Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка основ технологии получения никотинамидадениндинуклеотида из биомассы хлебопекарских дрожжей

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка основ технологии получения никотинамидадениндинуклеотида из биомассы хлебопекарских дрожжей"

На правах рукописи

003054 1ш

Парижева Раиса Абдул-Хамидовна

Разработка основ технологии получения никотинамидадениндинуклеотида из биомассы хлебопекарских дрожжей.

03.00.23 - биотехнология.

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук.

Москва - 2007

003054110

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д. И. Менделеева.

Научный руководитель:

Кандидат химических наук, доцент Красноштанова Алла Альбертовна.

Официальные оппоненты:

Доктор технических наук, профессор Строгов Семен Ефимович.

Кандидат химических наук, доцент Сидоров Александр Иванович.

Ведущая организация: Московская государственная академия

тонкой химической технологии имени М.В.Ломоносова ЗО

Защита диссертации состоится « » í£¿¿1&?7¿1- 2007 г в часов на заседании Диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ

им. Д. И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., д. 9) в 443 ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д. И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан « А» ¿РШЛС/S2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета ДМ 212.204.13 U '^ОЯС^Г и. В. Шакир.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) является одним из важнейших коферментов, ответственных за окислительно-восстановительные процессы в клетках. НАД используется в медицине, как иммуномодулятор. Он обеспечивает нейротрансмиттерную функцию - передачу нервных импульсов между мозгом и остальными органами тела. Нарушение синтеза некоторых гормонов, например, интерферона, также может быть вызвано недостатком НАД. Никотинамидные коферменты являются антиоксидан-тами, защищают организм от свободных радикалов, токсинов, канцерогенов, загрязнений окружающей среды и изменений в процессе старения. Кроме того, НАДН защищает печень от алкоголя, предотвращая образование алькогольин-дуцированного ингибитора - тестостерона. Он также нормализует уровень холестерина и кровяного давления. НАД входит в состав лекарственных препаратов, используемых для лечения болезней, связанных с нарушением деятельности центральной нервной системы, таких как болезни Паркинсона и Альцгей-мера. Также препараты, содержащие НАД, используют в медицине при лечении заболеваний сердца, желудка и печени. Например, препарат «Энергостим», содержащий НАД, цитохром С и инозин, применяли в терапии животных, страдающих токсико-аллергическим миокардом.

В настоящее время НАД за рубежом получают микробиологическим и химическим синтезом. Химический синтез является многостадийным процессом с применением дорогостоящих реагентов. В России производство НАД в настоящее время отсутствует. Сегодня в мире развиты крупнотоннажные биотехнологические производства, в которых отходом является микробная биомасса, которая может являться потенциальным источником НАД. В литературе приводится описание методов выделения НАД из микробной биомассы, которые не используются в промышленности из-за сложности масштабирования процесса и применения дорогостоящих и труднодоступных реагентов. Для промышленного получения НАД наиболее перспективным сырьем являются хлебопекар-ские дрожжи Васс1\аготусе$ сеге\'1я1ае, которые выпускаются промышленностью в больших объемах, а также образуются в значительных количествах в качестве отходов спиртового производства. Так как содержание НАД в биомассе дрожжей не превышает 0,3% от воздушно сухих веществ (СВ), организация такого сопутствующего производства не позволит снизить количества образующегося твердого отхода, хотя и повысит рентабельность основного производства.

Поэтому представляется актуальной разработка технологии выделения НАД из биомассы хлебопекарских дрожжей с применением дешевых и доступных реагентов (растворы минеральных кислот, солей и щелочей) и технологических операций, которые могут быть реализованы в промышленных условиях с утилизацией образующихся твердых и жидких отходов.

Целью работы явилась разработка малоотходной технологии получения очищенного препарата НАД из нативной биомассы хлебопекарских дрожжей.

В задачи данной работы входило: создание научных основ с целью совершенствования технологического процесса получения НАД из биомассы хле-бопекарских дрожжей включающего экстракцию водными растворами, ультрафильтрацию, одностадийный ионный обмен, осаждение из водно-спиртовых растворов, разработка кинетических схем для создания алгоритма управления технологическим процессом и предложить пути утилизации отходов, образующихся в основном производстве, для получения на их основе продуктов нук-леотидной, белковой и углеводной природы технического назначения.

Научная новизна: Впервые показана возможность получения очищенного препарата НАД из биомассы хлебопекарских дрожжей с применением стадии ультрафильтрации для очистки от высокомолекулярных примесей, одностадийного ионного обмена на катеоните, кристаллизации из водно-спиртового раствора.

Показана принципиальная возможность получения НАД из биомассы других дрожжей (p. Candida, Torula) по предлагаемой технологии.

Впервые показана возможность применения миндальной кислоты в качестве ингибитора нуклеаз на стадии экстракции НАД, что позволило упростить процесс очистки конечного продукта от примесей нуклеотидной природы.

Проведено количественное изучение стадий экстракции НАД, ультрафильтрации, ионного обмена, кристаллизации из водно-спиртовых растворов, как основы для создания алгоритма управления технологическим процессом получения НАД.

Практическая значимость: Разработаны основы технологии получения очищенного препарата НАД (с содержанием основного вещества не менее 95%) из нативной биомассы хлебопекарских дрожжей. Предложены алгоритмы управления стадиями экстракции НАД из биомассы дрожжей, ультрафильтрации, ионного обмена и кристаллизации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: Третьем Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2005 г); Международных конференциях «Успехи в химии и химической технологии» (РХТУ им. Д. И. Менделеева, Москва, ноябрь 2004 г, ноябрь 2005 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и два тезисных сообщения в материалах научных конференций.

Структура и объем работы: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методик проведения экспериментов и анализов, 5-ти глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы ( 115 наименований, в том числе 100 на иностранных языках) и 4 приложений. Работа изложена на 165 стр. машинописного текста и содержит 60 таблиц, 64 рисунков,

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Обзор литературы.

В обзоре литературы приводятся характеристика и области применения НАД, описание и анализ способов получения НАД из различных источников

сырья и методов его очистки, краткая характеристика метаболических путей образования НАД.

2. Материалы и методы.

В работе использовали нативную биомассу хлебопекарских дрожжей производства ОАО «Дербеневка», отобранную в конце логарифмической фазы роста, содержащую 0,2-0,3% НАД, 6-7% суммарных нуклеиновых кислот, 45-50% сырого протеина; высокоочищенные препараты НАД, НАДН, НАДФ, ферментный препарат алкогольдегидрогеназы производства фирмы ICN с активностью не менее 273 ед/г, а также химические реактивы квалификации не ниже «чда»; титранты и растворы для проведения анализов готовили на дистиллированной воде.

Содержание сырого протеина определяли микрометодом Къельдаля, белковых веществ - модифицированным методом Лоури, суммарных нуклеиновых компонентов - методом Спирина, НАД - по специфической реакции восстановления алкогольдегидргеназой в присутствии этанола; содержание восстановленных форм НАДН и НАДФН по реакции их окисления соответственно до НАД и НАДФ в присутствии феназинметасульфата.

Эксперименты по экстракции НАД проводили в лабораторном стеклянном реакторе объемом до 1 л, снабженном рубашкой для обогрева, горловинами для отбора проб и механической мешалкой.

Ультрафильтрацшо проводили с использованием плоских мембран и полых волокон с диаметром пор, задерживающих вещества с молекулярными массами 5, 10,15, 20кДа.

Ионообменную очистку НАД проводили методом ионного обмена с применением сильнокислотного катионита С-150.

Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки «Specord-M40».

Экспериментальные данные обрабатывали, используя стандартные программы интегрирования дифференциальных уравнений и оптимизации их параметров с последующим сопоставлением результатов расчета с экспериментом по критерию Фишера при уровне значимости 0,05 для проверки адекватности разработанных математических моделей эксперименту.

3. Экспериментальная часть и обсуждение результатов.

3.1. Экстракция никотинамидных коферментов из нативной биомассы хлебопекарских дрожжей водными растворами.

Анализ литературных данных показывает, что для извлечения никотинамидных коферментов применяют различные экстрагенты. При выборе экстра-гента необходимо учитывать, что никотинамидные коферменты неустойчивы при повышенных температурах и экстремальных значениях рН среды. В связи с этим проведение процесса экстракции в жестких условиях может привести к их значительному разрушению и накоплению в экстракте в высоких концентрациях других веществ, содержащихся в микробной клетке, прежде всего, нуклео-тидной, белковой и углеводной природы. Поэтому в качестве экстрагента нами были выбраны водные растворы, имеющие слабокислые и слабощелочные значения рН среды. Согласно литературным данным известно, что в таких услови-

ях происходит частичная перфорация клеточных мембран, что приводит к выходу низкомолекулярных соединений в раствор.

В качестве параметров процесса экстракции были выбраны: начальное содержание дрожжей в суспензии, температура и рН среды, которые меняли соответственно в интервалах: 2,5 -10% мае., 60 -90°С, 6,0 -10,9.

На рис. 1. приведены типичные кривые накопления никотинамидных ко-ферментов при экстракции из биомассы хлебопекарских дрожжей. Из представленных данных следует, что в экстракте присутствуют 4 типа нуклеотид-ных коферментов (ввиду методических сложностей раздельное определение НАДФН и НАДН не проводилось, а определялось суммарно содержание восстановленных; форм (£НАД(Ф)Н). Из представленных результатов следует, что в данных условиях с максимальным выходом извлекается НАД, выход же остальных коферментов не превышает 30-40%. Кроме того, содержание НАДН, НАДФН и НАДФ в клетках дрожжей в 5-10 раз меньше, чем НАД, поэтому их извлечение из экстрактов экономически нецелесообразно В связи с этим дальнейшая оптимизация условий экстракции проводилась с точки зрения достижения максимального выхода НАД. Анализ вида кинетических кривых показал отсутствие зависимости степени извлечения НАД от исходного содержания биомассы в суспензии, что позволяет предположить 1-ый порядок процесса Также, на начальных участках кинетических кривых отсутствует Б-образный характер, а сами они имеют экстремум. Все это позволяет представить процесс экстракции НАД в виде следующей схемы последовательно-параллельных превращений:

где НАДр и £НАД(Ф)НР - соответственно содержание НАД и восстановленных форм нуклеотидных коферментов в биомассе, а НАД[. и 2НЛД(Ф)НЬ. их же концентрации в растворе. кь кг, кз, ]ц - эффективные константы скорости соответствующих стадий.

Для данной схемы был выбран следующий порядок обработки экспериментальных данных. Первоначально при одной и той же температуре (80°С) и рН среды (6,0) изучали зависимость в координатах 1п (1-х)~:С(т), (х - степень извлечения НАД и £НАД(Ф)Н в раствор). Как видно из рис. 2, данную зависимость можно считать линейной (гк=0,95). Зависимости, представленные на рис. 2, позволяют оценить численные значения эффективных констант к! и кг. Константы к3 и кд находили в ходе численного интегрирования системы дифференциальных уравнений, отвечающих схеме превращений (1). После оценки всех значений эффективных констант проводили их оптимизацию.

Тот же подход использовали при изучении влияния температуры и рН среды, обрабатывая соответствующие серии кинетических кривых. В ходе обработки экспериментальных данных было установлено, что влияние на скорость экстракции никотинамидных коферментов температуры описывается уравнением Аррениуса, а влияние рН среды - уравнением специфического кислотно-основного катализа:

7 *

а ОН

Ка + аон _

(2),

где к* - эффективная константа скорости, не зависящая от активности гидро-ксид-иона в растворе, а0н- - активность гидроксид-ионов, Ка - константа равновесия образования интермедиата между гидроксид-ионами и никотинамидными коферментами.

На основе установленных значений эффективных констант, уравнений Аррениуса и (2) были рассчитаны параметры к*; Ка; Е (эффективной энергии активации) для каждой стадии в схеме превращений (1), причем для уравнения (2) наблюдалось 2 участка линейной зависимости: первый в интервале рН - 6,08,5, второй - 9,6-10,9. Их значения приведены в таблице 1.

Как показали последующие расчеты, схема превращений (1) определяет кинетическую схему процесса экстракции никотинамидных коферментов водными растворами из дрожжевой биомассы. Она адекватно описывает экспериментальные данные в выбранных интервалах изменения температуры, содержания дрожжей в суспензии и рН среды.

Таблица 1.

Значения эффективных констант и энергии активации процесса экстракции НАД и ХНАД(Ф)Н из биомассы хлебопекарских дрожжей БасЬаготусез сеге-

Путь Е, рН 6,0-8,5 рН 9,6-10,9

кДж/моль к*, с1 Ка, к*, с1 Ка, моль/л

•10"3 моль/л» 10"6 •10"3 •10"5

к, 7,0±0,7 1,16 ±0,10 1,60±0,16 0,23±0,02 4,80±0,48

к2 8,2±0,8 1,25 ±0,12 1,65±0,16 0,55±0,06 5,10±0,50

к3 13,9±1,3 0,30 ±0,03 1,70±0,17 1,33±0,13 6,12±0,61

кд 10,1±1,0 0,25 ±0,03 1,65±0,17 0,45±0,05 6,07±0,60

Используя данную математическую модель, попытались подобрать условия, оптимальные для выделения НАД. Проведенные с использованием предложенной кинетической схемы расчеты, подтвержденные в дальнейшем экспериментом, показали, что НАД извлекается с выходом 90 % при (80±2) °С, рН 6,0 ± 0,1 в течение 20 минут.

Как видно из рис.1, при увеличении времени экстракции свыше 20 мин происходит снижение выхода НАД, что связано с его деструкцией под воздействием высокой температуры. С целью снижения потерь НАД на стадии экстракции была изучена возможность применения цистеина и сульфита натрия -веществ, широко используемых в технологии выделения БАВ в качестве стабилизаторов, а также миндальной кислоты, которая является ингибитором внутриклеточных рибонуклеаз. Результаты исследований по влиянию вышеуказан-

ных соеданений на кинетику экстракции НАД представлены в таблице 2 и на рис. 3.

Таблица 2.

Влияние концентрации цистеина, сульфита натрия, миндальной кислоты на вы-

Цистеин Сульфит натрия Миндальная кислота

С, моль/л Выход, % С,моль/л Выход, % С,моль/л ю-5 Выход, %

0,10 47,2 0,10 51,3 2,6 95,0

0,25 39,0 0,25 42,0 3,9 93,2

0,50 26,5 0,50 26,4 7,9 91,2

Из представленных данных следует, что минимальная деструкция НАД наблюдается при использовании миндальной кислоты в концентрации 2,6 10"5моль/л. Выход НАД при этом возрастает незначительно.

Перед проведением дальнейшей переработки полученного экстракта клетки дрожжей отделили центрифугированием при факторе разделения 280(^ и получили бесклеточный экстракт, состав которого представлен в таблице 3. Основным отходом на данной стадии является отработанная биомасса дрожжей в количестве 8260 г/г НАД, содержащая 17% СВ, 50% СП, 0,8 % НК в пересчете на СВ. Она может быть использована для получения кормового белкового продукта либо переработана в продукты нуклеотидной и белковой природы.

Как видно из представленных данных, содержание НАД1" в полученном экстракте относительно других компонентов не велико, поэтому его выделение представляет собой достаточно сложную технологическую задачу, которую мы решили в несколько этапов.

Таблица 3.

Состав НАД- содержащего экстракта из биомассы хлебопекарских дрожжей.

Наименование компонента Д44", нм НАД БК НК УВ

Относительное содержание, % 0,55 0,8 45,2 6,8 47,3

3.2. Очистка НАД-содержащих экстрактов ультрафильтрацией.

Поскольку экстракция никотинамидных коферментов проводилась при повышенной температуре, но при нейтральных значениях рН среды, то мы не вправе ожидать высокой степени извлечения высокомолекулярных фракций нуклеиновых и белковых компонентов. Данное предположение было подтверждено результатами анализа на содержание высокомолекулярной фракции белковых веществ модифицированным методом Лоури, показавшими, что последняя присутствует в экстракте в количестве не более 10-15% от суммы белковых веществ. Что касается нуклеиновых компонентов, то ранее проведенные исследования по выделению дрожжевой РНК из биомассы дрожжей показали, что в данных условиях происходит в основном извлечение так называемого «низкомолекулярного пула нуклеиновых кислот», который всегда присутствует в дрожжах за счет действия примесных рибонуклеаз. В связи с этим стадию ультрафильтрационной очистки мы использовали для осветления раствора, частичного удаления примесей белковой, нуклеотидной и углеводной природы.

Ранее проведенные на кафедре биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева показали, что для разделения компонентов дрожжевого экстракта лучше всего подходят мембраны УПМ-5, УПМ-10, УПМ-15, УПМ-20, удерживающие вещества с молекулярными массами соответственно 5,10,15,20 кДа. Их характеристики, применительно к разделению компонентов дрожжевого экстракта, представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, наилучшими показателями обладает мембрана УПМ-10, которая имеет достаточно высокую производительность и максимальную интегральную селективность по всем примесным компонентам раствора. Селективность по НАД для этой мембраны составляет 18 %. Её отличное от «нуля» значение свидетельствует о том, что при проведении процесса экстракции при повышенной температуре возможно ковалентное связывание НАД с другими биополимерами клетки, что приводит к задерживанию НАД мембранным фильтром. Результаты проведенных исследований влияния температуры на интегральную селективность, представленные на рис. 4, показали, что заметное возрастание последней происходит при ультраконцентрировании экстрактов, полученных при температурах выше 80°С. Было сделано предположение, что введение в экстракт стабилизирующих добавок может понизить степень связывания НАД с высокомолекулярными соединениями и тем самым повысить выход его в пермеат. Результаты представлены на рис. 3, из которого следует, что в случае введения в экстракт миндальной кислоты в концентрации 3,9-10"5 моль/л интегральная селективность по НАД снижается с 18% до 8%.

Таблица 4.

Основные характеристики ультрафильтрационных мембран в процессе очистки НАД- содержащих экстрактов от высокомолекулярных примесей, полученных в оптимальных условиях._

Характеристики процесса ультрафильтрации Тип мембраны

УПМ-5 УПМ-10 УПМ-15 УПМ-20

Интегральная селективность мембранного аппарата (ср*) по:

-НАД 8,0 8,0 13,6 13,0

- белковым веществам 54,0 55,0 35,0 28,0

- нуклеиновым компонентам 83,0 82,0 19,0 13,0

- углеводам 6,5 6,0 4,5 2,6

-Удельная производительность мембранного аппарата по пермеа-ту, О, л/м2 • ч 0,1 0,4 0,8 1,8

* - р = \—- , (3) где Сп и Ск - соответственно концентрации исследуе-

Ск

мых компонентов в пермеате и экстракте.

1 т 0,8 0,6 -

X

0,4 0,2 -

10 11

15 20 Время,мин

0

-0,5 -1 -1,5 -2 -2,5

н —!— а=к. — — — —1— а_=кз; . _ - - -

2

;

;

; 1

1

Время, мин

Рис.2 Зависимость начальной скорости экстракции никотинамидных

Рис 1. Кривые накопления нуклеотидных коферментов в экстракте

в процессе водной экстракции из биомассы хлебопекарских дрожжей коферментов от времени при различных СВ. Условия: I = 80°С; рН бДОбозначения: 1 - НАД; Условия-1 = 80°С; рН 6,0; СВ -10% Обозначения: 2 - £НАД(Ф)Н; 3 - НАДФ СВ дрожжей в суспензии: Д - 2,5 %; Q - 5,0%; <) -7,5%; О -10%.

1 -НАД; 2-£НАД(Ф)Н.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Время, мин

Рис 3. Кривые экстракции НАД+ в оптимальных условиях 0 = 80°С, рН 6,0, СВ дрожжей - 10 % мае ) в присутствии антиоксидантов Обозначения концентрации антиоксидантов 1-миндальная кислота С=0,1 моль/л, 2-цистеин С=0Д моль/л, 3-сульфит натрия С-0,5 моль/л

60 65 70 75 80 85 90 95

Рис 4 Влияние температуры экстракции на селективность мембраны УАМ-10 по основным компонентам дрожжевого экстракта. Условия экстракции СВ -10%, рН 6,0, время 20 мин Обозначения 1 -БК,2 - НК, 3 - НАД, 4 - УВ

ос

Для выбранной мембраны УПМ-10 была получена зависимость удельной производительности ультрафильтрационной установки от концентрации белковых веществ, которые, как видно из таблицы 4, в наибольшей степени задерживаются мембраной. Её вид приведен на рис. 5. Наличие линейного участка на кривой Сг= Г (1п СБк,Р) позволяет провести обработку данных, используя уравнение для мембраны с «идеальной селективностью»:

где Сг - концентрация олигонуклеотидов, отвечающая точке их гелеобразова-ния, ¡3 - коэффициент массоотдачи. Такая обработка дала значения Сг = 67 г/л; |3 = 0,5 л/м2-ч.

Величина Сг значительно превышает реальные концентрации белковых веществ в ретанте и экстракте, поэтому гелеобразование не является лимитирующим фактором процесса. Это позволяет с учетом геометрии аппарата концентрировать экстракт не менее чем в 10 раз.

В результате проведения ультрафильтрации получили пермеат и ретант, состав которых представлен в таблице 5.

Состав НАД- содержащего пермеата из биомассы хлебопекарских дрожжей (в

Наименование показателя дш НАД БК НК УВ

Относительное содержание в пермеате, % 0,35 0,6 43,8 3,3 53,4

Относительное содержание в ретанте, % 1,23 0,3 53,5 2Д 44,0

Из представленных в таблице 5 данных следует, что ультрафильтрация позволяет получить осветленный прозрачный раствор, в котором относительное содержание НАД в расчете на СВ по сравнению с экстрактом увеличивается в 1,3 раза. Такой раствор может быть направлен на выделение НАД. Отходами данной стадии является ретант, образующийся в количестве 1,5 л/г НАД Он содержит 9,2 г/л СП, 37 г/л НК и 75 г/л УВ и может быть объединен с биомассой дрожжей с получением кормового продукта. 3.3. Выделение и очистка НАД ионным обменом.

НАД в пермеате, как следует из таблицы 5, присутствует в составе многокомпонентной смеси, причем не является её основным компонентом. На основе предварительных исследований была выбрана схема ионообменного выделения и очистки НАД с применением различных сильных и слабых катионитов и анионитов (таблица 6). Столь широкий спектр исследованных ионообменных смол обусловлен тем, что НАД может сорбироваться как по ионному, так и по гидрофобному механизму. То же самое можно сказать и об остальных компонентах пермеата. На первом этапе исследований были проведены эксперименты по сорбции компонентов пермеата на ионитах. Для сокращения объемов сточных вод был выбран способ статической сорбции и десорбции целевого продукта. Для всех ионитов было подобрано оптимальное соотношение ио-нит:пермеат, обеспечивающее 95%-ую степень сорбции НАД. Результаты опытов показали, что для большинства ионитов оно оказалось близким 1:1. Из таб-

Таблица 5.

лицы 6 следует, что иониты А-847, ЭДЭ-10П, АВ-17><8 в ОН-форме и КУ-2*8 не обеспечивают высокую степень сорбции НАД, поэтому в дальнейших исследованиях их не использовали.

Таблица 6.

Эффективность сорбции компонентов пермеата на различных ионитах.

Тип ионита и его форма Степень сорбции при соотношении ионит : пермеат 1:1,%

НАД нк БК УВ

КУ-2х8, Н" 55 82 94 35

КУ-2><8, NH4+ 40 75 90 26

С-145, НГ 81 78 93 32

С-150, Н4 92 75 96 40

АВ-17х8, СГ 90 95 98 50

АВ-17х8, ОН" 78 82 63 33

ЭДЭ-10П, ОН" 63 76 82 69

ЭДЭ-10П, СГ 65 80 86 70

А-847, СГ 35 42 40 28

На рис.6 приведены кривые сорбции НАД из пермеата при оптимальном соотношении ионит.раствор, а также кривая изменения рН среды в ходе процесса. Из полученных данных следует, что НАД сорбируется на данном ионите по ионному механизму. Однако расчеты показали, что число освобождаемых катионов водорода не соответствует количеству сорбированного НАД, что позволяет предположить наличие и гидрофобного механизма сорбции. Поэтому процесс сорбирования НАД на катеонит можно представить следующей схемой превращений:

НАД^ + в. — Н+ ) Я-НАД± + Н+ НАД^ + К-Н+< Ь ) Н+-Я-НАД^ к-\ к-2

(3)

где кь к _ь к 2; к. 2- константы обратимой сорбции НАД на ионите по ионному и гидрофобному механизму.

Обработка экспериментальных данных по вышеприведенной схеме (3) показала, что кривые сорбции НАД адекватно описываются при значениях констант ку=(2,0±0,2) 10"3 с-моль"1; к.,=(8,3±0,83) 10"4 с"1; к2=1,03±0,10 с-моль"1; к_2 =(2,9±0,29) 10'3 с"1.

Поскольку оптимальное соотношение ионит:пермеат оказалось достаточно высоким, то межгранулыюе пространство ионита содержит значительное количество примесей, прежде всего белковой и углеводной природы, поэтому перед проведением десорбции необходимо провести промывку ионита водой. В результате эксперимента было установлено, что оптимальная кратность промывки составляет 2,5 объема воды на 1 объем ионита. При этом соотношении относительное суммарное содержание НАД на ионите и в межгранульном пространстве возрастает в 1,77 раза, а содержание углеводов снижается в 1,53 раза. На следующем этапе работы мы оценили эффективность десорбции НАД с вышеуказанных ионитов.

Были испытаны два типа элюентов: 50 %-ный водный раствор этилового спирта, который используется в промышленности для десорбции веществ по гидрофобному механизму, а также растворы НС1 различной концентрации - для десорбции по ионному механизму. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Эффективность десорбции компонентов пермеата на различных ионитах.

Тип ионита и тип элюэнта Степень десорбции, при соотношении ионит:пермеат 1:1, %

НАД НК БК УВ

С-145, ГГ, 50%-ный рас- 15 36 22 85

твор этилового спирта

С-145, Н", 0,005 н раствор 60 33 15 70

соляной кислоты

С-145, ЬГ, 0,01 н раствор 55 41 27 74

соляной кислоты

С-145, КГ, 0,1 н раствор 62 50 62 75

соляной кислоты

С-150, П\ 50%-ный рас- 6 40 17 82

твор этилового спирта

С-150, tT, 0,005 н раствор 73 26 8 69

соляной кислоты

С-150, КГ, 0,01 н раствор 75 39 20 65

соляной кислоты

С-150, IT, 0,1 н раствор 70 46 58 60

соляной кислоты

АВ-17х8, СГ, 50%-ный 16 27 23 79

раствор этилового спирта

АВ-17х8, СГ, 0,005 н рас- 20 18 54 49

твор соляной кислоты

АВ-17х8, СГ, 0,01 н рас- 18 25 48 52

твор соляной кислоты

АВ-17х8, СГ, 0,1 н рас- 22 37 60 55

твор соляной кислоты

Из приведенных данных видно, что катионит С-150 обеспечивает максимальную очистку НАД от посторонних примесей при проведении на 1-ом этапе десорбции 50%-ным этиловым спиртом, что позволяет удалить углеводные примеси на 80%, а потери НАД не превышают 6 - 8% (рис.7). Таким образом, на основе полученных результатов был сделан вывод о целесообразности использования для ионного обмена катионита С-150, а в качестве элюэнта использовать соляную кислоту с концентрацией 0,005 н. На рис. 8 представлены соответствующие кинетические кривые десорбции. При изучении кинетики процесса использовали вышеприведенную схему превращений 3. Результаты последующих расчетов подтвердили возможность адекватного описания экспериментальных данных при тех же значениях

Рис 5 Зависимость удельной производительности процесса ультрафильтрации НАД- содержащего раствора для мембраны УПМ-10 от логарифма концентрации БК в ретанте.

40 50 60

Время, мин

100

Рис 7 Десорбция 50%-м раствором этилового спирта с катионита С-150. Условия десорбции соотношение катионит элюент 1'1 Обозначения: 1-УВ; 2-НК; 3-НАД; 4-БК.

1

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 * 0,4 0,3 0,2 0,1 0

у----.....!..... —|

—-

\ /у

• ;

— ?- —«

//у' 1

' 1

7 6 5

4 5

ш о. 3 ° X

2 1 0

10

35 40

45

15 20 25 30

Время, мин

Рис.б. Сорбция компонентов пермеата на кагионите С-150. Условия сорбции: I = 24°С; соотношение катионит пермеат 1:1 Обозначения: 1-БК; 2-НАД; 3-1 ПС; 4-УВ; 5-рН.

30 40 Время, мин

Рис 8 Зависимость степени десорбции НАД, БК, НК, УВ с катионита С-150 Условия десорбции: 1=24°С, С НС1-0,005 Н Обозначения 1-НАД, 2-УВ; 3-НК; 4-БК.

ю

констант. Расчеты, подтвержденные экспериментом, по оптимизации концентрации НС1 в элюенте показали, что НАД десорбируется 0,005 н НС1 на 73% за 40 минут. В ходе оптимизации объемного соотношения ионит: элюент было установлено, что в интервале соотношений 1:1 - 1:10 компонентный состав элюата практически не изменяется, тогда как выход НАД1" возрастает с 67 (при объемном соотношении 1:1) до 87-89% (при объемном соотношении больше 1:5). Исходя из этого было выбрано оптимальное соотношение ионит:элюэнт 1:5.

Полученный элюат содержит 0,024 г/л НАД+; 0,058 г/л НК; 0,1 г/л БК; 0,7 г/л УВ. Как показали результаты исследования стадии кристаллизации, таких концентраций для осаждения НАД не достаточно. Повторное использование элюата на стадии десорбции также не привело к увеличению концентрации НАД в растворе. Поэтому в технологический процесс ввели стадию вакуум-выпаривания. Поскольку, как показали предварительные исследования, наиболее просто из раствора осадить белковые вещества, кратность упаривания была выбрана, исходя из необходимости создания концентрации белковых веществ 5 г/л, т.е. в 50 раз.

Упаренный элюат, содержащий г/л: 1,2-НАД+; 2,9-НК; 5,0-БК; 35-УВ передавался на стадию кристаллизации.

На стадии ионного обмена отходом являются несорбированная фракция и промывные воды общим объемом 45,5 л/г НАД, содержащие 3,8 г/л СП, 0,14 г/л НК, 4,7 г/л УВ. Их можно объединить с биомассой кормовых дрожжей с последующей утилизацией с получением кормового продукта.

Поскольку в выбранных режимах ионного обмена степень десорбции БК не превышает 8-10%, то было предложено проводить регенерацию катионита 2%-ным раствором аммиака при объемном соотношении ионит:элюэнт 1:2, что обеспечивает десорбцию белковых компонентов на 95%. Полученный элюат можно использовать после выпаривания и высушивания в качестве азотсодержащей основы питательных сред для культивирования дрожжей. 3.4. Кристаллизация НАД из водно-спиртовых растворов.

При изучении процесса кристаллизации подбирали условия, обеспечивающие наиболее эффективное разделение компонентов упаренного элюата. Предварительные исследования показали, что использовать для этой цели осаждение из водных растворов неэффективно, поэтому было проведено изучение количественных закономерностей процесса осаждения из водно-спиртовых растворов. На рис. 9-12 приведены зависимости степени осаждения (Xs) НАД, НК, БК и УВ при различных объемных соотношениях упаренный элю-ат:этиловый спирт. Как следует из данных рисунков, показатель Xs во всех случаях монотонно растет с увеличением объемного соотношения этиловый спирт:упаренный элюат, однако, во всех случаях он не достигает 100%. Вид полученных зависимостей позволил предположить для каждого из компонентов раствора известную из литературы схему образования осадка, основанную на теории индуцированных сдвигом скоростей зарождения и образования осадков: к ¡ (4), где X - концентрация осаждаемого компонента.

2 X------> X 2 i Для данной зависимости в условиях стационара

*—Jrj¡----имеет место равенство Xs- (1-Xs)2 = (к]/ к _i) -С0, где

Со - начальная концентрация НАД в

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

1 1 1 1 1 :

\ \ \ \ ¡ i i i i ;

1 I 1 ' н t . t ..: , t T1

i- , %■ - . L___1---- * +

f! ! ! i. i

-4-2- Í--3-

/ J/ ____*—* т i i -É 4'

1ípr \ ; ; ; ; ;

■r ; ' ' i ! - -1-1- -1-1

0 5 10 15 20

25 30 35 40 Время,мин

45 50 55 60 65

Рис.11 Кривые осаждения нуклеиновых компонентов из водно-спиртового раствора. Условия осаждения' Г = 4-6°С, Сисх НК= 6,8 г/л Обозначения объемных соотношений упаренного элюата к этиловому спирту -1- 1 10, 2- 1:5; 3- 1.3; 4- 1:1.

25 30 35 40 45 50 55 60 65 Время,мин

Рис.9. Кривые осаждения НАД из водно-спиртового раствора. Условия осаждения: I = 4-6°С, Сисх. НАД=2,8г/л

Обозначения объемных соотношений упаренного элюата к этиловому спирту: 1- 1:10,2- 1:5; 3-1:3; 4-1:1.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Время, МИН

Рис.10. Кривые осаждения белковых веществ из водно-спиртового раствора. Условия осаждения: I = 4-6°С, Сисх. БК=40,28 г/л Обозначения объемных соотношений упаренного элюата к этиловому спирту: 1-1:10; 2- 1-5, 3-1 3; 4- 1:1.

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 о

II illl i i \ t

¡ ¡ 1 1 ¡

\ \ ! !

j ¡

! ¡ i i -- Í4-

1 1 _4 E—*—^—f—- —*— —— -i

t i m É- Ш- ж ?

E- «-Ш-*- —*— -¿3

v—щ—*—*— * i -

1 ' 'P-- t- 1 ..... —!——1 ——i l—-- -1-

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Время, мин

Рис 12 Кривые осаждения углеводов из водно-спиртового раствора Условия осаждения I - 4-6°С, Сисх УВ=53,4 г/л

Обозначения объемных соотношений упаренного элюата к этиловому спирту: 1- 1.10, 2- 1-5, 3- 1:3; 4- 1.1.

растворе. В дальнейшем значение каждой константы находили при обработке кривых образования осадка. Их значения приведены в таблице 5, из которой следует что константы к] и к _1 не остаются постоянными, а линейно (гК=0,95) изменяются в зависимости от концентрации спирта и воды.

Наличие линейных зависимостей значительно упростило поведение соответствующих расчетов по выбору условий очистки и выделения НАД. Проведенные расчеты показали, что наиболее полно (на 90%) осаждаются БК уже при объемном соотношении раствор:спирт 1:1, и начальной концентрации 10 г/л, тогда как НАД осаждается на 90% и более при объемном соотношении рас-твор:спирт 1:10 и начальной концентрации 1,0-1,5 г/л. Степень осаждения примесей нуклеотидной и углеводной природы во всех случаях не превышала 2030%. Вышеуказанные различия в данных условиях позволили нам предложить следующую схему очистки и выделения НАД методом кристаллизации.

Таблица 8.

Значение эффективных констант процесса кристаллизации НАД, белковых веществ, углеводов и нуклеиновых компонентов из водно-спиртовых растворов.

Объемное НАД, С =2,8 г/л НК, С=6,8 г/л БК, С=40,28 г/л УВ, С=53,44 г/л

соотноше- к, к, ,с\ к, к-ьс'1, к: к.,, к, к-ьс1,

ние рас- г/л ■ с"1, •Ю-2 г/л -с"1, •ю-2 г/л ■ с"1, с-\-10-3 г/л • с"1, •ю-2

твор. ■10"2 •ю-2 •10"3 •ю-3

этиловыи

спирт

1:1 3,0 ± 20,02 0,70 ± 8,0 ± 6,0 ± 1,50 ± 0,50 ± 12,0 ±

0,2 ±1,60 0,06 0,5 0,5 0,15 0,04 1,0

1:2 5,0 ± 14,00 1,00 ± 7,5 ± 6,5 ± 1,00 ± 0,60 ± 10,0 ±

0,4 ±1,10 0,08 0,6 0,6 0,10 0,05 0,8

1:5 9,0 ± 5,00 ± 1,50 ± 5,0 ± 7,5 ± 0,15 ± 1,00 ± 8,0 ±

0,7 0,40 0,01 0,4 0,7 0,01 0,08 0,6

1:10 12,0 0,10 ± 3,00 ± 2,5 ± 8,5 ± 0,10 ± 2,00 ± 6,0 ±

±0,9 0,01 0,02 0,2 0,8 0,01 0,02 0,5

1. Осаждение компонентов упаренного элюата при объемном соотношении этиловый спирт:раствор 1:1, при этом происходит отделение осадка, главным образом, БК.

2. Доведение объемного соотношения раствор:этиловый спирт до 1:10 и отделение осадка НАД+. Состав осадка, получаемого на этой стадии в % к СВ следующий: НАД - 26,3; НК - 13,6; БК - 41,8; УВ - 18,3 .

3. Повторное осаждение с использованием сначала объемного соотношения раствор:этиловый спирт 1:1, отделение осадка БК и осаждение НАД+ при объемном соотношении раствор:этиловый спирт 1:10. состав полученного осадка следующий, в % к СВ: НАД- 74,2; НК - 7,6; БК - 6,4; УВ - 11,8, что соответствует качеству технического препарата.

4. Двукратная перекристаллизация технического НАД проводилась из водно-спиртового раствора при объемном соотношении раствор:этиловый спирт 1:10. При этом содержание НАД в препарате увеличилось с 90% после 1-ой кристаллизации до 96,7% после 2-ой.

Общие потери НАД на стадии кристаллизации не превышали 20%.

Осадки БК могут быть объединены с водно-аммиачным элюатом со стадии ионного обмена и совместно переработаны в азотсодержащую основу питательных сред.

По результатам работы была разработана технологическая схема получения НАД из биомассы хлебопекарских дрожжей, с выходом НАД 0,048 % от массы сухих дрожжей или 22 % от его исходного содержания в биомассе.

Выводы:

1. Предложена технологическая схема получения НАД из биомассы хлебопекарских дрожжей, включающая в себя экстракцию водным раствором, ультрафильтрацию, выделение целевого продукта ионным обменом, его кристаллизацию и перекристаллизацию из водно-спиртового раствора, сушку готового продукта. Выход НАД с содержанием основного вещества 98% составляет 0,048% от массы сухих дрожжей или 22% от его содержания в биомассе.

2. Проведено количественное изучение процесса водной экстракции, подчиняющегося законам специфического кислотно-основного катализа. Предложены кинетические схемы для управления процессом экстракции, на основе которых подобраны оптимальные условия процесса экстракции, обеспечивающие выход НАД не менее 90% от его содержания в клетке.

3. Показано, что добавление миндальной кислоты в концентрации 3,9-10"5 моль/л к экстрагенту позволяет в дальнейшем на стадии ультрафильтрации снизить содержание примесных нуклеиновых компонентов в пермеате в 5,5 раз и упростить дальнейшую очистку препарата НАД.

4. Изучены процессы выделения и очистки НАД методами ультрафильтрации, одностадийного ионного обмена на сорбенте С-150 в Н+ форме с использованием в качестве элюэнтов 50%-ного водного раствора этилового спирта для предварительного удаления примесей углеводной природы и 0,005 н раствора соляной кислоты, кристаллизации из водно-спиртового раствора при объемном соотношении элюент:ионит 10:1. Разработаны алгоритмы управления стадиями ультрафильтрации, сорбции, десорбции, кристаллизации НАД из водно-спиртовых растворов, позволяющие выбрать оптимальные условия их проведения.

5. Предложены способы утилизации основных отходов, образующихся в технологическом процессе выделения НАД с получением продуктов белковой природы кормового назначения, что позволяет реализовать малоотходную технологию.

6. Проведена технико-экономическая оценка разработанной технологии. Установлено, что себестоимость препарата НАД по предложенной технологии составила 4756,63 руб/г НАД, что сопоставимо с ценами препаратов зарубежных фирм.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Парижева P.A., Красноштанова А. А., Крылов И. А. Количественные закономерности процесса экстракции никотинамидных коферментов из биомассы пекарских дрожжей. // Химическая технология. - 2005г. № 11. С. 16-21.

2. Парижева P.A., Красноштанова А. А., Крылов И. А. Изучение процесса осаждения никотинамидадениндинуклеотида и нуклеиновых компонентов из водно-спиртовых растворов. // Химическая технология. - 2005г. №12. С.13-18.

3. Парижева P.A.,. Трибелл К. А. Исследование процесса экстракции РНК и НАДН из биомассы хлебопекарских дрожжей. // Успехи в химии и химической технологии. - 2004 г. том XVIII, №6, С.106-108.

4. Парижева P.A. Исследование процесса ионообменного выделения восстановленных никотинамидных коферментов из водно-щелочного экстракта пекарских дрожжей. // Успехи в химии и химической технологии. - 2005 г. том XIX, №5, С. 67-70.

5. Парижева P.A., Трибелл К А, Красноштанова А. А., Крылов И. А. Исследование количественных закономерностей процесса экстракции НАДН и РНК из биомассы пекарских дрожжей. // Сборник трудов третьего Международного Конгресса «БИОТЕХНОЛОГИЯ-состояние и перспективы развития», Москва. - 2005г, С. 359-360.

6. Rais a A Parizheva, Krystina A. Tribel., Alla A. Krasnoshtanova, Igor A Krylov. «Investigation of Quantitative Regularities of Process of NADH and RNA Extraction from Bakery Yeast»; // J. Nova Science Publishers, Inc., New York -2006, pp. 63-72.

Список сокращений: СВ-сухие вещества; СП-сырой протеин; БК-белковые компоненты; НК-нуклеиновые компоненты; УВ-углеводы; БАВ-биологически активные вещества.

Подписано в печать 14.02.07 Формат 60x90 1/16 Гарнитура Тайме Печать офсетная Бумага тип. Усл.печ.л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ № 4127

Отпечатано в типографии ООО «Мультипринт» 121360 г. Москва, ул. Верейская,д.29 Тел. 978-85-03; 518-76-24;

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Парижева, Раиса Абдул-Хамидовна

ВВЕДЕНИЕ.

Список принятых в работе сокращений.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Структура и основные физико-химические свойства никотинамидных коферментов.

1.2. Распространение никотинамидных коферментов в животных тканях.

1.3. Области применения никотинамидных коферментов.

1.4. Способы получения никотинамидных коферментов.

1.5. Выделение и очистка никотинамидных коферментов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Реагенты.

2.3. Методы анализа.

2.3.1. Методика определения концентрации НАД+ в растворах и конечном продукте.

2.3.2. Методика определения восстановленных форм никотинамидных коферментов НАДН и НАДРН.

2.3.3. Определение концентрации нуклеиновых компонентов в растворах и содержания нуклеиновых компонентов в готовом продукте.

2.3.4. Количественное определение азотсодержащих веществ в белковых гидролизатах и растворах.

2.3.5. Методика определения неорганического фосфора по Фиске - Суб-бру.

2.3.6. Методика определения хлоридов в растворе.

2.3.7. Определение концентрации соляной кислоты в растворе.

2.3.8. Определение содержание аминокислот методом хроматографии на бумаге.

2.4. Методы исследования.

2.4.1 Методика проведения экстракции нуклеиновых кислот и никотина-мидадениндинуклеотидых коферментов из биомассы пекарских дрожжей.

2.4.2. Методика проведения ультрафильтрации.

2.4.3. Методика выделения никотинамидных коферментов ионным обменом.

2.4.4. Методика выпаривания.

2.4.5. Методика осаждения.

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Экстракция никотинамидных коферментов из клеток хлебопекарских дрожжей водными растворами. Количественные закономерности процесса.

3.2. Очистка НАД+ содержащих экстрактов ультрафильтрацией. Количественные закономерности процесса.

3.3. Выделение и очистка НАД+ методом ионного обмена.

3.4. Кристаллизация НАД+ из водно-спиртовых растворов.

3.5. Разработка стадии утилизации отходов, образующихся в производстве НАД из биомассы хлебопекарских дрожжей.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка основ технологии получения никотинамидадениндинуклеотида из биомассы хлебопекарских дрожжей"

Актуальность темы. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД+) является одним из важнейших коферментов, ответственных за окислительно-восстановительные процессы в клетках. НАД+ используется в медицине, как иммуномодулятор. Он обеспечивает нейротрансмиттерную функцию - передачу нервных импульсов между мозгом и остальными органами тела. Нарушение синтеза некоторых гормонов, например, интерферона, также может быть вызвано недостатком НАД+. Никотинамидные коферменты являются антиокси-дантами, защищают организм от свободных радикалов, токсинов, канцерогенов, загрязнений окружающей среды и изменений в процессе старения. Кроме того, НАДН защищает печень от алкоголя, предотвращая образование алко-гольиндуцированного ингибитора - тестостерона. Он также нормализует уровень холестерина и кровяного давления. НАД+ входит в состав лекарственных препаратов, используемых для лечения болезней связанных с нарушением деятельности центральной нервной системы, таких как болезни Паркинсона и Альцгеймера. Также препараты содержащие НАД+ используют в медицине при лечении заболеваний сердца, желудка и печени. Например, препарат «Энерго-стим», содержащий НАД+, цитохром С и инозин, применяли в терапии животных страдающих токсико-аллергическим миокардом.

В настоящее время НАД+ за рубежом получают микробиологическим и химическим синтезом. Химический синтез является многостадийным процессом с применением дорогостоящих реагентов. В России производство НАД+ в настоящее время отсутствует. Сегодня в мире развиты крупнотоннажные биотехнологические производства, в которых отходом является микробная биомасса, которая может являться потенциальным источником НАД+. В литературе приводится описание методов выделения НАД+ из микробной биомассы, которые не используются в промышленности из-за сложности масштабирования процесса и применения дорогостоящих и труднодоступных реагентов. Для промышленного получения НАД+ наиболее перспективным сырьем являются хлебопекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые выпускаются промышленностыо в больших объемах, а также образуются в значительных количествах в качестве отходов спиртового производства. Так как содержание НАД+ в биомассе дрожжей не превышает 0,3% от воздушно сухих веществ (СВ), организация такого сопутствующего производства не позволит снизить количества образующегося твердого отхода, хотя и повысит рентабельность основного производства.

Поэтому представляется актуальной разработка технологии выделения НАД+ из биомассы хлебопекарских дрожжей с применением дешевых и доступных реагентов (растворы минеральных кислот, солей и щелочей) и технологических операций, которые могут быть реализованы в промышленных условиях с утилизацией образующихся твердых и жидких отходов.

Целью работы явилась разработка малоотходной технологии получения очищенного препарата НАД+ из нативной биомассы хлебопекарских дрожжей.

В задачи данной работы входило: создание научных основ с целью совершенствования технологического процесса получения НАД+ из биомассы хлебопекарских дрожжей включающего экстракцию водными растворами, ультрафильтрацию, одностадийный ионный обмен, осаждение из водно-спиртовых растворов, разработка кинетических схем для создания алгоритма управления технологическим процессом и определить пути утилизации отходов, образующихся в основном производстве, для получения на их основе продуктов нуклеотидной, белковой и углеводной природы технического назначения.

Научная новизна: Впервые показана возможность получения очищенного препарата НАД+ из биомассы хлебопекарских дрожжей с применением стадии ультрафильтрации для очистки от высокомолекулярных примесей, одностадийного ионного обмена на катионите, кристаллизации из водно-спиртового раствора.

Показана принципиальная возможность получения НАД+ из биомассы других дрожжей (p. Candida, Torula) по предлагаемой технологии.

Впервые показана возможность применения миндальной кислоты в качестве ингибитора нуклеаз на стадии экстракции НАД+, что позволило упростить процесс очистки конечного продукта от примесей нуклеотидной природы.

Проведено количественное изучение стадий экстракции НАД+, ультрафильтрации, ионного обмена, кристаллизации из водно-спиртовых растворов, как основы для создания алгоритма управления технологическим процессом получения НАД+.

Практическая значимость: Разработаны основы технологии получения очищенного препарата НАД+ (с содержанием основного вещества не менее 95%) из нативной биомассы хлебопекарских дрожжей. Предложены алгоритмы управления стадиями экстракции НАД+ из биомассы дрожжей, ультрафильтрации, ионного обмена и кристаллизации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: 3-ем Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2005 г); Международных конференциях «Успехи в химии и химической технологии» (РХТУ имени Д. И. Менделеева, Москва, ноябрь 2004 г, ноябрь 2005 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и двое тезисных сообщения в материалах научных конференций.

Структура и объем работы: диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Описания методик проведения экспериментов и анализов, 5-ти глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, Заключения, Выводов, Списка литературы (115 наименований, в том числе Ш0 на иностранных языках) и 4 приложений. Работа изложена на 165 стр. машинописного текста и содержит 60 таблиц, 64 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Парижева, Раиса Абдул-Хамидовна

ВЫВОДЫ

1. Предложены пути совершенствования технологии получения НАД из биомассы хлебопекарских дрожжей, включающие в себя экстракцию водным раствором, ультрафильтрацию, выделение целевого продукта ионным обменом, его кристаллизацию и перекристаллизацию из водно-спиртового раствора, сушку готового продукта. Выход НАД с содержание основного вещества 98% составляет 0,048% от массы сухих дрожжей или 22% от его содержания в биомассе.

2. Проведено количественное изучение процесса водной экстракции, подчиняющегося законам специфического кислотно-основного катализа. Предложены кинетические схемы для управления процессом экстракции, на основе которых подобраны оптимальные условия процесса экстракции, обеспечивающие выход НАД не менее 90% от его содержание в клетке.

3. Показано, что добавление миндальной кислоты в концентрации 3,9-10'5 моль/л к экстрагенту позволяет в дальнейшем на стадии ультрафильтрации снизить содержание примесных нуклеиновых компонентов в пермеате в 5,5 раз и упростить дальнейшую очистку препарата НАД.

4. Изучены процессы выделения и очистки НАД методами ультрафильтрации, одностадийного ионного обмена на сорбенте С-150 в Н+ форме с использованием в качестве элюэнтов 50%-ного водного раствора этилового спирта для предварительного удаления примесей углеводной природы и 0,005 Н раствора соляной кислоты, кристаллизации из водно-спиртового раствора при объемном соотношении элюэнт:ионит 10:1. Разработаны алгоритмы управления стадиями ультрафильтрации, сорбции, десорбции, кристаллизации НАД из водно-спиртовых растворов, позволяющие выбрать оптимальные условия их проведения.

5. Предложены способы утилизации основных отходов, образующихся, в технологическом процессе выделения НАД с получением продуктов белковой природы кормового назначения, что позволяет реализовать малоотходную технологию.

6. Проведена технико-экономическая оценка разработанной технологии. В результате нее было установлено, что себестоимость препарата НАД по предложенной технологии составила 4756,63 руб/г НАД, что сопоставимо с ценами препаратов зарубежных фирм.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Парижева, Раиса Абдул-Хамидовна, Москва

1. Burton R. M., Kaplan N. О. - Arch. Biochem. and Biophyz., 1963, 101, p. 150.

2. В. А. Яковлева. Коферменты.- M.: Медицина, 1973. 13 с.

3. Moore С. Е., Underwood A. L. Anal. Biochim., 1969, 29, p. 149.

4. Caterall W., Hollis D, Walter C. Biochemistry, 1969,8, p. 4032.

5. Jardetzky 0, Wade- Jardetzky N. J. Biol. Chem., 1966,241, p. 85.

6. Windmueller N., Kaplan N. J. Biol. Chem., 1961, 236, p. 2716.

7. Weder G. Nature, 1957, 180, p. 1409.

8. Oliver H. Lovvry, Janet V. Passonneau "The stability of pyridine nucleotides". Journal of Biological Chemistry. 1961, Vol. 236, №10.

9. Chaykin S, Meissner L. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1964, 14, p. 233.

10. Jarmolinsky M. В., Colowick S. P. Biochem. Biophys. Acta, 1956, 20, p. 177.

11. Красновский А. А., Брин Г. П., ДАН СССР, 1968, 153, 212 с.

12. Ludowieg J., Levy А. Biochemistry, 1964, 3, p. 373.

13. Ditmar A., Fondy L. J. Am.Chem. Soc., 1964, 88, p. 91.

14. Wallenfels К. В кн.: The steric course of microbiological reactions.L., 1959, p. 10.

15. Kaplan N. О. В кн.: Enzymes. New York, 1960,3, p. 127.

16. Gutman M, Margalit R. Biochemistry, 1968, 7, p. 2778.

17. Amelunxen D, Grisolia S. J. Biol. Chem., 1962,237, p. 3240.

18. Tucker D., Grisolia S. J. Biol. Chem, 1962, 237, p. 1068.

19. Arancyo M, Cilento G. Biochemistry, 1969, 8, p. 2140.

20. Bates D. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1970, 39, p. 502.

21. Woenckhaus C, JeckR. Lieb. Ann, 1970, 736, p. 126.

22. Colowick S, Kaplan N. J. Biol. Chem, 1951,191, p. 447.

23. Meyerhof O, Ohlmeyer P. Biochem. Z, 1938,297, p. 113.

24. Pfleiderer G, Jeckeel D. Biochem. Z, 1956,328, p. 187.

25. Pfleiderer G, Jeckeel D. Biochem. Z, 1957, 329, p. 104.

26. Walter P„ Kaplan N. J. Biol. Chem, 1963, 238, p. 2823.

27. Anderson В., Kaplan N. J. Biol. Chem., 1959, 234, p. 1226.

28. Miles D., Kaplan N. Lieb. Ann., 1959, 621, p. 166.

29. Ozols R., Marinetti G. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1969, 34, p. 712.

30. Villee C.A. In:"The Molecular control of cellar activity". J.M. Allen (ed) N.Y., 1962,стр. 297.

31. Glock G.E., McLean P. Biochem.J.,1955, стр. 388.

32. Jacobson K.B.,Astrachan L. J. Biol. Chem., 1957, 226, p. 69.

33. Euler H.,Shleank F., Heiwinkel H., Hogberg B. Hoppe-Seyler's Z. physiol.Chem., 1938. p.256, 208.

34. Schlenk F., Glein W. Svensk Kern. Tidskr., 1937,49, p. 181.

35. Burch H.,Lowry O.et al. Biol.Chem., 1963,238, p. 2838.

36. Carruthers C., Suntzeff V. Arch.Biohem.,and Biophys., 1953,45, p. 140.

37. Glock G.E., McLean P. Biochem.J.,1955, p. 388.

38. Jedeikin L. A., Weinhouse S. J. Biol. Chem. 1955, 213, p. 271.

39. Sippel T. 0. Exptl Eye Res., 1962, 1, p. 368.

40. Klingenberg M., Slenezka W. Biochem. Z, 1959, 331, p. 486.

41. Briggs M. H. J.N. Z. Inst.Chem, 1962, 26, p. 84.

42. Racker E. Phisiol. Revs. 1955, 35, p. 1.

43. Singer T. P., Kearney E. B. Advances Enzymol. and Related Subjects Biochem., 1954, 15, p. 79.

44. Wenner Ch. E., Dunn D. E. J. Biol. Chem., 1953, 205, p. 409.

45. Ricci C., Marinello E. Boll. Soc. ital. boil, sperim., 1961, 37, p. 680.

46. Holzer H.,Schultz G., Lynen F. Biohem.Z.,1956,328,p. 252.

47. Mclwain H. Nature, 1949,163, p. 641.

48. Колотилова А.И. Биохимия, 1960,25, с. 407.

49. Великий Н.Н. Исследование роли окислительно-восстановительного состояния никотинамидных коферментов во внутриклеточном метаболизме в тканях животных. АН УССР. Институт биохимии им. А.В. Палладина. Автореферат: Киев, 1987

50. Dolphin D., Poulsen R. Pyridine nucleotide coenzymes: chemical, biochemicaland medical aspects, Wiley, New York, 1987;

51. You K-S., Anderson B. The Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press, New York, 1982.

52. Lee H. C., Graeff R. Biochemie, 1995, 77, p. 345.

53. Aarhus R., Dickey D. M. J. Biol. Chem. 1996, 271, p. 8513.

54. Anderson В. M. Pyridine Nucleotide Coenzymes. Academic Press, Inc., New York, 1982, p. 91.

55. Woenckhaus C., Jeck R. Pyridine nucleotide coenzymes: chemical, biochemical and medical aspects, Wiley, New York, 1987, p. 449.

56. Rex A, Hentschke MP, Fink H. Bioavailability of reduced nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH) in the central nervous system of the anaesthetized rat measured by laser-induced fluorescence spectroscopy. Pharmacol Toxicol. 2002 Apr; 90(4):220-5.

57. Santaella ML, Font I, Disdier O.M. Comparison of oral nicotinamide adenine di-nucleotide (NADH) versus conventional therapy for chronic fatigue syndrome. P R Health Sci J. 2004 Jun;23(2):89-93.

58. Swerdlow RH. Is NADH effective in the treatment of Parkinson's disease? Drugs Aging. 1998 Oct;13(4):263-8.

59. Sukoan GV, Antelava AV, Kavadze IK, Chikobava EA, Iarovaia EV, Karsanov NV. Cardioprotective effect of energostim in toxic allergic myocarditis. Eksp Klin Farmakol. 2004 Mar-Apr;67(2): 19-23.

60. Birkmayer JG, Nadlinger KF, Hallstrom S. On the safety of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). J Environ Pathol Toxicol Oncol. 2004;23(3): 179-94.

61. Demarin V, Podobnik SS, Storga-Tomic D, Kay G. Treatment of Alzheimer's disease with stabilized oral nicotinamide adenine dinucleotide: a randomized, double-blind study. Drugs Exp Clin Res. 2004;30(l):27-33.

62. Северин С. E., Соловьева Г. А. Практикум по биохимии. М.: Изд-во МГУ. 1989г. С.509.

63. Промышленная микробиология. Под ред. Н. С. Егорова. М.: «Высшая школа», 1989.

64. А. М. Безбородое. Биохимические основы микробиологического синтеза. М.: «Легкая и пищевая промышленность», 1984.

65. Беккер М. Е. Введение в биотехнологию. Москва «Пищевая промышленность», 1978г, стр.203.

66. SU , патент, № 1693057, кл С 12 Р 19/36.

67. SU, патент, № 510510, кл С 12 Р 19/36.

68. Kiyoshi Nakayama, Sagamihara-shi. Method for producing NAD. Japan, assignor to Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan. Patent. Int. CI. CI 2d 13/06, 1972; U.S. CI. 195-28 N,№ 3,705,080.

69. Чехословакия, патент, № 267244 , кл С 12 Р 19/36.

70. RU, патент, № 2097431, кл С 1.

71. Brazda, F.G. and R.A. Coulson: Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 70,325 (1949).

72. Delia Volpe, R. and E. Albertini: Rev. Biol. (Perugia) 54, 537 (1961).

73. Emmrich, R. and H. Petzold: Arch, exptl. Path. Pharmakol. 217, 10 (1953).

74. Binet, L., F. Bouriere and F. Molimard: Compt.rend. 250, 4083 (1960).

75. Coulson, R.A and F.G. Brazda: Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 65,1 (1947).

76. Fujioka, M. and I. Lieberman: J.Biol. Chem. 239, 1164 (1964).

77. Gershbein, L.L: Int. Z. Vitaminforsch. 35,264 (1965).

78. Kornberg. Methods of Enzymology. 1957, Vol. 3, p. 876.

79. Jeck. Federation of European Biochemists Society Letters. 1974, Vol. 42, p. 161.

80. Synthesis of Nicotinamid Adenine Dinucleotide (NAD) from Adenosine Monophosphate (AMP). Journal of the American Chemical Society. Vol. 102. p. 7805, Dec. 17, 1980.

81. Pollak. Enzyme Immobilization by Condensation Copolymerization into Cross-linked Polyacrylamide Gels. Journal of the American Chemical Society. Vol. 102. pgs. 6324-6336 Dec. 17. 1980.

82. Whitesides G., Walt D.R. Synthesis of nicotinamide cofactors. Pat. No. 4411995, USA, CI C12P 19/36-publ. Oct. 25.

83. Yokoyama S., Shinichiro S. Method for producing reduced-form coenzyme. Pat. No. 4661448, USA, CI C12N 19/36-publ. Apr. 28, 1987.

84. Japanese Patent Application Kokai (Laid-open) No. 101491/1979.

85. Izumi, et al., Collection of Lectures on the Meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan in 1983, pp. 358.

86. Izumi, et al., Collection of Lectures on the Meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan in 1984, pp. 595.

87. Eguchi, et al., Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 47, pp. 2941-2943, 1984.

88. Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 14, 1987 pp. 147-1971.

89. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 7, No. 9, 1985, pp. 1277-1281.

90. Biotechnology letters 1983, 5 (7), 463-468.

91. Durliat H., Comtat M., Seris J-L. Process for the electrochemical regeneration of pyridine cofactors. Pat. No. 5538867, USA, CL C12P 39/00-publ. Jul 23, 1996.

92. Gonzalez B, Franc.ois J, Renaud M. 1997. A rapid and reliable method for metabolite extraction in yeast using boiling buffered ethanol. Yeast 13: 1347-1356.

93. Goyal A, Chand S. Isolation of NADH from Saccharomyces cerevisiae by ether permeabilization and its purification by affinity ultrafiltration. Indian J Exp Biol. 1996 0ct;34(10):999-1004.

94. Strandjord P. E., Clayzon K. J. The control of inhibitory imparities in NADH in lactate dehydrogenase assays. J. Lab. Clin. Med. 1966, 67, p. 144.

95. Dalziel K. Some observations on the preparation and properties of dihydronicoti-namide- adenine dinucleotide. Biochem. J. 1962, 84, p. 240.

96. Everse J., and Kaplan, N. O., Lactate dehydrogenases: Structure and function. In Advances in Enzymology, N.Y., 1973, pp.61-133.

97. Renderrath К. Thin layer separation methods for nucleic acid derivatives. In Methods in Enzymology. Academic Press., N.Y., 1967, 12A, p. 323.

98. Pastore, E.J., and Friedkin, M., The chromatographic separation and recovery of reduced and oxidized pyridine nucleotides. J.Biol. Chem. 236, p. 2314, 1961.

99. Silverstein, E., Separation and purification of oxidized and reduced nicotine adenine dinucleotides. Anal. Biochem. 12, p.199, 1965.

100. DiSabato, G., Reactions of DPN+ and pyruvate. Biochem. Biophys. Acta 167, p.646, 1968.

101. Horvath J. X., Nigt performance ion-exchange chromatography with narrow bore columns: Rapid analysis of nucleic acid constituents at the subnanomole level. In Methods Biochemical Analysis, 21, D. Glick, Ed., Interscience, New York, N.Y., 1973.

102. Khym, J. X., An analytical system for rapid separation of tissue nucleotides at low pressures on conventional anion exchange. Clin. Chem. 21, p. 1245, (1975).

103. Rajcsanyi , P. M., Csillag, M., and Kriskovics, E., Separation of nucleic acid constituents by column liquid chromatography. Sep. Purif. Methods 3, p. 167, (1974).

104. Singhal, R.P., Separation and analysis of nucleic acids and their constituents by ion exclusion and anion exchange column chromatography. Sep. Purif. Methods 3, p. 339,(1974).

105. Ziegenhorn, J., Senn, M., et al., Molar absorptivities of f3-NADH and p-NAD at 260 nm. Clin. Chem. 22,151 (1976)

106. Burton, R. M., and Kaplan, N. O., The reaction of diphosphopyridine nucleotide and related pyridinium salts with alkali. Arch. Biochem. Biophys. 101, p. 139 (1963).

107. Kelli A. Markham, R. Steven Sikorski. Purification, analysis, and preservation of reduced nicotinamide adenine dinucleotides 2'-phosphate. Anal. Biochemistry 322, p.26, (2003).

108. Крылов И. А, Баурина М. М. и др. Способ получения низкомолекулярных фракций БАВ из клеточных биополимеров.патент РФ). Патент РФ № 5167831 (2001 г).

109. Волкова Н. В.Разработка технологии микробных РНК и ДНК из метанути-лизирующих бактерий. Дис.канд. хим. наук, М,1996. Рукопись.

110. Красноштанова А. А. Гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Дис.канд. хим. наук, М.,1995. Рукопись.

111. Бейли Дж, Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с анг. в 2-х частях. 4.2-М.: Мир, 1989.-590 с.

112. Крылов И. А. Основы комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов. Дис. на соискание ученой степени доктора химических наук. -М, 1998. Рукопись.