Применение полимеров в микробиологических трансформациях стероидов

Дружинина, Анна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Применение полимеров в микробиологических трансформациях стероидов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Применение полимеров в микробиологических трансформациях стероидов"

004613ИУУ /

ДРУЖИНИНА АННА ВИКТОРОВНА

Применение полимеров в микробиологических трансформациях

стероидов

03.01.06 «Биотехнология (в том числе бионаиотехнологии)»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Москва-2010

004613899

Работа выполнена в Центре «Биоинженерия» Российской Академии Наук

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Наталия Евгеньевна Войшвилло кандидат химических наук Валентина Александровна Андрюшина

доктор биологических наук Ирина Павловна Смирнова доктор химических наук Игорь Викторович Заварзин

Ведущая организация:

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Защита диссертации состоится « г. в/->7^часов на заседании

диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, биологический факультет, ауд. М-1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « %у> Цдл-гГКз 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

'Ф

Пискункова Н.Ф.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

противоастматических, диуретических, анаболических, противораковых, гормональных, контрацептивных и других лекарственных средств.

Известно использование стероидных препаратов при лечении свыше 100 распространенных заболеваний. Роль этой группы лекарственных препаратов, спасших не одну человеческую жизнь, трудно переоценить, поэтому многие из них входят в список жизненно необходимых. Потребность в стероидных гормональных препаратах в мире с каждым годом возрастает в связи с ухудшением экологии и соответственно значительным ростом аллергических, онкологических и других заболеваний.

В России в конце 80-х - начале 90-х годов выпускалось порядка 20 субстанций стероидных гормонов в объеме ~ 4-5 тонн. Объем производства кортикостероидов, включавший 7 наименований, составлял ~ 1,5 тонны.

За последние 15 лет состояние дел в этой области в России резко ухудшилось. Производство стероидных субстанций практически прекращено, а заводы переориентированы на выпуск готовой лекарственной формы из импортных субстанций, что привело к зависимости России от поставок из-за рубежа и недоступности для потребителей жизненно необходимых препаратов из-за их дороговизны. Поэтому разработка синтеза стероидных препаратов из доступного отечественного сырья и отработка отдельных технологических стадий синтеза с учетом новейших достижений биотехнологии является чрезвычайно актуальной задачей. Следует отметить, что химический синтез стероидов вследствие сложности строения стероидной молекулы и ее полифункционалыюсти многостадиен и очень сложен. Поэтому важная роль в синтезе стероидов, особенно в промышленном масштабе, отводится микробиологической трансформации, имеющей значительные преимущества в виде высокой селективности (при наличии соответствующих штаммов), сокращению количества стадий синтеза, простоты аппаратурного оформления, отсутствия необходимости в дорогих реактивах и экологической чистоты микробиологических методов. Более того, такая трансформация стероидов как гидроксилирование практически выполнима только с помощью микробных катализаторов.

Однако, несмотря на все достоинства ферментативных процессов, их использование затрудняет чрезвычайно низкая растворимость стероидных субстратов в водных средах, что особенно существенно при масштабировании процессов. Проблема решения высокой нагрузки стероидного субстрата является чрезвычайно актуальной и наиболее сложной при решении вопросов синтеза стероидов в промышленном масштабе.

Для повышения растворимости и доступности для микробной клетки практически нерастворимых в воде стероидных субстратов используют ряд приемов: механическое измельчение кристаллов до микрочастиц, применение смешивающихся и не смешивающихся с водой органических растворителей, использование природных полимеров, таких как циклодекстрины, хитин или хитозан, или синтетических полимеров класса М-виниламида, например поливинилпирролидона (ПВП) и поливинилкапролактама (ПВК). Тем не менее, ни один из приведенных способов не является универсальным. Среди указанных выше методов наиболее перспективным является применение полимеров.

Поэтому представлялось актуальным проведение исследований по поиску среди синтетических и природных полимеров универсального солюбилизатора, эффективного для трансформаций стероидных соединений различной структуры, а также исследование его влияния на стероид трансформирующую активность как бактерий, так и грибов, и изучение условий проведения в его присутствии наиболее часто используемых в синтезе стероидов трансформаций, таких как 1,2-дегидрирование и гидроксилирование в различные положения стероидной молекулы.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось исследование в области повышения эффективности практически значимых микробиологических трансформаций стероидов, таких как 1,2-дегидрирование и направленное гидроксилирование путем применения в реакциях синтетических и природных полимеров.

В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

• Определить зависимость солюбилизирующей активности полимеров от их химического строения и молекулярной массы, а также структуры трансформируемых стероидов.

• Определить оптимальную концентрацию полимеров, наиболее эффективных в процессах 1,2-дегидрирования бактериями и гидроксилирования грибами.

• Исследовать факторы регуляции процесса 1,2-дегидрирования в присутствии наиболее эффективного солюбилизатора. и определить оптимальные условия, обеспечивающие максимальный выход целевого продукта.

• Провести в присутствии лучшего полимера направленное гидроксилирование Л4-3-кето- и Д5-Зр-гидроксистероидов ряда андростана и прегнана грибами с различной гидроксилазной активностью с целью выхода на новые биологически активные соединения.

Научная новизна работы.

Изучена зависимость способности к солюбилизации стероидов у 16 полимеров класса Ы-виниламидов и циклодекстринов от величины молекулярной массы, концентрации полимера, его химической структуры. В числе исследуемых полимеров 11 соединений ранее не применялись в трансформациях стероидов, осуществляемых с помощью бактерий, и 16 соединений - для трансформаций, осуществляемых грибами.

Впервые для стероидных трансформаций, осуществляемых грибными культурами, применены полимеры класса N-виниламидов и химически модифицированные циклодекстрины (ХМД).

Показано, что метилированный (randomly) Р-циклодекстрин (МЦД) эффективен как солюбилизатор в процессах трансформации стероидных соединений различной структуры, осуществляемых как бактериями, так и грибами.

Впервые показана возможность увеличения нагрузки исследуемых стероидных субстратов в реакциях гидроксилирования грибами от 0.5-2 до 1020 г/л в присутствии МЦД.

Впервые показана возможность повторного использования МЦД (не менее 3 раз) без его регенерации в процессах трансформации стероидов, осуществляемых как бактериями, так и грибами.

Впервые показано наличие 7а-гидроксилазной активности у гриба Curvularia lunata в отношении Д5-Зр-гидроксистероидов.

Методом лабораторной селекции при непосредственном участии автора получен новый штамм С. lunata, отличающийся высокой 7а-гидроксилазной активностью в отношении стероидных Д5-олефиноп. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-981.

Разработан способ направленного 7а-гидроксилирования Д5-Зр-гидрокси-стероидов с помощью нового штамма С. lunata ВКПМ F-981. На способ 7а-гидроксилирования получен патент РФ № 2 377 309 (Бюлл. Изобр. №36 от 27.12.2009). Изобретение включено отделом экономики и статистики промышленной собственности ФИПС в базу «Перспективные изобретения».

С помощью нового штамма С. lunata получено 17 гидроксипроизводных Д4-3-ксто- и Д5-Зр-гидроксистероидов ряда андростапа и прегнана, среди которых 4 новых соединения.

Практическая значимость работы.

Проведена оптимизация процесса трансформации 17а-метщггестостероиа (МТС) с использованием штамма Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632 с высокой 1,2-дегидрогеназной активностью. На основании разработанной технологии предложен эффективный одностадийный метод 1,2-дегидрирования Д4-3-кстостероидов при повышенной нагрузке субстрата (до 20 г/л) в водном растворе МЦД. 1,2-Дегидроаналоги, находящие широкое применение в медицине и ветеринарии получены практически с количественным выходом. Метод соответствует лабораторно-техническому уровню согласно испытаниям, проведённым в аппаратном зале Центра «Биоинженерия» РАН, на основании которых составлен акт о наработке 125 г. метандростенолоиа (МЕТА).

Разработан способ направленного 7а-гидроксилирования стероидов с помощью нового штамма С. lunata ВКПМ F-981, открывающего возможности получения новых биологически активных соединений с иммуностимулирующей, противораковой, радиопротекторной и антихолестеринемической активностью.

Использование Р-циклодекстрина (ЦЦ) и его химически-модифицированных производных - МЦД и гидроксипропил-ЦД (ГПЦД) в

процессе направленного 7а-гидроксилирования позволили не только увеличить нагрузку субстратов с 2 до 10 г/л, но и скорость реакции почти в 2 раза и поднять выход 7а-гидроксистерокдов с 15до 95%.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на VI Международном Форуме «Биотехнология и современность» (2005, Санкт-Петербург), VII Международном форуме «Биотехнология и современность» (2006, Санкт-Петербург), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (2007, Пущино), XX зимней международной молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва), XXVIII Российской Школе «Наука и технология» (2008, Миасс).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 2 патента РФ, 1 сообщение и 5 тезисов.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, приложения. Работа содержит 115 страниц машинописного текста, 13 таблиц, 34 рисунка. Библиография включает 153 наименований, из них 123 иностранные работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы, использованные в работе. В работе использовали штаммы бактерий и плесневых грибов ВКПМ Pimelobacter simplex Ac-1632, Rhodococcus erythropolis Ac-1740, Curvularia lunata F-981, а также Corynebacterium simplex, Alternaría altérnala, Beauveria sp., Bipolaris sorakiniana, Fusarium sp., Rhizopus nigricans из рабочей коллекции лаборатории «Биотехнология стероидов» Центра «Биоинженерия» РАН.

Изучаемые микроорганизмы хранили при 4°С, бактерии - на скошенном кукурузно-глюкозном агаре, грибы - на средах, описанных в литературе. Процессы выращивания биомассы и трансформации стероидов проводили при 28°С на круговой качалке при скорости перемешивания 220 об/мин. Культуры выращивали в конических колбах 750 мл со 100 мл среды. Через 6-8 ч роста бактерий P. simplex а среду добавляли ацетат кортизона. Через сутки культивирования клетки бактерии отделяли центрифугированием при 3000 g, 4°С и дважды отмывали охлажденным стерильным физиологическим раствором. Полученную биомассу распределяли равными порциями в пробирки и замораживали при 20°С.

Трансформации стероидов бактериями в неростовых условиях проводили отмытыми от среды клетками в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих деминерализованную воду, если не сказано иначе. Стероидный субстрат в количестве 5 г/л вносили в виде раствора в метиловом спирте в комплексе с 2% СаС12 и солюбилизировали с помощью ЦД, ХМЦ, ПВК,

поливиншширролидона (ПВП), полиэтиленоксидов (ПЭО), поливиниловых спиртов (ПВС). Биоконверсию стероидов в ростовых условиях осуществляли на кукурузно-глюкозной среде, содержащей стероид и МЦЦ в мольном соотношении 1:1. Стероидный субстрат вносили в среду в диметилформамиде (ДМФА), количество которого в среде не превышало 2%.

Трансформацию стероидов грибными культурами в ростовых условиях проводили в конических колбах объемом 750 мл в 100 мл среды. Биоконверсию с помощью мицелия, отделенного от питательной среды, осуществляли в фосфатном буфере, рН 6.0-6.3 в тех же условиях. В трансформационную среду стероид вносили следующими способами: как суспензию микрочастиц размером до 5-15 мкм; в виде комплексов с МЦЦ, с ПВК или ПВП; в растворе ДМФА.

Анализ продуктов трансформации осуществляли с помощью методов ТСХ, ВЭЖХ, ПМР. Для ТСХ использовали пластинки Silufol UV 254 (Чехословакия) и Sorbifil (Россия). Аликвоты культуральной жидкости (1-2 мл) отбирали с интервалом, определяемом целями эксперимента. Экстракцию стероидов осуществляли 5-кратным объемом этилового эфира уксусной кислоты. Разделение стероидных соединений проводили в системах растворителей: хлороформ/метанол (8:1) для продуктов 1,2-дегидрирования и ацетон/хлороформ (7:3) для продуктов гидроксилирования. Визуальную оценку продуктов биоконверсии проводили на хроматоскопе. Для оценки содержания 5-олефинов, хроматографические пластинки проявляли 1%-ным раствором ванилина в 10%-ной хлорной кислоте с последующим нагреванием до появления окрашенных пятен.

