on Lymphocytes in Schizophrenia. Abstracts of X World Congress of Psychiatry. Madrid. 1996 v.2. p.243

31. Васильева Е.Ф., КушнерС.Г., Каледа В.Г., Шабанова М.Е.Система естественной цитотоксичности и иммуномодулирующее действие Энкада при шизофрении. Материалы 10-ой научно-практической конференции неврологов «Нейроиммунология». С.-Петербург. 2001. С.38-40

32. Шабанова М.Е., Крылов И.А. Новые возможности медицинского применения отечественного препарата нуклеотидов Аллергология и иммунология в педиатрии 2006№ 2-3 (9) С 94

33. Рубенис О.С., Бринкманис Р.А., Ирген А. М., Лиепеня В.А., Тенисон Р.А. Прикладная биохимия и микробиология, 1976, т.ХН, вып. 3, с. 403 407

34. By Тхи Фыонг Ань Разработка основ технологии РНК из дрожжей // Дисс. канд. хим. наук. -М., 1997 Рукопись!

35. Методы исследования нуклеиновых кислот. Под ред. Белозерского А.Н. М. Мир. 1970.С.278

36. Пратикум по биохимии: Учебное пособие/ Под ред. С.Е., Соловьевой Г.А. М. Изд-во МГУ, 1989 С.509

37. Norimoto Y., Ohmura S., Enzymatic Hydrolysis of Ribonucleic Acid US Patent US 3,920,519 Nov. 18, 1975

38. Beljanski M. Polyribonucleotides capable of promoting the genesis of leucocytes and blood platelets. Пат. 4,190,649 (США), A61K 31/70. 0публ.26.02.1980

39. Beljanski M. Polyribonucleotides capable of promoting the genesis of leucocytes and blood platelets. Пат. 4,335,239 (США), A6IK 31/70. Опубл. 15.06.1982

40. Фукс Б.Б. Способ получения рибонуклеотидов Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1969 №9 С 23-26

41. Богословский А. И., Кацнельсон Л. А., Милявская Т. И., Трутнева К. В., Фукс Б. Б., Шабанова М. Е. и Шершевская С. Ф. Способ получения рибонуклеотидов. А.с. 663403 (СССР), А 61К 37/00. Опубл. 15.11.1976

42. Гайлума М. А., Ермолаев Е. Д., Замах В. П., Микстайс У. Я., Семтурис М. М. Фукс Б. Б. и Шабанова М. Е. Способ получения рибонуклеотидов. А.с. 948108 (СССР), С 07 Н 19/00. Опубл. 11.02.1981

43. Фукс Б. Б., Шабанова М. Е., Федоров С. Н., Краснопольский М. Ю., Микстайс У. Я., Ермолаев Е.Г. и Гаймула М.А. Способ получения рибонуклеотидов.-А.с. 1575359 (СССР), С 12 Р19/34. Опубл. 14.06.1988

44. Fux В.В., Shabanova М.Е., Fedorov S.N., Krasnopolsky J.M., Mixtais U.Y., Ermolaev E. D., Gaimula M.A. Method of Preparing a Mixture of Ribonucleotides. Patent US 5064758, С12Р19/ЗООпубл 12.11.1991 .

45. Тимиров IO.G., Швец В.И., Краснопольский Ю.М. Способ получения рибонуклеотидов. Патент UA 66706А. А61К37/00, С12Р19/34.0публ.17.05.2004

46. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Т. 1-3. М.: Мир, 1982. С. 1120

47. Dubos R. J. and Thompson R. H. S. The Decomposition of Yeast Nucleic Acid by a Heat-resistant Enzyme J. Biol.Chem 1938 124,(2) p 501-510

48. Шапот В. С. Нуклеазы. M., Медицина, 1968. С. 212

49. Aqvist, S. E. G. and Anfinsen, C.B. A Comparative Study of the Structures of Bovine and Ovine Pancreatic Ribonucleases // J. Biol. Chem., 234,1112 (1959)

50. С. H. Hirs, S. Moore, and W. Stein. A Chromatographic Investigation of Pancreatic Ribonuclease. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 200. pgs. 493506. Feb. 1953.

