Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунорегуляция эмбрионального развития. Экспериментальное моделирование

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунорегуляция эмбрионального развития. Экспериментальное моделирование"

РОС С ИИС К\Я АКАЛГМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ЖТРОССИИСКИИ— НАУЧНО-ИССЛЬ'ЮВАТЬ'Н>СКИИ ИПСТИТУ1 ЖИПОТНОВОЛСТИА

РАЛЧЕНКОВ Виктор Петрович

ИММУНОРЕГУЛЯЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ.

03 00.13. - физиология человек;! п ливопшх 14.00.3t). - аллергология и имм\ чология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание >ченой степени локтора биологических

п. ДУБРОВ1ШЫ, МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ - 1993 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследопателк-ком институте животноводства РАСХН.

Официальные оппоненты :

доктор биологических наук, профессор Ю.Д. Клинскии доктор медицинских наук, профессор М.А. Туманян доктор ветеринарных наук, профессор М.А. Лучко

Ведущее предприятие: Вссроссйский научно-исследовательский институт

племенного дел;

Автореферат разослан " ¿3 " 0Н/ГГ1\)С(/И# 1993 г.

"Л1"

гъ - утс/},^

Зашита диссертации состоится -и - утмр* 1993 г.

в 10 часов, на заседании специализированного совета во Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства

(ВИЖ).

Адрес: 142012. Московская обл.. Подольский район, п. Дубровицы. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь совета, к.б.н.

И.И. Шмыгин

ОПШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

-------------Актуальность-------проблемы.— В- нарушении___репродуктивной___функции

> млекопитающих. по-прежнему, ведущее место занимают пренатальные потери. Многочисленными исследованиями установлено, что у разных видов. имеющих существенную разницу в строении плаценты и сроках переменности, величина пренатальной выживаемости (60-70%) и критические периоды эмбрионального развития сходны (Соколовская И.И., Миловании В.К., 1481; Roche J.F.. 1986; Lambert E.M. «t. al., 1990.) Несмотря на длительный период изучении причин, вызывающих снижение пренатальной выживаемости и разработки способов ее повышения, решение данной проблемы еще далеко до полного завершения.

В последнее время значительный интерес был проявлен к изучению возможной роли материнской иммунной системы в нормальном и нарушенном пренатальном развитии В первую очередь это было обусловлено обнаружение факта распознавания (независимо от типа плаценты) материнской иммунной системой антигенов зародыша отцовского гаплотипа. В настоящее время существует большое число иммунотроп-ных препаратов, способных осуществлять коррекцию иммунитета посредством изменения активности определенных звеньев иммунного ответа, что открывает новые перспективы хак в изучении роля иммунной системы cavK и в нормальном и нарушенном пренатальном развитии, гак и в разработке иммунологических способов повышения эмбриональной выживаемости. Другим важным аспектом в изучении роля иммунной системы самки в нарушении пренатального развития является выяснение возможного взаимоотношения вторичных иммунодефицитов и штаммов синегнойной палочки, контаминируюших семя производителем, в возникновении этой формы патологии. Решение данной проблемы имеет важное значение как для разработки научно-обоснованных норм ветеринарно-санитарного качества семени производителей, так н для разработки способов профилактики и лечения некоторых форм патологии репродуктивной функции у животных.

В настоящее врема при изучении иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш" наибольшее распространение получили исследования на экспериментальных моделях (Chaouat G et. al., 1988, 1992; Clark D.A. et. al., 1989, 1992; Banwatt D. et. al., 1992). Возможность проведения этих исследований с использованием экспериментальных моделей на лабораторных животных обусловлена тем, что многократно эыло показано существование сходных иммунных взаимоотношений в :истеме "самка-зародыш" у животных независимо ни от строения пла-

центы, ни от сроков беременности.

Цель работы - определение взаимосвязи между активностью иммунной системы самки и нормальным прснатальным развитием, выяснение возможности коррекции эмбриональной выживаемости посредством изменения иммунологической реактивности материнского организма, а также изучение возможной взаимосвязи вторичных иммунодефицитов и синегнойной палочки в возникновении пренатальных потерь.

Задачи исследований: 1. Определить влияние на эмбриональное развитие экспериментального угнетения иммунной системы у самок как с аллогенной. так и сингенной беременностью. 2. Исследовать роль иммунных реакций самки в снижении эмбриональной выживаемости, обусловленной действием глюкокортикостероидов. 3. Разработать специфические (посредством иммунизации) способы предотвращения пренатальных потерь у самок (как аллогенно, так и сингенно спаренных) со вторичными иммунодефицитами. 4. Определить возможность использования иммуномодуляторов лля коррекции эмбриональных потерь у самок с угнетенной иммунной системой. 5. Выяснить индукторы становления им-мунотрофической функции материнской иммунной системы как при аллогенной, так и сингенной беременности. 6. Изучить биологические показатели, степень вирулентности и синтез факторов патогенности, а также устойчивость к антимикробным препаратам штаммов синегнойной палочки, контаминируюших сперму быков-производителей. 7. С использованием экспериментальных моделей выяснить возможную взаимосвязь угнетения иммунной системы у самок и синегнойной палочкой в снижении пренатальной выживаемости. 8. Исследовать влияние на биологические показатели сперматозоидов (как in vitro, так и in vivo) естественной и искусственной контаминации спермы быков-производителей штаммами Ps.aeruginosa с различной степенью вирулентности.

Научная новизна. Впервые на экспеиментальных моделях установлено, что угнетение активности иммунной системы как у аллогенно-, так и сингенноспаренных самок вызывает снижение эмбриональной выживаемости. В условиях аллогенной беременности это снижение происходит в начальный период плацентации, а при сингенной беременности пренатальные потери происходят. в предплацентационный период. С использованием дополнительной специфической сенсибилизации выяснено, что данное снижение эмбриональной выживаемости обусловлено нарушением иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш".

Впервые выяснено, что первичными индукторами становления иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш" являются при аллогенной беременности - антигены плазмы семени и живчиков, а при

сингенной - антигены живчиков.

Впервые показано, что обработка беременных (как еннгенно, так и аллшемно) самок_синтетическими— иммуномодуляторами, способными отменять феномен иммунологической толерантности (индуцированный акти-вапиеи неспецифических клсток-супрессоров, с которыми нередко связывают нормальное пренатальное развитие) не только не увеличивает величину пренлтальных потерь, но предотвращает их у самок с угнетенной иммунной системой. Таким образом, установлено новое научное направлен ис п разработке способов повышения пренатальной выживаемости у самок - посредством обработки их синтетическими иммуномодуляторами.

На основе этих впервые установленных фактов, сформулировано новое теоретическое положение о том, что хтя нормального пре-натального развития необходим иммунный ответ самки на антигены ранних эмбрионов.

Впервые показано, что ни искусственная, ни естественная контаминация спермы быков-производителей штаммами синегнойной палочки, обладающими высокой степенью вирулентности, а также синтезирующими различные факторы патогенности, не оказывает отрицательного влияния на выживаемость сперматозоидов in vitro.

Впервые установлено отсутствие взаимосвязи в возникновении пренатальных потерь между вторичными иммунодефицитами и штаммами синегнойной палочки (независимо от степени вирулентности и синтеза фактороз патогенности), контаминируюшими семя производителей. На основе этих исследований сформулировано новое теоретическое положение :> существовании у сперматозоидов и тканей половых путей коров и гелок тканевоспецифического конституционального иммунитета по отношение к штаммам синегнойной палочки.

Практическая ценность работы. Разработаны экспериментальные мо-!ели угнетения и восстановления пренатальной выживаемости посредством изменения активности иммунной системы самок (как при аллогенном, ак и сингенном спаривании). Данные модели могут быть использованы фи дальнейшем изучении как иммунных факторов, участвующих в юрмальиом пренатальном развитии, так и при определении возможного заимодействия иммунодефицитов и микроорганизмов в нарушении эмб-:ионального развития. Экспериментально обосновано использование как пецифической сенсибилизации (иммунизация лейкоцитами, либо плазмой пермы или сперматозоидами самцов доноров спермы), так и . синтети-еских иммуномодуляторов для предотвращения пренатальных потерь у гмок со сниженной активностью иммунной системы. Показано, что

при разработке системы мероприятий по профилактике нарушений репродуктивной функции необходимо учитывать, что факторы, вызывающие снижение резистентности увеличивают пренатальные потери, вследствни нарушения иммунотрофического действия организма самки на зародыш.

Внедрение в практику. Обнаруженное нами отсутствие отрицательного влияния на воспроизводительную функцию у животных (даже с пониженной резистентностью) контаминации спермы быков-производителей штаммами синегнойной палочки (независимо от степени их вирулентности) было использовано при изменении ветеринарно-саннтарной оценки качества спермы быков-производителей в изменении N I ГОСТ 26 030-83 "Сперма быков замороженная. Технические условия", а также в "Ветеринарно-санитарных правилах для племпредприятий (станций) и пунктов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных" утвержденных ГУВ МСХ СССР от 29.12.90 года. Практическое использование на ряде племпредприятий в течение 5 лет новой оценки ветеринарно-санитарного качества спермы быков-производителей с одной стороны подтвердило правильность теоретических положений, выдвинутых в диссертационной работе, с другой стороны увеличило выход спермы ценных в племенном отношении быков-улучшателей.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

В условиях внутривидовой беременности распознавания материнской иммунной системой антигенов зародыша отцовского гаплотипа приводит не к формированию реакций отторжения, а к становлению по отношению к зародышу иммунотрофической функции. Иммунотрофическое взаимодействие в системе "самка-зародыш" является необходимым звеном нормальною пренатального развития.

Существует несколько групп антигенов, осуществляющих индукцию иммунотрофической функции иммунной системы самки. При сингенноя беременности (не являющейся, согласно наиболее распространенной точке зрения, исключением из зтей закономерности) к ним относятся ткане-воспецнфические антигены живчиков, не имеющие общих детерминант с антигенами лейкоцитов. Индукторами становления иммунотрофического взаимодействия в системе "самка-зародыш" при аллогенной беременности, помимо тканевоспехшфических антигенов живчиков, являются и антигены гистосовместимости, экспрессирующиеся как на зародышах, так и на лейкоцитах и в семени.

Критическим периодом становления иммунотрофической функции при нормальной беременности являются первые сутки после оплодотворения. Угнетение активности иммунной системы у самок в этот пе-

риод припо.цп к резкому снижению эмбриональной выживаемости в прсдплаценташюнный и плацентационныйг периоды.

Предупреждение снижения пренатальной выживаемости у самок с ичч \ нодефииитами. вызванными зндо- или экзогенными причинами достигается либо дополнительной сенсибилизацией самок антигенами, имеющими детерминанты с антигенами зародышей, либо обрЛЧ>откой иммуномодуляторами.

Непосредственной причиной увеличения пренатальных потерь у самок со вторичными иммунодефицитами, обусловленными неблагоприятными факторами внешней среды, является не контаминация семени производителей штаммами синегноиной палочки, а нарушение иммунот-рофического взаимодействия в системе "самка-зародыш".

Отсутствие отрицательного влияния естественной контаминации в семени быков-производителей штаммами синегнойной палочки (не зависимо ни от степени их вирулентности, ни от синтеза факторов патоген ности) на процесс воспроизводства у крупного рогатого скота обусловлено существованием у живчиков и в тканях половых путей коров и телок ткаиевоспецифического конституционального иммунитета по отношению к этому микроорганизму.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 2 (Киото, 1953), 3 (Торонто, 1986), 4 (Киль,

1989), 5 (Рим. 1992) Международных конгрессах по иммунологии репродукции, на 6, 7 Международных симпозиумах по иммунологии репродукции (Варна, 1985, 1988), на 1 Международном форуме по иммунологии воспроизведения (Магдебург, 1990), на 1 Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989), на 2, 3 и 4 Всесоюзных симпозиумах по иммунологам воспроизведения (Москва, 1979, Киев. 1987,

1990), на научной конференции "Морфологи - здравоохранению и медицине" (Москва, 1983), доложены на заседании секции общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов имени И.И. Мечникова (Москва, 1990), на заседании рабочей комиссии ОНК ВЕТ ВАСХНИЛ "Патология размножения, профилактика болезней молочной железы и новорожденных животных" (Москва, 1989), а также представлены в комиссию (созданную приказом ГУВ МСХ СССР N 81 от 29.08.90г.) по разработке нового проекта петеринарно-санитарных правил для плем-предприятий.

По материалам диссертации опубликозано 44 работы, из них 28 с отечественной и 16 в зарубежной печати.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, пяти глав обзора литературы, пяти глав собственных исследований, вы-

водов, практических предложений и списка литературы. Диссертация изложена на 353 страницах машинописного текста и иллкктрирована 31 таблицей. ¿3 графиками и 8 фотографиями. Библиография включает 474 источника. ' из них 46 публикаций отечественных и 428 публикаций зарубежных авторов.

Материалы и методы исследований.

За период с 1980 по 1993 года в экспериментальной работе было использовано 1200 мышей СБА весом 18-20 грамм, 964 кролика калифорнийской породы. 219 быков-производителей (принадлежавших ЦСИО с-х животных. Красноярскому и Дмитровскому племпредприятиям и около 2 млн. коров и телок (в зоне деятельности ЦСПО с-х животных).

В качестве экспериментального вторичного угнетения иммунной системы у спаренных крольчих использовали - блокаду СМФ. конкуренцию антигенов и обработку синтетическим глюкокортикостероидом-преднизолоном.

Блокаду СМФ осуществляли в/в введением суспензии карбоно-вых частиц (доза на одно введение 4 мл 2,5% суспензии) на вторые сутки после осеменения. Конкуренцию антигенов индуцировали посредством в/в иммунизации эритроцитами барана (в дозе 5 мл 50% суспензии) на вторые сутки сукрольности. Обработку преднизоло-ном осуществляли в/м однократно либо на 2-ые, либо на 7-ые сутки посте спаривания. Доза преднизолона на одно введение составила 2 мг/кг массы тела.

Дополнительную сенсибилизацию крольчих к антигенам зародышей проводили за 1 - 2 часа до экспериментального угнетения иммунной системы путем в\в иммунизации лейкоцитами (5 х 10 клеток в 2 мл 0,9% раствора хлористого натрия), либо живчиками (2 х 10 клеток) или плазмой семени (10 мг/кг массы тела).

Обработку иммуномодуляторами самок осуществляли через 1-2 часа после экспериментального угнетения иммунной системы. В качестве иммуномодуляторов использовали - полиакриловую кислоту (ПАК), сополимер акриловой кислоты и Ы-винилпирролидона (ЫА) (любезно предоставленные академиком РАН Р.В.Петровым и профессором Р.М.Хаитовым) и левамизол в дозах на кг массы тела соответственно 10 мг, 15 мг и 50 мг.

Для экспериментального угнетения иммунитета у самок СВА использовали активацию неспецифических клеток-супрессоров путем создания феномена конкуренции антигенов. Этот феномен индуцировали

Схема I.

I

Схема модельных экспериментов но и.п чению роли иммунной системы |

олно-, либо трехкратно»« в/в иммунизацией эритроцитами барана в оптимальной иммуномодулируюшей дозе.

В работе использовали методы: I) клеточной имунолопши - локальный гемолиз в геле атарозы. Кон-А индуцированную бласттрансфор-мацию лимфоцитов, спонтанное розеткообразованис и реакцию торможение миграции макрофагов: 2) нммунохимическис методы - им-муноблот. твердофазный иммуноферментный анализ (тест-систему для количественного определения кроличьего фибронектина готовили по Ермолину Г.А. с соавт.. 1986). ионообменную и аффинную хромотог-рафии: 3) микробиологические методы (в работе использовали 314 идоле т о в с и н е г н о й н о й палочки. выделенных из семени быков-производителей) - среды: N 28. Кинг А и Кинг В и среда с ЦПХ. цитохромоксидазный тест, серотипирование. определяли - вирулентность в ЛД5о- протеазную и эластазную активности, а также образование экзотоксина-А. При изучении влияния на результативность осеменения самок семенем ,с искусственной контаминацией высоковирулентным штаммов синегнойной палочки использовали эталонный экзоток-син-А образующий штамм РА-103, полученный из Г11СК имени Тарасевича МЗ РФ.

Результаты исследований.

Модели с алогенным спариванием. Влияние блокады СМФ на пренатальную выживаемость. В 80-ые годы наибольшее распространение получила "иммуносупрессивная" теория пренатального развития (Faulk W.P.. 1983. 1989; Pierre В.. Chaouat G.. 1988), согласно которой необходимым звеном нормального пренатального развития является угнетение иммунных реакций материнского организма на антигены зародыша отцовского гаплотипа.

Для проверки этой теории, а также для определения возможности использования в целях предупреждения эмбриональных потерь экспериментального изменения активности иммунной системы у самок была использована' разработанная ранее модель угнетения иммунитета посредством блокады СМФ карбоновыми частицами. Известно, что введение животным этих частиц нарушает функции антигенпредставляющих клеток, следствием чего является резкое угнетение первичного иммунного ответа (Козлов В.А. и др., 1982; Василев Ч.Л., 1986).

На первом этапе этих исследований было изучено влияние на эмбриональную выживаемость обработки самок (на 2-ые сутки после спаривания) карбоновыми частицами в дозах: 12,5 мг, 50 мг и 100 мг. Было обнаружено, что инъекции самкам этих частиц в дозах 12,5

мг и 50 мг практически не повлияли на прсиатальную выживаемость, определенную____по числу . нормальных__и дегенирированных зародышей^ после убоя самок на 13-ые сутки сукрольности. В тоже время вопреки иммносупроссивной теории обработка этими частицами в дозе 100 мг не только не уменьшила пренатальные потери, но даже увеличила их на статистически высокодостоверную величину (Р<0,001).

В следующем эксперименте определяли зависимость между первичным иммунным ответом и временем обработок самок суспензией карбоновых частиц в дозе 100 мг. Было установлено, что число АОК/Ю7 спленоцитов составило у самок контрольной группы 686 ± 83, при иммунизации за несколько часов до блокады СМФ 586 ± 104 и через 24, 72 и 144 часа соответственно 163 ± 45 (Р<0,01); 310 ± 82 (Р<0,05) и 430 ± 143. Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что лишь в течении первых 3-х суток посте введения карбоновых частиц (в дозе 100 мг) происходит резкое подавление первичного иммунного ответа.

В связи с этим на следующем этапе исследований, для определения времени критического периода становления иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш" крольчих на разных этапах эмбрионального развития обрабатывали суспензией карбоновых частиц. Было выяснено, что только инъекции этих частиц на 2-ые, но не на 4-ые или 7-ые сутки после спаривания вызывают увеличение пре-натальных потерь на статистически высокодостоверную величину (Р<0,001). Следовательно, критическим периодом становления необходимых для нормального эмбрионального развития иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш" являются первые сутки после спаривания.

Известно, что снижение пренатальной выживаемости в естественных условиях нередко происходит в предплацентационный, плацентацион-ный и постплацентационный периоды. Так как в предыдущих экспериментах пренатальные потери определяли лишь на 13-ые сутки сукрольности, хотя блокаду СМФ осуществляли на 2-ые сутки после спаривания, то в следующем опыте внутриутробную выживаемость определяли на разных этапах пренаталъного развития. Результаты этого эксперимента указаны в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, обработка карбоновыми частицами самок на 2-ые сутки после спаривания не вызвала гибели зародышей в доим плантационный период. В тоже время у таких самок снижение пренатальной выживаемости произошло в начальный период имплантации. К периоду завершения формирования плаценты, а также в постплацентационный период дальнейшего увелечения

преяаталькых потерь не произошло.

Таблица 1.

Пренатадъная выживаемость на разных этапах развития зародыша у самок с блокадой СМФ.

Время определения прс- Обработки Число Число жел- Число зародышей или детенышей Пренатальная

натальной выживаемости самок тых тел Всего Из них нормальных выживаемость %

сутки 3 физ. раствор 4 30 30 30 100.0

карб. част. 5 32 32 32 100.0

п физ. раствор 7 50 50 50 100.0

карб. част. 6 44 43 28 65.1 ±7.3*)

13 физ. раствор 24 178 174 96.5 * 1.4

хаоб. част. 26 174 \2.1 70.0± 3.6

По дауным окрола физ. раствор каоб. част. 36 35 267 187 100.0 71.6±2.1

* - прекатальную выживаемость определяли по отношению к контролю: - Р<0.001

Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что блокада СМФ у самок на ранних этапах беременности вызывает резкое снижение эмбриональной выживаемости. В тоже время не исключено, что в этих экспериментах увеличение пренатальных потерь произошло не в следствии снижения иммунологической реактивности организма самки, а в результате нарушения каких-либо иных важных для нормального эмбриогенеза физиологических процессов. В связи с этим для проверки данного предположения, а также для выяснения первичных индукторов становления иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш" была использована дополнительная сенсибилизация (к антигенным зародышей) самок с блокадой СМФ..

Пренатальная выживаемость у самок с блокадой СМФ дополнительно сенсибилизированных антигенами, имеющими общие . детерминанты с антигенами зародышей. Возможность использования данной .сенсибилизации для этих целей обусловлено тем, что согласно результатам, представленным выше, при иммунизации животных до; обработки инертными частицам» первичный иммунный ответ не • меняется. В таком случае, если преватальные потери у самок с блокадой . СМФ обусловлены непосредственно нарушением распознавания материнской иммунной системой антиганов зародыша отцовского гаплотипа, то восстановление этого процесса распознованвя посредством дополнительной (до

0(1|К1

Премиальная им-^иваеыоси. у •..инигеиами еамцоп и .п..;

Число ¡час'

Лнтиген;!:.ч1 ¡Карбонпвымн ¡частицами

Лейкоциты СЯМ1ЧТ, доноров спермы

Лейкоциты ропних сал;и;"

Плазма спермк I ! ' цов донороп сперм:,

Плазма спермы «о,-торонних са::п;)3

Живчики самчоз доноров СПС!''"

ЖИВЧИКИ ГССТарС'!-них самцог

Экстракт эмбрионов

+ +

+ +

самок ¡ими I

6/ ¡0* |

6 '' ¡0 |

I

6 1(1 I 1

& ? ! 5

I I

5 I'

4 ' П !

4 ¡ч|

5 ' '

5 К'! 5 ■ !'.)!

- в числите лг |>!1,;ло самок, в ;«»а%:енл.

*) - Р < (1.001 ' * - [' - и."

киишм '2

¡ы.:шпелы10 cc ис поп. i и ыроваиж.'ч шрплнов) .41 олокады СМФ.

Живых i mw:\.'3

.4:41 ТЬЧ.1 :

_.ЭмЙр_1ЮНОН

100.(1

Bit 'м III.

С.! M К '

65.1 ± 4.3 ' : I"

100.(1

62.2 ± 7.3

100.0

I 7 •,

66.7 ± 7.5 i ; :

100.0 100.0

100.0

100.0 ()7.2 ± 2.2

ь,

i..

7 4 I

I

'г. '.ОН I PO I О НИМ J

6(1.2 ± 3*'

¡

i

10; и; i

i i

(:7.(l ± 3.7*}

I

78.6 ± O.'i.'ii

70 -1 i i *)

... .. J

I0;i ! 4S.6 i 07)!,'

101' !>

!0ü.o 100.0

окролтиичея самок

обработки карбоиовыми частицами) специфической сенсибилизации самок, должно предупредить эмбриональные потери. Ранее было показано, что антигены лейкоцитов, живчиков и собственно плазмы семени имеют общие детерминанты. В наших исследованиях с использованием иммуноблота у кроликов также была установлена общность детерминант между антигенами зародышей, плазмы семени и живчиков. В связи с этим в следующем эксперименте дополнительную сенсибилизацию (за 1 - 2 часа до блокады СМФ) осуществляли лейкоцитами, либо плазмой семени или живчиками как самцов доноров-семени, так и посторонних самцов. Результаты эксперимента представленыы в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, пренаталь-ная выживаемость полностью восстановилась до уровня контроля у самок с блокадой СМФ дополнительно просенсибилизированиых антигенами самцов доноров-семени (лейкоцитами, живчиками и ::лазмой семени) и экстрактом эмбрионов. В отличие от дополнительной сенсибилизации антигенами самцов доноров-се;;ени иммунизация самок с блокадой СМФ антигенами посторонних самцов дала неоднозначные результаты. Так, дополнительная сенсибилизация лейкоцитами как и плазмой семени в этом случае не оказала положительного влияния на пренатальную выживаемость у самок, обработанных суспензией карбоновых частиц. Напротив, иммунизация живчиками посторонних самцов (также как и самцов доноров-семени) полностью восстановила до уровня контроля эмбриональную выживаемость. Это несовпадение эмбриопротективного действия иммунизации лейкоцитами или плазмой семени с одной стороны и иммунизации живчиками с другой может быть обусловлено существованием у них различных антигенов, имеющих общие детерминанты с антигенами эмбрионов. По-видимому, на живчиках в отличие от лейкоцитов и плазмы семени представлены антигены (имеющие общие эпитопы с антигенами эмбрионов) с невысокой степенью полиморфизма.

Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что специфическая дополнительная сенсибилизация самок (со вторичным иммунодефицитом) антигенами отцовского гаплотипа оказывает положительное влияние на пренатальное развитие. При естественном спаривании непосредственным фактором, индуцирующим этот процесс " сенсибилизации, по-видимому, является антигены плазмы семени и живчиков. Вместе с тем положительный эффект сенсибилизации этими антигенами обусловлен либо феноменом "усиления" (активацией спецефических и неспецифических Т-супрессоров), либо функциональной активностью других звеньев иммунного ответа. Участие в этом процессе блокирующих антител маловероятно, так как со времени иммунизации до критического периода

. (времени гибели эмбрионов > самок с блокадой СМФ) проходит всего лишь 4-5 суток.

Пренатпльная выживаемость- "~у~~слмокТ "Обработанных "иямуи'омолуля-" торами на фоне блокады СМФ. Извести;-', что многие нммуномодуля-торы посредством стимуляции иммунологической активности макрофагов способны усиливать иммунореактивность организма В частности,,, этими свойствами обладают ПАК, НА, левамнзол (Асквит П, 1983; Петров Р.В. н др.. 1983). В тоже время эти иммуномодуляторы обладают способностью отменять феномен 'чеиления". иммунологическую толерантность, опосредованную активацией Т-клеточного супрессорного звена (Петров Г.В. и др.. ¿933; Тада Т., !055).

I» связи с этим для дальнейшей экспериментальной проверки иммуносупрессивной теории, а также для выяснения возможности использования иммуномодуляторов для предупреждения пренатальных потерь у самок с иммунодефииитами крольчих через 1 - 2 часа после введения карбоновых частиц обрабатывали различными иммуномодуляторами. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, все использованные им мун о модуляторы (отменяющие феномен "усиления") независимо от их природы восстало? или эмбриональную выживаемость у самок с блокадой СМФ до уровня поптроля. Б тоже время обработка иммуиомодуляюрамч самок с интактнон иммунной системой не вызлала у них снижения пронатальной выживаемости.

Таким образом. результаты этого эксперимента поу.азали, что иммуномодуляторы, также как и специфическая иммунизация. могут быть использованы для предупреждения пренатальных потерь у самок с иммунодефииитами. Эмбриопротективный эффект иммуномодуляторов в этом эксперименте связан не со стимуляцией феномена "усиления", а по-видимому, с восстановлением т'.\глютрпфтескон функции (по отношению к зародышу) организма самки, индуцированной антигенами плазмы семени и живчиков.

Клеточные иммунные реакции у самок со сниженной и восстановленной эмбриональной выживаемостью. Ранее было показано, что у крольчих уже на начальных этапах беременности происходит изменение некоторых клеточных иммунных реакций (Пропекая Л.В. и др.. 1930). В связи с этим нами было изучено изменение числа Е-РОК и КонА индуцированный бласттрансформг.шш лимфоцитов у самок с угнетенной и восстановленной эмбриональной выживаемостью. В этих исследованиях было установлено, что блокада СМФ снижает в периферической крови число Е-РОК на 3-й и 6-ые сутки после

Таблица 3.

Пренатальная выживаемость у самок, обработанных различными

иммуномодуляторами после блокады СМФ .* *

Обработки Число Число мест Живых потомков

Карбоновые Иммуномоду- самок имплантации Эмбрионов Крольчат

частицы ляторы Всего нормальных на %

Всего /о самку к контролю

- - 5/10* 36 36 36 100.0 7.4 »00.0

+ левамизол 7/10 49 49 47 95.9 ± 2.8 7.2 97. ± 2.3

- левамкзол 13 - - - - 7.8 100.00

+ полиакриловая кислота 5/10 35 35 35 100.0 7.3 98.6 ± 1.0

+ сополимер акриловой кислоты и {^-винил пир-ролидона 4/10 32 32 32 100.0 7.7 100.0

* - в числителе число вскрытых самок, в знаменателе число окролившихся самок

** - исследования выполнены с Соколовской И.И. и Вронской A.B.

- обработки суспензией карбонових частиц (Р<0,001). Инъекции таким самкам левамияола или иммунизации их как лейкоцитами самцов-доноров так к посгорних самцов полностью восстановила этот показатель клеточного иммунитета до уровня контроля. В тоже время иммунизация лейкоцитами посторонних самиов в отличие от иммунизации лейкоцитами самцов до норпв-семени, либо обработки иммуномодуляторами не предотвратит снижения пренатальной выживаемости у самок с экспериментально вызванным вторичным иммунодефицитом.

Следовательно, увеличение числа Е-РОК в периферической крови не всегда совпадает с течением нормального эмбриогенеза, то ест'* данный показатель не может быть использован с качестве способа определения нормальной и нарушенной беременности. Это несовпадение между увеличением числа Е-РОК и пренатальной выживаемостью, по-видимому, обусловлено тем, что для нормального эмбриогенеза необходима специфическая сенсибилизация материнского организма к антигенам зародыша отцовского гаплотипа, что у самок, обработанных карбоновы-ми частицами, достигается либо иммунизацией лейкоцитами самиов до-норов-семени, либо обработкой иммуномодуляторами.

Как и в случае со спонтанным розеткообразованием блокада СМФ вызвала резкое снижение Кон-А индуцированный бласттрансформа-ции лимфоцитов периферической крови. Наибольшее угнетение этого показателя произошло через сутки посте обработки карбоновыми частицами (Р<0,001). Снижение синтеза ДНК сохранялось в течении 5 7 суток посте спаривания. Иммунизация самок с блокадой СМФ лейкоцитами самцов доноров-семени не только не повысила у них индекс включения Н^ - тимидина (индуцированного Кон-А) лимфоцитами периферической крови, но даже вызвала его дальнейшее снижение. Угнетение бласттрансформации лимфоцитов в отличие от восстановлении чиста' Е-РОК при аналогичной обработке, по-видимому, связано с суммой неспеиифичесхих супрессивных факторов - специфической сенсибилизации (иммунизация лейкоцитами самцов) и блокадой СМФ. Известно, что иммунизация, как тимус-зависимыми, так и тимус-незави-еймыми антигенами стимулирует появление в организме специфических и неспецифических клеток-супрессоров, причем, как правило, количество неспецифических супрессоров во много раз превышает количество специфических Т-супрессоров (Брондз Б.Д.. 1957).

Эмбриональные потери и их предотвращение у самок с активированными клетками супрессорами, либо обработанных глюкохортикостеро-здом. Согласно "иммуносупресивной" теории важным звеном нормального »мбриояальяого развития являются неспецифические клетки-сунрессоры

(Ribbing ct. al., 1988). Известно, что они облегчают становление иммунологической толерантности (Tada Т.. 1988). В тоже время установлено. что при хронических патологических процессах с высокой активностью этих клеток нередко бывают нарушения воспроизводительной функции. В связи с этим большой как теоретический, так и практический интерес представляет выяснение функции неспецифических кле-ток-супрессоров. В 70-е годы была разработана модель активации неспецифических клеток-супрессоров посредством создания "феномена" конкуренции антигенов. Позднее было показано, что этот "феномен" отменяется обработкой иммуномодуляторами (Петров Р. В. и др.. 1983). Также большой интерес представляют исследования по выяснению непосредственных причин снижения эмбриональной выживаемости часто сопровождающее стрессы. Известно, что иммунодепрессивное действие глюкокортикостероидов обусловлено, главным образом, угнетением синтеза ИЛ-2. которое отменяется введением экзогенного ИЛ-2 (Stüttgen К. et. al., 1990). Установлено, что иммуностимулирующее действие многих им-мунотропных препаратов связано с усилением синтеза эндогенного ИЛ-2.

Результаты эксперимента по изучению влияния на пренатальную выживаемость конкуренции антигенов и ее разобщения, а также обработки синтетическим глюкокортикостероидом - преднизолоном. либо преднизолоном и левамизолом представлены в таблице 4. Как видно из данных, представленных в таблице 4, вопреки "иммуно-супрессивной" теории активация неспецифических клеток-супрессоров снизила пренатальную выживаемость на статистически достоверную величину. Обработка таких самок иммуномодуляторами - ПАК и левамизолом полностью восстановила эмбриональную выживаемость до уровня контроля. Эмбрио-токсическое действие преднизолона также отменялось обработкой левамизолом. Эмбриональные потери при конкуренции антигенов и при введении преднизолона проходили как и при блокаде СМФ в ранний импланта-ционный период.

Динамика изменения численности Е-РОК и Кон-А стимулированной бла-сттрансформации лимфоцитов у самок с индуцированной и разобщенной конкуренцией антигенов, а также обработанных преднизолоном, либо преднизолоном и левамизолом полностью совпадала с динамикой изменения аналогичных показателей клеточного иммунитета у самок с блокадой СМФ, либо обработанных карбоновыми частицами и левамизолом.

Таким образом, результаты экспериментов, представленных в этой главе показали, что угнетение иммунной системы у аллогенноспаренных самок вызывает снижение эмбриональной выживаемости, которое может быть предотвращено обработкой самок иммуномодуляторами, либо

Inf) Ulli.i •).:

Пренатальная выживемость у самок с инл> пиров,шпон и разобщенной конкуренцией лнпиенов. ,; также обработанных преднизолосом, либо нре.ши.юлоном и /ичшмизолом

Число Живых эмбрионов

Обработки Число мест )M6J)HOIIOH Крцльчаг

самок им- ■ Всего i

н.чан - Всего Из них 1 на ",, к

та ци и нормальных inlMKl к«штро.ш>

- - 7/12 53 53 100.0 87 i 7.2 100.0

эритроциты барана - 5/11 40 31 78.0± 6.4 61 i 5.6 | 78 4 ± 1.4

эритроциты барана ПАК 4/9 33 32 96.9± 4.8 65 | 7.2 i 100.0

эритроциты барана левамизол 4/12 34 34 100.0 86 7.2 , 100.0

преднизолон - 7/10 45 17 37.8± 7.2 "> 32 3.2 45.1 ± 4.8 **'

преднизолон левамизол 5/10 40 40 100.0 71 7.1 98.6 i 1.0

** - исследования выполнены совместно с 11.11. Соколовской и A.B. Вронской.

в числителе число вскрытых самок; в знаменателе Р < 0.01 ; **) . р < 0.001

число окролившихся самок

яооалютельной сенсибилизацией антигенами, имеющими общие детерминанты с антигенами зародышей. Следовательно, распознавание материнской иммунной системой антигенов зародыша отцовского га плоти па, приводящее к становлению нммунотрофической функции является необходимым звеном нормального эмбриогенеза.

Модели с еннгенным спариванием. Важным аргументом, противоречащим "нммунотрофической" теории считают сингенную беременность (Clark D.A.. Chaouat О, 1989). Известно, что при сингенной беременности, когда антигены гистрсовместимости у самца и самки практически полностью совпадают, увеличением эмбриональных потерь, как правило, не отмечается.

Таким образом, если действительно иммунотрофическое взаимодействие в системе "самка-зародыш" является обязательным звеном нормального эмбриогенеза, то этот физиологический процесс должен существовать и при сингенной беременности.

В экспериментах по изучению рати иммунной системы самки в развитии сингенного зародыша использовали модель активации неспецифических клеток-супрессоров посредством создания феномена конкуренции антигенов. Данный феномен вызывали 3-х кратной иммунизацией эритроцитами барана. Степень активации этих клеток вычисляли путем определения величины подавления первичного иммунного ответа. Экспериментально было обнаружено, что на вторые сутки после последней иммунизации эритроцитами барана чисто АОК к эритроцитам

свиньи (на 106 соленоцитов) снизилось с 692 ± 82 (в контроле) до 28 ± 4 (z опыте). В тоже время инъекции левамизола (в дозе 15 мг/кг массы тела) полностью разобщила эту конкуренцию (число АОК составило 718 ± 92).

При изучении влияния конкуренции антигенов и ее разобщения на пренатальную выживаемость было обнаружено, что активация неспецифических клеток-супрессоров вызывает снижение числа сингеннобере-меннмх самок с 81.8 ± 11.6 % (я контроле) до 42.9 ± 13.2 % (в опыте, Р<0.05). Данвое нарушение беременности не было обусловлено действием анткэрнтроцитарных антител, т.к. введение спаренным^ самкам мышиной антисыворотки к эритроцитам барана не повлияло на^ число беременных самок в группе (которое составило 90.0 ± 9.5 ; Обработка самок с феноменом конкуренции антигенов иммуномодулггором Г: левамизолом восстановила число беременных самок в группе :до 833 ± 10.8 %. В тоже время при вскрытии самок (с активированными клеткамн-супрессорамн) на 13-е сутки беременности не было обнаружено pM-mwpf в эмбриональной выживаемости по сравнению с контролем

( 84.0 ± 5.5 ".,. и опыте и 83.3 ± 3.9 в контроле). Так как при

вскрытии самок в этот шгриод беременности можно определить лишь прена гальные потери, проишедшие в имплантанионный период. можно предположить, что снижение числа беременных самих п группе живо-тмы\ с активированными клетками-супрессорами вызвано полной доимп-лангационнои гибелью зародышей у значительной части таких «мок. В связи с этим в следующем эксперименте у самок с индуцированном конкуренцией была из\чена пренатальная выживаемость на стадии лит-т|,| и морулы Выло обнаружено, что .на выживаемость > них на данных стадиих эмбриогенеза была практически одинаковой как в контроле. так и в опыте и соответственно составила 91.6-!- К.К 84.6 г 10.9 и 90.0 ~ ¡0.0 %, 81.8 2: 9.0 '/„. Следовательно, сниже-

ние числа беременных в группе самок с активированными клеткамн-супрессорами обусловлена нарушением процесса имплантации зародышей.

То. что нарушение процесса имплантации зародышей у синген-нобеременных самок с индуцированной конкуренцией антигенов связано с иммунными факторами, а не с нарушением каких-либо других физиологических механизмов было подтверждено и в адоптивном переносе. Так. перенос интактным спаренным самкам спленонитов от интактны* беременных, либо небеременных самок практически не повлиял на до-имплантаиион.чую выживаемость зародышей, число беременных самок составило соответственно - 81.3 - 9.7 "„ и 75.0 ± 7.2 '.'„ против 77.1 ~ 6.1 'У„ в контроле. В тоже время адоптивный перенос интактным спаренным самкам спленонитов от животных с индуцированной конкуренцией антигенов вызвал снижение числа беременных самок в группе до 33.0 ± 7.3 % (Р<0.00П. Также в адоптивном переносе било показано, что нарушение процесса имплантации у самок с активированными клетками-супрессорами обусловлено действием прилипающих к пластику спленонитов. Перенос спаренным самкам с индуцированной конкуренцией антигенов спленоцитов от интактных беременных самок восстановил доимплантационную эмбриональную выживаемость (число беременных самок составило в контроле 85.0 ± 8.0 % и в опыте 70.6 ± 11.0 % при Р>0.05).

Известно, что и при сингенной беременности зародыш имеет антигены отличающиеся от антигенов материнского организма. В частности, на ранних зародышах экспресскрованы антигены локуса Т, которые помимо эмбрионов представлены также на живчиках и па клетках некоторых опухолей. Следовательно, эти антигены всегда будут "чужеродны" для организма самки. Исходя из этого можно предположить, что антигены локуса Т, локализованные на живчиках, могут

быть индукторами иммунотрофической функции при сингенной беременности.

3 связи с этим в следующем эксперименте спаренным самкам адоптивно переносили спленоциты от самок, иммунизированных живчиками. либо спленошггами сингенных самцов. Восстановление доимплантаци-онной пренатальной выживаемости произошло лишь при переносе спленощггов от самок, иммунизированных живчиками (83.3 ± 10.7 %), но не спленоцитами (41.7 ± 13.2 %). Число беременных самок в контроле составило 85.0 ±8.0 %.

При определении индекса ингибиции миграции макрофагов в присутствии сингенных живчиков была также обнаружена прямая зависимость между этим показателем клеточного иммунитета и доимпланта-ционной эмбриональной выживаемостью у самок с сингенной беременностью. Так, у виргинных самок данный индекс составил 101.0 ± 7.7, т.е. сенсибилизация к антигенам сингенных живчиков у них практически отсутствовала. В тоже время у интактных беременных самок появляется сильная сенсибилизация к этим антигенам (индекс -32.3 2: 2.9), у спаренных самок с активированными клетками-супрессора-ми индекс ингибиции миграции макрофагов (98.9 ± 12.4) практически не отличался от контроля. Адоптивный перенос спаренным самкам с индуцированной конкуренцией антигенов спленоцитов от интактных беременных, либо небеременных животных, иммунизированных сингенными живчиками, восстановил не только доимплантационную эмбриональную выживаемость, ко и этот вид клеточных иммунных реакций. Индекс ингибиции миграции макрофагов соответственно составил - 33.5 ± 3.5 и 34.6 ± 3.5 .

Таким образом, результаты, представленные в этой главе, показали что и при сингенной беременности распознавание материнской иммунной системой "чужеродных" антигенов зародыша является необходимым звеном нормального эмбриогенеза. Индукторами этого процесса, по-видимому, являются антигены живчиков, имеющие общие детерминанты с антигенами зародышей.

Оценка возможного значения в нарушениях воспроизводительной функции у крупного рогатого скота штаммов синегнойной палочки, контаминирующих семя быков-производителей

В отечественной литературе длительное время дискуссируется вопрос о возможном взаимодействии в возникновении пренатальных потерь штаммов синегнойной палочки, контаминирующих семя быков-производителей и снижения резистентности у самок. Исходя из этого в нормативные документы по ветеринарно-санитарной оценке качества

семени-производителей был внесен (без достаточной .экспериментальной -проверки) — пункт,-— прел усматривающий —выбраковку семенит—кпнтамгчмрор.птт ною этими микроорганизмами. Так как, штаммы синегнойной палочки нередко присутствуют в семени быков-производителеи, то выбраковка семени быков-улучшателей с высоким генетическим потенциалом наносит болыпои ущерб племенному дел>.

Действительно многокатно показано, что при снижст'н рел'отен-гности организма синегноинак палочка действительно может Г«,ч.. при чиной различных форм патологии. Исследования. проведенные нами показали, что при угнетении иммунной системы на ранних ■•тана'» беременности резко увеличиваются эмбриональные потери С лелов.чте ■ч,><п вполне можно предположить, что либо все они. либо значительная их часть может быть вызвана действием штаммов синепюйнои палочки, попавших в половые пути вместе с семенем производителен

В связи с этим бью изучено возможное взаимодействие в сии жении пренатальной выживаемости вторичных иммунодефицитов у самок и штаммов синегнойной палочки.

Вирулентность и синтез факторов патогенности иггаумам■,■ „иче-гноинои палочки, выделенных из семени производителей.

Ранее было показано, что как правило, отсутствует взаймы» ,• между контаминацией семени быков-производителей штаммах1 ч сит:»- и ной палочки и какими-либо нарушениями репродуктивной фчик;,.:;' этих быков. Следовательно большой интерес представляет и (учение степени вирулентности у синтеза факторов патогенности этим! штаммами, то есть вполне вероятно, что они являются авирулентнымн.

При изучении вирулентности и синтеза факторов патогенности штаммами синегнойной палочки, выделенными из семени быков-мроизв<>-дителей, было обнаружено, что несмотря на то. что эти итаммы были выделены из семени быков без каких-либо клинических проявлении нарушения репродуктивной функции, они нередко обладали высокой степенью вирулентности и синтезировали факторы патогенности. В частности, экзотоксин-А и протеолитические ферменты синтезировали соответственно 30% и 60% от числа исследованных штаммов. Среди них было обнаружено - вирулентных (ЛД50 40-100 млн) - 26,7% и слабовируленных (ЛД50 более 200 млн) - 46,6%.

Таким образом, результаты этих исследований показал 1, что в семени быков-производителей нередко присутствуют штаммы с шегнойной палочки обладающие высокой вирулентностью и синтезирующие факторы патогенности.

Изучение влияния штаммов синегнойной палочки на выживаемость

живчиков вне организма.

В связи с обнаружением в семени быков-производитстей штаммов синегнойной палочки, синтезирующих факторы патогенности нами было изучено влияние на выживаемость живчиков вне организма естественной контаминации семени производителей данными штаммами. Результаты эксперимента представлены в таблице 5.

Как видно из данных, представленных в таблице 5. естественная контаминация спермы быков как штаммами синегнойной палочки, так и штаммами Proteus sp. не оказывает отрицательного влияния на пс-реживаемость спермиев вне организма.

Таблица 5.

Влияние естественной контаминации спермы быков условнопатогенной микрофлорой на переживаемость спермиев в течение 5 часов при 38П С.

Контаминация Чисто Подвижность (в баллах)

исстедованных серий Сразу посте оттаивания Через 5 часов

Синегнойной палочкой 195 4.45 * 0.08 2.25 ± 0.07

Контроль (без контаминации) 195 4.38 * 0.03 2.12 i 0.08

Proteus sp. 50 4.53 ± 0.06 2.31 ± 0.13

Контроль (без контаминации) 50 4.45 ± 0.07 2.14 ± 0.16

- в контроле и опыте исследовали равное чисто проб от одних и тех же быков

Так как, штаммы синегнойной палочки сильно варьируют как по величине продукции факторов патогенности, так и по степени вирулентности, нами было изучено влияние на показатель абсолютной живучести спермиев быка искусственной (1 * 105 микробных тел/мл разбавленной спермы) контаминации спермы штаммами синегнойной палочки, продуцирующими факторы патогенности и обладающими высокой вирулентностью in vivo. В качестве экзотоксин-A образующего штамма использовали эталлонный штамм РА-103, штаммы, обладающие высокой протеазной (1:32) и эластазной (1:16) активностью, а также имеющие

ЛД^о соответственно - 44.57 чди а !15.8 млн были получены нами

— —семени быков-произподите.-ггй. В—\ozte - этих—исследований также -не---

б (¿то обнаружено какой-либо зависимости между показателем абсолютной живучести жначикоэ и контаминации семени данными штаммами Рз.

Таким образом, результаты данных исследований показали, что контаминация семени быков-пр'снпводчге.теА штаммами синегнойяой палочки независимо ни от степени вирулентности, ни от синтеза ими факторов патогенносуи не оказывает отрицательного влияния на выживаемость живчиков «не организма.

Определение возможного взаимодействия вторичных иммуннодефици-тоз у самок и штаммов Р5. аега^пои в возникновении пренатальных потерь.

Известно, что СМФ (и факторы ею синтезируемые) являются ведушей системой зашиты организма от синегнойной инфекции, помимо этого антигенпрезентирующие клетки (входящие в эту систему) являются ключевыми в индукции специфического иммунного ответа. В связи с этим в данных исследованиях использовали разработанную нами

модель блокады СМФ карбоновыми частицами у самок, осемененных семенем производителей искусственно контаминированным штаммом РА-103. Выбор этого штамма был обусловлен, во-первых тем, что он является суперпродуиентом экзотоксина-А. Во-вторых, его цитотоксическое действие связано с нарушением белкового синтеза, который крайне ограничен в семени и черезвычайно высок в эмбриогенезе. Следовательно, вполне вероятно, что штаммы, обрузующие экзотоксин-А, и не снижающие выживаемость живчиков вне организма, могут вызывать раннюю гибель зародышей. Результаты этих исследований представлены в таблице 6.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, не произошло снижения пренатальной выживаемости у самок (с нормальной активностью иммунной системы), осемененных спермой дополнительно контаминированной штаммом РА-ЮЗ. В тоже время экспериментально вызванный Иммунодефицит вызвал практически одинаковое снижение пренатальной выживаемое™ как у самок, осемененных спермой искусственно контаминированной синегнойной палочкой, так и без этой контаминации (Р < 0.01). Не установлено корреляции между эмбриональными потерями и количеством микробных гел в сперме самцов. Из смывов маток крольчих контрольной и опытной групп, а также из дегенерированных зародышей и мест их имплантации микроорганизмы (в том числе и контаминнровавшие сперму) не были выделены. .

Таблица 6.

Эмбриональные потери и их предотвращение у самок с экспериментально вызванным иммунодефицитом и осемененных семенем, контаминированным штаммом РА-103.

Введено ми- Число Иммуноиодул 1ЦИЯ Мест Живых потомков

кробных тел самок Блокада Иммуниза- Обработка ИМт Эмбрионов Крольчат

(мл семени) СМФ ция лейкоцитами левамизолом плантации Всего 7 /о Всего на самку %. к контролю

Контроль (без контаминации) _ _ 29 28 96.6 ± 3.4 43 7.2 100.0

Контроль (без контаминации) 4/5 + - - 35 24 68.7 ± 9.7 * 19 4.8 66.6 ± 10.6*

1 * I05 4/5 - - - 33 33 100.0 37 7.4 100.0

1 »ю5 4/5 + - - 28 19 67.9 ± 8.8 * 23 4.6 63.8 + 10.0 *

1 ♦ ю5 4/6 + + - 28 28 100.0 43 7.2 100.0

1 » 106 5/5 - - - 30 30 100.0 35 7.0 97.2 ± 2.8 *

1 *106 4/5 + - - 29 19 65.5 ± 8.8 * 21 4.2 58.3 ± 10.7**

LIO6 4/7 + + - 30 30 100.0 51 7.2 100.0

1 • 10б 5/5 + - + 34 34 100.0 35 7.0 97.2 ± 2.8

' - в числителе число вскрытых самок, в знаменателе число окролившихся самок; * - Р < 0.01; ** - Р < 0.05

Ойр.и'мчка самок с блокадой С'МФ иммуностимулятором - лсвамизолпм -

— л поп — иммунизация— их- лейкоцитами самцов—доноров — спермы — полностью---------------------

восстановила нренатальную выживаемость до уровня контроля.

Таким образом, ати результаты показали, что у самок с экспериментально емплелирпианпыми иммунодефицитами и осемененных спермой искусственно к опта м и н и рованной вирулентными шткммами синегнонной пилочки снижение прснатальиой выживаемости обусловлено неинфекнионными причинами. Так как восстановление эмбриональной пы-жинаемости произошло к результате иммунизации самок антигенами, имеющими общие детерминанты с антигенами лмбрионов, можно сделать вывод. что :мо снижение премиальной выживаемости у самок с им-мунодефипитачи произошло вследствии нарушения иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш", а именно в результате подавления иммунотрофического действия материнской иммунной системы.

Полученный в этом модельном эксперименте вывод об отсутствии отрицательного влияния на результативность осеменения самок семенем. контаминированным штаммами синегнойной палочки, был изучен нами в научно-производственном эксперименте, проведенном в зоне деятельности L1CH0 сельскохозяйственных животных. Для этих исследований были отобраны данные за 1988 год по результативности осеменения коров и телок спермой быков с контаминацией ее услов-нопатогенными микроорганизмами. За контроль была взята результативность осеменения этими же быками в 1987 году (когда сперму контаминированную условнолатогенными микроорганизмами полностью выбраковывали). Результаты анализа представлены в таблице 7

Как видно из данных, представленных в таблице 7, естественная контаминация спермы быков как штаммами синегнойной палочки, так и Proteus sp., а также их ассоциация не только не оказала отрицательного влияния на результативность осеменения крупного рогатого скота, но даже повысила ее на статистически недостоверную величину, но близкую к критической.

Не было обнаружено также никакой зависимости между результативностью осеменения хоров и телок и естественной контаминацией семени производителей штаммами синегнойной палочки, с различной степению вирулентности и синтезом факторов патогенности. Отсутствие такой зависимости было установлено нами и в другом эксперименте с осеменением крупного рогатого скота семенем, искусственно контаминированным штаммом РА-103 (суперпродуцентом экЗ»токсина-А). Всего в этом опыте было использовано 224 животных. Стельность от первого осеменения и доля абортированных животных в контроле и опыте со-

ставила соответственно 75.7 2.7

± 4.1

4.5

78.8 ± 3.9

Таблица 7

Результативность осеменения крупного рогатого скота спермой с естественной контаминацией ее штаммы условнопатогенных микроорганизмов.

¡Число | быков |

Контаминация

¡Осеменение ¡Число повтор- !Рсзультатин

животных

56 '¡Синегнойной палочкой , 123480 Без контаминации ! 174462

I

;ных осеменени ;ность осеме-; нения в пср-

1 в\ю охот\-

42681 60836

75 Протеем

Без контаминации

184433 ! 62225 208921 ; 70757

27 | Протеем и синегной-

!ной палочкой 62535 \ 21607

¡Без контаминации I 77683 I 27858

I | !

47 !Без контаминации , !

| (1988 г.) 86914 | 28795

Без контаминации |

(1987 г.) 113052 | 37259

66.2 - 1.0 63.6 ± 1.3

65.8 ± 1.0

62.9 * 1.3

67.1 ± 1.7 62.6 * 2.2

65.1 ^ 1.0

64.3 г 1.3

»аким ооразом. результаты научно-производственных экспериментов также показали, что ни естественная, ни искусственная контаминация семени быков-производителей штаммами синегнойной палочки (независимо от степени вирулентности или синтеза факторов патогенно-сти) не оказывает отрицательного влияния на результативность осеменения коров и телок.

Выводы

1. Сформулировано новое теоретическое положение о том, что для нормального . пренатального развития необходим иммунный ответ самки на антигены эмбриона отцовского га плоти па, проявляющийся не в формировании реакций отторжения, а в становлении иммунотрофиче-ской функции по отношению к зародышу.

2. Экспериментальное угнетение иммунной системы самки посредством блокады СМФ, либо конкуренции антигенов или обработки пред-низолоном на ранних стадиях аллогенной беременности вызывает

снижение .«мбрноналмшй выживаемости в период имплантации.

___i. Эмбриональные потери, вызванные введением синтетического

тлюкокортикостероила - преднизолона, обусловлены не прямым эмбрио-юксическим действием .»того гормона, а нарушением иммунотрофического взаимодействия п системе "самка-зародыш*.

4. Восстановление иренатальной выживаемости у аллогенно,. - беременных самок с экспериментальным нарушением иммунотрофической функции доститаегся дополнительной сенсибилизаниеи их не тол!.ко лейкоцитами самцов доноров - спермы, но и иммунизацией их как собственно снермиями, так и плазмой спермы.

5. При сингенной беремености также существует иммунотрофиче-ское взаимодействие в системе "самка-зародыш", поскольку, несмотря на совпадение TLX антигенов у самца и самки при сиигенном их спаривании экспериментальное угнетение иммунной системы у самок в первые сутки после оплодотворения снижает пренатальную выживаемость в предимплантационный период.

6. Адоптивный перенос сингенно-беременным самкам с индуцированной конкуренцией антигенов спеленоцитов от интактных беременных самок, либо самок, иммунизированных спермиями сингенных самцов, предупреждает снижение эмбриональной выживаемости.

7. Критическим периодом становления иммунных взванмоогношений в "системе самка" зародыш, как у аллогенно-, так и сингенноспарен-ных самок, являются первые сутки после оплодотворения, так как этот период пренатального развития наиболее чувствителен к иммуно-депрессивному действию.

8. Антигены ранних эмбрионов являются вторичными индукторами становления необходимой для нормального пренатального развития иммунотрофической функции организма самки. Первичными индукторами этого процесса являются антигены спермиев, имеющие общие детерминанты с антигенами зародышей.

9. Установлено новое научное направление в разработке способов повышения пренатальной выживаемости у самок посредством обработки их иммуномодуляторами.

10. Иммуномодуляторы, вызывающие отмену иммунологической толерантности, обусловленную активацией клеток-супрессоров, не только не оказывают отрицательного влияния на эмбриогенез у' самок с интакт-ной иммунной системой, но и предупреждают пренатальные потери у самок с угнетенной иммунотрофической функцией.

11. Установлено новое теоретическое положение о наличие у спермиев быков-производителей и в тканях половых путей коров и

телок тканеврспсинфнческого конституционального иммунитета по отношению к штаммам синсгнойной палочки.

12. У самок с угнетенной иммунной системой снижение эмбриональной выживаемости обусловлено не действием штаммов синсгнойной палочки, контаминируюших сперму быков-производителей а нарушением иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш".

13. Среди быков-производителен наиболее распространены пиоцио-нинобразующие штаммы синсгнойной палочки 03 серотипа, обладающие высокой степенью вирулентности в ЛД50 и синтезирующие факторы па-тогенности: экзотоксин-А. протеазу и эластазу. Эти штаммы также обладают высокой резистентностью к антимикробным препаратам, используемым как для санации спермы, так и для лечения животных.

14. Контаминация спермы быков-производителей штаммами Ps. aeruginosa не зависимо от степени их вирулентности и наличия у них факторов патогенности: экзотксина А. протеазы и эластазы не оказывают отрицательного влияния на биологические показатели спермиев как in vivo, так и in vitro.

Практические предложения.

Материалы диссертации были использованы при разработке следующих нормативных документов: 1. Изменения N 1 ГОСТ 26030-83 "Сперма быков замороженная. Технические условия", введенное в действие 01.11.87 г.; 2. Изменение N 1 ГОСТ 23745-79 "Сперма быков неразбавленная, свежеполученная" и Изменение N г 2 ГОСТ 26030-83 "Сперма быков замороженная. Технические условия", согласованных 09.04.91 .. с Госплеминспекцией Главного управления государственных инспекций и ГУВ Государственной комиссии по продовольствию и закупкам при Совмине СССР. 3. "Ветеринарно-санитарных правил для племпредприятий (станций) и пунктов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных", утвержденных ГУВ Государственной комиссии по продовольствию и закупкам при Совмине СССР 29.12.90г.

Разработаны • экспериментальные модели для изучения роли иммунной системы самки в нормальном и нарушенном пренатальном развитии, а также модели для выяснения возможного взаимодействия вторичных иммунодефицитов и штаммов условнопатогенных и патогенных микроорганизмов в возникновении эмбриональных потерь, которые вопыи в "Методические рекомендации по иммунологии воспроизведения", утвержденные и рекомендованные к изданию Ученым советом ВИЖа от 04.11.83г., Дубровшш, 1985г.

Перечень основных работ, опубликованных по теме диссертации.

__________1.___Соколовская И.И., Вронская А.В., Радченков В.П. Эмбриональная выживаемость в связи с изменением иммунных-реакций.//"До----------------------

клады ВЛСХНИЛ, 1983, N 4, с. 29-31.

2. Radchenkov V.P., Sokolovskaya 1.1.. Bronskaya A.V. The prenatal ¡¡viability at the females treatment with male's immunc<:en in combination with MPS bloking.// J. Reprod. Immunol., 1983. v. Suppl., p. 73.

3. Соколовская И.И.. Радченков В.П., Бронская А.В. Зависимость пренатальной выживаемости от состояния иммунной системы самки.//Вестник с.-х. науки, 1984, N 2. с. 87-91.

4. Соколовская И.И., Радченков В.П., Бронская А.В. Активация иммунной системы самки как фактор предотвращения эмбриональной смертности.//Доклады ВАСХНИЛ, 1984, N 7, с. 22-23.

5. Radchenkov V.P., Sokolovskaya I.I., Bronskaya A.V. Influence of antigen competition on prenatal liviability.// AJRIM, 1985, v. 7, p.79.

6. Radchenkov V.P., Sokolovskaya 1.1., Bronskaya A.V. Influence of antigen competition on prenanal liviability.// AJRIM, 1985, v.7, p. 79.

7. Радченков В.П., Бронская А.В.. Соколовская И.И. Повышение пренатальной выживаемости путем разобщения конкуренции антигенов.// Доклады ВАСХНИЛ, 1986, N. 11, с. 31-32.

8. Радченков В.П., Мороз А.Ф., Радкевич С.А., Веткова Л.Г. Стоянов В.К. Биологические особенности штаммов Ps. aeruginosa, выделенных из спермы быков-производителей.// С.-х биология, 1986, N 11, с. 81-83.

9. Радченков В.П.. Радкевич С.А., Литвинов Н.С., Мороз А.Ф. Оценка этиологической роли синегнойной палочки в пренатальных потерях у крупного рогатого скота.// С.-х. биология, N 1, с. 91-96.

¡0. Радченков В.П., Бронская А.В. Зависимость пренатальной выживаемости от активности неспецифических клеток-угнетателей. // Тезисы 3-его Всесоюз. симп. по иммунол. репрод. с междунар. участием, Киев, 1987, с. 64.

11. Sokolovskaya I.I., Radchenkov V.P., Bronskaya A.V. The prevention of prenatal losses arising after prednisolo.n injection.// AJRIM, 1988, v. 16, N 2, p. 79.

12. Radchenkov V.P., Sokolovskaya I.I., Bronskaya A.V. The restablishment of prenatal liviability after MFS-inhibition in rabbit pregnancy.// AJRIM, 1988, v. 16, N 2, p. 72.

13. Радченков В.П., Радкевич СЛ., Мороз А.Ф. Влияние услов-

нопатогенной микрофлоры ка воспроизводительную функцию животных.// Зоотехния, 1988, N И, с. 55-57.

.14. Соколовская И.И., Бронская А.В., Радченков В.П. Предотвращение пренатальной смертности, вызванной глюкокортикостероидом, у самок при введении левамизола.// Доклады ВАСХНИЛ, N 4, с. 33-35.

15. Bronskaya A.V., Radchenkov V.P., Sokolovskava I.I. E-RFC number at normal and disturbed pregnancy.// AJR1M. v. 16, p. 77.

16. Sokolovskava l.l., Radchenkov V.P., Bronskaya A.V., Machorskaya l.V. Prevention by levamisol inhibition of E-RFC activiiv and increasing of embryos death provoked with prednisolon injection.// J. Reprod. Immunol., 1989, v. Suppl., p. 246.

17. Radchenkov V.P. Non- specific suppressor cells as the cause of the syngeneic pregnancy abortion.// Abst. First. Inter. Forum Reprod. Immunol., Magdeburg, 1990. p. 35.

18. Bronskaya A.V., Radchenkov V.P., Ponomarevn l.V. Immune regulation embrios liviabilitv.// Abst. First Forum Reprod. Immunol., Magdeburg. 1990, p. 35.

19. Радченков В.П., Радкевич С.А., Веткова Л.Г., Мороз А.Ф. Иммунодефицит и контаминация спермы синегнойной палочки в прена-тальных потерях.// Вестник с.-х. науки, 1990, N2, с 97-99.

20. Листунов А.Д., Радченков В.П., Радкевич С.А., Александров А.Д., Мороз А.Ф. Использование спермы быков-производителей, контами-нированной условнопатогенными микроорганизмами.// Зоотехния, 1990, N 9, с. 61-64.

21. Бронская А.В., Радченков В.П., Пономарева И.В., Соколовская И.И Эмбриогенез при угнетении материнской иммунной систе-мы.//Тезисы 4-го Всесоюз. симп. по . иммунол. репрод. с межднар. участием, Киев, 1990, с. 236.

22. Радченков В.П. Неспецифические супрессоры как причина нарушения сингенной беременности.//Тезисы 4-го Всесоюзн. симп. по иммунол. репрод. с междунар. участием, Киев, 1990, с. 190.

23. Радченков В.П. Роль /антигенов плазмы спермы в нормальном и нарушенном пренатальном развитии.// Доклады ВАСХНИЛ, 1991, N 10, с. 49-50

24. Радченков В.П., Литвинов Н.С. Угнетение иммунной системы самок как причина нарушения имплантации сингенного зародыша.// С.-х. биология, 1991, N 6, с. 134-138.

25. Radchenkov V.P. Spermatozoa as inductors of immunotrophical action of maternal immune system at syngeneic pregnancy.// J. Immunol., Immunopharmacol., 1992, v. 12, N 12, p. 131.