Содержание Д4-3-кетостероидов в среде определяли с помощью ВЭЖХ. Содержание Д5-3-гидроксистероидов - с помощью ПМР. Выход гидроксипродуктов определяли соотношением выделенного кристаллического продукта в % от теоретического количества.

Для ВЭЖХ использовали колонки «Нуклеосил Си» 250 х 4.6 мм. Подвижная фаза — смесь 70% метанола с 30% воды, подкисленной концентрированной ортофосфорной кислотой (1 мл кислоты на 1 л воды). Скорость подвижной фазы -1.2 мл/мии.

Спектры ПМР снимали на ПМР-спектрометре XL-400 («Varian»CIlIA) в CDC13 или в смеси CDCI3 и D-DMSO.

Все эксперименты проведены три раза в трех повторностях. Результаты представлены усредненными значениями. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью Exel (MS Office 2007).

2.2 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.2.1.1,2-Дегидрирование стероидных субстратов.

При сравнении способности бактерий С. simplex, R. erythropolis и Р. simplex вводить 1,2-двойную связь в 17а-метилтестостерон (МТС) было установлено, что штамм P. simplex проявил максимальную 1,2-дегидрирующую активность в отношении МТС. При нагрузке МТС 1 г/л до 80% субстрата штамм превращал его в целевой продукт — МЕТА, токсичный для бактерий в концентрации выше 1 г/л. С целью повышения концентрации стероидов,

нерастворимых в водных средах, и увеличения их доступности для бактериальной клетки, изучали интенсивность процесса 1,2-дегидрирования МТС с помощью P. simplex в присутствии полимеров синтетического и природного происхождения.

2.2.1.1. 1,2-дегидрирование МТС в присутствии ПВК. Согласно данным табл. 1, стероид трансформирующая активность бактерии и конверсия МТС при нагрузке 4 г/л в присутствии низкомолекулярных ПВК были минимальными. Небольшой положительный эффект имел место при использовании высоко молекулярных ПВК (мол. масса не менее 500 кДа). Однако стероид трансформирующая активность клеток по отношению к МТС при этом была лишь сравнима с контролем (без солюбилизатора).

Таблица 1. 1,2-дегидрогеназная активность P. simplex по отношению к МТС,

солюбилизированному с помощью ПВК

М.м. полимера, кДа Концентрация полимера, % Активность клеток, мкмоль/мин/мг Кл Конверсия МТС*, %

3 5.0 0.2 9-10

15 5.0 0.5 30-35

500 1.0 4.5 55-60

-«- 4.0 5.1 65-68

-«- 6.0 6.5 70-75

-«- 10.0 8.2 80-88

900 тыс. 0.6 4.1 40-42

-«- 1.0 4.8 40-45

-«- 2.5 4.9 52-56

-«- 4.0 5.3 58-60

-«- 6.0 6.1 70-74

-«- 10.0 7.8 90-92

контроль - 5.6-5.9 80-82

* - Продолжительность трансформации 70 ч., биомасса 1.2 г/л

До 70% МЕТА образовывалось при использовании ПВК с молек. массой 2000 кДа, но при концентрации полимера не выше 1.5% (рис. 1). Следует заметить, что и в контроле и в большинстве опытов с ПВК, конверсия МТС была высокой 80-90% (табл. 1), но во всех вариантах 1,2-дегидрирование сопровождалось деструкцией образующегося МЕТА при увеличении времени трансформации.

2.2.1.2. Трансформация МТС с помощью ПВС.

Из данных табл. 2 следует, что добавление в реакционную среду гидрофильных ПВС существенно уменьшает стероид трансформирующую активность клеток.

Таблица 2. 1,2-Дегидрогеназная активность P. simplex по отношению к МТС, солюбилизированному с помощью ПВС___

М.м. полимера, кДа Концентрация полимера, % Активность клеток мкмоль/мин/мг Кл Конверсия МТС, 72ч, %

10 0.5 4.2 65

-«- 1.0 2.1 55

-«- 3.0 2.5 50

4.0 2.5 45

6.0 2.1 40

53 5.0 1.5 28

контроль - 5.2 85

Скорость конверсии МТС уменьшалась при увеличении как содержания ПВС, так и молекулярной массы полимера. Низкая скорость трансформации МТС в присутствии ПВС 53 кДа сохранялась также при увеличении плотности биомассы в 2 раза, при этом выход МЕТА составил не более 30%.

2.2.1.3.1,2-дегидрирование МТС в присутствии ПВП.

ПВП были активными солюбилизаторами МЕТА. Стероид трансформирующая активность клеток была выше контрольного значения при использовании как низкомолекулярных ПВП, так и ПВП с молекулярной массой 500 кДа в концентрации 0.5-5.0% при плотности биомассы 1.5 г/л (табл. 3).

При солюбилизации МТС с помощью ПВП 500 кДа (в концентрации 3.5%) и увеличении плотности биомассы до 4 г/л содержание МЕТА достигало 70% за 8 ч трансформации (рис. 2). При более высоком содержании полимера в среде (10%) резко ухудшался режим аэрации и выход МЕТА составлял не более 20%. ПВП с молекулярной массой 2000 кДа был применим только в количестве не более 1.5%. Деструкция продукта в присутствии ПВП также имела место, но она протекала менее интенсивно, чем при солюбилизации МТС с помощью ПВК (рис. 2).

Таблица 3. 1,2-Дегидрогеназная активность P. simplex по отношению к МТС,

солюбилизированному с помощью ПВП (плотность биомассы 1.5 г/л)

М.м. полимера, кДа Концентрация полимера, % Активность клеток мкмоль/мин/мг Кл Конверсия МТС, % Время, ч

-«- 0.5 6.8 80-85 72

-«- 1.0 6.9 80-82 72

-«- 2.0 7.2 85-90 72

-«- 4.0 7.1 85-95 72

-«- 5.0 6.9 80-90 48

500

-«- 0.5 6.5 80-85 50

-«- 4.0 9.2 90-96 48

-«- 5.0 7.8 70 72

контроль - 5.1 80-85 72

Время, ч

Рис. 2. Накопление МЕТА в зависимости от концентрации (в %) ПВП (М.м.= 500 кДа), нагрузка МТС 4 г/л, нлотность биомассы 4 г/л.

2.2.1.4. Трансформация МТС в присутствии ПЭО.

Для солюбилизации 5 г/л МТС использовали ПЭО с молекулярной массой 20 кДа и 200 кДа, взятые в весовом соотношении МТС/ПЭО 1:5. При солюбилизации МТС с помощью ПЭО с М.м. 200 кДа отмечалась деструкция стероидов, а выход МЕТА составил не более 30% (в контроле - 10-20%). Однако, при использовании ПЭО с М.м. 20 кДа деструкции стероидов не наблюдалось, а содержание МЕТА составляло 50%.

2.2.1.5. Трансформация МТС в присутствии химически модифицированных циклодекстринов

С целью активизации процесса 1,2-дегидрирования было предпринято изучение биоконверсии МТС в присутствии ЦД (контроль), МЦЦ, ГПЦД и гидроксиэтил-ЦД (ГЭЦД). Содержание МТС в реакционной смеси составляло 5 г/л, мольное соотношение стероид/ЦЦ -1:1. Плотность биомассы - 4 г/л.

Рис. 3. Накопление МЕТА в зависимости от модификации ЦД

Р-ЦД-

-мцц -

-гпц д -

-гэцд

Как видно из рис. 3, в случае использования ХМЦ полное превращение МТС в МЕТА происходило в течение 1.5-2.5 ч, тогда как при солюбилизации МТС с помощью ЦД образовывалось не более 40% МЕТА. При этом не происходило восстановление 1,2-двойной связи и не наблюдалась деструкция стероидов. Этим ХМЦ, используемые в качестве солюбилизаторов МТС, существенно отличались от исследованных ранее синтетических полимеров -ПВК и ПВП, при которых, во-первых, минимальное время трансформации 4 г/л МТС в МЕТА было не менее 8 ч и, во-вторых, при достижении определенного количества МЕТА начиналась деструкция продукта реакции.

Максимальная скорость накопления МТС наблюдалась при использовании ГПЦД. Однако для дальнейших исследований был выбран МЦД, как достаточно эффективный и более экономичный солюбилизатор.

2.2.1.5.1 Оптимизация 1,2-дегидрирования МТС штаммом P. simplex в присутствии МЦД.

Влияние индуктора на 1,2-дегидрогеназпую активность отмытых клеток P. simplex. Как видно из рис. 4, время, необходимое для полной трансформации 5 г/л МТС в МЕТА было существенно меньше в случае использования индуктора (ацетат кортизона).

1 2 3 4 5 6 ■»— без индуктора -•— с индуктором

Рис. 4. Влияние индуктора на процесс 1,2-дегидрирования МТС.

Полученные данные говорят о присутствии небольших количеств конститутивного фермента в клетках P. simplex. Внесение в растущую культуру P. simplex ацетата кортизона резко увеличивало активность 3-КСД.

Трансформация МТС растущими и отмытыми клетками P. simplex. Как видно из рис. 5, биоконверсия МТС в МЕТА в присутствии МЦД отмытыми клетками (нагрузка 5 г/л) была более эффективна, чем растущей культурой (нагрузка 2 г/л). При этом на 16 час трансформации наблюдалась полная

конверсия МТС в МЕТА в то время как при трансформации растущей культурой содержание МЕТА составляло 60% при остаточном МТС- 30%.

Через 24 ч в культуральной жидкости обнаруживается лишь 30% МЕТА, что связано с разрушением стероидного субстрата и использованием клетками в качестве источника углерода как стероидов, так, возможно, и самого МЦД.

Рис. 5. Трансформация МТС в МЕТА растущей культурой и отмытыми клетками Р. simplex

£3 растущая культура № отмытые клетки

время, ч 16 24

Влияние количества биомассы P. simplex на скорость 1.2-дегидрирования МТС. При использовании биомассы в количестве 2-8 г/л полная конверсия 5 г/л МТС проходила за 1.5-3.5 ч. Продолжительность конверсии МТС с помощью биомассы в количестве 1.0 г/л возрастала до 6.5 ч, причем полного его превращения в МЕТА не происходило (рис. 6).

Рис. 6. Влияние количества биомассы (г/л) отмытых от среды клеток 4 P. simplex на образование МЕТА при

трансформации МТС: 1 -биомасса 8 г/л,

2 - биомасса 4 г/л,

3 -биомасса 2 г/л,

4 - биомасса 1 г/л (сухой вес).

Влияние состава трансформационной среды . Как видно из рис. 7, величина ионной силы используемого раствора имеет существенное значение. Начальная скорость трансформации МТС, растворенного в воде, была несколько выше по сравнению со скоростью превращения МТС в солевых растворах. В свою очередь, начальная скорость трансформации МТС в растворе с меньшим содержанием солей - 7 г/л (физиологический раствор) была выше, чем в фосфатном буфере (11 г/л).

время, ч

время,ч

- вода дистиллированная ■ вода деминерализованная

- фосфатный буфер рН 7.0 —и— физиологический раствор

Рис. 7. Влияние состава трансформационной среды на конверсию 5 г/л МТС в МЕТА.

Влияние рН на скорость 1.2-дегидрироваиия МТС. Клетки P. simplex проявляли активность 3-КСД в широком интервале рН (5-8.5) (габл. 4). В кислой среде (рН 5.2) скорость процесса снижалась относительно нейтральных значений рН, время полной трансформации составило 4.5 ч и 2.5 ч соответственно. Скорость трансформации МТС незначительно снижалась при щелочном значении рН, при этом время, необходимое для полного превращения субстрата, составило 3 ч.

Таблица 4. Влияние рН буферной среды на стероид трансформирующую

РН буферной среды Время полной конверсии МТС в МЕТА, ч Активность отмытых клеток, нмоль/мин х мг

5.2 4.5 15.7

7.0 3.0 23.6

8.5 3.5 20.2

Влияние количества растворителя на конверсию МТС в МЕТА. Как видно из рис. 8, с увеличением концентрации вносимого растворителя, наблюдалось снижение скорости процесса. Так, если при концентрации метилового спирта 5% время полной конверсии МТС составило 3.5 ч, то при 7% увеличилось до 4.5 ч. При увеличении содержания в среде метанола до 10% полная конверсия МТС в МЕТА не была достигнута в течение 7 часов инкубации.

3 4

0% (контроль)

Рис. 8. Влияние метанола (%) на скорость образования МЕТА при конверсии МТС,

солюбилизированного Ме-ЦД.

Влияние концентрации стероидного субстрата на скорость процесса 1,2-дегидрирования МТС. Исходя из полученных результатов экспериментов по оптимизации условий трансформации МТС, представлялось возможным увеличение концентрации стероидного субстрата. С увеличением нагрузки МТС снижалась скорость процесса 1,2-дегидрирования. Время полной конверсии МТС при исходном содержании стероидного субстрата 5, 7 и 10 г/л составило 2,3.5 и 4.5 ч. соответственно.

В подобранных оптимальных условиях трансформации (МВД, денонсированная вода, 28°С, биомасса P. simplex 4 г/л, концентрация метанола - 7%) с нагрузкой МТС 20 г/л полная конверсия субстрата наблюдалась через 15 ч без образования побочных продуктов и МЕТА был выделен с выходом 90%. В аналогичных условиях при использовании ГПЦД время трансформации сократилось до 4,5 ч.

Повторное использование МИД в качестве солюбилизатора. Было показано, что трансформация с повторным использованием МЦЦ отличалась от контроля только скоростью образования МЕТА, который ив 1, и во 2 цикле был получен с количественным выходом. Конверсия МТС в 3 цикле была не полной. МЕТА был получен с выходом не более 80%. Мы предполагаем, что трансформация в 3 цикле тормозится накоплением этилацетата в полимере.

2.2.1.6. 1,2-Дегидр1)рование андростендиона и гемисукцината тестостерона

Используя оптимальные условия биоконверсии МТС с помощью P.simplex проводили трансформацию андростендиона (АД) при нагрузке 20 г/л и гемисукцината тестостерона при нагрузке 10 г/л при мольном соотношении МЦЦ/стероид 1.5/1 и 1.7/1 соответственно. 1,2-Дегидроаналоги этих соединений были получены с количественным выходом через 3.5-4 ч трансформации. В отсутствие МЦЦ биоконверсия указанных стероидов в виде микрокристаллов не происходила.

2.2.2.Гидрокс11лирование

Изучали влияние полимеров на процессы гидроксилирования Д4-3-ксто- и Д5-ЗР-гидроксистероидов на примере АД и ацетата дегидроэпиандростерона (АДЭА) и грибами A. alternata, Beauveria sp., В. sorokiniarta, С. lunata, Fusarium sp., R. nigricans, выбранными на основании литературных данных об их способности к трансформации стероидов.

2.2.2.1. На-Гидроксшшрование АД

Трансформация андростендиона мицелием Beauveria sp. Известно, что Beauveria sp. проявляет по отношению к АД как 11а-гидроксилазную активность, так и активность 17(1-оксистероиддсгидрогсназы (ОСД) (рис.9).

Рис. 9. Трансформация АД культурой Веатепа щ

Но соотношение образующихся продуктов существенно зависело от способа внесения АД. Даже при минимальном содержании АД 1 г/л, внесенным в среду в виде 1%-ного раствора в ДМФА, одновременно с 11а-гидроксилированием протекало восстановление 17-кетогруппы и в качестве единственного продукта получено 35% 11а-гидрокситестостерона вместо 11 а-гидрокси-АД (табл.5).

При увеличении количества трансформируемого АД до 4 г/л и соответственно ДМФА до 3.5%, наблюдалось полное ингибирование 11а-гидроксилазной активности гриба и значительное подавление ОСД. Полная конверсия АД имела место только при использовании МЦД.

Таблица 5. Трансформация АД мицелием Веаиуепа ¡р. (биомасса 8 г/л)

Нагрузка АД, г/л Способ внесения АД Время трансформации, ч Сте роиды в реакционной смеси, %

АД 11а-ОН-АД ТС 11а-ОН-ТС

1 ДМФА 48 60 - - 35

1 микрокристаллы 30 20 - 35 40

! МЦД 20 0 0 - 60

4 ДМФА 30 85 - 10 -

4 микрокристаллы 30 60 5 - 30

4 МЦД 46 45 - 45 3

4 МЦД* 30 0 - 70 20

*-биомасса 17 г/л

Наилучшим вариантом оказался способ внесения АД в виде комплекса с МЦД, который позволил разграничить стадии восстановления и 11а-гидроксилирования и ускорить процесс. При увеличении количества используемого мицелия вдвое, скорость и степень биоконвсрсии АД увеличивались почти в два раза, основным продуктом являлся ТС, который получен с содержанием 70% (Табл. 5).

2.2.2.2.14а-Гцдрокс!1Лироваиие

Трансформация АД стероидов мицелием С. 1ипШа ВКПМ Р-981 в присутствии ПВП. Изучали влияние ПВП с молекулярной массой 500 и 2000 кДа на процесс трансформации АД в 14а-гидрокси-АД. Из табл. 6 видно, что

при использовании ПВП с молекулярной массой 500 кДа и 2000кДа, содержание 14а-гидрокси-АД было лишь незначительно выше, чем в контроле. Более низкая по сравнению с контролем степень деструкции и гидроксилирования стероидов может быть связана с образованием прочного комплекса стероидов с полимером, недоступного для ферментных систем клетки.

Таблица 6. Трансформация АД мицелием С. 1ипша с помощью ПВП.

Молекулярная масса ПВП, кДа Стероиды в реакционной смеси, %

АД Ма-ОН-ДД

500 50 20

2000 45 25

Контроль 10 15

Трансформация АД в виде комплекса с ХМЦ. Для солюбилизации АД использовали МЦЦ и ГПЦД в мольном соотношении АД/ЦД 1:1 (весовое 1:5). При трансформации АД, солюбилизированного с помощью ГПЦД, мицелием С. 1ипа(а ВКПМ Р-981 степень конверсии достигала лишь 35% (табл. 7).

Таблица 7. Трансформация 4 г/л АД мицелием С. 1ипШа в присутствии

ХМЦ___• _

Солюбилизатор Время трансформации, ч Конверсия АД, % Содержание 14а-ОН-АД,%

МЦД 20 80 75

ГПЦД 22 35 40

Контроль 17 20 20

При этом наблюдалось увеличение содержания побочных продуктов по сравнению с контролем. В отличие от ГПЦД, при использовании МЦД содержание 14а-гидрокси-АД в трансформационной среде через 20 ч составляло не менее 70%. При этом целевой продукт был выделен с выходом 55-60% (Табл. 7).

Подбиралось оптимальное количество МЦД, необходимое и достаточное для успешной трансформации. Показано, что весовое соотношение АД/МЦД может быть уменьшено до 1:4. В то время как при меньших соотношениях снижались скорость трансформации и степень биоконверсии АД. (Рис. 10)

Рис. 10. Накопление 14а-гидрокси-АД при

различных соотношениях АД/МЦЦ (нагрузка 4 г/л)

4® Время, ч

1:1 -» 1:3 1:4

Изучалась возможность повторного использования МЦД. С этой целью водная фаза после отделения мицелия и экстракции продуктов трансформации была использована для проведения 3 повторных циклов трансформаций. Все три цикла осуществлялись с использованием свежего мицелия, без регенерации и добавления новой порции МЦЦ. При нагрузках АД в 4 г/л период его полной конверсии в 14а-гидрокси-АД составлял 24 ч, а содержание 14а-гидрокси-АД в водной фазе второго и третьего циклах - 70%. В 4-ом цикле гидроксилазная активность мицелия была низкой.

Трансформация 9а-гидрокси-АД и андростадиендиона (АДД). Установлено, что кроме АД С. lunaía вводит 14а-гидроксигруппу так же в 9а-гидрокси-АД и АДД. Однако трансформация 9а-гидрокси-АД в виде комплекса с МЦД протекала, в отличие от АД, с более низким выходом целевого 14а-гидроксипроизводного, по сравнению с тем, какой получали при трансформации кристаллического субстрата (табл. 8). В отсутствие МЦД 9а-гидрокси-АД при нагрузке 0.5-2.0 г/л был полностью конвертирован в 9а, 14а-дигидрокси-АД, выделенного с выходом 70-85%. Трансформация 9а-гидрокси-АД в количестве 2 г/л в комплексе с МЦД характеризовалась образованием 9а,14а-дигидрокси-АД в небольшом количестве и появлением не идентифицированных продуктов.

Таблица 8. Продукты гидроксилирования Д4-3-кетостероидов ряда

андростана и прегнана мицелием С. Innata, образуемые в присутствии МЦЦ и в отсутствие солюбилизатора (контроль).__

Стероидный Нагрузка, Основные продукты Содержание основных

субстрат г/л трансформации продуктов, %

МЦЦ Контроль

ТС 4.0 1 lß-гидрокси-ТС 75 35

АД 4.0 14а-гидрокси-АД 70 20

9а-ОН-АД 2.0 9а, 14а-дигидрокси-АД 10 80

АДД 4.0 1,2-дегидро-ТС 45 75

14а-гидрокси-АДД 45 10

Д4ПГ 2.0 6а-гидрокси-Д4ПГ 30 10

1 lß-гидрокси-Д''ПГ 30 10

В-во «S» 10.0 В-во «F» 65 55

14а-гидрокси-«8» 30 40

ГМПД 4.0 1 lß-гидрокси-ГМПД 50 -

7Р-гидрокси-ГМПД 30 -

7ß,l lß-дигидрокси-ГМПД - 15

Трансформации АДД (4 г/л) как в отсутствие МЦД, так и в его присутствии, предшествовала удлиненная лаг-фаза, процесс трансформации протекал с образованием 1,2-дегидро-ТС и 14а-гидрокси-АДД соответственно в отношении 7:1 и 1:1 (табл. 8).

2.2.2.3. llp-Гидроксшшровапие стероидов мицелием Curvularia lunaía ВКПМ F-981. В отличие от гидроксилирования 17-кетостероидов андростанового ряда (АД, АДД, 9а-гидрокси-АД), мицелий С. Innata вводил гидроксигруппу в 17-гидроксиандростен - ТС в положение lip. Аналогично, в 1 ip-положение протекало гидроксилирование прегнаповых стероидов -прогестерон (Д4ПГ), вещества «S» Рейхштейна (в-во «S»), 20-гидроксиметилпрегна-1,4-диен-3-она (ГМПД), основными продуктами трансформации которых являлись lip-гидроксипроизводные - исходные соединения в синтезе некоторых лекарственных препаратов стероидной природы. В случае lip-гидроксилирования указанных соединений М1Щ также оказался эффективным солюбилизатором (табл. 8). Следует отметить, что новые продукты трансформации ГМПД (lip-гидрокси-ГМПД и 7р-гидрокси-ГМПД) получены только в присутствии МЦД (табл. 8).

Трансформация ТС. lip-Гидроксилирование ТС проводили при нагрузке 4 г/л. В присутствии МЦД конверсия ТС в lip-гидрокси-ТС протекала без накопления побочных продуктов и закапчивалась за 24 ч. За это время в реакционной жидкости образовалось до 75% 11р-гидрокси-ТС, тогда как без солюбилизатора накопилось только 35% продукта (табл. 9), после чего началась его деструкция. При трансформации ТС, Д4ПГ, ГМПД в присутствии МЦЦ деструкция отсутствовала.

Трансформация в-ва «S». Также без деструкции стероидов происходило введение llp-гидроксигруппы в в-во «S», конвертируемое в виде комплекса с МЦД в отношении 1:1 (моль/моль) при концентрации до 10 г/л в течение 22 ч, тогда как в контроле без МЦЦ - в течение 46ч (табл. 9).Следует отметить, что в присутствии МЦД на мицелии отсутствовали продукты трансформации, что значительно упрощало выделение чистого гидрокортизона из водной фазы (табл. 9). Также следует подчеркнуть, что в присутствии МЦД трансформация протекала с образованием меньшего количества побочного 14а-гидроксипроизводного в-ва «S».

Таблица 9. Трансформация кортексолона с помощью мицелия С. lunata

ВКПМ F-988 при нагрузке 10 г/л.

Наличие МЦД Время трансформации, ч Общее содержание продуктов трансформации, % Выход кристаллического гидрокортизона, %

в водной фазе в мицелии

- 46 48.8 42.6 43.2

+ 22 91.5 следы 58.0

2.2.2.4.7а-гидроксшифование стероидов

Гидроксилирование стероидных 5-олефинов проводили грибами А. alternata, В. sorokiniana, С. lunata, Fusarium sp., Rh. nigricans. Исследуемые грибы проявили низкую степень конверсии АДЭА даже при низкой нагрузке стероидного субстрата (0.5 г/л), за исключением С. lunata, который был выбран для дальнейших исследований (табл. 10).

Таблица 10. Трансформация АДЭА различными грибами

Микроорганизм Нагрузка АДЭА, г/л Время, ч Конверсия АДЭА, % Содержание 7а-ОН-ДЭА в реакционной смеси, %

Bipolaris sorokiniana 0.5 24 40 30

Curvularia lunata 1.0 20 90 65

Fusarium sp. 0.5 24 50 40

Rkizopus nigricans* 0.5 48 70 40

*-растущая культура

С помощью мицелия указанного штамма С. lunala удалось получить 7а-гидроксипроизводные АДЭА с содержанием продукта 65%, а также некоторых других стероидных Д5-олефинов при нагрузках, увеличенных до 2 г/л. Однако, только в случае 5-олефинов андростанового ряда (ДЭА, АДЭА, 3ß,17ß-дигидроксиандрост-5-ена (ДГА), его ацетата (АДГА)) трансформация проходила регио- и стереоселективно без образования побочных продуктов.

7а-гидроксилирование А5-ЗВ-гидроксистероидов в присутствии ХМЦ. Следующие Д5-ЗВ-гидроксистероиды использованы как субстраты для трансформации: ДЭА, АДЭА, ДГА, АДГА, прегненолон (Д5-ПГ), 16,17а-оксидопрегненолон (А5ОПГ), моноацетат (MAR) и триацетат (TAR) вещества «R.» Рейхштейна. Результаты гидроксилирования АДЭА, выполненного при нагрузке 10 г/л в присутствии ЦД, МЦЦ и ГПЦЦ, представлены в табл. 11.

Таблица 11. Влияние циклодекстринов на трансформацию АДЭА при нагрузке

Юг/л

Полимер Содержание стероидов в реакционной смеси, % Выход 7а-гидрокси-ДЭА, %

АДЭА ТГА 7а-гидрокси-ДЭА

р-цд 45 5 50 20,5

МЦД 5 3 92 77

ГПЦЦ 10 следы 90 65

Контроль* 70 15 15 9

♦трансформация без полимера

За 44 ч трансформации в присутствии МЦЦ достигнута максимальная степень конверсии АДЭА в 7а-гидрокси-ДЭА, который выделен с выходом 77%. Высокое содержание 7а-гидрокси-ДЭА в реакционной смеси (90%) наблюдалось также при использовании ГПЦЦ. Однако ГПЦЦ, по сравнению с МЦЦ образовывал более прочный комплекс с 7а-гидрокси-ДЭА, что затруднило выделение продукта, и вследствие чего он был получен с меньшим

выходом - 65% (табл.12). При солюбилизации АДЭА с помощью ЦЦ содержание 7а-гидрокси-ДЭА в реакционной массе не превышало 50%. Кроме того, ЦД образовывал с ним еще более прочный комплекс, чем ГПЦД, вследствие чего выход выделенного продукта составил лишь 20.5% (табл. 11).

При трансформации ДГА в количестве 2 г/л (в виде микрокристаллов, либо в виде комплекса с МЦД) полная конверсия в ТГА наблюдалась через 2024 ч инкубации. При нагрузке ДГА 5 г/л, трансформируемого в виде микрокристаллов, конверсия субстрата даже через 48 ч была неполной и количество 7а-гидроксипродукта не превышало 20%. Трансформация ДГА в виде комплекса с МЦД заканчивалась за 30 ч, содержание ТГА в реакционной смеси составило 80% (табл. 12).

Таблица 12. Продукты гидроксилирования А -3-гидроксистероидов

Стероидный Нагрузка, Основные продукты Содержание основных

субстрат г/л трансформации продуктов, %

МЦД Контроль*

ДГА 5.0 7а-гидрокси-ДГА 80 20

АДЭА 10.0 7а-гидрокси-ДЭА 95 15

Д'ПГ 2.0 7а, 11 р-дигидрокси-Дь- 70 10

ПГ

Д5ОПГ 2.0 7а-ОН- Д5ОПГ 80 75

MAR 2.0 В-во «R» 30 -

7а-гидрокси-«1Ъ> 30 15

11Р-гидрокси-«К» |_25 10

TAR 1.0 В-во «R» 60 -

7а-гидрокси-«К» 20 7

11 Р-гидрокси-«Я» 15 5

*- без солюбилизатора

Получить практически значимый выход гидроксипроизводных Д5-ПГ и ацетатов вещества «R» даже при низкой нагрузке 2 г/л оказалось возможным лишь в присутствии МЦД (табл. 12). В отсутствие солюбилизатора через 27 ч трансформации Д5-Г1Г и 23 ч трансформации MAR и TAR общий выход выделенных стероидов составил не более 10-25%, по-видимому, вследствие интенсивной деструкции как исходного субстрата, так и продуктов реакции. Выход 7-гидроксипроизводных в присутствии МЦД превышал контрольные значения в 2-7 раз (табл. 12). Следует отметить, что продукты трансформации MAR и TAR, также как и продукты трансформации ГМПД мицелием С. lunata в доступной литературе не описаны.

выводы

1) Изучена стероид солюбилизирующая активность 17 водорастворимых синтетических и природных полимеров, проявляемая в процессах трансформации стероидов бактериями и грибами. Установлено, что солюбилизирующая активность полимеров класса N-виниламидов возрастает с увеличением их молекулярной массы и достигает максимума у полимеров с молекулярной массой 500-2000 кДа. У природных полимеров -циклодекстринов - солюбилизирующая активность определяется наличием и характером заместителя в молекуле олигосахарида, при этом лучшие результаты получены в присутствии метил-р-циклодекстрина (МЦД).

2) Установлено, что оптимальной концентрацией полимеров класса N-виниламидов в процессе 1,2-дегидрирования метилтестостерона бактерией Pimelobacter simplex является 1% для ПВК и 3.5% для ПВП. Оптимальным мольным соотношением МЦД/стероид в процессах 1,2-дегидрирования является 1.2:1, а в процессах гидроксилирования грибами - 0.8:1.

3) Определены оптимальные условия, обеспечивающие количественный выход целевого продукта в процессе 1,2-дегидрирования: рН 7.2, количество биомассы - 4 г/л, концентрация метанола - 7%, присутствие индуктора 3-кетостероидцегидрогеназы, среда для трансформации - деминерализованная вода, солюбилизатор - МЦЦ. Разработан эффективный одностадийный метод 1,2-дегидрирования МТС при нагрузке субстрата до 20 г/л в растворе МЦД.

4) Впервые для гидроксилирования (7а-, lip- и 14а-) стероидов плесневыми грибами использованы химически модифицированные циклодекстрины. В результате трансформации Д4-3-кето- и Д5-Зр-гидроксистероидов ряда андростана и прегнана мицелием Curvularia lunata в присутствии МЦД получено 17 гидроксипроизводных, из которых 4 стероида не описаны в литературе. Установлено, что в присутствии МЦД в случае гидроксилирования стероидов продукты трансформации содержатся только в водной фазе, что существенно облегчает их выделение в кристаллическом виде.

5) Разработан способ получения 7а-гидроксипроизводных стероидных 5-олефинов с помощью нового штамма Curvularia lunata ВКПМ F-981. Способ позволяет достигнуть 95% выхода 7а-гидроксистероидов в присутствии МЦД при нагрузке стероидного субстрата 10 г/л.

6) Показано, что МЦД можно рассматривать как универсальный солюбилизатор, эффективный в процессах трансформаций стероидных соединений различной структуры, осуществляемых как бактериями, так и грибами. При этом была показана возможность его повторного использования после выделения продуктов реакции.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1). Дружинина А.В., Андрюшина В.А., Аринбасарова А.Ю., Пашкин И.И., Савинова Т.С., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. Бактериальное 1,2-дегидрирование 17а-метилтестостерона в присутствии синтетических полимеров. Биотехнология, 2008; №1, с. 46-50.

2). Дружинина А.В., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. Превращение 17а-метилтестостерона в метандростенолон с помощью бактерии Pimelobacter simplex

ВКПМ АС-1632 в присутствии циклодекстршюв. Прикладная биохимия и микробиология. 2008; т. 44, № 6, 642-646.

3). Андрюшина В.А., Войтвилло Н Е., Дружинина A.B., Стыценко Т.С., Скрябин К Г. Новая технология получения высокоактивных дегидроаналогов стероидов. VI Международный Форум «Биотехнология и современность», г.Санкт-Петербург. Тезисы, стр. 44-45,2005.

4). Дружинина A.B., Ядерец В.В., Войшвилло Н.Е., Стыценко Т.С., Аидрюшина В.А. «Применение полимеров в микробиологических процессах трансформации стероидов» Тезисы докладов VII Международного форума «Биотехнология и современность», стр. 30-31,2006.

5). Дружинина A.B. Получение тестостерона и гидрокст-естостерона с помощью гриба Beauveria sp. Тезисы I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток дня биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты», с.34, Пущино, 2007.

6). Дружинина A.B., Ядерец В.В. 14а-гидроксилирование андростендиона грибом Cumularía lunata LBS в присутствии природных и синтетических полимеров. Тезисы докладов XX зимней международной молодёжной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, с. 132,2008.

7). Дружинина A.B. Микробиологический способ получения 7а-гидроксиандросгенов. Наука и технологии. Краткие сообщения ХХУШ Российской школы, стр. 61-63, г. Миасс, июнь 2008г.

8). Аидрюшина В.А., Дружинина A.B., Ядерец В.В., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. 7альфа-гидроксилирование стероидных 5-олефинов плесневыми грибами. Прикладная биохимия и микробиология, 2010, Т. 46, №1, с. 1-6.

9). Аидрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Дружинина A.B., Стыценко Т.С., Ядерец В.В., Скрябин КГ. Микробиологический способ получения 7альфа-гидроксиандроегенов. Патент РФ X» РФ № 2 377 309 (Бюлл. №36 от 27.12.2009).

10). Аидрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Стыценко Т.С., Дружинина A.B., Родина Н.В., Ядерец В.В. Разработка научных основ технологий получения стероидных лекарственных субстанций из отечественного сырья. Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств. Материалы симпозиума Москва. 2008. Стр, 11.

11). Андрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Дружинина A.B., Стыценко Т.е., Ядерец В В., Скрябин К.Г., Бартошевич Ю.Э., Новак М.И., Домрачева А.Г. Способ llß-гидроксилирования Д4-3-кетостероидов. Патент РФ № 2399674 (Бюл. № 26 от 20.09.2010)

12). Андрюшина В.А., Дружинина A.B., Ядерец В.В., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. Гидроксилирование стероидов мицелием Curvularia lunata в присутствии метил-ß-циклодекстрина. Прикладная биохимия и микробиология, 2011, Т. 47, №1, с. 1-7.

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям к.х.н. Андрюшиной В.А. и к.б.н. Войшвилло Н.Е. за всестороннюю поддержку при выполнении диссертации, к.х.н. Стыценко Т.С. за неоценимую помощь при планировании и выполнении работы, Соловьёвой Н.П. за помощь в снятии и интерпретации ПМР спектров, Пашкину И.И. и Рухле Е.Г. за предоставление образцов полимеров, Комбаровой С.П. за ценные советы, а также всем сотрудникам лаборатории Биотехнологии стероидов Центра «Биоинженерия» РАН.

Подписано в печать:

28.10.2010

Заказ № 4402 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дружинина, Анна Викторовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Значение трансформации стероидов для микроорганизмов.

2.2. Виды трансформаций стероидных соединений микроорганизмами.

2.2.1. 1,2-Дегидрирование стероидов.

2.2.1.1. Структура и свойства МЕТА.

2.2.1.2. Известные микробиологические методы получения МЕТА.

2.2.2. Микробиологическое гидроксилирование стероидов.

2.2.2.1. 7а-Гидроксилирование.

2.2.2.2. 11а-Гидроксилирование.

2.2.2.3. 14а-Гидроксилирование.

2.3. Повышение доступности стероидов для микроорганизмов-трансформаторов.

2.3.1. Механизм потребления микроорганизмами субстратов, практически не растворимых в воде.

2.3.2. Способы повышения доступности стероидных субстратов для микроорганизмов.

2.3.2.1. Конверсия субстратов в мелкокристаллической форме.

2.3.2.2. Использование органических растворителей.

2.3.2.3. Применение сурфактантов.

2.3.2.4. Использование синтетических полимеров класса N-виниламидов.

2.3.2.4.1. Использование поливинилпирролидона.

2.3.2.4.2. Использование поливинилкапролактамов.

2.3.2.5. Использование циклодекстринов и их производных.

2.3.2.5.1. Структура циклодекстринов и их производных, образование комплексов включения.

2.3.2.5.2. Применение циклодекстринов в промышленности.

2.3.2.5.3. Использование циклодекстринов в биотрансформациях стероидов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Реактивы.

3.2. Микроорганизмы и методы их культивирования.

3.2.1. Штаммы, использованные в работе.

3.2.2. Среды для хранения и выращивания микроорганизмов.

3.2.3. Получение биомассы Pimelobacter simplex для проведения трансформации.

3.2.4. Трансформация стероидов бактериями.

3.2.4.1. Трансформация стероидов растущей бактериальной культурой.

3.2.4.2. Трансформация стероидов отмытыми клетками Pimelobacter simplex.

3.2.5. Трансформация стероидов растущими грибными культурами.

3.2.6. Трансформация стероидов отмытым мицелием.

3.3. Выделение продуктов трансформации.

3.4. Получение МИД для повторного использования.

3.5. Аналитические методы.

3.5.1. Тонкослойная хроматография (ТСХ).

3.5.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

3.5.3. Протонный магнитный резонанс (ПМР).

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. 1,2-Дегидрирование.

4.1.1. Анализ 1,2-дегидрирующей активности штаммов Corynebacterium simplex, Rhodococcus erythropolis, Pimelobacter simplex.

4.1.2. 1,2-Дегидрирование МТС в присутствии ПВК.

4.1.3. Трансформация МТС с помощью поливиниловых спиртов.

4.1.4. 1,2-Дегидрирование МТС в присутствии ГТВП.

4.1.5. Трансформация МТС с помощью полиэтиленоксидов.

4.1.6. Трансформация МТС в присутствии модифицированного ЦД.

4.1.6.1. Влияние индуктора на 1,2-дегидрогеназную активность отмытых клеток P. simplex.

4.1.6.2. Трансформация МТС растущими и отмытыми клетками Р. simplex.

4.1.6.3. Влияние количества биомассы P. simplex на скорость 1,2-дегидрирования МТС.

4.1.6.4. Оценка влияния на процесс 1,2-дегидрирования состава трансформационной среды.

4.1.6.5. Изучение способности P. simplex к синтезу солюбилизаторов стероидов.

4.1.6.6. Влияние рН на скорость 1,2-дегидрирования МТС.

4.1.6.7. Влияние количества вносимого растворителя на конверсию МТС.

4.1.6.8. Влияние концентрации стероидного субстрата на скорость процесса 1, 2-дегидрирования МТС.

4.1.6.9. Оценка эффективности 1,2-дегидрирования различных стероидных субстратов в оптимизированных условиях.

4.1.6.10. Повторное использование МЦД в качестве солюбилизатора МТС.

4.1.6.11. Трансформация МТС в МЕТА в оптимальных условиях.

4.2. Гидроксилирование стероидов.

4.2.1.11 а-Гидроксилирование.

4.2.1.1. Трансформация андростендиона растущей культурой Beanveria sp.

4.2.1.2. Трансформация АД мицелием Beauveria sp.

4.2.2. 14а-Гидроксилирование стероидов мицелием Curvularia Innata

ВКПМ F

4.2.2.1. Трансформация АД в присутствии ПВП.

4.2.2.2. Трансформация АД в виде комплекса с химически модифицированными циклодекстринами.

4.2.2.3. Трансформация 9а-гидрокси-АД и АДД.

4.2.3. 11 ß-Гидроксилирование.

4.2.3.1. Трансформация ТС.

4.2.3.2. Трансформация в-ва «S».

4.2.4. 7а-Гидроксилирование.

4.2.4.1. 7а-Гидроксилирование мицелием С. lunata.

4.2.4.2. 7а-Гидроксилирование А5-Зр-гидроксистероидов в присутствии химически модифицированных ЦД.

4.2.4.3. Трансформация А5-ПГ, MAR и TAR.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение полимеров в микробиологических трансформациях стероидов"

Актуальность проблемы.

Стероиды - кортикостероиды, гестагены, андрогены и эстрогены благодаря своей уникальной биологической активности и широкому спектру действия нашли большое применение в медицинской практике в качестве противовоспалительных, противошоковых, антиаллергических, противоастматических, диуретических, анаболических, противораковых, гормональных, контрацептивных и других лекарственных средств.

За последние 15 лет состояние дел в этой области в России резко ухудшилось. Производство- стероидных субстанций практически прекращено, а заводы переориентированы на выпуск готовой лекарственной формы из импортных субстанций, что привело к зависимости России от поставок из-за рубежа и недоступности для потребителей жизненно необходимых препаратов из-за их дороговизны. Поэтому разработка синтеза стероидных препаратов из доступного отечественного сырья и отработка отдельных технологических стадий синтеза с учетом новейших достижений биотехнологии является чрезвычайно актуальной задачей. Следует отметить, что химический синтез стероидов вследствие сложности строения стероидной молекулы и ее полифункциональности многостадиен и очень сложен. Поэтому важная роль в синтезе стероидов, особенно в промышленном масштабе, отводится микробиологической трансформации, имеющей значительные преимущества в виде высокой селективности (при наличии соответствующих штаммов), сокращению количества стадий синтеза, простоты аппаратурного оформления, отсутствия необходимости в дорогих реактивах и экологической чистоты микробиологических методов. Более того, такая трансформация стероидов как гидроксилирование практически выполнима только с помощью микробных катализаторов.

Состояние вопроса.

Для повышения растворимости и доступности для микробной клетки практически нерастворимых в воде стероидных субстратов используют ряд приемов: механическое измельчение кристаллов до микрочастиц, либо переосаждение стероида в водной реакционной среде из раствора в смешивающемся с водой органическом растворителе, что также позволяет получать субстрат в виде микрочастиц. Мелкодисперсную эмульсию стероидов в воде получают путем внесения их в виде раствора в органических растворителях, после чего растворители упаривают [1]. Иногда проводят реакцию в присутствии растворителя, смешивающегося с водой, например, диметилсульфоксида, который вносят не только одновременно с субстратом [2], но и последовательно [3], что также улучшает диспергирование субстрата. Применяют органические растворители наряду с солюбилизирующими агентами [3, 2]. Однако органические растворители, как смешивающиеся, так и не смешивающиеся с водой, оказывают токсическое действие на микроорганизмы, а солюбилизирующие агенты приводят к образованию пены, что затрудняет массообмен и аэрирование системы. Как правило, при использовании органических растворителей реакцию проводят в присутствии искусственных акцепторов электронов, чаще всего менадиона [2]. Однако даже при этом не достигается высокая степень превращения, поскольку менадион сам токсичен для микроорганизмов. Кроме того, присутствие гидрофобного менадиона в реакционной смеси затрудняет очистку гидрофобного продукта. Оригинальное решение доступности субстратов для микробной клетки было предложено венгерскими исследователями [4]. Предложенный ими способ включает микробиологическое превращение стероидных субстратов в присутствии интенсифицирующих процесс а-, (3- или у-циклодекстринов или их смесей. Было показано, что в присутствии этих соединений растворимость стероидов значительно увеличивается за счет образования комплексов включения, наблюдалось также увеличение скоростей реакций, сокращалось время превращения и уменьшалось характерное для многих стероидов ингибирование скорости реакции продуктом. Циклодекстрины после проведения процесса могут быть регенерированы. Среди недостатков этого метода следует отметить недостаточно высокую концентрацию субстратов (не более 4 г/л); при этом удовлетворительное превращение (98%) достигается лишь в присутствии менадиона. Позже этот способ был улучшен в реакции дегидрирования с Р-циклодекстрином российскими учеными, применившими в трансформации вещества, снижающие трансмембранный потенциал (аминокислоту, никотинамид или ретинол, или их сочетание), что позволило избежать использования менадиона [5]. Однако, несмотря на то, что способ позволил поднять концентрацию субстрата в 2 раза, он далеко не универсален, описан только для процесса дегидрирования и подходит не для всех субстратов. Кроме того, само использование (3-циклодекстрина ограничено его невысокой растворимостью в воде. Поэтому для интенсификации процессов биотрансформации стероидов перспективным является использование хорошо растворимых его химических модификантов. Одна из попыток решения этой задачи была предпринята путем получения эпихлоргидринового полимера ß-циклодекстрина [6]. Особенностью таких полимеров является не только хорошая растворимость в воде, но и способность образовывать комплексы с большими гостевыми молекулами по сравнению с ^модифицированным ß-циклодекстрином [6]. Однако существенного увеличения растворимости молекулы гидрокортизона достигнуто не было.

Известно также использование водорастворимых химически модифицированных производных ß-циклодекстрина, в процессах деградации стеринов до 17-кетоандростанов АД и АДД и в процессах получения 1,2-дегидропроизводных Д4 -3-кетостероидов [7-9], однако этот способ также не является универсальным и ограничен подбором для каждого процесса и каждого субстрата определенного производного ß-циклодекстрипа. Кроме того, в последнее время появилось несколько публикаций о влиянии некоторых производных циклодекстрина на рост и активность стерин трансформирующих микобактерий и их способности вызывать лизис культуры Bacillus halondurans [10, 11].

Для солюбилизации стероидов и других гидрофобных соединений описано также использование природных полимеров, таких как хитин и хитозан, или синтетических полимеров класса N-виниламида, например поливинилпирролидона (ПВП) и поливинилкапролактама (ПВК) [5, 12-16]. Использование хитиновых полимеров, к сожалению, не дало желаемых результатов. Значительным продвижением вперед было использование полимеров ПВК. Их использование в некоторых процессах позволило значительно поднять концентрацию некоторых стероидных субстратов в процессе микробиологического дегидрирования [14]. Однако исследование ограничилось одним процессом и узким набором субстратов.

Таким образом, в настоящее время известны несколько способов решения проблемы низкой растворимости стероидных субстратов. Тем не менее, ни один способ не является универсальным. Однако среди рассмотренных выше методов применение полимеров представляется наиболее перспективным.

Поэтому представлялось актуальным проведение исследований по поиску среди синтетических и природных полимеров универсального солюбилизатора, эффективного для различных процессов и стероидных соединений различной структуры, а также исследование его влияния на стероид трансформирующую активность бактерий и грибов и изучение условий проведения в его присутствии наиболее часто используемых в синтезе стероидов трансформаций, таких как 1,2-дегидрирование и гидроксилирование в различные положения стероидной молекулы. Цель и задачи работы.

