Диссертации » Физико-химическая биология » Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регио- и стереоспецифическое гидроксилирование дегидроэпиандростерона в положении 7 мицелиальными грибами
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Регио- и стереоспецифическое гидроксилирование дегидроэпиандростерона в положении 7 мицелиальными грибами"

01-34603747 На правах рукописи

Лобастова Татьяна Геннадьевна

РЕГИО- И СТЕРЕОСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ ДЕГИДРОЭПИАНДРОСТЕРОНА В ПОЛОЖЕНИИ 7 МИЦЕЛИАЛЫ1ЫМИ ГРИБАМИ

03.01.06 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино, 2010 г.

004608747

Работа выполнена в Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

М.В. Донова

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор JI.A. Головлева

доктор биологических наук A.A. Москаленко

Ведущая организация Учреждение Российской Академии Наук

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г.Москва

Защита состоится « 36» июня 2010 г. в. •40 часов СОмин на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Учреждении Российской Академии Наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академия Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Автореферат размещен на сайте http://www.ibpm.ru Автореферат разослан «. » мая 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, /

доктор биологических наук В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Стероиды участвуют в осуществлении разнообразных биологических функций организма животных и человека. Исследования последних лет показали, что ряд Зр-гидрокси-5-ен-стероидов (называемых также нейростероидами) - дегидроэпиандростерон (ДГЭА, ЗР-гидроксиандрост-5-ен-17-он), сульфат дегидроэпиандростерона (ДГЭАС), прегненолон (Зр-гидроксипрегн-5-ен-17-он) и др. могут являться аллостерическими регуляторами нейротрансмиттерных рецепторов и изменять возбудимость нейронов при прямом контакте с клеточной поверхностью (Rupprecht and Holsboer, 1999). Показано, что ДГЭА и его 7-гидроксилированные метаболиты обладают также антиглюкокортикоидной и антиоксидантной активностью (Kalimi et al., 1994; Hampl et al., 1997; Pelissier et al., 2004). Помимо этого, положительные эффекты 7а-гидроксидегидроэпиандростерона (7а-ОН-ДГЭА; Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она), полученные в тестовых опытах и в экспериментах на животных, открывают перспективы его использования в лечении болезни Альцгеймера (Lardy, 1994), ожирения (Lardy, 1992), иммунных и эндокринных заболеваний (Rose et al., 2002). Другие гидроксипроизводные ДГЭА (7р,11ц-дигидроксидегидроэпиандростерон (7р,11а-ди-ОН-ДГЭА; Зр,7р,11а-тригидроксиандрост-5-ен-17-он) и 7а,15а-дигидроксидегядроэпиандростерон (7а,15а-ди-ОН-ДГЭА; Зр,7а,15а-тригидроксиандрост-5-ен-17-он)) нашли применение как ключевые интермедиаты синтеза лекарственных препаратов, -дроспиренона и эплеренона (Petzoltd et al., 1984; White et al., 2006).

Получение гидроксилированных производных ДГЭА возможно путем микробиологической трансформации или химического синтеза. Однако химический синтез гидроксипроизводных Зр-гидроксистероидов проходит с низкой селективностью и небольшим выходом (Defaye et al., 1978; Criton et al., 2007). Более предпочтительным представляется получение гидроксипроизводных ДГЭА с помощью микробиологической трансформации.

Известна способность мицелиальных грибов к эффективному гидроксилированию 3-кетостероидов андростанового и прегнанового рядов (Mahato and Garai, 1997; Fernandes et al., 2003). Между тем, данные о гидроксилировании Зр-гидрокси-5-ен-стероидов, в том числе ДГЭА, до начала наших исследований были ограничены.

Актуальными задачами являются поиск эффективных штаммов, способных к регио- и стереоспецифическому введению гидроксильных групп в положения 7а, 7р и 7а,15а ДГЭА без структурной модификации кольца А; изучение их потенциала в качестве продуцентов нейроактивных стероидов и их предшественников, получение новых, потенциально биоактивных 7а-гидроксистероидов, a также поиск путей интенсификации процессов гидроксилирования гидрофобных стероидных субстратов мицелиальными грибами.

Состояние вопроса. Известно, что мицелиальные грибы способны вводить гидроксильную группу в различные положения стероидной молекулы.

Основное внимание исследователей в течение долгого времени уделялось микробиологическому гидроксилированию З-кето-4-ен-стероидов. Определен широкий круг мицелиальных грибов различной таксономической принадлежности, способных осуществлять 7(а/Д)-гидроксилирование З-кето-4-ен-стероидов (Mahato and Garai, 1997; Fernandes et al., 2003). Способность к гидроксилированию ЗР-ол-5-ен-стероидов была показана для ограниченной группы штаммов - представителей родов Fusarium (Defaye et al., 1978; Cotillon et al., 1997; Kolek, 1999; Wilson et al., 1999), Mucor (Madyastha and Joseph, 1995), Rhizopus (Dodson et al., 1959; Choudhary et al., 2003) и некоторых других родов.

. Показано,, что замена З-кето-4-ен- на ЗР-гидрокси-5-ен структуру стероидного ядра может приводить к изменению положения введения пщроксильной группы. Например, ' Mucor piriformis осуществлял преимущественно 14а-гидроксшшрование Ci?- и С21-стероидов с З-кето-4-ен структурой (Madyastha, 1994), в то же время ДГЭА и прегненолон гидроксилировались этим грибом стереоспецифически в положении 7а с образованием соответствующих 7а-гидроксипроизводных (Madyastha and Joseph, 1995). В ряде случаев реакция гидроксилирования сопровождалась трансформацией Зр-ол-5-ен- в З-кето-4-ен структуру (Charney and Herzog , 1967; Choudhary et al., 2003). Литературные данные по 7а,15а-дигидроксилированию ДГЭА мицелиальными грибами ограничены несколькими работами (Okada and Saito, 1965; Petzoldt et al., 1984; White and Gilbert, 2004; Romano et al., 2006).

Сведения о наличии у мицелиальных грибов активности Байер-Виллигер монооксигеназы - фермента, ответственного за лактонизацию кольца D стероидов были приведены в ряде публикаций (Ахрем и Титов, 1970; Mostava and Zohri, 2000; Bartmanska et al., 2005 и др.). Получение лактонов из С(9- и С2Г стероидов с Зр-гидрокси-5-ен-структурой без модификации кольца А было показано только у культур Pénicillium lilacinum AM 111 (Kolek et al., 2008) и Pénicillium camemberti AM 83 (Kolek et al., 2009): штаммы конвертировали прегненолон и ДГЭА до Зр-гидрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-она (Kolek et al., 2008; Kolek et al., 2009). Сведений об образовании 7-гидроксипроизводных лактонов с Зр-ол-5-ен структурой в доступной литературе не обнаружено.

В целом, анализ данных научной и патентной литературы свидетельствует о наличии ограниченного числа штаммов, представляющих интерес для дальнейшего биотехнологического использования при получении биоактивных стероидов и ключевых интермедиатов на основе 7-гидроксилированных производных ДГЭА. Недостаточно изученной остается также связь 7-гидроксилирования Зр-гидроксистероидов с лактонизацией по кольцу D и другими реакциями трансформации, осуществляемыми ферментными системами мицелиальных грибов, - окислением 3ß-гидроксигруппы, Д5_и-изомеризацией, 17ß - восстановлением, 15а-гидроксилированием.

Цель в задачи работы. Целью работы являлось изучение гидроксилирования дегидроэпиандростерона в положениях 7а и 7ß мицелиальными грибами и разработка биотехнологических методов получения 7-гидроксипроизводных Зр-ол-5-ен-стероидов ряда андростана.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Оценить гидроксюшрующую активность мицелиальпых грибов в отношении дегидроэпиандростерона и выявить штаммы, наиболее эффективно осуществляющие гидроксилирование в положениях 7а и 7ß без структурной модификации кольца А.

2. Выбрать наиболее активные штаммы, катализирующие стереоселективное дигидроксилирование дегидроэпиандростерона в положениях 7а и 15а.

3. Изучить связь 7-гидроксилирования с сопутствующими реакциями трансформации дегидроэпиандростерона: 15а-гидроксилированием, 17ß-восстановлеггаем, окислением 3-гидроксигруппы, Д5->4-изомеризацией, лактонизацией кольца D.

4. Исследовать особенности трансформации дегидроэпиандростерона наиболее активными штаммами и определить оптимальные условия селективного образования целевых 7-гидроксипроизводных.

5. Разработать биотехнологические способы получения 3ß,7a,15a-тригидроксиандрост-5-ен-17-она и 3 ß,7a-nHntnp0KCHaimp0CT-5-eii-17-она из дегидроэпиандростерона с выделением продуктов.в кристаллическом виде.

Научная новизна работы. Исследована трансформирующая активность 487 штаммов 312 видов 89 родов мицелиальных грибов в отношении дегидроэпиандростерона. Большинство штаммов осуществляли гидроксилирование ДГЭА в положении 7а, при этом, наиболее активные представители были выявлены среди родов Actinomucor, Backusella, Benjaminiella, Epicoccum, Fusarium, Phycomyces, Trichothecium, Gongronella, Gliocephalotrichum, Mucor, Rhizomucor, Neurospora и Cunninghamella. Представители родов Bipolaris, Conidiobolus и Curvularia наиболее активно вводили гидроксильную группу в положение 7ß. Найдены штаммы, активно проводящие 7а,15а-дигидроксилирование ДГЭА. При этом высокая активность отмечена для представителей родов Acremonium, Fusarium, Gibberella и Nigrospora. Впервые выявлены штаммы (родов Basidiobolus, Botrytis и Phoma) эффективно восстанавливающие 7а-ОН-ДГЭА с образованием андрост-5-ен-Зр,7а,17р-триола. Представители родов Drechslera, Eurotium и Sporotrichum активно модифицировали Зр-ол-5-ен группировку ДГЭА в З-кето-4-ен-структуру с образованием андрост-4-ен-3,17-диона. Впервые исследовано 7а-гидроксилирование ДГЭА культурой Gibberella zeae ВКМ F-2600. Найдены условия, обеспечивающие селективное образование 7а-гидроксипроизводного (при совместном использовании твина-80, метилированного ß-циклодекстрина и растворителя (этанола или диметилформамида)). Впервые изучены особенности 7а,15а-дигидроксилирования ДГЭА культурой Fusarium graminearum F-159. Установлено, что образование 7а, 15а-дигидроксипроизводного является результатом последовательного

осуществления реакций 7а-гидроксилирования ДГЭА и 15а-гидроксшшрования 7а-гидроксипроизводного ДГЭА.

Впервые выявлена способность штамма рода Spicaria к осуществлению 7(а/р)-гидроксилирования дегидроэпиандростерона и лактонизации кольца D Зр,7(а/р)-диолов андростанового ряда. Ранее о возможности микробиологического получения лактонов Зр,7(аУ(5)-диолов андростанового ряда, а также о наличии активности Байер-Виллигер монооксигеназы у грибов рода Spicaria не сообщалось.

Практическая значимость работы. Найдены штаммы мицелиальных грибов, осуществляющие моногидроксилирование в положениях 7(а/р) и 7а,15а-дигидроксилирование зр-гидроксистероидов без структурной модификации кольца А. Получены микробиологическим путем новые стероидные лактоны - Зр,7(а/р)-дигидрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-оны. Разработаны эффективные биотехнологические методы получения Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она и ЗР,7а,15а-тригидроксиандрост-5-ен-17-она -важных интермедиатов синтеза терапевтических стероидов. Предложен метод комбинированного химико-микробиологического синтеза ЗР-гидроксиандрост-5,7-диен-17-она - ценного интермедиата новых производных витамина D. Результаты могут быть использованы при получении биоактивных стероидов и интермедиатов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 9-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), на II Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006), на VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), на ежегодных Отчетных сессиях научных работ ИБФМ РАН (2004, 2006, 2007, 2009). По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часта, включающей описание материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений 1 и 2. Работа содержит 119 страниц машинописного текста, 26 таблиц и 30 рисунков. Библиография включает 180 наименований, из них 149 иностранных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Микроорганизмы и их культивирование. В работе использовали штаммы мицелиальных грибов из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ИБФМ РАН) и рабочей коллекции Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений ИБФМ РАН. Выращивание культур проводили в колбах Эрленмейера (750 мл), содержащих 50 мл сусла или среды

следующего состава (г/л): глюкоза - 20, К2НР04 - 15.2, КН2Р04 - 18.1, картофельный отвар до 1 л (pH 6.5). Штаммы культивировали на роторной качалке при 200 об/мин и температуре 29°С.

Трансформацию ДГЭА грибными культурами при скрининге проводили в ростовых условиях с использованием среды №1, содержащей (г(мл)/л): сахароза - 50, КН2Р04 - 5, MgS04 - 5, жидкий кукурузный экстракт - 20 мл, диет, вода до 1 л (pH 6.5). ДГЭА вносили в виде кристаллического порошка в концентрации 0.5, 2 и 5 г/л. В ряде экспериментов 7а-ОН-ДГЭА и 7ß-OH-ДГЭА (1 г/л) добавляли в виде этанольных растворов (конечная концентрация этанола в среде не превышала 2 объемн.%). Биоконверсию проводили в колбах Эрленмейера (750 мл) на роторной качалке при 200 об/мин и температуре 29°С.

Биокоивсрсня ДГЭА Fusarium graminearum F-159 в ростовых условиях. Посевной материал выращивали в колбах Эрленмейера (750 мл) с суслом (pH 5.5) в два этапа. После 2-го выращивания посевной материал (5 мл) вносили в 50 мл среды №1 с органическим источником азота (кукурузный экстракт (лиофил.)) в концентрации 10 г/л. ДГЭА (5 г/л) вносили в виде кристаллического порошка или в комбинации с твин-80 (до конечной концентрации твина в среде - 0.1%), в виде растворов в органических растворителях (метанол, этанол, диметилформамид (ДМФА) и диметилсульфоксид (ДМСО)). Концентрацию растворителей в среде варьировали от 2 до 8 объемн.%. В отдельных экспериментах трансформацию ДГЭА вели в присутствии метилированного ß-циклодекстрина (МЦД).

При исследовании трансформации ДГЭА (20 г/л) в 3-х л ферментере АНКУМ 2М с рабочим объемом 1.5 л, субстрат, растворенный в ДМФА с твин-80 (до конечной концентрации твина в среде — 0.1%), вносили после 20-24 ч роста культуры. Концентрация ДМФА в среде не превышала 4 объемн.%. Культивирование проводили при следующих условиях: рОг - 20-50%, скорость перемешивания - 500-1000 об./мин, аэрация воздухом - 0.5-1.5 л/мин, температура 30°С, pH 5.5-6.5.

Выращивание Gibberella zeae ВКМ F-2600 и биоконверсия ДГЭА отмытым мицелием. Культуру выращивали 48 ч в колбах Эрленмейера (750 мл) со средой №2 (50 мл) (г/л): соевая мука (обезжиренная) - 20, кукурузный экстракт (лиофил.) - 10, дрожжевой экстракт - 5, К2НРО4- 3, КН2Р04 - 2, MgS04 - 0.2, FeS04- 0.005, (pH 6.8-7.0). Полученный посевной материал в объеме 10 % вносили в среду №1 с органическим источником азота (соевый пептон - 10 г/л) и культивировали 48 ч.

Трансформацию ДГЭА (1 г/л) проводили отмытым мицелием (80 г/л, вес сырой биомассы) в колбах Эрленмейера (750 мл) с 50 мл 0.1 M K-Na-фосфатного буфера (pH 7.0). ДГЭА (1 г/л) вносили в виде этанольного раствора (до конечной концентрации этанола в среде - 2 объемн.%).

В некоторых экспериментах в среде №1 сахарозу заменили глюкозой, фруктозой и лактозой, а соевый пептон - дрожжевым экстрактом, триптоном и NaNCb. В исследованиях по влиянию возраста мицелия время выращивания культуры варьировали от 24 до 72 ч. В ряде экспериментов субстрат вносили в виде кристаллического порошка или в комбинации с твин (21, 40, 60 и 80), в

ДМФА или этаноле с твин (21, 40, 60 и 80). Твины добавляли в трансформационную среду в концентрации 0.1%. Концентрацию растворителей в среде варьировали от 2 до 6 объемн.%, рН среды - от 5.0 до 8.0, влажный вес - от 40 до 160 г/л, концентрацию субстрата - от 1 до 20 г/л. В исследованиях по индукции 7а-гидроксилазной ферментной системы в качестве индукторов использовали ДГЭА, 7а-ОН-ДГЭА, 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА, прегненолон и холестерин в концентрации 0.2 г/л. В экспериментах по ингибированию синтеза белка вносили циклогексимид (ЦТ) (150 мг/л) и хлорамфеникол (ХФ) (1-2 мМ). Выращивание и трансформацию проводили на роторной качалке при 200 об/мин, температуре 29°С.

Выращивание Gibberella геае ВКМ F-2600 и биоконверсия ДГЭА в ростовых условиях. Посевной материал получали в два этапа в колбах Эрленмейера (750 мл) с 50 мл среды №2 (дрожжевой экстракт заменили триптоном). После 2-го выращивания полученный инокулят (10 % по объему) вносили в 50 мл среды №1 с органическим источником азота (триптон-10 г/л). ДГЭА в виде этанольного раствора добавляли в среду в концентрации 5 г/л после 24 часов роста культуры. Конечная концентрация этанола в среде составляла 2 объемн.%. В некоторых экспериментах одновременно с субстратом вносили МЦД.

При исследовании трансформации ДГЭА (5-20 г/л) в 3-х л ферментере АНКУМ 2М с рабочим объемом 1.5 л субстрат, растворенный в ДМФА с твин-80, и МЦД вносили после 20-24 ч роста культуры. Культивирование проводили при следующих условиях: рСЬ - 20-50%, скорость перемешивания - 400-950 об./мин, аэрация воздухом - 0.5-1.5 л/мин, температура 30°С, рН 5.5-7.0.

Аналитические методы.

ТСХ. Стероиды экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты или этиловым спиртом и анализировали на пластинках Sorbfil УФ 254 (Россия) с использованием систем растворителей: бензол:ацетон (5:3, об./об.), бензол:этилацетат:ацетон (1:1:1, об./об.), или бензол:ацетон (3:1, обУоб.). ДГЭА и его производные с Зр-ол-5-ен структурой выявляли при обработке пластинок ТСХ 4 % раствором фосфорномолибденовой кислоты (ФМК) в этаноле с последующим прогреванием пластинок, З-кето-4-ен-андростаны (АД, АДЦ) - в хемископе Desaga HP-UVIS (Германия) при 254 им.

ВЭЖХ. Анализ стероидов проводили с использованием хроматографа 1200 Series (Agilent, США) на колонке с обращенной фазой С18 Symmetiy (Waters, США) 250 х 4.6 мм, в смеси растворителей ацетонитрилгвода (45:55, об./об.), при скорости протока 1 мл/мин и температуре 50°С. Детекцию пиков осуществляли по УФ-абсорбции при 200 нм. Концентрации стероидов рассчитывали на основе полученных значений площади пиков. Время удерживания (Rt, мин) составило для ДГЭА - 12.01; 7а-ОН-ДГЭА - 4.01; 7(3-ОН-ДГЭА - 3.75; 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА- 3.17.

ГЖХ. Осадок со стероидами растворяли в 0.6 мл силанизирующей смеси гексаметилдисилозан-триметилхлорсилан-пиридин (3:1:9, об./об.). Анализ стероидов проводили на приборе "Hewlett Packard 5890" (США) с кварцевой колонкой (15 м х 0.25 мм) с полидиметилсилоксановой неподвижной фазой

SPB-1, детектор - плазменно-ионизационный с регистрацией на интеграторе HP 3396А ("Hewlett Packard", США), объём вводимой пробы - 2 мкл, газ-носитель -гелий. Температура испарителя и детектора 280 и 300°С, температурная программа анализа от 150°С (задержка 1 мин) со скоростью 10°С/мин до 285°С.

Колоночная хроматография. Выделяли стероиды методом колоночной хроматографии на сорбенте силикагель 60 (Merck, 0,040-0,063 мм), используя колонку (16 х 450 мм) и элюцию гексан-этилацетатной смесью.

Масс спектрометрия. Масс-спектры продуктов трансформации и исходных стероидных соединений, использованных в работе, получены на масс-спектрометре Finnigan MAT- SSQ710 (США) с прямым вводом образца в ионизационную камеру при энергии ионизации - 70 эВ.

'Н-ЯМР и 13С-ЯМР- спектроскопия. Спектры 'Н-ЯМР и "С-ЯМР продуктов трансформации и исходных стероидных соединений были сняты на спектрометре Unity + 400 (Varían) с рабочей частотой 400 МГц на ядре !Н и' 100.6 МГц на ядре 13С. В качестве внутреннего стандарта в спектрах Н-ЯМР использован СНС13 (5 7.24), в спектрах 13С-ЯМР - сигнал CDC13 (5 76.90), для смесей CDClj + CDOD - сигнал CDOD (S 49.00).

Химический синтез Зр-гидроксиандроста-5,7-диен-17-опа (7-дегидро-ДГЭА) из 7а-ОН-ДГЭА:

Получение 0-3р-трет-бутилдиметилснлилокси-7а-гидрокси-аидрост-5-ен-17-он. Раствор 7а-ОН-ДГЭА (3.04 г, 10.0 ммоль) и t-BuMe2S¡CL (2.26 г, 15 ммоль) в безводном пиридине (4.8 л, 60 ммоль) и СН2С12 (9 мл) держали закрытым в течение 24 ч при 25°С. Затем органический слой упаривали до сухого состояния и получали белый кристаллический осадок - D-Зр-трет-бутилдиметилсшшлокси-7а-гидроксиандрост-5-ен-17-она (3.50 г, 95% из 7а-ОН-ДГЭА) после рекристаллизации из толуола (100 мл).

Получение 0-Зр-трет-бутилдиметилсилилокси-7а-хлор-апдрост-5-еп-17-он. Раствор 0-Зр-трет-бутилдиметилсилилокси-7а-гидроксиандрост-5-ен-17-она (400 мг, 0.96 ммоль) в СН2С12 (8 мл) смешивали с раствором SOCb (0.14 мл, 1.9 ммоль) и пиридином (0.77 мл, 9.6 ммоль) в СН2С12 (4 мл) и перемешивали в течение 30 мин при 25°С. Затем смесь разбавляли СН2С12, отфильтровали через колонку с А1203 (10 г), промывали СН2С12, органический экстракт упаривали, осадок суспендировали в гексане (60 мл), затем снова отфильтровывали и высушивали. Осадок представлял собой Г)-ЗР-трет-бутиддиметилсилилокси-7а-хлор-андрост-5-ен-17-он. (390 мг (93%) из D-Зр-трет-буталдиметилсилилокси-7а-гидроксиандрост-5 -ен-17-она).

Получение 0-Зр-гидроксиандроста-5,7-диен-17-она (7-дегидро-ДГЭА). 1 М Раствор n-Bu4NF-3H20 в тетрагидрофуране (ТГФ) в объеме 3.4 мл сконцентрировали под вакуумом. Осадок (950 мг, 3.4 ммоль) растворяли в абсолютном ТГФ (4 мл) и смешивали с раствором D-ЗР-трет-бутилдиметилсилилокси-7а-хлор-андрост-5-ен-17-он (350 мг, 0.8 ммоль) в ТГФ (4.5 мл). Полученную смесь растворяли в t-BuOMe (100 мл). Затем раствор промывали Н20 (2 х 50 мл) и упаривали до сухого состояния. Полученный белый кристаллический порошок представлял собой аналитически чистый 7-

дегидро-ДГЭА с выходом 210 мг (92% из D-ЗР-трет-бутилдиметилсилилокси-7а-хлор-андрост-5-ен-17-она).

Методы анализа стероидных соединений, полученных при химическом синтезе. Спектры 'Н-ЯМР стероидных соединений получали на спектрометре Bruker VM-250 (250.13 МГц) (США) при 303 К, используя тетраметилсилан (5 0.00) в качестве внутреннего стандарта, УФ и ИК-спектры -на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) и ИК-спектрометре Specord М82 (Германия), соответственно. Масс-спектры соединений получали на Finnigan MAT- INCOS SO (США) с прямым вводом образца в ионизационную камеру при энергии ионизации - 70 эВ. Удельные вращения определяли на универсальном поляриметре PU-1 (Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Скрининг мицелиальных грибов на наличие 7-гидроксилазной активности в отношении дегидроэпиандростерона.

7а-Гидроксилированне ДГЭА. Исследовали активность 487 штаммов мицелиальных грибов в отношении ДГЭА. Способность к гидроксилированию ДГЭА в положении 7а установлена в общей сложности для 294 штаммов, относящихся к 33 родам аскомицетов,. 17-ти родам зигомицетов, 2-м родам базидиомицетов и 14-ти родам митоспоровых грибов. Максимальное число штаммов с 7-гидроксилирующей активностью (149) было выявлено среди аскомицетов. Наиболее активные штаммы относились к родам Fusarium, Gliocephalotrichum и Neurospora.

Зигомицеты (111 штаммов) также были способны гидроксилировать ДГЭА в положении 7а. Наиболее активные штаммы относились к родам Actinomucor, Benjaminiella, Cunninghamella, Gongronella, Phycomyces, Backusella, Mucor и Rhizomucor. До начала наших исследований в литературе имелись сведения о наличии 7-гидроксилирующей активности только у нескольких представителей зигомицетов: Rhizopus sp. (Dodson et al., 1959), Rhizopus stolonifer (Choudhaiy et al., 2003) и Mucor piriformis (Madyastha and Joseph, 1995).

Среди митоспоровых грибов, наиболее активные 7а-гидроксилирующие штаммы относились к родам Acremonium, Epicoccum и Trichothecium. Среди базидиомицетов 7а-гидроксилазная активность была выявлена у штаммов родов Trametes и Stereum. Ранее 7а-гидроксилирование было описано у Amanita, Armillaria (Ахрем и Титов, 1970) и Pleuroíus (Thoa et al., 1978).

Результаты скрининга также показали, что ряд штаммов, относящихся к родам: Achlya, Antrodia, Ascotricha, Calcarisporium, Circinella, Diplodia, Dipodascus, FomUopsis, Geomyces, Gremmeniella, Monocillium, Nectria, Neocosmospora, Paecilomyces, Phialophora, Pseudeurotium, Sepedonium, Sporolrichum, Trichaptum, Trichoderma, Viennotidia, Volutella, не гидроксилировали ДГЭА в положении 7а.

7р-Гидроксилирование ДГЭА. Способность к введению гидроксильной группы в позицию 7ß была установлена в общей сложности у 71 штаммов -представителей аскомицетов (21 род), зигомицетов (12 родов) и мйтоспоровых грибов (7 родов). При этом ряд штаммов родов Bipolaris, Conidiobolits и Curvularia трансформировали ДГЭА с образованием 7Р-ОН-ДГЭА в качестве основного продукта. В литературе образование 7р-гидроксипроизводного ДГЭА в смеси с 7а-гидроксистереомером сообщалось для штаммов родов Rhizopus, Amanita, Armillaria и Fusarium (Dodson et al, 1959; Ахрем и Титов, 1970; Cotillon et al., 1997).

7а,15а-Дигидроксплированис ДГЭА. Среди аскомицетов 64 штамма, относящихся к 12 родам, осуществляли дигидроксилирование ДГЭА в положениях 7а, 15а, при этом, у представителей 10 родов такая активность была установлена впервые. У представителей зигомицетов (50 штаммов) была обнаружена искомая активность, причем 21 штамм принадлежал к роду Cunninghamella (виды: C.blakesleeana, C.homothallica, C.echinulata, C.japonica и C.vesiculosa). Среди представителей базидиомицетов (род Stereum) и мйтоспоровых грибов (рода: Acremonium, Oospora, Verticillium и Zygosporium) также были выявлены штаммы, гидроксилирующие ДГЭА в положениях 7а и 15а. Отмечена корреляция 7а- и 7а,15а-гидроксилазной активностей штаммов, однако, количество штаммов, осуществляющих 7а,15а-дигидроксилирование ДГЭА, было значительно меньше, чем осуществляющих моногидроксилирование в положении 7а. Так, из 143 штаммов аскомицетов, способных к 7а-гидроксилированию, лишь 64 штамма проявляли способность к 7а,15а-дигидроксилированию ДГЭА.

Сопоставительный анализ позволил выявить наиболее активные штаммы среди родов Fusarium, Gibberella, Acremonium и Nigrospora, способные к дигидроксилированию 7а и 15а положениях. Среди представителей 12 видов рода Fusarium максимальную 7а,15а-гидроксилазную активность проявляли штаммы F. graminearum F-159, F. oxysporum ВКМ F-1600, F. wolguense BKM F-2306, F. sporotrichiella BKM F-2763. Мольный выход продукта составил 54-81 % при исходной концентрации ДГЭА 2.0 г/л. Сопоставимый уровень 7а, 15а-гидроксилазной активности был установлен у 3 штаммов рода Gibberella: G. zeae BKM F-2598, G. zeae BKM F-2599, G. zeae BKM F-2600 (58.5-68%). При трансформации ДГЭА (2.0 г/л) Acremonium felinum BKM F-1300 и Nigrospora oryzae BKM F-1939 в среде накапливалось 50 и 40.5 % 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА, соответственно.

Другие продукты трансформации ДГЭА мицелиальными грибами.

Помимо процессов гидроксилирования ДГЭА мицелиальные грибы проводили реакцию 17Р-восстановлсния 7а-ОН-ДГЭА с образованием андрост-5-ен-Зр,7а,17Р-триола. Наиболее активное образование «триода» было отмечено для штаммов родов Basidiobolus, Botrytis и Phoma. Ряд мицелиальных грибов осуществляли модификацию Зр-ол-5-ен- (ДГЭА) в З-кето-4-ен структуру (АД). Наиболее активное образование АД из ДГЭА (2 г/л)

осуществляли представители родов: ОгесЪвкга, Еигойит и БроШпскит. В некоторых случаях наряду с АД наблюдалось образование АДЦ, что свидетельствовало о наличии у грибов 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназной активности.

На основании полученных результатов была предложена общая схема трансформации ДГЭА мицелиальными грибами (рис.1).

Рис.1. Схема трансформации ДГЭА мицелиальными грибами.

При проведении скрининга основные стероидные продукты трансформации ДГЭА были выделены и охарактеризованы методами ТСХ, масс-спектрометрии и 'Н-ЯМР-спектроскопии.

В ходе скрининга был выявлен штамм Бркапа/итояо-^еа ВКМ Р-881, трансформирущий ДГЭА (2 г/л) с образованием 7а-ОН-ДГЭА, 7Р-ОН-ДГЭА, 3|3,7а-дигидрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-она и 3 р^р-дигидрокси-Па-окса-Б-гомо-андрост-З-ен-П-она. Структура соединений была подтверждена методами масс-спектрометрии, 'Н-ЯМР и 13С-ЯМР-спектроскопии.

Выход основного продукта - Зр,7р-дигидрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-она достигал 42%, выход его 7а-стереоизомера составлял 13.7%. Образования стероидных лактонов, не содержащих гидроксильную функцию при атоме С-7, в ходе трансформации не выявлено. Мы предположили, что

начальным этапом образования полученных стероидных лактонов из ДГЭА может являться гидроксилирование ДГЭА в положении 7 с образованием смеси 7-гидроксистереоизомеров. Для подтверждения данного предположения в качестве субстратов использовали выделенные и очищенные нами 7а- и 7Р-ОН-ДГЭА. При инкубации этих стероидов (1 г/л) с Бркапа /итояо-гозеа ВКМ Р-881 наблюдали образование соответствующих гидроксилированных стероидных лактонов (рис.2). Полученные результаты, а также анализ динамики трансформации ДГЭА данным штаммом позволили предположить, что образование гидроксилированных лактонов является результатом последовательного осуществления реакций 7(а/р)- гидроксшшрования ДГЭА и лактонизации полученных гидроксипроизводных по кольцу Б (Рис.2).

Рис.2. Схема образования стероидных лактонов с ЗР-ол-5-ен структурой при трансформации ДГЭА культурой Spicaria fumoso-rosea ВКМ F-881.

Возможность образования гидроксилированных лактонов с З-кето-4-ен структурой через соответствующие гидроксисоединения ранее была показана у Penicillium lilacinum (Sebek et al., 1962), Aspergillus íamarii (Hunter et al., 2006), Fusarium javanicum var. ensiforme (Fried and Thoma, 1958). В отличие от этих штаммов культура Cephalosporium aphidicola, наоборот, вводила 7а-гидроксильную группу уже в лактоны с 3-кето- и ЗР-гидрокси-5а-андростановой структурой (Hanson and Hunter, 1998). Однако, образование 7(а/р)-гидроксилированных лактонов с Зр-гидрокси-5-ен-структурой из дегидроэпиандростерона в одну микробиологическую стадию в литературе не описано.

НО

~ ^ ОН но^ ин

7Р-ОН-ДГЭА Зр,7Р-дигвдрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-он

.0

Оптимизация процесса 7а,15а-дигидроксилирования ДГЭА штаммом Fusarium graminearum F-159 в ростовых условиях.

Штамм F. graminearum F-159 наиболее активно осуществлял трансформацию ДГЭА с образованием 7а,15а-дигидроксипроизводного. Анализ динамики трансформации ДГЭА F. graminearum F-159 показал, что первоначально образуется 7а-ОН-ДГЭА, а затем наблюдается накопление дигидроксипроизводного. При инкубации F. graminearum F-159 с 7а-ОН-ДГЭА (1 г/л) наблюдали образование только 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА (рис.3). Полученные результаты позволили предположить, что образование 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА является результатом двух последовательных реакций 7а-гидроксилирования ДГЭА и 15а-гидроксилирования 7а-ОН-ДГЭА (рис.3).

ДГЭА 7а-ОН-ДГЭА 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА

Рис.3. Схема образования 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА из ДГЭА.

Известно, что для стероидов характерна низкая растворимость в водных растворах (Goetschel and Bar, 1992). Растворимость в воде ДГЭА не превышает 22 мг/л (Ахрем и Титов, 1970), что, вероятно, существенно ограничивает доступность субстрата к гидроксилазным системам клеток. Известны различные методы, направленные на повышение эффективности гидроксилирования гидрофобных стероидов микроорганизмами: внесение субстратов в органических растворителях, смешивающихся с водой (Lee et al., 1993; ¿nidarSic et al., 1998; Berrie et al., 1999), в комбинации с ПАВ (Slijkhuis and Marx, 1994; Smith et al., 1993) или модифицированными циклодекстринами (Чинчолкар и др., 1992; Sukhodolskaya et al., 2000).

Исследовали различные способы внесения субстрата в среду биоконверсии (Табл.1). Сравнение выхода 7а,15а-дигидроксипроизводного при трансформации ДГЭА F. graminearum F-159 при различных его способах внесения показало (табл.1), что наиболее высокий выход 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА (49.5%) наблюдался при внесении субстрата в трансформационную среду в растворе этанола. При внесении субстрата в виде кристаллического порошка, выход продукта не превышал 30% (Табл.1).

Таблица 1. Влияние способа внесения ДГЭА (5 г/л) в трансформационную среду на 7а,15а-дигидроксилирование ДГЭА К ¿гаттеагит Р-159*.

Способ внесения ДГЭА Выход 7а, 15а-ди-ОН-ДГЭА, % (мольн.)

Время, ч

48 72

контроль (кристаллический порошок) 27 29.6

в этаноле 49.5 40.5

в метаноле 36.0 39.0

в ДМСО 40.5 39.6

в ДМФА 15.7 41.4

в ДМФА* *+твин-80 29.5 43.7

кристаллический порошок + твин-80 42.3 40.5

* Концентрации растворителей в трансформационной среде - 4 объемн.%, Концентрация твин-80 в среде -0.1 %. ** Концентрация ДМФА в среде - 2 объемн.%.

Известно, что использование комплексообразующих агентов, например, химически модифицированных производных р-циклодекстрина, позволяет повысить эффективность процесса биоконверсии за счет увеличения растворимости субстрата, снижения его токсичности 'для культуры, предотвращения образования сметанных кристаллов и т.д. (Зге^И, 1991). Исследование влияния МЦЦ на процесс 7а,15а-дигидроксилирования ДГЭА Р.

аттеагит Р-159 показало, что скорость образования и выход 7а, 15а-дигидроксипроизводного зависят от концентрации МИД и достигают максимальных значений при мольном соотношении МЦЦ к субстрату 0.5:1 (табл.2). Повышение концентрации МЦЦ приводило к снижению выхода дигидроксилированного продукта втрое при мольном соотношении МЦЦ к субстрату 1.5:1 (табл.2).

Таблица 2. Влияние МЦЦ на 7а,15а-дигидроксилирование ДГЭА (5 г/л) штаммом Fusarium graminearum F-159._

Соотношение МЦЦ:ДГЭА* (моль/моль) Выход 7а, 15а-ди-ОН-ДГЭА, % (мольн.)

Время, ч

48 72

контроль (без МЦЦ) 49.5 40.5

0.5:1 56.3 60.8

1.0:1 40.5 42.8

1.5:1 10.8 20.4

* ДГЭА вносили в виде этанольного раствора, концентрации этанола в среде - 4 объемн.%.

Как показано выше, образование 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА из ДГЭА

происходит через промежуточный продукт - 7а-ОН-ДГЭА. Вероятно, при трансформации ДГЭА, образующийся 7а-ОН-ДГЭА связывался с МЦД, с формированием комплекса [МЦД - 7а-ОН-ДГЭА], при этом «связанный» 7а-ОН-ДГЭА становился менее доступным для действия стероидной гидроксилазной ферментной системы. Аналогичные эффекты описаны в литературе для других процессов микробиологической трансформации стероидов (КЬотШоу е1 а1., 2007).

Выход 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА зависел также от концентрации растворителя в трансформационной среде. Как видно из рис.4 (а,б), повышение до 8 % концентрации этанола в среде, содержащей МЦД, подавляло гидроксилирование 7а-ОН-ДГЭА в положении 15а и способствовало повышению выхода моногидроксипроизводного (до 66-71% за 36-48 ч биоконверсии). Следовательно, с помощью растворителей можно регулировать соотношение образующихся продуктов гидроксилирования ДГЭА.

О 12 24 36 48 60 72 Время, ч

■*-7»-ОП-ДГЭА -*- 7» ,15а-ди-ОН-ДГЭА

12 24 36 48 Время, ч

7а-ОН-ДГЭА -*-7а,15а-дн-ОН-ДГЭА

Рис.4. Влияние концентрации этанола на выход продуктов трансформации ДГЭА (5 г/л) в присутствии МЦД. А) концентрация этанола в среде - 4 объемн.%, Б) концентрация этанола в среде - 8 объсмн.%. Соотношение МЦЦгДГЭА (0.5:1, моль/моль).

Выход 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА зависел от времени внесения субстрата в среду: внесение ДГЭА после 24 и 48 часов роста культуры приводило к накоплению 60.7-61.6% дигидроксилированного продукта, в то время как при внесении субстрата вместе с инокулятом его выход не превышал 52%.

Исследование трансформации ДГЭА культурой F. graminearum F-159 в 3-х л ферментере АНКУМ 2М показало, что внесение субстрата (20 г/л) в растворе ДМФА с твин-80 после 20-24 часов роста культуры обеспечивает выход 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА на уровне 14,3-14,5 г/л. Целевой продукт был выделен и очищен. При этом мольный выход кристаллического 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА с чистотой не менее 96% из ДГЭА составлял более 55 %.

Способ микробиологического получения 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА из ДГЭА (20 г/л) штаммом F. graminearum F-159 по своим выходным параметрам превосходит известные методы (Romano et al., 2006; White

and Gilbert, 2004). Разработанный метод может быть рекомендован для получения 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА - ключевого интермедиата в химическом синтезе дроспиренона, являющегося одним из основных компонентов комбинированных оральных контрацептивов.

Химико-микробиологический синтез Зр-гидроксиандроста-5,7-диен-17-она из ДГЭА. Ключевым интермедиатом синтеза новых производных витамина D является Зр-гидроксиандроста-5,7-диен-17-он (7-дегидро-ДГЭА) (Okabe et al., 1995). Синтез 7-дегидро-ДГЭА возможен из коммерчески доступного ДГЭА с использованием аллильного 7-бромирования с последующим дегидробромированием. Однако использование такой технологии не отвечает современным высоким экологическим требованиям для фармацевтического получения стероидных субстанций. Альтернативой может являться микробиологическое 7-гидроксилирование с последующим химическим введением двойной 7(8)-связи в стероидное кольцо В. Для создания комбинированного метода были разработаны способ микробиологического получения 7а-гидроксипроизводного ДГЭА и химических синтез последующего введения двойной связи в положение 7(8) 7а-ОН-ДГЭА.

Оптимизация процесса получения 7а-ОН-ДГЭА из ДГЭА отмытым мицелием Gibberella zeae ВКМ F-2600.

С целью увеличения выхода 7а-ОН-ДГЭА оптимизировали условия проведения биоконверсии ДГЭА: оценивали влияние различных источников углерода и азота на гидроксилазную активность мицелия, зависимость скорости и селективности моногидроксилирования ДГЭА от рН среды, фазы роста мицелия, величины биомассы, способа внесения субстрата (в органических растворителях, в комбинации с ПАВ и циклодекстринами).

Использование для трансформации ДГЭА культуры, выращенной на среде с сахарозой, глюкозой или фруктозой в качестве источника углерода, обеспечивало высокую скорость трансформации и выход 7а-ОН-ДГЭА: за 4 часа трансформации выход продукта достигал 66.3-72.7%, а при использовании лактозы выход не превышал 38 %.

Выход 7а-гидроксипроизводного после 4 ч трансформации ДГЭА мицелием, выросшим на среде с органическим источником азота (соевый пептон, дрожжевой экстракт, триптон), составлял 75.5-76.7% и в 1.7 раза превышал выход моногидроксипроизводного, наблюдаемый при росте мицелия на среде с нитратом натрия.

Исследование влияния рН среды на 7а-гидроксилазную активность G. zeae ВКМ F-2600 в 0.1 М K-Na фосфатном буфере показало, что рН 7.0 являлся оптимальным значением (табл.3). При этом, выход 7а-ОН-ДГЭА на 4 часа трансформации был максимальным и составил 73.9 %. Полученные результаты коррелируют с литературными данными по влиянию рН на гидроксилирование

стероидов мицелиальными грибами (Суходольская с соавт., 1996; Wang et al., 1998; Xionga et al., 2006).

Таблица.З. Влияние значение pH среды на трансформацию ДГЭА (1 г/л) Gibberella zeae ВКМ F-2600.

Значение рН Время трансформации, ч Содержание стероидов в среде, % (мольн.)

7а-ОН-ДГЭА 7а, 15а-диОН-ДГЭА ДГЭА

5.0 4 56.9 6.0 35.0

6.0 4 65.4 6.6 27

7.0 4 73.9 9.0 16

8.0 4 62.5 6.2 30

При оптимальном значении рН увеличение биомассы от 40 до 120-160 г/л (вес сырой биомассы) приводило к сокращению времени достижения максимального выхода 7а-ОН-ДГЭА с 7 до 3 часов. Максимальный выход составил 71 — 75.7 %. При этом, выход продукта почти не зависел от возраста мицелия: при трансформации ДГЭА культурой, выращенной в течение 24, 48 или 72 часов, выход 7а-гидроксипроизводного достигал к 4 часам максимального значения - 74-76 %.

Известно", что повышение растворимости стероидных субстратов и увеличение выхода целевых продуктов микробиологического гидроксшшрования может быть обеспечено при использовании органических растворителей, смешивающихся с водой (Ядерец с соавт., 2007; Мапозпм й а1., 2007). Полученные нами результаты показали, что внесение ДГЭА в этаноле или ДМФА (концентрация растворителей в среде 2-4 объемн.%) значительно в 1,8-2,1 раза увеличивало выход 7а-гидроксипроизводного по сравнению с контрольным вариантом (рис.5).

3 80 п

ц о

Время, ч

а СЗ кристаллический порошок Ш этанол-2 %

В ДМФ-2 % □ этавол-4 %

Щ ДМФ-4 % ■ этапол-6 % ВДМФ-6%

Рис.5. Влияние растворителей и их концентрации на 7а-гидроксилирование ДГЭА (1 г/л) Gibberella zeae ВКМ F-2600.

В тоже время, добавление субстрата в этаноле (2%) с ПАВ в концентрации 0.1 % показало незначительное стимулирующее действие твина 40, 60 и 80 на выход 7а-ОН-ДГЭА (78,7-80,5%). Непосредственное внесение твина 21, 40, 60 и 80 в концентрации 0.1% в трансформационную среду с субстратом в виде кристаллического порошка не влияло на выход 7а-гидроксипроизводного.

Индукция 7а-гидроксилазной системы штамма аЬЬегеИа геае ВКМ Р-2600. Для выяснения принадлежности 7а-гидроксилазной системы аЬЬегеИа геае ВКМ Р-2600 к группе конститутивных или индуцибельных ферментов трансформацию ДГЭА (1 г/л) проводили в присутствии циклогексимида (ЦТ) -ингибитора синтеза белка (рис.6). Как видно из рис.6, как неиндуцированный, так и индуцированный мицелий в буферном растворе активно осуществляли процесс 7а-гидроксилирования. За 4 часа трансформации выход 7а-ОН-ДГЭА составил 70-74 %. В присутствии ЦГ неиндуцированный мицелий проявлял крайне низкую 7а-гидроксилазную активность: выход целевого продукта не превышал 0.9-1% за 6 часов трансформации. Индуцированный в ходе роста мицелий при трансформации в «голодной» среде в присутствии ЦГ проявлял 7а-гидроксилазную активность, но выход 7а-ОН-ДГЭА составил 24.6 % на 6 ч трансформации. Следует отметить, что неиндуцированный во время роста мицелий при трансформации субстрата в «голодной» среде осуществлял синтез фермента, что сопровождалось накоплением 70 % 7а-ОН-ДГЭА за 4 ч трансформации.

□ неиндуцированный мицелий

□ неиндуцированный мипелвй + ЦГ

Рис.6. Влияние ДГЭА на синтез 7а-гидроксилазной системы Gibberella zeae ВКМ F-2600. Концентрация циклогексимида -150 мг/л.

Использование ингибитора синтеза белка - хлорамфеникола (1-2 мМ), не оказывало существенного влияния на 7а-гидроксилирование ДГЭА культурой G. zeae ВКМ F-2600.

Полученные результаты свидетельствуют об индуцибельности 7а-гидроксилазы G. zeae ВКМ F-2600 и коррелируют с литературными данными, полученными ранее для Fusarium moniliforme. В частности, было показано, что 7а-гидроксилаза F. moniliforme, локализованная в цитоплазме, является индуцибельным ферментом и относится к суперсемейству цитохром- Р-450-монооксигеназ (Cotillon et al., 1997).

Для индукции 7а-гидроксилазной активности G. zeae ВКМ F-2600 использовали стероиды с Зр-гидрокси-5-ен конфигурацией, отличающиеся наличием или отсутствием боковой цепи при атоме С-17 и количеством гидроксильных групп (ДГЭА, 7а-ОН-ДГЭА, 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА, прегненолон, холестерин). Как показали результаты исследования, наиболее эффективным индуктором являлся прегненолон: при его использовании скорость накопления продукта была почти в 4 раза выше, чем в контроле. ДГЭА, 7а-ОН-ДГЭА, 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА и холестерин были менее эффективны (табл.4).

Таблица 4. Влияние структуры индуктора на 7а-гидроксилирование ДГЭА (1 г/л) штаммом Gibberella zeae ВКМ F-2600.

Время трансформации, ч Выход 7а-ОН-ДГЭА, % (мольн.)

контроль индукторы

ДГЭА 7а-ОН- ДГЭА 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА Прегненолон холестерин

1 7.9 14.8 14.2 12.3 31.1 9.5

2 33.1 46.4 42.6 42.6 68.2 43.5

Влияние МЦЦ на 7а-гидроксилирование ДГЭА СЛЬетеИа геае ВКМ Р-2600 в ростовых условиях. Как показано выше для культуры К ат'шеагит Р-159, использование высоких концентраций МЦЦ способствовало повышению селективности 7а-гидроксилирования ДГЭА за счет подавления второго гидроксилирования (в положении 15а). С целью повышения выхода 7а-ОН-ДГЭА гидроксилирование ДГЭА культурой & геае ВКМ Р-2600 проводили также в присутствии МЦЦ. В этом случае максимальный выход 7а-ОН-ДГЭА из ДГЭА (5 г/л) достигался при использовании соотношения ДГЭА:МЦЦ (1:2, (моль/моль)) и составлял 75.8%, при этом содержание дигидроксилированного продукта было незначительным.

Трансформация ДГЭА до 7а-ОН-ДГЭА ЫЬЬегеИа геае ВКМ Р-2600 в ферментере АНКУМ 2М. При проведении трансформации растущим мицелием С. геае ВКМ Р-2600 в ферментере АНКУМ 2М в найденных оптимальных условиях выход целевого 7а-гидроксипроизводного составил свыше 70 % при исходной концентрации субстрата до 20 г/л. После выделения и очистки 7а-ОН-ДГЭА был получен в кристаллическом виде с выходом 54-55 % и содержанием основного вещества более 96 %. Полученные

данные превосходят известные мировые аналоги (Dray and Cotillon, 1999; Ко'ек et al., 1999; Romano et al, 2006). В дальнейших исследованиях полученный кристаллический 7а-ОН-ДГЭА использовался для химической конверсии в 7-дегидро-ДГЭА.

Химическая конверсия 7а-ОН-ДГЭА в 7-дегидро-ДГЭА. 7а-ОН-

ДГЭА обладает двумя химически неравноценными гидроксильными группами (3ß и 7а), и хотя обе являются вторичными, 7а-гидроксильная группа является аллильной и потому - более реактивной в реакциях элиминации. При элиминации 7-гидроксигруппы требуется защита 3-гидроксигруппы в 7а-ОН-ДГЭА. Применение реагента t-BuMe2SiCl/nHpHflHH позволило получить силиловый эфир 7а-ОН-ДГЭА (рис.7). Соединение было выделено в индивидуальном виде с 95 % выходом в одну стадию кристаллизации.

Рис.7. Синтез 7-дегидро-ДГЭА. (а) 1-ВиМе281С1, пиридин, 95 % силиловый эфир 7а-ОН-ДГЭА; (б) БОСЬ, пиридин, 93% силиловый эфир 7а-С1-ДГЭА; (с) п-Ви4№, 92% 7-дегидро-ДГЭА.

Обработка силилового эфира 7а-ОН-ДГЭА классическим дегидратационным реагентом БОСЬ/пиридин позволила получить с высоким выходом соответствующий хлорид (силиловый эфир 7а-С1-ДГЭА) (рис.7). Хлор в силиловом эфире 7а-С1-ДГЭА конфигурационно стабилен в течение нескольких недель при хранении в гексане или СН2С12 или в течение 20 ч в СОС13 при 25°С. Конфигурационная стабильность 7а-хлора (силиловый эфир 7а-С1-ДГЭА) является важной для дегидрохлорирования. Использование силилового эфира 7а-С1-ДГЭА в качестве субстрата для дегидрохлорирования приводило к чистому кристаллическому 7-дегидро-ДГЭА при обработке с п-ВщОТ в растворе тетрагидрофурана, при этом, одновременно удалялась силилькая группа.

Разработанная 3-х-стадийная химическая схема конверсии 7а-ОН-ДГЭА в 7-дегидро-ДГЭА обеспечивала высокий выход интермедиатов и

конечного продукта. При этом, выход 7-дегидро-ДГЭА из 7а-ОН-ДГЭА в химическом синтезе составил 81.3 %.

Таким образом, проведенное. исследование показало, что большое число штаммов мицелиальных грибов способны трансформировать ДГЭА, в том числе, гидроксилировать ДГЭА в 7-м положении: 7а -гидроксилазная активность была показана для представителей 66 родов, обнаружены штаммы грибов, способные к введению гидроксильных групп в положения 7ß и 7а, 15а ДГЭА. При проведении скрининга штаммов была найдена культура Spicaria fumoso-rosea ВКМ F-881, способная не только гидроксилировать ДГЭА в положения 7а и 7ß, но и вводить атом кислорода в кольцо D 7(а/р)-гидроксилированных производных ДГЭА. Отобраны штаммы, наиболее активно осуществляющие трансформацию ДГЭА до 7а-ОН-ДГЭА {Gibberella zeae ВКМ F-2600) и 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА (Fusarium graminearum F-159) и найдены условия, обеспечивающие селективное и эффективное моно- и дигидроксилирование ДГЭА.

Полученные в работе результаты могут быть использованы в современной промышленности при создании биотехнологий получения 7а-ОН-ДГЭА и 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА. Разработанный комбинированный синтез получения 3ß-гидроксиандрост-5,7-диен-17-она из ДГЭА, включающий в себя микробиологическое получение 7а-ОН-ДГЭА и трех стадийную его химическую модификацию, может быть использован как альтернатива другим методам по получению ключевого интермедиата в химическом синтезе новых производных витамина D.

ВЫВОДЫ:

1. Изучена способность более 450 штаммов мицелиальных грибов различной таксономической принадлежности к осуществлению моногидроксилирования дегидроэпиандростерона в положениях 7а и 7ß, a также дигидроксилирования -в положениях 7а, 15а, и выявлены наиболее активные штаммы.

2. Впервые изучены особенности 7а,15а-дигидроксилирования дегидроэпиандростерона грибным штаммом Fusarium graminearum F-159. Установлено, что образование 7а,15а-дигидроксипроизводного является результатом последовательного осуществления реакций 7а-гидроксилирования дегидроэпиандростерона и 15а-гидроксилирования 7а-гидроксипроизводного ДГЭА.

3. Разработан и масштабирован до уровня лабораторных ферментеров эффективный одностадийный микробиологический метод получения 3ß,7a,15a-тригидроксиандрост-5-ен-17-она - ключевого интермедиата синтеза фармацевтического препарата дроспиренон. Метод основан на дигидроксилировании дегидроэпиандростерона штаммом Fusarium

graminearum F-159. Основные показатели метода (мольный выход целевого кристаллического продукта - свыше 55 % при нагрузке субстрата - 20 г/л) превосходят известные мировые аналоги.

4. Впервые изучены особенности 7а-гидроксилирования дегидроэпиандростерона культурой Gibberella zeas ВКМ F-2600. Найдены условия, обеспечивающие селективное получение Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она с мольным выходом свыше 70% при концентрации субстрата до 20 г/л. Разработан и реализован в лабораторном ферментере метод получения Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она из дегидроэпиандростерона. Метод обеспечивает мольный выход кристаллического продукта 54-55 % с содержанием основного вещества более 96%. Разработанный метод получения Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она из дегидроэпиандростерона использован в синтезе ЗР-гидроксиандрост-5,7-диен-17-она - ключевого интермедиата синтеза новых производных витамина D.

5. Выделены и охарактеризованы два новых стероидных лактона: Зр,7а-дигидрокси-17а-окса-Б-гомо-андрост-5-ен-17-он и 3 р,7р-дигидрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-он, образующиеся при трансформации дегидроэпиандростерона штаммом Spicaria fiimoso-rosea ВКМ F-881. Показано, что начальным этапом образования лактонов из дегидроэпиандростерона является образование 7а- и 7р-стереоизомеров — Зр,7а-дишдроксиандрост-5-ен-17-она и Зр,7р-дигидроксиандрост-5-ен-17-она, с последующей их лактонизацией по кольцу D. Обнаруженные гидроксилактоны потенциально являются биоактивными стероидами с противоопухолевой активностью.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи:

1. Lobastova T.G.. Gulevskaya S.A., Sukhodolskaya G.V., Turchin K.F., Donova M.V. Screening of mycelial fungi for 7a- and 7P-hydroxylase activity towards dehydroepiandrosterone. Biocatalysis and Biotransformation, 2007, Vol.25, N.6, pp.434-442.

2. Donova M.V., Sukhodolskaya G.V., Dovbnya D.V., Khomutov S.M., Nikolayeva V.M., Lobastova T.G.. Fokina V.V. Steroid bioconversion by actinobacteria and mycelial fungi for production of apis and key intermediates. Journal of Biotechnology, 2008, V. 136/S, P.283.

3. Lobastova T.G., Gulevskaya S.A., Sukhodolskaya G.V., Desherevskaya N.O., Donova M.V. Microbial hydroxylation of dehydroepiandrosterone. Journal of Biotechnology, 2008, V. 136/S, P.399.

4. Lobastova T.G.. Khomutov S.M., Vasiljeva L.L., Lapitskaya M.A., Pivnitsky K.K., Donova M.V. Synthesis of 3p-hydroxy-androsta-5,7-dien-17-

one from 3ß-hydroxyandrost-5-en-17-one via microbial 7a-hydroxylation. Steroids, 2009, V.74, pp.233-237.

5. Лобастова Т.Г.. Гулевская C.A., Суходольская Г.В., Донова MJB. Дигидроксилирование дегидроэпиандростерона в положениях 7а и 15а мицелиальными грибами. Прикладная биохимия и микробиология, 2009, Т.45, №6, с.684-689.

Тезисы:

6. Лобастова Т.Г.. Гулевская С.А., Суходольская Г.В., Донова М.В. 7(a/ß)-Гидроксилирование дегидроэпиндростерона мицелиальными грибами. Тезисы 9-ой международной Путинской школы конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", 18-22- апреля 2005 г., Пущино, 2005, С.354.

7. Лобастова Т.Г.. Суходольская Г.В., Гулевская С.А., Донова М.В. Двойное гидроксилирование дегидроэпиандростерона мицелиальными грибами. Тезисы II международной молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии", Москва, 1-3 ноября 2006г., с.92-93.

8. Донова М.В., Суходольская Г.В., Довбня Д.В., Фокина В.В., Хомутов С.М., Николаева В.М., Лобастова Т.Г., Егорова ОБ. Инновационные биотехнологии для получения стероидных фармацевтических субстанций и интермедиатов. Материалы VI Международной научной конференции "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии", Минск, 2-6 июня 2008 г., Т.2, стр.20-22.

9. Донова М.В., Суходольская Г.В., Довбня Д.В. Хомутов С.М., Николаева

B.М., Коллеров В.В., Лобастова Т.Г. Биотрансформации в органическом синтезе стероидных фармацевтических субстанций и интермедиатов. Материалы III Международной конференции "Химия, структура и функция биомолекул", г. Минск, 1-3 октября 2008 г., стр. 96-97.

10. Гулевская С.А. Лобастова Т.Г.. Донова М.В. Гидроксилирование 3ß- и За-гидроксистероидов в положении 7ß мицелиальными грибами с целью получения терапевтически важных производных. Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием "Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов", Москва, 24-27 декабря 2009 г.,

C.52.

11. Лобастова Т.Г„ Донова М.В. Образование стероидных лактонов из дегидроэпиандростерона культурой Spicaria fumoso-rosea ВКМ F-881. Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием "Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов", Москва, 24-27 декабря 2009 г., С.111.

Благодарности

Автор выражает признательность с.н.с., к.б.н. Суходольской Г.В. и с.н.с., к.б.н. Гулевской С.А. за помощь и участие в совместных исследованиях, с.н.с., к.х.н. Хомутову С.М. и м.н.с. Довбне Д.В. за участие в разработке биотехнологических методов получения гидроксипроизводных дегидроэпиандростерона, к.х.н. Турчину К.Ф. за снятие спектров 'Н- и ,3С-ЯМР и их описание, к.х.н. Анисимовой О.С. за снятие масс-спектров и их интерпретацию, к.х.н. A.B. Ариповскому за выполнение ГЖХ-анализа, а также всем сотрудникам лаборатории МТОС за ценные советы и помощь в работе. Автор приносит особую признательность за выполнение химического синтеза ЗР-гидроксиандроста-5,7-диен-17-она (7-дегидро-ДГЭА) из 7а-ОН-ДГЭА д.х.н. Пивницкому К.К., к.х.н. Лапицкой М.А., к.х.н. Васильевой JI.JI. (Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН) и описание УФ -, ИК-, масс- и 'Н-ЯМР-спектров полученных стероидных соединений.

Особую благодарность автор приносит своему руководителю д.б.н. Доновой М.В. за научное руководство.

Подписано в печать:

11.05.2010

Заказ № 3709 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лобастова, Татьяна Геннадьевна

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Микробиологическое гидроксилирование стероидных соединений

2.1.1 7(а/р)-гидроксилирование стероидных соединений мицелиальными грибами

2.1.2 Дигидроксилирование стероидов в положения 7а и 15а мицелиальными грибами

2.1.3 Функционализация кольца D мицелиальными грибами

2.2 Дегидроэпиандростерон и его производные

2.2.1 Дегидроэпиандростерон и его производные, их роль в организме человека и животных

2.2.2 Гидроксилирование ДГЭА мицелиальными грибами

2.2.3 Способы получения дегидроэпиандростерона и его гидроксилированных производных

2.2.3.1 Получение ДГЭА

2.2.3.2 Химический синтез 7(а/р)-гидроксипроизводных ДГЭА

2.2.3.3 Преимущества микробиологического метода получения гидроксилированных стероидов.

2.2.4 Ферменты, катализирующие процессы гидроксилирования дегидроэпиандростерона

2.3 Факторы, влияющие на процесс гидроксилирования стероидов мицелиальными грибами

2.3.1 Влияние состава питательной среды

2.3.2 Влияние возраста культуры и величины биомассы

2.3.3 Влияние pH и температуры

2.3.4 Влияние способа внесения стероида в трансформационную среду

2.3.5 Индукция стероидных гидроксилаз

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регио- и стереоспецифическое гидроксилирование дегидроэпиандростерона в положении 7 мицелиальными грибами"

Актуальность проблемы

Стероиды участвуют в осуществлении разнообразных биологических функций организма животных и человека. В основе механизма действия стероидных гормонов лежит их взаимодействие с соответствующими клеточными рецепторами, которые действуют как факторы регуляции транскрипции и модулируют экспрессию соответствующих генов (Tong and Dong, 2009). Исследования последних лет показали, что ряд ЗР-гидрокси-5-ен-стероидов (называемых также нейростероидами) -дегидроэпиандростерон (ДГЭА, 3(3-гидроксиандрост-5-ен-17-он), сульфат дегидроэпиандростерона (ДГЭАС), прегненолон (ЗР-гидроксипрегн-5-ен-17-он) и др. могут являться аллостерическими регуляторами нейротрансмиттерных рецепторов и изменять возбудимость нейронов при прямом контакте с клеточной поверхностью (Rupprecht and Holsboer, 1999). Показано, что ДГЭА и его 7-гидроксилированные метаболиты обладают также антиглюкокортикоидной и антиоксидантной активностью (Kalimi et al., 1994; Hampl et al., 1997; Pelissier et al., 2004). Помимо этого, положительные эффекты 7а-гидроксидегидроэпиандростерона (7а-ОН-ДГЭА; ЗР,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она), полученные в тестовых опытах и в экспериментах на животных, открывают перспективы его использования в лечении болезни Альцгеймера (Lardy, 1994), ожирения (Lardy, 1992), иммунных и эндокринных заболеваний (Rose et al., 2002). Другие гидроксипроизводные ДГЭА (7(3,11а-дигидроксидегидроэпиандростерон (7Р,11а-ди-ОН-ДГЭА; Зр,7р,11атригидроксиандрост-5-ен-17-он), и 7а,15а-дигидроксидегидроэпиандростерон (7а, 15а-ди-ОН-ДГЭА; Зр,7а,15а-тригидроксиандрост-5-ен-17-он)) нашли применение как ключевые интермедиаты синтеза лекарственных препаратов, - дроспиренона и эплеренона (Petzoltd et al., 1984; White et al., 2006).

Получение гидроксилированных производных ДГЭА возможно путем микробиологической трансформации или химического синтеза. Однако химический синтез гидроксипроизводных ЗР-гидроксистероидов проходит с низкой селективностью и небольшим выходом (Defaye et al., 1978; Criton et al., 2007). Более предпочтительным представляется получение гидроксипроизводных ДГЭА с помощью микробиологической трансформации.

Известна способность мицелиальных грибов к эффективному гидроксилированию 3-кетостероидов андростанового и прегнанового рядов (Mahato and Garai, 1997; Fernandes et al., 2003). Между тем, данные о гидроксилировании ЗРгидрокси-5-ен-стероидов, в том числе ДГЭА, до начала наших исследований были весьма ограничены.

Актуальными задачами являются поиск эффективных штаммов, способных к регио- и стереоспецифическому введению гидроксильных групп в положения 7а, 7ß и 7а, 15а ДГЭА без структурной модификации кольца А; изучение их потенциала в качестве продуцентов нейроактивных стероидов и их предшественников, получение новых, потенциально биоактивных 7а-гидроксистероидов, a также поиск путей интенсификации процессов гидроксилирования гидрофобных стероидных субстратов мицелиальными грибами.

Состояние вопроса

Известно, что мицелиальные грибы способны вводить гидроксильную группу в различные положения стероидной молекулы. Основное внимание исследователей в течение долгого времени уделялось микробиологическому гидроксилированию 3-кето-4-ен-стероидов. Определен широкий круг мицелиальных грибов различной таксономической принадлежности, способных осуществлять 7(а/р)-гидроксилирование З-кето-4-ен-стероидов (Mahato and Garai, 1997; Fernandes et al., 2003). Способность к гидроксилированию Зр-ол-5-ен-стероидов была показана для ограниченной группы штаммов - представителей родов Fusarium (Defaye et al., 1978; Cotillon et al., 1997; Kolek, 1999; Wilson et al., 1999), Mucor (Madyastha and Joseph, 1995), Rhizopus (Dodson et al., 1959; Choudhary et al., 2003) и некоторых других родов.

Показано, что замена З-кето-4-ен- на ЗР-гидрокси-5-ен структуру стероидного ядра может приводить к изменению положения введения гидроксильной группы. Например, Mucor piriformis осуществлял преимущественно 14а-гидроксилирование С19 и С21 стероидов с З-кето-4-ен структурой (Madyastha, 1994), в то же время ДГЭА и прегненолон гидроксилировались этим грибом стереоспецифически в положении 7а с образованием соответствующих 7а-гидроксипроизводных (Madyastha and Joseph, 1995). В ряде случаев реакция гидроксилирования сопровождалась трансформацией Зр-ол-5-ен- в З-кето-4-ен структуру (Charney and Herzog , 1967; Choudhary et al., 2003). Литературные данные по 7а,15а-дигидроксилированию ДГЭА мицелиальными грибами ограничены несколькими работами (Okada and Saito, 1965; Petzoldt et al., 1984; White and Gilbert, 2004; Romano et al., 2006).

Исследований по изучению ферментных систем низших эукариот, ответственных за моногидроксилирование в положениях 7а и 7ß и дигидроксилирование (в положениях 7а и 15а) ЗР-ол-5-ен-стероидов андростанового ряда, практически не проводилось. Изучение ферментной системы, ответственной за 7а-гидроксилирование ДГЭА, было проведено только на культуре Fusarium moniliforme (Cotillon et al., 1997; Cotillon and Morfïn, 1999).

Сведения о наличии y мицелиальных грибов активности Байер-Виллигер монооксигеназы - фермента, ответственного за лактонизацию кольца D стероидов были приведены в ряде публикаций (Ахрем и Титов, 1970; Mostava and Zohri, 2000; Bartmanska et al., 2005 и др.). Образование тестололактона (17а-окса-0-гомо-андрост-4-ен-3,17-диона) из З-кето-4-ен-стероидов (преимущественно, тестестерона (Т, 17ß-гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона) и прогестерона (прегн-4-ен-3,20-диона)) мицелиальными грибами было выявлено у представителей родов Aspergillus (Mostava and Zohri, 2000), Pénicillium (Bartmanska et al., 2005), Fusarium (Plourde et al., 1972). Получение лактонов из С19- и С21-стероидов с ЗР-гидрокси-5-ен-структурой без модификации кольца А было показано только для культур Pénicillium lilacinum AM 111 (Kolek et al., 2008) и Pénicillium camemberti AM 83 (Kolek et al., 2009): штаммы конвертировали прегненолон и ДГЭА до ЗР-гидрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-она. При биоконверсии прегненолона начальным этапом являлась деградация прегнановой боковой цепи с образованием ДГЭА в качестве интермедиата с последующим его окислением до 3ß-гидроксилактона (Kolek et al., 2008; Kolek et al., 2009). Сведений об образовании 7-гидроксипроизводных лактонов с Зр-ол-5-ен структурой в доступной литературе не обнаружено.

В целом, анализ данных научной и патентной литературы свидетельствует о наличии ограниченного числа штаммов, представляющих интерес для дальнейшего биотехнологического использования при получении биоактивных стероидов и ключевых интермедиатов на основе 7-гидроксилированных производных ДГЭА. Недостаточно изученной остается также связь 7-гидроксилирования 3-гидрокси-стероидов с лактонизацией по кольцу Д и другими реакциями трансформации, осуществляемыми ферментными системами мицелиальных грибов, - окислением 3-гидроксигруппы, Д5>4-изомеризацией, 17ß - восстановлением, 15а-гидроксилированием.

Цель и задачи работы.

Целью работы являлось изучение гидроксилирования дегидроэпиандростерона в положениях 7а и 7ß мицелиальиыми грибами и разработка биотехнологических методов получения 7-гидроксипроизводных Зр-ол-5-ен-стероидов ряда андростана.

Были поставлены следующие задачи:

1. Оценить гидроксилирующую активность мицелиальных грибов в отношении дегидроэпиандростерона и выявить штаммы, наиболее эффективно осуществляющие гидроксилирование в положениях 7а и 7ß без структурной модификации кольца А.

2. Выбрать наиболее активные штаммы, катализирующие стереоселективное дигидроксилирование дегидроэпиандростерона в положениях 7а и 15а.

3. Изучить связь 7-гидроксилирования с сопутствующими реакциями трансформации дегидроэпиандростерона: 15а-гидроксилированием, 17р-восстановлением, окислением 3-гидроксигруппы, Д5,4-изомеризацией, лактонизацией кольца D.

4. Исследовать особенности трансформации дегидроэпиандростерона наиболее активными штаммами и определить оптимальные условия селективного образования целевых 7-гидроксипроизводных.

5. Разработать биотехнологические способы получения Зр,7а,15а-тригидроксиандрост-5-ен-17-она и ЗР,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она из дегидроэпиандростерона с выделением продуктов в кристаллическом виде.

Научная новизна работы.

Исследована трансформирующая активность 487 штаммов 312 видов 89 родов мицелиальных грибов в отношении дегидроэпиандростерона. Большинство штаммов осуществляли гидроксилирование ДГЭА в положении 7а, при этом, наиболее активные представители были выявлены среди родов Actinomucor, Backusella, Benjaminiella, Epicoccum, Fusarium, Phycomyces, Trichothecium, Gongronella, Gliocephalotrichum, Mucor, Rhizomiicor, Neurospora и Cunninghamella. Представители родов Bipolaris, Conidiobolus и Curvularia наиболее активно вводили гидроксильную группу в положение 7ß. Найдены штаммы, активно проводящие 7а, 15а-дигидроксилирование ДГЭА. При этом высокая активность отмечена для представителей родов Acremonium, Fusarium, Gibberella и Nigrospora. Впервые выявлены штаммы (родов Basidiobolus, Botrytis и Phoma) эффективно восстанавливающие 7а-ОН-ДГЭА с образованием андрост-5-ен-Зр,7а,17Р-триола. Представители родов Drechslern, Eurotium и Sporotrichum активно модифицировали Зр-ол-5-ен группировку ДГЭА в З-кето-4-енструктуру с образованием андрост-4-ен-3,17-диона. Впервые исследовано 7а-гидроксилирование ДГЭА культурой Gibberella zeae ВКМ F-2600. Найдены условия, обеспечивающие селективное образование 7а-гидроксипроизводного (при совместном использовании твина-80, метилированного ß-циклодекстрина и растворителя (этанола или диметилформамида)). Впервые изучены особенности 7а,15а-дигидроксилирования ДГЭА культурой Fusarium graminearum F-159. Установлено, что образование 7а,15а-дигидроксипроизводного является результатом последовательного осуществления реакций 7а-гидроксилирования ДГЭА и 15а-гидроксилирования 7а-гидроксипроизводного ДГЭА.

Впервые выявлена способность штамма рода Spicaria к осуществлению 7(a/ß)-гидроксилирования дегидроэпиандростерона и лактонизации кольца D Зр,7(а/р)-диолов андростанового ряда. Ранее о возможности микробиологического получения лактонов Зр,7(а/р)-диолов андростанового ряда, а также о наличии активности Байер-Виллигер монооксигеназы у грибов рода Spicaria не сообщалось.

Практическая значимость работы.

Найдены штаммы мицелиальных грибов, осуществляющие моногидроксилирование в положениях 7(a/ß) и 7а,15а-дигидроксилирование 3ß-гидроксистероидов без структурной модификации кольца А. Получены микробиологическим путем новые стероидные лактоны - Зр,7(а/р)-дигидрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-оны из дегидроэпиандростерона. Результаты открывают перспективы нового биотехнологического подхода к получению лактонов, потенциально обладающих противоопухолевой и антиандрогенной активностями. Разработаны эффективные биотехнологические методы получения 3ß,7a-дигидроксиандрост-5-ен-17-она и 3ß,7a, 15а-тригидроксиандрост-5-ен-17-она - важных интермедиатов синтеза терапевтических стероидов. Предложен метод комбинированного химико-микробиологического синтеза Зр-гидроксиандрост-5,7-диен-17-она — ценного интермедиата новых производных витамина D. Результаты могут быть использованы при получении биоактивных стероидов и интермедиатов.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 9-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2005), на II Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006), на VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), на ежегодных Отчетных сессиях научных работ ИБФМ РАН (2004, 2006, 2007, 2009).

Основные положения диссертации были представлены на совместном семинаре Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений и Лаборатории энзиматической деградации органических соединений.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений 1 и 2. Работа содержит 119 страниц машинописного текста, 26 таблиц и 30 рисунков. Библиография включает 180 наименований, из них 149 иностранных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Лобастова, Татьяна Геннадьевна

ВЫВОДЫ:

1. Изучена способность более 450 штаммов мицелиальных грибов различной таксономической принадлежности к осуществлению моногидроксилирования дегидроэпиандростерона в положениях 7а и 7ß, а также дигидроксилирования - в положениях 7аД5а, и выявлены наиболее активные штаммы.

2. Впервые исследованы особенности 7а, 15а-дигидроксилирования дегидроэпиандростерона грибным штаммом Fusarium graminearum F-159. Установлено, что образование 7а,15а-дигидроксипроизводного является результатом последовательного осуществления реакций 7а-гидроксилирования дегидроэпиандростерона и 15а-гидроксилирования 7а-гидроксипроизводного ДГЭА.

3. Разработан и масштабирован до уровня лабораторных ферментеров эффективный одностадийный микробиологический метод получения 3 ß,7a, 15а-триги дроксиандрост-5 -ен-17-она - ключевого интермедиата синтеза фармацевтического препарата дроспиренон. Метод основан на дигидроксилировании дегидроэпиандростерона штаммом Fusarium graminearum F-159. Основные показатели метода (выход целевого кристаллического продукта - свыше 55 % при нагрузке субстрата - 20 г/л) превосходят известные мировые аналоги.

4. Впервые изучены особенности 7а-гидроксилирования дегидроэпиандростерона культурой Gibberella zeae ВКМ F-2600. Найдены условия, обеспечивающие селективное получение Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она с выходом свыше 70% при концентрации субстрата до 20 г/л. Разработан и реализован в лабораторном ферментере метод получения Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она из дегидроэпиандростерона. Метод обеспечивает выход кристаллического продукта 54-55 % с содержанием основного вещества более 96%. Разработанный метод получения Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она из дегидроэпиандростерона использован в синтезе 3Р-гидроксиандрост-5,7-диен-17-она -ключевого интермедиата синтеза новых производных витамина D.

5. Выделены и охарактеризованы два новых стероидных лактона: Зр,7а-дигидрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-он и 3 Р,7Р-дигидрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-он, образующиеся при трансформации дегидроэпиандростерона штаммом Бргсапа /итояо-гояеа ВКМ Р-881. Показано, что начальным этапом образования лактонов из дегидроэпиандростерона является образование 7а- и 7р-стереоизомеров — Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она и Зр,7Р-дигидроксиандрост-5-ен-17-она с последующей их лактонизацией по кольцу Б. Обнаруженные гидроксилактоны потенциально являются биоактивными стероидами с противоопухолевой активностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенное исследование регио- и стереоспецифического гидроксилирования ДГЭА по положению 7 мицелиальными грибами показало, что большое число штаммов мицелиальных грибов способны трансформировать ДГЭА, в том числе, гидроксилировать ДГЭА в 7-м положении: 7а -гидроксилирующая активность была показана для представителей 66 родов, обнаружены штаммы грибов, способные к введению гидроксильных групп в положения

7ß и 7a, 15a ДГЭА. При проведении скрининга штаммов была найдена культура Spicaria fumoso-rosea ВКМ F-881, способная не только гидроксилировать ДГЭА в положения 7а и 7ß, но и вводить атом кислорода в кольцо D 7(ау^)-гидроксилированных производных ДГЭА. Отобраны штаммы, наиболее активно осуществляющие трансформацию ДГЭА до 7а-ОН-ДГЭА (Gibberella zeae ВКМ F-2600) и 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА {Fusarium graminearum F-159) и найдены условия, обеспечивающие селективное и эффективное моно- и дигидроксилирование ДГЭА.

Полученные в работе результаты могут быть использованы в современной промышленности при создании биотехнологий получения 7а-ОН-ДГЭА и 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА. Разработанный комбинированный синтез получения Зß-гидpoкcиандpocт-5,7-диeн-17-она из ДГЭА, включающий в себя микробиологическое получение 7а-ОН-ДГЭА и трех стадийную его химическую модификацию, может быть использован как альтернатива другим методам по получению ключевого интермедиата в химическом синтезе новых производных витамина D.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лобастова, Татьяна Геннадьевна, Пущино

1. Ангелова Б.А., Суходольская Г.В., Кощеенко К.А. Сравнительное изучение закономерностей роста и ферментативной активности свободного и иммобилизованного мицелия Curvularia lunata. Изв. АН СССР, сер.биол., 1986, № 5, С.753-761.

2. Ахрем А.А. и Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. Изд-во «Наука», Москва, 1970. 528с.

3. Бхакка Н., Уильяме Д. Применение ЯМР в органической химии. Издательство «Мир», Москва, 1966,243с.

4. Войшвилло Н.Е., Истомина З.И., Камерницкий А.В., Весела И.В., Решетова И.Г., Стрелкова О.Г. Поиск микроорганизмов, способных к 9а-гидроксилированию 3(3-гидроксистероидов. Прикл. биох. микроб., 1994, Т.4, Вып.4-5, С.617-623.

5. Габинская К.Н. Влияние различных источников углерода и азота на рост Rhizopus nigricans ВНИХФИ-7 и lla-гидроксилирование 16а-метилпрогестерона Микробиологическая промышленность, 1970, № 4, С.27-31.

6. Габинская К.Н., Шпингис А.А., Мессинова О.В. О методах внесения исходного стероида при его микробиологическом гидроксилировании. Микробиология, 1972, Т.41, Вып.4, С.750-751.

7. Гончаров Н.П., Кация Г.В., Нижник А.Н. Дегидроэпиандростерон и функции мозга. Вестник Российской АМН, 2005, № 8, С.37-43.

8. П.Джафаров М.Х., Зайцев С.Ю., Максимов В.И. Стероиды: строение, получение, свойства и биологическое значение, применение в медицине и ветеринарии. Учебное пособие, СПб.: Издательство «Лань», 2010, 288с.

9. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н., Аринбасарова А.Ю., Вагабова JI.M., Морозова З.В., Кощеенко К.А. Способ получения андроста-1,4-диен-ЗД7-диона. РФ 2039824, 1995.

10. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н., Аринбасарова А.Ю., Вагабова JI.M., Морозова З.В., Кощеенко К.А. Способ получения андрост-4-ен-3,17-диона. РФ 2079258, 1997.

11. Донова М.В. Трансформация стероидных соединений актинобактериями (обзор). Прикл. биохим. микроб., 2007, Т.43, №1, С.5-18.

12. Куплетская М.Б., Туровцева В.В., Скрябин Г.К. Синтетическая среда для выращивания гриба Tieghemella hyalospora. Микробиологическая промышленность, 1971, №11, С.32-36.

13. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух томах. Т.2. Изд. 13-е, Харьков: Торсинг, 1997, 592с.

14. Могильницкий Г.М. О некоторых факторах, оказывающих влияние на трансформацию вещества S Рейхштейна грибом Tieghemella orchidis. Микробиологическая промышленность, 1970, № 6, С.64-68.

15. Могильницкий Г.М., Кощеенко К. А. Особенности трансформации 21-ацетата вещества "S" Рейхштейна грибом Tieghemella orchidis в связи с использованием исходного субстрата в тонкоизмельченном состоянии. Прикл. биохим. микроб., 1973, Т.9, Вып.З, С.380-384.

16. Могильницкий Г.М., Андреев Л.В., Кощеенко К.А. Ферментативная деструкция стероидов в процессе 11а- и 11 Р-гидроксилирования 21-ацетата вещества "S" Рейхштейна грибом Tieghemella orchidis (сем. Mucoraceae). Микробиология, 1975, T.XLIY, Вып.2, С.351-356.

17. Скрябин Г.К., Вайсман Е.М., Ерошин В.К. Влияние фазы развития культуры

18. Thighemella orchidis на трансформацию вещества S Рейхштейна. Изв. АН СССР, сер.биол., 1966, №4, С.549-553.

19. Скрябин Г.К., Лебедева Ж.Д. Гидроксилирование стероидов в 17а-положении культурой Trichothecium roseum. Микробиол. Промышленность, 1971, № 9, С. 17-21.

20. Суходольская Г.В., Гулевская С.А., Чинчолкар С.Б., Кощеенко К.А., Джоши А.К., Бихари В., Басу С.К. Стероид-11 p-гидроксилазная активность Curvularia lunata ВКМ F-644 и факторы её стабилизации. Прикл. биохим. микроб., 1996, Т.32, №1, С.69-77.

21. Турута A.M., Войшвилло Н.Е., Камерницкий А.В. Микробиологическое гидроксилирование 5а-Н-стероидов. Успехи химии, 1992, Т.61, Вып.10, С.1882-1931.

22. Умнова Э.Ф., Рыжкова В.М., Воробьева Л.И. Гидроксилирование 16а-Метил-17а,21-диоксипрегн-4-ен-З-она. Хим.-Фарм. Журн., 1990, Т.24, № 6, С.56-58.

23. Физер Л., Физер М. Стероиды. Изд-во: «Мир», 1964, 982с.

24. Хефтман Э. Биохимия стероидов. Изд-во: «Мир», Москва, 1972, 175с.

25. Шувалова С.Д., Габинская К.Н., Попова Е.В., Савинова Т.С., Андрюшина В.А. 2001. Гидроксилирование андрост-4-ен-3,17-диона с помощью гриба Curvularia lunata. Хим.-Фарм. Журн., 2001, Т. 35, №5., С.44-46.

26. Ядерец В.В., Андрюшина В.А., Бартошевич Ю.Э., Домрачева А.Г., Новак М.И., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. Изучение стероидгидроксилирующей активности мицелия Curvularia lunata. Прикл. биохим. микроб., 2007, Т.43, № 6, С.695-700.

27. Abdel-Fattah A.F., Badawi М.А. Production, induction, and activity of progesterone hydroxylases by Aspergillus niger 12 Y. J. Gen. Appl. Microbiol., 1974, V.20, pp.363-371.

28. Akwa Y., Morfin R.F., Robel P., Baulieu E.-E. Neurosteroid metabolism. 7a-HydroxyIation of dehydroepiandrosterone and pregnenolone by rat brain microsomes. The Biochem. Journal, 1992, Vol.288, part 3, pp.959-964.

29. Armas LAG, Hollis BH, Heaney RP. Vitamin D2 is much less effective than Vitamin D3 in humans. J.Clin. Endocrinol. Metab., 2004, V.89, pp.5387-5391.

30. Baran J.C. The synthesis, stereochemistry, and biology of 16-hetero and 17-oxa-D-homo steroids. J. Med. Chem., 1967, V.10, pp.1039-1047.

31. Bartmanska A., Dmochowska-Gladysz J., Huszcza E. Steroids transformations in Penicillium notatum culture. Steroids, 2005, V.70, pp.193-198.

32. Bastianetto S., Ramassamy C., Poirier J., Quirion R. Dehydroepiandrosterone (DHEA) protects hippocampal cells from stress-induced damage. Mol. Brain Res., 1999, V.66, pp.35-41.

33. Baulieu E.-E., Schumacher M. Progesterone as a neuroactive neurosteroid, with special reference to the effect of progesterone on myelination. Steroids, 2000, V.65, pp.605-612.

34. Beaton J.M. Preparation of sterol substrates for bioconversion. US Patent 412460, 1978.

35. Bensasson C.M., Hanson J.R., Hunter C. The hydroxylation of A5-androstenes by Cephalosporin aphidicola. Phytochemistry, 1998, V.49, N.8, pp.2355-2358.

36. Bensasson C.M., Hanson J.R., Le Huerou Y. The microbiological hydroxylation of 3a,5-cycloandrostanes by Cephalosporium aphidicola. Phytochemistry, 1999, V.52, pp. 1279-1282.

37. Bide A.E., Henbest H.B., Jones E.R.H., Peevers R.W., Wilkinson P.A. Studies in the sterol group. Part XLVII. A new route to 7-dehydrocholesterol (provitamin D3) and its derivatives. J. Chem. Soc., 1948, pp. 1783-1788.

38. Brannon D.R., Martin J., Oehlschlager A.C., Durham N.N., Zalkow L.H. Transformation of progesterone and related steroids by Aspergillus tamari. J.Org.Chem., 1965, V.30, N.3, pp.760-762.

39. Braustein G.D. Aromatase and gynecomastia. Endocr. Relat. Cancer, 1999, V.6, pp.315-324.

40. Brodie A.M.H., Njar V.C.O. Aromatase inhibitors in advanced breast cancer: mechanism of action and clinical implications. J.Steroid Biochem. Mol. Biol., 1998, V.66, pp.1-10.

41. Capek A., Hanc O. Microbiological transformation of steroids XIV. Microbial 11(3-hydroxylation of steroids. Folia Microbial., 1961, V.6, N.4, pp.237-242.

42. Capek A., Hanc 0., Macek K., Tadra M., Riedl-Tümova E. Das Studium der Überfuhrung von progesterone in testololacton. Naturwissenschaften. 1956, Jg.43, Heft 20, S.471.

43. Chalbot S., Morfin R. Human liver S9 fractions: metabolism of dehydroepiandrosterone, epiandrosterone, and related 7-hydroxylated derivatives. Drug Metabolism and Disposition. 2005, V.33, N.4, pp.563-569.

44. Charney W., Herzog H.L. 1967. Microbial Transformation of Steroids. Acad. Press: N.-Y. and London, 1967. 728p.

45. Cherivi K., Seman M. Stereospecific synthesis, for preparation of e.g. pharmaceuticals, comprises contacting allyl derivative with copper or selenium catalyst and carboxylate oxidant. Fr 2793491-A1. 2000.

46. Choudhary M.I., Batool I., Shah S.A.A, Nawaz S.A., Atta-Ur-Rahman. Microbial hydroxylation of pregnenolone derivatives. Chem. Pharm. Bull., 2005, V.53, N.ll, pp.14551459.

47. Choudhary M.I., Shah S.A., Musharraf S.G., Shaheen F., Atta-Ur-Rahman. Microbial transformation of dehydroepiandrosterone. Nat. Prod. Research, 2003, V.17, pp. 215-220.

48. CIBA LTD. Oxidation products from compounds of the steroid series and process of making same. GB Patent 792803, 1958.

49. Cotillon A.C., Doostzadech J., Morfm R. The inducible and cytochrome P-450 containing dehydroepiandrosterone 7-hydroxylating enzyme system of Fusarium moniliforme. J.Steroid Biochem. Mol. Biol., 1997, V.62, pp. 467-475.

50. Cotillon A.C., Morfin R. Transformation of 3-hydroxy-steroids by Fusarium moniliforme 7a-hydroxylase. J.Steroid Biochem. Mol. Biol., 1999, V.68, pp. 229-237.

51. Cresnar B., Zakelj-Mavric M. Aspects of the steroids response in fungi. Chem. Biol. Interact, 2009, V.178, pp.303-309.

52. Criton M., Gloux D., Montero J.-L. Novel methods for the preparation of DHEA derivatives. US 2007/0032462 Al, 2007.

53. Defaye G., Luche M.J., Chambaz M. 1978. Microbiological 7- and 15-hydroxylations of C-19 steroids. J. Steroid Biochem., 1978, V. 9, pp.331-336.

54. Despreaux C.W., Rittweger K.R., Palleroni N.J. Microbial 7a-hydroxylation of 3-ketobisnorcholenol. Appl. Environ. Microbiol., 1986, V.51, pp.946-949.

55. Dodson R.M., Goldkamp A.H., Muir R.D. Microbiological hydroxylation of Cig-steroids at positions C-l and C-2. J. Am. Chem. Society, 1957, V.79, N.14, p.3921.

56. Dodson R.M., Kraychy S., Nicholson R.T. Mizuba S. The 1 P-hydroxylation of androstenedione, J.Org. Chem., 1962, V. 27, p.3159.

57. Dodson R.M., Nicholson R.T., Muir R.D. Microbiological transformations IV. The oxidation of dehydroisoandrosterone at C-l. J. Am. Chem. Society, 1959, V. 81, pp.6295-6297.

58. Donova M.V., Egorova O.V., Nikolayeva V.M. Steroid 17p-reduction by microorganisms -a review. Process Biochemistry, 2005, V. 40, pp. 2253-2262.

59. Doostzadeh J., Morfin R. Studies of the enzyme complex responsible for pregnenolone and dehydroepiandrosterone. Steroids, 1996, V.61, pp.613-620.

60. Doostzadeh J., Cotillon A.C., Benalycherif A., Morfin R. Inhibition studies of dehydroepiandrosterone 7a- and 7P-hydroxylation in mouse liver microsomes. Steroids, 1998, V.63, N.l 1, pp.608-614.

61. Dray F.J., Cotillon A.C. 7a-Hydroxylation of dehydroepiandrosterone and pregnenolone by bioconversion using Fusarium moniliforme. Fr. Patent 2771105, 1999.

62. Djurendic E.A., Sakac M.N., Zavis M.P., Gakovic A.R., Canadi J.J., Andric S.A. et al. Synthesis and biological evaluation of some new A,B-ring modified steroidal D-lactones. Steroids, 2008, V.73, pp.681-688.

63. El-Kadi I.A., Mostafa M.E. 2004 Hydroxylation of progesterone by some Trichoderma species. Folia Microbiol. (Praga), 2004, V.49, N.3, pp.285-290.

64. Eman Mostafa M., Zohri A.A. Progesterone side-chain degradation by some species of Aspergillus flavus group. Folia Microbiol. (Praga), 2000, V.45, N.3, pp. 243-247.

65. Farooq A., Hanson J.R., Igbal Z. Hydroxylation of progesterone by Cephalosporium aphidicola. Phytochemistry, 1994, V.37, pp.723-726.

66. Fernandes P., Cruz A., Angelova B., Pinheiro H.M., Cabral J.M.S. Microbial conversion of steroid compounds: recent developments. Enzyme Microb.Technol., 2003, V.32, pp.688-705.

67. Fried J., Thoma R.W. Synthesis of steroids of the 1-dehydrotestolactone series. US Patent2823171,1958.

68. Fried J., Thoma R.W., Klingsberg A. Oxidation of steroids by microorganisms. III. Side chain degradation, ring D-cleavage and dehydrogenation in ring A. J. Am.Chem. Society. 1953, V.75, N.22, pp.5764-5765.

69. Fukushima D.K. Biochemical studies on the 7ß-hydroxylation of steroids. J. Biol. Chem., 1964, V.239, N.6, pp.1748-1752.

70. Fujiwara A., Miyamoto C., Okuda T. Process for the manufacture of la-hydroxydehydroepiandrosterone. US Patent 4379842, 1983.

71. Galabova D., Tuleva B., Spasova D. Permeabilization of Yarrowia lipolytica cells by Triton X-100. Enzyme Microb. Technol., 1996, V.18, pp. 18-22.

72. Ghanem K.M., El-Aassar S.A. Yusef H.H. Transformation of Reichstein's compound S into prednisolone by immobilized mixed cultures. J. Chem.Tech. Biotechnol., 1992, V.54, pp.115121.

73. Goetschel R., Bar R. Formation of mixed crystals in microbial conversion of sterols and steroids. Enzyme Microb. Technol., 1992, V.14, pp.462-469.

74. Hampl R., Larcik O., Klak J., Kasal A., Novacek A., Sterzl I., Sterzl J., Starka L. 2000. 7-Hydroxydehydroepiandrosterone a natural antiglucocorticoid and a candidate for steroid replacement therapy? Physiological Research, 2000, V. 49, pp. 107-112.

75. Hampl R., Morfin R., Starka L. 7-Hydroxylated derivatives of dehydroepiandrosterone: what are they good for? Endocrine Regulations, 1997, V.31, pp.211-218.

76. Hanson J.R., Hunter A.C. The hydroxylation of steroidal ring D lactones by Cephalosporium aphidicola. Phytochemistry, 1998, V.49, N.8, pp.2349-2353.

77. Hanson J.R., Nasir H., Parvez A. The hydroxylation of testosterone and some relatives by Cephalosporium aphidicola. Phytochemistry, 1996, N. 2, pp.411-415.

78. Heaney R.P. Vitamin D: Role in the Calcium Economy, In: Feldman D., Pike J.W., Glorieux F.H., editors. Vitamin D (2), 978-0-12-252687-9; 2005, pp. 773-787.

79. Holland H.L. Organic synthesis with oxidative enzymes. Weinheim: Verlag Chemie; 1992., pp.241-254.

80. Hunter A.C., Carragher N.E. Flexibility of the endogenous progesterone lactonisation pathway in Aspergillus tamarii KITA: transformation of a series of cortical steroid analogues. J.Steroid Biochem. Mol. Biol., 2003, V.87, pp.301-308.

81. Huszcza E., Dmochowska-Gladysz J., Bartmanska A. Transformations of steroids by Beauveria bassiana. Z. Naturforsch., 2005, V.60, N.l-2, pp.103-108.

82. Itagaki E. Studies on steroid monooxygenase from Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011. Oxygenative lactonization of androstendione to testololactone. The Journal of Biochemistry (Tokyo). 1986, V.99, N.3, pp.825-832.

83. Jadoun J., Bar R. Microbial transformation in a cyclodextrin medium. Part.3. Cholesterol oxidation by Rhodococcus erytropolis. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, V.40, pp.230-240.

84. Jekkel A., Likoy E., Horvath G., Pallagi I., Suto J., Ambrus G. 1998. Microbial hydroxylation of 13p-ethyl-4-gonene-3,17-dione. J Mol Catal B: Enzym. V 5. pp. 385-387.

85. Jones E.R.H. The microbiological hydroxylation of steroids and related compounds. Pure Appl. Chem., 1973, V.33, pp.39-52.

86. Juhasz G., Tamm C. 7P-Hydroxylierung von digitoxigenin durch Aspergillus oryzae, Rhizopus arrhizus und Trichothecium roseum. Helv. Chim. Acta, 1961, Y.44, p.1063.

87. Kalimi M., Shafagoj Y., Loria R., Padgett D., Regelson W. Anti-glucocorticoid effects of dehydroepiandrosterone (DHEA). Mol. Cell. Biochem., 1994, V.131, pp.99-104.

88. Khomutov S.M., Sukhodolskaya G.V., Donova M.V. The inhibitory effect of cyclodextrin on the degradation of 9a-hydroxyandrost-4-ene-3,l 7-dione by Mycobacterium sp. YKM Ac-1817D. Biocatal. Biotransform. 2007, V.25, pp.386-392.

89. Kokate T.G., Svensson B.E., Rogawski M.A. Anticonvulsant activity of neurosteroids: correlation with gamma-aminobutyric acid evoked chloride current potentiation. J.Pharmacol. Exp. Ther., 1994, V.270, pp.1223-1239.

90. Kolek T. Biotransformation XLVII: transformation of 5-ene steroids in Fusarium culmorum culture. J. Steroid Biochem., 1999, V.71, pp.89-90.

91. Kolek T., Szpineter A., Swizdor A. Baeyer-Villiger oxidation of DHEA, pregnenolone, and androstenedione by Penicillium lilacinum AMI 11. Steroids, 2008, Y.73, pp.1441-1445.

92. Kolek T., Szpineter A., Swizdor A. Studies on Baeyer-Villiger oxidation of steroids:

93. DHEA and pregnenolone d-lactonization pathways in Pénicillium cammemberti AM83. Steroids, 2009, V.74, N.10-11, pp.859-862.

94. Krischenoski D., Kieslich K. Two novel microbial conversion products of progesterone derivatives. Steroids, 1993, V.58, pp.278-281.

95. Kumar R., Dahiya J.S., Singh D., Nigam P. Biotransformation of cholesterol using Lactobacillus bulgaricus in a glucose-controlled bioreactor. Bioresource Technol., 2001, V.78, pp.209-211.

96. Kutney J., Milanova R.K., Vassiliev C.D., Stefanov S.S., Nedelcheva N.V. Process for the microbial conversion of phytosterols to androstenedione and androstadiendione. WO Patent 9949075, 1999.

97. Lardy H. Treatment process for promoting weight loss employing a substituted À5-androstene. WO 9203925.1992.

98. Lardy H. Treatment of Alzheimer's disease and modulation of immune system with À5-androstenes. WO 94/03176-A1. 1994.

99. Laskin A.I., Fried J. Process for microbial hadroxylation of steroids contaning aromatic Arings. US 3115444. 1963.

100. Lee C.-Y., Chen C.-D., Liu W.H. Production of androsta-l,4-diene-3,17-dione from cholesterol using two step microbial transformation. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, V.38, pp.447-452.

101. Loria R.M. Antiglucocorticoid function of androstenetriol. Psychoneuroendocrinology. 1997, V.22, pp.103-108.

102. Madyastha K.M. Preparatively useful transformation of steroids and morphine alkaloids by Mucorpiriformis. Proc. Indian Acad.Sci. Chem Sci., 1994, V.106, pp.1203-1212.

103. Madyastha K.M., Joseph T. Transformation of dehydroepiandrosterone and pregnenolone by Mucorpirformis. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995, V.44, pp.339-343.

104. Mahato S.B., Baneqee S., Podder S. Steroid transformations by microorganisms-III. Phytochemistry, 1989, Y.28, pp7-40.

105. Mahato S.B., Garai S. 1997. Advances in microbial steroid biotransformation. Steroids, 1997, V.62, pp.332-345.

106. Maksay G., Laube B., Betz H., Subunit-specific modulation of glycine receptors by neurosteroids. Neuropharmacology, 2001, V.41, pp.369-376.

107. Manosroi J., Abe M., Manosroi A. Biotransformation of steroidal drugs usingmicroorganisms screened from various sites in Chiang Mai, Thailand. Bioresource Technol., 1999, V.69, pp. 67-73.

108. Martin C., Bean R., Rose K., Habib F., Seckl J. Cyp7bl catalyses the 7a-hydroxylation of dehydroepiandrosterone and 25-hydroxycholesterol in rat prostate. Biochem. J., 2001, V.355, pp.509-515.

109. McCurdy J.T., Garrett R.D. Microbiological transformation of steroids. I. The synthesis of 19-nortestololactone. J. Org. Chem., 1968, V.33, N.2, pp.660-661.

110. Mellon S.H., Griffin L.D. Neurosteroids: biochemistry and clinical significance. Trends Endocrinol. Metab., 2002, V.13, pp.35-43.

111. Meystre C., Vischer E., Wettstein A. Mikrobiologische hydroxylierung von cortexon in der 7alpha-, 15alpha- oder 15beta-stellung. Helv.Chim.Acta, 1955, V.38, p.381.

112. Mineki S., Iida M., Kato K., Fukaya F., Kita K., Nakamura J. et al. Microbial production of hydroxy-Cig-steroids as estrogen synthetase (P-450 aromatase) inhibitors. J. Ferment Bioeng., 1995, V.80, pp.223-228.

113. Morfin R., Courchay G. Pregnenolone and dehydroepiandrosterone as precursors of active 7-hydroxylated metabolites which increase the immune response in mice. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1994, V. 50, pp.91-100.

114. Murray H.C., Peterson D.H. Oxygenation of steroids by Mucorales fungi. U.S. Patent 2602769,1952.

115. Nozaki Y. Influence of pH on the bioconversions of cardiac aglycones by Rhizopus arrhizus and Mucorparasiticus. Agr. Biol.Chem. (Japan), 1961, V.25, p.559.

116. Nozaki Y., Masuo E., Satoh D. Acceleration of microbial hydroxylations of digitoxigenin by the addition of C2i-delta4-3-keto steroids. Agr. Biol.Chem. (Japan), 1962, V.26, p.399.

117. Okabe M., Sun R.-C., Scalone M., Jubilian C.H., Hutchings S.D. Synthesis of 25-hydroxycholecalcifer-16-en-23-ynol: a potential antipsoriatic agent. J. Org. Chem. 1995, V.60, pp.767-71.

118. Okada M, Saito Y. 1965. Microbiological formation of 3p,7a,15a-trihydroxyandrost-5-en-17-one. Steroids, 1965, V.6, pp.651-657.

119. Okada M., Yamada A., Ishidate M. 1965. Microbiological transformation of dehydroepiandrosterone, progesterone, deoxycorticosterone, and testosterone by Gibberella saubinetti. Chemical Abstracts, 1966, V.64, N.l, p. 1061.

120. Okamura A., Matsui H. Bile acid converting microorganism and process for preparing bileacid. US 5989855,1999.

121. Pelissier M.A., Trap C., Malewiak M.I., Morfin R. Antioxidant effects of dehydroepiandrosterone and 7a-hydroxydehydroepiandrosterone in the rat colon, intestine and liver. Steroids, 2004, V.69, pp. 137-144.

122. Petzold K., Wiechert R., Laurent H., Nickisch K., Bittier D. Process for preparing 3ß,7ß-dihydroxy-A5-steroids. US Patent 4416985, 1983.

123. Petzold K., Laurent H., Wiechert R. 3ß,7ß,15a-Trihydroxy-5-androstene-17-one, its 3,15-dipivalate, and their preparation. US Patent 4435327, 1984.

124. Plourde R., El-Tayeb O.M., Hafez-Zedan H. Reduction of the 20-carbonyl group of C-21 steroids by spores of Fusarium solani and other microorganisms. Appl. Microbiol., 1972, Y.23, N.3, pp.601-612.

125. Prairie R.L., Talalay P. Enzymatic formation of testololactone. Biochemistry, 1963, V.2, N.l, pp. 203-208.

126. Rappoldt M.P., Pauli L.F., Hoogendoorn J. Method of preparing A5'7-steroids. US Patent 4464298, 1984.

127. Reinfold V. The mechanisms of vitamin D toxicity. Bone Miner, 1990, V.ll, pp. 267-72.

128. Röbel P., Baulieu E.-E. Dehydroepiandrosterone (DHEA) is a neuroactive neurosteroid. Ann N.Y. Acad. Sei., 1995, V.82-110.

129. Romano A., Romano D., Ragg E., Costantino F., Lenna R., Gandolfi R., Molinari F. 2006. Steroid hydroxylations with Botryodiplodia malorum and Colletotrichum lini. Steroids, 2006, V.71, pp.429-434.

130. Rose K.A., Seckl J.R., Yau J.L.W., Best R., Lathe R., Leckie C.M. Use of 7a-substituted steroid to treat neuroppsychiatric, immune or endocrine disorders. US Patent 6420353, 2002.

131. Rupprecht R., Holsboer F. Neuroactive steroids: mechanisms of action and neuropsychopharmacological perspectives. Trends Neurosci., 1999, V.22, N.9 pp.410-416.

132. Rumijowska A., Lisowska K., Ziolkowski A., Sedlaczek L. Transformation of steroils by Mycobacterium vaccae: effects of lecithin on the permeability of cell envelopes to sterols. World J. Microbiol.Biotechnol., 1997, V.13., pp. 89-95.

133. Sato Y., Hayakawa S. Microbiological hydroxylation of steroidal alkaloids. J.Org. Chem., 1961, V. 26, p.4181.

134. Sawada H., Watanuki M. Method for producing conjugated ursodeoxycholic acids by means of microbial transformation. US Patent 4604353, 1986.

135. Sawada H., Kulprecha S., Nilubol N., Yoshida T., Kinoshita S., Taguchi H. Microbial production of ursodeoxycholic acid from lithocholic acid by Fusarium equiseti M41. Appl.Environ. Microbiol., 1982, V. 44, pp. 1249-1252.

136. Schlosser D., Irrgang S., Schmauder H.-P. Steroid hydroxylation with free and immobilized cells of Pénicillium raistrickii in the presence of P-cyclodextrin. Appl. Microbiol.Biotechnol., 1993, V.39, pp.16-20.

137. Schneider J.J., Lewbart M.L. Chapter 7. Fractionation and isolation of steroids conjugates. Recent Progress in Hormone Research, 1959, V.15, New York-London, Academic Press. Edited by Pincus G., pp.201-225.

138. Sebek O.K., Reineke L.M., Peterson D.H. Intermediates in the metabolism of steroids by Pénicillium lilacinum. J. Bacterid., 1962, V.83, pp.1327-1331.

139. Shuytema E.C., Hargie M.P., Siehr D.J., Merits I., Schenck J.R., Smith M.S., Varner E.L. Transformations of progesterone by Basidiomycetes. Appl. Microbiol., 1963, V.ll, N.3, pp.256259.

140. Singh M., Sharma R., Baneijee U.C. Biotechnological applications of cyclodexrins. Biotechnology Advances. 2002, V. 20, pp.341-359.

141. Slijkhuis H., Marx A.F. Preparation of 9a-hydroxy-17-keto steroids using Mycobacterium species CBS 482 86. US Patent 5298398,1994.

142. Smith M., Zahley J., Pheifer D., Goff D. Growth and cholesterol oxidation by Mycobacterium species in Tween 80 medium. Appl. Environ.Microbiol. 1993, V.59, pp. 14251429.

143. Sonova M.V., Dovbnya D.V. Kalinichenko A.N., Arinbasarova A.Yu., Vagabova L.M., Morozova Z.V. et al. A method of obtaining 9a-hydroxy-4-en-3,17-dione. Ru Patent 2077590, 1997.

144. Spassov G., Pramatarova V., Wandrey C. Conversion of corticosteroid hormones by immobilized cells of Flavobacterium dehydrogenans, Curvularia lunata and Arthrobacter simplex on ceramic carriers. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996, V.46, pp. 481-488.

145. Srivastava A., Patil S. Investigation of some physico-chemical parameters involved in thebiotransformation of cholesterol to 17-ketosteroids by Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153. J. Microbiol. Biotechnol., 1994, Y.9, pp.101-112.

146. Sukhodolskaya G.V., Nikolaeva V.M., Donova M.V., Gulevskaya S.A., Baskunov B.P., Koshcheynko K.A., Turchin K.F. Conversion of 1-benzoylindole by Aspergillus strains. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, V.53, pp.695-700.

147. Sulcova J., Starka L. Characterisation of microsomal dehydroepiandrosterone 7-hydroxylase from rat liver. Steroids, 1968, V.12, Issue 1, pp.113-126.

148. Sulcova J., Starka L. 7a-Hydroxylation of dehydroepiandrosterone in human testis and epididymis in vitro. Experientia, 1972, V. 28, pp.1361-1362.

149. Suzuki K., Sanga K.I., Chikaoka Y., Itagaki E. Purification and properties of cytochrome P-450 (P-450iun) catalysing steroid lip-hydroxylation in Curvularia lunata. Biochim. Biophys. Acta, 1993, V. 1203, pp. 215-223.

150. Szejtli J. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed. Duchene D. Editions de Sante. France, 1991, 625 p.

151. Takeda K., Terasawa T., Dobashi K., Yoshioka T. 25-Hydroxylation of steroid(s). WO Patent 9749829, 1997.

152. Terada M., Horie Y., Komiyama M., Minami J., Abe N., Sato M. Preparation of ursodeoxycholic acid by edible basidiomycetes. Japanese Patent 60172296, 1985.

153. Thoa H.K., Sasek V., Budesinsky M., Jablonsky I., Eignerova L., Chan N.G., Prochazka Z. 1978. Biological transformation of 3P-hydroxy-5-androsten-17-one with mushroom Pleurotus ostreatus. Coll. Czech. Chem. Commun., 1978, V. 43, pp.336-343.

154. Tong W.-Y., Dong X. Microbial biotransformation: recent developments on steroid drugs. Recent Patents on Biotechnol., 2009, V. 3, P. 141-153.

155. Vasudevan P.T., Zhou T. Enzymatic assay of cholesterol by reaction rate measurements.

156. Biotechnol. Bioeng., 1997, V.53, pp.391-396.

157. Vitas M., Rozman D., Komel R., Kelly S. 1995. P450 mediated progesterone hydroxylation in Cochliobolus lunatus. J. Biotechnol., 1995, V.42, pp.145-150.

158. Wang J., Chen C., Li B., Zhang J., Yu Y. Production of hydrocortisone from cortexolone-21-acetate by immobilized Absidia orchidis in co-solvent containing media. Enzyme Microb. Technol., 1998. V.22, pp.368-373.

159. Weaver E.A., Mount S. Method of increasing microbial activities. US Patent 3019170, 1962.

160. Weintraub A., Eppstein S.H., Meister P.D. Process for the 1,2-dehydrogenation of a steroid with Septomyxa. US Patent 2902410, 1959.

161. Weiss-Berg E., Tamm C. Hydroxylierung und dehydrierung durch Psilocybe semperviva und Ps. mexicana. Helv. Chim. Acta, 1963, V. 46, p.2435.

162. Wilson M.R., Gallimore W.A., Reese P.B. Steroid transformations with Fusarium oxysporum var. cubense and Colletotrichum musae. Steroids, 1999, V.64, pp.834-843.

163. White M.J., Gilbert I.G. A microbiological process to prepare 5-androsten-3ß,7a,15a-triol-17-one and related analogues. WO 2004/070048 Al, 2004.

164. White M.J., Wuts P.G.M., Beck D. 5-Androsten-3ß-ol steroid intermediates and processes for their preparation. US Patent 7002028,2006.

165. Wohlgemuth R. Interfacing biocatalysis and organic synthesis. J. Chem. Technol. Biotechnol., 2007, V. 82, pp. 1055-1062.

166. Wülfert E., Pringle A.K., Sundstrom L.E. Neuroprotective 7ß-hydroxysteroids. WO 02/00224 Al, 2002.

167. Xionga Z., Weib Qi., Chena H., Chenb Sh., Xua W. Microbial transformation of androst-4-ene-3,17-dion by Beauveria bassiana. Steroids, 2006, V.71, pp.979-983.

168. Zakelj-Mavric M., Plemenitas A., Komel R., Belie I. 11 ß-Hydroxylation of steroids by Cochliobolus lunatus. J Steroid Biochem., 1990, V.35, N.5, pp. 627-629.

169. Znidarsic P., Komel R., Pavko A. Studies of a pelleted growth form of Rhizopus nigricanse as a biocatalyst for progesterone 1 la-hydroxylation. J. Biotechnol., 1998, V.60, pp.207-216.

Информация о работе
  • Лобастова, Татьяна Геннадьевна
  • кандидата биологических наук
  • Пущино, 2010
  • ВАК 03.01.06
Диссертация
Регио- и стереоспецифическое гидроксилирование дегидроэпиандростерона в положении 7 мицелиальными грибами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Регио- и стереоспецифическое гидроксилирование дегидроэпиандростерона в положении 7 мицелиальными грибами - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы