Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка оптимальных методов иммобилизации холинэстеразы для индикации фосфороорганических соединений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка оптимальных методов иммобилизации холинэстеразы для индикации фосфороорганических соединений"

.МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ХАВКИН Михаил Шьевич

УДК 532.957:543.866.

РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ИММОБИЛИЗАЦИИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ДЛЯ ИНДИКАЦИЙ ФОСФОРОРГАНИЧЕСШ СОЕДИНЕНИЙ

03.00.04. - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г.Уфа - 1995 г.

О

Работа выполнена в Отделе биохимик и цитохимик Уфимского научного уентра Российской Академии наук

Научные руководители: действительный член Академик наук

Республики Башкортостан, доктор биологических наук, профессор В.А.Вахитов

кандидат медицинских наук, доцент Б.А.Мьшмин

Ведущая организация: Челябинский Государственный медицина институт МЗМП РФ

Защита диссертации состоится "_" марта 1995 г. в 1С часов

на заседании диссертационного Совета К 084.35.02. при Башкирском Государственном медицинском институте (450000, г.Уфа, ул.Ленина ;

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирског медицинского института.

Автореферат "разослан _ 1995 г..

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук,

профессор Э.Г.Давлетов

- J -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Зосфорорганические ингибиторы (ЙОИ) холинзсте-раз (ХЭ) широко испольну:« в качестве сельскохозяйственных инсектицидов, благодаря их еысокой эффективности, широкому спектру действия и быстрой деградации во внешней среде. Важнейшим условием безопасного применения ФОИ является надёжный контроль их остаточных количеств в природных объектах и пгецевых продуктах. Как правило, его осуществляют с помощью компьютеризованных газо-жидкостных хроматографов, ко сложность и Еысохгя стоимость анализа ограничивает применение этого метода.

Другой принцип детектирования 50И основан на использовании ¿неэквивалентных систем (биосенсоров), содержащих бкологичэскую мишень СОИ - энзимы группы ХЭ. Для сложных природных и лицевых объектов предпочтительно применение »«мобилизованных на носителе ХЭ, что обеспечивает получение накопительного токсического эффекта и может упростить пробоподготовку.

(Еиксацию ХЭ на твёрдой фазе осуществили многие исследователи с

ПОМОЩЬЮ ковалентного I • Í Тар Minh et al,, 1973; Уао et ni., 1985; Я1с-n y et al., 1989 сорбЦИОННОГО ICoodson h Jacobs, 1973 ; Mordis 4 Coulât, 1990), аффИННОГО (Oundarsta 4 Wilson, 1990) СВЯЗЫВаНИЯ И физ'ической ОККЛЮЗИИ (Degany 5 Mirón, 1970; louis et al., 19D0) ,

a также комбинацией этих методов (Н.А.Длатэ к соавт. 1985; 1992). Хотя энзим сохранял зстеразную активность, его чувствительность к действию ФОИ обычно снижалась. Лишь в немногих случаях удалось создать твердофазные детекторные системы для индикации ФОИ <Goodson ?, ai.

^976: Leon-Gonzales & Taunahend, 1990; Kinderwater et nl., 1990; Quintero,& а1.,199оуно их техническая сложность препятствовала широкому применений для природоохранных и санитарно-гигиенических целей.

Диссоциация функциональных свойств при иммобилизации ХЭ, по-видимому, зависит от особенностей молекулярного механизма гидролиза субстратов и инактивации активного центра энзима при действии ФОИ

(А.С.Садыков и соавг., 1976; Л.П.Кузнецова и соавт., 1990). В каталитическом акте участвуют несколько поверхностных сайтов (анионный и гидрофобные) молекулы ХЭ, которые ориентируют субстрат перед его транспортом в эстеразный центр, расположенный в складчатой структуре. Поэтому маскирование каталитической области, а также ограничение пространственной подвижности или искажение конформации молекулы ХЭ при иммобилизации приводит как к падению эстеразной активности, так я к снижению чувствительности к действию ФОИ. При этом второй показатель снижается особенно ощутимо, поскольку структура 00И неполностью соответствует структуре природных субстратов ХЭ, что затрудняет взаимодействие с активными сайтами каталитического региона энзима.

Отмеченные выше особенности строения и функции ХЭ предъявляют особо высокие требования к методике их иммобилизации,

Цель работы. Сопоставление эффективности различных подходов при иммобилизации ХЭ в твердофазных системах для получения оптимальной формы биооквивалентнаго сенсора $0И, обеспечивающего широкий экологический и санитарно-гигиенический мониторинг.

Задачи исследования. ^

1. Разработка детекторной системы достаточной чувствительности;

2. Обеспечение стабильности биосенсора при/хранении и б процессе анализа;

3. Получение целевого продукта приемлемой стоимости за счет использования доступных реагентов и технологий при изготовлении;

4. Максимальное упрощение стадии пробоотбора и обеспечение возможности применения метода в полевых условиях;

5. Обеспечение возможности исследования сложных пищевых и природных объектов.

Научная новизна. Показано, что при ковалентной фиксации ХЭ целесообразно использовать протяженные и высоко гидрофильные вставочные молекулы (спейсеры), разобщающие лиганд и поверхность носителя. Впервые получены и использованы спейсеры полиоксидиальдегид ("Пол-

диаль") и активированные производные олигосахарида бета-циклодекстри-на, снижающие вероятность внутримолекулярных сшивок биолигавда.

Улучшены методы инкапсулирования белков в губчатом слое анизотропных полых волокон за счет минимизации активного объема и его защиты от внешних воздействий путем покрытия двойной мембраной, что улучшило операционные свойства ФОИ-детектора на основе инкапсулированной ХЭ.

Сопоставлены характеристики различных носителей и показано, что по операционным свойствам оптимальны "керновые" композиции с размещением биолиганда на поверхности носителя для обеспечения улучшенного массопереноса низкомолекулярных эффекторов - субстратов и ФОИ. Специфическая активность "керновьпс" композиций повышена путем иммобилизации лиганда в форме надмолекулярных ассоциатов.

Использование ферромагнитных дисперсий (ФМД) в качестве носителя ХЭ расширяет возможности метода и позволяет исследовать сложные природные и пищевые объекты. Разработан оригинальный способ пассивирования частиц ФВД в высокочастотном электрическом поле, что позволяет сохранить высокую дисперсность и однородность носителя. Предложена новая композиция "Магносорб", позволяющая иммобилизовать различные белки на гидрате окиси алюминия (ГОА), мицеллы которого удерживаются сложным комплексантом на основе 8-оксихинолина, ковалентно связанного с пассивированной ФЩ.

Впервые разработана бинарная форма бийсенсора, состоящая из лиофи-лизированной ХЭ и "Магносорба", что повышает надежность индикации ФОН в экспедиционных условиях.

Научно-практическая значимость. Предложена комплектация тест-набора, состоящего из бинарного биосенсора и вспомогательных реагентов, а также специально разработанных устройств для проведения анализа -магнитных дозатора и сепаратора. Простая техника анализа адаптирована к полевым условиям, что позволяет идентифицировать пораженные зоны для последующего исследования более точными методами.

Разработанные технологические приемы могут быть использованы для широкого круга биотехнологических процессов.

Положения, выносимые на защигу:

1. Стерическая свобода молекулы холинэстераэы необходима для сохранения чувствительности иммобилизованного энзима к действию фосфор-органических ингибиторов. Этот принцип реализуется при фиксации ХЭ через протяженные гидрофильные спейсеры, пространственно раэобщащие биолигавд и носитель и реагирующие с ограниченным числом функциональных групп молекулы энзима.

2. Инкапсулирование ХЭ в полых волокнах полностью исключает неблагоприятные воздействия на биолиганд, что позволяет использовать поло-волоконные детекторы для индикации фосфорорганических ингибиторов с накопительным эффектом.

3. Ферромагнитные композиции при сорбционной фиксации ХЭ наиболее удобны при ислледовании сложных природных и пищевых объектов. Бинарная форма детектора повышает его стабильность в экспедиционных условиях.

Внедрение. Результаты исследования внедрены в практические курсы ВТМЗ на военной кафедре Башкирского Государственного медицинского института.

Апробация работы.Основные результаты работы доложены на Всероссийской конференции "Новые направления биотехнологии" Шуцино, 1994 г.); на итоговой научной конференции Отдела биохимии и цитохимии Уфимского научного центра РАН (Уфа, 1995 г.). По теме диссертации опубликовано б печатных работ, подано 3 заявки на патент РФ, из них по двум проведена формальная экспертиза с положительным решением.

Структура и объем работы. Работа изложена на страницах машнолиси, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования и собственных наблюдений, заключения и списка литературы, который включает в себя 134источника, из них 93 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 15 рисунками.

Материалы и методы исследования. Использовали сывороточную бути-рил-ХЭ к аие'тил-ХЭ а виде стромы человеческих эритроцитов, а в качестве субстратов апетил- и бутирилхолины и их тиольныс аналоги. Энзима-тическую активность определяли потенииометрически, титриметрически и колориметрией с реактивом Эллмана. В качестве фосфорорганических ингибиторов использовали препараты для сельскохозяйственных и бытовых целей в виде коммерческих препаративных форм, а также стандарты, предоставленные Банкирской республиканской станцией химзащиты растений.

Основные материалы: ферромагнитная дисперсия (ФЦЦ) на основе гамма-окиси железа марки Ш-1; полые волокна (ПВ) УПА-15 (ультрафильтрационные, полиамидные) и экспериментальные ацетатцеллюлозныадля обратного осмоса, полученные из ЕЛО "Химволокно" (г.Мытищи). Ряд реагентов -тиофосген, бис-аминодиол "Аларминол", полиоксидиальдегйд "Полдйаль", активированные производные бета-циклоденстрина и др. получали лабора-торно.

В работе использованы электрофоретические, хроматографические, спе-ктрофотометрические и другие методы с применением стандартной аппаратура. Разработаны оригинальные устройства для дозирования и выделения ферромагнитных композиций из исследуемого материала.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ковалентные методы иммобилизации холинэстераз. При конструировании энзиматических детекторов важна физическая форма носителя, который должен обеспечить операционную стабильность и минимальное время отклика биосенсора. Испытав ряд носителей в виде гранулированных и волоконных форм, мы остановились на фильтровальной бумаге, аппретированной поливиниловым спиртом (ПВС). Высокая гидрофильность ГОС предупреждала взаимодействия лиганда и носителя, в то же время методы активации ПВС хорошо разработаны и доступны.

Для фиксации ХЭ наиболее удобными были альдегид-производные, которые получали двумя путями: периодатным окислением и ацеталированиеч в сильно кислой среде глутаровым альдегидом. Однако прямая фик-

сация биолиганда на этих матрицах была мало эффективной (табл.1), поэтому мы использовали дополнительные приемы - увеличение доступности активных групп носителя с помощью спейсера "Полдиаль", а также перевод альдегидных групп в гидразидные путем обработки избытком дигид-разида адшиновой кислоты (ДГАК) - см. рис.1.

I-

' пёс{сй2-сн^сн-сц-сги.Ла1гснЗ- сн-сн-"он он. он ' ОН

О, ± 0 *.У>ч

0 'он! 1 ,

с-//н-д^он-АДя-с;^ Л%хэ

; , I «2 |-снг/УН-хэ

Рис Л. Получение полигидроксидиальдегидного спейсера "Полдиаль" и его использование для иммобилизации ХЭ.

При аппретировании целлюлозной основы затрудняется фиксация биолиганда внутри матрицы. Это улучшает диффузионные характеристики композиции, но снижает её ёмкость, и следовательно активность биосенсора. Это затруднение может быть преодолено, если использовать для иммобилизации не молекулярную форму ХЭ, а надмолекулярные ассоциаты, полученные при адсорбции энэиыа на ГОА. Данные табл. I демонстрируют преимущества фиксации биолиганда через "Полдиаль", а также повышение специфической активности композиции при иммобилизации надмолекулярных ассоциагов. Обработка избытком ДГАК улучшает механическую прочность окисленной целлюлозы за счет прочных дигццразонных спивок матрицы. "Полдиаль" также способствует повышению специфической активности ХЭ за счет обеспечения стерической свободы молекулы, а также предупреждения внутримолекулярных сшивок, характерных для ГА, поскольку вое активные группы носителя реагируют с белком по одноточечному меха-

Таблица I.

Свойства ХЭ, иммобилизованной на целлюлозных носителях.

XXX ) Операционная стабильность

Метод активации

Форма биолиганда

Активность3^ ИЕ/кв.см.

Чувстви-

периодат

то же

то же ■+• ДГАК + "Полдиаль"

молекулярная ассоциат

молекулярная

ПВС-ацеталь с ГА молекулярная то^же + ДГАК + М0Лекулярная

менее 0,05 0,8

0,25

0,65

0,5

"Полдиаль" х)

Потенциометрическое титрование с рН-етатом хх)

не опр. 1,8

1,5

более 3,0 1,1

деструкция то же

70$

100$

100%

Концентрация фосфолана в мкМ, снижающая активность на 30% и более

ххх)

Остаточная активность после встряхивания полосок сенсора в течение 30 мин.

низму (см. рис.1). Наиболее важным преимуществом использования слейсера "Полдиаль" являетс^овышение чувствительности ХЭ к ФОИ более чем в 3 раза, хотя энзиматическая активность композиций, пвс -ацеталь и ЛВС-ацеталь+'ДГАК+"Полдиаль" различается мало. Эти данные подтверждают наличия диссоциации функциональных свойств ХЭ при жестком способе иммобилизации энзима.

Наряду с описанным, мы испытали также другие способы ковалент-ной и ковалентно-аффинной фиксации на упрочненной бумаге с использованием лектина пшеницы и гемагглютинирующих иммуноглобулинов для связывания эрктроцитарной стромы, содержащей природный ассоциат ацетил-ХЭ. Для детектирования ФОИ в проточном варианте были изготовлены рулонные сенсорные узлы, однако регистрация ингибиро-вания энзима на имевшейся в нашем распоряжении аппаратуре была недостаточно эффективной. Рулонный сенсор был также непригоден для исследования сложных объектов из-за отложения осадка в разделяющей сетке между витками мембраны. Это побудило.нас испытать иные подходы для решения поставленной задачи.

- го -

Окклдзионные методы иммобилизации холинзстеразы.

Физическое включение (окклюзия) биолигандов в гидрогели, а также инкапсулирование в контейнеры с полупроницаемыми стенками -являются наиболее мягкими способами получения твердофазных композиций. Окклю-дирование.ХЭ в армированные гидрогелевые мембраны не позволило получить сенсоры ФОИ с приемлемыми операционными характеристиками. Лучшие результаты были получены при инкапсулировании энзима в трубчатых полупроницаемых мембранах - полых волокнах (ПВ).

Для изготовления ООН-сенсоров были испытаны 2 типа ПВ - гиперфильтрационные с ацетатцеллюлозной изотропной стенкой (АцПВ) и ультрафильтрационные с анизотропной полиамидной стенкой (УПА-ПВ). Раствор ХЭ находился во внутреннем канале АцПВ или в губчатом слое стенки УПА-ПВ. Соответственно субстрат- или ФОИ-содержащиЯ раствор находился во внутреннем канале УПА-ПВ или снаружи АцПВ - сы. рис.2.

УПЙ-ПЬ

хххххххххххххххххххххх хххххххххххххххххххххх

<р0оеоооа>ооооа»ооЪоаЪооо

5 5 5 8 5

О 0900»00000ое00000(

хххххххххххххххххх ххххххххххххххххххх:

ШШЙшШШ

я

......- . - - О О 0 Р о о

ххххххххххххххххх ххххух^схххххххх^

оаоооооооо

ЛцПВ

Рис.2. Схема строения половолоконных ФОИ-детекторов. Обозначения: СН - стеклянный капилляр, Г - силоксановый г-ериеткк,. ЗУ - защитная ацетатцеллюлоэная мембрана, ДМ - диализная мембрана, (барьерная зона стенки полого:'" волокна), С/И. - зона субстрата или ингибиторов, ХЭ - холинэстераза, Ш - губчатая зона мембрана.

Сенсор на основе АцПВ формировали в виде пучка из 20-12 ПВ,:. : -. согнутого в петлю, концы волокон запаивали. Сенсор погружали в исследуемый раствор и после экспозиции и отмыва переносили в раствор субстрата, содержащий индикатор бромкрезоловый пурпурный. По 2 пучка опытных и контрольных ПВ располагали крестообразно на белой поролоновой губке, накрытой полиэтиленовой пленкой. Поверх сенсоров помещали пленку и накрывали пластинкой из оргстекла. При' периодическом надавливании на центр пластинки межволоконная жидкость размешивалась, что ускоряло переход окраски индикатора. Эта простейшая техника позволяла провести учет активности инкапсулированной ХЭ в микрообъеме, что повышало чувствительность метода. Основные трудности при изготовлении сенсора на АцПВ были связаны с необходимостью тщательной визуальной отбраковки волокон.

Для получения сенсора на основе Л1А.-ПВ пучок волокон монтировали с помощью эпоксидного компаунда в стеклянном кожухе, который заполняли раствором ХЭ. Сквозь внутренние каналы ПВ пропускали 505? раствор высокомолекулярного полиэтиленгликоля (ПЭГ-40.000). Белок накапливался в наружном губчатом слое волокна за счет осмотической концентрации, количество инкапсулированного ¿елка определяли по уменьшению объема внешнего раствора с помощью соединенной с кожухом пипетки. После насыщения волбкна извлекали из кожуха и покрывали защитным слоем, окунал их в 5% раствор триацетата целлюлозы в хлористом метилене с добавлением 0,5% гамма-аминопропил-триэтоксисилана.

После испарения хлористого метилена на поверхности ПВ формируется мембрана, содержащая алкоксисияан, являющийся промотором адгезии си-локсановых компаундов к ацетатцеллюлозкому покрытию. Эта техника позволяет устранить вымывание белка из рабочей зоны или её подсыхание, повысить механическую прочность композиции, а также предупредить микробную контаминацию. Для использования в качестве сенсора ФОИ •лобно смонтировать ПВ внутри стеклянного капилляра, который может

быть подключён к перистальтическому насосу в реякме протока или ре-циклинга. Сравнительная характеристика половолоконных детекторов демонстрирует их достаточную чувствительность к ФОИ, которая может быть повышена при использовании увеличенных объёмов исследуемого материала за счет накопительного эффекта (табл. 2).

Таблица 2.

Характеристика половолоконных ФОИ-детекторов.

П оказатель АцПВ УПА-ПВ

Наружный диаметр волокна, мм 0,25 1,0

Толщина диффузионной мембраны, мкм 35 2

Белок на I см волокна, мкг 1,02 28,3

то же на I детектор 980 140

Активность ХЭ ИЕ/детектор 23 8,3

то же, в % от теоретической 24% 74%

Чувствительность к ФОИ при контакте

с 50 мл раствора в течение 30 мин., 3,2 0,75

мкМ хлорофоса (снижение ИЕ на 30$)

то же при контакте с 500 мл раствора -

в течение 5 часов (проточный вариант) 0,18 не опр.

Половолоконные сенсоры могут быть использованы для исследования сложных объектов, содержащих взвешенные частицы, поскольку гладкая

поверхность АцПВ легко отмывается от большинства загрязнений, а внутренний канал УПА-ПВ диаметром 0,8 мм проходим для мелких дисперсий. Более высокая удельная активность второго варианта зависит от меньшей толщины диффузионной мембраны и оптимального соотношения между энзимным и ,'наружным объемом. В то же время при использовании УПА-ПВ необходима специальная вспомогательная аппаратура, которая может быть исключена при использовании АцПВ. Недостатками половолоконных сенсоров является большая трудоемкость их изготовления и сравнительно высокий расход энзима, что побудило нас продолжить поиски оптимального варианта ФОИ-детектора.

Разработка ферромагнитного детектора ФОИ.

При иммобилизации биолигандов в виде тончайшего слоя, покрывающего плотное ядро ("керн"), диффузионные затруднения при переносе продуктов реакции минимальны. Для обеспечения достаточной активности керновый носитель должен иметь максимально развитую поверхность. В качестве подобного носителя мы испытали ферромагнитные дисперсии (ФМД), позволяющие сочетать развитую поверхность с важными технологическими преимуществами - возможностью удержания или извлечения в магнитном поле. Это позволяет исследовать разнообразные природные и пищевые объекты без предварительной подготовки проб, затруднительно! в экспедиционных условиях.

Несмотря на очевидные преимущества, ФВД сравнительно редко используют в энзимной инженерии из-за необходимости надёжной защиты железосодержащих частиц от коррозии, а также из-за недостаточно разработанной техники дозирования ФВД, что снижает воспроизводимость аналитических методов. Поэтому при разработке ферромагнитного детектора особое внимание было обращено на: а) надёжную пассивацию носителя, 6) обеспечение достаточной ёмкости композиции, в) стабильность детектора э экспедиционных условиях, г) адаптацию техники метода к неинструментальному полевому анализу. '

Пассивация ДМД. Минимальные концентрации ионов железа катализируют гидролиз ацетилхолина, поэтому пассивация ЗВД представляла собой важнейшую задачу. Ю.А.Хавкин и соавт. (1988) предложили покрывать частицы ВДЦ слоем гидрофобного полимера полиметилметакрилата и затем ввести переэтерификадаей аминогруппы на поверхность покрытия. Однако этот способ не обеспечивал полной пассивации носителя, особенно при проведении реакции в кислой среде.

В качестве гидрофобного покрытия мы применили эпоксидной компа-уед, обладающий высокой адгезией к различным материалом. В качестве промотора адгезии был использован разветвленный высокомолекулярный полиэтиленполиимин (ПЭИ), образующий с железом прочные комплексные

соединения и легко реагирующий с оксирановыыи группами эпоксидных смол. При обычной обработке продукта ФЩ-йЭК смесью смоль! и отверди-теля образуются плотные конгломераты частиц, поэтому была разработана специальная техника формирования защитного слоя.

Сенсибилизированные обработкой ПЭИ частицы суспендировали в диме-тилаиетамиде (ДМШ, содержащем смесь диэпоксида (ДЭ) и ариламинного отвердителя диаминодифенилметана (ДАДФМ), прячем последний брали с 15—30% избытком. Суспензию помещали между коаксиально расположенными цилиндрическими электродами, на которые подавали напряжение с частотой 400 кгц. Поскольку частицы ФВД электоропроводны, а органическая фаза является изолятором, практически вся энергия индукционного, нагрева выделялась на частицах и инициировала отверждение компаунда на их поверхности.

Защитное покрытие содержало избыток ариламинных групп, которые могли быть модифицированы многими способами (см. рис.3). Ряд подходов был испытан для ковалентной иммобилизации ХЭ или промежуточных соединений. Лучшие результаты были получены при замещении ариламин-, ных групп гидрофильным диэпоксидом - диглицидиловьм эфиром диэтилен-гликоля (ДЭГ-1), который обеспечивал необходимые физические свойства поверхности носителя, однако специфическая ёмкость композиций была недостаточной.

Смешанная аффинно-ковалентная фиксация ХЭ на ДМД. При испытании различных вариантов аффинной фиксции ХЭ на ферромагнитном носителе (пшеничный лектин - эритроцитарная страма,"авидин - биотинилирован-ная ХЭ и полимиксин - ЛИС) по ряду параметров последний вариант был предпочтителен. В доступной литературе нет примеров использования системы ПМ-ЛПС для иммобилизации биолигандов, хотя ПМ-замещенная сефарова предложена в качестве коммерческого продукта для связывания ЛИС (Х^еЙ^г }. Аффинная связь ПМ-ЛПС исключительно проч-

на и диссоциирует лишь в присутствии сильных хаотроптных агентов, например дезоксихолата натрия.

Рис. 3. Стадии получения ферромагнитных носителей.

Стадия !

Компонент

Функция

I

I

Химическое строение продукта

1

2

3

4 5.

ФВД - ферромагнитная дисперсия ("керн")

' ПЗИ - полиэиленимин ММ = 10-30 кДа

ЭД - диглицидил(поли) фенилолпропан

ДАДФМ - диаминодифе-нилметан

АрА - ариламин (при избытке ДАДФМ)

Операции в магнитном поле

Промотор адгезии эпоксидного компаунда

Основа компаунда (диановые смолы)

Отвердитель компаунда

Активируемая группа

Гамма-окись железа (игольчатая форма)

^я-т^с^и^- щ

ад СгН^

снэ -

Я>МД -ПЭИ -у// -р//- Щв-ф?'® о . Ч;., сняон . .. СИ3 ;

№уынг ' —

см ^ 0

;сна

и

Активация АрА (испытаны для иммобилизации ХЭ)

Реагент (берется в избытке)

Активное производное

Химическое строение

альдегид гидразид изотиоцианат

5.1 ГА- глутаровый альдегид 5.1.1. + ДГАК - дигидразид адипиновой кислоты

5.2. Тиофосген

5.3. Азотистая кислота соль диазония

5.4. ДЭГ - диглипидиловый эфир (диэтиленгликоль)5^-

диэтиленгликоля оксиран

5.4.1. "Аларминол" - п-зм;шофенил- арилаыин с переводом 2-аыино-пропан-диол-1,3 в соль диазония

-С:

Л о

/+СГ Л

гидрофильная область * ---- к

носи.

ОН',

Введение ПМ в молекулу ХЭ осуществляли с помощью спейсера акт-ЦЦ, содержащего имидокарбонатные группы. Сначала проводили связывание

добавляли 10-кратный избыток ИМ и вели его связывание в тех же условиях в течение 15 минут. После доведения рН до 6,0 продукты реакции разделяли эксклюзионной гель-хроматографией на Сефарозе 4В или диа-лизовали на высокоэффективном кольцевом диализаторе. Хотя ХЭ недостаточно устойчива при высоких значениях рН, сокращенное время реакции позволяло получить выход порядка 60-705? от исходного.

Для иммобилизации ЛПС на носителе использовали 2 подхода - связывание через углеводный компонент с помощью иммобилизованной м-амино-фенилбороновой кислоты (АФЕЮ и через иммобилизованный ПМ. Оба сое-

динения фиксировали на изотиоцианатном производном эпоксидированной ФВД (рис. 3). Связь через АФБК была недостаточно прочной," особенно в кислой среде. Общая схема процесса представлена на рис, 4.

Рис.4. Схема аффинно-ковалентной фиксации ХЭ.

Композиция ФМД-Ш-ЛПС-ЛМ-ХЭ имела сравнительно высокую активность порядка 6 ИЕ/г. Очевидно, полимерное строение ЛПС, состоящего из сотен идентичных субединиц позволило фиксировать ХЭ в виде надмолекулярных ассоциатов. Этот подход позволяет сочетать достаточную емкость с главным преимуществом керновых композиций - высокоэффективным массопереносом. Поскольку сорбционные ассоциаты ХЭ также могли бы обеспечить сочетание этих свойств при упрощении техники получения биосенсора, мы испытали также и этот способ иммобилизации.

спейсера с ХЭ при рН 8,0 и температуре +4° в течение 60 минут, затем

• -I СПХ'О ЛПС

Ковалентно-сорбционная иммобилизация ХЭ. Минеральный сорбент ГОА связывает ХЭ с сохранением её чувствительности к ФОИ (см. табл. I). Для фиксации мицелл ГОА на пассивированной ФМД мы использовали подход, разработанный нами для получения твердофазного экстрагента с селективным переносом ионов тяжелых металлов (ККс^кт^, -1994 ). Схема процесса (рис. 3) включает в себя реакцию бис-аминодиола ''Алар-минол" с оксирановыми группами ДЭГ, при этом реагируют лишь более активные алкиламинные функции. Свободные ариламинные группы после диаэотирования сочетают с комплексантом 8-оксихинолином, получал сложный коыплексообразующий сайт, который удерживает ГОА за счёт основной (оксиновой) и двух вспомогательных (аминодиольной и диазо-) групп (см. рис. 4). Полученный продукт "Магносорб" сорбирует многие белки, включая ХЭ.

Яке н~0~> -лк

СИЗНОСИ, Ш

• ' ,01С,

Рис. 4. Схема строения продукта !>Магносорб". ОКС и :ДКС - : основной и дополнительные комплексообразующие сайты. Остальные обозначения см. рис. 3.

Сорбция ХЭ на "Магносорбе" технически проста и осуществляется при рН 5-6, что позволяет избежать снижения активности энзима за счёт щелочной денатурации.

Определение активности ХЭТ иммобилизованной на ДЗД■ Техника учёта активности ХЭ во многом определяет чувствительность и воспроизводимость метода детекции ФОИ, Лотенциометрическое титрование и колориметрия восстановленного реактива Эллмана доступны лишь в лабораторных условиях, поэтому для адаптации метода к полевому неинструментальному анализу необходимо было-найти иные решения.

Важной проблемой было также надёжное дозирование ферромагнитного носителя, поскольку ни объёмный, ни весовой метод не давали воспроизводимых результатов. Сконструированный нами магнитный дозатор представлял собой плоскодонную пробирку с размещенным внутри подпружиненным штоком. Магнит с концентратором поля укрепляли на нижнем конце штока. В нижнем положении магнит удерживал дозу ФВД иаружи дна пробирки, при отпускании штока магнит перемещался вверх и доза суспензии вносилась в жидкость. Точность дозирования была достаточной для получения воспроизводимых результатов с коэффициентом вариации 6-8^.

Для детекции минимальных количеств кислоты, вьщеляющейся при гидролизе субстрата, была разработана специальная иадикаторная мембрана. Полиамидная пористая основа мембраны удерживала индикатор бром-крезол пурпурный и бис-аминодиол "Аларминол", обладающий буферными свойствами. Освобождающаяся уксусная или масляная кислота преимущественно накапливалась в мембране, буферность которой обеспечивала плавный, хорошо различимый переход от синего к желтому цвету через зелёный. Благодаря проведению реакции в ультрамикрообъеме, чувствительность детекции различных ФОИ.повышалась на порядок, по сравнению с потен-циометрическим методом.

Недостатком индикаторной мембраны является необходимость постоянного внимания к изменению цвета, поскольку в присутствии суспензии биосенсора выделяющаяся кислота может нивелировать различия между опытом и контролем. В альтернативном варианте учета результатов доза биосенсора была удвоена (0,4 г вместо 0,2 г), а время конверсии суб-страт^ограничено 5 минутами. Суспензию отделяли в магнитном поле, к раствору субстрата добавляли индикатор и с помощью дозирующей пипетки в обе пробирки вносили по 5 мкл 1% раствора карбоната натрия попеременно в опытную и затем в контрольную пробу. Этот метод позволял зарегистрировать различия в 0,1 ИЕ энзима на дозу и получить количественные результаты.

Важнейшей характеристикой сенсора является его стабильность при хранении и в процессе анализа. Лиофилизация в присутствии обычных кри-опротекторов (желатин, сахароза, декстран и др.) снижала активность иммобилизованной ХЭ уже на стадии обычного или сверхбыстрого (в жидком азоте) замораживания. Лучшие результаты дала контактная суша безводным сульфатом магния, однако препарат сохранял активность только при низких температурах над безводным хлористым кальцием. Очевидно, что обеспечить эти требования в полевых условиях трудно.

Другой валкой проблемой была инактивация биосенсора в водных средах. Стадию ингибирования желательно проводить при рН около 7,0 и выше при повышенной температуре, что способствует денатурации ХЭ. Используемый буферный раствор (0,04 М трис-НС1 рН 6,5 с 0,05 мг твина-80 и 5 мг сульфата магния в I мл) вызывал падение активности ХЭ и,а еще большей степени, чувствительности к действию ФОН. Предварительное хранение биосенсора в воде усугубляло эти изменения - табл.3.

Таблица 3

Изменение свойств иммобилизованной ХЭ при хранении в водной среде.

Ингибитор

Показатель'

х)

экспозиция при 22°, часы

1Г

тг

ж

'Ж

Контроль

Фталофос 10 мкг/мл

Карбофос

Ш А

ИЕ И

ИЕ II

0,В8 100& 0,48 45%

0,58 34%

0,88

0,78 89% 0,60 ж

0,62 Щ

0,70 80% 0,68

0,69 ! 1.588

х^Примечание: ИЕ - активность ИЕ/дозу, потенциометрическое титрование; А - активность в % от исходной; И - ингибирование активности, контактный объем 50 мл, экспозиция 30 мин. при 37°.

Диссоциация функциональных свойств иммобилизованной ХЭ могла быть обусловлена постепенной переориентацией гидратированных молекул энзима на поверхности носителя с маскированием каталитической области.

Предотвращение диссоциации свойств ХЭ возможно при использовании све-жеизготовленных биосенсоров. Для этой цели была предложена"бинарная форма, состоящая из носителя "Магносорб" и лиофилизированного энзима, полный сенсор получается смешением обоих компонентов за 2-4 часа перед применением.

Бинарная композиция испытывалась на модельных смесях молока и томатного сока с $ОЙ-инсекгицидами. При учете активности с помощью полиамидной индикаторной мембраны можно было обнаружить присутствие фталофоса в концентрации 10 нг/мл (молоко) и 5 нг/мл (сок). Различные ФОИ в концентрациях, близких к ЦЦК ( I мкг/мл) снижали активность ХЭ на 49^ - фталофос, 40% - карбофос, 38$ - хлорофос и 33% - рогор (ингибирование вели при 40°, объем материала 200 мл). Таким образом, бинарная композиция позволяла обнаружить малые количества 50ÍÍ в пищевых объектах без их предварительной подготовки.

ВЫВОДЫ :

1. При иммобилизации ХЗ возможна диссоциация функциональных свойств энзима - сохранение- эстеразной активности при значительном снижении чувствительности к фосфорорганическим ингибиторам.

2. Для уменьшения влияния твердой фазы на энзим при иммобилизации предложены протяженные вставочные молекулы (спейсеры) высокой гидро-фильюсти, способствующие пространственному разобщению биолиганда от носителя и увеличивающие стерическую свободу белковой молекулы. Разработаны 2 варианта спейсеров - полиоксидиальдегид ("Полдиаль") и активированные производные бета-циклодекстрина,

3. Предложены половолоконные детекторы ФОИ, содержащие инкапсули-' рованну» ХЭ, с улучшенными операционными характеристиками и повышенной чувствительностью за счет накопительного эффекта.

4. Носители "кернового" типа с поверхностной иммобилизацией биоли-ганда обесечивают более эффективный массоперенос продуктов знзимати-ческой реакции. Специфическая активность керновых композиций может быть повышена при иммобилизации надмолекулярных ассоциатов ХЭ.

5. Оптимальным вариантом керновых'носителей являются ферромагнитные дисперсии, расширяющие технические возможности метода и упрощающие процедуру анализа. Предложен способ пассивации частиц гамма-окиси железа эпоксидным компаундом при индукционном нагреве, что позволяет сохранить высокую и однородную дисперсность носителя, а также активировать его разнообразными химическими модификациями.

6. Разработана композиция "Магносорб", несущая мицеллы гидрата окиси алюминия на ферромагнитной основе за счет сложного комплексанта, ковалентно присоединенного к пассивирующему'покрытию.

7. Стабильность детектора в процессе хранения и ^его функциональные свойства улучшены с помощью использования свежеизготовляемой полной композиции из раздельно хранящихся "Магносорба" и лиофилизированной ХЭ.

8. Бинарная форма сенсора и регистрация его активности в микрообъёме позволяют детектировать малые количества фосфорорганических инсектицидов в пищевых объектах без их предварительной подготовки.

9. Предложенные методические подходы могут улучшить экологический

и санитарно-гигиенический мониторинг, а также способствовать совершенствованию биотехнологических процессов.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1. Эффективный кольцевой диализатор / Хавкин M.D., Зимницкий А.Н./7 "Лабораторное дело"//1990..-С.79.

2. Сорбенты на основе хелатных красителей для удаления и детекции тяжелых металлов/ Хавкин Ю.А,, Ройтман М.И., Хавнин М.Е., Смирнова H.H.// Теория и практика хроматографии: Тез. докл. межотраслевого семинара. - Уфа, 1991.-С. I0-II.

3. Использование магнетизированных поликатионов для иммобилизации микробных клеток/ Хавкин M.J0., Ройтман М.И., Гайлюнас И.А., Хавкин Ю.А. // Новые направления биотехнологии: Тез. докл. 6-й Воеросс. конф,-Пущино, 1994.-С.54.

4. T'tie b«Leetive transfer in solid-phase extraction: a new nethod for water cleaaing fro» heavy metals / Khavkin JSc.J., Vakhfcov V.A., Ehavjtin J.A. // "lletal ions ia Biology and;Medicine"// 1994.-v.3-~ F. 291-293 // "Libty inc.".-Montreal, Canada.

фосфорорганическик соединений. Сообщение I. Иммобилизация фермента с сохранением его чувствительности к ингибиторам. / Хавкик II,Ю,, Вахитов В.А., Хавкин Ю.А. // Вопросы биохимии: Межвузовский сб.-Уфа, 1995.-С.128-132.

б. Использование иммобилизованной холинэстераэы для индикации фосфорорганических соединений. Сообщение 2. Разработка детектора с ферромагнитными свойствами / Хавкин М.ЗО. // Вопросы биохимии: Межу вузовский сб.- Уфа, 1995.- С.133-138.

Заявки на патент Р®, прошедшие формальную экспертизу:

1. Способ получения носителя для иммобилизации биологически активных веществ / Хавкин М.Ю., Хавкин Ю.А. // Заявка на пат. РФ.-

Р Гос.регистрации 93041258.

2. Способ получения инкапсулированных ферментов / Хавкин М.Ю. // Заявка на пат. РФ,- № Гос. регистрации 930564В5.

5. ние иммобилизованной

холинэстераэы для индикации