Целью данной работы являлось исследование в области повышения эффективности практически значимых микробиологических трансформаций стероидов, таких как 1,2-дегидрирование и направленное гидроксилирование путем применения в реакциях синтетических и природных полимеров. В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

Провести в присутствии лучшего полимера направленное гидроксилирование Д4-3-кето- и Д5-ЗР-гидроксистероидов ряда андростана и прегнана грибами с различной гидроксилазной активностью с целью выхода на новые биологически активные соединения.

Научная новизна работы.

Изучена зависимость способности к солюбилизации стероидов у 16 полимеров класса N-виниламидов и циклодекстринов от величины молекулярной массы, концентрации полимера, его химической структуры. В числе исследуемых полимеров 11 соединений ранее не применялись в трансформациях стероидов, осуществляемых с помощью бактерий, и 16 соединений - для трансформаций, осуществляемых грибами.

Впервые для стероидных трансформаций, осуществляемых грибными культурами, применены полимеры класса N-виниламидов и химически модифицированные циклодекстрины.

Впервые показана возможность увеличения нагрузки исследуемых стероидных субстратов в реакциях гидроксилирования грибами от 0.5-2 до 10-20 г/л в присутствии МЦД.

Впервые показано наличие 7а-гидроксилазной активности у гриба Curvularia Innata в отношении Д5-3(3-гидроксистероидов.

Методом лабораторной селекции при непосредственном участии автора получен новый штамм С. lunata, отличающийся высокой 7а-гидроксилазной активностью в отношении стероидных Д5-олефинов. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-981.

Разработан способ направленного 7а-гидроксилирования Д5-ЗР-гидрокси- стероидов с помощью нового штамма С. Innata ВКПМ F-981. На способ 7а-гидроксилирования получен патент РФ № 2 377 309 (Бюлл. Изобр. №36 от 27.12.2009). Изобретение включено отделом экономики и статистики промышленной собственности ФИПС в базу «Перспективные изобретения».

С помощью нового штамма С. lunata получено 17 гидроксипроизводных Д4-3-кето- и Д5-3(3-гидроксистероидов ряда андростана и прегпана, среди которых 4 новых соединения.

Практическая значимость работы.

Проведена оптимизация процесса трансформации 17а-метилтестостерона (МТС) с использованием штамма Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632 [17] с высокой 1,2-дегидрогеназной активностью. На основании разработанной технологии предложен эффективный одностадийный метод 1,2-дегидрирования Д4-3-кетостероидов при повышенной нагрузке субстрата (до 20 г/л) в водном растворе МЦД. 1,2-Дегидроаналоги, находящие широкое применение в медицине и ветеринарии получены практически с количественным выходом. Метод соответствует лабораторно-техническому уровню согласно испытаниям, проведённым в аппаратном зале Центра «Биоинженерия» РАН, на основании которых составлен акт о наработке 125 г. метандростенолона (МЕТА).

Использование (З-циклодекстрина (ЦД) и его химически-модифицированных производных - МЦД и гидроксипропил-ЦД (ГПЦД) в процессе направленного 7а-гидроксилирования позволили не только увеличить нагрузку субстратов с 2 до 10 г/л, но и скорость реакции почти в 2 раза и поднять выход 7а-гидроксистероидов с 15до 95%.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на VI Международном Форуме «Биотехнология и современность» (2005, Санкт-Петербург), VII Международном форуме «Биотехнология и современность» (2006, Санкт-Петербург), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (2007, Пущино), XX зимней международной молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва), XXVIII Российской Школе «Наука и технология» (2008, Миасс).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 2 патента РФ, 1 сообщение и 5 тезисов.

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, приложения. Работа содержит 115 страниц машинописного текста, 13 таблиц, 34 рисунка. Библиография включает 153 наименования, из них 123 иностранные работы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Дружинина, Анна Викторовна

5. ВЫВОДЫ

1) Изучена стероид со любил изирующая активность 17 водорастворимых синтетических и природных полимеров, проявляемая в процессах трансформации стероидов бактериями и грибами. Установлено, что солюбилизирующая активность полимеров класса N-виниламидов возрастает с увеличением их молекулярной массы и достигает максимума у полимеров с молекулярной массой 500-2000 кДа. У природных полимеров -циклодекстринов - солюбилизирующая активность определяется наличием и характером заместителя в молекуле олигосахарида, при этом лучшие результаты получены в присутствии метил-р-циклодекстрина (МИД).

3) Определены оптимальные условия, обеспечивающие количественный выход целевого продукта в процессе 1,2-дегидрирования: рН 7.2, количество биомассы — 4 г/л, концентрация метанола - 7%, присутствие индуктора 3-кетостероиддегидрогеназы, среда для трансформации - деминерализованная вода, солюбилизатор - МЦД. Разработан эффективный одностадийный метод 1,2-дегидрирования МТС при нагрузке субстрата до 20 г/л в растворе МИД.

4) Впервые для гидроксилирования (7а-, 1ф- и 14а-) стероидов плесневыми грибами использованы химически модифицированные циклодекстрины. В результате трансформации Д4-3-кето- и Д5-Зр-гидроксистероидов ряда андростана и прегнана мицелием Curviilaria Innata в присутствии МЦД получено 17 гидроксипроизводных, из которых 4 стероида не- описаны в литературе. Установлено, что в присутствии МЦД в случае гидроксилирования стероидов продукты трансформации содержатся только в водной фазе, что существенно облегчает их выделение в кристаллическом виде.

5) Разработан способ получения 7а-гидроксипроизводных стероидных 5-олефинов с помощью нового штамма Ситъйапа 1ипМа ВКПМ Р-981. Способ позволяет достигнуть 95% выхода 7а-гидроксистероидов в присутствии МЦД при нагрузке стероидного субстрата 10 г/л.

6). Показано, что МЦД можно рассматривать как универсальный солюбилизатор, эффективный в процессах трансформаций стероидных соединений различной структуры, осуществляемых как бактериями, так и грибами. При этом была показана возможность его повторного использования после выделения продуктов реакции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дружинина, Анна Викторовна, Москва

1. Beaton J. Preparation of sterol substrates for bioconversion. US patent №4124607, IPC С 07 J 9/00, 1978.

2. Zaffaroni A., Campillo C. Process for the production of 11-hydroxylatedsteroids. GB patent № 1083204, IPC C12P33/00, 1967.

3. Nagy U.E., Bartho I., Hantos G., Trinn M., Vida Z., Szejtli J., Stadler A., Habon I., Balazs M. Process for the intensification of microbiological conversions of steroids by using cyclodextrin additives. GB patent № 2108965 В, С 07/J 1/00, 5/00, 1985.

4. Аринбасарова А.Ю., Кощеенко K.A., Андрюшина В.А., Гриненко Г.С., Скрябин Г.К. Патент РФ № 1830949 Способ получения 1,2-дегидрированных кортикостероидов. Кл. С 12 Р 33/00. EHN 19, 1995.

5. Волкова Д.А., Банникова Г.Е., Лопатин С.А., Ильин М.М., Андрюшина В.А., Грачева И.М., Варламов В.П. // Хим.-Фарм.Ж. 1999. - Т. 33. -№3. - С. 30-32.

6. Harada A., Furue M. and Nozakura S. Inclusion of aromatic compounds by a (3-cyclodextrin epichlorohydrin polymer. Polymer.J., 1981, V.13, №8, p. 777-778.

7. Суходольская Г.В., Донова M.B., Николаева В.M. и др. Способ получения 1,2-дегидропроизводных 4-дельта-З-кетостероидов. Патент РФ 2156302, 2000.

8. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н. и др. Способ получения андроста-1,4-диен-3,17-диона. Патент РФ 2039824, 1995.

9. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н. и др. Способ получения андрост-4-диен-3,17-диона. Патент РФ 2079258. Бюлл. Изобр. № 13. 1997.

10. Donova M.V., Nikolayeva V.M., Dovbnya D.V., Gulevskaya S.A., Suzina N.E. Methyl-p-cyclodextrin alters growth, activity and cell envelope features of sterol-transforming mycobacteria. Microbiology, 153, 2007, p. 19821992.

11. Zhang H., Li Z., Uematsu K., Kobayashi Т., Horikoshi K. Antibacterial activity of cyclodextrins against Bacillus strains. Arch Microbiol, 2008, №190, p. 605-609.

12. Sedlaszek L. Biotransformation of steroids. Crit.Rev.Biotechnol., 1988, V.7,№3,p.l 87-236.

13. Кощеенко K.A., Аринбасарова А.Ю., Донова M.B., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Пашкин И.И., Кирш Ю.Э., Зубов В.П. Способ получения дегидроаналогов стероидов. Патент РФ 2042687. Бюл. Изобр. №24. 1995.

14. Андрюшина В.А., Аринбасарова А.Ю., Войшвилло Н.Е., Савинова Т.С., Сазонова А.С., Стыценко Т.С. Способ получения метандростенолона. Патент РФ 2236464. Бюл. Изобр. № 2, 2004.

15. Банникова Т.Е., Волкова Д.А., Лопатин С.А., Габинская К.Н., Андрюшина В.А., Ильин М.М., Варламов В.П. Материалы пятой конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». Москва-Щелково, 25-27 мая. М., Изд-во ВНИРО, 1999, С. 12-15.

16. Андрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Скрябин К.Г., Стыценко Т.С., Савинова Т.С., Сазонова А.С. Штамм Pimelobacter simplex, проявляющий стероид-1,2-дегидрогеназную активность. Патент РФ № 2215038. Бюл. изобрет. №30, 2003.

17. Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. М., Наука, 1970, с. 525.

18. Войшвилло Н.Е., Андрюшина В.А., Савинова Т.С. и др. Идентификация нового штамма трансформирующих стероидымикобактерий как Mycobacterium neoaurum. Прикладная биохимия и микробиология, т. 39, №2, 2003, с. 173-179.

19. Войшвилло Н.Е., Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стерины водорослей. Биологические Науки, № 1, 1972, С. 92-101.

20. Porter R., Gallimore W., Reese P. Steroid transformation with Exophiala jeanselmei var. lecaniicorni and Ceratocystis 'paradoxa, Steroids., 1999, Vol. 64, p. 770-790.

21. Mahato S., and Garai S. Advances in microbial steroid biotransformation, Steroids, V. 64, №4, 1997, p. 332-345.

22. Schomer U., Martin C., Microbial transformation of sterols. Biotechnol. Bioeng., 1980, Vol. 22, №11, p. 11-24.

23. Charney W., Herzog H. Microbial transformation of steroids. Academic Press, Inc., New York. P., 1967, p. 728.

24. Машковский M. Д. Лекарственные средства. M.: Новая волна, 2002. Т. 2, с. 58.

25. Arinbasarova A., Karpov A., Fokina V., Medentsev A., Koshcheyenko К. Kinetic characteristics of 1-en-dehydrogenation of methyHydrocortisone by cells of Arthrobacter globiformis 193. Enzyme and Microbial technology, 1996, №19, p. 501-506.

26. Potin-Gotier H., Casiot C., Abstr.Sot.Trace Elem. Res. Hum. (ISTERH) 5th Int. Conf., Lyon, Sept., 26-30, 1998, P. 351.

27. Fernandes P. et al. Microbial conversion of steroid compounds: recent developments. Enzyme and Microbial Technology, 2003, V.32, p. 688-705.

28. Yusuf J. Abul-Hajj, Stereochemistry of C-1,2 Dehydrogenation of 5(3-Pregnane-3,11,20-trione by Septomyxa affinis. The Journal of Biological Chemistry, V. 247, №3, 1972, p. 686-691.

29. Perez C., Falero A., Llanes N., Hung B.R., Herver M.E., Palmero A., Marti E. Resistance to androstanes as an approach for androstandienedione yield enhancement in industrial mycobacteria. J Ind Microbiol Biotechnol, 2003, V.30, №10, p. 623-626.

30. Donova M.V. Transformation of steroids by actinobacteria: A Review. Applied Biochemistry and Microbiology, 2007, Vol. 43, №1, p. 1-14.

31. Войшвилло H.E., Турута A.M., Камерницкий A.B., Микроорганизмы как реагенты для трансформации 5а-стероидов. Известия РАН, серия химическая, 1994, №4, с. 567-588.

32. Choi K.P., Molnar L., Murooka Y. Secretory overproduction of 3-ketosteroid-1,2-dehydrogenase. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995, V.43, №6, p. 1044-1049.

33. Ахрем A.A., Войшвилло H.E. Трансформация метиландростендиола в дианабол культурой Mycobacterium sp. . Прикл. биохим. микробиол., 1970, Т. 6, №6, с. 654-659.

34. Ахрем A.A., Войшвилло Н.Е. Действие 17а-метиландростендиола и продуктов его микробиологического превращения на Mycobacterium sp. 77. Известия АН, Серия биологическая, 1971, № 2. с. 302-304.

35. Donova M.V., Egorova O.V., Nikolaeva V.M. Steroid 17-reduction by microorganisms. Process Biochem., 2004, № 5, p. 1-10.

36. Boynton J, Hanson JR, Hunter AC. The hydroxylation of some 13-methylsteroids by Cephalosporium aphidicola. Phytochemistry, 1997, V. 45, p. 951-956.

37. Holland H.L. Recent advances in applied and mechanistic aspects of the enzymatic hydroxylation of steroids by whole-cell biocatalysts. Steroids, 1999, V. 64, p. 178-186.

38. Wang P.F., Baez J.A., Liu C. et al. 1 lalpha-hydroxy-steroid-4,6-diene-3-one compounds and a process of their preparation. European Patent № 1167380, C07J21/00, 2002.

39. Dray F. J., Cotillon A. C. 7a-Hydroxylation of dehydroepiandrosterone and pregnenolone by bioconversion using Fusarium moniliforme. Fr Patent 2771105, 1999.

40. Cotillon A. C., Morfin R. Fusarium moniliforme 7a-hydroxylase: a new tool for the production of immunostimulating steroids. Biotrans 97, La grande motte, France: Abstract book, 1997, p. 126.

41. Cotillon A. C. and Morfin R. Transformation of 3-hydroxysteroids by Fusarium moniliforme 7a-hydroxylase. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1999, V. 68, p. 229-237.

42. Lathe R., Rose K.A., Seckl J. R., Best R., Yau J. L., Leckie C.M. Use of 7a-hydroxy or 7-oxo substituted steroids. World Patent WO 9737664,1997.

43. Morfin R. and Courchay G. Pregnenolone and dehidroepiandrosterone as precursors of activ 7-hydroxylated metabolites which increase the immune response in mice. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1994, V. 50, p. 91-100.

44. Loria R.M. Immune up-regulation and tumor apoptosis by androstene steroids. Steroids, 2002, V. 67, p. 953-966.

45. Hampl R., Lapcic O., Hill M., Klak J., Kasal A., Novacek A., Sterzl I., Starka L. 7-Hydroxiepiandrosterone a natural antiglucocorticoid and a candidate for steroid replacement therapy? Physiol. Res., 2000, V. 49, (Suppl.l) p.107-112.

46. Kolek T., Biotransformation XLVII: transformations of 5-ene steroids in Fusarium culmorum culture. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 1999, № 71, p. 83-90.

47. Wilson M.R., Gallimore W.A., Reese P.B. Steroid transformations with . Fusarium oxysporum var. cubense and. Colletotrichum musae. Steroids,1999, V. 64, № 12, p.834-843.

48. Choudhary M.I., Ali Shah S.A., Musharrah S.G., Shaheen F., Ur-Rahman A. Microbial transformation of dehydroepiandrosterone. Nat. Prod. Res., 2003, V. 17, № 3, p. 215-220.

49. Bensasson C.M., Hanson J.R., Hunter A.C. The hydroxylation of delta 5-androstenes by Cephalosporium aphidicola. Phytochemistry, 1998, V. 49, № 8, p. 2355-2358.

50. Namboori K., Pereira L., Merchant J.R. Fungal transformation • of pregnenolone & progesterone with the marine fungus Cladosporium herbarum. Indian J. Biochem. Biophys., 1980, V.17, № 2, p. 149-152.

51. Romano A., Romano D., Ragg E., Costantino F., Lenna R., Gandolfi R., Molinary F. Steroid hydroxylations with Botryodiplodia malorum and Colletotrichum lini. Steroids, 2006, V. 71, № 6, p. 429-434.

52. Madyastha K.M., Joseph T. Transformation of dehydroepiandrosterone and pregnenolone by Mucor piriformis. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995, V. 44, № 3-4, p. 339- 343.

53. Lamm A.S., Chen A.R.M., Reynolds W.F., Reese P.B. Steroid hydroxylation by Whetzelinia sclerotiorum, Phanerochaete chrysosporium and Mucorplumbeus. Steroids, 2007, V. 72, № 9-10, p.713-722.

54. Войшвилло H.E., Истомина З.И., Камерницкий A.B. Введение 9a-гидроксигруппы в Д5-3 3-гидроксистероиды с помощью плесневых грибов Circinella sp. Известия АН, Сер. Хим., 1994, №4, с. 737-742.

55. Murray Н.С., Peterson D.H. Oxygenation of steroids by Mucorales fungi. U.S. Patent 2602769, 1952.

56. Samantha T.B., Ghosh D.K. Characterisation of progesterone 11a-hydroxylase of Aspergillus achraceus TS: a cytochrome linked monoxygenase. J Steroid Biochem, 1987, V. 28, p.327-32.

57. Smith K.E., Ahmed F., Williams R.A.D., Kelley S. Microbial transformations of steroids—VIII. Transformation of progesterone by whole cells and microsomes of Aspergillus fumigatus. J Steroid Biochem Mol Biol, 1994, V. 49, p. 93-100.

58. Reskvar К., Cresnar В., Hadnik-Plevnik T. Resolution and reconstitution of cytochrome P-450 containing steroid hydroxylating system of Rhizopus nigricans. J Steroid Biochem, 1987, V. 14, p. 395-399.

59. Yoshihama M. Microbial hydroxylation of steroid hormones and their pharmaceutical applications. Yukijirushi Nyugyo Kenkyusho Hokoku, 1993, 99, p. 1-70.

60. Dtugonski J, Bartnicku K, Choyeeka V, Sedlaezek L. Stabilization of steroid 11-hydroxylation activity of Cunninghamella elegans protoplasts in organic osmotic stabilizers. World J Microbiol Biotechnol, 1992, V. 9, p. 56-58.

61. Zeng В., Zhang B. The relationship between the growing characterization and steroid 1 la-hydroxylation of Beauveria bassiana AS69 during fermentation. Weishengwuzue, 1992, V. 12, p.43-45.

62. Farooq A.H., James R., Iqbal Z. Hydroxylation of progesterone by Cephalosporium aphidicola. Phytochemistry, 1994, V. 37, p. 723-726.

63. De Jager E. A new progestagen for oral contraception. Contracept Delivery" Syst, 1982, V. 3, p. 11-15.

64. Hu S., Tian X., Sun Y., and Han G. Microbial hydroxylation of 13-ethyl-17|3-hydroxy- 18,19-dinor-17a- pregn- 4- en- 20- yn- 3- one. Steroids, 1996, V. 61, p. 407-410.

65. Баюнова В.И., Габинская K.H., Колыванова T.C., Коробова Ю.Н., Гриненко Г.С. Трансформация андрост-4-не-3,17-диона и андроста-1.4-диен-3,17-диона с помощью Beauveria sp. С. 471-473.

66. Griffiths D.A., Brown D.E., Jezequel S.G. Metabolism of xenobiotics by Beauveria bassiana. Xenobiotica, 1993, V. 23, p. 1993-1085.

67. Hu S., Genain G., and Azerad R. Microbial transformation of steroids: Contribution to 14a-hydroxylations. Steroids, 1995, V. 60, April, p. 337352.

68. Yoshioka H., Asada S. 14a-Hydroxy-4-androstene-3,17-dione manufacture with Myrothecium. Japanese Patent 06. 153. 987 (Nippon Kayaku, KK), 1994.

69. Asada S. Microbial manufacture of 14ct-hydroxy-4-androstene-3,l7-dione. Japanese Patent 06. 225. 791 (Nippon Kayaku,KK), 1994.

70. Madyastha K.M., Joseph T. Studies on the 14a-hydroxylation of progesterone in Mucorpiriformis. J Steroid Biochem Mol Biol, 1993, V. 45, p. 563-569.

71. Holland H.L., Poddar S., Tripet B. Effect of cell immobilization and organic solvents on sulfoxidation and steroid hydroxylation by Mortierella isabellina. J lnd Microbial, 1992, V. 10, p. 195-197.

72. Краснова JI.A., Мессинова O.B., Баюнова В.И. Колыванова Т.С., Гриненко Г.С. Способ получения 14а-оксиандрост-4-ен-3,17-диона. Авторское свидетельство № 801517, 1979.

73. Shuvalova S. D., Gabinskaya K. N., Popova E. V., Savinova T. S., and Andryushina V. A., Hydroxylation of androst-4-ene-3,17-dione with the aid of Curvularia lunata fungus. Pharmaceutical Chemistry Journal, 2001, V. 35, №. 5, p. 279-281.

74. Pinheiro H.M. and Cabral J.M.S. Effects of solvent molecular toxicity and microenvironment composition on the A1 dehydrogenation activity of Arthrobacter simplex cells. Biotech. Bioeng., 1991, V. 37. p. 97-102.

75. Tramper J., Wolters I., Verlaan P., The liquid-impelled-loop reactor: a new type of density-difference-mixed bioreactor in Biocatalysis in organic media. Eds.: Laane C., Tramper J., Lilly M.D., Elsevier, Amsterdam, 1987, p. 311-316.

76. Mahato S., Majumdar I. Current trends in microbial steroid transformation. Phytochemistry, 1995, V. 218, p. 883-898.

77. Goswami P.C., Singh H.D., Bhagat S.D., Baruah J.N. Microbial transformation of steroids. Biotechnol. Bioeng., 1983, V. 35, p.2929-2943.

78. Wodzinski R.S., Larocca D. Microbial transformation of steroids. Appl. Environ. Microbiol., 1977, V. 33, p. 660.

79. Chakravarty M., Singh H.D., Baruah J.N. et al. Microbial transformation of steroids. Biotechnol. Bioeng., 1975, V.17, p.399.

80. Reddy P.G., Singh P.K., Roy P.K., Baruah J.N. Microbial transformation of steroids. Biotechnol. Bioeng., 1982,V.24, p. 1241.

81. Heberland N.E., Reynolds J.A. Biotransformation of steroids. Proc. Natl. Acad. Sci., 1973, V. 70, p. 2313.

82. Thompson E.D., Knights B.A., Parks L.W. Biotransformation of steroids. Biochem. Biophys. Acta, 1973, V. 304, p. 131.

83. Звягинцева И.С., Звягинцев Д.Г. Микробиология. М: Наука, 1969, Т. 38. С. 816- 820;

84. Goetschel R., Bar R. Formation of mixed crystals in microbial conversion of sterols and steroids. Enzyme Microb Technol, 1992, V.14, p. 462-469.

85. Аринбасарова А.Ю., Фокина В.В., Карпов А.В. и др. 1-Ен-дегидрирование ба-метилгидрокортизона клетками Arthrobacter globiformis 193. Биохимия, 1995, Т. 60, Вып. 10, с. 1679-1687.

86. Fernandes P., Cabral J.M., Pinheiro Н.М. Bioconversion of а hydrocortisone derivativein organic aqueous two liquid phase system. Enzyme Microbiol. Biotechnol., 1995, V. 17, №.2, p. 163-167.

87. Angelova В., Schmauder H.-P. Lipophilic compounds in biotechnology— interactions with cells and technological problems. J Biotechnol, 1999, V.67, p. 13-32.

88. Takazawa Y., Sato S. and Takahashi J., Microbial oxidation of tetradecanols and related substances in organic solvents. Agric. BioL Chem., 1984,V. 48, №10, p.2489-2495.