51. G. Taborsky. Chromatography of Ribonuclease on Carboxymethyl Cellulose Columns. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 234. pgs. 2652 2656. Oct. 1959.

52. Anfinsen CB, White FH Occurrence, Structure, and Properties The Enzymes P. Boyer Academic Press. NY 1961. v.5. p. 95-122

53. Кнорре Д. 3., Мызина С. Д. Биологическая химия М.: Высш. шк. 2002. -С. 469

54. Barnard Е A Biological Function of Pancreatic Ribonuclease. Nature. i969. v. 221. p. 340-344

55. A.S.E.G. Anfinsen The Isolation and Characterization of Ribonucleases from Sheep Pancreas. J. Biol. Chem. 1959. v. 234 p. 1112-1117

56. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты М. Мир. 1982 Т. 1-3 С.1118

57. Moore S., Stein W. Н. Chemical Structures of Pancreatic Ribonuclease and Deoxyribonuclease, Science, 180, 458-464 (1973)

58. Plumber Т.Н. Hir C.H.W. On the Structure of Bovine Pancreatic Ribonuclease

59. B. Isolation of a Glycopeptide. J. Biol. Chem 1964 239 p. 2530-2538

60. Richards F. M., Wyckoff H.W. Bovine Pancreatic Ribonuclease. The Enzymes. P. Boyer Academic Press. NY 1971. p. 647-806

61. Кнорре Д.Г. Биологическая химия. M., Высш. шк. 2002 С.479.

62. Филлипович Ю. Б. Основы биохимии. Изд. «Высшая школа», М., 1969,1. C. 574

63. Kunitz М. Crystalline Ribonuclease. J. General Physiology 1940. v.24, 15 p. 15-32

64. McDonald M. Proteolytic Contaminants of Crystalline Ribonuclease. J. General Physiology 1948. v.32 p. 33-37

65. Кривошеев Б. Н., Салганик Р. И., Лыкова С. Г. и др. Опыт применения рибонуклеазы в лечении псориаза. // Современные вопросы дерматологии и венерологии. Новосибирск, 1993. С. 30-35

66. Scheit К. Н., Reddy Е. R. and Murti Т. R. Seminal plasma ribonuclease and method for its recovery. US Pat. 4,331, 764 C12N 9/22 25.05.1982

67. Рогов И. А., ШапогинаА. M., Комолова Г. С., Ионова И. Н., Тихомирова Н.А. Способ очистки сырья молочной промышленности от избытка панкреатической рибонуклеазы. А.с. 02110066 (РФ). Опубл. 27.04.1998

68. Федосов Ю.В., Рассказов В.А. Способ получения рибонуклеазы А.с. SU813845A. А61К35/60. Опубл. 30.03.1986. Бюл №12

69. Козлов А. В., Ковалева Л. Б. и Мячин В. Ф. Способы очистки нуклеазы из проростков ячменя. А.с. 1703688 (СССР), C12N 9/22. Опубл. 07.01.1992

70. Банникова Г. Е., ВарламовВ. П. и Рогожин С. В. Способ выделения и очистки бактериальной эндонуклеазы из культуральной жидкости Serratia marcescens. А.с. 1392902 (СССР), C12N 9/22 Опубл. 01.09.1986

71. McDonald М. A Method for Preparation of Protease-free Crystalline Ribonuclease J. General Physiology 1948. v.32 p. 39-42

72. McDonald M. R., Ribonucleases. Methods in enzymology. New York. Academic Press, 1955, v.2, p. 427

73. Crestfield A.M., Stein W.H., Moore S. On the Preparation of Pancreatic Ribonuclease A. J. Biol. Chem. 1963 238. p.618-621

74. Maxvell L.C. Thompson Prepapation of Pancreatic Enztmes Ribonuclease, Trypsinogen, chymotrypsin В and Alpha Chemotrypsin US Patent 2751329 C12N 9/22 Опубл. 19.06.1956

75. Хомов B.B., Сизов A.A., Масычева В.И. и Загребельный С.Н. Способ получения рибонуклеазы панкреатической. А.с. 0291195 (РФ), А61К 35/39. Опубл. 20.09.1997

76. Рышка Ф.Ю., Полонская Л.Б., Беленький Н.Г. и др., Способ очистки рибонуклеазы. А.с. 259790 (СССР), Кл. 6а, 22/07. Опубл. 27.12.1970

77. Куриненко Б.М., Калачева Н.В., Способ получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы. А.с. 540873 (СССР), C12N 9/22, C12N 9/12. Опубл. 08.02.1987

78. Левицкий А.П., Барабаш Р.Д., Марченко А.И. и др., Способ получения рибонуклеазы. А.с. 561565 (СССР), C12N 9/22. Опубл. 22.07.1977

79. Голубенко И.А. и др., Рибонуклеаза Bacillus intermedins 7р. Очистка хроматографией на фосфоцеллюлозе и некоторые характеристики гомогенного продукта. // «Биохимия», т.44, вып.4, М., 1979, с.640-647

80. Лещинская И.Б., Клейнер Г.И.,, Паэгле Б.Я. и др. Способ получения внеклеточной щелочной рибонуклеазы Bacillus intermedins 7р. А.с. 1010125 (СССР), C12N 9/22, C12N 1/20 Опубл. 07.04.1983

81. Банникова Г.Е., Варламов В.П. и Рогожин С.В. Способ выделения и очистки буктериальной эндонуклеазы из культуральной жидкости Serratia marcescens. А.с. 1392902 (СССР), C12N 9/22 Опубл. 01.09.1986

82. Хомов В.В., Сизов А.А., Масычева В.И. и Загребельный С.Н. Способ получения рибонуклеазы панкреатической. А.с. 0291195 (РФ), А61К 35/39. Опубл. 20.09.1997

83. Глазова Н.В., Быченкова О.В., Писарев О.А. и др. Способ очистки рибонуклеазы. А.с. 2152995 (РФ), C12N 9/22. Опубл. 20.07.2000

84. Практикум по биохимии. / Под ред. Северина С.Е., М.: МГУ, 1989, 509с.

85. Kunitz М. A spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity//J. Biol. Chem., 1946, V. 164, №161, P. 563-568

86. Kalnitsky G. and Rogers W. I. The activity of ribonuclease after digestion with carboxypeptidase // Biochimica et Biophysica Acta v. 20, 1956, p. 378-386

87. Kunitz M. Crystalline Desoxyribonuclease. Spectrophotometric Method for the Measurement of Desoxyribonuclease Activity. J. General Physiology 1950. v.33. p.349-377

88. Полыгина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева JI.B. Определение активности ферментов. Справочник. М.: ДеЛи принт, 2003. - С. 373

89. Землянухин А.А. Малый практикум по биохимии. Воронеж, Изд-во Воронежского ун-та, 1985. С. 254

90. Методы исследования нуклеиновых кислот. / Под редакцией Белозерского А.Н., М.: «Мир»,1970. С. 277

91. Крешков А. П. Основы аналитической химии. М., Изд-во «Химия». 1972,-С. 657

92. Худсон Д. Статистика для физиков. М., Изд-во «Мир», - 1970. - С. 270

93. Дытнерский Ю. И. Баромембранные процессы. Теория и расчет. М.: Химия, 1986.-С. 272

94. Дытнерский Ю.И. Процессы и аппараты химической технологии. Т.2. М. Химия.-2002.-С. 368

95. Березин М.А., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: МГУ, 1976. - С. 320

96. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с англ. В 2-х частях. 4.2. М.: Мир, 1989. - С. 590

97. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. - С. 720

98. Zendzian E.N., Barnard Е.А. Disdributions of Pancreatic Ribonuclease, Chy-motrypsin, and Trypsin in Vertebrates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1967. v.122. p.699-713.

99. Баер H.A., Неклюдов А.Д., Иванкин A.H., Дубина В.И., Бердутина А.В., Баканов Н.А. Способ активации комплекса протеолитических ферментов поджелудочной железы убойных животных. Патент РФ № 2112801. 1998. Б.И. № 16.

100. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Биологически активные соединения из природных объектов. Свойства и структурно-функциональные взаимосвязи. М.: МГУЛ, 2003.480 с.

Информация о работе

Баурина, Марина Михайловна
кандидата химических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы