Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ РАННЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И ПОВЫШЕНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ РАННЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И ПОВЫШЕНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ"

ВСЕСОЮЗНЫ И НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ РАННЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И ПОВЫШЕНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.13 — ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ {ФИЗИОЛОГИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

РАДЧЕНКОВ Виктор Петрович

УДК 636.082.455.612.017

Дубровнцы, Московской области, 1684 год.

Работа выполнена в отделе биологии воспроизведения и искусственного осеменения сельскохозяйственных животных Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Соколовская И. И.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Каннский Ю. Д.,

'Кандидат биологических наук Решетникова Н. М.

Ведущее предприятие — Белорусский научно-исследовательский институт животноводства.

Защита диссертации состоится . 1984 г. на засе-

дании специализированного Совета Д-020.16.02 при Всесоюзном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012, Дубровины, Подольского района, Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЖа. Автореферат разослан 1984 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических иаук

И. И. Шиыгнн

I. С1ЩАЯ ХА.РАКТЕИ1СТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. В Продовольствеяной программе -важнейшей части авономичеокой стратегии оартгояа ближайшее десяти» летав поставлена задача увеличения продукции животноводства. Еюго-даря разработке и внедрению искусственного осеменения /В.К.Мыова-яов я др./ генетический потенциал стад достиг выоокого уровне. В решении проблемы реаляаацяи генетических возможностей животных значительное место занимает улучшение воспроизводства и повышения выхода молодняка сельскохозяйственных животных.,Важный вклад в решение »той проблемы внесли советские ученые В.К.Миловаяов, И.И.Соко* ловская, М.М.Завадовскяй. Б.М.ЗавадовокиЗ, О.Д.Кливский, А.А.Паду-чева и диггве. Тем не менее не вое .проблемы решены и в настоящее время наиболее актуальная задача — сокращение сервио-периала я предотвращение пренатаяьных потерь, которые у сельскохозяйственных животных нередко достигав? значительных размеров.

Исследования пооледних лет показали,вакное значение для воспроизводства стад соотояние иммунной оистемы во всех звеньях процесса воспроизведения Д.Ц.Братааов» 1967-1983,-К.И.Соколовская,1938-1983/.

1.3. Цель исследования - разработать л*муяологичеокие методы повышения вффектимости воспроизвсд ства у сельскохозяйственных жи-

В соответствии о этим были доставлены задачи:

X. Шяонить возможность использования Э- и ЭАК-роветкообразова-ния, кая показателей состояния шв^мтой системы у крупного рогатого окота.

2. Изучить проявление иммунных реакций самки на зародыш у животных с разными типами пяацент /коровы и крольчихи/.

3. Определить значение иммунных реакций самки на зародыш для . нормального внутриутробного развитая.

4. Создать модель для изучения действия именных факторов на цреяатальше потери.

5. Разработать на этой основе конкретные метода предотвращения пренатальных потерь у самок с иммуноде^ицитами.

6. Усовершенствовать иммунологаческий метод раннего определения стельности /реакцию ЭСЭ/.__

ВОТНЫХ.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. свльско*оз академии

1.3. Научная яовизна.Епервыв установлено, что угяетеяаз моно-нукдеарной фагоцитирущей системы /ШЮ/ вызывает увеличение прена-тальнн* потерь вследствие не только йпснтанянх абортов, но л ранней /до оладентации/ гибели зародышей. Впервые установлена возможность предотвращения пранатальннх потерь у самок с иммунодефищггами путем обработки их не только лимфоцитами самца-донора семени, но я н©природными полиэлектролятамя, актквируталми все звенья иммуногенеза. Доказана возможность замены в реакции ЭСЭ антигенов эмбрионЬв крупного рогатого сгота антигенами вибрионов овккей /при определении стельности у коров/. Разработан менее трудоемкий» чем ранее известную способ выявления в периферической крови самок цитотоксяческих клеток, способных разрушать ткани »мбрноаов.

1.4. Практическая ценность* Усовершенствованы метода оценки состояния иммунной сяотемы у коров* Доказана возможность предотщ)атония, пренаталхшис штерь т самок о иммунодефицитами. Установлена возможность замени антигенов эмбрионов крупного рогатого окота антигенами эмбрионами свиней в иммунологическом методе раннего определения стельности у коров.

1.5. Апробация работы. Материалы диссертации доложена ва втором Всесоюзном симпозиуме ш иммунологии во о проив ведения /декабрь.1980Г,/, ва научной конференции "Морфологи - здравоохранению и сельскому хоэяйотну" /март 1983 г./, ва совместной конференции Отдела биологии воспроизведения и искусственного оо вменения сельскохозяйственных животных ВНИИ животноводства и ВНПО по племенному делу в животноводстве ЦСХ СССР /кинь 1983 г./, ва совещании специалистов -оовхоза "Путь Ильича" Подольского района, Нооковокой облаоти /август 1983 г./.

По материалам диссертации опубликовано 6 статей и две находятся в печати*

1.6. Объем работы. Диссертация изложена ва 145 страницах машинописного тенота я содержит 19 таблиц. 22 фотографии и 8 графиков. Она состоит из введении» обзора литература, целей и задач исследований, собственных результатов, выводов и практических предложения. Библиография - 216 наименований, на них 153 на иностранных языках.

2.,МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИОСВДОВЙЯИЙ

Лабораторные исследования проведены в лаборатория иммунологии воспроизведения Отдела биологии воспроизведения в искусственного осеменения сельскохозяйственных животных ЗДЖа. Научяо-хозяйствен-нве опыты проведены в совхозе "Путь Ильича* Подольского райояа, Московской облаоти.

Воего в опытах было использовано 359 хоров, два 7-8-ыееячнцг теленка, 4 плода крупного рогатого енота /все животные черно-пвст-рой порода/ и 311 кроликов■калифорнийской породы.

С цель» исключения потери Б^лимфоцитов вон стеклянную посуду, используемую в опытах во определению роэеткообразугезос клеток си-ликоаизировали, Ори взятии кровя от исследуешнс животных в качестве антикоагулянта использовали гепарин из расчета 20-40 ЕД на I мл крови, либо 3,2^-ный раствор лимоннокислого натрия, I часть штра-та на 9 частей крови.

, Выделение мононуилеарных клеток периферической кровя осуществлен на градиенте плотности фиколл-верогра|яна /А.Бейум, 1960/. Суопенэгао лейкоцитов периферической крови шделяли путем гемолиза .. эритроцитов 0,83? раствором хлористого аммония, забуференного трио с рН-7,4*/П.Д.Зуев и др., 1978/. Процент живых клеток в суспензии лейкоцитов определяли в тесте с трипеновой синькой.

Сравнили несколько методов постановки реакции образования лимфоцитами крупного рогатого скота спонтанных розеток с эритроцитами барана /эти розеткообразующие клетки обозначают как Э-РОК или Э-Р08/, предложенных для определения Т-лим$оштов человека /Р.В.Петров и др., 197б;'л«айаХ в* 1972/ И крупного рогатого скота /В.М.Суро-вао, 1978} Сгвм1 «г а1. , 1976/.

При определении абсолютного числа Э-РОК в периферическое крови отельных коров ио пользовали меток спонтанного розеткооб разовая ия, -предложенный степах е^ а1. /1976/ в нашей магпйикащш,

которая.заключалась в прижизненном окрашивании жйкоцитов акриди-новвм- оранжевым.

При определении Э-РОК в периферической крови сукролышх крольчих использовали метод оповтаяного розеткообразовеаия, предложенный Р.В.Петровам я др. /1976/,

Б-лимфошты в периферической крови крупного рогатого скота определяй го споообу /1972/ в нашей модифи-

кации. В отличив от прототипа розетки подсчитывали после приюта*

веяного окрашивания акридиновым оранжевым.

Аутороаеткообразующие клзтки крупного рогатого окота выявляли по Caranx et al. Д979/.

Цитотоксичеокие клетки /ЦТК/, способные раздошать антигены эмбрионов, определяли по методу л.С.Резниковой и И.П.Будаевов /1978/ в нашей модификации, которая заключалась в использован ИИ штигвнов эмбрионов для реакция, а также в изменении способа подсчета клеток.

Активность эритрспоээа определяли путем тдочета ретикулоцитов /АД.Кудрявцев, Л.А.Кудрявцева, 1974/ я аутогемагазинобразугщих клеток /Н.К.Клемпарская, 1969/.

Реакцию ЭСЭ ставала по И.И. Соколовской и В. К. Милован ову /1961/,

Реакцию непрямой нммунофяуореспенции осуществляя в по В.Ф.Кубица /1968/,

Угнетение имцунной сиотемы у самок Ензывали внутривенным введением 4 мх 2,5^-яой суспензии тупш..

Активность первичного иммунного ответа определяли ш J«и» Ногdin ./1963/,

Дяя восстановления угнетенного иммунного ответа на антигены эмбрионов самок о кммуноде^идатами сммуикзироважи лейкоцитами самцов-доноров семени или посторонних самцов, либо обрабатывали неприродными шшилектродитами, любезно предоставленными нашей лаборатории академиком АМН СССР Р.В.Петровым н профессором Р.М.Хактокым.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа состояла из трех этапов: ^ на первом этапе изучали гуморальные и клеточные иммунные реакции У стальных коров н сукроль-ных крольчих о целью определять иммунные реакции самки на зародыш для выяснения возможности создания модели действия состоянии иммунной системы самок на преяаталъяое развитие. Па втором зтапе изучали имеет.ли установленное на первом этапе изменение лимфотоеза пер« вичное происхождение* вызванное беременностью или же оно сопутствует поотулнровааному ранее iUtteon et al* /1930/, Pbl-lip, Ayr and /1982/ пролиферации эритроидвого ростка. На третьем этапе изучали пренатальное развитие у самок о иммунодофицитами и разрабатывали способ предотвращения пренатаяьных потерь 7 таких самок.

оральные иммунные реакции самки на антигены зародыша

Ранее было экспериментально доказано, что нараяних этапах беременности иммунная система самки действительно синтезирует вещества, имеющие рецепторы к антигенам вмбриояов /И.И.Соходовская н др., I97?;Н,М.Решетникова и др., I977i А.В.Бронская и др.,. 1980/.

В данной работе предварительно была изучена связь ранней беременности у крольчих с наличием в jcc сыворотке кропя веществ,имеющих рецепторы » антигенам эмбрионов. О результате судили ю поведению индикаторных частиц, нагруженных антигенами вибрионов в сыворотке крови крольчих /табл.1/,

Таблтв I

Взаиыодейотвяе сыворотки крови с антигенами аллогеяного происхождения в реакции ЭСЭ /44 крольчихи/

Рйпятгя : Иооле- :Ив них окролилооь'в срок: Подтверждение

эся : довело 1-! реакшшЭСЭ по

: самой : Число : % : окролам /%/

Положительная 23 22 96 96

Отрицательная 21 21 0 100

Из таблида I видно, 'гго у заведомо несукрольных самок ни у одной не было обнаружено в периферической крови веществ, имеющих рецептора к антигенам вибрионов. Среди оа вмененных о емок, у которых в сыворотке крови в первой трети сукрольности был обнаружен фактор» давишй положительную реакцию с антигенами эмбрионов, одна не окро-лилась, что шжет быть объяснено ранней преяатальной смертность».

В таблице 2 приведены результаты исследований методом ЭСЭ сиво-роток крови осенеяенных и заведено яеетельных коров,

Иэ таблица 2 видно, что у всех коров, оказавшихся стельными /при ректальном исследовании на 70-90 сутки пооле осеменения/, в период предшествующий формированию плаценты в периферической крови присутствуют вещеотва, имеющие рецептора к штигеяам эмбрионов. Обращает на себя внимание, что 21 корова,положительно реагкдоххцая в реакции ЭСЭ, оказалась не отельной при ректальном исследовании. Эти коровы повторили течку с- запозданием.

Присутствие в периферической крови 2 заведомо не стельных коров веществ, имещих рецептора к антигенам эмбрионов, может быть

Тайлипа 2

Сопоставление данных иммунологячаского и ректального исследований стельности у 222 коров

Ям»« *п :Иссле-;Дали шло- :Стельность: Повторили :Совпале-:довано: кительную:подтвержде-: течку о задние доследование -норов :реакцию ЭСЭ:на ректал^-:поздаииввг^:кых ЭСЭ г I • ■ ¡во « :рвнталь-

• 1__; _:_:ныг жо-

: :число: % :число: % «число: % :

15-18 суток после осеменения 118 87 74 65 55 22 18 74 .

Не осемененные 45-50 суток после „

отела 104 2 2 - - 98

Запоздалое проявление течки - признан потери стельности*

предположительно обълояеао оледстаяв« остатотаух явлений теле отр-ла, так как известно, что титры ведает«, имеющих рецепторы к антигенам эмбрионов.у некоторых коров замедленно снижаются после отела /И.И.Соколовская, В.К.Палованов,1981/.

Ранее установлено, что даже у 60% многократно осемененных хоров при убое в яйцеводах найдены в иго ты / О'ГагвИ , 1983/, а у физиологически адоровых коров оплодотвордамость /определенна« по убойному материалу/ составляет 100&/Т*0*Иингазов, 1976 и мя.др./.

Следовательно, несовпадение данных раннего имцунологического исследования /на 15-18-е сутки после сюемененгя/ и более позднего ректального молсет быть объяснено ранней гибелью зародышей» которая чаще всего происходит в конце первого месяца после осеменения /тишь«, Саэ1йа , 1949/. Боли верно это предположение, то у хоров о более поздними сроками стельности процент совпадений данных ЭСЭ с ректальными исследованиями должен возрасти. Результаты орагяи-тельяого определения совпадений данных ЭСЭ и ректальных исоледова-' ни2 представлены в таблице 3.

Таблипа 3

Сровнен» результатов определения стеаьпостя, подученных методом ЭСЭ в боле» поэдниэ, о роля после осеменения; чем со данным таблици 2, о данными ректальных исследований /на 70-90 • сутки посла осеменения/

в«,.,. :Иссле- :Дали полсшгтель-:Сталькость под-:Совпад ение дан-:довано ;ную реакця» ЭСЭ :твврждена рек- :ннх ЭСЭ и рек-

ЯЙЬ'когов \—-—J^jbt

/суток/ . j чицлн, j % * чиояо : % : "

31-45 133 104 78 103 7? 99

45-60 121 П6 96. 116 96 100

Из таблицы 3 видно, что о увеличением сроков стельности число совпадений данных реакций-ЭСЭ о данндая ректальных исследований возрастает» то есть у норов о нормально развивающимися зародышами .реакция ЭСЭ на второй месяц после ооеменения била почти всегда положительной.

Эти данные наводят на мысль, что эмбриона, доотигший плодного периода развития, обладали высокой степенью иммуногенности,то есть вызывали адекватную реакцию иммунной системы коров. Тогда как зародыши, погибшие в предвлоднай период, обладали слабой пмуиогекно—, стьв или хе у коров были угнетенная иммунная система ж по «тому реакция иммунной оистемы самки иа антигены этих зародышей была слабой. У таких коров на 15-18 сутки после осеменения реакция ЭСЭ бы-г ла положительное, но после гибели зародыша в течение первого месяца после осеменения, вещеотва, реагирующие в реакции ЭСЭ, выводились из организма и в дальнейшем у этих коров реакция ЭСЭ была отрицательной.

Таким образом, реальная польза от раннего иммунологического определения стельности в первые 15-18 суток после ооеменения -выявление, с высокой степенью достоверности /В8%/ коров не станпжх стельными. Положительная реакция у коров после осеменения показывает, что эта пороги стали стельными, во вследствие ранней змб-риональной смертности они могут повторить течку о запозданием. Поэтому за коровами, положительно прореагировавшими в реакции ЭСЭ на 15-18 сутки после ооеменения, необходимо внимательно следить, чтобы н€ пропустить проявления повторной охоты, & также повторно

ах исследовать через 30-40 суток- после осеменения /так как в этот период достоверность определения в реакции ЭСЭ ш стельным коровам 99*/.

Одно аз затруднений, возникающее в применении метода ЭСЭ для определения стельности, — необходимость иметь достаточное число 25-суточннх вибрионов крупного рогатого скота для приготовления эмбрионального экстракта в качестве реагента. Была изучена возможность иопользования вн«зародышевых оболочек, амниотической и аллая-тисной жидкости с целью приготовления антигена для реакции* ЭСЭ. Исследование сывороток крови от 133 хоров показало, что использование экстрактов внезародышевых оболочек,.а также амниотическоЯ и аллантнсной жидкостей онижает точность определения стеяьнооти на статистически достоверную величину а вслэдстше »того перечисленные антигены не могут заменить антигены вибрионов в реахши ЭСЭ.

Была также испытана возможность использования в реакции ЭСЭ при определении стельности у коров антигенов эмбрионов свиней /табл.4/.

Таблица 4

Сравнительное изучение до пользования экстрактов эмбрионов свиней а коров для валнего определения отельнооти в реакции «ЯГ/118 хоров, 31--45сутга1

после оовменения/

Экстракта эмбрионов

Определены как стельные

'.В реакции ЭСЭ :* Ректально :

число : % : число I %

хоров :: * » : хоров ! * •

{Расхождение -¡данных реакции :ЭСЭ а ре к тал ь-:кого определе-

ния

число I %

Коров Свиней

97 92

82 78

97 97

82 82

О

5

100

96

Из таблицы 4 видно, что эмбриональная тканевая специфичность. выше видовой /в данном сопоставлении/, что дает основания для вывода о возможности использования экстракта эмбрионов свиней в реакции ЭСЭ при определении стельности.

Таким образом, исследование сывороток крови коров а крольчих методом ЭСЭ показало, что в период предшествующий гаацентацки а в период плапевтации в периферической крови самок всегда присутствуют вещества, имеющие рецепторы к антигенам эмбрионов.

Вышеприведенные исследования поставили перед нами аадачу опрв-. делить * какому классу веществ /антителам или факторам мой природа/ о тносятся в еще ства, выявляемые в реакции ЭСЭ, чтобы, опираясь ва этж данные, искать возможности влиять на пренагаяадую выживаемость яе вмперичеоким путем, а аа основе знания места я способа регуляции вещеотв, выявляемых в этой реакции» Известно, что некоторые факторе, блокирующие иммунные реакции /к этой группе могут относиться в фактора, выявляемые в сыворотке ярош беременны*/,разрушаются при 56% ' в течение 45 минут, тогда Кая антитела выдерживают такое прогревание /В.И.Пноарев к др., 1930/.'

Тепловая инактивация сывороток крови ваведомо отельных 8 коров в 10 суярольных крольчих не повлияла на результаты реакции 9СЭ. Следовательно, "фактор беременности", выявляемый реакцией ЭСЭ, относится к териостабильным белкам. Исходя из »того, можно предположить, что »тот фактор принадлежит я группе гамма-глобулниов, которые относятся я щгппе териоотабикьяых белков.

В следующем опыте с использованием метода непрямой иммувофяуо-ресценцт определяли принадлежит ли фактор, выявляемый в реакции ЭСЭ, к иммуноглобулинам. Для »того ткани 13-сутсчных эмбрионов кроликов н 25-30-суточных эмбрионов крупного рогатого окота обрабатывали сыворотками крови беременных самок /первой трети сухрольпо-оти или 25-35-суточноЙ стельности/ либо сыворотками крови не бе ременных самок или самцов того же вода для контроля/. Затем, обрабатывали срезы меченой ФИТЦ антисывороткой к глобулинам кроликов йог я глобулинам крупного рогатого окота в зависимости от видовой принадлежности исследуемых животных. Места связывания антигенов с комплементарными антителами должны быть обнаружили по свечению в месте ооединеяия антигена с антителом. Результаты опыта показаны в таблице 5.

Из таблица 5 видно, что вещества периферической крови сукроль-ных крольчих и стельных хоров, дащие положительную реакцию ЭСЭ, положительно же реагируют с тканями аутологичных.к аллвгенных эмбрионов в реакции непрямой тащунофлуоре с пенсии. Следовательно, они представляют собой иммуноглобулины. Отсвда так*о видно, что тканевая специфичность ранних /до плацентацяи/ эмбрионов преобладает над индивидуальной. Это объясняет возможность использования в реакции ЭСЭ суммарного экстракта эмбрионов определенного возраста.

Важный момент в изучении иммунных взаимосвязей в системе "оам-ка-продукт оплодотворения" - определение реагирует ли иммунная

Таблит 5

Действие сыворотки крови крольчих яа тканн эмбрионов того же вида в реакции.непрямой нмыунофлуоресцении в сопоставлении о реакцией ЭСЭ

Сыворотки

:Номера но-: :следовая- ; :ных живот—: :ных /доно-! ;ров сыво- : :роток/ :

Реакция ЭСЭ

тШ« : Реакция лшж--'р-нов

■ :рконов

I

Сукрольных крольчих

Замцов кролик /контроль/

ов

Стельных коров

Нйтельныг , кбров /контроль/

I г

3

4

5

6

7

8

9 10

11

12

13

14

+ + +

Аутологичные Аллогенные

+ +

+ +

оиотема оамки на антигены гиотосовместимости, полученные зародышем от самца—донора осмеян.

Значение »того исследования связано о выяснением возможности усиления или,наоборот, ослабления сенсибилизации к антигенам гн-• отосовместимости самца-донора семени о целью улучшения пренатадь-но! выживаемоети.

С целью »того изучения тимопиты оаыпа-кролика обработали сыворотками оукрольных крольчих, осемененных этим самцом или посторонним оамцом и затем исследовали обработанные клетки методом непрямое иммунофлуоресценцяи. На препаратах тимоцитов, обработанных сывороткой крови самки, осемененной атим самцом было обнаружено сильное свечение при исследования в лшиннсцентном микроскопе.

В то же время ва препаратах твмоцитов того хз самца, обработанных вывороткой крови самки, осемененной другим самцом, проявлялось лишь умеренное свечение. Свечение тканей тимуса в этсм случае неложет быть' связано с антителами и живчикам, так как на Т-лимфоцитах- /которые составляют 96-98^ тимоцитов/ выражены аятггенн гисгосовмеотимо-оти I класса и крайне редко антигены гистооовмеотимости 2 класса /Н.В.Ыедушщин, 1982/, Известно, что на живчиках присутствуют лишь антигены гвотосовместимости 2 класса н отоутстдупт антигевы гтото-совмеотимооти I ляасса/Д.Х.Сзедл и др., 1979/. Таким образом,видовая система самки распознает а специфически реалцует на. антигены гвстосовмествмооти, полученные зародышем от оамца-донора оемевв. . Умеренное овеченне тимоцитов самца, обработанных онворстхой крови крольчихи, осемененной ддугим самцом, объясняется предположительно наличием перекрестных антигенов внутри вида /Д.ЖгСяелл ж др.,1979/.

Обнаружение гуморальных иммунных реакций самки на нятягенн ва-. родина наводст на мысль, что при беременное тку животных должны изменяться и клеточные иммунные реакции и в тарную очередь система Т-димфоцнтов. '

3.2. Изменение клеточных иммунных реакций в ходе беременвооти у животных

. Для идентификации Т-лимфоцитов человека разработан метод епо-танного розеткообразования /Р.В.Петров и'др., 1976; Лоп4*1 »1. , 1972/. Имеются данные, что этим методом можно определить ж Т-лямфо-циты нрупного рогатого скота /В.М.Суровао, 1978/.

В данной работе в предварительных опытах была изучена возможное» выявления атим методом Т-лкыфоцитов крупного роштого охота. Было изучено влияние температуры и времени ивхубащн исследуемых суспензий, способов выделения лейкоцитов, способов подсчета роаетяо-образуодих клеток ва число Э-РОК. Изменение в тих факторов ве привело к полночу выявлению Т-лны$оцитов крупного рогатого .скота методом спонтанного роэеткообразовшия /максимальное, число Э-РСС в тимуое было 60*/. Определение на Б-лвыфопятах рецепторов и »ритроцгтам барана.показало, что лишь незначительное число Б-хлэток имеют такие рецепторы. Следовательно, метод спонтанного розеткообразования у крупного рогатого скота выявляет ве всю популядаю, а лишь какую-то субпопудяцию Т-клеток.

Численность спонтанных, комплементарных и ауторозеткоббразуотих

клеток в периферической крови воров в разные периоды ранней стельности предотавлеао в таблице 6.

Таблида:6

Содержание Э-, ЭАК- в А-розеткообразующих клеток в связи со стельность» у коров /4 коровы/

Срок Г Э-РСК~~ Г ЭАК-РОК i : JÜPÖK ' : стель-

ности ¡Сочтено: Э-РОК »Сочтено: ЭАК-РСИ :Сочтено: А-/оуток/:лимфо- : /%/ угимфо- : /%/ :лимфо- : /\ :цитов : гдатов. г ■ :цитов t

О .839 7,7+0,9* 1200 . 21,0+1,2 1200 0,06+0,08х

15 1200 I4,sil,0* 1200 22,9+1,3 , 1200 0,08+0,08*

25 1200 15,6+1,0 1200 24,(¿1,2 1200 Г,75±0,4Х

45 , 1200 • 14,0+1,0 1200 25,7+1,3 1200 3,16±0,3Х

£0 1200 12,4^0,9 1200 24,7+1,3х 1200 - 4,40+0,6*

х)Р< 0,05 "

Из таблицы 6 видно, что в периферической крови не стелышх коров содержится незначительное число спонтанных розеток /Э-РОК/ и практически отсутствуют аутороветкообраэующие клетки /А-РОК/.Сйнако ухе на 15—е сутки после осеменения в периферическое крови отельных воров число Э-РОК увеличивается вдвое и не снижается до 25 суток стельности, затем наблюдается небольшое снижение. По мере снижения числа Э-РОК после 25 суток-стельности увеличивается число ЭАК-РСК и особенно А-РОК. Несовпадение во времени увеличения в периферической крови числа лимфоцитов, .имеющих рецептор) к эритроцитам барена и лимфоцитов, имеющих реоэпторы к аутологичныч эритроцитам. по-види-ышу,' связано с .различными функциями этих клеток в иммунных реакциях. Установлено, что А-РОК способны неепеци$пчееки подавлять иммунные реакции* Эти клетки возникают на поздних стадиях иммунного ответа /В.П.Леоков, 1980,. По-видимому, напервых этапах иммунных реакций оамки на-эароднш участвуют Э-РОК, а А-РОК возникает позднее.Возможно, что увеличение в периферической крогя А-РСК связано*со снижением в системе "самка-зародыш",активности иммунных реакций отторжения и начало становления иммунной толерантности, что представляет собой один из способов естественной защиты эмбриона от специфических иммунных реакций*самки.

Для о равнения было исследовано ивменегнае численности «шатанных розеток в разные сроки сукрольности у 8 крольчих /гемохориальныи

тки плаценты/. Установлено, что у крольчих увеличивается число Э-РОК в периферической крови в период предшествующий имклштацик и в не-, риод имплантации, как л у коров, во в отличие от них число этих клеток поддершвается на высоком уровне до средины береыенноотн.

3.3. Состояние еритропоэза в хода беременности у животных ,

Существует мнение, что у самок при беременности происходит лишь а «специфическое изменение иммунных реакций и что пролиферация кло-. нов Т- и ^-лимфоцитов при беременности обусловлена влиянием эрктро-идного ростка / гмир, иг «а , 1982/.

С целью выяснения действительной причины изменений иммунных реакций у беременных самок в данной работе были поставлены опыты по определению активности эритропоэза у однородных и многовлодннх животных. Если верно предположение, что изменение иммунных реакций при беременности обусловлено активацией зритроадного роотка, то-ах* тявацая аритропоээа у таких животных должна происходить одновременно иди немного предшествовать активации лимфоидного роотка..

Исследование содержания 8 периферической крови аутогенолизин-образугсщх клеток /АГОй/, ретккулоцитов у сукральных крольчих ж АГОК у отельных коров показало, что активация аритропоээа у этих животных происходит не одновременно. У крольчих число АШГ реэдо увеличивается уже в период предшествующий имплантации /яа стадкж круглой блаотоциоты/, а у коров лишь.на 45-е сутки стельноот* /период разрастания внезарсдышевых оболочек в оба рога матки/.

Таким образом, у стельных коров активация ллмфондяого и »рит-. роидного ростков в ходе стельности не совпадает, а так хаи вовре-мени следствие не может предшествовать причине, то активация лимфоидного роста при беременности имеет иные причина, отличные от неопецифпесхого влияния еритроидногЬ ростка. Усидевге лимфоидного ростка при беременности /особенно в предолацентационнай и плацен-тационкый периоды/, по-видимому, обусловлено проникновением антигенов эмбрионов в кровоток материнского организма.

3.4. Изучение биологического значения яшунных реакций сайка на зародыш для нормального пренатаяьного развития

•Ранее было выдвинуто предположение, что для нормального пренатаяьного развития необходима активация иммунной системы самки /И.И.Соколовская, В.К.Мшгсванов, 1981/.

Практическое значение этого предположения состоит в тем, что. при условии действительной необходимости иммунной реакции самки на эмбрион для нормального внутриутробного развития можно, во-первых, подействовать на активность иыцунной системы с целю улучшения пре-нательной выживаемости, - а во-вторых, создать такие условия содержания и кормления, которые способствовали бы оптимальной регуляоти функций иммунной системы.

Дня'проверки предголожения о значении активаости иммунной системы, самки для эмбриогенеза в данной работе было изучено влияние дозированного, нарочитого угнетения иммунной системы самки на пренаталь-нув выживаемооть.

Установлено, что блокада мононуклеараой фагоцитирующей система /1МС/ инертными чаотицами снижает первичный иммунный ответ /В.А.Козлов и др., 1982/.

В предварительно* оште мы изучили влияние блокады НФС на пер* впчный иммунный ответ у 19 кроликов в вавнэимостн■ от времени.юму-. низации. Установлено, что после введения туши /блокады/ чюло. анти-телообразуюпих клеток в селезенке в течение недели отало меяше на отатисткчеоки достоверную величину, тогда как иммунизация, проведенная за 3-4 часа до блокады, не влияла на активность первичного иммунного ответа.

Нами было тайке установлено /на 15 крольчихах/, что блокада М5С нарушает не только афферентное звено гуморальных иммунных реакций* но и эфферентное эвено клеточных иммунных реакций. Таи, чюло клеток,:' способных разрушать антигены вибрионов* у самок с угнетенной ЛФС было значительно меньше /в период имплантации у контрольных животных - 5,56±0,19£, у опытных в »тот же период 0,95+0,07; Р< 0,01/,

Известно, что угнетение иммунных реакций при блокаде МФС осуществляется путем нарушения кооперации между макрофагами и Т-антиген-распоэ нашими клетками, в результате чего тормозится формирование и действие Т-Т-лгафоцйтов /клетки передающие информацию цредшествен-

винам Т-убиЙц/ ж Т-Б-лимфоцитов /клетки, передающие информацию Б-лимфоцитам/.

Опираясь на данные, показавшие, что блокада МФО вызывает угнетение формирования и гуморальных и клеточных иммунных реакций, мы изучили пренатальную выживаемость у самой о искусственно вызванным иммунодефицитом /табл.7/.

Таблица 7

Прекатальная выживаемость у крольчих при блокаде МФО

Сроки вокры-: ¡Число. ¡Число : Число вибрионов

тЬя самок' : иоР®2®*11а : самок :желтых;- —■ ..

после оовме-: саыок ; •: тел : Всего ¡Из них живых,

нения /суток: : : :

:Чисяог

Без блокиро-7 ваяия МФС

./контроль/ 5 35 34 33

Блокирование

ШЗ 15 , 45 43 32

13 Без блокирования №КГ _

/контроль/ 10 74 71 68

.^кирование ю ^ е? 45

97+5,9 74±6,7

96±2,3 67*5,7

Из таблицы 7 видно, что потери эмбрионов в результате блокирования МФС составили в среднем 2&% при отатиотичеоки шсокодос товарной разнице с контролем. В следующем опыте о результате влияия. иммунодефицита саыок на пренатачьную выживаемость судили ш рождаемости приплода /табл. 8/.

Таблица 8

Действие блокады МФС на число крольчат в гнезде

Группы ¡Осеме- -:0кроявлось или: Аборт и: абортировало :ров|^о Родилось жи- % к

нено ¡самок :вых крольчат { ~ "" - —--_ ^^^ * контролю

: Число : % : ¡Всего: На •

• • : : самку ♦ *

Без блокады /контроль/

Блокирование МФС

10 10

10 10

100 100

О 20

75 47

7,5 4,7

100 63*7,0

Из таблицы 8 шдао, что искусственный иммунодефицит у самок а ранние периода внутриутробного разгития вызывает не только ранят э мбриональную смертность, яо и аборты на поздних стадиях пренаталь- . ного развития.

3.5. Разработка способа предотвращения гфеватальной смертности у самок о имцуноде^яштами

Выше /3.1/ было показано, что именная система самки распознает я специфически реагирует на антигены эародша, котомке он получает от самца-донора семени. № щ>едшложияи, что причина пренатальвой смертности у санок с блокадой МЗС - нарушение а то го процесса. Для выяснения этого вопроса были проведены опыты го нарочитой иммуниза-■ ции беременных самок /с блокадой МФС/ антигенами самцов. Схема иммунизации для йтого опыта была составлена.согласно результатам опыта по влиянию блокады МФС на первичный ищуншй ответ /3.4/.

Результаты добавочной сенсибилизации самок с иммунодеРиштами лейкоцитами самцов-доноров семени представлены в таблице 9.

Таблица 9'

Рождаемость у крольчих, иш^унизирсванных лейкоцитами самцов на фоне блокады МФС

Группы

Число самок

Родилось крольчат

Всего : Из них жившс

* _ - - -|, | - —----

: Всего : На-самку;

% к контролю

Блокада МФС 10 47 47 4,7 63+7,0

Лейкоцита самцов:

доноров семени 10 79" 79 7,9 ■ 100

посторонних 7 35 35 5,0 66+8,0

Без обработки /контроль/ 10 75 . 75 7,5 100

Из таблицы 9 видно, что добавочная сенсибилизация самок лейко-* цитами самцов-доноров оемени полностью сняла действие блокады МФС, в противоположность иммунизация лейкоцитами посторонних савдов не оказала положительного влияния ва пренаталыюе. развитие у самок с иммун ©дефицитами.

Таким образом, в этсы опыте выяснено,' что пренатальную смертность у самок с иммунодафицитами можно предотвратить иммунизацией

а тих самое лейкоцитами самцов-доноров семени.

Но в практике животноводства это сделать ватпгдннтельно,,так как, например, только для обработки 10 свинаиатш, осемененных одним хряком, необходимо взять почти вес кровь от этого самца*.

. В связи с этим были предприняты исследования с целы) изыскать другие способы предотвращения иммунодефицита у самок. Для этого нами бшш избраны препараты наиболее аффективно вамедающие некоторае Функции Т-Т и Т-Б-помотаиков, то есть вещества, способные возместить иммунодефицит* Среди известных препаратов этого рода нашим целям -наиболее соответствовали синтетические псашалектролиты —подлакри-. ловая кислота /ПАК/ и сополимер акриловой кислоты и -и/* -виаилпирро-лиаона /<л/А /,.

После обработки дозировки и рационального срока введения препарата во время беременности были поставлены опыты ю вилянию ПАК и лАна прея&тальаув выживаемость, о которой судили по рождаемости потомства. Результаты ошта< представлены в таблице'10.

Таблица 10

Влияние обработки синтетическими полиэлект ролжтаыи сукрольных крольчих с блокадой МФС на число .крольчат .в .гнезде

Обработки

1Чиоло:Время введе- : Окроли-:Аборти-:Родилось крольчат

самок:нкя препара- :лооь :роваяо :-——-

:тов по отно- : или -;оамоя :чиоло;н* л и

:мвни .блокады гровало ! :МФС /в сутках/о • ■ ♦ * ♦ * Щ *

10 2 и 5 100 0 70

9 5 100 0 64

10 100 0 73

на

оа*иу:яоят-• 1РОП»

Тушь и ПАК

Тушь и иА/А

Контроль без обработок

7.0 9вх

7.1 97х

7,3 100^

х)

Р*- 0,05

Из таблицы 10 видно, что ПАК я. Л^А успешно компенсирует угнетение иммунной системы, предотвращая вызванную блокадой МФС эмбриональную смертность.

Таким образом, выяснено, что синтетические пояяелехтроляты могут быть применены для улучшения амбрион&льноЗ выживаемоете'у вамок с кимуноде фи штамп столь же аффективно, как и лейкоциты самцр»-дояоров.семени.

Этидавныа открывают перспективу разработки методов улучшения воспроизводства у самок сельскохозяйственны* животных о вроэденны-ми или ''приобретенными иммунодефицитами.

ВЫВОДЫ

1. Методы спонтанного в ауторозетвообраэовадия выявляют две субпопуляции Т-лиыфоцитов крупного рогатого слота, а меток комплементарного роаетнообразоваяия - всю популяцию Б-опшАоцитоэ,

2. Выраженность клеточных н гуморальных иммунных реакций закономерно изменяется у самок как с'гемохориальной, так и синдесыохо-риальной типами. плаценты, а период ее формирования.

3. Иммунный ответ организма самки на антигены раннего эмбриона -необходимое звено нормального эмбриогенеза.

4. Создание искусственного иммунодефицита у беременных самок * путем угнетения мононукдеарной $агооттиругщей системы - доступная рациональная иммунологическая модель для разработки методов предотвращения пренаталышх потерь у самок с иммунодефицитами.

,5. Прекатальные потери у самок.о иммунодефицитами можно предотвратить добавочной сенсибилизацией их лимфоцитами самца-донора семени либо синтетическими адъввантами /ПАК, «VA /, активирующими все этапы иммуногенеза.

5. Для раннего иммунологического определении, стельности реакцией ЭСЭ экстракт вибрионов крупного рогатого' скота может, быть заменен экстрактом ембрионов свиней, что практически более доступно.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Ейедрять в практику изучения состояния шмуной система к^уп-HoroÉ рогатого скота в разных целях-, _в тем числе и при стельности, модифицированные в данной работе методы спонтанного, комплементарного и ауторозеткообраз ования•

2. Внедрить в практику научных исследований, разработанную в данной.работе модель для выявления факторов*- изменяющих - активность иммунной системы и таким путем способных:предотвращать оренагаяьные потери у самок с имчунедефищтами.

3. Для раннего определения стельности в реакции.пасснной гемаг-глвтинапии /ЭСЭ/ использовать экстракты эмбрионов свиней вместо «кс трактов эмбрионов крупного рогатого окота.

Саясок работ, опубликованных ю теме диссертация*

1. Радченков В.П., Соколовская U.M. Характеристика беременности методом бляшек. - Тезисы докл. Второго Всесовз.спма* по иммунологии воспроизведения. II., I960, 0.179.

2. Вронская A.B., Соколовская И.И., Горбунова Р .И. .Радченков В.П. Изменение реакции лимфоцитов на ксеногеннне еритроштн в ходе беременности. - Тезисы докл. Второго Всесокэ. симп. по иммунология воспроизведения, М., I960, с.185.

3. Соколовекая И.И., Бронсяая A.B., Радченков В.П. Эмбриональная выживаемость в связи с изменением иммунных реакций, - Доклады ВАСХНИЛ, 1983, » 4, 0.29-31.

4. Радченков В.П., Соколовская И.И. Роэеткообрвзущяе лтайопи-ты крупного рогатого скота и рациональные методу их выявления. Сельскохозяйственная биология, 1983, Л 12, о.87-91.

5. Solcoloyatey» 1.Х.» Bronakaya A.V. Oyradia-В.Л., НогЬоаога B.I., Oehadcbulc V.S. , Tour* U.B., Radchenkor Т.Р., Meluhina Ь.Т. Inotua* Reaction during Pregnancy. - dol., 1лвжшао1. re prod., 1961* . №. tt p. 23-32*

6. SefcolOTekaya I., Badchenlcoy V., Broimkaya A., Qyvadia В., AbllOT A.I ¡Гае Т., SölovyoT« Я., Subbotin A*» Oehadcbuk T. The eigeifie«w«of female,* а Insune reaotiona on foetue at pregnanoy, I. The prenatal llrabillty at experimental blokadlng of pregnant i«Mli,*l iiarriir» eyeten. 7 J. fieprod* lmnnn. ( Tbee. 2 inter. «ans. reprod. Immunol., Kyoto» 1963)» vol. auppl., p. 72»

7. BadchenkoT Т., SokoloTakara l.» Bronakaya A. th* slgnlficaa-ее offemale^alsmiune reaction« on foetus at pregnancy. II. The yre* natal liTiability at the females treatment with salens lumunogens

In ocmtiin&tlon with - UPS blokLng. - J. Beprod. Twin, (Thea. 2 inter^ cone, reprod, imrainol., Kyoto, ХЭ83)» 1983» toI. suppl., p, 73,

в. Bronakaya 1., Sokolovakaya I., Radchenkor У. The elgnlfionice of female*в Imrwmw reactions on normal or diaturbed pregnanoy. J.. Beprod. Ttmwtn. (Thea. 2 inter, coag. re prod. Imninol., Xyeto, 1983)» 1983, toI. auppl., p. 73,

Д-68473. Подписано в печать 15.'02.84 г. Формат бумаги 60x84/16. Объем 1.25 п.д. Тираж 100 экз. Зак. 646. Ротапринт._

~ ТШ01рафия НИШШ1, г.Щербинка