Бесплатный автореферат и диссертация по географии на тему

Разработка новых тест-систем Drosophila melanogasterдля оценки отрицательных последствий загрязненияокружающей среды

ВАК РФ 11.00.11, Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых тест-систем Drosophila melanogasterдля оценки отрицательных последствий загрязненияокружающей среды"

^^ На правах рукописи

'чСЙДОРСКАЯ ВИОЛА АНАТОЛЬЕВНА

УДК 504.062.2.001.5

Разработка новых тест-систем 0гозорЫ1а те1аподаз1ег для оценки отрицательных последствий загрязнения окружающей среды

11.00.11. - Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Брянск-2000

Работа выполнена в Российском государственном педагогическом университете им. А.И.Герцена (С.-Петербург) и Арзамасском государственном педагогическом институте им. А.П.Гайдара

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор ¡П.Я.Шварцман}; доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН E.H. Самошкин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р.И. Гончарова; доктор медицинских наук, профессор H.H. Самойлов

Ведущее учреждение: Институт химической физики РАН

Защита диссертации состоится 2000 г. в часов на заседант

диссертационного совета К 113.29,03 Брянского государственной педагогического университета им. академика И.Г. Петровского по адресу: 24103( г. Брянск, ул. Бежицкая, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Брянскогс государственного педагогического университета им. академика И.Г. Петровского.

Автореферат разослан "Г" 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного

£ ОМ. О Е QVAMt-M-Mt/b

совета

Москаленко О.П.

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Исходя из концепции охраны окружающей среды, остро встает вопрос о необходимости организации широкой проверки действия внешних факторов с целью выявления патологических, наследственно обусловленных реакций.

Дрозофила (Drosophila (Dr.) melanogaster) входит в состав стандартных батарей гестов для определения мутагенного (Шварцман, 1986; Würgler, Graf, 1985) и антимутагенного (Гончарова, 1999; Хайцева, 1995) действия различных классов химических веществ. Тесты на основе дрозофилы более экономичны, а по информативной ценности не уступают результатам на млекопитающих (Vogel, 1987). Однако недостаточно освещен вопрос о возможности модификации мутагенных , эффектов путём изменения чувствительности генома тестерного организма. Линии с нарушением адаптивного ответа, как правило, прояшотот повышенную чувствительность г действию повреждающих факторов. К таковым относятся мутагенчувствительные, эадиочувствительные и термочувствительные мутанты дрозофилы (Würgler и др., 1986; Хромых, 1982; Arking, 1975). Использование этих линий дрозофилы может шособствовать выявлению механизмов специфической (генотипической) модификации генетических эффектов тех или иных агентов и взаимодействия различных клеточных :истем (в том числе, репарации ДНК, белков теплового шока), участвующих в юддержании гомеостаза. Кроме того, мало разработаны способы надёжной оценки жнергических эффектов нескольких факторов на геном. В качестве неспецифического фактора, модифицирующего генотоксический эффект химических соединений, может )ыть использовано и действие экстремальной температуры, которая приводит к «запуску» :истемы стрессовых белков, выполняющих универсальные (в отношении других щеточных систем) стабилизирующие функции и обеспечивающих первичный ответ на гействие стрессорного фактора (Tanguaiy, 1988).

Цель исследования - создание и изучение чувствительности новых тест-систем )r. melanogaster к мутагенному, морфогенному и токсическому действию (репаратов, различающихся по химической природе и способу действия в клетке, и [зучение возможности специфической и неспецифической модификации этих 'ффектов.

Задачи исследования:

1. Создание линий Dr. melanogaster на основе мутагенчувствительной mus(2)201G1) и(или) температурочувствительной (l(l)ts403) мутаций Dr. melanogaster, а акже крылового маркера mwh.

2. Анализ мутагенного, морфогенного и токсического эффектов мутагенов прямого и освенного действия у новых линий дрозофилы с нарушением адаптивного ответа.

3. Оценка роли белков теплового шока и репарационных систем в становлении 1утагенного, морфогенного и токсических эффектов используемых химических агентов у иний дрозофилы, характеризующихся нарушением в функционировании данных легочных систем.

4. Изучение возможности модификации генетических эффектов мутагенов действием

гипертермии.

5. Оценка чувствительности новых тест-систем дрозофилы по исследуемь показателям в сравнении с традиционно используемыми тестами.

Объекты исследования. Объектами исследования явились созданные нами лаборатории генетики РГПУ им. А.И. Герцена следующие линии дрозофил! mus(2)201G';mwh, l(l)ts403;mwh, l(l)ts403;mus(2)201G1;mwh и контрольная линия mwh.

Научная новизна. Впервые сконструированы линии дрозофилы, имеющие в сво< генотипе, кроме крылового маркера mwh мутагенчувствительную мутацию mus(2)20l' которая приводит к нарушениям эксцизионной репарации ДНК, и(ил температурочувствительную леталь l(l)ts403 с нарушением синтеза белков теплово шока. Выявлены у этих тест-систем новые генетические эффекты, вызванные мутаген« прямого действия (этиленимином) и ксенобиотиком (диэтилнитрозоамином). Таю показана возможность модификации индуцированных исследуемыми агентами разш событий (соматический мозаицизм, морфозы щетинок плоскости кры; постэмбриональная гибель потомства) кратковременным последействием теплово стресса. Обнаруженный в ходе исследования морфогенный и сопряженный мутагенные токсический эффекты этих соединений у разных мутантных линий позволя! предположить ведущую роль во многих клеточных процессах мутации mus(2)201 затрагивающей этап эксцизионной репарации. В то же время, возможность модификац. генетических эффектов анеугенов гипертермией и дифференциальная чувствительное различных мутантов дрозофилы позволяет предположить о кооперации систем репарац и белков теплового шока как в ходе нормального морфо- и онтогенеза, так и п воздействии химических соединений, нарушающих работу генного аппарата и процеа клеточной пролиферации.

Положения, выносимые на защиту.

1. Повышенная чувствительность разработанных линий - l(l)ts403;mv .mus(2)201G';mwh и l(l)ts403;mus(2)201G';mwh в тесте SMART (Somatic Mutation a Recombination Test)« мутагенам прямого и косвенного действия.

2. Принятая для исследования мутация mus(2)201G1 обусловливает образован морфозов волосков крыла при различном анеугенном воздействии.

3. Повышенная чувствительность новых линий дрозофилы к токсическому эффек этиленимина и диэтилнитрозоамина.

4. Различная генетическая детерминированность спонтанной доминанта летальности у новых тест-систем.

5. Модифицирующий эффект теплового стресса.

Практическая ценность. Результаты, полученные с применением новых лин дрозофилы, свидетельствуют о повышенной чувствительности их к мутагенно} морфогенному и токсическому действию различных экзогенных факторов, поэтому moi быть рекомендованы в качестве тест-систем с повышенной разрешающей способност для решения практических задач скрининг-анализа.

Обоснованность и достоверность выводов подтверждена необходимым объем экспериментального материала, полученного в ходе нескольких серий эксперимент

»веденных в трех повторностях; использованием современных методик исследования, юперсионного и корреляционного анализа, обработкой данных на ЭВМ.

Личный вклад. Автор обосновал цели и задачи исследования, выполнил :спериментальную часть работы и сделал анализ полученных результатов. Статьи, 1учные доклады подготовлены самостоятельно.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были представлены на 1 .езде ВОГиС (Саратов, 1994), международной научной конференции "Брянщина у токов лесной науки славянских народов" (Брянск, 2000), научно-практической жференции "Экологические исследования и проблемы экологического образования" Арзамас, 1997), 4-й научно-практической конференции "Экологическое образование и >спитание в Нижегородской области" (Нижний Новгород, 1997), Всероссийской научно-эактической конференции "Проблемы экологии и экологического образования: ¡стояние, пути решения" (Красноярск, 1998), научно-технических конференциях "Вклад шных и специалистов в национальную экономику" (Брянск, 1998), Герценовских гениях РГТТУ им. А.И. Герцена (1990-1993), ежегодных научно-практических энференциях по итогам НИР Арзамасского государственного педагогического института 995-1999), семинарах лаборатории генетики Российского государственного гдагогического университета (Санкт-Петербург) и кафедры дендрологии, селекции и ¡еленения Брянской государственной инженерно-технологической академии.

Основное содержание диссертации опубликовано в 11 научных статьях.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 183 с. машинописного текста, вдержит общую характеристику работы, 5 глав, выводы и рекомендации, список -гтературы из 271 источника, 146 из которых на иностранных языках, текст ■ ллюстрируют 4 0 приложений.

1.Генетический контроль скорости индуцнрованного соматического мозаицизма у Drosophila meianogaster

На первом Советско-Американском симпозиуме по мутагенам окружающей среды . Я. Шварцман (1972) предложил использовать индукцию соматического мозаицизма у зозофилы как интегральный тест, позволяющий определить в совокупности генные утации, потери хромосом или их фрагментов и митотическую рекомбинацию в эматических клетках, гетерозиготных по каким-либо маркерным генам.

В настоящее время в мировой практике используется несколько тестовых систем, эзволяющих изучать мутагенез в различных тканях- сомы дрозофилы: тела - y/sn (Stem, 536), глаз-w/w+, w/wa(Patterson, 1928; Timofeeff-Ressovsky, 1929), w-z (Rasmuson и p., 1984), w/wco (Шварцман, 1975; Mollet, Würgler, 1974), w/w' (Green и др., 1983) и эыла - mwh/flr (Graf и Würgler, 1984), последняя получила широкое зспространение в скрининг-программах, как учитывающая различные :нетические события в связи с ее экономичностью и быстротой (Шварцман, хаенко, 1994-1999; Хайцева, 1995; Vogel и др., 1997; Frei и Würgler, 1997).

В настоящее время в геноме дрозофилы выделено более 60 локусов

мутагенчувствительности (Boyd и др., 1987). Однако исследование влияния этих мутац] на мутационный процесс находится ещё в стадии своего становления.

В результате последних исследований установлено, что в клетках дрозофш функционируют системы энзимологической фотореактивации (Boyd, Presley, 19' Левин, Козлова, 1976), эксцизионной и пострепликативной репарации (Boyd, Harris, 19S Лучкина и др., 1982; Brown, Boyd, 1981), репарации двойных разрывов ДНК (Dezzani др., 1977; Dusenbery, 1996).

Ряд авторов (Лобашев, 1946; Жестянников, 1968; Ауэрбах, 1978) считают, ч мутагены приводят сначала к образованию потенциальных изменений в генетическс материале. В течение некоторого времени (не более 90 мин) они могут стать мутациями вероятность этого резко увеличивает действие гипертермии, или эти изменен восстановятся до нормы (Шварцман, 1986; Тихомирова, 1989). Возможно, высок температура может индуцировать систему SOS-репарации, которая работает с ошибках/ и тем самым увеличивает частоту мутаций, или гипертермия может каким-то образе препятствовать действию ферментов безошибочных конститутивных систем репарац! (Тихомирова, Тупицина 1983).

Одна из гипотез допускает, что изменение клеточных структур (мембрг цитоскелета) и перераспределение протеинов в ядре под влиянием гипертермии мог делать повреждения ДНК менее доступными для ферментов репарации (Исаенко, 1998).

Использование мутантных линий с нарушенным синтезом белков теплового шо позволяет оценить роль этих белков в жизненно важных клеточных процессах. Так, температурочувствительной линии l(l)ts403 М.Б. Евгеньевым и О.Н. Денисенко (19S было показано нарушение регуляции синтеза бежов теплового шока посттранскрипционном уровне, Л.А. Мамон с соавторами - нарушение расхожден половых хромосом в митозе (1990,1992), снижение выживаемости имаго (199! нарушение динамики яйцеоткладки и повреждение яйцевых камер в овариолах (199: слипание, пульверизация и агрегация хроматина (1993), O.A. Исаенко (1998) - увеличен соматического мозаицизма.

Анализ литературной информации показал, что недостаточно изучено влиян мутагенчувствительных и температурочувствительных аллелей на процесс становлен мутаций в соматических клетках при действии агентов различной химической природ практически не рассматривался вопрос о взаимодействии различных клеточных систем том числе, репарации ДНК, белков теплового шока) в модификации генетическ эффектов прямых и косвенных мутагенов. Остается актуальной проблема истинных ложных гогтен mwh, так как различные подходы к ее рассмотрению привели к весы противоречивым результатам (Graf, 1986; Захаренко, Захаров, 1996). С нашей точ зрения недооцененным оказалось значение критерия летальности потомства на разш стадиях развития в оценке потенциальной мутагенности изучаемых факторов.

2.Материал и методика

В различных сериях эксперимента использовали следующие линии:

1. mwh (multiple wing hairs)(3-0.0). Рецессивная мутация mwh приводит гомозиготном состоянии к образованию нескольких (2-5) щетинок на одной клетке крьи

2. Sm5,Cy/mus(2)201G1. Мутация mus(2)201G'(2-73,8), в дальнейшем mus, приводит к арушению эксцизионной репарации ДНК и повышенной мутагенчувствительности ГГучкина и др., 1982).

3. I(l)ts403;cnbw. Мутация l(l)ts403(l-32,5), в дальнейшем ts, охарактеризована как емпературочувствительная деталь с нарушением синтеза белков теплового шока Ввгеньев, Левин, 1980).

4.1(l)ts403;cnbw;mwh (далее ts;mwh) выведена нами на основе мутации ts и маркера îwh.

5. mus(2)201G'/Sm5,Cy;mwh (далее mus;mwh) создана нами на основе мутации mus и иркера mwh.

6. l(l)ts403;mus(2)201OI/Sm5,Cy (далее ts;mus) сконструирована нами на основе утаций mus и ts.

7. l(l)ts403;mus(2)201G1/Sm5,Cy;mwh (далее ts;mus;mwh) получена нами на основе утаций mus, ts и маркера mwh.

8. Canton-S - стандартная лабораторная линия дикого типа.

В различных сериях экспериментов были использованы 2 мутагенных препарата.

1. Этиленимин (ЭИ)- мутаген прямого действия, приводящий к серьёзным овреждениям генетического материала генеративных и соматических клеток у азличных организмов (Рапопорт, 1978; Самошкин, 1980; Шварцман, 1986), спользовался в концентрациях - 1, 0,5, 0,25% водного раствора. Кружки из ильтровальной бумаги с только что вылупившимися личинками (24 ч после начала гкладки яиц) обрабатывали в течение 4 ч парами раствора этиленимина нужной онцентрации в эксикаторе объёмом 1,5 л при t=+25°C (острая обработка), после чего ереносшш их на стандартную питательную среду.

2. Диэтилнитрозоамин (ДЭН) - мутаген косвенного действия, требующий етаболической активации и приводящий к широкому спектру изменений в геноме /ogel, 1980; Vogel и др., 1983; Parke, 1987), использовался в двух концентрациях (5 и ,5мМ) водного раствора. Его вносили в питательную среду на весь период личиночного озвития (хроническая обработка).

Воздействию высокой температуры (t=+37°C) подвергали обработанных мутагеном ичинок и контроль в течение 1 ч в суховоздушном термостате ТС-80-М-2.

Приготовление препаратов, анализ крыловой поверхности и классификация пятен в ;сте на крыловой соматический мозаицизм проводился в соответствии с традиционной етодикой SMART-анализа (Graf и др., 1984), модифицированного в нашей лаборатории I лаборатории генетики Санкт-Петербургского педагогического университета).

Учёт гибели потомства проводили у разных линий в разные периоды развития (ста-ии яйца, личинки и куколки) с использованием методик, разработанных Ю.М. Хромых 974) и П.Я. Шварцманом с сотрудниками (1973).

От скрещивания линий, применяемых в SMART-анализе, получали четыре оследовательные 6-ч кладки в каждом варианте эксперимента, подсчитывали общее эличество отложенных яиц, а через 48 ч количество неразвившихся яиц. При этом ифференцировали яйца по окраске на 2 типа: ранние эмбриональные летали (РЭЛ-

светлая окраска) - погибают за 0-10 ч эмбриогенеза и поздние эмбриональные летал] (ПЭЛ-тёмная окраска) - погибают сравнительно поздно - на 10-20 ч эмбриогенез (Шварцман, Литвинова, 1974).

Куколочная гибель учитывалась после массового вылета мух путем простог подсчёта общего числа куколок и погибших среди них особей.

Учёт личиночной гибели основывался на разности таких показателей, как числ вылупившихся личинок и число окуклившихся особей. Количество вылупившихс личинок определяли как разность между числом отложенных яиц и показателем обще эмбриональной гибели на стадии яйца.

Частота гибели потомства служила показателем общей выживаемости тесторны линий при действии мутагенного фактора и без него, которая оценивалась отношение; числа вылетевших мух к числу отложенных яиц.

Статистический анализ данных в SMART-тесте проведён в соответствии описаниями H.Frei и F.E. Würgler (1988), а также F.E. Würgler и др.(1986), которы рекомендуют использовать в такого рода экспериментах критерий X2 с поправкой Иейтс< При статистической обработке результатов были также применены дисперсионный корреляционный (с z-преобразованием Фишера) анализы, критерий Стьюденга использованием поправки Иейтса на непрерывность, ф - преобразование Фишера (углова трансформация) (Лакин, 1990; Плохинский, 1980;Снедекор, 1961).

Сравнение F<j, с Fs велось с учетом трёх доверительных уровней: Р=0,05, Р=0,01 Р=0,001. По повторностям опытов во всех экспериментах Рф<Рй.

При анализе материалов учтены руководства по математической статистике И.<1 Рокицкого (1978), К. Мазера и Дж. Джинкиса (1985), М.А. Kastenbaum и К.О. Bowma (1970) и Г.И. Мендельсона и др.(1990), C.B. Рябовой и В.Г. Петина (1998).

Обработка данных проводилась с использованием компьютерных програт разработанных в соавторстве с С.Б. Беневольским и аппроксимированных к SMART анализу.

3. Новые тест-системы в SMART-анализе - mus(2)201G1;mwh, l(l)ts403;mwh и l(l)ts403;mus(2)201G1;mwh

При создании новых тест-систем мы стремились решить следующие задачи:

1)повысить разрешающую способность SMART-анализа как для прямых, так и да косвенных мутагенов;

2)упростить анализ и идентификацию пятен.

Поэтому для конструирования тестерных линий были выбраны мутагенчувствител] ный мутант - mus(2)201cl и температурочувствительный мутант l(l)ts403 (заранее оказ; лись более восприимчивы к отдельным факторам) и крыловой маркер mwh.

Исходя из неоднозначности действия аллели flr (Würgler, Vogel, 1986; Zimmering др, 1997), было решено этот маркер в новых тест-системах не использоват Освободившись, с нашей точки зрения, от генетически малоинформативных fir-пятен и i всегда показательных mwh/flr, мы значительно упростили сам SMART-анализ. Таки образом, модифицированный SMART-анализ заключался в подсчёте только mwh пяте]

:оторые ранжировались на малые (1-2 клетки) и большие (более 2 клеток).

Мутации mwh могли появляться у новых тестерных линий в результате делеций в (икой аллели локуса mwh, точковых мутаций, анеуплоидной потери хромосом или же >ыть следствиями кроссинговера.

Результаты SMART-анализа свидетельствовали (рис. 1), что все новые линии с очень ¡ысокой степенью достоверности (Р<0,001) увеличивали частоту появления неморфозных лалых пятен mwh при использовании как этиленимина, так и диэтилнитрозоамина.

Линии mus;mwh/+ и ís;mwh/+ статистически достоверно (Р<0,05) увеличивали выход юльших неморфозных пятен при применении 0,5 и 1% этиленимша. Диэтилнитрозоамин >ыл способен индуцировать данный тип пятен в двух концентрациях (5 и 2,5 мМ) у линии s;mus;mwh/+ и в одной (2,5мМ) у линии mus;mwh/+.

Используя критерий оценки чувствительности репаративных мутантов, 1редложенный F.E. Würgler и др. (16), было проведено сравнение чувствительности ювых тестерных линий со стандартной линией mwh/+. По общей чувствительности к ииленимину и диэтилнитрозоамину в SMART-анализе тестируемые линии тасположились следуюцщм образом: ts;mus;mwh/+ > mus;mwh/+ > ts;mwh/+ > mwh/+. 1аиболее мутагенчувствительной оказалась линия, содержащая в своём геноме 2 мутации l(l)ts403 и mus(2)201G1, она при одних и тех же дозах на 1,5 порядка увеличивала выход лалых пятен по сравнению с контрольной линией.

Сравнение наших линий с другими тестовыми системами w/+ (Шварцман и др., 1975, 1980), wco/w (Vogel, Sobéis, 1976), ysn/4-+-, sn/+ (Шварцман и др., 1980), y+/+sn Хованова, 1978; Ингель, 1989), mwh+/TM3, mwh+/+flr (Frei, Clements, 1992; Rodriguez-\rnaiz, 1996), mwh+/+flr(ORR)(Frölich, Würgler, 1989) убедительно свидетельствуют о юльшей эффективности новых тест-систем по сравнению с традиционно применяемыми :истемами гетерозигот.

Для анализа зависимости соматического мозаицизма от дозы мутагена была федпринята ранжировка всех имеющихся больших пятен mwh по классам в соответствии : описанием Würgler и Vogel (1986), которая показала, что эффективность средних и шзких доз мутагенов определяется ни общим числом больших пятен, а качественной их сарактеристикой, т.е. количеством клеток, участвующих в образовании клона. Поэтому -ил предлагаем в тесте на крыловой соматический мозаицизм из группы больших пятен ¡ыделить в самостоятельный класс группу, включающую 3-4 клетки как переходную ¿ежду двумя типами клонов с разной пролиферативной активностью.

Частота возникновения неморфных пятен пшИ при действии этиленимина, диэтилнитрозоамина и теплового шока у разных __ линий дрозофилы

! Г Г

120,00% т

1з;тиб;т1Л1Ь/+ пты+

малые пятна

большие пятна

ти8;тж11/+ т«11/+ тшЬЛ-

Рис. 1. Условные обозначения: ЭИ - этиленимин, ДЭН - диэтилнитрозоам: ТШ - тепловой шок; по оси ординат - количество пятен (%) на крыло.

Оценивая' с этих позиций мутаген прямого действия и косвенного действия, можно констатировать, что мутаген этиленимин приводит к более серьёзным нарушениям генома, чем диэтилмлрозоамин, причём интенсивность его повреждающего действия в большей степени

Gl

зависит от присутствия в генотипе мутации mus(2)201 .

Дополнительное воздействие гипертермии существенно (Р<0,01) повышало частоту малых пятен mwh, индуцируемых этиленимином у мутагенчувствительных линий mus;mwh/+ и ts;mus;mwh/+ (см. рис.1). Это, возможно, связано с реализацией возникших в ходе обработки мутагеном потенциальных изменений хромосом. Такое же тепловое последействие для температурочувствительного мутанта ts;mwh/+ оказалось не столь эффективным, видимо, повреждающее действие этиленимина в системах с нормальным репаративным синтезом не столь велико, как в случае с мутагенчувствительными мутантами, а нарушение синтеза белков теплового шока и, вследствие этого, отсутствие связи их с хроматином не препятствует работе ферментов репарации. Этими же причинами можно объяснить повышение мутабильности температурочувствительных линий к комбинированному повреждающему действию диэтилнитрозоамина и высокой температуры. Известно, что вероятность реализации мутаций зависит от времени существования аддуктов нуклеотидов с алкильними радикалами, образующимися в ходе биотрансформации промутагена (Vogel и др., 1982; Vogel, 1986-1990), т.к. обработка диэтилнитрозоамином проводилась в хроническом режиме, то логично предположить, что активные метаболиты, присутствующие в организме мухи в течение всего периода личиночного развитая, могли атаковать незащищенные белками теплового шока молекулы ДНК и приводить к генным и хромосомным мутациям.

4.Проблема истинных и ложных мутантных пятен mwh в методе SMART у Drosophila melanogaster

Новые мутантные линии mus;mwh, ts;mwh и ts;mus;mwh имели такую особенность, как образование морфозных пятен mwh.

Чтобы разобраться в проблеме истинных и ложных мутаций типа mwh, был предпринят анализ морфозов щетинок крыла, возникающих спонтанно и индуцированно. Все пятна, клетки которых имели две ворсинки, делились на следующие группы: А - клоны клеток, имеющие щетинки нормальной морфологии и равной или разной длины; Б - клоны клеток .такие же, как в группе А, но с измененной структурой волосков - тонкие, извитые; В - клоны клеток с двумя мощными ворсинками; Г - клоны клеток, расположенные на жилках.

Перечислим аргументы, почему клетки плоскости крыла с двумя ворсинками групп А и Б следует считать мутациями. Во-первых, они встречаются у гомозигот mus;mwh, ts;mwh и ts;mus;mwh. Во-вторых, они отмечены в составе большого пятна у гетерозигот и тогда по традиционной методике учитываются. В-третьих, они индуцируются этиленимином и диэтилнитрозоамином так же, как и клетки с тремя

волосками. Отметим, что хотя измененная форма щетинок пятен группы Б 1 является следствием образования морфозов, но этот процесс происходит на боле, поздней стадии формирования структуры волоска, на которой их количество уж> детерминировано либо мутаций пшЬ (множественные или двойные трихомы), либ( дикой аллелью этого гена (одинарный волосок).

Рассматривая относительную частоту встречаемости истинных, с нашей точю зрения, морфозов, можно заключить, что только линии, содержащ» мутагенчувствительную мутацию тиз(2)201О1, обладают склонностью ] образованию морфозов (рис.2). Возможный механизм таких модификаций -временные ненаследуемые изменения генетического материала, устраняемые затеи в норме системами репарации, или, в отсутствии активных репарационны: ферментов, приводящие к тем или иным изменениям фенотипа щетинок, что 1 наблюдается в случае с линиями тиз;т\л'И/+ и 15;тиз;т\¥11.

Частота возникновения пятен типа т\у Ь при действии этиленимина, диэтилнитрозоамина и теплового шока у разных линий дрозофилы

Анализ частоты появления разных типов морфозных пятен при различно:* анеугенном воздействии позволяет заключить, что действие этиленимина I диэтилнитрозоамина в отношении тех т\уЬ-подобных структур, которьи рассматриваются нами как истинные мутации, у различных мутантных линш

аналогично тому, что наблюдалось при индукции типичных пта'Ь пятен (см. рис. 1,2). Истинные морфозы хорошо индуцируются мутагенами у линии тиз;1туЬ/+, что этражает вмешательство внешних факторов в процессы реализации признака в системах, дефектных по репарации, в критические периоды индивидуального эазвития организма при детерминации клеток.

Анализ показывает, что тепловой шок эффективен у линии 1з;ш\уЬ/+ в мдукции малых морфозных пятен групп А или Б (или А+Б), у линии тш;т\у11/+ в -шдукции или малых или больших пятен тех же групп. Для линии Г5;тш;тшИ/+ тшертермия в отношении образования морфозных клонов оказалась малоэффективной.

Комбинированное воздействие мутагенов и теплового шока статистически шачимо (Р<0,05) только у линии тив;тшЬ/+ при индукции пятен групп А,Б и(или) \+Б по сравнению с обработкой только одним мутагеном. Во всех случаях 1аблюдался достоверный (Р<0,05) прирост соматического мозаицизма, связанный с увеличением дозы применяемых агентов (см. рис.2). Возможно, у этой линии белки •еплового шока, с одной стороны, способствуют фиксации потенциальных ювреждений хромосом, образующихся в результате обработки мутагенами, и, с [ругой, препятствуют работе ферментов репарации.

5. Характеристика линий пш8(2)201 ;ш\уЬ/+, 1(1)18403;тлуЬ/+ и (1)18403;пи1$(2)201С|;птЬ/+ по показателю доминантной летальности

Обобщая полученные данные по анализу спонтанной доминантной :етальности на разных стадиях развития мухи, можно заключить, что продукт гена [Ш8(2)201О1 необходим в эмбриогенезе дрозофилы (на это указывает возрастание на ;анном этапе частоты гибели потомков у мутагенчувствительных линий), видимо, в [роцессе возникновения, становления и фенотипической реализации спонтанной .оминантной летальности активно задействованы механизмы репарации; мутации 1118(2)20101 и 1(1)1з403 имеют частично перекрывающийся генетический контроль, о ем свидетельствует возрастание аналогичного показателя у двойного мутанта на сех стадиях индивидуального развития организма.

Анализ чувствительности мутантных линий к токсическому действию тиленимина и диэтилнитрозоамина проводился -по критерию гибели на стадии ичинки и куколки (рис.3), а также по выживаемости, которую определяли как тношение числа вылетевших особей - имаго к числу яиц. Полученные выводы озволяют констатировать, что этиленимин и диэтилнитрозоамин при всех онцентрациях показали токсический эффект у всех тестерных линий (значительно величена (Р<0,001) гибель потомков на всех стадиях развития) и в итоге уменьшен бщий вылет мух; различие по смертности особей мутантных линий в сравнении с онтрольной линией тшЫ+ при действии химических агентов были минимальны на

стадии куколки и весьма существенны на стадии личинки и вылета имаго, причем, если у линии 1з;т\¥И/+ они касались только этиленимина (Р<0,05 - 0,001), то у мутагенчувствительных линий как мутагена прямого действия (Р<0,001), так и косвенного (Р<0,05 - для тиз;т\уЬ/+ и Р<0,001 - для 15;ти5;т\\'Ь/+) (см. рис.3).

Очевидно, что высокая доза обоих мутагенов является токсичной в момент воздействия для многих структур клетки, значительно снижая или полностью блокируя их функции, что ведет к гибели клеток и, в итоге, целого организма на стадии личинки.

Результаты проведенных исследований показали (см. рис.3), что высокая температура, как самостоятельный фактор анеугенного воздействия, увеличивает гибель насекомых на постэмбриональных стадиях развития у всех линий; при комбинированном воздействии тепловой шок существенно усиливает токсическое действие только этиленимина в концентрациях 1 и 0,5% у линий шшЬ/+ и 1б;пшЬ/+ на стадии личинки; по чувствительности к совместному воздействию мутагенов и гипертермии мутагенчувствительные линии тш;тшЬ/+ и 15;тиз;т\уЬ/+ значительно превосходят контрольную линию т\\'Ь/+, в основном, по показателям личиночной гибели и общей выживаемости.

Усиление температурным шоком токсического эффекта прямого мутагена вполне оправдано, так как высокая температура увеличивает тяжесть внутриклеточных повреждений, индуцированных этиленимином, в основном, за счет увеличения его инактивирующих свойств. Температурное последействие в случае с косвенным мутагеном приходится на тот период, когда еще в клетке нет активных метаболитов, поэтому и его эффект не столь значителен.

Повышенная чувствительность к комбинированному действию мутагенов и гипертермии на разных стадиях у мутагенчувствительных линий по сравнению с контрольной может свидетельствовать о сопряженном нарушении функций репарации ДНК и системы белков теплового шока не только при мутагенезе и морфогенезе, но и в ходе всего онтогенеза.

Индуцированная различным анеугенным воздействием гибель потомков дрозофилы на разных стадиях ее развития

личиночная гибель

/ тиз;тууЬ/+

куколочная гибель

20,00% ■

1 о,ооа/в

тиз;тУ¥й/+

Рис. 3. Условные обозначения: см. рис. 1

Выводы и рекомендации

1. Новые линии Dr. melanogaster - l(l)ts403;mwh, mus(2)201°';mwh и l(l)ts403;mus(2)20IG';mwh являются более чувствительными тестами в индукции соматического мозаицизма по сравнению с традиционно используемыми системами.

2. Продемонстрирована эффективность мутагенов прямого и косвенного действия в индукции малых пятен mwh в тесте на крыловой соматический мозаицизм (SMART) у всех тестерных линий.

3. Наиболее высокий выход маркерных клонов всех типов отмечен у линии, имеющей в своем генотипе температурочувствительную (I(l)ts403) и мутагенчувствительную (mus(2)201Q1) мутации.

4. Выявлено, что эффективность средних и низких доз мутагенов определяется не общим числом больших пятен, а качественной их характеристикой: количеством клеток, участвующих в образовании клона.

5. Дана оценка разных типов морфозов щетинок плоскости крыла с точки зрения проблемы истинных и ложных мутантных пятен mwh.

6. Показано, что только линии, содержащие мутантную аллель mus(2)201GI, нарушающую функции системы эксцизионной репарации ДНК, обладают склонностью к образованию морфозов при различном анеугенном воздействии.

7. Обнаружена генетическая детерминированность спонтанной доминантной летальности у новых тест-систем, более высокий уровень отмечен у мутагенчувствительных линий.

8. Выявлена повышенная чувствительность новых линий дрозофилы к токсическому эффекту этиленимина и диэтилнитрозоамина.

9. Продемонстрирована возможность модификации индуцированных разными химическими агентами событий (соматический мозаицизм, морфозы щетинок крыла, постэмбриональная гибель потомства) кратковременным последействием гипертермии у линий с нарушением адаптивного ответа.

10. Рекомендовано использовать новые тест-системы - l(l)ts403;mwh, mus(2)201G1;mwh и l(l)ts403;mus(2)201G1;mwh для оценки мутагенной, морфогенной активности и токсичности различных экзогенных факторов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1.Сидорская В.А. Сравнительный анализ частоты соматического мозаицизма у мутантных линий Drosophila melanogaster, имеющих в своем генотипе дополнительные маркеры l(l)ts403 и(или) mus(2)201G1 при действии этиленимина /у Генетика. - 1994. - Т.30. - С.144.

2.Сидорская В.А. Возможности дрозофильного практикума курса «Генетика» б моделировании экологических ситуаций // Экологическое образование и воспитание

в Нижегородской области: Сб. науч. трудов. - Нижний Новгород, 1997. - С.44-46.

3.Сидорская В.А. БгозорЫк melanogaster как модельный объект экологической генетики // Экологические исследования и проблемы экологического образования: Сб. науч. статей, Вып. 1. - Арзамас, 1997. - С.56-59.

4.Сидорская В.А., Сидорская Э.А. Экологическая направленность в преподавании специальных дисциплин // Актуальные проблемы химико-педагогического и химического образования в средней и высшей школе: Сб. докл. -Орел, 1997,-С.47-48.

5.Сидорская В.А. Соматический мозаицизм у дрозофилы - как перспективный метод оценки вредных факторов окружающей среды // Вклад ученых и специалистов в национальную экономику: Сб. науч. докл. - Брянск, 1998. - Т.1. -С.119-121.

6.Сидорская В.А. Использование новых тест-систем для решения некоторых вопросов генетики и экологии // Вклад ученых и специалистов в национальную экономику: Сб. науч. докладов. - Брянск, 1998. - Т.1. - С.29-32.

7.Сидорская В.А. Дрозофила как тест-объект характеристики экологического состояния внешней среды // Проблемы экологии и экологического образования: состояние, пути решения: Сб. науч. работ. - Красноярск, 1998. - С.70-71.

8.Сидорская В.А. О применении соматического мозаицизма у дрозофилы как метода для решения некоторых вопросов генетики и экологии // Перспектива: Сб. науч. трудов. - Арзамас, 1999.-С.114-117.

9.Сидорская В.А. Возможности использования новых тест-систем БгозорЬЛа ше1апоца51ег для оценки генетического риска прямых и косвенных мутагенов // Брянщина у истоков лесной науки славянских народов: Материалы международной научной конференции. - Брянск, 2000. - С.121-124.

Ю.Сидорская В.А. Модификация частоты соматического мозаицизма тепловым шоком у новых тест-систем дрозофилы // Брянщина у истоков лесной науки славянских народов: Материалы международной научной конференции. - Брянск, 2000. - С.120-121.

11.Сидорская В.А. Возможности новых тест-систем в генетическом анализе//Материалы конференции молодых ученых АГПИ. - Арзамас, 2000. - С. 104106.