Разработка методов направленного 11β- и 14α-гидроксилирования стероидов

Ядерец, Вера Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методов направленного 11β- и 14α-гидроксилирования стероидов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов направленного 11β- и 14α-гидроксилирования стероидов"

На правах рукописи №

Ядерец Вера Владимировна

Разработка методов направленного 11р- и 14а-гидроксилирования стероидов

03.01.06. «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

1 1 МАР 2011

4840664

Работа выполнена в Центре «Биоинженерия» Российской Академии Наук

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

кандидат химических наук Андрюшина Валентина Александровна;

кандидат биологических наук Войшвилло Наталия Евгеньевна

доктор химических наук Заварзин Игорь Викторович

кандидат биологических наук Мурыгина Валентина Павловна

Московский государственный университет пищевых производств.

Защита диссертации состоится 22 марта 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета.

Автореферат разослан 21 февраля 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Пискункова Н.Ф.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время в медицине и ветеринарии в качестве лекарственных средств, как правило, используются модифицированные аналоги стероидных гормонов, обладающие более сильным и направленным действием, не отягощенным побочными эффектами. Особое место среди модифицированных стероидов занимают гидроксилсодержащие стероиды, поскольку введение гидроксила в любое положение молекулы приводит либо к повышению ее биологической активности, либо к изменению направленности действия, причем на активность влияет не только положение, но и пространственная ориентация гидроксигруппы относительно стероидного скелета.

Так, например, гидроксигруппа при С16 - за глюкокортикоидную активность. Введение гидроксила в 9а-положение стероидной молекулы приводит к интермедиатам, широко используемым в фармацевтической практике для синтеза фторированных кортикоидов противовоспалительного и антиаллергического действия. Гидроксилированные в 14а-положение андростаны являются важными интермедиатами синтеза высокоактивных гестагенов, а 11а -гидроксилирование прегнановых производных повышает гестагенный и контрацептивный эффект. Избирательное гидроксилирование в 11р-положение стероидной молекулы приводит к синтезу высокоактивных кортикостероидов противовоспалительного и антиаллергического действия, таких как гидрокортизон, преднизолон, триамцинолон, дексаметазон и др., многие из которых входят в список жизненно необходимых и имеют неоценимое практическое использование в онкологии, пульмонологии, дерматологии, ревматологии и других областях медицины. |Регпапс1ез Р. е1 а1. 2003].

Спрос на стероидные лекарственные препараты в мире с каждым годом возрастает, что объясняется ухудшением экологии и ростом в связи с этим онкологических, аллергических и других заболеваний. Эта ситуация диктует необходимость поиска путей синтеза новых высокоактивных аналогов стероидов с улучшенными терапевтическими свойствами. Опыт синтеза новых стероидных соединений, являющихся структурными аналогами природных гормонов, и изучения их активности, открывает перспективу дальнейших исследований с целью создания новых эффективных препаратов, приемлемых в медицине и ветеринарии в лечебных целях и для регуляции рождаемости. Поэтому тема настоящего исследования, посвященная синтезу гидроксил-содержащих стероидов, обладающих высокой и пролонгированной активностью, не отягощенной сопутствующими побочными эффектами, является чрезвычайно актуальной.

Состояние вопроса. Химический синтез стероидных соединений труден и многостадиен и, как правило, наиболее сложным этапом этого синтеза является введение гидроксильной группы. Поэтому проблема селективного гидроксилирования относится к числу важнейших в химии стероидов. И только микробиологическое гидроксилирование позволяет заменить многостадийный химический синтез одностадийной биоконверсией. Поэтому

при модификации стероидной молекулы предпочтение отдается микробиологической трансформации, отличающейся стерео- и регио-специфичностью, недоступной химическим методам и не требующей предварительной защиты имеющихся в молекуле функциональных групп. Немаловажную роль играет в этом случае и экологическая безопасность. Зачастую, микробиологическое гидроксилирование является единственно возможным методом. (Решался Р. й а1.2003].

Однако, несмотря на полувековую историю применения микробиологических методов трансформации стероидов, процесс гидроксилирования по-прежнему остается наименее изученным. Недостаточно сведений о зависимости направленности микробиологического гидроксилирования от структуры стероидного субстрата и таксономического положения микроорганизма-трансформатора.

Используемые в известных способах синтеза штаммы недостаточно селективны, процесс гидроксилирования проводится при низких нагрузках стероидного субстрата с низкими выходами целевых продуктов, а образующиеся многочисленные побочные продукты значительно затрудняют стадии выделения и очистки.

Продолжает оставаться неизвестной физиологическая роль гидроксилирования стероидов грибами, у которых скорость, направление и ориентация трансформации зависят от вида микроорганизма, трансформируемого субстрата и ряда физико-химических факторов. Поэтому актуален поиск новых продуцентов с высокой стерео - и регио-специфической гидроксилазной активностью и подбор условий, позволяющих осуществлять данный процесс селективно с максимальным выходом целевого продукта.

В настоящее время идентифицированы различные микроорганизмы, использование которых позволяет осуществить почти все возможные трансформации стероидной молекулы. Из них наибольшую практическую значимость имеют следующие реакции: гидроксилирование (7а/р, 9а-, 11а/р-, 14а-,15а/р, 16а-), 1,2-дегидрирование и селективное отщепление боковой цепи стеринов и желчных кислот, получившие промышленное применение в производстве стероидных лекарственных препаратов.

Объектами настоящего исследования являются практически значимые процессы направленного 11р- и 14а-гидроксилирования, открывающие пути синтеза новых модифицированных стероидов с ценными фармакологическими свойствами.

Анализ фактического материала, накопленного к настоящему времени, свидетельствует о том, что, в отличие от 11а-гидроксилирования, которое осуществляют достаточное число микроорганизмов, способность к накоплению 11Р-гидроксистероидов с удовлетворительным выходом, но в смеси с 11а-гидроксипродуктами, присуща ограниченному количеству видов грибов (ЛЬягсНа огсМсИя, Сиптп^ЪатеИа Ыакезкеапа, Сипп^ИатеПа elegans, СосМ'юЪо1т 1ипа1т). И только штаммы СитЛаг'ш ктсйа (коллекций - АТСС, №0, NR.HL, ВКМ, ВКПМ и др.) из 35 известных видов широко

распространенного в природе плесневого гриба рода Сип>и1апа, проводят гидроксилирование Д4-3-кетостероидов преимущественно в 11р-положение и применяются в промышленности для получения гидрокортизона и его производных.

Несмотря на внушительное число исследований, выполненных с различными штаммами грибов и, главным образом с С. \unata, особого прогресса в процессе 11р-гидроксилирования не наблюдается: используемые штаммы далеки от совершенства, а нагрузки субстратов невысоки .

Что касается 14а-гидроксилирования, то интерес к этой реакции обусловлен тем, что 14а-гидроксистероиды или сами по себе обладают физиологической активностью, или открывают путь к синтезу соединений с высокой контрацептивной и канцеролитической активностью [УовЫока Н. е1 а1. 1994]. Однако в мировой практике используются только несколько препаратов этого ряда, что объясняется трудностью их синтеза, а конкретно - сложностью введения гидроксильной группы в стерически затрудненное 14а-положение. Кроме того, микробиологическое 14а-гидроксилирование по сравнению с 9а- и 1 ф-гидроксилированием менее изучено.

В целом, анализ литературных данных свидетельствует о том, что не смотря на большое количество работ, посвященных проблемам 11Р- и 14а -гидроксилирования, многие вопросы, имеющие ключевое значение для решения проблемы селективности и повышения эффективности этих процессов остаются недостаточно изученными.

Поэтому представлялось целесообразным разработать и оптимизировать методы направленного 11р- и 14а-гидроксилирования, обеспечивающие селективность процесса, а также максимальную нагрузку исходного субстрата и выход целевого продукта. Кроме того, планировалось на основе полученных гидроксистероидов разработать схему синтеза гестагенов нового поколения (аналогов пролигестона) и изучить их биологическую активность.

Цели и задачи работы. Основной целью работы являлась разработка методов направленного Ир- и 14а-гидроксилирования стероидной молекулы, открывающих путь к синтезу высокоактивных аналогов стероидных лекарственных препаратов.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

1. Выявить наиболее активные штаммы со способностью к 11р- и 14а-гидроксилированию стероидов андростанового и прегнанового рядов;

2. Провести селекционные работы с выбранными штаммами для разработки способов 110- и 14а-гидроксилирования с повышенными нагрузками стероидных субстратов;

3. Исследовать взаимосвязь между строением стероидной молекулы и направлением реакций гидроксилирования с помощью выбранных микроорганизмов;

4. Разработать эффективный способ 14а-гидроксилирования андростендиона как первой стадии синтеза препаратов для медицины и ветеринарии антигонадотропного и канцеролитического действия;

5. Разработать эффективный способ lip-гидроксилирования Д4-3-кетостероидов для синтеза высокоактивных аналогов стероидных лекарственных препаратов;

6. Провести исследования по синтезу пролигестона и его аналогов из андростендиона и наработать 14а-гидроксилированные производные прегнана для изучения их биологической активности.

Научная новизна работы. Методом лабораторной селекции при непосредственном участии автора получен новый штамм Cumularía lunata с маркером резистентности к антибиотику генетицину "G-418", отличающийся от известных штаммов высокой селективностью в процессе lip-гидроксилирования. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-988 и защищен патентом РФ № 2399674 (Бюл. Изобр. № 26 от 20.09.2010).

Впервые с использованием штамма С. lunata ВКПМ F-988 разработан способ направленного lip-гидроксилирования Д4-3-кетостероидов, который может быть использован при разработке биотехнологических методов получения новых лекарственных препаратов противовоспалительного и антиаллергического действия.

Впервые с использованием штамма С. lunata ВКПМ F-981, полученного ранее в лаборатории биотехнологии стероидов, разработан способ направленного 14а-гидроксилирования Д4-3,17-дикетоандростенов, перспективных в синтезе новых стероидных препаратов канцеролитического, контрацептивного и антигонадотропного действия. На способ 14а-гидроксилирования получен патент РФ № 2 407 800 (Бюл. Изобр. № 36 от 27.12.2010).

Оптимизированы процессы lip~ и 14а-гидроксилирования новыми штаммами грибов, что позволило значительно увеличить нагрузку некоторых стероидных субстратов в реакциях гидроксилирования грибами.

Осуществлен синтез пролигестона из основного предшественника андростендиона с использованием на первой стадии разработанного метода направленного 14а-гидроксилирования.

Впервые показана возможность использования 14а-гидроксикортексолона в качестве интермедиата в синтезе гестагенов нового поколения.

Впервые получен новый аналог пролигестона с высокой контрацептивной активностью.

Практическая значимость работы. Результаты работы являются основой новых биотехнологических методов получения ценных гидроксистероидов, которые или сами по себе обладают высокой биологической активностью или являются полупродуктами синтеза новых высокоэффективных аналогов стероидов.

Полученные в процессе исследования штаммы могут быть использованы в промышленном производстве стероидных лекарственных препаратов с уникальной фармакологической активностью.

Проведенная оптимизация способов направленного lip- и 14а-гидроксилирования стероидов позволит использовать эти методы при масштабировании процессов синтеза гидроксилсодержащих стероидных аналогов с ценными терапевтическими свойствами.

Разработан способ получения гестагенов нового поколения и показана их высокая контрацептивная активность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 сообщение, 5 тезисов и 2 патента РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (2007, Пущино), XX зимней международной молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва), XXVIII Российской Школе «Наука и технология» (2008, Миасс), V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2009, Москва), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. (2009, Москва), Международной конференции «Передовые технологии российских инноваторов» (2010, Париж.)

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 115страниц печатного текста, 11 таблиц, 38 рисунков. Библиография включает 153 наименований, из них 123иностранных работ.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Культивирование микроорганизмов. Культивирование мицелиапьных грибов, используемых в работе, за исключением Rhisopus nigricans, проводили в жидкой среде следующего состава (г/л): глюкоза - 20.0, пептон - 5.0, дрожжевой экстракт - 5.0, соевая мука - 10.0, рН = 6.0-6.3. Среда для выращивания R. nigricans содержала (г/л): глюкоза - 10.0, кукурузный экстракт - 15.0, КН2Р04 - 1.0, рН = 5.4-5.6. Культуры выращивали в 70-100мл среды в колбах Эрленмейера объемом 750 мл в течение 72 ч при температуре 29°С и скорости перемешивания 220 об/мин. Посевной материал (10% об.) переносили в свежую среду того же состава. Для получения рабочего мицелия продолжали инкубацию в течение 24-48 ч. Для трансформации в условиях растущей культуры через 16-18 ч роста вносили стероидный субстрат в виде раствора в метаноле (2 % об.) в количестве 0.5-1.0 г/л.

Получение гриба С. lunata, устойчивого к генетицину "G-418".

Клоны гриба, резистентные к генетицину, получали методом ступенчатой селекции на указанной выше агаризованной среде в чашках Петри, но содержащей антибиотик в определенной концентрации. Был получен штамм, обладающий способностью к росту на среде с генетицином в количестве 80 мкг/мл. Агаризованную среду с антибиотиком максимальной концентрации использовали для поддержания культуры.

Трансформацию стероидов отмытым мицелием С. lunata проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл при температуре 28-29°С и скорости перемешивания 220 об/мин. В качестве среды для трансформации использовали 1/15 М фосфатный буфер, pH = 6.0 - 6.2, который разливали в колбы по 50-70 мл. Стероидные субстраты вносили в виде растворов в органических растворителях (диметилформамид (ДМФА), метанол (МеОН), количество которых составляло 4% об, а также в виде тонко измельченного порошка или в виде комплекса с метилциклодекстрином (МЦД).

Аналитические методы.

ТСХ. Пробы стероидов экстрагировали этилацетатом (1:2 об.) и анализировали на пластинках Silufol UV 250 нм (Чехословакия) и Sorbfill UV 250 нм (Россия), используя систему хлороформ/ацетон (7:3). Для анализа трансформации 5-олефинов использовали цветные реакции, для чего пластинки опрыскивали растворами сульфата церия или ванилина в водных растворах серной или хлорной кислот и нагревали до 70-80° С.

ВЭЖХ анализ проводили на колонке "Нуклеосил С18" 250 х 4.0 мм. Подвижная фаза - смесь 70% метанола с 30% воды, подкисленной концентрированной ортофосфорной кислотой (1 мл кислоты на 1 л воды). Скорость подвижной фазы - 1.2 мл/мин. Детекция в УФ при 240 нм, чувствительность 0.05 ед. ОП на шкалу. Пробы вводили инжектором с дозирующей петлей, вместимостью 10 мкл. Определение проводили при комнатной температуре. Концентрация стандартов -1 мг/мл.

Выделение продуктов трансформации. Мицелий С. lunata отфильтровывали, промывали водой и проверяли с помощью ТСХ содержание в нем стероидов. При их наличии мицелий экстрагировали этилацетатом. Фильтрат (трансформационная среда) и промывную воду объединяли и экстрагировали до полного извлечения стероидов. Объединенный экстракт осветляли активированным углем и упаривали на роторном испарителе. Полученный остаток сушили до постоянного веса и анализировали с помощью ТСХ. Для получения индивидуальных соединений использовали метод кристаллизации в органическом растворителе (метаноле). Многокомпонентные смеси разделяли препаративной хроматографией на стеклянных пластинках Merck Kieselgel 40 F254 или на колонке с Si02 40-100 мк. На колонке выделяли также побочные соединения, которые накапливались в маточных растворах при перекристаллизации стероидов.

Выход соединений рассчитывали по формуле Q=100-P/(S-(Mp/Ms), где Р -вес выделенного кристаллического продукта, S - количество взятого в

реакцию субстрата, Мр - молекулярный вес продукта, Ms - молекулярный вес субстрата.

Хроматографирование на пластинке. 20-25 мг смеси стероидов растворяли в 1-2 мл хлороформа или в смеси хлороформ/метанол (1:1) и наносили на пластинку (20x20 см), которую помещали в систему хлороформ/ацетон (4:1). Распределение полос со стероидами определяли на УФ-хромотоскопе или проявляя раствором ванилина в хлорной кислоте. Сорбент, содержащий определенный стероид, снимали с пластинки и промывали хлорофомом на фильтре Шотта. Растворитель упаривали и выделяли кристаллический продукт, который промывали эфиром. Структуру веществ подтверждали ПМР-спектроскопией.

Хроматографирование на колонке. Многокомпонентную смесь растворяли в хлороформе и заливали на колонку, заполненную силикагелем из расчета 1 г смеси на 50 мл силикагеля. Элюировали смесью хлороформ/ацетон от 7:1 до 4:1, контролируя появление целевого стероида с помощью ТСХ. Элюат упаривали, кристаллический остаток промывали эфиром. Предполагаемую структуру подтверждали ПМР-спектроскопией.

Протонный магнитный резонанс (ПМР) использовали для идентификации продуктов трансформации. Спектры ПМР снимали на ПМР-спектрометре XL-400 («Varían» США) в CDC13 или в смеси CDC13 и D-DMSO.

Все эксперименты проведены три раза в трех повторностях. Результаты представлены усредненными значениями. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью Exel (MS Office 2007).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.2.1. Разработка способа 14а-гидроксилирования.

2.2.1.1. Выбор способа гидроксилирования. Для синтеза биологически активных 14а-гидроксилсодержащих прегнанов последнего поколения, в частности препарата пролигестона, возможны два подхода. Первый включает первоначальное построение диоксиацетоновой цепи у андростанов (5 химических стадий) с последующим одностадийным микробиологическим введением гидроксильной группы в 14а-положение.

Согласно второму пути, сначала осуществляется введение 14а-гидроксигруппы химическим или микробиологическим способом в молекулу стероида и последующим наращиванием прегнановой боковой цепи до получения целевого продукта.

Исходными соединениями в обоих вариантах являются андростендион (АД) и дегидроэпиандростерон (ДЭА) - полупродукты синтеза стероидных препаратов из растительного сырья. Первоначально мы проверили возможность введения гидроксильной группы при Си с помощью химических реакций.

К сожалению опробованные нами варианты синтеза оказались неудачны: Нам не удалось получить 14а-ОН-АД химическим путем, a выход 14а-ОН-ДЭА не превысил 35%. Это согласуется с известными из литературных

источников данными по химическим методам 14а-гидроксилирования, отличающимся жесткими условиями реакций и чрезвычайно низкими выходами.

Прямое введение кислородной функции в неактивное положение стероидного ядра на стыке колец С и D стероидной молекулы (intact ring system) было осуществлено путем окисления хромовым ангидридом 5,6-дибромида ацетата ДЭА в уксусной кислоте в безводных условиях по методу Физера с последующим дебромированием продукта реакции. Однако данный способ оказался малоэффективным. Таким образом, микробиологическое 14а-гидроксилиирование оказалось предпочтительнее.

2.2.1.2. Исследование гидроксилазной активности плесневых грибов.

Кортексолон (в-во «S») - основное соединение в синтезе биологически активных стероидных соединений, а после введения 14а-гидроксигрупы и удаления гидроксильной группы в 21-положении может быть рассмотрено как ценный интермедиат в синтезе гестагенов нового поколения.

Поэтому, на первом этапе исследования была проведена работа по поиску культур, способных вводить 14а-гидроксильноую группу в молекулу АД, ацетата ДЭА (АДЭА), в-во «S». Для исследования были выбраны культуры, имеющиеся в коллекции Центра «Биоинженерия» РАН: Cunninghamella blakesleeana ВКМ F-993, Cunninghamella echinulata ВКМ F-1059, Curvularia lunata ВКПМ F-981, Helicostylum piriforme ВКМ F-1068, Mortierella isabellina BKM F-1626, Rhizopus nigricans LBS, Thieghemella hyalospora LBS. Основанием для такого выбора служили литературные данные о способности штаммов этих микроорганизмов к образованию 11- и 14-гидроксипроизводных Д4-3-кетостероидов ряда андростана и прегнана.

Результаты представлены в табл.1.

Таблица 1.

Гидроксилирование в-ва «S», АД и АДЭА плесневыми грибами

Культура Субстраты, реакции

«S» АД АДЭА

основная реакция побочная реакция основная реакция побочная реакция основная реакция побочная реакция

С. lunata llß- 14а- 14a 17-СО-> 17ß-OH 7а -

С. blakesleeana 11а- llß- н/пр Последы 7а н/пр

С. echynulata 11а- llß- н/пр Наследи 7а н/пр

Н. piriforme н/пр н/пр 7а н/пр

М. isabellina 11а- llß- н/пр 7а 17-СО-> 17ß-OH

Т. hyalospora 11а- llß- 17-СО-> 17ß-OH 7а н/пр

R. nigricans 1 la- 6ß- 1 la- 6ß- Па- lia-

Прим. н/пр - смесь неидентифицированных продуктов; 17-СО -> 17ß-OH-восстановление кетогруппы при Сп; (-) - отсутствие реакции.

Как видно из представленных данных, 14а-гидроксилирование как основная реакция протекала только при гидроксилировании АД с помощью культуры С. lunata. Наблюдалось образование 14а-гидрокси-АД (14а-ОН-АД), a в качестве побочного соединения - 11 Р-гидрокси-тестостерона (110-ОН-ТС) (см. рис.1). При трансформации в-ва «S» для всех штаммов, кроме Н. piriforme, отмечена способность вводить в в-во «S» 11-гидроксигруппу. И только при трансформации с помощью С.lunata наблюдалось образование 14а-производного, но в качестве побочного продукта (рис.2).

сн,9н

АД 14а-ОН-АД 11р-ОН-ТС

Рис. 1. Гидроксилирование АД С. lunata.

н I I п I п + I I н I он

«S» «F» 14a-0H-«S»

Рис. 2. Гидроксилирование «S» С. lunata.

Для культуры R. nigricans, в отличие от С. lunata, характерна одинаковая направленность гидроксилирования Д4-3-кетостероидов ряда прегнана (в-во «S»,) и андростана (АД). При наличии lla-/lip- гидроксилазной активности по отношению к в-ву «S», хотя и слабой, у культур С. blakesleeana,

C. echinulata, М. isabellina при гидроксилировании АД наблюдалось образование смеси трудно разделяемых гидроксипроизводных. Тем не менее, в культуральной жидкости грибов рода Cunninghamella зафиксировано присутствие 14а-0Н-АД в следовых количествах. В ряде случаев идентифицированы

продукты восстановления Ср-кетогруппы, т.е. происходила реакция, которая является первым шагом к деструкции кольца

D. Следовательно, т.н. смесь не идентифицированных продуктов могла состоять из целого ряда гидроксипроизводных, образующихся на разных стадиях разрушения стероидной молекулы.

Исключением являются эксперименты с культурой Т. hyalospora, которая гидроксилировала в-во «S» и АДЭА, но АД только восстанавливала в ТС, который оказался основным продуктом трансформации, что для данной культуры показано впервые.

У исследуемого штамма Н. piriforme способность вводить 14а-гидроксигруппу в в-во «S» и АД не обнаружена, хотя согласно литературным данным [Ни S.-h. et al. 1995] этот вид образует 14а-гидроксипроизводные из ТС, АД и прогестерона (Д'ПГ).

Таким образом, для 110- и 14а-гидроксилирования был выбран штамм СЛипаШ Р-981, полученный ранее в нашей лаборатории методом селекции при непосредственном участии автора.

2.2.1.2. Выбор субстрата для синтеза 14а-гидроксилированных производных прегнана. С целью выбора субстрата для синтеза гестагенов нового поколения был проведен анализ продуктов трансформации стероиднов андростанового, прегнанового и эстранового рядов. Идентификация продуктов гидроксилирования проводилась с помощью ПМР-спектроскопии. Концентрация исходных соединений - 1г/л. Результаты представлены на рис.3 и 4.

Н - АД, АДЦ Я=Н-)4а-ОН-АД, Но-ОН-АДД 19-Н0р-ТС 11Д-ОН-19-Н0Р-ТС

Рис. 3. Гидроксилирование Д4-3-кетоандростенов СЛипаШ.

Установлено, что основными продуктами гидроксилирования Д4-3-кето-прегнанов мицелием С. 1ипа1а являются 11Р-гидроксистероиды. Гидроксилирование Д4-3-кетоандростанов с кетогруппой при С]7 -андростадиендиона (АДЦ), АД и 9а-гидрокси-АД (9а-ОН-АД) происходило в основном в 14а-положение. Гидроксилирование 17-гидрокси-андростенов -канренона и ТС происходило так же, как и гидроксилирование прегнанов, -в 11р-положение. А при трансформации 17а-метил-тестостерона (17а-СН3-ТС) помимо 11р-гидроксилирования, наблюдалось введение гидроксильной группы в 7а- и 7р-положения.

R-Ac, R'= H -21-Ac-«S» R, R'= Ас - 17,21-диацетат- «S»

R, R'= H - «S»

«F»

R= H - 16a-CH3-«S» 16a-CH3-«F» R=Ac-21-Ac-CH3-«S»

CH,

6a-CH3-«S»

6a-CH3-«F»

17a-OH- Д4ПГ

11 ß, 17а-дигидрокси-Д4ПГ

О,

16,17-оксидо- Д4ПГ 11 ß-OH-16,17-оксидо- Д4ПГ Рис. 4. Гидроксилирование Д4-3-кетопрегнанов С. lunata.

Данные гидроксилирования АД, ТС и 17а-СН3-ТС отчетливо демонстрируют зависимость положения и ориентации вводимой гидроксильной группы от структуры стероидной молекулы. Они хорошо согласуются с основными положениями теории направленного гидроксилирования, разработанной проф. Джонсом с сотр. для 5а-Н-стероидов, согласно которой направление вводимой в стероиды гидроксигруппы определяется структурой стероидной молекулы, определяющей в свою очередь ее ориентацию по отношению к активному центру фермента [Jones Е. R. Н. 1973].

Особый интерес представляло получение 14а-гидроксипроизводного CN-АД, поскольку метод построения из данного соединения прегнановой боковой цепи известен и легко осуществим [Патент РФ № 2156255]. Однако вместо него при микробиологическом гидроксилировании CN-АД (рис. 5.) получили с низким выходом 14а-ОН-АД (не более 30%), причем при концентрации субстрата не выше 0.5 г/л. По-видимому, ингибирующее влияние циангидринной группировки не способствовало образованию нужного продукта, к тому же сама эта группировка оказалась неустойчивой в условиях гидроксилирования.

СИ-АД АД 14а-0Н-АД

Рис. 5. Гидроксилирование СИ-АД (0.5 г/л) С. \unala.

На основании полученных результатов, для оптимизации условий микробиологического 14а-гидроксилирования был выбран АД (рис. 2).

В связи с высокой гидрофобностью указанного субстрата были проведены эксперименты по определению его оптимального количества. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица № 2.

Трансформация АД и накопление продуктов гидроксилирования

Концентрация АД, г/л Время трансформации, ч Степень конверсии АД, % Содержание продуктов гидроксилирования, %

14а-ОН-АД Пр-ОН-ТС

2.0 28 80 58 15

3.0 40 50 42 следы

4.0 40 40 30 следы

Как видно из табл. 2, наибольшая степень конверсии АД и максимальное содержание 14а-ОН-АД (55-58%), имели место при нагрузке исходного не выше 2 г/л.

Можно предположить, что концентрация АД является лимитирующим фактором при его трансформации с помощью мицелия С. 1ипШа. В нашем случае из-за высокой гидрофобности АД, большая его часть оставалась недоступной для стероидных гидроксилаз и концентрация 2.0 г/л являлась предельной.

2.2.1.3. Поиск путей регуляции 11р/14а-гидроксилазной активности С. /ииaía. В связи со способностью выбранной культуры образовывать 11 р- и 14а-гидроксипроизводные в обоих рядах проводилась работа по поиску условий, позволяющих проводить процессы более селективно. Известно, что на гидроксилазную активность влияют возраст микроорганизма-трансформатора и его количество, состав ростовой и трансформационной сред, наличие в среде индукторов ферментной активности или веществ, влияющих на проницаемость клеточной стенки, способы внесения трансформируемых субстратов и т.п. В ряде случаев показано, что изменение указанных факторов помогает регулировать как скорость, так и соотношение основных продуктов.

Как видно из табл. 3 и 4 наибольшей стероид-гидроксилазной активностью обладает мицелий, возраст которого соответствует 24 ч. Однако, оптимальное количество биомассы, необходимое для эффективного превращения в-ва «8» (4.0 г/л) и АД (2.0 г/л) в в-во «Р» (гидрокортизон) и в

14а-0Н-АД соответственно, различно. Для трансформации в-ва «8» оно составляет 13.5-15.0 г/л (сухой вес), для АД - 9.5 - 10.5 г/л. В оптимальных условиях была достигнута степень конверсии в-ва «5» - не ниже 90%, содержание в-ва «Р» - 60%; степень конверсии АД - 80-85%, содержание 14а-ОН-АД - 60%.

Таблица 3.

Потребление АД и накопление основных продуктов трансформации

в зависимости от возраста мицелия и его количества

Содержание АД и продуктов гидроксилирования, %

Возраст Время АД 14а-ОН-АД ир-он-тс

мицелия, ч тр-ни, ч биомасса*, г/л

1 2 1 2 1 2

24 24 следы - 60 50 10 20

48 24 - 0,2 40 45 следы 10

Прим.* 1-9,5-10 г/л; 2- 13,5-15 г/л.

Таблица 4.

Потребление «8»и накопление основных продуктов трансформации в зависимости от возраста мицелия и его количества

Возраст мицелия, ч Время тр-ни, ч Содержание «в» и продуктов гидроксилирования, %

«в» | «Р» | 14(1-011-8

биомасса*, г/л

1 2 1 2 1 2

24 26 10 - 55 62 10 15

48 26 15 следы 47 52 8 7

Прим.* 1 - 9,5-10 г/л; 2 - 13,5-15 г/л.

Необходимо отметить, что увеличение биомассы с 9.5 до 15.0 г/л при трансформации АД привело к интенсификации процессов восстановления и и увеличению содержания таких побочных продуктов, как ТС и Пр-ОН-ТС (схема гидроксилирования АД представлена на рис. 6).

Также известно [Суходольская Г.В. и др, 1986], что для мицелия С. \imata, находящегося в стационарной фазе роста, что соответствует 48 ч, характерна более высокая 14а-гидроксилазная активность по отношению к в-ву «8». Однако в нашем случае эти данные не были подтверждены, и лучшие результаты получены с культурой в середине экспоненциальной фазы роста (24 ч). Можно предположить, что происходящие со временем морфофизиологические изменения клетки приводят к изменению массообменных процессов, и в результате трудно растворимые стероиды становятся недоступными для стероидных гидроксилаз. Подтверждением сказанного является тот факт, что мицелий, находящийся в стационарной фазе роста, имеет черный цвет в отличие от светлокоричневой окраски растущего мицелия, что свидетельствует о накоплении меланина в клетке. [Ьашэтк Я. е1 а1.2003]. Поэтому, если предположить, что гидроксилирование

стероидов - это одна из стадий их детоксикации, то защищенный меланином мицелий становится невосприимчивым к внешним экзогенным веществам, в том числе и к стероидам.

11р,14а-дигидрокси-АД Рис. 6. Продукты трансформации АД С. Innata ВКПМ F-981

Не привело к увеличению активности мицелия и выращивание его в среде, содержащей индукторы, в качестве которых мы использовали АД, в-во «S», Д4ПГ и ДЭА в количестве 0.2 г/л. Литературные данные также подтверждают конститутивную природу 1 ip-гидроксилазы [Smith К. Е et. al. 1994.]

Конверсия в-ва «S» (4.0 г/л) и АД (2.0 г/л) в буферах разного состава не выявила существенных различий в накоплении в-ва «F» и 14а-ОН-АД соответственно или соотношении основных реакций к побочным, (рис. 7 и 8)

Примечание к рис. 7 и 8: 1 - фосфатный буфер (контроль); 2 -цитратный буфер; темные символы - в-во «S», АД; светлые - в-во «F», 14а-ОН-АД.

Во всех приведенных примерах степень конверсии исходных соединений и выход целевых продуктов были практически одинаковыми. Для в-ва «S» степень конверсии составляла 90%, содержание в-ва «F» не превышало 60%, содержание 14a-OH-«S» -15%; степень конверсии АД - 8085%, содержание 14а-ОН-АД-бО%, 11р-ОН-ТС- 15%.

Рис. 7. Потребление «Б» и накопление «Р».

Рис. 8. Потребление АД и накопление 14а-ОН-АД

10 15 Время, ч

Согласно литературным данным, некоторые растворители, солюбилизаторы и поверхностно активные вещества позволяют регулировать как скорость реакции, так и выход, и соотношение основных продуктов трансформации. [НогЬоИ С. & а1. 1999]

Влияние ДМФА и МеОН на потребление в-ва «8» (4.0 г/л) и АД (2.0 г/л) и соответственно накопление в-ва «Р» и 14а-ОН-АД показано на рис. 9-10.

Примечание к рис. 9-10: способ внесения субстратов: 1- микрокристаллы (контроль); 2 - 4% р-р ДМФА; 3 - 4% р-р МеОН.

Рис. 9. Накопление в-ва «И» в присутствии растворителей.

Рис. 10. Накопление 14а-ОН-АД в

присутствии растворителей.

Время, ч

В присутствии ДМФА и МеОН отмечено частичное ингибирование биоконверсии в-ва «8» и АД. Наблюдалось уменьшение степени конверсии исходных соединений (с 85% для контрольных образов до 50% в варианте с ДМФА), и уменьшение выхода целевых продуктов (с 60% до 40% в варианте с ДМФА).

2.2.1.4. Селекционные работы с культурой С. 1ипШа ВКПМ Р-981.

Несмотря на то, что гидроксилазы низших грибов содержат ионы некоторых тяжелых металлов, влияние последних на выход основного и побочного продуктов гидроксилирования изучено недостаточно. Известно, что выход гидроксипродуктов, образуемых С. 1ипа(а, возрастал в присутствии ?е2+, но не Си2+, а накоплению побочных бр- и 14а-гидроксистероидов, образуемых С. ЫакеэЬеапа, способствовали ионы 2п2+.

Совместно с сотруд. лаборатории биоинженерии антибиотиков Центра «Биоинженерия» РАН были получены клоны С. \unata ВКПМ Р-981 с устойчивостью к тяжелым металлам (Со, Мо и Си). Мы рассчитывали найти среди полученных мутантов клоны гриба, отличающиеся биохимическими и физиологическими свойствами от исходного штамма.

Гидроксилазную активность проверяли по отношению к в-ву «Б» у клонов, резистентных к ионам Со2+ и Си2+, так как при максимальной исследуемой концентрации солей 2% молибден не ингибировал рост гриба. На средах с Со2+ и Си2+ ингибирование роста происходило при концентрациях 0.45 и более 0.5% соответственно.

Следует заметить, что мицелий, выращенный на агаровой среде, содержащей токсичные для него дозы солей тяжелых металлов (0.4% СоС12 или 0.45 и 0.5% СиБС^), и перенесенный в жидкую питательную среду, не содержащую указанные соли, отличался от контрольного варианта наличием черной пигментации уже на ранней стадии роста.

Таблица 5.

Гидроксилирование 4 г/л «Б» мицелием С. 1ипШа, выращенным в

присутствии солей меди и кобальта.

Концентрация солей в агаровой среде, % Стероиды в реакционной смеси, %

«Б» «Г» 14а-ОН-«8»

СиБОо, 0.2 15 49 12

Си504,0.35 следы 42 11

СоС12,0.3 13 40 7.5

Контроль 7 58 16

У клонов, резистентных к солям в максимальной концентрации (0.4% Со2+ и 0.5% Си2+) полностью отсутствовала гидроксилазная активность. Мицелий, выращенный при более низких концентрациях ионов Со2* и Си2+,

проявлял гидроксилазную активность по отношению к в-ву «8», но меньшую по сравнению с контролем (табл. 5).

Уменьшение гидроксилазной активности мицелия, резистентного к солям тяжелых металлов, можно объяснить несколькими способами. С одной стороны, используемые соли могут быть ингибиторами гидроксилазных ферментов, и поэтому реакции протекают с меньшей скоростью, или же, исходя из предположения о том, что гидроксилирование в-ва «Б» является следствием реакции детоксикации, то защищенный меланином мицелий становится более устойчив к токсичным для него экзогенным веществам, присутствующим в окружающей среде. Однако не исключено, что увеличение содержание меланина в клетке приводит к такому изменению клеточной проницаемости, когда стероид становится недоступным ферментным системам.

Наряду с ранее рассмотренными путями повышения стероид трансформирующей активности микроорганизмов особое внимание уделяется применению водорастворимых стероидных комплексов [V/. Ьи е1 а1. 2007], для образования которых используют различные производные циклодекстринов (ЦЦ). При разработке способа 14а-гидроксилирования наряду с другими параметрами (варьирование температуры, рН, способа внесения субстрата, использование ПАВ, индукторов, растворителей и др.) мы использовали ранее найденный в нашей лаборатории для процессов гидроксилирования универсальный солюбилизатор - МЦЦ. В результате были подобраны оптимальные условия для трансформации АД с нагрузкой 6.0 г/л, (количество биомассы 14.5-15 г/л) (табл. 6). По найденному способу была проведена наработка 14а-ОН-АД для разработки метода синтеза пролигестона и его аналогов.

Таблица 6.

Трансформация АД мицелием С. 1ипа1а ВКПМ Р-981 в присутствии

МЦД*

а. Субстрат и продукты трансформации

= * АД 14а-ОН-АД ТС 11Р-ОН-ТС

и а « Содержание стероидов в реакционной смеси, %

18 30 35 10 следы

24 22 44 13,5 5

40 6 60 15 9

46 следы 58 10 12

*Прим. соотношение стероид/МЦД 1:5 (весовое).

Разработанная технология 14а-гидроксилирования с помощью культуры С. ЫпаШ ВКПМ Р-981 был а подтверждена на примерах получения 14а-гидроксипроизводных Д4-3,17-дикетоандростенов (АД, АДД и 9а-ОН-АД). Помимо оптимизации условий микробиологической трансформации, были

разработаны условия выделения и очистки целевых гидроксипродуктов с высокими выходами и качеством. И на разработанный способ 14а-гидроксилирования стероидов получен патент РФ № 2407800 от 27.12.2010 Бюл. Изобр. № 36.

«сИ&сесас

14а-ОН-АД

Рис. 11. Содержание 14а-ОН-АД в трансформационной среде при 6 г/л АД (46 ч, ВЭЖХ).

2.2.2. Разработка способа 11р-гидроксилирования.

2.2.2.1. Трансформация в-ва «Б» мицелием С. 1ипа(а, резистентным к генетицину «С418». До настоящего времени гидроксилирование «Б» изучалось только с целью получения «Р», и образование 14а-ОН-«8» рассматривалось как нежелательный побочный процесс. Поэтому достаточное количество исследований сводилось к поиску методов гидроксилирования, позволивших свести побочные процессы гидроксилирования «8» к минимуму. Однако, мы рассматривали 14а-ОН-«8» как ценный интермедиат в синтезе гестагенов нового поколения. Поэтому наши дальнейшие усилия были направлены на определение оптимальных условий гидроксилирования не только с целью получения «Б», но и ценного интермедиата - 14а-ОН-«8».

Одним из способов увеличения гидроксилазной активности микроорганизмов является получение мутантов, устойчивых к воздействию различных экзогенных факторов. [Рагазгк^еуугсг К. е1 а1.1998.]

Полученный методами селекции совместно с лабораторией биоинженерии антибиотиков клон гриба, устойчивый к антибиотику генетицину "0-418" (80 мкг/мл), был проверен на способность к 11р-гидроксилированию в-ва «Б» при нагрузках 4.0-20.0 г/л. Результаты представлены в табл. 7.

Подобранные условия 11р-гидроксилирования с новым штаммом позволили увеличить нагрузку «Б» с 4.0 до 20.0 г/л, что существенно превышает известные литературные данные. Можно отметить как высокие степень конверсии исходного соединения и скорость 11Р-гидроксилирования, так и высокий выход гидроксипродуктов.

Наряду с образованием «Р» с выходом 60% при нагрузке 20 г/л, удалось достигнуть выхода 14-ОН-«8» до 25%, который далее был использован в синтезе производных пролигестона.

Таблица 7.

Трансформация «S» мицелием гриба С. lunata ВКПМ F-988

Нагрузка, г/л Способ внесения Время тр-ции, ч Степень конверсии, % Выход выделенных продуктов трансформации, %

«F» 14a-OII-«S»

4.0 микрокристаллы 20 90 62 10

10.0 микрокристаллы 48 92 44 15

комплекс с мцд 28 91.5 64 15

15.0 комплекс с мцд 28 96 62 20

20.0 комплекс с МЦД 48 98 60 25

Штамм С. 1ипа1а, устойчивый к антибиотику генетицину «С-418» и обладающий высокой 11Р-гидроксилазной активностью, был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Р-988.

Рис. 12. Состав реакционной среды при трансформации «Б» 20 г/л. (48 ч, ВЭЖХ) \ 14а-ОН-«8»

ÜL

2.2.2.2. lip-гидроксилирование 16а-метил-кортексолона (16а-СН3-«S») с помощью С. lunata ВКПМ F-988. Высокая lip-гидроксилазная активность нового штамма была подтверждена на примере получения lip-гидроксипроизводного основного предшественника дексаметазона 16a-CH3-«S», полученного нами ранее из АД серией химических реакций.

16a-CH3-«S»

16a-CH3-«F» 14а-ОН-16a-CH3-«S »

Рис. 13. Гидроксилирование 16a-CH3-«S» с помощью мицелия С. lunata ВКПМ F-988.

Как следует из табл. 8, концентрация 2.0 г/л для 11р-гидроксилирования 16а-СН3-«8» является оптимальной (в виде микрокристаллов). И только

использование МЦЦ позволило увеличить нагрузку стероида до 10.0 г/л, при которой трансформация заканчивалась через 48 ч, степень конверсии составила 80%, а содержание 16а-СН3-«Р» не ниже 50% (см. табл. 8).

Таблица 8.

Гидроксилирование 16а-СН3-«5» С. Ышйа ВКПМ Р-988_

Нагрузка, г/л Способ внесения Время тр-ции, ч Степень конверсии исходного субстрата,% Содержание основных продуктов гидроксилирования,%

16а-СН3-Р 14а-ОН-16а- СН]-«8»

1.0 микрокристаллы 18 85 65 10

2.0 микрокристаллы 24 80 55 20

4.0 микрокристаллы 32 50 40 следы

комплекс с МЦД 26 80 60 15

10 комплекс с МЦД 48 80 50 15

Помимо оптимизации условий процесса 11р-гидроксилирования Д4-3-кетостероидов новым штаммом, были подобраны оптимальные условия выделения и очистки гидроксипродуктов. На способ 11р-гидроксилирования с помощью С. 1ипШа ВКПМ Р-988 получен патент РФ № 2399674 от 20.09.2010.

2.2.3. Синтез пролигестона и его аналога. Согласно литературным данным, основными способами построения прегнановой цепи являются циангидринный метод и конденсация с ацетиленом. Хорошо отработанный на АД циангидринный метод в нашем случае не дал положительного результата из-за сложности подхода СЫ-иона с а-стороны стероидной молекулы, которая стерически блокирована гидроксилом при С14. При ацетиленовом синтезе атака с а-стороны стероидной молекулы также является предпочтительной, а образующийся 17Р-гидрокси-17а-замещенный стероид с помощью химических реакций превращается в нужный изомер.

Но существует ряд работ [Еи Ра! 0189951], в которых показана возможность образования 14а,17а-дигидрокси-17Р-замещенных стероидов. Основным способом получения данного изомера является реакция взаимодействия 14а-гидрокси-17-кетостероидов с металлорганическими соединениями, такими как ацетилиды щелочных металлов (К, Ыа, Ы), или реактивом Гриньяра. Мы остановили свой выбор на известном способе проведения ацетиленового синтеза в присутствии сильного основания и эпи-амина, который способствует получению нужного 17р-этинил,17а-гидроксипроизводного.

В результате проведенной работы из полученного нами 14а-ОН-АД был синтезирован пролигестон, формула которого представлена на рис. 14.

Помимо 14а-ОН-АД в синтезе пролигестона и его аналогов может быть использован и 14а-ОН-«8» после предварительного удаления гидроксильной группы при С21. Однако в своей работе мы использовали непосредственно 14а-ОН-«8», и в результате проведенной работы было получено ранее не описанное в литературе аналог пролигестона, структурная формула которого указана на рис. 14.

-^СНз

пролигестон 21 -ацетат-14а, 17а-проипилидендиокси-4-

прегнен-21-ол-3,20-диона Рис. 14. Структурные формулы пролигестона и его аналога.

Указанные соединения были направлены в Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН для исследования их контрацептивной активности, которое проводилось в комбинации с этинилэстрадиолом в соотношении 1:20. Опыты осуществлялись на половозрелых белых крысах-самках линии «Вистар» массой 200-250 г (опыт №1) и 180-200 (опыт №2) г. Животные были получены из питомника «Рапполово» и содержались в регламентированных условиях вивария НИИАГ им. Д.О. Отга РАМН при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных.

Изучаемые эстроген-гестагенные комбинации вводили в виде масляного раствора (растворитель - растительное масло) в желудок (перорально) в объеме 0,3 мл с использованием зонда в течение 14 дней. Доза этинилэстрадиола и гестагена во всех исследованиях была одинаковой и составила 0,04 мг/кг и 0,8 мг/кг соответственно. Животные контрольной группы получали растительное масло в том же объеме и в те же сроки, что и животные подопытных групп.

Результаты представлены в табл. 9-10.

Таблица 9.

Исследование контрацептивной активности (КА) пролигестона (0.8 мг/кг) в комбинации с этинилэстрадиолом (0.04 мг/кг)

Группа Количество крыс в группе КА, %

животных всего покрытых беременных небеременных

контрольная 15 14 14 0 0

подопытная группа 17 11 0 11 100

Таблица 10.

Исследование контрацептивной активности (КА) 21-ацетат-14а,17а-

проипилидендиокси-4-прегнен-21-ол-3,20-диона (0.8 мг/кг) в _комбинации с этинилэстрадиолом (0.04 мг/кг)_

Группа животных Количество крыс в гр) /ппе КА, %

всего покрытых беременных небеременных

контрольная 15 12 12 0 0

подопытная группа 11 7 0 7 100

Результаты экспериментального исследования контрацептивной активности (табл. 9-10) показали, что оба исследуемых препарата в количестве 0.8 мг/кг в комбинации с этинилэстрадиолом (0.04 мг/кг) обладают 100%-ной контрацептивной активностью.

Полученные результаты могут послужить основой для расширения спектра контрацептивных препаратов нового поколения, обладающих такими преимуществами, как высокая пролонгированная активность и отсутствие побочных действий.

3. ВЫВОДЫ:

1. Изучена субстратная специфичность С. 1ипШа ВКПМ Р-981 и показана зависимость направленности гидроксилирования от строения стероидной молекулы.

2. Разработан метод направленного 14а-гидроксилирования стероидов с помощью штамма С. 1ипаШ ВКПМ Р-981 как первой стадии синтеза высокоактивных препаратов для медицины и ветеринарии антигонадотропного, контрацептивного и канцеролитического действия. Способ позволяет достигнуть полной конверсии АД за 48 ч с нагрузкой 6.0 г/л, и выходом 14а-ОН-АД 60%. На способ получен Патент РФ №2 407 800 (Бюл. Изобр. №36 от 27.12.2010)

3. Разработан способ направленного 11р-гидроксилирования стероидов с помощью нового штамма С. 1ипШа ВКПМ Р-988. Способ позволяет проводить 11р-гидроксилирование кортексолона с нагрузкой до 20 г/л за 48 ч трансформации с выходом гидрокортизона 60% и может быть использован в промышленном масштабе для синтеза высокоактивных глюкокортикостероидных препаратов противовоспалительного, антиаллергического и противошокового действия. На способ получен патент РФ №2399674 (Бюл. Изобр. №26 от 20.09.2010).

4. Подобраны оптимальные условия 11Р-гидроксилирования 16-метилсодержащих аналогов кортексолона, позволяющие получать полупродукты синтеза дексаметазона и других фторированных противовоспалительных кортикостероидов с выходом 50% при нагрузке субстрата 10 г/л, что значительно превышает мировые стандарты.

5. Разработана схема синтеза пролигестона и его аналогов из 3,17-дикетоандростенов (АД, АДД и 9а-ОН-АД) - полупродуктов синтеза стероидных лекарственных препаратов из растительного сырья.

6. Проведен синтез пролигестона из 14а-ОН-АД, полученного микробиологическим путем по разработанному способу.

7. Получен ранее не описанный в литературе аналог пролигестона -21-ацетат-14а,17а-пропилидендиокси-4-прегнен-21-ол-3,20-диона - из 14а-OH-«S» с высокой контрацептивной активностью.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Ядерец В.В., Андрюшина В.А., Бартошевич Ю.Э., Домрачева А.Г., Новак М.И., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. Изучение стероидгидроксилирующей активности мицелия Curvularia /ыиа/я.//Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т.43. № 6. С.: 695-700.

2. Ядерец В. В., Андрюшина В. А., Войшвилло Н. Е., Стыценко Т.С., Зейналов О. А. Изучение путей синтеза биологически активных 14а-гидроксилированных стероидов.//Хим. — Фарм. журнал. 2009. № 1. С.: 37-40.

3. Андрюшина В.А. Войшвилло Н.Е. Дружинина A.B., Стыценко Т.С., Ядерец В.В., Скрябин ЮГ., Бартошевич Ю.Э., Новак М.И., Домрачева А.Г. Способ 1 lß-гидроксшшрования Д4-3-кетостероидов.//Патент РФ № 2399674 (Бюл. № 26 от 20.09.2010)

4. Ядерец В.В., Андрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Двойников П.С., Стыценко Т.С., Зейналов O.A., Скрябин К.Г. Способ получения 14а-гидроксипроизводных Д4-3,17-дикето-андростенов.//Патент РФ № 2407800 (Бюл. Изобрет. № 36 от 27.12.2010.)

5. Ядерец В.В., Войшвилло НЕ., Стыценко Т.С., Егоров И.М. Поиск условий селективного гидроксилирования стероидов с помощью гриба Curvularia /ша(а.//Тезисы докладов VII Международного форума «Биотехнология и современность». С,- Петербург, 1416 июня. 2006. С.: 29- 30.

6. Ядерец В.В. Поиск путей регуляции 14а/Ир-гидроксилирования стероидов грибом Curvularia lunata путем изменения условий выращивания и трансформации.//Тезисы конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты». Пущино, 24-25 мая. 2007. 42 с.

7. Ядерец В.В. Исследования в области синтеза биологически активных гидроксилсодержащих стероидов.//Наука и технологии. Краткие сообщения 28-ой Российской школы. Миасс, 24-28 июня. 2008. С.: 58-60.

8. Ядерец В.В. Разработка способа направленного микробного гидроксилирования для синтеза стероидных препаратов нового поколения.//Тезисы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 1620 марта. 2009. С.: 226-227.

9. Ядерец В.В. Особенности гидроксилирования стероидов плесневым грибом Curvularia lunata ВКПМ F-981.//Тезисы международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Москва, 28 сентября - 1 октября. 2009. Т.2. С.: 276-279.

10. Ядерец В.В. Инновационные технологии для получения стероидных фармацевтических субстанций».//Доклад на конференции «Передовые технологии российских инноваторов». Париж, 25-27 ноября. 2010.

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям к.х.н. Андрюшиной В.А. и к.б.н. Войшвилло Н.Е. за всестороннюю поддержку при выполнении диссертации, к.х.н. Стыценко Т.С. за неоценимую помощь при планировании и выполнении работы, Соловьёвой Н.П. за помощь в снятии и интерпретации ПМР спектров, Комбаровой С.П. за ценные советы, также всем сотрудникам лабораторий биотехнологии стероидов и биоинженерии антибиотиков Центра «Биоинженерия» РАН.

Подписано в печать: 20.02.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 323 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ядерец, Вера Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Классы стероидов, влияние структуры стероидной молекулы на активность.

2.2. Применение кортикостероидов и их синтетических аналогов в медицине и ветеринарии.

2.3. Применение модифицированных стероидов для регуляции репродуктивной функции.

2.4. Физиологические основы микробиологических трансформаций стероидов.

2.5. Гидроксилирование стероидных соединений.

2.6. Реакция 11 (3-гидроксилирования в схеме синтеза глюкокортикоидных препаратов.

2.7. Реакция 14а-гидроксилирования.

2.8. Зависимость направления гидроксилирования стероидов от структуры молекулы.

2.9. Влияние условий роста на трансформационную способность.

2.10. Повышение доступности стероидов для микроорганизмов -трансформаторов.

2.11. Синтез прегнанов на основе 17-кетоандростанов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Реактивы.

3.2. Микроорганизмы и методы их культивирования.

3.2.1. Штаммы, использованные в работе.

3.2.2. Условия хранения и выращивания грибов.

3.3. Получение клонов СитиШпа 1ипШа, устойчивых к солям тяжелых металлов.

3.4. Получение клопов СигшШпа 1ипШа, устойчивых к генетицину «С-418».

3.5. Трансформация стероидов грибами.

3.5.1. Трансформация стероидов отмытым мицелием.

3.5.2. Трансформация стероидов растущими клетками гриба.

3.6. Анализ продуктов трансформации.

3.6.1. Тонкослойная хроматография.:

3.6.2. ВЭЖХ.

3.7. Выделение продуктов трансформации.

3.7.1. Препаративная хроматография

3.7.1.1. Хроматографирование на пластинках.

3.7.1.2. Хроматографирование на колонке.

3.8. Протонный магнитный резонанс (ПМР).

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Выбор способа 14а-гидроксилирования.

4.2. Исследование гидроксилазной активности плесневых грибов.

4.3. Исследование субстратной специфичности штамма

С. lunata ВКПМ F-981.

4.4. Гидроксилирование АД и CN-АД с помощью

С. lunata ВКПМ F-981.

4.5. Поиск путей регуляции 11р/14а-гидроксилирования с помощью мицелия С. lunata ВКПМ F-981.

4.5.1. Определение возраста наиболее активного мицелия

С. lunata ВКПМ F-981 и его оптимальное количество.

4.5.2. 11р- и 14а-Гидроксилирование в присутствии источника углерода.

4.5.2.1. 11р- и 14а-Гидроксилирование в цитратном буфере.

4.5.2.2. 1 ip- и 14а-Гидроксилирование в присутствии глюкозы или сахарозы.

4.5.3. Влияние растворителей на процессы 11Р- и

14а-гидроксилирования.

4.5.4. Использование МЦЦ в процессах 1 ip- и 14а-гидроксилирования.

4.5. Гидроксилирование кортексолона и андростендиона при высоких нагрузках.

4.6. Трансформация кортексолона мицелием С. Innata, резистентным к солям тяжелых металлов.

4.7. Разработка способа 11 Р-гидроксилирования.

4.7.1. Трансформация кортексолона клоном гриба С. lunata, 93 резистентным к генетицину «G-418».

4.7.2. 11 Р-Гидроксилирование 16а-метил-кортексолона с помощью С. lunata F-988.

4.8. Синтез пролигестона и его аналога.

4.8.1. Получение пролигестона

4.8.2. Синтез 21-ацетата 14а,17а-пропилидендиоксипрегн-4-ен-21-ол-3,20-диона (21-ацетат 14а,17а-пропилидендиокси в-ва «S»).

4.9. Исследование контрацептивной активности пролигестона и ацетата 21-гидрокси-пролигестона.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов направленного 11β- и 14α-гидроксилирования стероидов"

Актуальность работы.

Стероидные лекарственные препараты занимают важное место среди синтетических лекарственных средств. Благодаря своей уникальной биологической активности, не ограничивающейся гормональным действием, они используются при лечении свыше 100 распространенных заболеваний, проявляя противовоспалительную, антиаллергическую, противошоковую, канцеролитическую, диуретическую и многие другие виды активности, а также для решения таких важных задач, как безопасное планирование семьи у людей и регуляция рождаемости у животных.

Являясь поливалентными соединениями, стероиды оказывают влияние на широкий круг процессов жизнедеятельности, что и объясняет наличие побочных эффектов при лечении стероидными препаратами. Устранить нежелательные побочные эффекты, а также усилить биологическую активность или изменить ее направленность можно с помощью структурной модификации природных соединений.

Опыт синтеза новых стероидных соединений, являющихся структурными аналогами природных гормонов, и изучения их активности, открывает перспективу дальнейших исследований с целью создания новых эффективных препаратов для медицины. Поэтому поиск веществ, обладающих высокой и пролонгированной активностью, не отягощенной сопутствующими побочными эффектами, является актуальной задачей.

Среди различных методов трансформации стероидной молекулы, проблема селективного гидроксилирования относится к числу важнейших в химии стероидов, поскольку введение гидроксильной группы в определенные положения молекулы определяет величину и направленность терапевтического действия. Гидроксистероиды используются при лечении широкого спектра заболеваний и применяются при лечении как в различных областях медицины (акушерство, гинекология, кардиология, неврология, онкология, дерматология и др.), так и в ветеринарии (лечение, контрацепция, синхронизация охоты и др) [19].

При модификации стероидной молекулы (вследствие ее полифункциональности) предпочтение отдается микробиологическим методам, не требующим предварительной защиты функциональных групп и обладающим, при наличии соответствующих штаммов, высокой селективностью. Немаловажную роль играет в этом случае и экологическая безопасность. Как правило, гидроксилирование ■ сопровождается образованием ряда побочных продуктов, затрудняющих выделение и очистку целевого соединения. Продолжает оставаться неизвестной физиологическая роль гидроксилирования стероидов грибами, у которых скорость, направление и ориентация трансформации зависят от вида микроорганизма, трансформируемого субстрата и ряда биологических и физико-химических факторов, тогда как у бактерий данные реакции являются промежуточными этапами расщепления стероидов до СОг и Н20 и не находятся в прямой зависимости от условий роста и трансформации. Поэтому актуален подбор условий, позволяющих осуществить процесс гидроксилирования селективно 1 с максимальным выходом целевого продукта.

Состояние вопроса.

Химический синтез стероидных соединений труден и многостадиен, и, как правило, наиболее сложным этапом этого синтеза является введение гидроксильной группы. При модификации стероидной молекулы предпочтение отдается микробиологическим- способам трансформации, имющим' ряд преимуществ перед химическими методами. Зачастую, гидроксилирование с помощью микрооргнаизмов является единственно возможным способом [68].

Однако, несмотря на полувековую историю применения микробиологических методов трансформации стероидов, процесс гидроксилирования по-прежнему остается наименее изученным. Недстаточно сведений о зависимости направленности гидроксилирования от структуры стероидного субстрата и таксономического положения микроорганизма-трансформатора. а

Используемые в известных способах синтеза штаммы недостаточно селективны, и микробиологические процессы проводятся при низких нагрузках стероидного субстрата с низкими выходами целевых соединений, а образующиеся многочисленные побочные продукты значительно затрудняют стадии выделения и очистки. Поэтому актуален поиск новых штаммов с высокой стерео- и регео-специфической гидроксилазной активностью и подбор условий, позволяющих осуществлять данный процесс селективно и с максимальным выходом целевого продукта.

В настоящее время идентифицированы различные микроорганизмы, использование которых позволяет осуществить почти все возможные трансформации стероидной молекулы. Из них наибольшую практическую значимость имеют следующие реакции: гидроксилирование (7а/(3, 9a-, 11а/(3-, 14а-,15а/р, 16а-), 1,2-дегидрирование и селективное отщепление боковой цепи стеринов и желчных кислот, получившие промышленное применение в производстве стероидных лекарственных препаратов.

Объектами настоящего исследования являются практически значимые процессы направленного lip- и 14а-гидроксилирования, открывающие пути синтеза новых модифицированных стероидов с ценными фармакологическими свойствами.

Анализ фактического материала, накопленного к настоящему времени, свидетельствует о том, что, в отличие от 11а-гидроксилирования, которое осуществляет достаточное число микроорганизмов, способность к накоплению 11 (3-гидроксистероидов с удовлетворительным выходом, но в смеси с 11 а-гидроксипродуктами, присуща ограниченному количеству видов грибов (Absidia orchidis, Cunninghamella blcikesleeanci, Cimninghamella elegans, Cochliobolus lunatus). Лишь штаммы Curvularia Innata (коллекций -ATCC, IFO, NRRL, BKM, ВКПМ и др.) из 35 известных видов широко распространенного в природе плесневого гриба рода Curvularia, проводят гидроксилирование Д4-3-кетостероидов преимущественно в 1lp-положение и применяются в промышленности для получения гидрокортизона и его производных.

Однако, несмотря на внушительное число исследований, выполненных с различными штаммами грибов и, главным образом с С. lunata, особого прогресса в процессе 11 p-гидроксилирования не наблюдается, используемые штаммы далеки от совершенства, а нагрузки субстратов невысоки.

Интерес к реакции 14а-гидроксилирования обусловлен тем, что 14а-гидроксистероиды или сами по себе обладают физиологической активностью, или открывают путь к синтезу соединений с высокой контрацептивной и канцеролитической активностью [158]. Однако в мировой практике используются только несколько препаратов этого ряда, что объясняется трудностью их синтеза, а конкретно — сложностью введения гидроксильной группы в стерически затрудненное 14а-положение. Кроме того, микробиологическое 14а-гидроксилирование по сравнению с 9а- и 11(3-гидроксилированием менее изучено.

В целом, анализ литературных данных свидетельствует о том, что несмотря на большое количество работ, посвященных проблемам 1 ip~ и 14а-гидроксилирования, многие вопросы, имеющие ключевое значение для решения проблемы селективности и повышения эффективности этих процессов остаются недостаточно изученными.

Поэтому представлялось целесообразным разработать и оптимизировать способы направленного 11р- и 14а-гидроксилирования, обеспечивающие селективность процесса, а также максимальную нагрузку исходного субстрата и выход целевого продукта. Кроме того, планировалось на основе полученных гидроксистероидов разработать схему синтеза гестагенов нового поколения (аналогов пролигестона) и изучить их биологическую активность.

Цели и задачи работы. Основной целью работы являлась разработка методов направленного lip- и 14а-гидроксилирования стероидной молекулы, открывающих путь к синтезу высокоактивных аналогов стероидных лекарственных препаратов.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

1. выявить наиболее активные штаммы со способностью к 11[3- и 14а-гидроксилированию стероидов андростанового и прегнанового рядов;

2. провести селекционные работы с выбранными штаммами для разработки способов 11(3- и 14а-гидроксилирования с повышенными нагрузками стероидных субстратов;

3. исследовать взаимосвязь между строением стероидной молекулы и направлением реакций гидроксилирования с помощью выбранных микроорганизмов;

4. разработать эффективный способ 14а-гидроксилирования андростендиона как первой стадии синтеза препаратов для медицины и ветеринарии антигонадотропного и канцеролитического действия;

5. разработать эффективный способ 11 |3-гидроксилирования Д4-3-кетостероидов для синтеза высокоактивных аналогов стероидных лекарственных препаратов;

6. провести исследования по синтезу пролигестона и его аналогов из андростендиона и наработать 14а-гидроксилированные производные прегнана для изучения их биологической активности.

Научная новизна работы. Методом селекции при непосредственном участии автора получен новый штамм Curvularia Innata с маркером резистентности к антибиотику генетицину «G-418», отличающийся от известных штаммов высокой селективностью в процессе 11 (3-гидроксилирования. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-988 и защищен патентом РФ № 2399674 (Бюл. Изобр. № 26 от 20.09.2010).

Впервые с использованием штамма С. lunata ВКПМ F-988 разработан способ направленного 11 р-гидроксилирования Д4-3-кетостероидов, который может быть использован при разработке биотехнологических методов получения новых лекарственных препаратов противовоспалительного и антиаллергического действия.

Впервые с использованием штамма С. lunata ВКПМ F-981, полученного ранее в лаборатории биотехнологии стероидов, разработан способ направленного 14а-гидроксилирования А4-3,17-дикетоандростенов, перспективных в синтезе новых стероидных препаратов канцеролитического, контрацептивного и антигонад отропного действия. На способ 14а-гидроксилирования получен патент РФ № 2407800 (Бюл. Изобр. № 36 от 27.12.2010).

Оптимизированы процессы 11(3- и 14а-гидроксилирования новыми штаммами грибов, что позволило значительно увеличить нагрузку некоторых стероидных субстратов в реакциях гидроксилирования грибами.

Впервые получен новый 21-ацетокси-аналог пролигестона с высокой контрацептивной активностью.

Проведенная оптимизация способов направленного 11(3- и 14а-гидроксилирования стероидов позволит использовать эти методы при масштабировании процессов синтеза гидроксилсодержащих стероидных аналогов с ценными терапевтическими свойствами.

Разработан способ получения гестагенов нового поколения и показана их высокая контрацептивная активность.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (2007, Пущино), XX зимней международной молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва), XXVIII Российской Школе «Наука и технология» (2008, Миасс), V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2009, Москва), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. (2009, Москва); Международной конференции «Передовые технологии российских инноваторов» (2010, Париж.)

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Ядерец, Вера Владимировна

5. ВЫВОДЫ:

1. Изучена субстратная специфичность С. lunata ВКПМ F-981 и показана зависимость направленности гидроксилирования от строения стероидной молекулы.

2. Разработан метод направленного 14а-гидроксилирования стероидов с помощью штамма С. lunata ВКПМ F-981 как первой стадии синтеза высокоактивных препаратов для медицины и ветеринарии антигонадотропного, контрацептивного и канцеролитического действия. Способ позволяет достигнуть полной конверсии АД за 48 ч с нагрузкой 6.0 г/л, и выходом 14а-ОН-АД 60%. На способ получен Патент РФ №2 407 800 (Бюл. Изобр. №36 от 27.12.2010)

3. Разработан способ направленного 11 |3-гидроксилирования стероидов с помощью нового штамма С. lunata ВКПМ F-988. Способ позволяет проводить 11 |3-гидроксилирование кортексолона с нагрузкой до 20 г/л за 48 ч трансформации с выходом гидрокортизона 60% и может быть использован в промышленном масштабе для синтеза высокоактивных глюкокортикостероидных препаратов противовоспалительного, антиаллергического и противошокового действия. На способ получен патент РФ №2399674 (Бюл. Изобр. №26 от 20.09.2010).

4. Подобраны оптимальные условия 11 ß-гидроксилирования 16-метилсодержащих аналогов кортексолона, позволяющие получать полупродукты синтеза дексаметазона и других фторированных противовоспалительных кортикостероидов с выходом 50% при нагрузке субстрата 10 г/л, что значительно превышает мировые стандарты.

6. Проведен синтез пролигестона из 14а-ОН-АД, полученного микробиологическим путем по разработанному способу.

7. Получен ранее не описанный в литературе аналог пролигестона -21-ацетат-14а, 17а-пропилидендиокси-4-прегнен-21-ол-3,20-диона - из 14а-OH-«S» с высокой контрацептивной активностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ядерец, Вера Владимировна, Москва

1. Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Гриненко T.C.II 1997. Патент РФ №2091019.

2. Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Скрябин К.Г., Зейналов O.A.// 1998. Патент РФ № 2101013.

3. Андрюшина В. А. Савинова Т. С., Скрябин К. Г. Способ получения прегнанов.// 2000. Патент РФ № 2156255.

4. Ангелова Б.А., Суходольская Г.В., Кощеенко К.А. Микробиологическое 11 ß гидроксилирование стероидных соединений грибами Cunninghamella и Смгга/агш.//Микробиология. 1985. Т. 54. № 5. С. 704-709.

5. Валюшкин К.Д., Медведев Г.Ф. Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных. Минск: Урожай. 1997. 718 с.

6. Воробьев A.A., Быков A.C., Пашков Е.П., Рыбакова A.M. Микробиология. — М.: Медицина. 1996. 288 с.

7. Войшвилло Н.Е., Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Стыценко Т.С., Трансформация андростендиона и андростадиендиона бактериями, деградирующими стерины.//Прикл. Биохим. Микробиол. 2004. Т. 40. № 5. С.: 536- 543.

8. Грачёва И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов, 3-е изд., перераб. и доп. М.: Колос. 2000. - 512 с.

9. Дружинина A.B., Ядерец В.В., Войшвилло Н.Е., Стыценко Т.С., Андрюшина В.А.//Тезисы докладов VII Международного форума Биотехнология и современность.2006. С.: 30-31.

10. Блинов Н. П. Химическая микробиология. С-Пб.: Наука. 1995.- 600 с.

11. Зейналов O.A., Андрюшина B.Ä., Скрябин К.Г. «Новые гестагенные препараты для ветеринарии».//Российский ветеринарный журнал. 2005. №1. С.: 16-20.

12. Карпов В.А. Акушерство и гинекология мелких домашних животных. 1990 г. 268 270 с.

13. Клинский Ю.Д., Жирков Г.Ф., Гриненко Г.С. Авт. свид. СССР № 572248. 1977. Т. 54. № 34. 6 С.

14. Корхов В.В., Бойкова В.В., Гриненко Г.С.// Хим.-фарм. ж. 1983. Т. 17. № 12. С.: 1454—1457.

15. Корхов В.В. Вопросы онкологии. 1997. Т. 43. №3. С.: 317—320.

16. Логинов А.Г. Бюл. Всес. НИИ физиологии и биохим. питания сельскохозяйственных животных. 1981. Т. 15. № 2. С.: 11—14.

17. Лекарственный справочник врача-офтальмолога. Под ред. Астахова Ю.С. С-Пб.: Сага. 2002. - 175 с.

18. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1993.- 688 с.

19. Никитин В.Я. Студенцов А.П. Шипилов B.C. Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных.- М.: Колос. 2005. 512 с.

20. Некрасов Г.Д. Суманова И.А. Акушерство, гинекология и биотехника воспроизводства животных.- М.: Форум. 2009. 176 с.

21. Прокофьев М.И., Кадатский Г.М., Сабиров Т.К. Регуляция воспроизводительной функции у коров прогестагенами.//Зоотехния. 1994. №12. С.: 21-24.

22. Розен Б.Н. Основы эндокринологии. — М.: Высшая школа. 1980.-336 с.

23. Ряховская М.И., Гриненко Г.С. Синтез прегнанов на основе 17-кетоандростанов.//Хим.-фарм. Журнал. 1992. № 9-10. С.: 97-106.

24. Симпсон Дж. Руководство по репродукции неонатологии собак и кошек. М.: Софион. 2005. - 207 с.

25. Созинов В.А., Ермолина С.А. Современные лекарственные средства для лечения собак и кошек. М.: Аквариум-Принт. 2004.- 496 с.

26. Сорокина Т.С. История медицины:- М.:Академия, 2004. 368 с.

27. Суходольская Г.В., Ангелова Б., Кощеенко К.А., Басовская И.М., Скрябин Г.К.//Патент РФ № 1411336.

28. Суходольская Г.В., Ангелова Б.А., Кощеенко К. А. Физиолого-биохимические особенности культуры Curvularia lunata ВКМ F-644, осуществляющей 11 ß-гидроксилирование стероидных субстратов. //Прикладная биохимия и микробиология. Т. 22. № 2. С.: 226-237.

29. Турута А. М., Н.Е. Войшвилло, A.B. Камерницкий. Микробиологическое гидроксилирование 5а-Н-стероидов.//Успехи химии, 1992. Т. 61 №10. С.: 1883-1932.

30. Физер JL, Физер М.Стероиды. -М.: Мир. 1964. 983 с.

31. Чинчолкар С.Б., Суходольская Г.В., Баклашова Т.Г., Кощеенко К.А. Особенности процесса 11 ß-гидроксилирования стероидных соединениймицелием Curvularia lunata BKM F-644 в присутствие ß-циклодекстрина.// Прикл. Биохим. Микробиол. 1992. Т. 28. С.: 685-693.

32. Alexander D.L., Fisher J.E., A convenient synthesis of 7 alpha-hydroxycholest-4-en-3-one by the hydroxypropyl-beta-cyclodextrin-facilitated cholesterol oxidase oxidation of 3 beta,7alpha-cholest-5-ene-3,7- diol.//Steroids. V. 60. №3. 1995. P.: 290-294.

33. Arinbasarova A.Y., Karpov A.V., Fokina V.V., Medentsev A.G., Koscheyenko K.A. Kenetic characteristics of 1-en-dehydrogenaiton of 6a-methylhydrocortison by cell of Arthrobacter globiformis-\93.//EnzyQ Microb Technol. 1996. V. 19. № 7. P.: 501-506.

34. Asada S. Microbial manufacture of 14a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione.//Japanese Patent. 1994. № 06225791.

35. Atrat P, Hösel P, Richter W, Meyer HW, Hörhold С. Interactions of Mycobacterium fortuitum with solid sterol substrate particles.//J Basic Microbiol. 1991. V. 34. №6. P.: 413-423.

36. Bayunova V. I. , Gabinskaya К. N., Kolyvanova T. S, Korobova Yu. N., Grinenko G. S. . Transformation of androst-4-ene-3,17-dione and androsta-l,4-diene-3,17-dione by means of Beauveria sp. II.//Pharm. Chem. J. 1989. V. 33. №. 4. P.: 352-355.

37. Beck D. M., Gilbert I. G., Whitw M. J. Microbial process for preparation of 7-lceto dehydroepiandrosterone and related analogs.//WO Patent № 003148. 2005.

38. Bensasson C.M., Hanson J.R., Hunter A.C. The hydroxylation of A5-androstanes by Cephalosporium aphidicolaJiPhytochomestry. 1998. V. 49. № 8. P.: 2355-2358.

39. Bensasson C., Hanson J. R. The microbiological hydroxylation of des-ring D androstanes by Cephalosporium aphidicola.Ui. Chem. Research. 2003. V. 2003. №3. P.: 124-125.

40. Borrego S., Niubô E., Ancheta O., Espinosa M. E. Study of the microbial aggregation in Mycobacterium using image analysis and electron microscopy.// Tissue & Cell. 2000. V. 32. № 6. P.: 494-500.

41. Boynton J., Hanson J. R., Hunter A. C. The hydroxylation of some 13a-methylsteroids by Cephalosporium aphidicola.//Phyiochemlstvy. 1997. V. 45. №5. P.: 951-956.

42. Breiter S., Schlosser D., Weiss D., Schmauder H.P. Microbial hydroxylation of androsta-1, 4-diene-3, 17-dione.//Nat. Prod. Res. 1995. V. 6. № 1. P.: 7- 14.

43. Breslcvar K. Ferencak Z, Hudnik-Plevnik T. The role of cytochrome P450 (11 alpha) in detoxification of steroids in the filamentous fungus Rhizopus nigricans J/J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1995 V. 52. №3. P.: 271-275.

44. Chen K-C, Wey H-C. Dissolution-enzyme kinetics of lip-hydroxylation of cortexolone by Curvularia lunata.llEnzyme Microb Technol. 1990. V. 12. № 8. P.: 616-621.

45. Chiang J.Y. Regulation of bile acid synthesis.//Front Biosci. 1998. V. 15. №3. P.:176-193.

46. Chincholkar S.B., Seeta Laxman R., Wakharlcar R.D. Hydroxylation of progesterone by Cunninghamella blakesleeana NCIM 687.//World Journal of Microbiology & Biotechnology. 1995. V. 11. № 3. P.: 357-358.

47. Chosson P., Vidal H., Aumelas A., Couderc F. 11 P-Hydroxy lation of norethisterone acetate by Curvularia lunata.llMicrobiol. Lett. 1991. V. 83. №. I.P.: 17-22.

48. Choudhary MI, Sultan S, Khan M.T, Rahman A.U. Microbial transformation of 17alpha-ethyny 1- and 17alpha-ethylsteroids, and tyrosinase inhibitory activity of transformed products.// Steroids. 2005 Nov;70(12):798-802.

49. Cotillon AC, Morfin R. Fusarium moniliforme 7a-hydroxylase: a new tool for the production of iminunostimulating steroids. Biotrans 97, La Grande Motte, France: Abstract Book; 1997. p. 126.

50. Cotillon A.C., Doostzaech J., Morfin R. The inducible and cytochrome P-450 containing of Fusarium moniliforme.//L Steroid Biochem Mol Biol. 1997. V. 62. № 5-6. P.: 465-475.

51. Cruz A., Fernandes P., Cabral J. M. S., H. M. Pinheiro. Whole-cell bioconversion of P-sitosterol in aqueous-organic two-phase systems.//J Mol Catal B: Enzymatic. 2001. V. 11. № 4-6. P.:579-85.

52. Das S., Dutta T. K., Samanta T. B. Influence of substituents at Cn on hydroxylation of progesterone analogs by Bacillus sp.//J. Steroid Biochem. Mol. Biology. 2002. V. 82. № 2-3. P.: 257-261.

53. Dlugonski J., K. Paraszkiewicz, L. Sedlaczelc. Maintenance of steroid 11-hydroxylation activity in immobilized Cunninghamella elegans protoplasts// J. Microbiology & Biotechnology, 1997 (13). P. 469-473;

54. Dray F.J., Cotillon A.C. 7a-Hydroxylation of dehydroepiandrosterone and pregnenolone by bioconversion using Fusarium moniliforme.//Fr Patent. 1999. № 2771105.

55. Draygan C.A., Zearo S., Hannemann F., Bernhardt R., Bureik M. Efficient conversion of 11-deoxycortisol to Cortisol (hydrocortisone) byrecombinant fission yeast Schizosaccharomyces pombe.//FEMS Yeast Research. 2005. V. 5. P.: 621-625.

56. Dutta T.K., Samanta T.B. Byconversion of Progesterone by the Activated immobilized conidia of Aspergillus ochraceus TS.//Curr Microbiol. 1999. V. 39. №6. P.: 309-0312.

57. Evans J.M., Sutton D.J. The use of hormones, especially progestagens, to control oestrus in bitches.//J Reprod Fertil. 1989. V.39. P.: 163173.;

58. Faramarzi M.A., Tabatabaei M. Y., Amini M., Zarrini G, Shafiee A. Microbial hydroxylation of progesterone with Acremonium striatum J/FEMS Microbiol Lett, 2003. V. 222. № 2. P.: 183-186;

59. Faramarzi M.A., Badiee M., Tabatabaei Yazdi M., Amini M., Torshabi M., Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3,17-dione by the filamentous fungus Mucor racemosus./U Mol Catal B: Enzymatic. 2008. V. 50. № 1. P.: 7-12.

60. Faramarzi M. A, Aghelnejad M., Tabatabaei Y.M, Amini M., Hajarolasvadi N. Metabolism of androst-4-en-3,17-dione by the filamentous fungus Neurospora crassa./lSteroids. 2008. V. 73. № 1. P.: 13-18.

61. Farooq A., Hanson J.R, Iqbal Z. Flydroxylation of progesterone by Cephalosporium aphidicola.//Phytochemistry. 1994. V. 37. № 3. P.: 723-726.

62. Farooq A., Hanson J.R. Oxidation of two pregnane steroids catalyzed by the fungus Cephalosporium aphidicola.// Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. V. 63. № 10. P.: 1798-1799.

63. Felig P., Frohman L. A. Endocrinology and metabolism.//NY: McGraw-Hill. 2001.- 1562 P.

64. Fernandes P., Cruz A., Angelova B., Pinheiro H.M. Microbial conversion of steroid compound: recent development.//Enzyme Microb Technol. 2003. V. 32. P. 688-705.

65. Gallimore W. A., Reese P. B., Wilsonl M. R. Steroid transformations with Fusarium oxyspomm var. cubense and Colletotrichum musae.//Steroids. 1999. V. 64. № 12. P.: 834-843.

66. Greenberg-Ofrath N., Terespolosky Y., Kahane I., Bar R. Cyclodextrins as carries of cholesterol and fatty acids in cultivation of Mycoplasmas.//Appl Environ Microbiol. 1993. V. 59. № 2. P.: 547-551.

67. Griffiths D.A., Brown D.E., Jezequel S.G. Biotransformation of warfarin by the fungus Beauveria bassiana.HAppl Microbiol Biotechnol. 1992. V.37. P.; 169-175.

68. Goetschel R, Bar R. Formation of mixed crystals in microbial conversion of sterols and steroids.// Enzyme Microb Technol. 1992. V. 14. № 6. P.:462-469.

69. Grogan G.J., Holland H. L. The biocatalytic reactions of Beauveria spp./tt Mol Catalysis B: Enzymatic. 2000. V. 9. № 1-3. P.: 1-32.

70. Hampl R., Lapcik O., Hill M., Klak J., Kasal A., Novacek A., Sterzl I., Sterzl J., Starka L. 7-Hydroxydehydroepiandrosterone a natural antiglu-cocorticoid and a candidate for steroid replacement therapy?//Physiol. Res. 2000. 49. Suppl. 1. P.: 107-112.

71. Halmos G, Janzso B, Olasz K. Optimization of the 11-hydroxylation of levodione by Aspergillus awamori.ll Acta-Microbiol Immunol Hung. 1996. V. 43. P.:262-263.

72. Hanson J.R., Nasir PL, Parvez A. The hydroxylation of testosterone and some relatives by Cephalosporium aphidicola.l'/Phytochemistry. 1996. V. 42. №2. P.: 411-415.

73. Holland H., Poddar S., Tripet B. Effect of cell immobilization and organic solvents on sulfoxidation and steroid hydroxylation by Mortierella isabellina.ilJ of Ind Microbiol. 1992. V. 10. P.: 195-197.

74. Holland H., Morris T., Nava P., Zabic M. A new paradigm for biohydroxylation by Beauveria bassiana ATCC 7159//Tetrahedron. 1999. V. 55. p.: 7441-7460.

75. Holland H. L., Brown F. M., Barrett F., French J., Johnson D. V. Biotransformation of beta-lcetosulfides to produce chiral beta-hydroxysulfoxides.//J Ind Microbiol Biotechnol. 2003. V. 30. № 5. P.: 292-301.

76. Huszcza E., Dmochowska-Gladysz J. Transformations of testosterone and related steroids in Absidia glauca culture.//J. Basic Microbiol. 43 (2003) 2, 113-120

77. Houng J-Y, Chiang W-P, Chen IC-C, Tiu C. 1 la-Hydroxylation of progesterone using alginate entrapped Aspergillus ochraceus gel beads coated with polyurea.// Enzyme Microb Technol. 1994. V. 16. № 6. P.: 485-491.

78. Hu S-H, Genain G., Azerad R. Microbial transformation of steroids: Contribution to 14a hydroxylations.// Steroids. 1995. V. 60. № 4. P.: 337-352.

79. Huang S.H., Xu S.W., Fa Y.H. 11 ß-hydroxylation of 16a-methyl-Reichstein's compound S 21-acetate by Curvularia lunata.ll Wei Sheng Wu Xue Bao. 1989. V. 29. № 1. P.: 68-71.

80. Iqbal Choudhary M., Adnan Ali Shah S., Ghulam Musharraf S., Shaheen Farzana, Atta-Ur-Rahman. Microbial transformation of dehydroepiandrosterone.//Nat Prod Res. 2003. Vol. 17. № 3. P.: 215-220

81. Irrgang S., Schlosser D., Schmauder H.-P. The steroid 15-hydroxylase of Penicillium raistrickii is inducibIe.//Biotechnology Letters Vol 14 No 1 33-38 (1992)

82. Jekkel A, Ilkóy É, Horváth G, Pallagi I, Süto J, Ambrus G. Microbial hydroxylation of 13p-ethyl-4-gonene-3,17-dione. J Mol Catal B: Enzymatic 1998;5:385-7.

83. Jackson, S.L., Heath, I.B. 1993 Roles of calcium ions in hyphal tip growth.//Microbiol. Rev. V. 57io № 2. P.: 367-382.

84. Jones E. R. H. Microbiological hydroxylation of steroids and related compounds.// Pure Appl. Chem. V. 33. № 1. P. 39-52.

85. Keith B. D. Systematic review of the clinical effect of glucocorticoids on nonhematologic malignancy.//BMC Cancer. 2008. V. 8. P.: 84102.

86. Knottenbelt C.M., Heritage M.E. Use of proligestone in the management of three German shepherd dogs with pituitary dwarfism.//J Small AnimPract. 2002. V. 43. №4. P.:164-170.

87. Kolek T. Biotransformation XLVII: transformations of 5-ene steroids in Fusarium culmorum culture//J Steroid Biochem Mol Biol. 1999. V. 71. № 1-2. P.: 83-90.

88. Kolek T., Swizdor A. Biotransformation XLV. Transformations of 4-ene-3-oxo steroids in Fusarium culmorum culture.//J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1998, vol. 67, no. 1, pp. 63-69.

89. Kollerov V.V, Shutov A.A., Fokina V.V., Sukhodol'skaya G.V., Donova M.V. Biotransformation of 3-keto-androstanes by Gongronella butleri VKM F-1033.// J Mol Catalysis B: Enzymatic. 2008. V. 55. № 1-2. P.: 61-68.

90. Korycka-Machala M., Ziólkowski A., Rumijowska-Galewicz A., Lisowska K., Sedlaczek L. Polycations increase the permeability of Mycobacterium vaccae cell envelopes to hydrophobic compounds.//Microbiology. 2001. V. 147/P.: 2769-2781.

91. Kumar R., Dahiya J. S., Singh D., Nigam P. Biotransformation of cholesterol using Lactobacillus bulgaricus in a glucose-controlled bioreactor.// Bioresour Technol. 2001. V. 78. № 2. P.: 209-211;

92. Kutney J. P., Milanova R. K., Vassilev C. D., Stefanov S. S., Nedelcheva N. V. Process for the microbial conversion of phytosterols to androstendione and androstadienedione.// US Patent. 2000. № 6071714.

93. Kutzler M., Wood A. Non-surgical methods of contraception and sterilization.//Theriogenology. 2006. V. 66. P.: 514-525.

94. Lanisnik R. T., Wheeler M.H. Melanin biosynthesis in the fungus Curvularia lunata (teleomorph: Cochliobolus lunatus)./ICan J Microbiol. 2003 V. 49. №2. P.: 110-119.

95. Lathe R, Rose KA, Seckl JR, Best R, Yau JL, Leckie CM. Use of 7a-substituted steroids to treat neuropsychiatric immune or endocrine disordes.//World Patent № 037664. 1997.

96. Lathe R. Steroid and sterol 7-hydroxylation: ancient pathways.//Steroids. 2002. V. 67. № 12. P.: 967-977.

97. León R., Femandes P., Pinheiro H. M., Cabral J. M. S. Whole-cell biocatalysis in organic media.//Enzyme Microb. Technol. 1998. № 23. P.: 483500.

98. Li X.-x., Wew Z., Kiao Kesheng, Wang M., Effect of P-cyclodextrin on growing characteristic of steroid biotransformation microorganisms.//Tianjin Keji Daxhle Xuebao. 2006. V. 21. № 3. P.: 1-4.

99. Lisowska K., Dlugoñski J. Concurrent corticosteroid and phenanthrene transformation by filamentous fungus Cunninghamella elegans./fi. Steroid Biochem Mol Biol. 2003. № 85. № 3. P.: 63-69.

100. Lobastova T.G., Gulevslcaya S. A., Sukhodolskaya G. V., Turchin K. F., Donova M. V. Screening of mycelial fungi for 7a- and 7p-hydroxylase activity towards dehydroepiandrosterone.//Biocatal Biotransformation. 2007. V. 25. №6. P.: 434 -442.

101. Lu W.-Y., Du L.-X., Wang M., Wen J.-P., Sun B., Guo Y.-W. Effect of two-steps substrate addition on steroids 11 (3-hydroxylation by Curvularia lunata CL-114.// Biochem. Eng. J. 2006. V. 32. P. 233-238.

102. Lu W., Du L., Wang M., Jia X., Wen J., Huang Y., Guo Y., Gong W., Bao H., Yang J., Sun B. Optimisation of hydrocortisone production by Curvularia lunata.I/Appl Biochem Biotechnol. 2007. V. 142. P.: 17-28.

103. LuW, Du L., Wang M., Guo Y., Lu F., Sun B., Wen J., Jia X. A novel substrate addition method in the 11 P-hydroxylation of steroids bu Curvularia lunata.//FoodBioprodProcès. 2007. V. 85. № Cl. P.: 63-72.

104. Madiastha K.M., Joseph T. Studies on the 14a-hydroxylation of progesterone in Mucor piriformis ./'/J Steroid Biochem. 1993. V. 45. № 6. P.: 563569.

105. Madyastha K. M. Preparatively useful transformations of steroids and morphine alkaloids by Mucor piriformis ./'/J Chem Sci. 1994. V. 106. № 5. P.: 1203-1212.

106. Madyastha K. M., Joseph T. Transformation of 16-dehydroprogesterone and 17a-hydroxyprogesterone by Mucor piriformis.//Appl Microbial Biotechnol. 1994. V. 41. № 2. P.: 170-177.

107. Madyastha K.M., Joseph T. Transformation of dehydroepiandrosterone and pregnenolone by Mucor piriformis.//Appl Microbiol Biotechnol. 1995. V. 44. № 3-4. P.: 339-343.

108. Mahato S.B., Mukherjee A. Steroid transformations by microorgamisms. //Phytochemestry. 1984. V. 23. № 10. P.: 2134-2154.

109. Mahato S.B. et al. Metabolism of progesterone and testosterone by a Bacillus ¿-^.//Steroids. 1984. V. 43. № 5. P.: 545-558.

110. Mahato S.B., Mazumder I. Current trends in microbial steroidtransformation.//Phytochemistry. 1995. V. 51. № 34. P.: 131-140.

111. Mahato S.B., Garai S. Advances in microbial steroid biotransformation. //Steroids. 1997. V. 62. № 4. P.: 332-345.

112. Manosroi J., Chisti Y., Manosroi A. Biotransformation of cortexolone to hydrocortisone by molds using a rapid color-development assay.//Appl. Biochem. Microbiol. 2006. V. 42. № 5. P.: 479-483.

113. Manosroi J., Saowakhon S., Manosroi A. A novel one-step biotrans-formation of cortexolone-21-acetate to hydrocortisone acetate using Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a.//Enzyme Microbal Technology. 2007. V. 41. №3. P.: 322-325.

114. McMaster A., Ray David William. Modelling the glucocorticoid receptor and producing therapeutic agents with anti-inflammatory effects but reduced side-effects.// Exp Physiol . V. 92. №2. P.: 299-309.

115. Mori H., Shibata K., Tsuneda K., Savvai M. Synthesis of ecdysone 3. A novel synthesis of 14alpha-hydroxy-7-en-6-oxo steroids.//Chem. Pharm. Bull. 1968. V. 16. № 8. P.: 1593-1634.

116. Murray H. Peterson D. 14a-hydroxy-androstenediones and process.//US Patent. 1953. № 2662089

117. Njar V. C. O., Shapiro S., Arunachalam T., Caspi E. Biotransformation of progesterone to 14a-hydroxypregna-l,4-diene-3,20-dione, a novel fungal metabolite, by Colletotrichum antirrhini.il J. Steroid Biochem. 1985. V. 22. №3. P.: 399-400.

118. Novaka I., Kovac B. Electronic structure and biological activity of steroids.//Biophys Chem. 1999. V. 78. № 3. P.: 233-240.

119. Paraszkiewicz K., Dlugorislci J. Cortexolone 11 (3-hydroxylation in protoplasts of Curvularia lunata,//J. Biotechnology. 1998. № 65. P.: 217-224.

120. Pavko A., Komel R., Znidarsic P. Studies of a pelleted growth form of Rhizopus nigricans as a biocatalyst for progesterone 1 la-hydroxylation.//J Biotech. 1998. V. 60. № 3. P.: 207-216.

121. Phase N., Patil S. Natural oils are better than organic solvents for the conversion of soybean sterols to 17-ketosteroids by Mycobacterium fortuitum. //World J Microbiol Biotechnol. 1994. V. 10. № 3. P.: 228-229.

122. Preisig C. L, Laakso J. A., Mocek U. M, Wang P.T., Baez J., Byng G. Biotransformations of the cardiovascular drugs mexrenone and canrenone.//J. Nat. Prod. 2003. V. 66. № 3. P.: 350-356.

123. Rolland G.J., Mantica L., Ciceri R.// Italian Pat. 1971. № 513843.

124. Rumijowslca A., Lisowska K., Ziolkowski A., Sedlaczek L. Transformation of sterols by Mycobacterium vaccae: effects of lecithin on the permeability of cell envelopes to sterols.// World J Microbiol-Biotechnol. 1997. V. 13. № 1. P.: 89-95.

125. Schaaf O., Dettner K. Transformation of steroids by Bacillus strains isolated from the foregut of water beetles (Coleoptera:Dytiscidae): I. Metabolism of androst-4-en-3,17-dione (AD).//J.Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998. V. 67. № 5-6. P.: 451-465.

126. Schlosser D., Irrgang S., Shmauder H. P. Steroid hydroxylation with free and immobilized cells of Penicillium raistrickii in the presence of beta-cyclodextrin.//Appl Microbiol Biotechnol. 1993. V. 39. № 1. P.: 16-20.

127. Shuvalova S. D., Gabinskaya K. N., Popova E. V., Savinova T. S., Andryushinal V. A. Hydroxylation of androst-4-ene-3,17-dione with the aid of Curvularia lanata fungus.//Pharm. Chem. J. 2002. V. 36. № 12. P.: 664-666.

128. Sedlaczek L., Smith L. Biotransformations of steroids.//Crit. Rev. Biotechnol. 1988. V. 7. №. 3. P.: 187-236.

129. Slijkhuis H., Marx A. F. Preparation of 9a-hydroxy-17-keto steroids using Mycobacterium species CBS 482 86.// 1994. Patent US. № 5.298.398.

130. Santhanam H. K., Shreve G. S. 1994. Solvent selection and productivity in multiphase biotransformation systems. Biotechnology progress. V.10. №2. pp. 187-92.

131. Smith K. E. Latif S., Kirk D. N. Microbial transformations of steroids-II. Transformations of progesterone, testosterone and androstenedione by Phycomyces blakesleeanus.il J Steroid Biochem. 1989. V. 32. № 3. P.: 445-451.

132. Smith K. E., Latif S., Kirk D. N. Microbial transformations of steroids-V. Transformations of progesterone by whole cells and extracts of Botryosphaericaobtusa.ilJ Steroid Biochem. 1989. V. 32. №1. P.: 445-451.

133. Smith K. E., White K. A., Kirk D. N. Microbial transformations of steroids-III. Transformations of progesterone by Sepedonium ampullosporum.l'/J Steroid Biochem. 1989. V. 33. № 1. P.: 81-87.

134. Smith M., Zahnley J., Pfeifer D., Goff D. Growth and cholesterol oxidation by Mycobacterium species in Tween 80 medium.//Appl Environ Microbiol. 1993. V. 59. № 5. P.: 1425-1429.

135. Smith K. E., Ahmed F., Williams R. A.D., Kelly S. L. Microbial transformations of steroids—VIII. Transformation of progesterone by whole cells and microsomes of Aspergillus fumigatus./H Steroid Biochem Mol Biol. 1994. V. 49. № 1. P.: 93-100.

136. P. Somal and C. L. Chopra Microbial conversion of steroids III:lla-hydroxylation by fungal mycelium.//Appl. Microbiol.Biotechnol. V. 21. P.: 267269.

137. Swizdor A., Kolelc T. Transformations of 4- and 17a-substituted testosteroneanalogues by Fusarium culmorum.il Steroids. 2005. V. 70. № 12. P.: 817-824.

138. Tsellcas K. Y., Saratsis P. H. Study of the efficacy and safety of proligestone administration for the control of the ovarian cycle in thebitch.//Journal of the Hellenic Veterinary Medical Society. 1998 V. 49. № 1. P.: 44-47.

139. Vasudevan P. T., Zhou T. Enzymatic assay of cholesterol by reaction rate measurements.//Biotechnol Bioeng. 1997. V. 53. № 4. P.: 391-396.

140. Vitas M., Smith K., Rozman D., Komel R. Progesterone metabolism by the filamentous fungus Cochliobolus lunatus.ll^ Steroid Biochem Mol Biol. 1994. V. 49. № 1. P.: 87-92.

141. Vitas M, Rozman D., Komel R., Kelly S.L. P450-mediated progesterone hydroxylation in Cochliobolus lunatus.llJ. Biotechnology. 1995. № 42. №2. P.: 145-150.

142. Wang J., Chen C., Li B., Zhang J., Yu Y. Production of hydrocortisone from cortexolone-21-acetate by immobilized Absidia orchidis in co-solvent containing media.//Enzyme Microb Technol. 1998. V. 22. № 5. P.: 368373.

143. White M., Wuts P., Guillaume M., Beck D. 5-Androsten-3p-ol steroid intermediates and processes for their preparation.// 2006. US Patent. № 7002028.

144. Williams David A., Foye William O. Lemke., Thomas L. Foye's principles of medicinal chemistry. 6th edition. — Lippincott Williams & Wilkins, 2008. —C. 464. — 1377 c

145. Yoshioka H., Asada H., Fujita S. Process for production of 6ß,14a-dihydroxy-4-androstene-3,17-dione.// 1994. European Patent. № 599658.

146. Znidarsic P., Komel R., Pavkol A. Infuence of some environmental factors on Rhizopus nigricans submerged growth in the form of pellets.//J Microbiol Biotech. 2000. V. 16. № 7. P.: 589-593.

147. УТВЕРЖДАЮ Директор Центра «Биоинженерия» РАН1. Ака;4 марта 2010 года1. АКТ

148. О наработке 14а-гидроксиандростендиона — ключевого промежуточного продукта для синтеза ветеринаринарных препаратов.

149. В.В. Ядерец Н.Е. Войшвилло1. Т.С. Стыценко

Информация о работе

Ядерец, Вера Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка методов направленного 11β- и 14α-гидроксилирования стероидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы