Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов получения и культивирования первичных и перевиваемых культур клеток животных для производства вирусных вакцин

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов получения и культивирования первичных и перевиваемых культур клеток животных для производства вирусных вакцин"



157&0

На правах рукописи

ХАПЧАЕВ Юсуф Хаджи-бекович

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЕРВИЧНЫХ И ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВИРУСНЫХ ВАКЦИН

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени.,. доктора биологических наук

Москва - 2003 г.

Работа выполнена в Государственном учреждении Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН и Федеральном государственном унитарном предприятии «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН»

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Грачев Виктор Павлович

доктор медицинских наук, профессор Миронова Любовь Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

Лаппсевич Василий Андреевич доктор биологических наук, профессор, академик РАМН '

Зверев Виталий Васильевич доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна

Ведущая организация: Государственное учреждение Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича МЗ РФ.

Защита состоится « » У) 2003 года в

си>

часов на заседании

диссертационного совета Д.001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

Автореферат диссертации разослан « & »

003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат йтпппт^ . О.А. Медведкнна

ЬИбЛ »ОТЕКА. |

1. Общая характеристика работы.

Культуры клеток человека и животных являются чрезвычайно важной моделью при решении как фундаментальных, так и прикладных задач биологии и медицины.

'■'•>, , •■ i Iii

В работе представлены результаты исследований по усовершенствованию методов получения, аттестации и культивирования первичных и перевиваемых культур клеток животных,, а также использования их ^ля производства вирусных вакцин. Разработана и внедрена в практику высокоэффективная технология приготовления первичных культур клеток почек обезьян, позволившая значительно увеличить выходы культур-продуцентов

из ткани животного-донора и, соответственно, объемы вакцин против по' ' 1 ".п

лиомиелйта и чумы плотоядных, получаемых на их основе. Приготовлены и аттестованы криобанкй отечественных линий клеток почек .(линия 4647) и селезенки (линия 455) зеленых мартышек, а также криобанк клеток линии Vero. Банки клеток линий 4647 и Vero сертифицированы ГИСК им. Л.А. Тарасевича МЗ РФ и Комитетом по МИБП МЗ РФ и разрешены для использования при изготовлении медицинских иммунобиологических препаратов. Установлены оптимальные параметры и режимы культивирования клеток этих Линий в стационарных и роллерных, условиях, а также на микроносителях в различных типах биореакторов. Разработаны модельные технологии изготовления вакцин против полиомиелита, клещевого энцефалита и Чумы плотоядных на сертифицированных линиях клеток с использованием какрутинных методов культивирования, так и цсевдосуспензионно-го метода культивирования, обеспечивающие возможность получения безопасных и эффективных препаратов.

Таким образом, на основании полученных данных разработана система получения и выращивания первичных и перевиваемых, культур клеток обезьян, обеспечивающая возможность - накопления в них вакцинных штаммов вирусов с сохранением аттенуированных свойств.

Актуальность проблемы

Определяющими и тесно взаимосвязанными звеньями технологий, основанных на использовании культур клеток животного происхождения, являются сама культура-продуцент и способ ее культивирования. До настоящего времени массовое производство многих медицинских культуральных

\ V ! V .

вирусных вакцин осуществляется с использованием первичных культур клеток животных. Поэтому увеличение биомассы культуры-продуцента, получаемой от одного животного-донора ткани, остается важным этапом производственного процесса. Решение этой задачи может бьггъ осуществлено либо замечет увеличения сборов первично-трипсинизированных клеток, либр.счет использования более эффективных способов культивирования клеток. В силу биологических особенностей первично-трипсинизированных клетрк кардинально усовершенствовать или заменить рутинные способы культивирования клеток не представляется возможным. Таким образом, дальнейшее совершенствование способов дезагрегации исходных тканей животных-доноров остается по-прежнему актуальным.

Высокая трудоемкость и низкая технологичность традиционных методов изготовления вирусных вакцин на базе первичных и диплоидных культур клеток требуют значительных материальных затрат и не позволяют в полном объеме обеспечить постоянно растущую потребность практического здравоохранения в эффективных, безопасных н экономичных препаратах. Кроме того, включение в технологию производства вакцин новых дорогостоящих методов контроля на безопасность, стадий глубокой очистки и концентрации препаратов требуют значительно больших объемов исходных вакцинных полуфабрикатов.

Одним из наиболее эффективных подходов к решению проблемы является использование в качестве клеточного субстрата перевиваемых линий клеток. Применение этого типа культур клеток при получении медицинских иммунобиологических препаратов основано на системе посевных и рабочих банков клеток, аттестованных в соответствии с требованиями Всемирной

организации здравоохранения (ВОЗ) к клеточным субстратам. В связи с этим исследования по изучению свойств перспективных перевиваемых линий с целью создания аттестованных криобанков таких культур являются высоко актуальными. Не менее актуальными являются разработки по совершенствованию методов культивирования сертифицированных, лишш клеток и вакцинных штаммов вирусов при создании и производстве новых вирусных вакцин. В настоящее время одним из наиболее перспективных направлений является культивирование клеток и вирусов на частицах микроносителей в биореакторах - псевдосуспензионный метод культивирования., Применение этого метода позволяет быстро проводить масштабирование процесса получения, вакцин, поддерживать в автоматическом режиме основные технологические параметры на оптимальном уровне и, как следствие, получать более стандартные препараты. _ .....

К моменту начала наших исследований метод пеевдосусцецзионнрго культивирования клеток и вирусов на микроносителях в нашей стране, практически не использовался и находился на уровне лабораторных разработок.

Цель и задачи исследования.

-Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования являлась разработка высокоэффективных и технологичных способов получения и культивирования первичных и перевиваемых культур клеток животных, пригодных для использования в качестве клеточных субстратов при изготовлении различных вирусных вакцин.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: (1) разработать способ дезагрегации почек зеленых мартышек, позволяющий увеличить объем производственной партии культуры-продуцента, получаемой из ткани животного-донора; (2) изучить возможность получения из селезенок зеленых мартышек первичных и перевиваемых культур клеток, пригодных для вирусологических исследований; (3) провести обследование отечественных культур клеток обезьян и создать криобанки линий,

отвечающих требованиям ВОЗ к перевиваемым линиям клеток, разрешенным для использования при изготовлении медицинских иммунобиологических препаратов; (4) изучить возможность использования отечественных перевиваемых линий клеток обезьян для размножения вакцинных штаммов вирусов полиомиелита'(штаммы Сэбина типов I, II и III), клещевого энцефалита (Штамм Софьин), бешенства (штамм Внуково-32), чумы плотоядных (штамм Рокборн); (5) установить оптимальные параметры культивирования клеток линии Vero и вакцинных штаммов вируса полиомиелита в условиях псевдосуспензии для отработки модельной технологии изготовления вакци-- ны против полиомиелита в биореакторах; (6) провести оценку экспериментальных серий моновакцин типов I, П и III против полиомиелита, приготовленных на клетках линии Vero с использованием биореакторной технологии; (7) изучить закономерности размножения вируса клещевого энцефалита (штамм Софьин) в клетках линии Vero, культивируемых на микроносителях, и разработать экспериментальную систему, обеспечивающую стабильную продукциюкуяьтурального антигена. . .. . •

■■ ■ Научная новизна. Впервые разработан способ' трипсинизации почек обезьян, позволяющий управлять процессом дезагрегации паренхимы органа и получать преимущественно либо взвесь дискретные клеток, либр взвесь, фрагментов почечных канальцев и клубочков. „ .-г,-,,V,СМ1 i ' ■ ,

Получена и аттестована новая перевиваемая линия . клеток ¡селезенки взрослой зеленой мартышки ,455 - линия 455. Показано, что, клетки линии 455 не контаминированы посторонними агентами^ не туморогенны, сохраняют стабильными свои характеристики на протяжении не менее 40 последовательных, ^пассажей, высокочувствительны к различным группам вирусов. ' ""'%nt "j, ■ '->;■•!<. i ji',1,

Впервые определены спонтанный уровень сестринских хроматидных обменов (CXQ), а также локализация ядр^щкообразующих районов (ЯОР)

хромосом в перевиваемых линиях клеток обезьян Cercopithecus aethiops. Показано, что выявленные особенности ЯОР хромосом являются генетическим маркером клеток этого вида обезьян и могут быть использованы для идентификации линий клеток с высоким модальным классом хромосом.

Разработана промышленная технология получения вакцины против чумы плотоядных из штамма Рокборн на линии клеток 4647.

Разработана модельная технология изготовления вакцины против полиомиелита на основе псевдосуспензионного метода культивирования штаммов Сэбина типов I, II и П1 и клеток линии Vero в биореакторе.

Установлено, что при псевдосуспензионном культивировании штамма Софьин вируса клещевого энцефалита в клетках линии Vero происходит стабильно высокое накопление вирусного антигена в жидкой фазе культуры. Показана возможность получения не менее 4-х сборов вирусного урожая от одной культуры-продуцента до наступления деструкции клеточного пласта на частицах микроносителя.

Практическая значимость работы

Разработанный метод перфузионной трипсинизадии почек обезьян используется более 20 лет в ФГУП "ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН" для получения культур-продуцентов при изготовлении вакцин против полиомиелита и чумы плотоядных (Регламент производства №1019-00 Вакцина полиомиелитная пероральная 1,2,3 типов, Технические условия ТУ-080-64-19-23-95 Вакцина сухая культуральная против чумы плотоядных «Вакчум»). За этот период изготовлено и поставлено (в том числе и за рубеж) более 1,2 млрд. доз полиовакцины и около 200 млн. доз вакцины против чумы плотоядных (Справка ФГУП «ПИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН»). Метод защищен авторским свидетельством №914624,1982г.

Получена новая перевиваемая линия клеток селезенки зеленой мартышки - линия 455. Линия 455 используется в качестве клеточной модели при проведении практических занятий со студентами на кафедре ветеринарной

вирусологии Московской Государственной Академии ветеринарной медицины и биотехнологий им. К.И. Скрябина (Справка от 19.06.2003г.). Линия 455 защищена авторским свидетельством № 984214, 1982г., депонирована в коллекции клеточных культур Института вирусологии им. Д.И. Ивановского FAIÜH (коллекционный номер 45). •> ■ ' -

Созданы и аттестованы криобанки клеток линий 455; 4647 и Vero. Посевной' ' бйнк клеток линии 4647 и рабочий байк -Клеток линии • Vero сертифицированы ГЙСК им. Л.А.Тарасевича МЗ РФи; Комитетом МИБП МЗ РФ и рекомендованы к использованию в качестве субстратов для приготовления диагностических препаратов и производства ^профилактических МИБП (Выписка из протокола №9 3áceAáHH'# • Ученого совета ГИСК им. Л.А.Тарасевича МЗ РФ от 01.04.1986г., Выписка из йро¥окола №3- заседания Ученого совета ШСК им.Л.А.Тарасевйча МЗ РФ от 20.03.2003 г., Выписка из протокола №3 заседаний Комитета МИБП МЗ РФ от 22.05.2003г.).

Сертифицированная линия 4647 используется в качестве клеточного субстрата при производстве первой отечественной цельновирионной инак-тивированной вакцины против гепатита А «Геп-А-ин-ВАК» в ГНЦ ВБ «Вектор». За период 1998-2О03гг. выпущено более 350 тыс. доз вакцины (справка №15.I5-0Í.G3'Ot 19.02.2003г «Вектор-БиАльгам» ГНЦ ВБ «Вектор»), Линия 4647 утверждена в качестве клеточного субстрата для накопления и титрования вируса'чумы плотоядных (штамм Рокборн) при изготовлении вакцины против Чумы плотоядных «Вакчум» (ТУ-080-64-49-23-95 Вирусвакцина сухая культуралЬная против чумы Ьлотоядных«Вакчум»). - 1

Разработана и испытана промышленная технологий изготовления вакцины против чумы плотоядных на линии 4647. Подложен способ приготовления культуральной инактиви^ованной вакцины против клещевого энцефалита на линии 4647 (Патент №-96119607/13 (025958), 1997г.). :

Разработана модельная технология изготовления вакцины против полиомиелита из штаммов Сэбина типов I, II и Ш на клетках сертифицированного рабочего банка линии Vero с помощью псевдосуспензионного способа

культивирования. Показано, что данная технология обеспечивает получение препарата, полностью соответствующего требованиям к оральной полио-миелитной вакцине.

Разработана методика культивирования клеток линии Varo,и штамма Софьин вируса клещевого энцефалита в условиях псевдосуспензии,. обеспечивающая стабильно высокое накопление вирусного антигена в жидкой фазе культуры при проведении не менее 4-х сборов вирусного урожая.

Апробацш работы

Материалы работы были представлены на II Всесоюзной конференции по криобиологии и медицине (Харьков, 1984); на Международной научзарй конференции по актуальным проблемам медицинской вирусологии (Москва,1985); на II, III и IV Всесоюзных совещаниях "Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1985,1990, 1992); на юбилейной конференции, посвященной 85-летию Томского НИИ вакцин и сывороток (Томск, 1991); на научно-практической конференции "Природпо-очагодые болезни человека" (Омск, 1996); на 2-ой Международной' конференции,- посвящещной 100-летию Пермского НПО "Биомед" (Пермь, 1998); на Международной юбилейной конференции, посвященной 90-летию М.П.Чумакова (Москва, 1999).

По теме диссертации опубликовано 29 научных работ, в' том числе 2 монографии. Получено 6 авторских свидетельств и 2 патента.

Благодарности .

Выражаю искреннюю благодарность директору Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН академику РАМН С.Г.Дроздову и директору ФГУП «ПИПВЭ им. М.ПЛумакова РАМН» Г.А.Беловой за предоставленную возможность выполнения данной работы.

Особую благодарность выражаю моим научным консультантам д.м.н., профессору Любови Леонидовне Мироновой и д.б.н., профессору Виктору

Павловичу Грачеву за постоянную поддержку и искреннюю заинтересованность в результатах моей научной и производственной деятельности. '

Я искренне признателен сотрудникам ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН и ФГУП "ПИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН" д.м.н. Кармышевой В.Я., д.м.н. Тимофееву A.B., к.м.н. Алпатовой Г.А., к.б.н. Аксеновой Т.А., к.м.н. Дзагу-ровой Т.К., K.6.H. Каргановой Г.Г., к.м.н. Козлову В.Г., к.б.н. Орловой Т.М., к.б.н. Поповой В.Д., к.м.н. Соболеву С.Г., к.м.н. Стобёцкому В.И., Клеблее-вой Т.Д., Кондратьевой Я.Ю. за сотрудничество.

Искренне благодарен сотрудникам ГИСК им. ДА.Тарасевича МЗ РФ д.м.н. Шалуновой Н.В., д.б.н Ломановой Г.А., к.б.н. БердНиковой З.Е., к.б.н. Петручук Е.М., принимавшим участие в проведении совместных экспериментов по аттестации банков клеток линий 4647 и Vero.

2. Результаты и их обсуждение.

Все представленные данные основаны на результатах не менее чем трех независимых экспериментов.

2.1. Разработка способов перфузионной трипсинизации почек и селезенок

зеленых мартышек.

1

В ФГУП «ПИПВЭ им. М.П.Чумакова.РАМН» При изготовлении вакцин против полиомиелита и чумы плотоядных в качестве клеточного субстрата используют первичные культуры клеток почек зеленых мартышек. К моменту начала наших исследовании первичные' взвеси клеток почек обезьян получали с помощью метода дробной трипсинизации измельченных кусочков ткани (Миронова и др.,1978).' Нами были разработаны и экспериментально апробированы различные модификации перфузионной дезагрегации целого органа in situ и in vitro . В таблице 1 представлены полученные результаты.

Было установлено, что, регулируя время воздействия, скорость нагнетания растворов диспергентов и интенсивность последующей механической

обработки, можно управлять процессом дезагрегации и получать преимущественно либо, взвесь функциональных элементов (фрагменты почечных канальцев и клубочков), либо взвесь дискретных клеток.

Таблица 1. Сравнительные результаты дезагрегации почек зеленых мартышек различными способами перфузионной трипсингоации и методом дробной трипсинизации.

Метод дезагрегации Кол-во опытов Выход клеток на 1 г ткани (xl О6) Доля нежизнеспособных клеток (%)

Перфузия in situ

а) 0,02% р-р Версена (3-5 мин) - 14 84,3±7,2 16,Ш;4 ■ -'

0,25% р-р трипсина (5-7 мин) - 10%

сыворотка КРС (1 мин) -

перемешивание

б) 0,02% р-р Версена (3-5 мии) - • 16 272,5±18,7 20,2+3,7 '

0,25% р-р трипсина (10-12 мин) -

перемешивание

Перфузия in vitro

а) 0,02% р-р Версена (5-8 мин) - 20 420,3+19,6 ■»17,1*2,0 ■

0,25% р-р трипсина (7-12 мин) -

перемешивание

6) 0,02% р-р Версена (5-8 мин)- 50 570,0±26,2 5,3+0,7 ^

0,25% р-р трипсина + 0,01% р-р

химопсина (7-12 мин)-встряхивание •* К. . '> />

Дробная тринсиншання 100 304,3±19,4 ,. , 30,112,6 ,,

(контроль)

За счет тотального воздействия диспергентов на всю паренхиму органа удалось полностью исключить ряд трудоемких и травмирующих клетки процедур, существенно сократить время дезагрегации и повысить выход клеток из 1 г ткани до (570,0 ±26,2)х106 (доля нежизнеспособных клеток

(5,3 ±0,7)%). Свежеизолированные клетки обладали высокими ростовыми потенциями и стабильно формировали мойослбй при посевной дозе (25-З5)х103 кл./мл на 6-7 сутки культивирования. Прймененке перфузионного способа дезагрегации позволило в 4-5 раз увеличить выход производственной партии культуры-пррдуцента и объем вирусной суспензии, получаемых из 1-ой пары почек животных, при изготовлении вакцин против полиомиелита и чумы плотоядных по сравнению с дробной трипсинизацией измельченных кусочков ткани (таблица 2).

Таблица 2. Результаты использования различных методов триысинизации почек обезьян для получения первичных культур клеток.

Метод трипсинизации Кол-во МК* на 1 г ткани' Инкубиро ванне (сутки) Титр вируса в БОЕ/мл (в 1§)

Полиомиелита вчп«* '> (

Б!** вп вга

Перфузионная трипсинизадия 35-40 6-7 7,8+0,2 7,7±0,3 7,9±0,1 5,0±0,1

Дробная трипсинизадия 7-8 7-8 7,6±0,3 7,7+0,2 7,8±0,1 5,0±0,1

Примечание: * - МК ~ 1,5-л матрасные колбы, ** - 57, 57/, БШ -штаммы Сэбина вируса полиомиелита, *** - ВЧП - вирус чумы плотоядных (штамм Рокборн).

Такое существенное увеличение объемов вирусных суспензий является экономически целесообразным только в том случае, если клеточный субстрат не контаминирован посторонними агентами. В рамках существующих технологий изготовления вирусных вакцин на первичных культурах клеток в подавляющем большинстве случаев контаминация может быть установлена только после заражения культур-продуцентов вакцинными вирусами и сбора вируссодержащих жидкостей.

Нами предложена методика, позволяющая проводить тестирование первичных взвесей клеток на контаминацию посторонними агентами до заклад-

ки производственных партий культур. В результате исследований было установлено, что первично-трипсинизированные клетки почек обезьян, полученные с помощью перфузионной трипсинизации, успешно выдерживают криоконсервирование в жидком азоте. Доля жизнеспособных клеток составляла ~ 70% после восстановления их через 21-90 суток. Первичные культу' ■ ^ 5 !1

ры, приготовленные как из свежеполученных, так и подвергнутых криокон-сервированию клеточных взвесей, формировали монослой в сроки, предусмотренные нормативно-технической документацией, не отличались по клеточному составу и по чувствительности к вакцинным штаммам Сэбина вируса полиомиелита (таблица 3).

Таблица 3. Сравнительная характеристика первичных культур, приготовленных из взвесей первично-трипсинизированных клеток почек зеленых мартышек на разных сроках криоконсервации.

Сроки Кол-во Доля жизнеспособных Посевная Формиро Титр вируса

хранения опытов клеток (в %) доза клеток вание полиомиелита

(су) (хЮ3) монослоя (суг) (в БОЕ/мл)

0 13 80,1 ±2,2 100-120 6-8 7,80 ± 0,20

21 6 70,3 ±1,7* 68,7 ±2,8** 130-150 7-8 7,73 ±0,16

90 7 71,0 ±2,4 69,6 ±1,9 130-150 7-8 7,76 ±0,12

Примечание: концентрация клеток в криоконсервированных взвесях: (*) -5x10? кл./мл; (**) — 10x10? кл./мл. В качестве криопротектора использовали глицерин или диметилсулъфоксйд в конечной концентрации 10%. Множественность заражения клеток вирусом во всех опытах составляла 0,02 БОЕ/клетка.

г Г ' '

Таким образом, использование криоконсервированных первичных взвесей клеток почек обезьян для получения культур-продуцентов может обеспечить ряд преимуществ при производстве вакцин против полиомиелита и чумы плотоядных, а именно:

а) проводить предварительное тестирование криоконсервированных взвесей на контаминацию посторонними агентами до закладки производственных партий культур. В качестве тест-системы выступают первичные культуры, "приготовленные из образцов этих взвесей;

б) создать из неконтаминированных клеточных пулов своего рода «рабочие ¿анки первично-трипсинизировашшх клеток ''

в) получать из таких «банков» необходимые количества кондиционных производственных партий культур-продуцентов в планируемые сроки й существенно сократить объемы выбракованных из-за контаминации посторонними агентами полуфабрикатов вакцин;

г) проводить масовый забой животных после окончания срока карантина и тем самым снизить вероятность распространения инфекций внутри колоний животных, а также сократить расходы, связанные с их. содержанием. „

Следующий этап исследований был посвящен разработке перфузион-ной трипсинизации селезенок обезьян. По аналогии с перфузионной трипси-низацией почек в первой серии экспериментов растворы диспергентов (0,02%-ный раствор Версена и смесь, содержащая 0,25%-ный раствор трипсина и 0,01% -ный раствор химопсина) вводилй через селезеночную артерию. Однако в силу особенностей кровеносной системы селезенки - наличие значительного количества ответвлений от селезеночной артерии до вступления в паренхиму органа - перфузия осуществлялась неудовлетворительно. Наиболее эффективной оказалась перфузионная трипсинизация ¿елезенок, при которой растворы диспергентов последовательно вводили непосредственно в устья сегментарных артерий. После окончания перфузии проводили несколько надрезов селезеночной капсулы и размешивали орган на магнитной мешалке. Полученную клеточную взвесь центрифугировали при 600 об./мин (3 мин), осадок ресуспендировали в 0,83%-ном растворе ЫН4С1 и инкубировали при +4°С (5 мин). Затем взвесь вновь центрифугировали. Полученный осадок ресуспендировали и готовили посадочную взвесь с концентрацией (З00-400)х103 кл./мл.

Клеточные взвеси, полученные с помощью дробной трипсинизации,

i ,

рассевали с такой же посевной дозой.

Процент успешных эксплантаций клеточных взвесей, полученных с помощью перфузионной трипсинизации, составлял 65,2%. При использовании дробной трипсинизации измельченных кусочков ткани ни в одном случае не было получено первичных культур клеток селезенок обезьян даже'при увеличении сроков инкубирования до 23-25 суток. '" • '!/,,

В процессе субкультивирования первичных культур клеток1 селезенок зеленых мартышек удалось получить новую перевиваемую линию клеток -линию 4551 "

2.2. Создание и аттестация посевных и рабочих банков перевиваемых линий клеток обезьян.

Разрешение ВОЗ на использование в качестве клеточных субстратов перевиваемых линий клеток при получении медицинских иммунобиологи-

• т * i \ i

ческих препаратов открыло хорошие перспективы для дальнейшего совер-шенствоания технологий производства культуральных вирусных вакцин. Как и в случае линий диплоидных клеток, использование перевиваемых линий основано на системе аттестованных посевных и рабочих банков клеток.

Нами были приготовлены и аттестованы криобанки 3-х перевиваемых линий клеток зеленых мартышек - линии 455, линии 4647 и линии Vero на 45, 90 и 139 уровнях пассажей соответственно. Банки клеток были обследованы в полном соответствии с Методическими указаниями МЗ РФ по аттестации перевиваемых линий клеток [М.,1989] и Требованиями ВОЗ к клеточным субстратам, применяемым при производстве медицинских иммунобиологических препаратов [WHO TRS №747,1987, WHO TRS №800,1990].

В ходе комплексных исследований, проведенных совместно с сотрудниками разных лабораторий ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН и ОБТК ФГУП

«ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», были установлены основные характеристики клеток банков этих линий.

Показано, что клетки линий 455, 4647 и Vero обладают высокой пролиферативной активностью при выращивании на отечественных

питательных средах, обогащенных 5-10% сыворотки крупного' рогатого

j ,

скота. Формирование монослоя происходит на 3-е - 4-е сутки культивирования при посевной дозе (30-50)х103 iol/cm2. Максимальный урожай ¿лёток на разных уровнях пассажей практически не изменяется и составляет для линии 455 (110,3±4,7)х103 кл./см2 и (120,1±3,4)х103 юь/см2, для линии 4647 -(125,2±6,9)х103 кл./см2 и (137,4+7,8)х103 кл./см2, для линии Vero -(170,2±6,4)х103 кл./см2 и (200,5±7,2)х103 кл./см2 соответственно при стационарном и роллерном способах культивирования. Данные, полученные при культивировании клеток на микроносителях, приведены в разделе 2.4.

Клеточный слой линии 4647 сохраняется на стекле без смены культу-ральной жидкости до 2 месяцев, а под агаровым покрытием - до 1 месяца. Для линии 455 аналогичные показатели составляют 1 месяц и 20 суток.

' "При гистологическом изучении линий 4647 и 455 на разных уровнях пассажей установлено', что клеточные пласты состоят из полигональных эшггелиоподббйых' клеток. На фоне однородной популяции встречаются небольшие вкрапления вытянутых веретеновидных клеток.

Кариологический анализ клеток банков линий'4647, 455 и Vero, проведенный соответственно на 90-130, 45-90 и 136-151 пассажах, показал, что модальное число хромосом оставалось постоянным и составляло для линии 4647 120 (46,0%), для линии 455 - 110 (56,4%), для линии Vero - 58 (36,0%).

При дифференциальном окрашивании AgN03 установлено значительное различие в степени импрегнации серебром ядрышкообразующих районов (ЯОР) маркерных хромосом клеток линий 455,4647 и Vero. В клетках с диплоидным и околодиплоидным набором хромосом одна из маркерных

хромосом (средняя субтелоцентрическая хромосома с вторичной перетяжкой в длинном плече) имела незначительные и не всегда прокрашиваемые районы образования ядрышка, в то время как у второй хромосомы этот район был обозначен крупным преципитатом серебра.

В гиперплоидных клетках линий 455, 4647 и Vero окрашивание ЯОР в одной паре гомологичных хромосом было интенсивным, во второй - слабо выраженным.

Выявленные особенности ядрышкообразующих хромосом являются четкими маркерами и могут быть использованы для проведения тестирования культур клеток зеленых мартышек на идентичность.

В образцах культуральных жидкостей, взятых при пассировании клеток банков линий 455,4647 и Vero и высеянных в соответствующие селективные среды, бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.

Контаминация клеток банков микоплазмами не выявлена ни в одном из препаратов, обследованных электронномикроскопически или окрашенных флуоресцентным красителем Hoechst-33258.

Тесты на наличие вирусов-контаминантов в клетках банков всех трех линий были проведены с использованием как взвесей живых клеток, так и культуралыадх жидкостей на первичных культурах клеток почек зеленых мартышек и кроликов, линии диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М-22. Присутствия цитопатогенных или гемадсорбирующих вирусов не выявлено.

Инфекционные агенты не обнаружены также при введении 9успензий клеток морским свинкам, кроликам, взрослым особям и сосункам белых мышей, а также куриным эмбрионам.

Наличие онкогенных потенций у клеток посевных банков линий 455 и 4647 исследовали в системе in vivo на иммуносупрессированных мышах линии СВА и в системе in vitro в органной культуре кожи 9-дневных

куриных эмбрионов. Ни у одного животного в опытных группах не наблюдали образования опухолей. Также не выявлено инвазирующего роста клеток линий 455 и 4647 в органных культурах.

При культивировании в полужидком агаре не отмечен рост клеток линий 455 и 4647 (срок наблюдения 35 суток).

В связи с тем, что рабочий банк клеток линии Vero был приготовлен нами из клеточной взвеси ампулы посевного банка Vero ВОЗ, тестирование клеток на туморогенность не проводили.

Культуры, приготовленные из банков клеток линий 455 и 4647, оказались высокочувствительными к различным, РНК- и ДНК-содержащим вирусам, в том числе и к вакцинным штаммам вирусов полиомиелита, клещевого энцефалита, желтой лихорадки, бешенства, кори и чумы плотоядных.

Из клеток посевного банка линии 4647 90-го пассажа были приготовлены три рабочих банка культуры: на 95-ом , 100-ом и 110-ом уровнях пассажей. Эти банки также были аттестованы согласно требованиям ВОЗ и полностью им соответствовали.

Как отмечалось выше, применение перевиваемых линий клеток для производства иммунобиологических препаратов основано на системе аттестованных посевных и рабочих банков клеток. Криоконсервирование в жидком азоте является единственным средством длительного сохранения аттестованного посевного материала. В таблице 4 приведены результаты длительного хранения клеток банков линий 455,4647 и Vero в жидком азоте.

Как видно из данных таблицы 4, в клеточных взвесях банков линий 455, 4647 и Vero доля жизнеспособных клеток постепенно снижается с увеличением сроков криоконсервации. Тем не менее, этот показатель остается достаточно высоким даже после 15 лет хранения и составляет ~70% для банков клеток линий 455 и 4647. Отсутствие данных для линии клеток Vero на дли-

тельных сроках криоконсервирования обусловлено тем, что рабочий банк клеток был приготовлен в 1999 г.

Таблица 4. Результаты криоконсервирования клеток банков линий 455 (45 пассаж), 4647 (90 пассаж) и Уего (139 пассаж) в жидком азоте.

Сроки Доля жизнеспособных клеток после Время формирования монослоя

хране- восстановления (%) (сутки)

ния линия 455 линия 4647 линия Vero линия 455 линия 4647 линия Vero

5сут 92,1±2,7 82,3+3.4 83,413,2 5-7 6-9 8-10

3 мес 88,3+3,1 80,114,2 84,013,5 5-7 8-10 8-10

1 год 87,7±2,4 81,3±3,8 82,613,1 6-8 8-10 8-10

3 года - 80,114,0 - - 8-12

5 лет 84,613,5 76,5±4,1 - 7-9 8-10 -

10 лет 82,212,3 71,8±3,3 - 7-10 7-9 -

15 лег 74,4±3,6 69,415,3 - 7-10 8-10 -

Примечание: * - нет данных.

Следует также отметить, что клетки банков всех трех линий, восстановленные на разных сроках криоконсервации, стабильно формируют монослойные культуры и сохраняют высокую чувствительность к вакцинным штаммам вирусов (таблица 5, разделы 2.3,2.4).

Посевной банк клеток линии 4647 на уровне 90 пассажа и рабочий банк клеток линии Vero на уровне 139 пассажа лицензированы ГИСК им. JI.A. Тарасевича МЗ РФ и Комитетом по МИБП МЗ РФ. Культуры, приготовленные из клеток этих банков, разрешены для использования при производстве медицинских иммунобиологических препаратов, в том числе и вирусных вакцир.

Таблица 5. Накопление вирусов полиомиелита (штаммы А.Сэбина типов I, II и Ш) на культурах клеток линий 455, 4647 и Vero, приготовленных из криобанков клеток.

Тип вируса, титр вируса (в lg БОЕ/мл)

Культура SI SII 8Ш

Линия 455

1 год* 7,4 ±0,1 7,3 ±0,1 ' 7,6 ±0,2

5 лет 7,6 ±02 7,4 ±0,1 7,5 ±0,2

10 лет 7,5 ±0,1 7,6 ±0,1 7,3 ±0,2

15 лет 7,5 ±0,2 7,4 ±0,2 7,4 ±0,2

Линия 4647

1 ГОД 7,7 ±0,2 7,5 ±0,2 7,5 ±0,1

5 лет 7,6 ±0,2 7,4 ±0,2 7,3 ±0,2

10 лет 7,8 ±0,2 7,4 ±0,2 7,4 ±0,2

15 лет 7,6 ±0,2 7,3 ±0,2 7,6 ±0,2

Линия Vero

5 сут 8,4 ±0,2 8,2 ±0,2 8,2 ±0,2

3 мес 8,3 ±0,2 8,1 ±0,2 8,3 ±0,2

1 год 8,3 ±0,2 8,4 ±0,2 8,1 ±0,2

3 года 8,4 ±0,2 8,3 ±0,2 8,2 ±0,2

Примечание: * - сроки хранения криобанков клеток, из которых приготовлены культуры, в жидком азоте. Множественность заражения клеток всех трех культур вирусами полиомиелита составляла 0,02 БОЕ/клетка.

2.3. Экспериментальные разработки по применению линии клеток 4647 для получения противовирусных препаратов. При аттестации посевного банка клеток линии 4647 (90 пассаж) было

г - ' . >

показано, что вакцинные штаммы вирусов полиомиелита (штаммы Сэбина типов I, П и III), клещевого энцефалита (штамм Софьин), бешенства (штамм Внуково-32), чумы плотоядных (штамм Рокборн) накапливаются в высоких титрах в жидкой фазе культуры. Эти данные послужили основанием для изучения возможности использования сертифицированной линии 4647 в качестве альтернативы первичным культурам клеток животных при получении соответствующих противовирусных препаратов.

2.3.1. Разработки по созданию вакцины против полиомиелита. Культивирование клеток и вирусов проводили в стационарных условиях. Клетки выращивали на среде Игла MEM с 5% сыворотки крупного рогатого скота, в качестве среды поддержки применяли 0,5%-ный гидролизат лакгальбумина на растворе Эрла (рН 7,6). Для заражения использовали посевные штаммы вируса, приготовленные на первичных культурах клеток I- почек зеленых мартышек, в дозе . 0,1 БОЕ/клетка. Сбор вируссодержащей жидкости проводили после наступления полной деструкции клеточного пласта .(2-е - 3-е сутки инкубирования). Результаты титрования полученных экспериментальных серий вакцин приведены в таблице 6.,,

Все серии моновакцин были отконтролированы в ¿голном соответствии с регламентными контролями для оральной полиомиелитной вакцины, включая и тест на нейровирулентность на обезьянах. По всем характеристикам они не отличались от серий вакцин, приготовленных на первичных культурах клеток почек зеленых мартышек в производственных условиях.

Таблица 6. Результаты титрования экспериментальных серий вакцины из штаммов А.Сэбина вируса полиомиелита, выращенного на культуре адгеток линии 4647. .

Серия ОПВ* Пассаж клеток Тип вируса Титр вируса (в lg БОЕ/мл) I

1 123 SI . 7,7+0,1 7,б±0,1**

2 . 126 SII - 7,5±0,2 7;5±0,2

3 122 S III • 7,7±0,2 7,5±0,2

Примечание: *— ОПВ — оральная полиомиелитная вакцина, ** - титрование проведено в ОБТК ФГУП «ПИПВЭ им. МЛ. Чумакова РАМН»

2.3.2. Разработки по созданию вакцины против клещевого энцефалита.

Была изучена возможность использования культур клеток, приготовленных из лицензированного банка линии 4647, для наработки культураль-ного антигена и создания на его основе экспериментальных серий вакцины клещевого энцефалита.

Для заражения использовали штамм Софьин вируса клещевого энцефалита в виде 10% или 50% мозговой суспензии мышей с титром 9,0-9,5 ^ БОЕ/мл. Культивирование клеток и вируса проводили в роллерных бутылях при 37°С.

Было установлено, что продуктивная вирусная инфекция в культуре 4647, в отличие от первичной культуры клеток эмбрионов кур, развивалась только при высокой заражающей дозе вируса - свыше 10 БОЕ/клетка. Максимальное накопление вируса в жидкой фазе культуры наступало на 4-е сутки инкубирования и составляло 8,0-8,5 ^ БОЕ/мл. В связи с тем, что вирус не оказывал выраженного цитопатогенного действия, удавалось получать от 4-х до ;6-ти сборов вируссодержащей жидкости от одной культуры-продуцента без снижения титра вируса.

Особое внимание было уделено очистке вирусных сборов от клеточной ДНК. Наиболее технологичной и эффективной оказалась обработка вирусных взвесей протаминсульфатом (5 мг/мл) с последующей гельхроматогра-фией.

Таблица 7. Характеристика экспериментальных серий вакцины против клещевого энцефалита, полученных на линии клеток 4647.

№№ серий- Протекгив- ная активность 1 МИДзо (в мл) Показатели очистки Безвредность для мышей и морских свинок Контаминация

Белок мкг/ доза БСА мкг/ доза Клет. ДНК пг/доза бактериями мико-шгазмами вирусами

1 0,008 3 <0,5 2,7 безвред. нет нет нет

2 0,009 5 £0,5 2,0 безвред нет нет негг

3 0,006 8 <0,5 7,7 безвред нет нет нет

Примечание: МИД$о - минимальная иммунизирующая доза для мышей (в мл), которая защищает 50% животных от 100-1000 ЛДьо вируса клещевого энцефалита (штамм Абсеттаров); БСА - бычий сывороточный альбумин.

Как видно из данных таблицы 7, экспериментальные серии препарата высокоиммуногенны по стандартному лабораторному критерию - протек-тивной активности для мышей, обладают удовлетворительными характеристиками очистки от примесных материалов, в том числе и от клеточной ДНК, и соответствуют отечественным и международным требованиям по необходимым лабораторным критериям безвредности препарата для людей.

2.3.3. Разработки по созданию вакцины против чумы плотоядных.

Исследования по созданию вакцины против чумы плотоядных на линии

-1 л ,

4647 проводили с использованием штамма Рокборн. Было показано, что вакцинный вирус способен размножаться в культуре без проведения этапа предварительной адсорбции. При этом цитопатические изменения в зараженных обоими способами культурах проявлялись в одни и те же сроки.

В ходе экспериментов были установлены оптимальные условия наработки вирусной биомассы, а именно: множественность заражения культуры штаммом Рокборн, состав среды поддержки, время проведения сбора вирус-содержащей жидкости, состав агарового покрытия для проведения титрования вируса на клетках линии 4647.

На основании полученных результатов была разработана промышленная технология получения вакцины против чумы плотоядных на культурах, приготовленных из банка посевных клеток линии 4647.

С целью оптимизации этапа получения культур-продуцентов стационарное культивирование в матрасных колбах было дополнено однократным пассированием клеток в роллерах. Наиболее технологичными оказались 3,0-литровые роллеры с площадью ростовой поверхности -1100 см2. Комбинированное применение стационарного и роллерного способов культивирования позволяло получать из клеточной взвеси одной ампулы посевного банка партию культуры в количестве 500 матрасных колб в ходе 7-ми серийных пассажей.

Полученные по этой схеме производственные партии культур заражали вирусом в дозе 0,03 БОЕ/клетка. В качестве среды поддержки использовали смесь (1:1) среды Игла и 0,5%-го гидролизата лактальбумина на растворе Эрла с 5% аминопептида. Полное поражение клеточного пласта наступало на 10-12 сутки культивирования.

Некоторые серии аминопептида в концентрации 5% оказывали токсическое действие на клетки. Было установлено, что токсикоз культуры в таких случаях можно снизить или практически полностью устранить путем снижения концентрации аминопептида до 2%, а оставшееся количеству (до 5%) вносить непосредственно в вирусные сборы.

Вирус накапливался в жидкой фазе культуры в титре 4,9-5,4 lg БОЕ/мл. Нитрование проводили на культуре 4647.

С, использованием разработанной технологии были приготовлены 2 крупные партии вакцины в количестве 700 тыс. доз и 5 млн. доз, которые полностью соответствовали требованиям к вакцине против чумы плотоядных.

2.3.4. Культивирование вакцинных штаммов вируса бешенства.

Исследования проводили с 3-мя вариантами штамма Внуково-32 вируса бешенства: Внуково-32-35; Внуково-32-105 и Внуково-32-177 (цифры 35, 105 и 177 показывают число серийных пассажей, которые штамм Внуково-32 прошел в первичной культуре клеток почек сирийских хомячков). В случае варианта Внуково-32-35 максимальное накопление вируса было отмечено после 6-ти серийных пассажей, в случае варианта Внуково-32-105 - после 7, Внуково-32-177 - после 9-ти пассажей. Титры вирусов составляли 9,0; 7,7 и 7,0 lg ЛД50/МЛ соответственно.

Адаптированные к клеткам линии 4647 варианты вируса бешенства имели выраженную иммуногенную активность. Максимальные индексы им-муногенности - 22 МЕ - были получены для варианта Внуково-32-35, минимальные - 3,5 МЕ - для варианта Внуково-32-177.

Следует особо отметить, что сертифицированная линия 4647 используется в качестве клеточного субстрата при производстве отечественной цель-новирионной инаюгивированной культуральной вакцины против гепатита А "Геп-А-ин-ВАК" в ГНЦ ВБ "Вектор". За период с 1998 г по 2003 г выпущено более 350 тыс. доз вакцины.

2.4. Разработка технологии выращивания культур клеток в условиях' псевдосуспензии на микроносителях.

2.4. ¡.Культивирование клеток линии 4647 в условиях псевдосуспензии., ,

В ходе аттестации посевного банка клеток линии 4647 (90 пасбаж) нами была изучена возможность культивирования клеток в условиях псевдосуспензии. В задачи эксперимента также входило проведение лабораторных испытаний отечественных опытных образцов спиннеров Биотех-М (г. Москва), биореактора Фермус-4 (г.Н.Новгород) и микроносителя ЦитопоЛ-92 (НИИОЧП, г.Санкт-Петербург). В качестве контролей были использованы спиннеры Techne (Великобритания), биореактор Celligen (США) и микроноситель Цитодекс-3 (Швеция). ' ■ '>

1

Взвесь клеток и микроносителей вносили в культуральные сосуда в конечном объеме питательной среды - Игла MEM с 5% сыворотки крупного рогатого скота. В течение первых 4-6 часов культивирования перемешивание суспензии проводили в импульсном режиме: 2 минуты - перемешивание - 15-20 минут - покой. Дальнейшее культивирование проводили при постоянном перемешивании. Начиная с 4-х суток, проводили частичную (1/2 объема/сутки) замену среды роста на свежую среду. Полученные результаты

. \

приведены в таблице 8.

Как видно из данных таблицы 8, максимально высокая концентрация клеток была получена при выращивании их на микроносителе Цитодекс-3 (3 г/л) в биореакторе Celligen - (821,8+17,3)х103 кл./мл. При культивировании на микроносителе Цитопол-92 (2 г/л) в биореакторе Фермус-4 концентрация

клеток была самой низкой и составляла всего (590,4+17,6)х103 кл./мл. Как в спиннерах, так и в биореакторах размножение клеток на микроносителе Цитодекс-3 было более эффективным по сравнению с микроносителем Цитопол-92. Из-за сильной гетерогенности частиц микроносителя Цитопол-92 по размерам происходило неравномерное распределение клеток по частицам на начальном этапе культивирования. Кроме того, спиннеры Биотех-М и, особенно, биореактор Фермус-4 значительно уступали по своим техническим возможностям зарубежным аналогам.

Таблица 8. Результаты культивирования клеток линии 4647 в условиях псевдосуспензий в различных культиваторах на микроносителях Цито-декс-3 и Цитопол-92

Культиватор МН, концентрация (Г/л) Посевная доза клеток в мл (Х103) Концентрация клеток в мл (х10У Индекс пролиферации

Techne Цитодекс-3 1 2 Цитопол-92 2 100 150 150 641,2±17,б 720,3+19,5 583,4+22,4 6,4±0Д 4,8+0,1 3,9±0,1

Биотех-М Цитодекс-3 2 Цитопол-92 2 150 150, 660,3±21,1 . 564,2±18,3 4,4±0Д 3,8±0,1

Фермус-4*) Цигодекс-3 1 2 Цитопол-92 1 2 100 150 100 150 580,0±27,4 706,2±32,1 546,б±35,7 590,4+17,6 5,8±0,3 4,7±0Д 5,5±0,3 3,9+0,1

Celligen**) Цитодекс-3 2 3 150 200 784,6±24,6 821,8±17,3 5,2±0,2 4,1±0,2

Примечание: " л " - учет результатов проведен на 7 сутки культивирования; " * " - параметры культивирования: рН 7,0-7,2; ВО 45-55 (%); температура (36,5-37,5)°С; число оборотов мешалки 20 об./мин; " ** " - параметры культивирования: рН 7,2; ИО 30%; температура 37° С; число оборотов импеллера -50 об./мин.

2.4.2. Псевдосуспензионное культивирование клеток линии Vero Для отработки псевдосуспензионного метода культивирования клеток линии Уёго были испытаны различные типы микроносителей, режимы и параметры Культивирования в спиннерах и биореакторах. В качестве микроносителя использовали Цитодекс-1, Цитодекс-2, Цитодекс-3 (Pharmacia, Швеция), Цитопол-82, Цитопол-92 (НИИОЧП, г.Санкт-Петербург) , G-2767 (Sigma). Культивирование проводили в спиннерах Techne (Великобритания), Cellspin (Германия) и биореакторе Celligen Plus (New BrunswicÍc,CÜIÁ).

Испытанные режимы культивирования клеток линии Vero в условиях псевдосуспензии приведены в таблице 9.

Таблица 9. Результаты культивирования клеток линии Vero на микроносителе Цитодекс-1 (1г/л) в спиннерах Techne при различных начальных режимах перемешивания псевдосуспензии*.

Режим перемешивания Посевная доза (х103кл/мл) Эффективность посева (%) Урожай клеток в мл (xlO3) Индекс пролиферации

Режим 1 Постоянное перемешивание конечного объема псевдосуспензии 100 200 62,513,4 69,112,6 687,1132,7 723,8121,3 6,9ЮД 3,610,2

Режим 2. Импульсное перемешивание конечного объема псевдосустгензии 100 200 76,7+3,6 79,312,9 818,4137,4 886,3127,1 8,210,3 4,4+0,2

Режим 3. Импульсное перемешивание 1/3 конечного объема псевдосуспензии 100 ' ' 200 90,412,6 86,111,3 1285,4147,3 1082,6159,8 12,8+0,6 5,4ЮД ■

Примечание: * - среда роста - Игла MEM с 5% сыворотки крупного рогатого скота. Полная однократная замена среды роста на свежую среду -через 96 часов после начала культивирования. Учет результатов проведен на 7-е сутки культивирования.

При использовании посевной дозы клеток 100x103 кл./мл и выращивании их в режиме 3 были получены максимальные значения показателей эффективности посева клеток, концентрации клеток и индекса пролиферации культуры - (90,4±2,6)%, (1285,4±47,3)х106 кл./мл и 12,8±0,6 соответственно.

На втором этапе эксперимента изучали влияние концентрации микроносителя Цитодекс-1 на конечную плотность культуры. Культивирование клеток проводили в спиннерах с рабочим объемом 250 мл по режиму 3. Использование микроносителя Цитодекс-1 в концентрации 2 г/л и посевной дозы клеток линии Vero 200х103 кл./мл обеспечивали стабильное получение культур с высокой плотностью клеток при сохранении достаточно высокого индекса пролиферации—1,6х10бкл./мл и ~8,0 соответственно (таблица 10).

Следующий раздел работы был посвящен отработке методики серийного пассирования клеток линии Vero в условиях псевдосуспензии.

Эксперименты проводили в спиннерах Techne с рабочими объемами 0,25 и 1,5 л на микроносителе Цитодекс-1. После формирования монослоя клеток на частицах микроносителя в спиннерах малого объема культураль-ную жидкость удаляли, осадок микроносителя с клетками отмывали от сыворотки крупного рогатого скота раствором Версена. Затем вносили раствор трипсина и перемешивали в течение 10 мин. Супернатант с отслоившимися клетками отбирали в колбу, содержащую среду Игла MEM с 50% сыворотки крупного рогатого скота. Осадок микроносителя с неотслоившимися клетками заливали средой Игла MEM без сыворотки и перемешивали в течение t 10 мин. Супернатант отбирали в колбу для сбора урожая. Процедуру повторяли еще раз. Доля собранных клеток составляла 82,4±3,8 (%) от количества клеток в исходной псевдосуспензии.

Для последующего субкультивирования клеток посевную дозу увеличивали до ~ (220-250)х103 кл./мл. Клетки культивировали в течение 7 суток. Урожай в одном 1,5 л спиннере составлял (2,15 ±0,26) хЮ9 клеток (концентрация клеток-(1,43± 0,20) хЮ6 кл./мл). .

Разработанную методику пассирования клеток использовали для культивирования клеток линии Vero в биореакторе Celligen Plus (рабочий объем 10 л) на микроносителях Цитодекс-1 и Цигодекс-3.

Клеточную взвесь, собранную из двух 1,5-литровых спиннеров Techne, распределяли поровну между двумя колбами, содержащими по 10 г микроносителя. Доводили объем среды в колбах до 1,5л и помещали на 37°С. Содержание сыворотки крупного рогатого скота в среде составляло 10%. В течение 4-S часов взвесь микроносителя и клеток перемешивали в импульсном режиме как описано выше. Параллельно реактор подготавливали к работе: вносили 7'л среды роста и устанавливали параметры культивирования: рН7,2, D060%, температура 37°С, скорость вращения импеллера 40 об./мин.

Таблица 10. Результаты культивирования клемме лтши Vero on различных тинах микроносителей в спиннерах Techne.*

Тип МН, концентрация Сг/л) Посевная доза клеток (хЮ5 кл./мл) Эффективность посева (%) Урожай клеток вмл^Ш6) Индекс пролиферации

Цитодекс-1 1 2 3 100 200 300 90,4±2,6 92,Ш,3 92,6±2,4 1,30±0,05 1,5810,06 1,76±0,06 12,8 ±0,6 7,9±0,3 5,9+0,2

Цитодекс-2 2 . 200 84,4+3,3 1^0+0,03 1 . ' 5,9+0,2

Цитодекс-3 2 200 94,Of 1,2 1,65±0,04 8,2±0,2

Цитопол-82 2 200 63Д±1,4 0,79±0,03 3,9±0,1

Цитопол-92 2 200 67,9±2,1' 0,84±0,03 ' ' 4Д±0,1 -

Стеклянный МН G-2767 10 15 25 200 200 200 78,3±3,3 80,2±4,1 67,4±5,2 0,79±0,03 0,83±0,04 0,68db0,03 ' vi' V,' . 3,9±0,1 4,1±0,2 ' 3,4±0,1

Примечание: * - среда роста - Игла MEM с 5% сыворотки крупного рогатого скота. Однократная полная замена среды роста на свежую среду — через 96 часов после начала инкубирования. Учет результатов проведен на 7-е сутки культивирования.

После завершения адгезии клеток к частицам микроносителя суспензию переносили в реактор и Доводили конечный объем среды до 10 л. Культивирование проводили в течение 7 суток с двухкратной частичной заменой среды роста (4-е и 6-е сутки инкубирования) на свежую среду. Полученные результаты приведены в таблице 11. '

Таблица 11. Результаты культивирования клеток линии Vero на микроносителях Цитодекс-1 и Цитодекс-3 в биореакторе CelHgen Pins*.

Тип МН Посевная доза (хМЯт/мл) Концентрация клеток в мл (хЮ6) Индекс пролиферации i 1

Цитодекс-1 ■ 2 г/л 200 1,48+0,10 7,4±0,5

Цитодекс-3 ъййя,.- Í- ,:г. •..,•200..... 1,55±0,15 7,7±0,3

Примечание; * - среда роста - Игла MEM с 5% сыворотки крупного рогатого скота. Частичная двукратная замена среды роста на свежую (по 4л) на 4-е и 6-е сутки культивирования. Учет результатов проведен на 7-е сутки культивирования.

После завершения культивирования культуральную жидкость удаляли, осадок отмывали питательной средой, затем переносили в 1,5 л колбу Techne. Отделение клеток от частиц микроносителей и сбор отслоившихся клеток проводили по методике, описанной выше. Урожай клеток составлял ~ 12x10® клеток, доля жизнеспособных клеток - 81,2+0,4 (%). Этого количества клеток достаточно для засева одного биореактора с рабочим объемом культурального сосуда 50 л или 30-35 спиннеров Techne с рабочим объемом 1,5 л с посевной дозой 200-250 х103 кл./мл.

Экспериментально показано, что предложенная методика серийного пассирования клеток линии Vero на микроносителях Цитодекс-1 и Цитодекс-3 может быть использована для наработки клеточной биомассы в промышленных масштабах как в биореакторах, так и в спиннерах. ,

Йа рис.2 приведена схема получения культуры-продуцента в спиннерах или биореакторах на микроносителе Цитодекс-1. Этапы 1-8 этой схемы экспериментально отработаны для получения культуры-продуцента в спиннерах; этапы 8-9 для получения культуры-продуцента в биореакторах могут быть выполнены при наличии соответствующего оборудования.

Рис.2. Технологическая схема наработки культуры-продуцента линии Vero в спиннерах или биореакторах на микроносителе Цитодекс-1.

1. 1 ампула банка Vero t KI -1 -И1 Í ' . ' . 1 ' ' 139 пассаж

2. 0,5 л флакон Шотта 140 пассаж

3. ,-1МК* ' ..<:•■> ■ 141 пассаж

4. 4 МК 142, пассаж

5. 12 МК 143 пассаж

6. 2 спиннера (1,5л)** ' 144 пассаж

7. Celligen Plus*** (Юл) или 8 спиннеров (1,5л) 145 пассаж

8. Celligen Plus (50л) или 30-35 спиннеров (1,5л) [культура-продуцент] 146 пассаж

9. Celligen Plus (50л) [культура-продуцент! 147 пассаж

Примечание: * - МК- 1,5 л матрасные колбы, ** - сттнеры с рабочим объемом 1,5 л, *** - биореакторы с рабочим объемом 10 ли 50 л соответственно.

Таким образом, экспериментально разработана технология псевдосуспензионного культивирования клеток линии Vero, обеспечивающая стабильное получение культуры-продуцента из приготовленного банка рабочих клеток Линии Vero в пределах разрешенных ВОЗ уровней пассажей культуры (до 150 пассажа).

2.4. Применение псевдосуспензионного метода культивирования клеток линии Vero для накопления вакцинных штаммов вирусов. 2.4.1. Культивирование клеток линии Vero и вакцинных штаммов вируса полиомиелита на микроносителе Цитодекс-1 в биореакторе Celligen Plus. Клетки линии Vero культивировали в биореакторе Celligen Plus на микроносителе Цитодекс-1 (2 г/л). Для заражения использовали культуры с концентрацией клеток не менее 1х106 кл./мл. Множественность заражения во

, п ,

всех опытах,и для всех трех типов вируса составляла 0,02 Б(!)Е/клетка. Для заражения использовали только посевные штаммы вируса, полученные на первичных культурах клеток почек зеленых мартышек.

Таблица 12. Результаты титрования экспериментальных серий ОПВ* I, П и Ш типов (штаммы А.Сэбина), полученных на клетках линии Vero в биореакторе Celligen Pius на микроносителе Цитодекс-1.

Тип вируса Титр вируса в БОЕ/мл** или ТЦД50/МЛ*** (в lg)

КПЗМ**) Нер-2***) Vero**)

8,5:£ОД 8,5 ±0,1 8,1 ± ОД

8,5 ±0,1 8,4 ± ОД 7,9 ± ОД

SI

8,5 ±0,2 8,5 ±0,1 8,5 ±0,1

8,5 ±0,1 8,5 ±0,1 8,3 ±0,1

8,2 ±0,2 8,5 ± ОД 7,9 ±0,3

sn 8,2 ±0,1 8,7 ±0,1 7,8 +ОД

8,5 ±0,1 8,6 ±0,1 7,9 ± ОД

• 8,6 ± 0,2 ' 8,3 ±0,2 7,8 ±0,3

8,4 ±0,1 8Д±0Д ' 7,9 ±0,3

sin

8,3 ± ОД 8,3 ±0,1 7,9 ± ОД

, 8,4 ± ОД . • 8,3 ±0,1 7,9 ± ОД

Примечание: * - ОПВ - оральная полиомиелитная вакцина, ** - КПЗМ первичные культуры клеток почек зеленых мартышек. Количество экспериментальных серий: тип 1—4 серии, тип II - 3 серии, тип III—4 серии.

Как видно из данных таблицы 12, вакцинные штаммы вируса полиомиелита накапливаются в высоких титрах в жидкой фазе культуры.

Контроль стерильности не выявил наличие бактерий, грибов й мйко-плазм во' всех партиях культур клеток Vero, культуральных жидкостях и экспериментальных сериях вакцин. ;'1 '

Тестирование проб культуральной жидкости клеток линии Vero на отсутствие татЫенных агентов в первичных культурах клеток почек зеленых мартышек, линии диплоидных клеток человека М-22 и клетках линии Vero не выявило их контаминации.

Тестирование проб экспериментальных серий вакцины на наличие посторонних вирусов в указанных выше культурах не выявило 'Присутствия цитоПатогенных агентов.

Результаты тестов на типоспецифичность и генетическую стабильность соответствовали требованиям к полиовакцине.

Тестирование образцов экспериментальных серий вакцин на сохранение вирусами свойств атгенуапии было проведено совместно с' к.м.н. В.Г.Козловым в тесте нейровирулентности на обезьянах Cercopithecus aethiops.

Клинические наблюдения не выявили существенных различий между группами животных, зараженных экспериментальными сериями вакцин и эталонными препаратами ВОЗ.

Гистологическое исследование центральной нервной системы (ЦНС) обезьян, зараженных экспериментальными сериями полиовакцины I, П й'Ш типов, показало, что в целом характер, локализация и степень выраженности изменений соответствовали морфологическим характеристикам вакцинного вйруса. Не было обнаружено статистически достоверной разницы срЬдйёго балла поражений ЦНС между группами животных, зараженных испытываемыми образцами и эталонными препаратами ВОЗ. • •' -

Результаты контроля экспериментальных серий ОПВ М'ЬстРаточную нейровирулентность на обезьянах были подтверждены данными по Ьценке

генетической стабильности популяций вируса в них с помощью полимераз-ной цепной реакции и рестрикционного анализа (MAPREC-теста), выпол-, ненного совместно с к.б.н. Г.Г.Каргановой. >

Таким образом, экспериментальные серии оральной полиомиелитной вакцины, полученные на клетках лини Vero с использованием разработанной технологи», по всем своим показателям не отличались от серий вакцины, приготовленных на первичных культурах клеток почек зеленых мартышек в производственных условиях, а по накоплению вирусной биомассы, даже превосходили их.

' f г> . f, f

2.4.2: Культивирование клеток линии Vero и вируса клещевого энцефалита (штамм Софьин) на микроносителе Цитодекс-1 в спиннерах Techne. , Возможность практического использования разработанной технологии псевдосуспензионного культивирования .была оценена на .модели вируса клещевого энцефалита (штамм Софьин). . -

••' При проведении данного исследования наработку клеточной биомассы проводили в условиях псевдосуспензии в спиннерах Techne с рабочими объемами 0,25 и 1,5 л. Для заражения использовали культуры с концентрацией клеток не менее 1x106 кл./мл. ....

" Для оптимизации условий выращивания вируса клещевого энцефалита в клетках линии Vero было проведено изучение влияния различных факторов на урожай вируса, а именно: множественность заражения клеток вирусом, состав среды поддержки, сроки проведения и количество сборов вирусной суспензии.

' Отбор проб для титрования и измерения антигенности вируса в ИФА проводили на 1,3 и 5 сутки после заражения. Пробы для ИФА очищали 10%-ным ПЭГ-6000 без предварительной инактивации вируса формалином. Полученные результаты приведены в таблице 13.

' Как видно из данных таблицы 13, на 5 сутки после заражения количество инфекционных вирусных частиц в культуральных жидкостях при множе-

ственности заражения 10 , 1 и ОД БОЕ/клетка практически совпадало и превышало показатель 8,0 lg БОЕ/мл.

Таблица 13. Влияние множественности заражения на накопление инфекционных частиц и специфического антигена вируса клещевого энцефалита (штамм Софьин) в клетках линии Vero при выращивании в условиях псевдосуспензии на микроносителе Цитодекс-1 в спиннерах Techne.

Множествен носгь заражения (БОЕ/кл) Титр вируса в БОЕ/мл (в lg) Концентрация Е антигена (мкг/мл)

Время, культивирования (сут)

1 3 5 1 3 5

10 6,5±0,1 7,6±0,1 8,5±0,1 0,08±0,02 ,0,17±0,03 0,89+0,06

1 6,0±0,2 7,5±0,1 8,5±0,2 0,05±0,01 0,08±0,02 0,75±0,06

0,1 б,0±0,1 7,0+0,1 8,5+0,2 0,04±0,02 0,06±0,02 0,70±0,05

0,01 6,0±0,2 6,0±0Д 7,5±0,2 0,01+0,00 0,03±0,01 0,21±0,04

Накопление вирусного антигена в жидкой фазе культуры в процессе инкубирования происходило тем быстрее, чем выше была исходная множественность заражения клеток вирусом. Однако уже на 5 сутки культивирования содержание антигена в вируссодержащих. жидкостях культур, зараженных дозой 10, 1 и 0,1 БОЕ/клетка, отличалось незначительно и составляло 0,89-0,70 мкг/мл.

Только при множественности заражения 0,1 БОЕ/клетка высокое накопление вирусного антигена в жидкой фазе культуры не сопровождалось дегенерацией клеточного пласта на частицах микроносителя. Последнее обстоятельство представляло значительный практический интерес, так как позволяла проводить несколько сборов вирусного антигена от одной .культуры-продуцента. - , ,

В следующей серии экспериментов была изучена динамика накопления вирусного антигена в культуральной жидкости в зависимости от продолжительности инкубирования псевдосуспвн^, ежеднев-

но в течение 7 суток. Вирус в пробах инактивировали формалином (1:2000) в течение 3-х суток при 32°С, затем хранили при +4° С до проведения ИФА.

Концентрация бежа Е была максимальной в пробах, взятых на 5 сутки инкубирования, и составляла 0,24 мкг/мл. В необработанных формалином nj5oéax этоТ показатель составлял 0,70 мкг/мл (таблица 13).

Сроки проведения последующих сборов вируссодержащих жидкостей определяли после замены среды поддержки на свежую среду по описанной выше схеме. Полученные результаты приведены на рис.3.

Рис. 3. Динамика накопления антигена вируса клещевого энцефалита (белок Е) в культуральных жидкостях псевдосуспензионной культуры клеток линии Vero при проведении повторных сборов вирусных урожа-,ев. Стрелками показаны сроки проведения полной замены среды поддержки и сбора вируссодержащих жидкостей.

1 I }

**» ■ -

Как видно из данных рис.3, при выращивании вируса клещевого энцефалита в клетках линии Vero в условиях псевдосуспензий удавалось1 проводить не Менее 4-х сборов вирусного урожая с высоким содержанием спецй-> фического антигена. Оптимальные сроки проведения сборов вирусньк уро10 жаев составили: для 1 сбора - 5 сутки после заражения культуры, дйя':2-3 сборов - 4 сутки инкубирования после полной замены среды поддержки на1' свежую среду. Содержание белка Е было максимальным в 3-м сборе й cdr ставляло 0,35 мкг/мл. В вируссодержащей жидкости 5-го сбора- концентра--ция вирусного антигена была существенно ниже по сравнению с 1-ым - 4-ым ' сборами. Кроме того, к моменту проведения 5-го сбора культура1 практически полностью дегенерировала и в суспензии присутствовало большое количество клеточного детрита. " 1 • ' i '■

Таким образом, нами подобраны оптимальные параметры' культивирования клеток линии Vero и штамма Софьин вируса клещевого энцефалита в условиях псевдосуспензии, обеспечивающие стабильное Накопление куль-турального антигена при проведении не менее 4-х сборов вируссодержащей жидкости. Показано, что от одной культуры-продуцента при использовании спиннеров с рабочим объемом 1,5 л можно получать до'5 л вируссодержащей жийкости с высоким содержанием специфического антигена. ' -

36

Выводы.

1. Впервые разработан перфузионный способ трипсинизации почек обезьян, позволяющий управлять процессом дезагрегации и получать взвеси, состоящие преимущественно из дискретных клеток или фрагментов почечных канальцев и клубочков. Способ позволяет в 4-5 раз увелйчшъ выход производственной партии культуры-продуцента и объем вирусной суспензии, получаемых из 1 пары почек животных, при изготовлении вакцин против полиомиелита и чумы плотоядных по сравнению с' трипсинйзацией измельченных кусочков ткани.

Перфузионный способ трипсинизации почек обезьян используется более 20 лет в ФГУП "ПИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН" для получения первичных культур клеток почек зеленых мартышек при производстве вакцин против полиомиелита и чумы плотоядных. ......

2. Созданы и аттестованы криобанки перевиваемых линий клеток селезенки (линия 455) и почек (линии 4647 и Vero) зеленых мартышек. Посевной банк клеток линии 4647 и рабочий банк клеток линии Vero сертифицированы ГИСК им. Л.А.Тарасевича МЗ РФ и Комитетом МИБП МЗ РФ и рекомендованы к использованию в качестве субстратов для приготовления диагностических препаратов и производства профилактических медицинских иммунобиологических препаратов.

Сертифицированная линия клеток 4647 используется в качестве клеточного субстрата при производстве первой отечественной цельновирионной инактивированной вакцины против гепатита А «Геп-А-ин-ВАК» в ГНЦ ВБ «Вектор».

3. На основе экспериментальных исследований разработана технология получения монослойных культур клеток линии 4647 в промышленных масштабах и определены оптимальные условия накопления вакцинного штамма вируса чумы плотоядных (штамм Рокборн) в них.

Проведенные исследования позволили утвердить линию 4647 в качестве альтернативного клеточного субстрата для накопления и титрования вируса чумы плотоядных при изготовлении вакцины "Вакчум".

4. Установлено, что в клетках линии 4647 вакцинные вирусы полиомиелита'(штаммы Сэбина типов I, II и П1), клещевого энцефалита (штамм Со-фьин) и бешенства (штамм Внуково-32) накапливаются в таких же высоких титрах, как и в первичных культурах клеток. На экспериментальном уровне отработана принципиальная схема накопления в жидкой фазе культуры 4647 антигена вируса клещевого энцефалита и очистки его от балластной клеточной ДНК. Приготовленные по этой схеме экспериментальные серии вакцины по своим характеристикам соответствуют требованиям к вакцине против клещевого энцефалита. < . >

■ 5. Разработана методика культивирования'клеток линии Vero в условиях псевдосуспензии с однократной заменой среды роста (среда Игла MEM с 5% сыворотки крупного рогатого скота), обеспечивающая эффективность посева клеток свыше 90% и индекс пролиферации культур на уровне 6,0-8,0.

6. Разработана методика пассирования клеток линии i Vero на часТйцах микроносителей, обеспечивающая наработку клеточной биомассы в промышленных масштабах. Экспериментально показано, что доля-жизнеспособных клеток, собранных при отделении их от частиц микроносителей, доставляет более 80% от количества клеток, выросших в исходных псевдосус-ПеНЗИЯЧ.' ''."i ! РЫЧ1.

7. Разработана методика культивирования клеток линии Veré »вакцинных штаммов Сэбина типов I, П и П1 вируса полиомиелита в условиях псевдосуспензии в биореакгорах. Установлены оптимальные параметр*!' и режимы ' культивирования, обеспечивающие накопление вакциеиных штаммов вируса полиомиелита в титрах, превышающих показатель 8,0-lg БОЕ/мл. Показано, что экспериментальные серии препарата,; полученные'на

"сертифицированной линии клеток Vero с использованием биореакторной

технологии, по всем своим показателям соответствуют требованиям к оральнрй цолиомиелитной вакцине.

8. Разработана методика культивирования клеток линии Vero и штамма ,Софьин-вируса клещевого энцефалита в условиях псевдосуспензии, обеспечивающая стабильно, высокое накопление вирусного антигена в жидкой фазе ■ культуры. Оптимизированы условия выращивания вируса в этой клеточной ..ристемв,, показана, возможность получения не менее 4-х сборов вирусного урожая с высоким содержанием специфического антигена от одной культуры-продуцента.: , , . , , . 9. разработана система получения и выращивания первичных и переви-.ваемых культур клеток обезьян, обеспечивающая возможность накопления в них вакцинных штаммов вирусов полиомиелита, клещевого энцефалита, ■бешенства и чумы плотоядных с сохранением аттенуированных свойств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Миронова JI.JL, Хапчаев Ю.Х., Кашликова В.И., Завальный М.А.

, Способ деза1регации паренхиматозного органа. - Авторское свидетельство №914624, 1982 г.

2. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х., Попова В.Д. Линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455, используемая для культивирования вирусов. - Авторское свидетельство №984214, 1982г. Патент РФ

, № 984213, 1993г.

3. Балтрушис P.C., Бересневичюс 3.-И.Г., Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х., Мицкявичюс В.Ю., Махтеева Г.А., Вшпонас В.Ю., Мильчюте Ю.В., Билин-скайте И.Ч., Грибаускайте P.A., Руткаускас К.В. Способ выращивания перевиваемых клеток почек обезьян линии 4647. - Авторское свидетельство

№1356459,1985г.

i * !

4. Балтрушис P.C., Бересневичюс 3.-И.Г., Миронова Л.Л., Мицкявичюс В.Ю., Билинскайте И.Ч., Хапчаев Ю.Х., Вилюнас В.Ю., Аманкавичене В.А.,

Ругкаускас K.B. Способ культивирования перевиваемых клеток почки обезьяны линии 4647. - Авторское свидетельство № 1515689, 1989г.

5. Балтрушис P.C., Бересневичюс 3.-И.Г., Вилюнас В.Ю., Миронова JI.JI., Рауделюнас В.И., Хапчаев Ю.Х. Способ культивирования перевиваемых клеток почек обезьяны. - Авторское свидетельство № 1641023, 1989г.

6. Литовченко В.Г., Хапчаев Ю.Х., Миронова Л.Л., Попова В.Д., Семенова H.A. Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток,- Авторское свидетельство № 1724687, 1991г.

7. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х. Применение метода перфузионной дезагрегации почек обезьян для получения первичных культур клеток. - Acta virologica, 1982, 5, с.404.

8. Стобецкий В.И., Орлова Т.М., Курбатов A.B., Хапчаев Ю.Х., Миронова Л.Л., Грачев В.П. Спонтанные сестринские хроматидные обмены в культивируемых клетках африканской зеленой мартышки. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1982, 5, с. 85-87.

9. Миронова Л.Л., Гинсбург В.Н., Ком С.Г., Хапчаев Ю.Х., Конюшко О.И., Курбатов A.B., Орлова Т.М. Изучение различных видов культур клеток методом цейтраферной микрокиносъемки. - В сб.: Механизмы гомеостаза в изолированных системах и организме. Красноярск, 1984, с. 194-203.

10. Хапчаев Ю.Х., Стобецкий В.И., Миронова Л.Л. Активность ядрышкооб-разующих районов хромосом нормальных и трансформированных клеток селезенки африканской зеленой мартышки. - Цитология, 1985, 10, с.1189-1191.

11. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х. Применение различный видов культур клеток и тканей для работы с вирусом гепатита А. - В сб.: Молекулярная биология вирусов. М., 1985, ч,1, с.121-126.

' i ' Ч г

12. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х. Характеристика линии перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455. - Acta virologica, 1986, 30, с.360-366. , , ,

13. Миронова Л.Л., Шалунова Н.В., Ломанова Г.А., Николаева М.А., Хапча-

ев Ю.Х., Стобецкий В.И.; Кармышева В.Я., Попова В.Д., Алпатова Г.А., Со'" ! - I

болев С.Г. Грачев В.П. Характеристика банка вакцинной линии гетеропло-идных клеток почки Зеленой мартышки 4647. - Вопросы вирусологии, 1987,6, ¿740-743. ' .....

15. Хапчаев Ю.Х., Соболев C.F., Миронова Л.Л. Идентификация линии перевиваемых клетбк селезейки' взрослой зеленой, мартышки 455. - Acto virologica, 1987,31, c.172-Í75. ' 1 ' ■ . , , ,

J í i

15. Стобецкий В.И.,' Хапчаев Ю.Х., Миронова Л.Л. 5-йодцезоксиуридин, так же как и 5-бромдезоксиуридин, индуцирует, образование срецифических дицентрических хромосом в клетках с микроядрами, г Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1987, 7, с.83-85.

16. Хапчаев Ю.Х., Хаустов В.И., Риос М.О., Королев М.Б., Миронова Л.Л. Оптимизация условий культивирования ротавирусов в линиях гетероплоид-ных клеток. - Вопросы вирусологии, 1989, 5, с.628-630.

Í7. Elbert L.B., Terietskaya É.N., Timofeev A.V., Mironova L.L., Khapchaev Ü.Kh.,' Amosenko F.A., Svitirin Y.V., Alpatova G.A., Krutyanskaya G.L. Inactivated vaccine against tick-borne encephalitis (TBE) derived from heteroploid continuous monkey cell line. - Vaccine, 1989, 7, p.477. Í8. Эльберт Л.Б., Терлецкая E.H., Тимофеев A.B., Амосенко Ф.А., Хапчаев to.X., Миронова Л.Л., Свиткин Ю.В., Ворович М.Ф., Лисицина Е.Л, Очистка препаратов вируса клещевого энцефалита. - Вопросы вирусологии, 1990, 3, с.219-221.

J 19. АкЬёУова Т.А!,'Хапчаев Ю.Х., Миронова Л.Л., Сашенко Ю.В., Селимов М.А.,' Хозйнский В.В. Культивирование вакцинного .вируса бешенства в линиях перевиваемых клеток зеленой мартышки. ->- Вопросы вирусологии, Г$92, 5, с.432-434.

20. Кармышева В.Я., Ровенский Ю.А., Миронова Л.Л., Конюшко О.И., Хапчаев Ю.Х. Характеристика линий, пригодных для производства вакцин по данным растровой электронной микроскопии. - Цитология, 1992,1, с.84-89.

21. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х. Линия гетероплоидных клеток 4647: изучение, применение, перспективы. - Тверь, 1995,113 С.

22. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х. Культивирование клеток животных для медицинской биотехнологии. - М., 1995,146 С.

23. Эльберт Л.Б., Чумаков М.П., Миронова Л.Л., Грачев В.П., Крутянская ГЛ., Кастен Е., Рубин С.Г., Гамбарян A.C., Хапчаев Ю.Х., Тимофеев A.B., Матросович М.Н. Способ приготовления вакцины против клещевого энцефалита или японского энцефалита из вирусной суспензии. - Патент на изо. бреггение по заявке № 96119607/13 (025958) от 5 ноября 1997 г.

24. Хапчаев Ю.Х., Клеблеева Т.Д., Попова В.Д., Кондратьева Я.Ю., Грачев В.П. Культивирование клеток линии Vero и вакцинных штаммов вируса полиомиелита (штаммы А.Сэбина) в условиях псевдосуспензии в полупромышленном биореакторе. - Биотехнология, 1999,6, с.45-50.

25. Миронова Л.Л., Попова В.Д., Конюшко О.И., Хапчаев Ю.Х., Зыбин Д.В., Акопян A.C. Опыт создания банка авторских линий перевиваемых клеток и их применение в вирусологической практике. - Биотехнология, 2000,6, с.41-47.

26. Грачев В.П., Хапчаев Ю.Х., Клеблеева Т.Д., Попова В.Д., Карганова Г.Г., Козлов В.Г., Кондратьева Я.Ю., Румянцев A.A. Оценка экспериментальных серий живой вакцины против полиомиелита, изготовленных на перевиваемой линии клеток Vero с использованием биореакторной технологии. - Биотехнология, 2001,1, с.44-48.

27. Хапчаев Ю.Х., Клеблеева Т.Д., Попова В.Д., Грачев В.П. Перевиваемые линии клеток и реакторная технология с применением микроносителей -перспективные направления в производстве вирусных вакцин. - В сб.: Актуальные проблемы медицинской вирусологии. Научная конференция, посвященная 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова. М., 23-25 ноября 1999 г, ч.1., с.115.

28. Грачев В.П., Карганова Г.Г., Хапчаев Ю.Х. Разработка альтернативных методов производства и биологического контроля оральной полиомиелит-

ной вакцины. - В сб.: Актуальные проблемы медицинской вирусологии. Научная конференция, посвященная 90-летию, со дня рождения М.П. Чумакова.'М., 23-25 ноября 1999г, Ч.1., с.97.

29. Хапчаев Ю.Х., Хоретоненко М.В., Тимофеев A.B., Грачев В.П. Репродукция штамма'1 Софьин вируса клещевого энцефалита в клетках линии Vero,' ¡культивируемых йа микроносителях в условиях псевдосуспензии. -Биотехнология, 2003,5, с.32-39. , .. ,

• I

II

if

i !

ï í

1

IK I 0 / 8 о

(j^-ygo

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Хапчаев, Юсуф Хаджи-бекович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Методы получения и культивирования свежеизолированных клеток животных для вирусологических исследований.

1.1. Ферментативная дезагрегация измельченных кусочков ткани.

1.2. Перфузионный способ дезагрегации паренхиматозных органов.

1.3. Способы выращивания первичных культур клеток.

Глава 2. Применение линий клеток человека и животных для получения вирусных вакцин.

2.1. Характеристика линий клеток человека и животных.

2.2. Способы выращивания перевиваемых линий клеток.

2.3. Перевиваемые линии клеток - субстраты для получения вирусных вакцин.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов получения и культивирования первичных и перевиваемых культур клеток животных для производства вирусных вакцин"

Актуальность проблемы.

Современная биотехнология вышла на новый качественный уровень. На основе достижений молекулярной биологии и генной инженерии разработаны и производятся в промышленных масштабах десятки различных биотерапевтических препаратов [108,134,235,305,317]. Интенсивные исследования проводятся и по разработке противовирусных вакцин нового поколения [59,131,182,202,204,258,275,293,297,299], однако предсказать сроки начала их практического применения не представляется возможным. В связи с этим вирусные вакцины, получаемые на клеточных культурах, по-видимому, будут продолжать играть в обозримом будущем ведущую роль в профилактике вирусных инфекций.

Массовое производство практически всех медицинских вирусных вакцин в настоящее время основано на первичных культурах клеток. Поэтому увеличение биомассы культуры-продуцента, получаемой от одного животного-донора ткани, остается важным этапом производственного процесса. Решение этой задачи может быть осуществлено либо за счет увеличения сборов первично-трипсинизированных клеток, либо за счет использования более эффективных способов культивирования клеток. В силу биологических особенностей первично-трипсинизированных клеток кардинально усовершенствовать или заменить рутинные способы культивирования клеток не представляется возможным. Таким образом, дальнейшее совершенствование способов дезагрегации исходных тканей животных-доноров остается по-прежнему актуальным.

Как известно, определяющими и тесно взаимосвязанными звеньями любой технологии, основанной на использовании культур клеток животных, являются сама культура-продуцент и способ ее культивирования.

Традиционные технологии изготовления культуральных вирусных вакцин на базе первичных культур клеток уже не могут в полной мере обеспечить постоянно растущую потребность практического здравоохранения в эффективных, безопасных и экономичных препаратах.

Очевидно, что для создания новых технологий необходим другой тип клеточного субстрата. Таким субстратом являются перевиваемые линии клеток (ПЛК). Несмотря на то, что ПЛК широко применяются в вирусологических исследованиях, использование их для получения медицинских биопрепаратов длительное время сдерживалось. Основное возражение сводилось к возможной онкогенности полученных на их основе биопрепаратов. Однако, тщательный анализ многочисленных данных, проведенный в рамках " Программы биологической стандартизации" ВОЗ, показал, что культуры, полученные из банков перевиваемых линий клеток, предварительно аттестованных в соответствии с международными требованиями к клеточным субстратам, являются наиболее безопасными и перспективными для производства биопрепаратов [153,200, 319].

Разрешение ВОЗ на использование в качестве клеточных субстратов ПЛК позволило внедрить в практику новые эффективные способы культивирования клеток при изготовлении биопрепаратов. Одним из таких способов является культивирование клеток на частицах микроносителей в суспензии (псевдосуспензионное культивирование) [307].Этот метод обеспечивает резкое (на порядок и выше) увеличение удельной ростовой поверхности по сравнению с другими культуральными системами. Кроме того, он позволяет значительно снизить или полностью исключить ряд существенных недостатков, присущих другим способам культивирования субстрат-зависимых клеток, а именно: 1) сложность масштабирования; 2) невозможность регулирования и поддержания оптимальных параметров культивирования; 3) трудности с обеспечением однородности культуры;

4) трудности с визуальным контролем качества культуры; 5) низкие выходы клеточной биомассы.

Создание новых типов микроносителей (МН) и разработка промышленных биореакторов с улучшенными массообменными и гидродинамическими характеристиками позволили существенно повысить эффективность псевдосуспензионного способа культивирования клеток [93,99,111,113,140,159,215,249,295,306,321]. За рубежом уже освоен выпуск ряда медицинских и ветеринарных вакцин с применением биореакторной технологии на постоянных линиях клеток [141,179,180, 193,206,218,219,247,255,262,263]. В России в силу ряда обстоятельств псевдосуспензионное культивирование клеток и вирусов на микроносителях все еще остается на уровне лабораторных исследований.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлась разработка высокоэффективных и технологичных способов получения и культивирования первичных и перевиваемых культур клеток обезьян, пригодных для использования в качестве клеточных субстратов при изготовлении различных вирусных вакцин.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способ дезагрегации почек зеленых мартышек, позволяющий увеличить объем производственной партии культуры-продуцента, получаемой от животного-донора ткани;

2. Изучить возможность получения из селезенок зеленых мартышек первичных и перевиваемых культур клеток, пригодных для вирусологических исследований;

3. Провести обследование отечественных культур клеток обезьян и создать криобанки линий, отвечающих требованиям ВОЗ к перевиваемым линиям клеток, разрешенным для использования при изготовлении медицинских иммунобиологических препаратов;

4. Изучить возможность использования для размножения вакцинных штаммов вирусов полиомиелита (штаммы Сэбина типов I, II и III), клещевого энцефалита (штамм Софьин), бешенства (штамм Внуково-32), чумы плотоядных (штамм Рокборн) отечественных линий клеток почек и селезенок обезьян;

5. Установить оптимальные параметры культивирования клеток линии Vero и вакцинных штаммов вируса полиомиелита в условиях псевдосуспензии для отработки модельной технологии изготовления вакцины против полиомиелита в биореакторах;

6. Провести оценку экспериментальных серий моновакцин I, II и III типов против полиомиелита, приготовленных на клетках линии Vero с использованием биореакторной технологии;

7. Изучить закономерности размножения вируса клещевого энцефалита (штамм Софьин) в клетках линии Vero, культивируемых на микроносителях, и разработать экспериментальную систему, обеспечивающую стабильную продукцию культурального антигена.

Научная новизна.

Впервые разработан способ трипсинизации почек обезьян, позволяющий управлять процессом дезагрегации паренхимы органа и получать преимущественно либо взвесь дискретных клеток, либо взвесь фрагментов почечных канальцев и клубочков.

Впервые установлена и аттестована новая перевиваемая линия клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455 - линия 455. Показано, что клетки линии 455 не контаминированы посторонними агентами, не туморогенны, высокочувствительны к различным группам вирусов, сохраняют стабильными свои характеристики на протяжении 40 последовательных пассажей.

Впервые определены спонтанный уровень сестринских хроматидных обменов (СХО), а также локализация и структура ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом в перевиваемых культурах клеток обезьян Сег-copithecus aethiops. Показано, что выявленные особенности ЯОР хромосом являются генетическим маркером клеток этого вида обезьян.

Разработана технология получения новой вакцины против чумы плотоядных из штамма Рокборн на линии клеток 4647.

Разработана модельная технология изготовления вакцины против полиомиелита на основе псевдосуспензионного метода культивирования штаммов Сэбина и клеток линии Vero в биореакторе.

Установлено, что при псевдосуспензионном культивировании штамма Софьин вируса клещевого энцефалита в клетках линии Vero происходит стабильно высокое накопление вирусного антигена в жидкой фазе культуры. Показана возможность получения нескольких сборов вирусного урожая от одной культуры-продуцента до наступления деструкции клеточного пласта на частицах микроносителя.

Практическая значимость работы.

Перфузионный способ дезагрегации почек обезьян используется с 1982 г в ФГУП "ПИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН" для получения первичных культур клеток при изготовлении вакцины против полиомиелита. За этот период изготовлено и поставлено (в том числе и за рубеж) более 1,2 млрд доз полиовакцины и около 200 млн доз вакцины против чумы плотоядных. Метод защищен авторским свидетельством №914624, утверждены методические рекомендации по его применению (М., 1983).

Созданы криобанки клеток линий 455, 4647 и Vero, отвечающие требованиям ВОЗ к клеточным субстратам, разрешенным для использования при производстве медицинских иммунобиологических препаратов. Посевной банк клеток линии 4647 на уровне 90 пассажа и рабочий банк клеток линии Vero на уровне 139 пассажа лицензированы ГИСК им. Л.А.Тарасевича МЗ РФ.

Экспериментально показано, что монослойные культуры, приготовленные из установленных банков клеток линий 455, 4647 и Vero, могут быть использованы в качестве стандартного клеточного субстрата в научных и прикладных вирусологических исследованиях.

На культурах, полученных из клеток посевного банка линии 4647, приготовлены экспериментальные серии вакцин против клещевого энцефалита (штамм Софьин), чумы плотоядных (штамм Рокборн), а также моновакцины против полиомиелита (штаммы Сэбина типов I, II и III). Полученные препараты успешно прошли все необходимые регламентные контроли и по своим характеристикам не отличались от коммерческих препаратов, приготовленных на первичных культурах клеток.

Утверждена Ведомость изменений к существующей нормативно-технической документации, разрашающая применение линии 4647 в качестве альтернативного клеточного субстрата для накопления и титрования вируса чумы плотоядных при изготовлении Вакчум (ТУ 46-12-32085).

Монослойные культуры, приготовленные из лицензированного банка посевных клеток линии 4647, используют в качестве клеточного субстрата при производстве цельновирионной инактивированной культу-ральной вакцины "Геп-А-ин-Вак" против гепатита А в ГНЦВБ "Вектор" (г. Новосибирск).

На основании экспериментальных исследований установлены оптимальные параметры и режимы культивирования клеток линии Vero на микроносителях в условиях псевдосуспензии в различных типах спиннеров и биореакторов. Разработана высокоэффективная методика серийного пассирования клеток на частицах микроносителей, обеспечивающая стабильное получение культуры-продуцента в промышленных масштабах в пределах разрешенных ВОЗ уровнях пассажей культуры.

Разработаны модельные технологии культивирования клеток линии Vero и вакцинных штаммов вируса полиомиелита (штаммы Сэбина типов I, II и III) и клещевого энцефалита (штамм Софьин) в биореакторах, обеспечивающие получение высоких урожаев вирусной биомассы. Получен-ны экспериментальные серии полиовакцины, которые по всем показателям, включая и тест на остаточную нейровирулентность in vivo, не отличаются от серий вакцины, приготовленных на первичных культурах клеток почек обезьян в производственных условиях. Установлено, что содержание нейровирулентных мутантов по MAPREC-тесту в экспериментальных сериях вакцины значительно ниже предельно допустимых значений.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на II Всесоюзной конференции по криобиологии и медицине (Харьков, 1984); на Международной научной конференции по актуальным проблемам медицинской вирусологии (Москва, 1985); на II, III и IV Всесоюзных совещаниях "Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1985,1990, 1992); на юбилейной конференции, посвященной 85-летию Томского НИИ вакцин и сывороток (Томск, 1991); на научно-практической конференции "Природно-очаговые болезни человека" (Омск, 1996); на 2-ой Международной конференции, посвященной 100-летию Пермского НПО "Биомед" (Пермь, 1998); на Международной юбилейной конференции, посвященной 90-летию М.П.Чумакова (Москва, 1999).

По теме диссертации опубликовано 29 научных работ, в том числе 2 монографии. Получено 6 авторских свидетельств и 2 патента. Научно-практические разработки вошли составной частью в Фармакопейные статьи и Производственные регламенты вакцин ОПВ и Вакчум, выпускаемых ФГУП "ПИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН".

Благодарности.

Выражаю искреннюю благодарность директору ФГУП Беловой Г.А. и академику РАМН РАМН С.Г.Дроздову за содействие в выполнении данной работы.

Особую благодарность выражаю моим научным консультантам д.м.н., профессору Любови Леонидовне Мироновой и д.б.н., профессору Виктору Павловичу Грачеву за постоянную поддержку и искреннюю заинтересованность в результатах моей научной и производственной деятельности.

Я искренне признателен д.м.н. Кармышевой В.Я., д.м.н. Тимофееву A.B., к.б.н. Аксеновой Т.А., к.м.н. Алпатовой Г.А., к.м.н. Дзагуровой Т.К., к.б.н. Каргановой Г.Г., к.м.н. Козлову В.Г., к.б.н. Орловой Т.М., к.б.н. Поповой В.Д., к.м.н. Соболеву С.Г, к.м.н. Стобецкому В.И., Клеб-леевой Т.Д., Кондратьевой Я.Ю. за сотрудничество.

Искренне благодарен сотрудникам ГИСК им. Л.А.Тарасевича МЗ РФ д.м.н. Шалуновой Н.В., д.б.н Ломановой Г.А., к.б.н. Бердниковой З.Е., к.м.н. Петручук Е.М., принимавшим участие в проведении совместных экспериментов по аттестации банков клеток линий 4647 и Vero.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Хапчаев, Юсуф Хаджи-бекович

Выводы.

1. Впервые разработан перфузионный способ трипсинизации почек обезьян, позволяющий управлять процессом дезагрегации и получать взвеси, состоящие преимущественно из дискретных клеток или фрагментов почечных канальцев и клубочков. Способ позволяет в 4-5 раз увеличить выход производственной партии культуры-продуцента и объем вирусной суспензии, получаемых из 1 пары почек животных, при изготовлении вакцин против полиомиелита и чумы плотоядных по сравнению с трипсинизацией измельченных кусочков ткани.

Перфузионный способ трипсинизации почек обезьян используется более 20 лет в ФГУП "ПИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМП" для получения первичных культур клеток почек зеленых мартышек при производстве вакцин против полиомиелита и чумы плотоядных.

2. Созданы и аттестованы криобанки клеток линий 455, 4647 и Vero. Посевной банк клеток линии 4647 и рабочий банк клеток линии Vero сертифицированы ГИСК им. Л.А.Тарасевича МЗ РФ и Комитетом МИБП МЗ РФ и рекомендованы к использованию в качестве субстратов для приготовления диагностических препаратов и производства профилактических медицинских иммунобиологических препаратов.

Сертифицированная линия клеток 4647 используется в качестве клеточного субстрата при производстве первой отечественной цельновири-онной инактивированной вакцины против гепатита А «Геп-А-ин-ВАК» в ГНЦ ВБ «Вектор».

3. На основе экспериментальных исследований разработана технология получения монослойных культур клеток линии 4647 в промышленных масштабах и определены оптимальные условия накопления вакцинного штамма вируса чумы плотоядных (штамм Рокборн) в них.

Проведенные исследования позволили утвердить линию 4647 в качестве альтернативного клеточного субстрата для накопления и титрования вируса чумы плотоядных при изготовлении вакцины "Вакчум".

4. Установлено, что в клетках линии 4647 вакцинные вирусы полиомиелита (штаммы Сэбина типов I, II и III), клещевого энцефалита (штамм Софьин) и бешенства (штамм Внуково-32) накапливаются в таких же высоких титрах, как и в первичных культурах клеток. На экспериментальном уровне отработана принципиальная схема накопления в жидкой фазе культуры 4647 антигена вируса клещевого энцефалита и очистки его от балластной клеточной ДНК. Приготовленные по этой схеме экспериментальные серии вакцины по своим характеристикам соответствуют требованиям к вакцине против клещевого энцефалита.

5. Разработана методика культивирования клеток линии Vero в условиях псевдосуспензии с однократной заменой среды роста (среда Игла MEM с 5% сыворотки крупного рогатого скота), обеспечивающая эффективность посева клеток свыше 90% и индекс пролиферации культур на уровне 6,0-8,0.

6. Разработана методика пассирования клеток линии Vero на частицах микроносителей, обеспечивающая наработку клеточной биомассы в промышленных масштабах. Экспериментально показано, что доля жизнеспособных клеток, собранных при отделении их от частиц микроносителей, составляет более 80% от количества клеток, выросших в исходных псевдосуспензиях.

7. Разработана методика культивирования клеток линии Vero и вакцинных штаммов Сэбина типов I, II и III вируса полиомиелита в условиях псевдосуспензии в биореакторах. Установлены оптимальные параметры и режимы культивирования, обеспечивающие накопление вакцинных штаммов вируса полиомиелита в титрах, превышающих показатель 8,0 lg

БОЕ/мл. Показано, что экспериментальные серии препарата, полученные на сертифицированной линии клеток Vero с использованием биореакторной технологии, по всем своим показателям соответствуют требованиям к оральной полиомиелитной вакцине.

8. Разработана методика культивирования клеток линии Vero и штамма Софьин вируса клещевого энцефалита в условиях псевдосуспензии, обеспечивающая стабильно высокое накопление вирусного антигена в жидкой фазе культуры. Оптимизированы условия выращивания вируса в этой клеточной системе, показана возможность получения не менее 4-х сборов вирусного урожая с высоким содержанием специфического антигена от одной культуры-продуцента.

9. Разработана система получения и выращивания первичных и перевиваемых культур клеток обезьян, обеспечивающая возможность накопления в них вакцинных штаммов вирусов полиомиелита, клещевого энцефалита, бешенства и чумы плотоядных с сохранением аттенуирован-ных свойств.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Хапчаев, Юсуф Хаджи-бекович, Москва

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков.-М., 1983,264 с.

2. Анджапаридзе О.Г., Доссер Е.М., Рапопорт Р.И. и др. Живая коревая вакцина на диплоидных клетках человека (безопасность, реакто-генность и иммуногенность). Вопр. вирусологии, 1968, 2, с.411-418.

3. Бабикова P.A. Применение коллалитина для получения однослойных первичных культур.- Вопр. вирусологии, 1978, 1, с. 118-120.

4. Балаян М.С. Экспериментальные разработки вакцин против гепатита А. Вопр. вирусологии, 1988, 1, с.5-11.

5. Баранов С.Г. Оптимизация крупномасштабного культивирования гибридомных клеток. Биотехнология, 1995, 12, с.3-7.

6. Бектемиров Т.А., Нагиева Ф.Г. Культивирование вируса герпеса в суспензионной культуре на микроносителе. Вопр. вирусологии, 1980,5, с.615-618.

7. Биология клетки в культуре (под ред.А.С.Трошина). J1., 1984,280 с.

8. Бочкова Н.Г., Погодина В.В., Левина Л.С. и др. Получение экспериментальных серий вакцин и диагностикума японского энцефалита с использованием перевиваемой линии гетероплоидных клеток почек эмбриона овцы 4184. Биотехнология, 2003, 2, с.54-58.

9. Бресслер С.Е. Физико-химические обоснования принципа получения вирусных вакцин с помощью адсорбционной хроматографии. В сб.: Убитая гриппозная вакцина (под ред. Т.В. Пирадзе), Л., 1976, с. 13-19.

10. Гаврилов В.И. Перевиваемые клетки в вирусологии. М., 1964, 268 с.

11. И. Гендон Ю.З. Успехи в разработке культуральных гриппозных вакцин. Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2002, 5, с.25-30.

12. Гендон Ю.З. Культуральные гриппозные вакцины. Вопр. вирусологии, 2002, 6, с.4-11.

13. Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Акопова И.И. и др. Разработка культуральной живой холодоадаптированной реассортантной гриппозной вакцины. Вопр. вирусологии, 2003, 2, с. 12-17.

14. Горбунов М.А., Павлова Л.И., Карпович Л.Г. и др. Оценка реактогенности и иммуногенности культуральной концентрированной инактивированной вакцины против гепатита А "Геп-А-ин-ВАК" Вопр. вирусологии, 1995, 5, с.219-221.

15. Говоркова Е.А. Селекция клетками хозяина антигенных вариантов гемагглютина вируса гриппа и выбор оптимальных систем для культивирования.-Вопр. вирусологии, 1999, 44, с. 199-206.

16. Голубев Д.Б., Соминина A.A., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии, М., 1976, 223 с.

17. Грачев В.П., С.Г.Дзагуров, Миронова Л.Л., Шалунова Н.В. Проблема использования культур клеток в производстве вирусных вакцин и вопросы контроля их безвредности. В сб.: Руководство но вакцинному и сывороточному делу, М.,1978, с. 176-184.

18. Грачев В.П., Ханина М.К., Эльберт Л.Б., Миронова Л.Л. Гетеро-плоидная линия клеток почки зеленой мартышки как субстрат для размножения вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии - 1983, 4, с.373-377.

19. Грачев В.П., Петриччиани Дж. Оценка перевиваемых линий клеток как субстрата для производства биологически активных веществ. -ЖМЭИ, 1987, 2, с.46-51.

20. Доссер Е.М. Метод культуры тканей применительно к вирусологии. В сб.: Итоги науки и техники. Вирусология и микробиология. М., 1970, с.62-107.

21. Исаченко В.А., Подчерняева З.Я., Ткаченко A.B. Изучение репродукции вирусов в клетках, выращенных на микроносителях. В сб.: Культивирование клеток животных и человека, Пущино, 1990, с. 95-96.

22. Киселева И.В., Александрова Г.И., Науменко З.С. и др. Культура клеток MDCK возможный субстрат для производства живой гриппозной вакцины. - В сб.: Актуальные проблемы медицинской вирусологии, М., 1999, т.1, с. 104.

23. Коптева A.A. Сравнительная оценка перфузионного и стандартного способов дезагрегации почек овец для получения первичных культур клеток. Автореф. дисс. канд. вет. наук, Покров, 1976, 23 с.

24. Курносов А.Н., Зуев В.А., Опарин В.Н., Осидзе Д.Ф. Способ дезагрегации почечной ткани животных для получения клеточных культур. Авт. свид. №340698, 1972.

25. Курносов А.Н., Зуев В.А., Опарин В.Н., Ночевный В.Т. Перфузи-онная трипсинизация изолированных почек поросят. Ветеринария, 1972, 12, с.50-52.

26. Курносов А.Н., Опарин В.Н., Жестерев В.И., Мищанин В.А. Изучение активности некоторых диспергирующих смесей при перфузионной дезагрегации почек поросят. Вопр. вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии, Покров, 1978, с. 18-19.

27. Кусов Ю.Ю. Вирус гепатита А: закономерности размножения в культуре клеток, иммунохимические характеристики и препараты для диагностики и профилактики инфекции. Автореф. дисс. докт. биол. наук, М., 1990,52 с.

28. Кусов Ю.Ю., Балаян М.С., Насташенко Т.А. и др. Способ получения вакцины гепатита А. Авт. свид. №1389059, 1987.

29. Кусов Ю.Ю., Эльберт Л.Б., Казачков Ю.А. и др. Изучение специфической активности, реактогенности и безопасностьи культуральнойинактивированной вакцины против гепатита А.- В сб.: Итоги науки и техники. Вирусология, 1990, т.22, с. 14.

30. Лашкевич В.А. Пригодность перевиваемых клеточных линий для производства препаратов, вводимых людям. В сб.: Культивирование клеток животных и человека, Пущино, 1992, с.88-89.

31. Лашкевич В.А., Дзагуров С.Г. Научно-экспериментальные основы производства и контроля полиомиелитных вакцин, М.,1973, 187 с.

32. Левенталь В.И.Влияние физико-химических факторов и биологически активных веществ на механические свойства контактов и поверхности клеток печени. Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1976, 19 с.

33. Левенталь В.И., Чуич Г.А. Влияние pH на выделение клеток печени крыс. Биофизика, 1976, 21, 2, с.330-333.

34. Лымарь В.Т., Прохор В.Ф., Ялышев М.Л. и др. Характеристика постоянной линии ВНК-21 после 20 лет непрерывного хранения при температуре -196°С. Биотехнология, 1992, 5, с.75-77.

35. Майданюк А.Г., Немцов Ю.В., Бондаренко Е.П. и др. Оптимизация условий получения инактивированной вакцины против гепатита А и ее характеристика. Вопр. вирусологии, 1995, 5, с.215-218.

36. Макарова О.П. Тенденции развития технологии культивирования животных клеток. В сб.: Культивирование клеток животных и человека, Пущино, 1992, с.90-96.

37. Малышева K.M., Хомякова Н.Д., Прохоров В.В. Способ дезагрегации почечной ткани. Авт.свидетельство №623869, 1978.

38. Малышева K.M., Хомякова Н.Д., Прохоров В.В. Усовершенствование перфузионного метода дезагрегации изолированных почек поросят. В сб.: Актуальные проблемы вет. вирусологии, Владимир, 1978, с. 10-11.

39. Миронова JI.JT. Культуры клеток и применение их для изготовления противовирусных препаратов. Автореф. дисс. докт. мед. наук., М., 1968, 49 с.

40. Миронова Л.Л.,Гольдрин Н.Е. Способ получения клеточной культуры из ткани почек обезьян. Авт. свидетельство №1342019, 1987.

41. Миронова Л.Л., Грачев В.П., Кузнецова Н.В., Попова В.Д. Способ культивирования вирусов. Авт. свидетельство №764391, 1980.

42. Миронова Л.Л., Орлова Т.М., Попова В.Д., и др. Линия диплоидных клеток африканской зеленой мартышки 5018 субстрат для изготовления ЖВС. - Цитология, 1994, 6, с. 570-571.

43. Миронова Л.Л., Попова В.Д., Орлова Т.М., и др. Линия М-7 -перспективная модель для вирусологической практики. Цитология, 1994, 6, с.571-572.

44. Миронова Л.Л., Преображенская Н.К., Княгинская Ю.Г., Белова А.Г. Изучение спонтанной контаминации первичных культур клеток почек зеленых мартышек пенящим вирусом.- Вопр. вирусологии, 1980,3, с.327-330.

45. Миронова Л.Л., Преображенская Н.К., Соболев С.Г. Изучение спонтанной цитомегаловирусной инфекции культур клеток почек зеленых мартышек. Вопр. вирусологии, 1982, 4, с.83-89.

46. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х. Применение метода перфузионной дезагрегации почек обезьян для получения первичных культур клеток.-Acta virologica, 1982, 5, р.404.

47. Миронова Л.Л., Попова В.Д., Конюшко О.И. и др. Опыт создания банка авторских линий перевиваемых клеток и их применение в вирусологической практике. Биотехнология -2000, 6, с. 41-47.

48. Методы культивирования клеток (под ред. Г.П.Пинаева), Л., 1988, 320 с.

49. Методические указания МЗ СССР. Аттестация перевиваемых клеточных линий-субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов. М., 1989, 33 с.

50. Новохатский A.C. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. В сб.: Итоги науки и техники. Вирусология, М., 1980, 8, с.3-134.

51. Новохатский A.C. Клеточные культуры в вирусологии. В сб.: Общая и частная вирусология, М., 1982, 4.1, с. 463-493.

52. Новые методы культуры животных тканей (под ред. Д.Уосли), М., 1976,255 с.

53. Опарин В.Н., Курносов А.Н. Получение и использование первичных культур клеток из постнатальных легких поросят. В сб.: Актуальные вопросы вет. вирусологии, Владимир, 1976, ч.1, с.65-67.

54. Орлова Т.М. Получение и характеристика диплоидной линии клеток кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки 5018. Автореф. дисс. канд. биол. наук., М., 1981, 21 с.

55. Пащенко Ю.И., Прохор В.Ф., Борисевич И.В. Характеристика клеток вМК-АН-ЦД), длительно пассируемых на микроносителе в ферментере КПМ-2. Биотехнология, 2002, 2, с. 52-57.

56. Полещук В.Ф., Балаян М.С., Соболь A.B. и др. Испытание на та-маринах Saguinas mystax культуральной инактивированной вакцины против гепатита А. Вопр. вирусологии, 1990, 4, с.296-298.

57. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. Влияние микоплазменной контаминации и деконтаминации с помощью ципрофлоксацина на кариотиии-ческую структуру клеточной линии легкого китайского хомячка V-79. -Цитология, 1993, 8, с.71-78.

58. Ратнер JI.C., Поздняков A.A., Головченко А.П. и др. Однослойная культура клеток из ткани тимуса и селезенки животных. Бюлл. экспер. биол. и мед., 1972, 11, с.120-123.

59. Ручко В.М., Михайлов В.В., Борисевич C.B. и др. Некоторые методические аспекты создания вакцин "нового поколения". Биотехнология, 2002, 1, с. 70-78.

60. Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных., М., 1976,311 с.

61. Сергеев В.А. Вирусные вакцины., Киев, 1993, 368 с.

62. Сергеев В.А., Жестерев В.И., Сафонов Г.А., Скичко Н.Д. Ферментативный гидролизат мышечных белков как основа питательных сред для клеточных культур. Вопр. вирусологии, 1989, 5, с.623-627.

63. СмородинцевА.А. Итоги изучения живой вакцины против полиомиелита. -В сб.: Живая вакцина против полиомиелита. JI., 1960, с.42-60.

64. Советова С.П., Амченкова A.M., Бояров А.Ф. и др. Получение и характеристика перевиваемой культуры клеток селезенки человека. -Бюлл. экспер. биол. и мед., 1976, 8, с. 995-998.

65. Стефанов С.Б. Ускоренное измерение некоторых гистологических характеристик. В сб.: Методы количественного анализа в патологической морфологии, Полтава, 1978, с.47-50.

66. Стобецкий В.И., Орлова Т.М., Грачев В.П. и др. Ядрышкообра-зующие районы хромосом зеленой мартышки. Цитология, 1980, 7, с. 861-863.

67. Суптель У.А., Загорная Н.Б.,Омельянц Т.Г. Способ дезагрегации почечной ткани лабораторных животных. Авт.свидетельство №825628, 1981.

68. Сухубаевская Л.П. Усовершенствование способов получения клеточной и вирусной биомассы в целях разработки тканевых инактиви-рованных гриппозных вакцин. В сб.: Вирусы человека и животных, Рига, 1981, с.53-54.

69. Тарасов В.Н. Управляемое и непрерывное культивирование вирусов и клеток позвоночных. В сб.: Итоги науки и техники. Микробиология, М., 1975,4, с. 152-207.

70. Тарасов В.Н. Клеточные культуры и производство биологически активных веществ. В сб.: Итоги науки и техники. Вирусология, М., 1980, с. 135- 189.

71. Терещенко И.П., Голованов М.В. Способ дезагрегации тканей для получения клеточных суспензий. Авт. свидетельство №526661, 1976.

72. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М., 1975.

73. Хижнякова Т.М., Саркисов И.Ю., Дарненко Е.О., Подчерняева Р.Я. Культивирование клеток млекопитающих на новом отечественном субстрате. Вопр. вирусологии, 1991, 6, с.523-526.

74. Хижнякова Т.М., Подчерняева Р.Я., Мельниченко Б.И. Культви-рование клеток на пористом макроносителе с использованием различных видов сывороток. Биотехнология, 1998, 5, с.38-42.

75. Хороших Е.М. Оптимизация условий культивирования линий клеток различного происхождения для репродукции производственных штаммов вирусов. Автореф. дисс. канд. биол. наук., 1991, Томск, 23 с.

76. Шубина H.A., Подчерняева Р.Я., Исаченко В.А. и др. Преимущества технологии культивирования клеток на новом пористом микроносителе. Биотехнология, 1992,2, с.40-42.

77. Царева A.A., Глинских Н.П., Дрейзин P.C. и др. Изоэнзимы и генетический анализ перевиваемых клеточных линий.- Вопр. вирусологии, 1975, 1, с.121-123.

78. Чеботарев А.Н., Селезнева Т.Г., Платонова В.И. Модифицированный метод дифференциальной окраски сестринских хроматид. Бюлл. экспер. биол. и мед., 1972, 2, с.242-243.

79. Чернышов В.И. Особенности содержания обезьян. В сб.: Руководство по вакцинному и сывороточному делу, М., 1978, с.36-44.

80. Чуич Г.А., Маковецкий Ю.А. Изменение ультраструктуры контактов гепатоцитов при механических деформациях ткани печени.-Цитология, 1976, 8, с.860-862.

81. Чумаков М.П., Дзагуров С.Г., Гагарина A.B. и др. Вопросы производства и контроля живой вакцины против полиомиелита из аттенуи-рованных штаммов Сэбина. В сб.: Полиомиелитная перроральная живая вакцина., М., 1961, с.379-390.

82. Эльберт Л.Б., Ворович М.Ф., Тимофеев A.B. Сравнительный анализ тестов in vitro и in vivo количественной оценки иммуногенности вакцины клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии - 1998, 5, с.236-238.

83. Эльберт Л.Б., Терлецкая E.H., Тимофеев A.B. и др. Очистка препаратов вируса клещевого энцефалита от клеточной ДНК. Вопр. вирусологии, 1990, 3,с.219-223.

84. Aaby P., Samb В., Simondon F. et al. Divergent mortality for male and female recipients of Iow-titer and high-titer measles vaccines in rural Senegal. Amer. J. Epidemiol., 1993, 138, p.756-755.

85. Abnormal Cells, New Pproducts, and Risks. Tissue Culture Associatin (Hopps H., Petricciani J., eds.), Gaithersburg, 1985.

86. Airiza A., Gaos S., Dindin N.et al. Some experiences on the implementation of the perfusion method for the preparation of primary monkey kidney cell suspension. Bull. Bio-Farma, 1975, 12, 2, p. 1-7.

87. Ajjan N., Plotkin S. Comparative study of the safety and protective value, in pre-exposure use, of rabies vaccine cultivated on human diploid cells and of the new vaccine grown on Vero cells. Vaccine, 1989, 7, p. 125-128.

88. Alimova I., Kodihalli S., Govorkova E. et al. Immunogenicity and protective efficacy in mice of influenza virus B vaccines grown in mammalian cells or embryonated chicken eggs. J. Virol., 1998, 72, p.472-477.

89. Amariglio N., Rechavi G. Insertional mutagenesis by transposable elements in the mammalian genome. Environ. Mol. Mutagen., 1993, 21, p.212-218.

90. American Type Culture Collection, Catalogue, 2000.

91. Amosenko F., Svitkin Y., Popova V. et al. Use of protamine sulphate for elimination of substrate DNA in poliovaccines produced on continuous cell lines. Vaccine, 1991, 9, p.207-209.

92. Baijot B., Duchene M., Stephenne J. Production of aujeszky vaccine by the microcarrier technology "from the ampoule to the 500 litre fermentor".-Dev. Biol. Stand., 1987, 66, p.523-530.

93. Bancel S, Hu WS. Confocal laser scanning microscopy examination of cell distribution in macroporous microcarriers. Biotechnol. Prog., 1996, 3, p.398-402.

94. Bashor M. Dispersion and disruption of tissues. In: Meth. Enzymol., N.Y., 1979, 58, p.l 19-131.

95. Beale A. Choice of cell substrate for biological products. Exper. Biol. Med., 1979, 118, p.83-97.

96. Beale A. The production of viruses for human vaccines from animal cells in culture. In: Animal Cell Biotechnology (Spier R., Griffiths J., eds.), Butterworths, 1992, p. 189-200.

97. Belford G. Membranes and bioreactors: a technical challenge in biotechnology. Biotech. & Bioeng., 1989, 8, p. 1047-1066.

98. Berg G., Bodeker B. Employing a ceramic matrix for the immobilization of mammalian cells in culture. In: Animal Cell Biotechnology (Spier R., Griffiths J., eds.) Acad.Press,London, 1988, 3, p.321-335.

99. Berry J., Barnabe N., Coombs K., Butler M. Production of reovirus type 1 and type 3 from Vero cells grown on solid and macroporous microcarriers. Biotech. & Bioeng., 1998, 62, p. 12-19.

100. Billig D., Clark J., Ewell A. et al. The separation of harvested cells from microcarriers: a comparisson of methods. Dev. Biol. Stand., 1984, 55, p.67-75.

101. Bishop L., Smith M., Beale A. An apparatus for producing trypsinized monkey kidney cell suspensions. Virology, 1960, 10, 2, p.280-283.

102. Brown P., Figueroa C., Costello M. et al. Непрерывно-проточное культивирование клеток животных. - В сб.: Биотехнология клеток животных, М., 1989, т.2, с. 210-226.

103. Burbidge С., Dacey I. The use of plate heat exchangers in growing human fibroblasts. - Dev. Biol. Stand., 1984, 55, p.255-259.

104. Butler M. A comparative review of microcarriers available for the growth of anchorage-dependent animal cells. -In: Animal Cell Biotechnology (Spier R.,Griffiths J., eds.) Acad.Press, London, 1988, 3, p.284-303.

105. Butler M., Burgener A., Patrick M. et al. Application of a serum-free medium for the growth of Vero cells and the production of reovirus. Bio-technol.Prog., 2000, 16, p.854-858.

106. Caij A, De Smet A, Dubois N, Koenen F. High titre Hog Cholera virus production on Cytodex 3 microcarrier cultures.- Arch.Virol., 1989, 105, p. 113-118.

107. Capstick P., Golland A., Chapman W., Masters R. Production of foot and mouth disease virus antigen taken from BHK21 clone 13 cells grown and infected in deep suspension cultures. Nature, 1965, 205, p.l 135-1136.

108. Carter M., Facklam T., Long P., Scotland R. Are continuous cell lines safe as substrates for human drugs and biologies? A case study with human growth hormone. Dev. Biol. Stand., 1989, 70, p. 101 -107.

109. Cell Substrates. Their use in the production of vaccines and other bi-ologicals., N.Y., Plenum Press, 1979.

110. Chisti Y. Hydrodinamic damage to animal cells. Crit. Rev. Bio-technol., 2001,2, p.67-110.

111. Chen T. In situ detection of mycoplasma contamination in cell cultures by fluorescent Hoechst33258 strain. Exp. Cell Res., 1977, 104, p.225-262.

112. Cherri R., Papoutsakis E. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech. & Bioeng., 1988, 8, p. 1001-1014.

113. Chumakov K., Dragunsky E., Norwood L. et al. Consistent selection of mutations in the 5'-untranslated region of oral poliovirus vaccine upon passaging in vitro. J. Med. Virology, 1994, 42, p.79-85.

114. Clark M., Gannon B., Bodkin N. et al. An impruved procedure for the high-yield preparation of intact beating heart cells from the adult rat biochemical and morphological study. J. Mol. Cell Cardiol., 1978, 2, p. 1101 -1121.

115. Committee Report: Continuously cultured tissue cells and viral vaccines. Science, 1963, 139, p. 15-20.

116. Corbeil M., Trudel M., Payment P. Production of cells and viruses in a new multiple-tube tissue culture propagator. J. Clin. Microbiol., 1979, 10, p.91-95.

117. Coronato S., Vullo D., Coto C. A simple method to eliminate mycoplasma from cell cultures. J. Virol. Methods, 1994, 1, p.85-94.

118. Crespi C., Imamura T., Leong Ph. et al. Microcarrier culture: applications in biologicals production and cell biology. Biotech. & Bioeng., 1981, 23, p.2673-2689.

119. Croughan M., Hamel J., Wang D. Effects of microcarrier concentration in animal cell culture. Biotech. & Bioeng., 1988, 8, p.975-982.

120. De Oca M., Probst H. Preparation of monolayer cultures of renal tissue. Appl. Microbiol., 1971, 2, p. 127-130.

121. Dobbs L., Geppert E.,Williams M. et al. Metabolic properties and ultrastructure of alveolar type II cells isolated with elastase. Biochim. & Bio-phys. Acta, 1980,3, p.510-523.

122. Doehmer J. Residual cellular DNA as a potential transforming factor. Dev. Biol. Stand., 1987, 68, p.33-35.

123. Dulbecco R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. P.N.A.S. USA, 1952, 8, p.747-752.

124. Dulbecco R.,Vogt. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J. Exp. Med., 1955, 99, p. 167-182.

125. Dureux B., Canton P., Gerard A., Ajjan N. Rabies virus for human use, cultivated on Vero cell. Lancet, 1986, 2, p.8498-8500.

126. Duxbury M., Jezuit M., Letwin B., Wright J. DNA in plasma of human blood for transfusion. In: Safety of Biological Products Prepared from

127. Mammalian Cell Culture (Brown F., Griffiths E., Horaud F., Petricciani J., eds.), Dev. Biol. Stand., 1998, 93, p. 125-128.

128. Ellender R., Wharton J., Middlebrooks B. An established spleen cell line from Bairdiella chrysura. In Vitro, 1979, 2, p. 112-113.

129. El-Karamany R. Production in Vero cells of an inactivated rabies vaccine from strain FRV/K for animal and human use. Acta Virol., 1987, 31, p.321-328.

130. Emeis J., Planque B. Heterogeneity of cells isolated from rat liver by pronase digestion: ultrastructure, cytochemistry and cell culture. J. Reticulo-cndothel. Soc. Rres., 1976, 20, 1, p.l 1-29.

131. Escriou N., Vignuzzi M., Gerbaud S., van der Werf S. Naked RNA immunization: positive RNA virus-derived replicons as vaccine vectors against influenza. In: Xl-th International Congress of Virology, Sydney, Australia, 1999, p.61.

132. European Collection of Animal Cell Cultures. Catalogue of Cell Lines and Services. 4-th edition.

133. Everet M., Shipman C., Owens R. et al. Preparation of primary cell cultures with four proteolytic enzimes. In Vitro, 1972, 7,4, p.265-268.

134. Facklam T. Absence of retroviruses in a murine cell line used in the production of human growth hormone. Dev. Biol. Stand., 1989, 70, p.203-204.

135. Fenge C., Klein C., Heuer C. et al. Agitation, aeration and perfusion modules for cell culture bioreactors. Cytotechnology, 1993, 11, p.233-244.

136. Fleckenstein E., Uphoff C., Drexler H. Effective treatment of mycoplasma contamination in cell lines with enroflaxacin (Baytril). Leukemia, 1994, 8, p.1424-1434.

137. Foley J., Aftonomos B.The use of pronase in tissue culture: comparison with trypsin. J. Cell Physiol., 1970, 7, 2, p. 159-161.

138. Frazatti-Gallina N., Paoli R., Francisco I. et al. Obtention of rabies antigen through BHK21 cells adhered to microcarriers. Rev. Inst. Med. Trop., 1998,40, p.291-294.

139. Frazatti-Gallina N., Paoli R., Mourao-Fuches R. et al. Higer production of rabies virus in serum-free medium cell cultures on microcarriers. J. Biotechnol., 2001, l,p.67-72.

140. Frazier M., Hadley J.,Andrews T., Drucker H. Use of thermolisin for the dissociation of lung tissue into cellular components. Lab. Invest., 1975, 33, 3,p.231-238.

141. Freshney R. Animal cell culture: a practical approach. IRL Press, Oxford, 1986, 248 p.

142. Gallegos G., Espinosa L., Ramos R. et al. Rabies veterinary virus vaccine produced in BHK-21 cells grown on microcarriers in a bioreactor. Arch. Med. Res., 1995, l,p.59-63.

143. Garber H., WitteJ.,Tayback M. et al. Clinical reactions following vaccination with two types of live virus measles vaccines. JAMA, 1968, 5, p.309-311.

144. Gebhart E. Sister chromatid exchange (SCE) and structural chromosome abberation in mutagenicity testing. — Hum. Genet., 1981, 58, p.225-254.

145. Girard H., Sutcu M., Erdem H., Gurhan I. Monolayer culture of animal cells with the Gyrogen equipped with tubes. Biotech. & Bioeng., 1980, 22, p.477-493.

146. Glacken M. Bioreactor control and optimization. In: Animal cell bioreactors (Ch.Ho, D.Wang eds.), Butterworth-Heinemann, 1991, p.373-404.

147. Gluck R., Hoskins J., Wegmann A. et al. Rubini, a new live attenuated mumps vaccine virus strain for human diploid cells. In: Use and Standardization of Combined Vaccines (Wezel van A., Hennessen W., eds.), Dev. Biol. Stand., 1986, 65, p.29-35.

148. Goodpasture C., Bloom S., Hsu Т., et al. Human nucleolar organizers: the satellites or the stalks? J. Hum. Genet., 1976, 28, p.559-566.

149. Gray D. Insertional mutagenesis: neoplasia arising from retroviral integration. Cancer Invest, 1991, 9, p.295-304.

150. Grachev V. World Health Organization attitude concerning the use of continuous cell lines as substrate for production of human virus vaccines. -In: Advances in Biotechnological Processes Viral Vaccines (Mizrahi A.,ed.), Wiley-Liss, 1990, 14, p.37-67.

151. Greenwald P., Woodard E, Nasca P. et al. Morbidity and mortality among recipients of blood from pre-leukemic and pre-lymphomatous donors. -Cancer, 1976, l,p.324-328.

152. Griffiths J. Биология клетки: экспериментальные аспекты. В сб.: Биотехнология клеток животных., М., 1989, т.1., с.58-97.

153. Griffiths Е. WHO Expert Commitee on Biological Standardization Highlights of the Meeting of October 1996 Biologicals, 1997, 25, p.359-362.

154. Griffiths J., Cameron D., Looby D. A comparison of unit process systems for anchorage dependent cells. Dev. Biol. Stand., 1987, 66, p.331 -338.

155. Griffiths J., Looby D. Fixed immobilized beds for the cultivation of animal cells. In: Animal Cell Bioreactors (Ho Ch., Wang D.,eds.), Butterworth-Heinemann, 1991, p. 165-190.

156. Grohn P., Klock G., Zimmermann U. Collagen-coated Ba2+ -alginate microcarriers for the culture of anchorage-dependent mammalian cells. Biotechniques, 1997,5, p.970-975.

157. Grossen P., Drets M., Arrighi F., Jonston D. Analysis of the frequency and distribution of sister chromatid exchanges in cultured human lymphocytes. Hum.Genet., 1977, 35, p.345-352.

158. Halperin S., Nestruck A., Eastwood B. Safety and immunogenicity of a new influenza vaccine grown in mammalian cell culture. Vaccine, 2002, 20, p. 1240-1247.

159. Harms E, Wendenburg J. Large scale perfusion culture of cells growing on surfaces with automatic gas and medium control.- Cytobiologie, 1978, 1, p.67-75.

160. Hayilick L. Human virus vaccines: why monkey cells? Science, 1972, 176, p.813-814.

161. Hayflick L. Subculturing human diploid fibroblast cultures. In: Tissue Culture Meth. Appl. (Kruse F., Patterson M.,eds.), N.Y., 1973, p.220-223.

162. Hayflick L. History of cell substrates used for human biologicals. -Dev. Biol. Stand., 1989, 70, p.l 1-26.

163. Hayflick L., Moorhead P. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exper. Cell Res., 1961, 25, p.585-621.

164. Hayflick L., Moorhead P., Pomerat C., Hsu T. Choice of a cell system for vaccine production. Science, 1963, 140, p.766-768.

165. Hayflick L., Plotkin S., Norton T., Koprowski H. Preparation of poliovirus vaccines in a human fetal diploid cell strain. Amer. J. Hyg., 1962, 75, p.240-258.

166. Hayflick L., Plotkin S., Stevenson R. History of the acceptance of human diploid cell strains as substrates for human virus vaccine manufacture. -In: Cells, Products, Safety (Petricciani J., Hennessen W.,eds.), Dev. Biol. Stand., 1987, 68, p.9-17.

167. Hilderman R., Goldblatt P. Procedure for preparation and characterization of liver cells made permeable by treatment with toluene. In: Meth. Cell Biol., N.Y., 1977, 15, p.371-380.

168. Hilfer S. Collagenase treatment of chick heart and thyroid. In: Tissue Cult. Meth. and Appl., N.Y., 1973, p. 16-20.

169. Hilleman M. Cell line saga an argument in favor of production of biologies in cancer cells. - Exper. Biol. Med., 1979, 118, p.47-58.

170. Horaud F. Absence of viral sequences in the WHO-Vero cell bank. A collaborative study. In: Continuous Cell Lines - An International Workshop on Current Issues (Brown F., Esber E., Williams M., eds.). Dev. Biol. Stand., 1992, 76, p.43-46.

171. Horaud F. Viral vaccines and residual cellular DNA. Biologicals, 1995, 3, p.225-228.

172. Hull R. Immunization of experimental animals with vaccines produced in known oncogenic cells. Nat. Cancer Inst. Monograph, USA, 1968, 29, p.503-509.

173. Ikic D. Recent information on poliomyelitis vaccine, live, oral, prepared in human diploid cell strain system. Progr. Immunobiol., 1964, 2, p.305-310.

174. Irie Y. Neutral protease usefull for animal tissue and cell culture.-Patent USA, 1976, №592534.

175. Jacobs J., Jones C., Bailie J. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature, 1970, 227, p. 168-170.

176. Jaiiaroensup W., Lang J., Thipkong P. et al. Safety and efficacy of purified Vero cell rabies vaccine given intramuscularly and intradermally. (Results of a prospective randomized trial). Vaccine, 1998, 16, p. 1559-1562.

177. Juarashi S. A simple enzymatic method for isolation of hepatocytes.-Experientia, 1977,33, 10, p. 1401-1402.

178. Kamili S., Spelbring J., Krawczynski K. DNA immunization in experimental model of HEV infection. In: Xl-th International Congress of Virology, Sydney, Australia, 1999, p. 123.

179. Kanoza R., Brunette D., Purdon A., Sodek J. Isolation and identification of epithelial-like cells in culture by a collagenase-separation technique.-In Vitro, 1978, 14, 9, p.746-753.

180. Kammer H. Cell dispersial methods for increasing yield from animal tissues. Appl. Microbiol., 1969, 17, 4, p.534-526.

181. Katinger H., Scheirer U. Массовое культивирование клеток животных и получение продуктов. В сб.: Биотехнология клеток животных., М., 1989, т. 1, с. 179-209.

182. Kistner О., Barrett P., Mundt W. et al. Development at a novel influenza vaccine derived from a continuous cell line. Altex, 2001, 18, p.50-54.

183. Kitano K. Serum-free media.- In: Animal cell bioreactors (Ch.Ho, D.Wang eds.), Butterworth-Heinemann, 1991, p.73-106.

184. Klietmann W., Klietmann В., Cox J., Charbonnier C. Effectiveness and tolerance of pre- and post-exposure treatment with purified inactivated rabies vaccine prepared on Vero cell line. Vaccine, 1988, 6, p.39-43.

185. Knuutila S., Maki-Paakanen J., Kahkonen M., Hakkanen E. An increased frequency of chromosomal changes and SCE's in cultured blood lymphocytes of 12 subjects vaccinated against smalpox. Hum. Genet., 1978, 1, p.89-96.

186. Kratje R., Reimann A., Hammer J., Wagner R. Cultivation of recombinant baby hamster kidney cells in a fluidized bed bioreactor system with porous borosilicate glass.- Biotechnol. Prog., 1994, 4, p.410-420.

187. Kurth R. Risk potential of the chromosomal insertion of foreign DNA.- In: Safety of Biological Products Prepared from Mammalian Cell Culture (Brown F., Griffiths E., Horaud F., Petricciani J., eds.), Dev. Biol. Stand., 1998, 93, p.45-56.

188. Lambert K., Birch J. Среды для выращивания клеток. В сб.: Биотехнология клеток животных., М., 1989, т.1, с.98-138.

189. Larsson В., Litwin J. The growth of polio virus in human diploid fibroblasts grown with cellulose microcarriers in suspension cultures. -Dev. Biol. Stand., 1987, 66, p.385-390.

190. Looby D., Griffiths J. Fixed bed porous glass sphere (porosphere) bio-reactors for animal cells. Cytotechnology, 1988, 1, p.339-346.

191. Lower J. Human retroviruses as risk factors in the production of biologicals. In: Continuous cell lines as substrates for biologicals (Hayflick L., Hennessen W., eds.), Arlington, Virginia, Karger, 1988, p. 19-23.

192. Lowy D. Potential oncogenic hazards posed by oncogenic encoded proteins. — Dev. Biol. Stand., 68, p.63-67.

193. Lupker J. Residual host cell protein from continuous cell lines. Effect on the safety of protein pharmaceuticals. Dev. Biol. Stand., 1998, 93, p.61-64.

194. Macpherson I., Montagnier L. Agar suspension culture for the selective assay of cells transformed by polyoma virus. Virology, 1964, 23, p.291-294.

195. Magrath D. Safety of vaccines produced in continuous cell lines. -In: Virological Aspects of the Safety of Biological Products (Horaud F., Brown F., eds.), Dev. Biol. Stand., 1991, 75, p. 17-20.

196. Mandache E., Moldeveanu E., Savi G. Ultrastructural and immunological features of isolated kupffer cells. Eur. J. Cell Biol., 1980, 1, p.623-624.

197. Manickan E, Rouse RJ, Yu Z. et al. Genetic immunization against herpes simplex virus. Protection is mediated by CD4+ T lymphocytes.- J. Immunol., 1995, 155, p.259-265.

198. Manousos M., Ahmed M., Torchio C. et al. Feasibility studies of oncornavirus production in microcarrier cultures. In Vitro, 1980, 15, p.507-515.

199. Mason HS, Arntzen CJ. Transgenic plants as vaccine production systems. Trends Biotechnol., 1995, 13, p.388-392.

200. Meignier B., Mangeot H., Favre H. Foot-and-mouth disease virus production on microcarrier grown cells. Dev. Biol. Stand., 1980, 46, p.249-256.

201. Mendonca R., Ioshimoto L., Mendonca R. et al. Preparation of human rabies vaccine in VERO cell culture using a microcarrier system. -Braz. J. Med. Biol. Res., 1993, 12, p.1305-1317 .

202. Mendonca R., Prado J., Pereira C. Attachment, spreading and growth of Vero cells on microcarriers for the optimization of large scale cultures. -Bioprocess Eng., 1999, 20, p.565-571.

203. Merk A. Large scale production of human fibroblast interferon in cell fermenters. Dev. Biol. Stand., 1982, 50, p. 137-140.

204. Merten O., Managuerra J., Hannoun C. et al. Production of influenza virus in serum-free mammalian cell cultures. Dev. Biol. Stand., 1999, 98, p.23-37.

205. Merten O., Cruz P., Rochette C. et al. Comparison of different biore-actor systems for the production of high titer retroviral vectors.- Biotechnol. Prog., 2001, 17, p.326-335.

206. Meulien P. DNA issues. In: Safety of Biological Products Prepared from Mammalian Cell Culture (Brown F., Griffiths E., Horaud F., Petricciani J., eds.), Dev. Biol. Stand., 1998, 93, p.57-60.

207. Microcarrier cell culture. Principles and methods. Pharmacia, Sweden, 1981, 128 p.

208. Miller W., Blanch H. Regulation of animal cell metabolism in biore-actors. In: Animal cell bioreactors (Ch.Ho, D.Wang eds.), ButterworthHeinemann, 1991, p. 119-161.

209. Minor P. Adventitious viral agent in biological products. -Dev. Biol. Stand., 1989, 70, p. 173-179.

210. Mitteregger R., Vogt G., Rossmanith E., Falkenhagen D. Rotary cell culture system (RCCS): a new method for cultivating hepatocytes on microcarriers. Int. J. Artif. Organs, 1999, 12, p.816-822.

211. Montagnon B. Polio and rabies vaccines produced in continuous cell lines: a reality for Vero cell line. In: Continuous Cell Lines as Substrates for Biologicals. Dev. Biol. Stand., 1989, 70, p.27-47.

212. Montagnon B., Fanget B., Nicolas A. The large-scale cultivation of Vero cells in microcarrier for virus vaccine production. Preliminary results for killed poliovirus vaccine. Dev. Biol. Stand., 1981, 47, p.55-64.

213. Montagnon B., Vincent-Falquet J. Experience with the Vero cell line.-In: Safety of Biological Products Prepared from Mammalian Cell Culture. Dev. Biol. Stand., 1998, 93, p.l 19-123.

214. Moorhead P., Novel P., Mellman W. et al. Chromosome preparation of leucocytes cultured from human peripheral blood. Exp. Cell Res., 1960, 20, p.613-616.

215. Mowles J. The use of ciprofloxacin for the elimination of mycoplasma from naturally infected cell line. Cytotechnology, 1988, 1, p.355-358.

216. Mundt W ., Barrett N., Dorner F. EibI J. Perfusion system and a method for the large scale production of virus or virus antigen. Patent USA №5719051, 1998.

217. National Cancer Institute Monograph, USA, 1968, p.29.

218. Nawroz H., Koch W., Anker P. et al. Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients. Nature Medicine, 1996, 2, p.1035-1037.

219. Nicholson M ., Hampson B., Pugh G., Ho Ch. Continuous cell culture. In: Animal cell bioreactors (Ch.Ho, D.Wang eds.), Butterworth-Heinemann, 1991, p.269-304.

220. Nikolai T., Hu W. Cultivation of mammalian cells on macroporous microcarriers. Enzyme Microb. Technol., 1992, 3, p.203-208.

221. Nilsson К. Microcarrier cell culture. Biotechnol. & Genetic Eng. Reviews, 1988, 6, p.403-439.

222. Ohara H. Cytogenetic examination of Vero cells derived from the present stock. In: Vero cells - origin, properties and biomedical applications (B.Simizu, T.Terasima, eds.), Tokyo 107, Japan - 1988, p.36-38.

223. Ohlson S., Branscomb J., Nilsson K. Bead-to-bead trasfer of Chinese hamster ovary cells using macroporous microcarrirs. Cytotechnology, 1994, 1, p.67-80.

224. Osterhaus A., Steenis G. Virologic control of monkeys used for the production of poliomyelitis virus vaccine. Dev. Biol. Stand., 1981, 47, p. 157161.

225. Pakos V., Johansson A. A large scale production of human fibroblast interferon in multitray battery systems. In: 6-th Proc. Gen. Meet. Eur. Soc. Animal Cell Technol., 1983.

226. Palache A., Scheepers I I., de Regt V. et al. Safety, reactogenicity and immunogenicity of Mardin Darby canine kidney cell-derived inactivated influenza subunit vaccine. A meta-analysis of clinical studies. Dev. Biol. Stand., 1999, 98, p.l 15-125.

227. Panina G. Системы выращивания в монослое: многоэлементные процессы. В сб.: Биотехнология клеток животных. М., 1989, т.1, с.227-259.

228. Peetermans J. Production, quality control and characterization of an inactivated hepatitis A vaccine. Vaccine, 1992, 10, p.99-101.

229. Peiwei G., Zhifen D., Zhongquan W. Experience with production of interferon and Japanese encephalitis vaccine in continuous cell lines. -Dev. Biol. Stand., 1989, 70, p.223-226.

230. Petricciani J., Ada G., Robbins F. WHO study group on biologicals: history, issues and goals of the meeting. Dev. Biol. Stand., 1987, 68, p. 1 -4.

231. Petricciani J. Cells, science and health. In: Continuous Cell Lines as Substrates for Biologicals (Hayflick L., Hennessen W., eds.), Dev. Biol. Stand., 1989, 70,p.3-10.

232. Petricciani J. Historical background, objectives and overview.- In: Safety of Biological Products Prepared from Mammalian Cell Culture (Brown F., Griffiths E., Horaud F., Petricciani J., eds.). Dev. Biol. Stand., 1998, 93, p.3-4.

233. Petricciani J., Regan P. Risk of neoplastic transformation from cellular DNA: calculations using the oncogene model. — Dev. Biol. Stand., 1987, 68, p.43-52.

234. Plotkin S. The detection of cytomegalovirus as a contaminant of cell cultures. In: Continuous Cell as Supstrates for Biologicals (Hayflick L, Hennessen W., eds.), Arlington, Virginia, Karger, 1989, p. 14-19.

235. Plotkin S., Cornfeld D., Ingalls T. Studies of immunization with living rubella virus: trials in children with a strain cultured from an aborted fetus.-Amer. J. Dis. Child., 1965, 110, p.381-389.

236. Prior Ch. Large-scale process purification of clinical product from animal cell cultures. In: Animal cell bioreactors (Ch.Ho, D.Wang eds.), Butterworth-Heinemann, 1991, p.445-478.

237. Proceedings of the Symposium of human diploid cell strains, Opatija, Yugoslavia, 1963, 8, p.37-58.

238. Proceedings of the Symposium on Oncogenicity of Virus Vaccines. Zagreb,Yugoslavia, 1968.

239. Putnak J., Barvir D., Burrous J. et al. Development of a purified, inactivated, denge-2 virus vaccine prototipe in Vero cells: immunogenicity and protection in mice and rhesus monkeys. J. Infect. Dis., 1996, 174, p. 11761184.

240. Rajs J., Sundberg M., Sundby G. et al. A rapid method for the isolation of viable cardiac myocytes from adult rat. Exp. Cell Res., 1978, 115, 1, p. 183-189.

241. Rasey J., Cornwell M., Maurer B. et al. Growth and radiation response of cells grown in macroporous gelatin microcarriers (CultiSpher-G).-Br. J. Cancer Suppl., 1996, 27, p.78-81.

242. Reed L., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg., 1938, 27, p.493-496.

243. Regan P., Petricciani J. The approach used to establish the safety of veterinary vaccines produced in the BHK-21 cell line. Dev. Biol. Stand., 1987, 68, p. 19-25.

244. Reiter M., Weigang F., Ernst W. et al. High density microcarrier culture with a new device which allows oxygenation and perfusion of microcarrier cultures. Cytotechnology, 1990, 1, p.39-42.

245. Reuveny S., Zheng Z.-B., Eppstein L. Evaluation of a cell culture fermenter. American Biotechnol. Lab., 1986, January/February, p.28-36.

246. Rhodes M., Gardiner S., Broad D. Scaleup of animal cell suspension culture. In: Animal cell bioreactors (Ch.Ho, D.Wang eds.), ButterworthHeinemann, 1991, p.253-268.

247. Rivera E, Karlsson K., Bergman R. The propagation of feline panleukopenia virus in microcarrier cell culture and use of the inactivated virus in the protection of mink against viral enteritis. Vet. Microbiol., 1987, 4, p.371-381.

248. Robertson J., Heath A. A collaborative study on DNA quantitation in biological products. Biologicals, 1995, 3, p. 199-205.

249. Robinson JH, Butlin PM, Imrie RC. Growth characteristics of human diploid fibroblasts in packed beds of glass beads. Dev. Biol. Stand., 1980, 46, p. 173-181.

250. Rovinski B., Klein M. Genetically engineered human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) vaccines. In: Modern Vaccinology (Kurstak E., ed.), N.Y., London., Plenum Med. Book Comp., 1994, p. 181-212.

251. Runstadler P., Cernek S. Large-scale fluidized bed, immobilized cultivation of animal cells at high densities. In: Animal Cell Biotechnology (Spier R., Griffiths J., eds.), Acad. Press, London, 1988, 3, p.306-320.

252. Russo M., Cittadini A., Dani A. et al. An ultrastructural study of calcium induced degenerative changes in dissociated heart cells. J. Mol. and Cell Cardiol., 1981, 13, 3, p.265-279.

253. Ryan U., Mortara M., Whitaker C. Methods for microcarrier culture of bovine pulmonary artery endothelial cells avoiding the use of enzymes.-Tissue and Cell, 1980, 12, 4, p.619-635.

254. Sabchareon A., Lang J., Attanath P. et al. A new Vero cell rabies vaccine: results of a comparative trial with human diploid cell rabies vaccine in children. Clin. Infect. Dis., 1999, 29, p.141-149.

255. Sabin A. Avirulent viruses for immunization against poliomyelitis.-Poliomyelitis. Papers and discusión presented at the Third Philad., Montreal, 1955, p. 186-194.

256. Sabin A. Discussion. Live poliovirus vaccines. 2-th Internat. Conf. of live poliovirus vaccines. РАНО-WHO Sci Publ., Washington, 1960, p.49.

257. Sabin A. Discussion. Session V of the International Conference on Rubella Immunization. Amer. J. Dis. Child., 1969, 118, p.378-381.

258. Salk J. Present status of the problem of vaccination against poliomyelitis. Amer. J. Public Health, 1955, 45, 3, p.285-297.

259. Salk J. The spector of malignancy and criteria for cell lines as substrates for vaccines. In: Cell Substrates. Their use in the production of vaccines and other biologicals, N.Y., Plenum Press, 1979, p. 107-113.

260. Sandford K., Earle W., Evans V. et al. The measurement of proliferation in tissue cultures by enumeration of cell nuclei. J. Nat. Cancer Inst., 1951, 11, p.773-795.

261. Sarlangue J., Poutiers F., Benaudin H., Bebear C. Assay the several antibiotic treatments for elimination of mycoplasmas from cell cultures. JOM Lett., 1992, 2, p.312.

262. Scheirer W., Merten O. Instrumentation of animal cell culture reactors. In: Animal Cell Bioreactors (Ho Ch., Wang D., eds.), ButterworthHeinemann, Boston, London, 1991, p.405-444.

263. Schmitt K., Daubener W., Bitter-Suermann D. A safe and afficient method for elimination of cell culture mycoplasmas using ciprofloxacin. J. Immunol. Meth., 1988, 109, p. 17-25.

264. Schmidt N. Метод культур тканей в диагностической вирусологии. В сб.: Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, М., 1974, с.68-145.

265. Shah К. A review of the circumstances and consequences of simian virus 40 (SV40) contamination of human vaccines. In: Continuous Cell as Supstrates for Biologicals (Hayflick L, Hennessen W., eds.), Arlington, Virginia, Karger, 1989, p.6-13.

266. Sharpe S.,Cranage M., Lee J. et al. A single oral dose of an el adenovirus vector expressing the measles virus nucleocapsid protein stimulates systemic CTL. In: Xl-th International Congress of Virology, Sydney, Australia, 1999, p.61.

267. Shipman C., de Oca M. High yield method for kidney tissue. In: Tissue Cult. Meth. Appl., N.Y., 1973, p.8-12.

268. Seglen Per O. Preparation of rat liver cells. I. Effcct of Ca2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Exp. Cell Res., 1972, 74, p.450-454.

269. Skoda R., Pakos V., Hormann A. et al. Communicating vessel systems for mass cell culture of anchorage dependent cells. Dev. Biol. Stand., 1979, 42, p.121-126.

270. Spier R. Системы выращивания в монослое: гетерогенные процессы в единичном оборудовании. В сб.: Биотехнология клеток животных., М., 1989, т.1, с.260-280.

271. Spier R. An overview of animal cell biotechnology: the conjoint application of science, art, and engineering.- In: Animal Cell Bioreactors (Ho Ch., Wang D.,eds.), Butterworth-Heinemann, 1991, p.3-18.

272. Spier R., Griffiths J. Введение. В сб.: Биотехнология клеток животных., М., 1989, т.1, с.7-19.

273. Spier R., Maroudas N. Microcarriers for animal cell biotechnology: an unfulfilled potential. In: Animal Cell Bioreactors (Ho cH., Wang D., eds.), Butterworth-Heinemann, 1991, p.191- 212.

274. Spier R., Whiteside J. The production of foot and mouth disease virus from BHK21C13 cells grown on the surface of glass spheres. Biotech. & Bioeng., 1976, 18, p.649-657.

275. Spier R., Whiteside J. The description of a device which facilitates the oxygenation of microcarrier cultures. Dev. Biol. Stand., 1983,55, p. 151-152.

276. Srivastava A., Putnak J., Lee S. et al. A purified inactivated Japanese encephalitis virus vaccine made in Vero cells. Vaccine, 2001, 19, p.4557-4565.

277. Steenis G.,Wezel A.,de Groot I., Kruijt B. Use of captive-bred monkeys for vaccine production. Dev. Biol. Stand., 1979, 45, p.99-105.

278. Szmuness W., Stevens C., Harley E. et al. Hepatitis B vaccine: demonstration of efficacy in a controlled clinical trial in a high-risk population in the United States. N. Engl. J .Med., 1980, 303, p.833-841.

279. Takahashi M., Otsuka T., Okuno Y. et al. Live vaccine used to prevent the spread of varicella in children in hospital. Lancet, 1974, 2, p. 12881290.

280. Talbot P., Lapierre J., Daniel C. et al. Growth of a murine corona-virus in a microcarrier cell culture system. J. Virol. Methods, 1989, 1, p.63-70.

281. Tam J. Physiological effects of transforming growth factor in the newborn mouse. Science, 1985, 229, p.673-674.

282. Temin H. Overview of biological effects of addition of DNA molecules to cells. J. Med. Virol., 1990, 31, p. 13-17.

283. Thomson A., Davis G., Best J., Whiteside J. Growth of rubella virus in a glass bead propagator. J. Virol. Meth., 1989, 25, p.l 19-122.

284. Tine J., Taylor J., Paoletti E. Recent advances in recombinant vaccines for viral and parasitic diseases. In: Modern Vaccinology (Kurstak E., ed.), N.Y., London, Plenum Med. Book Comp., 1994, p. 121-152.

285. Tokashiki M. High density cell culture. In: Animal cell bioreactors (Ch.Ho, D.Wang eds.), Butterworth-Heinemann, 1991, p.327-356.

286. Tramper J., de Gooijer K., Vlak J. Scale-up considerations and biore-actor development for animal cell cultivation. Bioprocess Technol., 1993, 17, p. 139-177.

287. Tree J., Richardson C., Fooks A. et al. Comparison of large-scale mammalian cell culture systems with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains. Vaccine, 2001, 19, p.3444-3450.

288. Tron F. Hepatitis B virus recombinant vaccines: achievement and progress. In: Modern Vaccinology (Kurstak E., ed.), N.Y., London., Plenum Med. Book Comp., 1994, p. 153-168.

289. Uphoff C., Gignac S., Drexler H. Micoplasma contamination in human leukemia cell lines. Elimination with various antibiotics. J. Immunol. Meth., 1992, 149, p.55-62.

290. Vesikari T., Kapikian A. Rotavirus vaccine development. In: Modern Vaccinology (Kurstak E., ed.), N.Y., London., Plenum Med. Book Comp., 1994, p.213-230.

291. Vincent-Falquet J., Peyron L., Souvras M. et al. Qualification of working cell banks for the Vero cell line to produce licensed human vaccines. Dev. Biol. Stand., 1989, 70, p.153-156.

292. Voeten J., Brands R., Palache A. et al. Characterization of high-growth reassortant influenza A virus generated in MDCK cells cultured in serum-free medium. Vaccine, 1999, 17, p. 1942-1950.

293. Vournakis J., Runstadler P. Optimization of the microenvironment for mammalian cell culture in flexible collagen microspheres in a fluidized-bed bioreactor. In: Animal cell bioreactors (Ch.Ho, D.Wang eds.), ButterworthHeinemann, 1991, p.305-326.

294. Waites К., Cassel G., Canupp K. In vitro susceptibilities of mycoplasmas and ureaplasmas to new macrolides and aryfluoroquinolones.- Anti-microb. Agents Chemother., 1988, 10, p. 1500-1502.

295. Wallace R., Vassington P., Petricciani J. et al. Development and characterization of cells lines from subhuman primates. In Vitro, 1973, 8, p.333-341.

296. Weiss S., Belisle В., Degiovanni A. et al. Insect cells as substrates for biologicals. Dev. Biol. Stand., 1989,70, p.271-280.

297. Werner A., Duvar S., Muthing J. et al. Cultivation of immortalized human hepatocytes HepZ on macroporous CultiSpher G microcarriers.- Biotech. & Bioeng., 2000, 1, p.59-70.

298. Wezel van A. Growth of cell-strains and primary cells on microcarriers in homogeneous culture. Nature, 1967, 216, p.64-65.

299. Wezel van A. Cultivation of anchorage-dependent cells and their applications. J. Chem. Technol. Biotechnol., 1982, 32, p.318-323.

300. Wezel van A. Системы выращивания в монослое: гомогенные процессы в единичном оборудовании. - В сб.: Биотехнология клеток животных., М., 1989, т. 1,с.281-300.

301. Wezel van A., Steenis van G., Hannik Ch., Cohen H. New approach to the production of concentrated and purified inactivated polio and rabies tissue culture vaccines. Dev. Biol. Stand., 1978, 41, p. 159-168.

302. Whiteside J., Spier R. The scale-up from 0.1 to 100 liter of a unit process system based on 3 mm diameter glass spheres for the production of our strains of FMDV from BHK monolayer cells. Biotech. & Bioeng., 1981, 23, p.551-565.

303. Whiteside JP, Spier RE. Factors affecting the productivity of glass sphere propagators. Dev. Biol. Stand., 1985, 60, p.305-311.

304. Wierenga D., Cogan J., Petricciani J. Administration of tumor cell chromatin to immunosupressed and non-immunosupressed primates. Bi-ologicals, 1995, 23, p.221-224.

305. Williams G. Primary and long-term culture of adult rat liver epithelial cells. In: Meth Cell Biol., N.Y., 1976, 14, p.357-364.

306. Wiseman L., Hammond W. The reacqusition of cell adhesiveness following tissue disagregation by eleven different agents. J. Exp. Zool., 1976, 17, p.429-433.

307. WHO TRS № 747, Geneva, 1987. Acceptability of cell substrates for production of biologicals.

308. WHO TRS № 771, Geneva, 1988. Expert Committee on Biological Standardization.

309. WHO TRS № 800, Geneva, 1990. WHO bank of Vcro cells for the production of biologicals.

310. WHO TRS № 878, Geneva, 1998. Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals.

311. WHO TRS № 897, Geneva, 2000. Recomendations and guidelines for biological substances used in medicine and other documents.

312. Zhang L., Zhang Y., Yan C., Yu J. The culture of chicken embryo fibroblast cells on microcarriers to produce infectious bursal disease virus. -Appl. Biochem. Biotech., 1997, 2-3, p.291-302.