89. Phase N., Patil S. Natural oils are better than organic solvents for the conversion of soybean sterols to 17-ketosteroids by Mycobacterium fortuitum. World J Microbiol Biotechnol, 1994, V. 10, p. 228-229.

90. Oda S., Ohta H. Microbial transformation on interface between lyophilic carriers and hydrophobic organic solvents. Biosci Biotechnol Biochem, 1992, V. 56, p. 2041-2045.

91. Strickley R. G., Solubilizing Excipients in oral and injectable formulations. Pharmaceutical Research, 2004, V. 21, №2, p. 201-230.

92. Chen Ching-Lin, Chang Shwu-Fen, Lee Daniel, Yang Lang-Yo, Lee Yi-Hsuan, Hsu Chung Y., Lin Shwu-Jiuan, and Liaw Jiahorng. Bioavailability effect of methylprednisolone by polymeric micelles. Pharmaceutical Research, 2008, V. 25, № 1, p. 39-47.

93. Park T. G. and Hoffman A. S . Immobilization of Arthrobacter simplex cells in thermally reversible hydrogels: comparative effects of organicsolvent and polymeric surfactant on steroid conversion. Biotechnology Letters, 1989, V.l, № 1, p. 17-22.

94. Veronese F.M. and Pasut G. PEGylation, successful approach to drug delivery. Drug Discov Today, 2005, V. 10, p. 1451-1458.

95. Buhler V. Polyvinylpyrrolidone excipients for pharmaceuticals. Springer Berlin Heidelberg, 2005, p. 5-125.

96. Plaizer-Vercammen J. A., Interaction of povidone with aromatic compounds IV: effects of macromolecule molecular weight, solvent dielectric constant, and ligand solubility on complex formation. J. Pharm. Sci., 1983, №9, p. 1042-1044.

97. Sekikawa H. et al. Dissolution behaviors and gastrointestinal absorption of sulflsoxazole in sulfisoxazole-polyvinylpyrrolidone coprecipitate. Yalcugaku Zasshi, 1978, V. 98, №1, p. 62-66.

98. Chien M.M. and Rosazza J. P. Microbial transformations of natural antitumor agents: use of solubilizing agents to improve yields of hydroxylated ellipticines. Applied and environmental microbiology, Oct. 1980, Vol. 40, №.4, p. 741-745.

99. Lugao A.B., Rogero S.O., Malmonge S.M. Rheological behaviour of irradiated wound dressing poly(vinyl pyrrolidone) hydrogels. Radiation Physics and Chemistry, 2002, V. 63, №3-6, p. 543-546.

100. Abeer Abd El-Hady and Hassan A. Abd El-Rehim. Production of prednisolone by Pseudomonas oleovorans cells incorporated into PVP/PEO radiation crosslinked hydrogels. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2004, V. 4, p. 219-226.

101. Kirsh, Y.E. Water Soluble Poly-N-Vinylamides. John Wiley & Sons, Chichester, Great Britain, 1998.

102. Фокина B.B., Аринбасарова А.Ю., Зубов A. Jl. и др. Дегидрирование стероидных субстратов бактериальными клетками, включенными в криогель поливинилового спирта. Прикл. биохим. микробиол., 1995, Т. 31, с. 213-219.

103. Dass C.R., Jessup W. Apolipoprotiens A-I, Cyclodextrins and liposomes as potential drugs for the reversal of atherosclerosis. J Pharm Pharmacol, 2000, V. 52, p.731-61.

104. Szejtli J., Past, present, and future of cyclodextrin research. Pure Appl. Chem., 2004, V. 76, №. 10, p. 1825-1845.

105. Szejtli J. Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry. Chem.Rev., 1998, V. 98, p. 1743-1753.

106. Szejtli, J. Cyclodextrin Technology. Kluwer academic publishers, Dordrecht, 1988, p. 450.

107. Eastburn S.D., Tao B.Y. Applications of modified cyclodextrins. Biotechnol Adv, 1994, №12, p.325- 339.

108. Moutard S., Perly В., Gode P., Demailly G. and Djedaini-Pilard F. Novel Glycolipids Based on Cyclodextrins. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2002, V.44, p. 317-322.

109. Loftsson Т., Brewster M.E. Pharmaceutical applications of cyclodextrins: 1. Drug solubilisation and stabilization. J Pharm Sci, 1996 V. 85, p. 1017-1025.

110. Schneiderman E., Stalcup A.M. Cyclodextrins: a versatile tool in separation science. J Chromatogr B, 2000, V.745, p.83-102.

111. Arias-Bianco M.J.A., Moyano J.R., Martinez J.I.P., Gines J.M. Study of inlusion complex of gliclazide in a-cyclodextrin. J Pharm Biomed Anal, 1998, V. 18, p. 275-279.

112. Nagase Y., Hirata M., Wada K., et al. Improvement of some pharmaceutical properties of DY-9760e by sulfobutyl ether beta-cyclodextrin. Int J Pharm, 2001, V. 229, p. 163-172.

113. Schmid G. Cyclodextrin glucanotransferse production: yield enhancement by overexpression of cloned genes. Trends Biotechnol, 1989, V. 7, p. 244-248.

114. Singh M., Sharma R. and Banerjee V.C. Biotechnological applications of cyclodextrins. Biotechnology Advances, 2002, V. 20, p. 341-359.

115. Fujishima N., Kusaka K., Umino T., Urushinata T., Terumi K. Flour based foods containing highly branched cyclodextrins. Japanese Patent JP 136,898,2001.

116. Bhardwaj R., Dorr R.T., Blanchard J. Approaches to reducing toxicity of parenteral anticancer drug formulations using cyclodextrins. J Pharm Sci Technol, 2000, V.54, p.233-239.

117. Lezcano M., Ai-Soufi W., Novo M., Rodriguez-Nunez E., Tato J.V. Complexation of several benzimidazole-type fungicides with alpha and beta-cyclodextrins. J Agric Food Chem, 2002, V.50, p. 108- 112.

118. Dufosse L., Souchon I., Feron G., Latrasse A., Spinnler H.E. In situ detoxification of the fermentation medium during gammadecalactone production with the yeast Sporidiobolus salmonicolor. Biotechnol Prog 1999, V. 15, p. 135-139.

119. Hedges R.A. Industrial applications of cyclodextrins. Chem Rev, 1998, V. 98, p. 2035-2044.

120. Gao S., Wang L. Application of cyclodextrin in environmental science. Huanjing Kexue Jinzhan, 1998, V.6, p. 80- 86.

121. Prasad N., Strauss D., Reichart G. Cyclodextrins inclusion for food, cosmetics and pharmaceuticals. European Patent 1,084,625, 1999.

122. Uekama K., Hirayama F., Irie T. Cyclodextrin drug carrier systems. Chem Rev, 1998, V. 98, p. 2045 -2076.

123. Saenger W. and Steiner T. Cyclodextrin inclusion complexes: host-guest interactions and hydrogen-bonding networks. Acta Cryst, 1998, V. A54, p. 798-805.

124. Bar R. Cyclodextrin aided bioconversions and fermentations. Trends Biotechnol, 1989, V. 7, p. 2- 4.

125. Szejtli J. Utilization of cyclodextrins in industrial products and processes. J. Mater. Chem., 1997, V. 7, № 4, p. 575-587.

126. Li X.-x., Wew Z., Kiao Kesheng, Wang M. Effect of p-cyclodextrin on growing characteristic of steroid biotransformation microorganisms. Tianjin Keji Daxhle Xuebao, 2006, V.21, №3, p. 1-4.

127. Schlosser D., Irrgang S., Shmauder H.P. Steroid hydroxylation with free and immobilized cells of Penicillium raistrickii in the presence of beta-cyclodextrin, Appl Microbiol Biotechnol., 1993, V. 39, №1, p. 16-20.

128. Jadoun J., Bar R. Microbial transformation in a cyclodextrin medium. Part 4. Enzyme in a microbial oxidation of cholesterol. Appl Microbiol Biotechnol, 1993, V. 40, p. 477-482.

129. Greenberg-Ofrath N., Terespolosky Y., Kahane I., Bar R. Cyclodextrins as carries of cholesterol and fatty acids in cultivation of Mycoplasmas. Appl Environ Microbiol, 1993, V. 59, 547-551.

130. Алехина T.M., Рыжкова B.M., Куракова B.B. и др. Микробиологическая трансформация соединений включения стероидов с p-циклодекстрином. Химико-фармацевтический журн., 1993, Вып. 4, с. 59-62.

131. Kumar R, Dahiya J. S., Singh D. and Nigam P. Biotransformation of cholesterol using Lactobacillus bulgaricus in a glucose-controlled bioreactor. Bioresour Technol, 2001, V. 78, №2, p. 209-211.

132. Alexander D.L., Fisher J.E., A convenient synthesis of 7 alpha-hydroxycholest-4-en-3-one by the hydroxypropyl-beta-cyclodextrin-facilitated cholesterol oxidase oxidation of 3beta, 7alpha-cholest-5-ene-3,7-diol. Steroids, 1995,V.60, №3, p. 290-294.

133. Чинчокар С.Б., Суходольская Г.В., Баклашова Т.Г., Кощеенко К. А. Особенности процесса 11 (3-гидроксилирования стероидных соединений мицелием Curvularia lunata ВКМ F-644 в присутствии циклодекстрина. Прикл. Биохим. Микробиол, 1992, т. 28, с. 685-693.

134. Van der Geize R., Hessels G., Dijkhizen L. Molecular and functional characterization of the kstD2 gene of Rhodococcus erythropolis SQ1 encoding a second 3-ketosteroiddehydrogenase isoensime. Microbiology, 2002, V. 148, № 10, p. 3285-3292.

135. Itagaki E., Hatta Т., Wakabayashi Т., Suzuki K. Spectral properties of 3-ketosteroid-delta 1-dehydrogenase from Nocardia corallina. Biochim. Biophys. Acta, 1990, V. 1040, №2, p. 281-286.

136. Ringold H.J., Hayano M., Stefanovic V. Concerning the stereochemistry and mechanism of the bacterial C-1,2 dehydrogenation of steroids. The Journal of biological chemistry, 1963, V. 238, p. 1960-1965.

137. Plesiat P., Grandguillot M., Harayama S., Vragar S., Michel-Briand Y. Cloning, sequencing and expression of the Pseudomonas testosteroni gene encoding 3-oxosteroid delta 1-dehydrogenase. Journal of bacteriology, 1991, V. 173, №22, p. 7219-7227.

138. Nikaido H., Jarlier V., Permeability of mycobacterial cell wall. Res. Microbial., 1991,V. 142, p. 437-441.

139. Szejtli J. Cyclodextrins and their inclusion complexes. Budapest, Hungary, 1982.

140. Miro A., Quaglia F., Giannini L., Cappello В., Immacolata La Rotonda M. Drug/Cyclodextrin Solid Systems in the Design of Hydrophilic Matrices: A Strategy to Modulate Drug Delivery Rate. Current Drug Delivery, 2006, V.3, Issue 4, p.373-378.

141. Huszcza E., Dmochowska-Gladisz J., Transformations of testosterone and related steroids in Absidia glauka culture. J. Basic Microbiol., 2003, V. 43, №2, p. 113-120.

142. Сайтон Д., Фотергилл А., Риналди M. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. «Мир» 2001, С. 468.

143. Al-Aboudi A., Mohammad М., Musharraf S.G., Choudhary М. I., Atta-ur-Rahman. Microbial transformation of testosterone by Rhizopus stolonifer and Fusarium lini. Natural Product Research, November 2008, V. 22, Is. 17, p. 1498- 1509.

144. Capek A., Hanc O., Tadra M. Microbial transformations of steroids. Publishing House of the Czechoslovak Academy of Sciences, Prague, 1966.

145. УТВЕРЖДАЮ Директор Центра «Биоинженерия» РАН Академи26 февраля 2010 года1. АКТ

146. О наработке анаболического препарата метандростенолона дляветеринарии.

Информация о работе

Дружинина, Анна Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Применение полимеров в микробиологических трансформациях стероидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы