Конверсия 3-кетостероидов Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д

Фокина, Виктория Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Конверсия 3-кетостероидов Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Конверсия 3-кетостероидов Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д"

На правах рукописи

Фокина Виктория Валерьевна

Конверсия 3-кетостероидов Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2003

Работа выполнена в лаборатории микробиологической трансформации органических соединений Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук М.В. Донова

доктор биологических наук профессор Л.А. Головлёва

кандидат биологических наук Н.Е. Войшвилло

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследова-

тельский химико-фармацевтический институт, Центр по химии лекарственных средств

Защита состоится «декабря 2003 года в 9 часов на заседании Совета по защите диссертаций Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан « 4 » ноября 2003 года.

Учёный секретарь

Совета по защите диссертаций

доктор биологических наук

В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Физиологическая активность 1(2)-дегидрированных стероидов определяет их широкое использование в терапии многих заболеваний в онкологии, дерматологии, для эффективного лечения больных ревматизмом, инфекционным неспецифическим полиартритом, бронхиальной астмой, различными аллергическими заболеваниями. В сравнении с 1(2)-насыщенными предшественниками 1(2)-дегидростероиды являются более эффективными и вызывают меньше побочных реакций, связанных с задержкой воды и натрия в организме (Машковский, 1997).

Известное с 50-х годов микробиологическое 1(2)-дсгидрирование стероидов является основой промышленных технологий получения преднизолона и других преднистероидов. Современное развитие Фарминдустрии ставит задачи повышения эффективности 1 (2)-дегидрирования известных 3-кетостероидов, а также разработки новых эффективных способов получения широкого ряда современных лекарственных средств, в том числе, фторированных кортикоидов, в синтезе которых большая роль отводится микробиологическому 1(2)-дегидрированию 3-кето-9(11)-ненасыщенных стероидов (Турута с соавт., 1992). В связи с этим, актуальным является изучение влияния структуры 3-кетостероидов на процесс их микробиологического 1(2)-дегидрирования, изучение взаимосвязи процесса 1(2)-дегидрирования с другими реакциями метаболизма 3-кетостероидов, и разработка способов интенсификации и повышения селективности процесса 1(2)-дегидрирования.

Выбор объекта исследований - культуры Nocardioides simplex В KM Ас-2033Д (Arthrobacter globiformis 193) обусловлен его высокой 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназной (3-КСД) активностью в отношении целого ряда стероидных субстратов: андростендиона, прогестерона, гидрокортизона, 6а-метилгидрокортизона, кортексолона и его 21-ацетата (Аринбасарова с соавт., 1995; Суходольская с соавт., 2000). Высокий биотехнологический потенциал штамма как продуцента стероидных 1 (2)-дегидроаналогов предусматривал уточнение его современного таксономического положения.

Состояние вопроса. Традиционно двойная связь между С1 и С2 в кольце А стероидов вводится либо на начальных, либо на конечных этапах синтеза.

Изучены особенности процесса дегидрирования- гидрокортизона, его 6а-

!рос. национальная ] библиотека 1

174 гй

метилированного производного, разработаны эффективные методы получения преднизолона и других дегидроаналогов (Аринбасарова с соавт., 1984; Аринбасарова с соавт., 1995). Исследованы свойства 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназы (3-КСД) у многих организмов (Nocardia corallina, Rhodococcm erythropolis, Arthrobacter simplex). Показано существование нескольких изоформ фермента различной локализации (Geize et al., 2002). На процессе биоконверсии гидрокортизона исследована взаимосвязь 1(2)-дегидрирования и 20р-восстановления у Arthrobacter globiformis (Medentsev et al, 1985).

Однако, литературные данные о 1(2)-дегидрировании 9(11)- и 9(11),16(17)-ненасыщенных 3-кетостероидов ограничены. Сообщалось о том, что процесс конверсии может сопровождаться нежелательной ароматизацией кольца А, либо деструкцией стероидного ядра (Wolf and Kominek, 1984). Данные о возможности биоконверсии ацетатных форм А4'^"'-3-кетостероидов в доступной литературе отсутствуют.

Показана высокая 3-КСД активность штамма "Arthrobacter globiformis 193" из рабочей коллекции лаборатории микробиологической трансформации органических соединений ИБФМ РАН в отношении гидрокортизона, 6а-метилгидрокортизона, и других стероидных субстратов (Аринбасарова с соавт., 1995).

Анализ диаминокислоты клеточной стенки показал, что штамм имеет LL-диаминопимелиновую кислоту, что отличает его от представителей рода Arthrobacter, для которых характерен пептидогликан A4 с лизином в качестве диаминокислоты. Представлялось актуальным определить соответствующее таксономическое положение штамма с использованием современных методов классификации микроорганизмов.

Биоконверсия многих стероидов осложнена их низкой растворимостью в водных средах. Так, растворимость гидрокортизона составляет менее 0.4 г/л, растворимость 9(11)-дегидрокортексолона и его ацетилированных форм - в несколько раз ниже. Предложены различные способы решения проблемы доступности стероидных субстратов клеточному биокатализатору, в том числе основанные на использовании органических растворителей и детергентов (Аринбасарова и Кощеенко, 1983; патент РФ 2042687, 1992). Одним из наиболее эффективных подходов является использование цшслодекстринов. Эти биосовместимые циклические олигосахариды образуют с гидрофобными стероидными соединениями комплексы включения, таким образом, оказывая на

стероиды солюбилизирующий эффект (Duchene, 1991). Эффективность использования циклодекстринов была показана для многих процессов конверсии стероидов, в том числе для 1(2)-дегидрирования гидрокортизона и ба-метилгидрокортизона (Кощеенко с соавг., 1992). Однако эффективность использования природных циклодекстринов (например, Р-циклодекстрина) для повышения эффективности биоконверсии имеет ограничения, связанные как с их растворимостью, так и с растворимостью их комплексов включения со стероидами (Fromming & Szejtli, 1994), поэтому наиболее целесообразным представляется использование в процессах биоконверсии водорастворимых модифицированных производных р-цюслодекстрина.

Осуществление 1(2)-дегидрирования 3-кетостероидов отмытыми клетками на буферной среде обеспечивает высокую скорость и селективность процесса, облегчает процедуру выделения и очистки целевого продукта, снижает риск контаминации. Однако эффективность такого подхода требует применения высокопроизводительных способов получения биомассы с высокой целевой активностью. Одним из таких приемов является получение уплотнённой культуры, обеспечивающее достижение высокой биомассы при сокращении числа стадий выращивания. В литературе описаны способы получения уплотнённых нокардиеподобных культур (Fass et al., 1995; Honda et al., 1998; Ikeda & Katsumata, 1999), однако, сведения о получении уплотнённых культур со стероидтрансформирующей активностью в литературе отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение конверсии Д4,9(П)-3-кетостероидов и их ацетилированных производных культурой Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д (Arthrobacter globiformis 193) и разработка способов получения их 1(2)-дегидроаналогов. В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Определение таксономического положения штамма "A. globiformis 193" с использованием современных методов классификации микроорганизмов.

2. Изучение возможности 1 (2)-дегидрирования ацетилированных Д4,9(11)-3-кетостероидов.

3. Исследование особенностей биоконверсии ацетилированных Д4,9(11)-3-кетостероидов в присутствии метилированного производного Р-циклодекстрина (МЦД).

4. Получение уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д с высокой стероид-1(2)-дегидрогеназной активностью.

5. Разработка методов получения 1(2)-дегидроаналогов Д4,9(П)-3-кетостероидов и их ацетилированных производных.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность микробиологического 1(2)-дегидрирования ацетилированных 3-кетостероидов, ненасыщенных по кольцу С и D. Исследованы особенности метаболизма 21-моно- и 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона культурой Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. Показано, что 1(2)-дегидрирование сопровождается дезацетилированием в положении 21 и 200-восстановлением. Впервые показана неферментативная миграция ацетильной группы из положения 17 в положение 21 при микробиологической конверсии 17а,21-диацетата А4'9*11 ^3-кетостероидов.

Изучены особенности микробиологического дезацетилирования 21-моно-и 17а,21-диацетатов А4,9(и)-3-кетостероидов, показан конститутивный характер стероидных эстераз Nocardioides simplex, а также их цитозольная и мембраносвязанная локализация.

Изучен биотехнологический потенциал бактерий рода Nocardioides в отношении 1(2)-дегидрирования стероидов и установлены преимущества использования штамма Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д, ранее классифицированного как Arthrobacter globiformis 193.

Исследованы особенности трансформации -кетостероидов в

присутствии химически модифицированных циклодекстринов. Показано, что ведение процесса в присутствии метилового эфира р-циклодекстрина обеспечивает полную конверсию 3-кетостероидов при высоких (5 г/л) концентрациях.

Разработан способ получения уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д с высокой 3-КСД активностью. Предложены эффективные методы получения 1(2)-дегидроаналогов Д4,9(11 '-З-кетостероидов.

Практическое значение работы. Определены условия эффективной конверсии клетками N. simplex ВКМ Ас-2033Д ацетатных форм 3-кетостероидов, ненасыщенных по кольцу С и D, и предложены эффективные микробиологические методы получения 21-ацетата прегна-1(2),4,9(11)-триен-17а,21-диол-3,20-диона, 17а-ацетата прегна-1(2),4,9(11)-триен-3,20-дион-

17а,21 -диола, 21 -ацетокси-прегна-1(2), 4,9(11),16(17)-тетраен-3,20-диона.

Применение разработанных методов при получении фторированных кортикостероидов позволит заменить многостадийный и низкоэффективный химический синтез этих соединений и повысить эффективность технологий получения лекарственных субстанций в целом.

Разработан способ получения уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д с высокой 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназной активностью. Применение способа позволит избежать затратного многоэтапного культивирования биомассы при масштабировании биотехнологий.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 5-ой Пущинской конференции молодых ученых (2001), International Symposium "Biocatalysis and Biotransformations" Biotrans-2001, (2001, Darmstadt), Biotrans-2003 (2003, Olomouc), на ежегодном конкурсе научных работ ИБФМ РАН (2001). Основные положения диссертации были представлены на совместном семинаре Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений и Лаборатории энзиматической деградации органических соединений. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 статьи и 3 тезисов.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 144 страницах, содержит 17 таблиц и 48 рисунков. Список литературы включает 178 наименований, из них 136 иностранных работ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы и условия культивирования. В работе использовали штаммы Nocardioides simplex ВКМ Ас-1118Т, N. jensenii ВКМ Ас-1878т, N. albus ВКМ Ас-805т, N. luteus ВКМ Ас-1246т, Nocardioides prauseri sp. nov. ВКМ Ac-806т, N. simplex ВКМ Ac-925, Nocardioides sp. BKM Ac-564, Nocardioides sp. ВКМ Ac-565 из коллекции ВКМ (ВКМ ИБФМ РАН) и штамм "Arthrobacter globiformis 193" из рабочей коллекции лаборатории микробиологической трансформации органических соединений ИБФМ РАН. Для культивирования

бактерий "Arthrobacter globiformis 193" использовали кукурузно-глкжозную среду (среда Г). Культивирование проводили в периодических условиях на роторной качалке (220 об/мин) при 28-ЗОС. Выращивание биомассы для хемотаксономических анализов осуществляли на пептонно-дрожжевой среде. Уплотнённую культуру N. simplex ВКМ Ас-2033Д получали в ферментере АНКУМ 2М, используя оборудование ПУ ИБФМ РАН. Для экспериментов с подпиткой в ферментере использовали среду с дрожжевым экстрактом (среда П). Подбор ростового субстрата проводили в колбах Эрленмейера с 50 мл среды П. В отдельных экспериментах дрожжевой экстракт заменяли кукурузным (10 г/л) (среда IIP. При подаче субстратов в ферментер в автоматическом режиме управление насосом осуществляли с помощью компьютера ШМ PC АТ-286 с программным пакетом SHEPHERD, разработанным в Институте математических проблем биологии РАН с инсталлированным в него алгоритмом ExpoDense (Ананьин с соавт., 1997), разработанным в ИБФМ РАН.

Идентификацию (реклассификацию) штамма "Arthrobacter globiformis 193" проводили на основе известных методов определения морфо-структурных (фазово-контрастная и электронная микроскопия), хемотаксономических (определение изомера диаминопимелиновой кислоты -Becker, 1964; препараты клеточных стенок - Schleifer & Kandier, 1972; состав жирных кислот - Evtushenko et al., 1989; полуколичественное определение менахинонов - Collins & Jones, 1981), филогенетических (ген 16S рРНК амплифицировали с универсальными праймерами 27f и 1522г, последовательность полученного фрагмента определяли с использованием набора ферментов Big Dye Terminator Kit (Perkin Elmer) на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI-310 (Perkin Elmer) в соответствии с предлагаемым фирмой протоколом; последовательность гена 16S рРНК с помощью программы CLUSTAL W (Tompson et al., 1994), построение филогенетического древа производили с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer & De Wächter, 1994), культуральных и физиолого-биохимических признаков (Методы общей бактериологии под ред. Герхарда,1984).

Индукцию 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназы проводили ацетатом кортизона (в некоторых экспериментах использовали гидрокортизон). В опытах по изучению индуцибельного характера 1(2)-стероидцегидрогеназы использовали хлорамфеникол. Биомассу отделяли от среды

центрифугированием, дважды отмывали буфером, готовили суспензию необходимой концентрации.

Фракционирование клеток производили по следующей методике: плотную суспензию клеток замораживали до -30°С и продавливали на ИБФМ-прессе, затем перемешивали с буфером и центрифугировали при 10000 х g в течение 15 мин. Супернатант отделяли и центрифугировали при 105000 х g в течение 40 мин. В эксперимент брали осадок, содержащий целые и поврежденные клетки (Ф1); осадок после второго центрифугирования, содержащий ЦПМ (Ф2); и надосадочную жидкость, содержащую цитозоль и фрагменты ЦПМ (ФЗ).

Конверсию 3-кетостероидов проводили в колбах Эрленмейера (750 мл). В 100 мл буфера вносили суспензию клеток и субстрат в виде тонко измельченного порошка. Инкубирование проводили на роторной качалке (220 об/мин) при 28-ЗОС0. В отдельных экспериментах трансформацию вели в присутствии метилированного производного p-циклодекстрина (МЦЦ), который вносили в молярном отношении к субстрату 2:1. Трансформацию 21-ацетоксипрегна 4,9(11), 16(17)-триен-3,20-диона клеточными фракциями: Ф1; Ф2 и ФЗ проводили в витаминных пробирках в вышеописанных условиях. Биоконверсию 21 -ацетата прегна-4,9( 11 )-диен-17а,21 -диол-3,20-диона проводили в ферментере АНКУМ 2М с рабочим объёмом 1.5 л.

Выделение и очистку метаболитов осуществляли методом препаративной ТСХ. Идентификацию метаболитов осуществляли методами ТСХ, ВЭЖХ, масс-спектрометрии и ('Н)-ЯМР-спектроскопии.

Анализ продуктов трансформации. Отбор проб проводили через равные промежутки времени. Из водного раствора стероиды экстрапаровали этиловым эфиром уксусной кислоты (5:1, об/об) и анализировали методом ТСХ на пластинах Silufol UV254 (Чехословакия) и Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия). Пластинку с нанесенными пробами и свидетелями помещали в хроматографическую камеру, содержащую систему бензол:ацетон 3:1 (об/об). После разделения стероидов проводили визуальную оценку продуктов биоконверсии на хемископе Desaga HP-UVIS (Германия) при 254 нм. Отдельные пробы анализировали спектрофотометрически и методом ВЭЖХ. Масс-спектрометрический (МС) анализ осуществляли на приборе Finnigan МАТ-8430 (Германия) при энергии ионизации 70 эВ.

('Н)-ЯМР-спектроскропия. Спектры ('Н)-ЯМР получали на спектрометре Unity +400 (Varían) при 400 МГц в CDCI3 в качестве растворителя. В качестве внутреннего стандарта использовали сигнал от следов СНСЬ в растворителе (8 7.24).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Идентификация (реклассификация) штамма

В результате комплексного изучения морфологических, хемотаксономических, филогенетических и физиолого-биохимических признаков штамма, ранее идентифицированного как "Arthrobacter globiformis 193" было установлено отсутствие жизненного цикла "кокк-палочка-кокк"; наличие LL-диаминопимелиновой кислоты в составе пептидогликана (АЗу-тип) клеточной стенки и менахинона MK-8(Ht) как основного хинона дыхательной цепи; преобладание насыщенных изо- и антеизо- разветвленных кислот в жирнокислотном профиле клеточной стенки при одновременном наличии туберкулостеариновой кислоты (Ме-19:0); также была установлена практически полная идентичность последовательности гена 16S рРНК с таковой для штамма N. simplex КСТС 9106т (рис. 1: на филогенетическом древе штаммы N. simplex ВКМ Ас-2033Д и Nocardioides simplex КСТС 9106т, являясь наиболее близкими между собой, входят в один кластер N. nitrophenolicus NSP 41т); и, наконец, подтверждена аналогичность физиолого-биохимических свойств исследуемого штамма и N. simplex ВКМ Ас-1118т. Таким образом, штамм, обладающий высокой 1(2)-стероиддегидрогеназной активностью, ранее известный как "Arthrobacter globiformis 193", был отнесен к роду Nocardioides и задепонирован как N. simplex ВКМ Ас-2033Д.

Исследование антибиотикорезистентности N. simplex ВКМ Ас-2033Д показало, что штамм устойчив (мкг/мл) к ампициллину (500), налидиксовой кислоте (50), фосфомицину (100), тетрациклину (20), гентамицину (10), стрептомицину (50), цефтазидиму (100), хетациллину (100). Полученная антибиотикограмма штамма является фенотипическим маркером культуры и может быть использована при масштабировании биотехнологического процесса.

Поскольку данные литературы о трансформации 3-кетостероидов представителями рода Nocardioides отсутствовали, мы исследовали способность ряда штаммов рода Nocardioides к биоконверсии гидрокортизона.

Нопдю копеп&з Ш 121т (У09159)

98Г

-АвгогтсгоЫит НаИ^юят КСТС 9576 т (АР005022)

_АеютюгоЫитегуфгеит N(^1. В-33811 (АР005021)

-МатЫсЫа аигагШасия ВС361Т(У18629)

NocardioidesJвnaвnii КСТС 9134 т (АР005006)

_^-ЫосагЛо^ а\Ш КСТС 9186 т (АР004988)

'-«осаШюШеаМеиа КСТС 9575 т (АР005007)

— ЫосапИсМев пЛгорЬепЫюиь МЭР41т (АР005024) 100^л/осэл/|О/с/ев итр/ех КСТС 9106 т (АР005009) ЫосаЫЫйез $1тр1ех В КМ Ас-2033Д

ЫосапйЫНезрШатт ШМВ 12834Т(АР110039)

100

' Ыосапкшдез ругкИгю1уЬсиз 034т (1161298)

Ыосап1Ыдв$ адиаЬсиэ 0ЭМ11439Т(Х94145)

Рис. 1. Филогенетическое древо, показывающее положение штамма ВКМ Ас-2033Д внутри рода ТЯосагйЫ^ и близких таксонов. Цифрами показаны величины показателя "ЫхЛ8й-ар"-анализа. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов.

Таблица 1. Трансформация гидрокортизона* в преднизолон бактериями

рода Nocаrdiodes

Штамм % конверсии продолжительность конверсии, час

N. ¡етепи ВКМ Ас-18781 0 96

N. а1Ьш ВКМ Ас-8051 0 96

ШсагйЫЗех Бр. ВКМ Ас-564 0 96

Мосагс1Мс1еь эр. ВКМ Ас-565 0 96

Nocardюides ргашеп зр. поу. ВКМ Ас-806 12 96

N. Шет ВКМ Ас-12461 0 96

N. БЫрЫ ВКМ Ас-925 87 4

N. втр1ех ВКМ Ас-11181 90 4

N. з1тр1ех ВКМ Ас-2033Д 92 2

* Исходная концентрация гидрокортизона — 5 г/л

Соотношение субстрат:биомасса для всех культур составляло 2:1 (вес сухой биомассы).

Сравнительный анализ показал, что к 1(2)-дегидрированию были способны штамм Nocardioides prauseri sp. nov. BKM Ас-806т и штаммы N. simplex, при этом максимальная активность, проявленная штаммами N. simplex BKM Ас-1118Т и N. simplex BKM Ас-925, более чем вдвое уступала активности исследуемого штамма N. simplex BKM Ас-2033Д (таблица 1). Не исключено, что применение современных таксономических критериев позволит отнести другие организмы, известные высокой 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназной активностью, к роду Nocardioides.

Биоконверсия 21-ацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона

При инкубации N. simplex Ас-2033Д с 21-ацетатом прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона (I) в среде были обнаружены 4 стероидных метаболита. После выделения и очистки методами препаративной ТСХ их структуры были определены методами МС и ('Н)-ЯМР-спектроскопии как 21-ацетат прегна-1(2),4,9(11 )-триен-17а,21 -диол-3,20-диона (II); прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-дион (Ш); прегна-1(2),4,9(11)-триен-17а,21-диол-3,20-дион (IV); прегна-1(2),4,9(11 >триен-17а,20(3,21 -триол-3-он (V).

На основании анализа структур и динамики накопления метаболитов была предложена схема биоконверсии 21-ацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона (рис. 2). Субстрат (I) подвергался 1 (2)-дегидрированию и дезацетилированию с образованием соединений П и Ш. Ацетилированный 1(2)-дегидроаналог (II) активно дезацетилировался с формированием 1(2)-дегидро-дезацетилированного продукта (IV). В его накоплении свою роль играло также 1 (2)-дегидрирование дезацетилированного интермедиата (Ш). Результатом реакции 20|}-восстановления соединения IV являлось накопление 20р-восстановленного 1(2)-дегидро-дезацетилированного производного (V).

Наличие 9(11)-двойной связи и 21-ацетатной группы значительно осложняло конверсию, обусловливало низкую скорость трансформации субстрата и его неполное превращение. Применение МЦЦ обеспечило значительную интенсификацию процесса. Оптимизация условий конверсии (биомассы, рН, концентрации субстрата и МЦЦ) позволила значительно повысить селективность процесса 1(2)-дегидрирования субстрата, скорость целевой реакции и получить 21-ацетат прегна-1(2),4,9(11)-триен-17а,21-диол-

3,20-диона (II) с выходом более 90% при исходной концентрации субстрата 5 г/л (рис. 3).

Рис. 2. Схема биоконверсии 21-ацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-

диона. Обозначения на схеме:

I - 21-ацетат прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона;

П - 21-ацетат прегна-1(2),4,9(11 )-триен-17а,21 -диол-3,20-диона;

Ш - прегна-4,9(11)-диен-17сс,21-диол-3,20-дион;

IV - прегна-1(2),4,9(11>триен-17а,21-диол-3,20-дион;

V - прегна-1 (2),4,9( 11 )-триен-17а,20Р,21 -триол-3-он.

Оптимизация параметров (концентрации растворенного кислорода, скорости подачи воздуха, скорости перемешивания) при проведении процесса в ферментере АНКУМ 2М обеспечила практически полную конверсию субстрата (I) за 3 часа. В результате испытаний способа микробиологического 1(2)-дегидрирования 21-ацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона (при нагрузке субстрата 5 г/л) индуцированными отмытыми клетками N. simplex ВКМ Ас-2033Д была продемонстрирована его эффективность на лабораторно-технологическом уровне с достижением заявленных показателей биоконверсии:

содержание 1(2)-дегидропроизводного (П) в культуральной жидкости составило 90-92% при степени конверсии субстрата 99% и продолжительности конверсии 3 часа. Продукт был получен в кристаллическом виде по разработанной для этого схеме выделения и очистки. Содержание основного вещества составило 98%, выход готового продукта составил 84% от загруженного субстрата. Способ рекомендован для создания технологии получения 1(2)-дегидрированных ацетилированных 9(11)-ненасыщенных 3-кетостероидов, являющихся предшественниками в синтезе фторзамещенных кортикоидов.

Время, часы

Рис. 3. Динамика биоконверсии 21-ацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона в оптимизированных условиях. Концентрация субстрата 5 г/л, биомасса 5 г/л (вес сухой биомассы), стероид:МЦД=1:2 (моль/моль). Обозначения стероидов, как на рис. 2.

Биоконверсия 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона

Биоконверсию 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона культурой N. simplex Ас-2033Д проводили в присутствии МИД, поскольку наличие двух ацетильных групп и 9(11)-двойной связи в его структуре обусловливало крайне низкую степень и скорость его биоконверсии в среде без МЦД. Структура основных метаболитов была определена с использованием масс-спектрометрии и ('Н)-ЯМР-спекгроскопии (рис. 4).

Как видно на рис. 4 и рис.7-а, начальным этапом биоконверсии являлось 1(2)-дегидрирование субстрата (I) с образованием 17а,21-диацетата прегна-1(2),4,9(11)-триен-17а,21-диол-3,20-диона (П), который подвергается дезацетилированию при С-21 с образованием 17а-ацетата (III). 17а-ацетат прегна-1(2),4,9(11)-триен-17а,21-диол-3,20-диона (III) конвертировался в

соответствующий 21-ацетат (IV). 21-Ацетат прегна-1(2),4,9(11)-триен-3,20-диона вновь подвергался дезацетилированию с образованием свободной формы 1(2)-дегидроаналога (V), который частично восстанавливался в 20-м положении с образованием 20р-восстановленного производного (VI).

Рис. 4. Схема биоконверсии 17а,21-диацетата прегна-4,9( 11 )-диен-17а,21 -диол-

3,20-диона.0бозначения на схеме:

I-17а,21 -диацетат прегна-4,9( 11 )-диен-17а,21 -диол-3,20-диона;

II-17а,21 -диацетат прегна-1 (2),4,9( 11 )-триен-17а,21 -диол-3,20-диона;

Ш-17а-ацетат прегна-1(2),4,9(11)-триен-17а,21-диол-3,20-диона;

IV-21-ацетат прегна-1(2),4,9(11)-триен-17а,21-диол-3,20-диона;

V-прегна-1 (2),4,9( 11 )-триен-17а,21 -диол-3,20-дион;

М-прегна-1 (2),4,9(11 )-триен-17а,20р,21-триол-З-он.

Таким образом, наряду с 1(2)-дегидрированием, 21-дезацетилированием и 20р-восстановлением при осуществлении биоконверсии 17а,21-диацетата отмечалась миграция ацетильной группировки из положения 17 в 21. Образование 21-ацетата из 17а-ацетата упоминалось в литературе для ацетатов гидрокортизона и преднизолона, однако, механизм реакции не был исследован (Браэзоу, е1 а1., 1983; Vlahov, й а1., 1981). Мы предположили неферментативный

характер данной реакции. Для его доказательства был поставлен модельный эксперимент с 17а-ацетатом вещества Б Рейхштейна (прегн-4-ен-17а,21-диол-3,20-дион).

Время,часы

Рис. 5. Неферментативное образование 21-ацетата из 17а-ацетата вещества Б Рейхштейна.

В ходе реакции, осуществленной в условиях, соответствующих биоконверсии (в присутствии МЦЦ), но без микробных клеток, наблюдалось образование 21-ацетата из 17а-ацетата вещества Б Рейхштейна, что подтверждало неферментативную миграцию ацильной группировки (рис. 5).

Как показано нами для 17а-ацетата вещества Б Рейхштейна, неферментативная ацильная миграция строго зависела от величины рН (рис. 5). При кислых значениях данная реакция проявлялась слабо, она увеличивалась при увеличении рН и при щелочных значениях наблюдалась полная конверсия 17а-ацетата в 21-ацетат вещества Б Рейхштейна. При щелочных значениях рН наблюдалось также образование свободной формы вещества в Рейхштейна, что свидетельствовало о неферментативном дезацетилировании 21-ацетата вещества 8 Рейхштейна в среде с МЦЦ. В литературе были описаны случаи, когда производные циклодекстринов активировали перегруппировки и неферментативный катализ веществ нестероидной природы (Бге^Н., 1991). Нами впервые показана неферментативная миграция 17а-ацетатной группировки в положение 21 стероида и доказана ее зависимость от величины рН, а также образование свободной формы стероида из его 21-ацетата в среде с добавками МЦЦ.

рН 6.2

■ типнип/иУаУ!

ае юо т 2 80 Ё 60 +.

Цкл

27 Часы

рН 7.2

100 Т 80-

Ё 60-

I 40 I 20

4 ж д

20 27 Часы

рН 8.0

100 у

2 80 +

£ 60 --

20 с 0

4 .>1 .Л

27 Часы

Рис. 6. Биоконверсия 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-3,20-дион-17а,21-диола при изменении рН. Обозначения стероидов, как на рис. 4.

Набор и количество продуктов микробной конверсии 17,21-диацетата 9(11)-дегидростероида также существенно менялись в зависимости от величины рН (рис. 6).

Оптимизация процесса включала исследование влияния концентрации субстрата и МЦД, рН, биомассы на скорость и полноту конверсии субстрата, селективность образования и выход 17а-ацетатапрегна-1(2),4,9(11)-триен-3,20-дион-17а,21-диола. В найденных оптимальных условиях: при рН 5.8-6.0,

концентрации субстрата (I) 5 г/л, биомассе 20 г/л, в присутствии МЦД, за 20 часов выход этого продукта достигал 90-92% (рис. 7-6). Содержание побочных продуктов - прегна-1(2),4,9(11)-триен-3,20-дион-17а,21-диола (V) и его 20р-восстановленного производного (VI) в сумме не превышало 7-10%.

а) б)

Рис. 7. Сравнение биоконверсии 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона до (а) и после (б) оптимизации. Обозначения стероидов, как на рис. 4.

Биоконверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона

Схема биоконверсии 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона культурой N. simplex В КМ Ас-2033Д, предложенная нами на основании идентификации метаболитов и анализа динамики их накопления, представлена на рис. 8. Отличительной особенностью биоконверсии этого субстрата являлось отсутствие образования 20р-восстановленных производных, вероятно, вследствие наличия 16(17)-двойной связи в молекуле стероида.

Отсутствие 20р-восстановления обусловило возможность использования биоконверсии этого субстрата в качестве удобного объекта для исследования взаимосвязи процессов 1(2)-дегидрирования и дезацетилирования. Об индуцибельном характере 3-кетостероид-1 (2)-дегидрогеназы и ее мембранной локализации хорошо известно, и наши исследования подтвердили этот факт. Данные литературы об индуцибельности и локализации стероидных эстераз немногочисленны и противоречивы.

В результате комплексного исследования влияния различных факторов индукции: времени внесения индуктора, добавок ингибитора синтеза белка,

индукторов различного строения (табл. 2) при использовании в экспериментах различных клеточных фракций с добавлением искусственных акцепторов электронов (рис. 9) было показано, что в отличие от 1(2>дегшгоогеназы. стероид-эстеразы ' штамма N. simplex ВКМ Ас-2033Д являются конститутивными ферментами и представлены цитозоль-растворимыми и мембрано-ассоциированными формами.

Рис. 8. Схема биоконверсии 21 -ацетокси-прегна-4,9( 11),16(17)-триен-3,20-диона.Обозначения на схеме: 1-21 -ацетокси-прегна-4,9( 11), 16( 17)-триен-3,20-дион; П-21-ацетокси-прегна-1(2),4,9(11),16(17)-тетраен-3,20-дион; Ш-прегна-4,9(11), 16(17)-триен-3,20-дион; 1У-прегна-1 (2),4,9( 11), 16( 17)-тетраен-3,20-дион.

Одновременное наличие нескольких видов стероид-эстераз было показано для родственных микроорганизмов (Лестровая с соавт., 1971). Из таблицы 2 следует, что, как индуцированные, так и неиндуцированные клетки на начальном этапе конверсии в равной степени обладали эстеразной активностью и конвертировали субстрат в дезацетилированный аналог Ш.

Таблица 2. Влияние использования индуцированных и неиндуцированных клеток на конверсию 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона штаммом N. simplex ВКМ Ас-2033Д

Варианты Содержание соединений (%) П, Ш and IV за

20 мин 40 мнн 2.5 час 6 час

П Ш IV П Ш IV II Ш IV П IHllV

Индуцированные клетки

1. Индукция в течение 24 час 40 5 8 62 10 16 8 10 70 0 0 88

2. Индукция в течение 7 час 10 6 5 20 8 8 30 12 15 9 7 72

3. Индукция в течение 7 час в присутствии хлорамфеникола 0 5 0 0 8 0 6 40 7 6 20 62

Неиндуцированиые клетки

4. Среда конверсии содержит МЦЦ 0 6 0 0 10 0 б 40 8 4 16 67

5. Среда конверсии с МЦ Ц и хлорамфениколом 0 6 0 0 11 0 0 57 0 0 69 5

6. Среда конверсии не содержит МЦЦ 0 6 0 0 11 0 0 60 0 0 67 5

Индуцированные клетки, в отличие от неиндуцированных, а также индуцированных в присутствии хлорамфеникола, обладали 1(2)-дегидрогеназной активностью и накапливали ацетилированное 1(2)-дегидропроизводное П. Индукция субстратом (I) 1(2)-дегидрогеназной системы занимала более 2-х часов, соединение П было зафиксировано лишь после 2.5 часов конверсии. Внесение индуктора одновременно с засевом культуры приводило к возрастанию 1(2)-дегидрогеназной активности в 4 раза по сравнению с культурой, которую индуцировали после 17 часов роста. Одновременное добавление индуктора и хлорамфеникола после 17-ти часов роста не влияло на эстеразную активность, но подавляло активность 1(2)-дегадрогеназы. В присутствии хлорамфеникола неиндуцированиые клетки сохраняли лишь эстеразную активность, 1(2)-дегидрогеназная активность проявлялась в незначительной степени на поздних сроках конверсии, о чем свидетельствовало появление следовых количеств соединения ГУ.

Клеточный дебрнс (Ф1)

1 2 3 4 5 Время, часы

а)

Мембранная фракция (Ф2)

3 80 -

60 -

о о. 40 --

В 20 -0 #

1 2 3 4 5 6 Время, часы

а)

Цитозольная фракция (ФЗ)

38 100 *

з" 80

5 60 -

о о. 40 -

20 -

Рис. 9. Наличие 1(2)-дегидрогеназной и дезацетилирующей активности у различных клеточных фракций без добавления (а) и с добавлением (б) ФМС. Обозначения стероидов, как на рис. 8. Ф1 « 2 г/л, Ф2 « 500 мг/мл, ФЗ « 1 г/л.

В найденных оптимальных условиях: при концентрации субстрата 1 г/л, биомассе 33 мг/мл, в присутствии МЦЦ и ФМС биоконверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона в его 1(2)-дегидроаналог осуществлялось с выходом 92% (рис. 10-6).

0 5 10 15 20 0 1 2 3 4 5 6

Время, часы Время, часы

а) б)

Рис. 10. Сравнение динамики конверсии 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона клетками N. simplex ВКМ Ас-2033Д до (а) и после (б) оптимизации. Обозначения стероидов, как на рис. 8.

Данные, демонстрирующие эффективную микробиологическую конверсию ацетатных форм Л4,9<11) и A4'WI),16(17) 3-кетостеридов, при высоких концентрациях субстрата, значительно превышающих предел их растворимости, были получены впервые. На их основе нами созданы способы микробиологического одностадийного получения ацетшшро ванных 1(2)-дегидрированных, ненасыщенных по кольцу С и D, предшественников фторзамещенных кортикоидов. По сравнению с известными многостадийными химическими методами синтеза 1(2),4,9(11)-триеновых стероидных структур с выходом от 11 до 68% (Cirilo et al., 1993; Castro et al., 1994-1995) предложенные микробиологические способы имеют неоспоримые преимущества.

Получение уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д

Применение метода уплотнённых культур позволяет сократить число этапов выращивания биомассы, что важно при масштабировании биотехнологических процессов. Особенно оправданно его использование в процессах, осуществляемых отмытыми клетками, когда эффективность биоконверсии нивелируется затратами на многоэтапное культивирование.

Для культивирования штамма N. simplex ВКМ Ас-2033Д мы использовали способ периодического культивирования с автоматическим режимом подпитки. Для управления скоростью подачи субстрата (и ферментацией в целом) был применен алгоритм ExpoDense, основанный на модели экспоненциального роста (Ananjin et al., 1991) и дававший хорошие результаты как при управлении с обратной связью (Ананьин с соавт., 1997), так и без обратной связи (Lee et al., 1999).

pQ,%; S, r

X, г/л

Рис. 11. Динамика основных параметров культивирования уплотнённой культуры N. simplex. Фаза I - управление по алгоритму ExpoDense без обратной связи,

фаза П - управление по алгоритму ExpoDense с обратной связью с рОг-Обозначения кривых:

1 - биомасса, X;

2 - количество этанола, S;

3 - растворенный кислород, р02.

В результате комплексного изучения влияния таких параметров культивирования, как природа ростового субстрата, рН, уровень растворенного кислорода, различные факторы индукции и режимы автоматического управления была получена биомасса с высоким объёмным выходом, обладающая высокой 1(2)-стероиддегидрогеназной активностью (рис. 11).

Среди нокардиеподобных культур, для которых была получена плотность биомассы от 15-20 до 25-37 г/л, микроорганизмы, способные трансформировать стероиды, не использовались. Нами впервые получена уплотнённая культура N. simplex ВКМ Ас-2033Д объёмным выходом 21 г/л, обладающая высокой 1(2)-стероиддегидрогеназной активностью. Разработанный нами метод рекомендован для использования при масштабировании процессов микробиологического 1(2)-дегидрирования 3-кетостероидов.

Результаты, полученные при изучении биоконверсии ацетилированных ненасыщенных по кольцу С и D 3-кетостероидов, а также метод получения уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д, обладающей высокой стероид-1(2)-дегидрогеназной активность, открывают перспективы их использования при создании и масштабировании промышленных технологий производства фторированных кортикостероидов.

ВЫВОДЫ

1. На основании комплексного изучения морфоструктурных, биохимических и филогенетических признаков штамм "Arthrobacter globiformis 193" реклассифицирован как Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. Установлены его преимущества как эффективного биокатализатора процессов 1(2)-дегидрирования 3-кетостероидов перед другими представителями рода Nocardioides.

2. Показана возможность микробиологического получения 1(2)-дегидроаналогов 3-кетостероидов, ненасыщенных по кольцу С и D, и их ацетилированных производных. Найдены условия, обеспечивающие селективное получение 1(2)-дегидроаналогов с выходом выше 90% при концентрациях субстратов, значительно превышающих пределы их растворимости (свыше 5 г/л).

миграция ацетильной группы из положения 17 в положение 21 при микробиологической трансформации 17сс,21-диацетата стероида.

4. Изучены особенности конверсии 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона N. simplex ВКМ Ас-2033Д. Показано, что в отличие от 3-кетостероид-1 (2)-дегидрогеназ, стероид-эстеразы являются конститутивными ферментами. Установлена их цитозольная и мембраносвязанная локализация.

5. Изучены особенности 1(2)-дегидрирования 3-кетостероидов в присутствии химически модифицированных циклодекстринов. Показано преимущество процесса одностадийного микробиологического способа получения ацетилированных 1(2)-дегидропроизводных ненасыщенных по кольцу С и D 3-кетостероидов по сравнению с известным химическим методом.

6. Впервые разработан метод выращивания уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д. Метод обеспечивает получение биомассы до 21 г/л с сохранением высокой стероид-1(2)-дегидрогеназной активности.

7. Разработаны микробиологические методы получения 21-ацетата прегна-1(2),4,9(11 )-триен-17а,21 -диол-3,20-диона, 17а-ацетата прегна-1(2),4,9(11)-триен-3,20-дион-17а,21-диола, 21-ацетокси-прегаа-1(2),4,9(11),16(17)-тетраен-3,20-диона - интермедиатов синтеза фторированных кортикостероидов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Victoria V. Fokina and Marina V. Donova. 21-Acetoxy-pregna-4(5),9(l 1), 16(17)-triene-21-ol-3,20-dione conversion by Nocardioides simplex VKM Ac-2033D. J. Steroid Biochem. and Mol. Biol. 2003, V. 87, N 4-5, pp. 434-439.

2. Victoria V. Fokina and Marina V. Donova. 21-Acetoxy-pregna-4(5),9(l 1),16(17)-triene-21-ol-3,20-dione bioconversion by Nocardioides simplex VKM Ac-2033D. Abstracts of Biotrans-2003 Conference in Olomouc, June 28-July 3 2003, Chem. listy 97 (6), 325-326,2003, pp. 454-455.

3. V.V. Fokina. G.V. Sukhodolskaya, B.P. Baskunov, K.F. Turchin, G.S. Grinenko, M.V. Donova. Microbial conversion of pregna-4,9(ll)-diene-17a,21-diol-3,20-dione acetates by Nocardioides simplex VKM Ac-2033D. Steroids, 2003, V. 68, N. 5, pp. 415-421.

4. B.B. Фокина, Г.В. Суходольская, C.A. Гулевская, Е.Ю. Гавриш, Л.И. Евтушенко, М.В. Донова. 1(2)-Дегидрирование стероидных субстратов штаммом Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. Микробиология, 2003, том 72, номер 1, с. 33-39.

5. В.М. Ананьин, В .В. Фокина. Г.В. Суходольская, М.В. Донова. Получение уплотненной культуры Nocardioides sp. Прикладная биохимия и микробиология, 2002, том 38, номер 6, с. 664-668.

6. V.Fokina, and M.Donova. 1(2)-Dehydrogenation of acetylated 9(ll)-dehydro cortexolone derivatives by Nocardioides sp. Abstracts of Biotrans-2001 Conference in Darmshtadt, 2-7 September 2001, p. 442.

7. Фокина B.B.. Донова M.B. 1(2)-дегидрирование ацетилированных производных 9(11)-дегидрокортексолона бактериями Nocardioides sp. Тезисы 5-ой конференции молодых ученых, Пущино, 2001, с. 182.

Принято к исполнениюЗО /10/003 Заказ № 411

Исполнено 31/10/2003 Тираж.60 экз.

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 318-40-68 \vww.autoreferat ги

Q.OO? - А

Р 17486

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фокина, Виктория Валерьевна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Биоконверсия 9( 11 )-дегидро-3-кетостероидов

2.2. Микробиологическое 1(2)-дегидрирование 3-кетостероидов

2.2.1. Распространенность 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназной (3-КСД) 13 активности среди микроорганизмов

2.2.2. Свойства 3-КСД

2.2.3. Сходство строения и механизма действия 3-КСД и других дегидрогеназ

2.2.4. Механизм 1 (2)-дегидрирования 3-кетостероидов на примере 3-КСД 19 Nocardia corallina

2.2.5. Субстратная специфичность 3-КСД

2.2.6. Локализация 3-КСД

2.2.7. Связь 3-КСД с другими ферментными системами клетки

2.3. Реклассификация штаммов рода Arthrobacter

2.3.1. Современная систематика микроорганизмов

2.3.2. Признаки, используемые для классификации и идентификации 26 актиномицетов

2.3.3 Переописание штаммов, ранее отнесенных к роду Arthrobacter

2.4 Биоконверсия труднорастворимых субстратов

2.4.1. Конверсия стероидных субстратов в микрокристаллической форме

2.4.2. Использование специальных реакторов для биоконверсии

2.4.3. Использование органических растворителей

2.4.4. Использование полимеров

2.4.5. Использование циклодекстринов и их производных 33 2.5. Культивирование микроорганизмов 39 2.5.1 Режим с периодической подпиткой 39 2.5.2. Варианты стратегии управлением режима с подпиткой

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 42 3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1.1. Реактивы

3.1.2. Микроорганизмы и методы их культивирования 42 3.1.2.1. Штаммы, использованные в работе 42 3.1.2.2 Среды для выращивания микроорганизмов

3.1.2.3. Условия культивирования "Arthrobacter globiformis 193"

3.1.2.4. Фракционирование (получение ЦПМ)

3.1.2.5. Трансформация стероидных субстратов

3.1.3. Микроскопия

3.1.3.1. Электронная микроскопия

3.1.3.2. Световая микроскопия

3.1.4. Аналитические методы

3.1.4.1. Анализ продуктов трансформации

3.1.4.2. Масс-спектрометрический анализ

3.1.4.3. ЯМР-спектрометрия

3.1.4.4. Определение концентрации белка

3.1.4.5. Определение растворимости стероидов

3.1.5. Таксономические методы

3.1.5.1. Определение чувствительности к антибактериальным препаратам

3.1.5.2. Определение способности утилизировать сахаро-спирты в качестве 49 единственного источника углерода

3.1.5.3. Определение гидролазной активности

3.1.6. Определение основных хемотаксономических признаков

3.1.6.1. Очищенные препараты клеточных стенок

3.1.6.2. Определение изомера диаминопимелиновой кислоты

3.1.6.3. Определение аминокислотного состава полученных препаратов 50 пептидогликанов

3.1.6.4. Полуколичественное определение менахинонов

3.1.6.5. Состав жирных кислот

3.1.7. Определение последовательности гена 16S рРНК

3.1.8. Филогенетический анализ 51 3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.2.1. Ре-идентификация штамма "Arthrobacter globiformis 193"

3.2.2. Биоконверсия ацетилированных 9(11 )-дегидро-3-кетостероидов

3.2.2.1. Конверсия прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона

3.2.2.2. Конверсия 21 -ацетата прегна-4,9( 11 )-диен-17а,21 -диол-3,20-диона

3.2.2.3. Конверсия 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона

3.2.2.4. Конверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона

3.2.3. Выращивание уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д

4. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конверсия 3-кетостероидов Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д"

Актуальность проблемы.

Физиологическая активность 1(2)-дегидрированных стероидов определяет их широкое использование в терапии многих заболеваний в онкологии, дерматологии, для эффективного лечения больных ревматизмом, инфекционным неспецифическим полиартритом, бронхиальной астмой, различными аллергическими заболеваниями. Иммунодепрессивные свойства этих препаратов используют при трансплантации органов и тканей для подавления реакции отторжения. В сравнении с 1(2)-насыщенными предшественниками 1(2)-дегидростероиды являются более эффективными и вызывают меньше побочных реакций.

Известное с 50-х годов микробиологическое 1(2)-дегидрирование стероидов является основой промышленных технологий получения преднизолона и других преднистероидов. Однако современное развитие Фарминдустрии ставит задачи повышения эффективности процессов 1(2)-дегидрирования 3-кето-стероидов, вводя при этом жесткие ограничения по применению токсических реагентов и растворителей, а также разработки эффективных способов получения широкого ряда современных лекарственных средств, в том числе, галогенированных кортикоидов, в синтезе которых большая роль отводится микробиологическому 1(2)-дегидрированию 3-кето-9(11)-ненасыщенных стероидов.

В связи с этим, актуальным является изучение влияния структурной модификации 3-кетостероидов на процесс их микробиологического 1(2)-дегидрирования, изучение взаимосвязи процесса 1(2)-дегидрирования с другими реакциями метаболизма 3-кетостероидов, разработка способов интенсификации и повышения селективности процесса 1(2)-дегидрирования.

Выбор объекта исследований - культуры Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д (Arthrobacter globiformis 193) обусловлен его высокой 3-КСД активностью в отношении широкого ряда стероидных субстратов: андростендиона, прогестерона, гидрокортизона, ба-метилгидрокортизона, кортексолона и его 21-ацетата (Суходольская с соавт., 2000; Аринбасарова с соавт., 1995). Высокий биотехнологический потенциал штамма как продуцента стероидных 1(2)-дегидроаналогов предусматривал уточнение его таксономического положения.

Состояние вопроса.

Традиционно двойная связь между С1 и С2 в кольце А стероидов вводится либо на начальных, либо на конечных этапах синтеза (Bork et al., 1968). Изучены особенности процесса дегидрирования гидрокортизона, его ба-метилированного производного, разработаны эффективные методы получения преднизолона и других дегидроаналогов (Аринбасарова с соавт., 1984; Аринбасарова с соавт., 1995). Исследованы свойства 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназы (3-КСД) у многих организмов (Nocardia corallina, Rhodococcus erythropolis, Arthrobacter simplex). Показано существование нескольких изоформ фермента различной локализации (Geize et al., 2002). На процессе биоконверсии гидрокортизона исследована взаимосвязь 1(2)-дегидрирования и 20р-восстановления у Arthrobacter globiformis (Medentsev et al, 1985).

Однако, литературные данные о 1(2)-дегидрировании 9(11)- и 9(11), 16(17)-ненасыщенных 3-кетостероидов ограничены. Сообщалось о том, что процесс конверсии может сопровождаться нежелательной ароматизацией кольца А, либо деструкцией стероидного ядра (Wolf and Kominek, 1984). Данные о возможности биоконверсии ацетатных форм Д4,9(||)-3-кетостероидов в доступной литературе отсутствуют.

Показана высокая 3-КСД активность штамма "Arthrobacter globiformis 193" из рабочей коллекции лаборатории микробиологической трансформации органических соединений ИБФМ РАН в отношении гидрокортизона, ба-метилгидрокортизона, и других стероидных субстратов (Аринбасарова с соавт., 1995).

Анализ диаминокислоты клеточной стенки показал, что штамм имеет LL-диаминопимелиновую кислоту, что отличает его от представителей рода Arthrobacter, для которых характерен пептидогликан А4 с лизином в качестве диаминокислоты. Представлялось актуальным определить соответствующее таксономическое положение штамма с использованием современных методов классификации микроорганизмов.

Биоконверсия многих стероидов осложнена их низкой растворимостью в водных средах. Так, растворимость гидрокортизона составляет менее 0.4 г/л, растворимость 9(11 )-дегидрокортексолона и его ацетилированных форм - в несколько раз ниже. Предложены различные способы решения проблемы доступности стероидных субстратов клеточному биокатализатору, в том числе основанные на использовании органических растворителей и детергентов (Аринбасарова и Кощеенко, 1983; Кощеенко с соавт., 1995). Одним из наиболее эффективных подходов является использование циклодекстринов. Эти биосовместимые циклические олигосахариды образуют с гидрофобными стероидными соединениями комплексы включения, таким образом, оказывая на стероиды солюбилизирующий эффект (Duchenc, 1991). 6

Эффективность использования циклодекстринов была показана для многих процессов конверсии стероидов, в том числе для 1(2)-дегидрирования гидрокортизона и 6а-метилгидрокортизона (Кощеенко с соавт., 1995). Однако эффективность использования природных циклодекстринов (например, Р-циклодекстрина) для повышения эффективности биоконверсии имеет ограничения, связанные как с их растворимостью, так и с растворимостью их комплексов включения со стероидами (Fromming and Szejtli, 1994), поэтому наиболее целесообразным представляется использование в процессах биоконверсии водорастворимых модифицированных производных Р-циклодекстрина.

Осуществление 1 (2)-дегидрирования 3-кетостероидов отмытыми клетками на буферной среде обеспечивает высокую скорость и селективность процесса, облегчает процедуру выделения и очистки целевого продукта, снижает риск контаминации. Однако эффективность такого подхода требует применения высокопроизводительных способов получения биомассы с высокой целевой активностью. Одним из таких приемов является получение уплотнённой культуры, обеспечивающее достижение высокой биомассы при сокращении числа стадий выращивания. В литературе описаны способы получения уплотнённых нокардиеподобных культур (Fass et al., 1995; Honda et al., 1998; Ikeda and Katsumata, 1999), однако, сведения о получении уплотнённых культур со стероидтрансформирующей активностью в литературе отсутствуют.

Цель и задачи работы.

Целью данной работы являлось изучение конверсии Д4,9(П'-3-кетостероидов и их ацетилированных производных культурой Nocardioides simplex ВКМ Лс-2033Д {Arthrobacter globiformis 193) и разработка способов получения их 1(2)-дегидроаналогов.

В связи с этим ставились следующие задачи:

2. Изучение возможности 1 (2)-дегидрирования ацетилированных Д4,9(П)-3-кетостероидов.

3. Исследование особенностей биоконверсии ацетилированных Д4-9<||)-3-кетостероидов в присутствии метилированного производного Р-циклодекстрина (МЦД).

4. Получение уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д с высокой стероид-1 (2)-дегидрогеназной активностью.

5. Разработка методов получения 1 (2)-дегидроаналогов Д49("'-3-кетостероидов и их ацетилированных производных.

Научная новизна работы.

Впервые показана возможность микробиологического 1(2)-дегидрирования ацетилированных 3-кетостероидов, ненасыщенных по кольцу С и D. Исследованы особенности метаболизма 21-моно- и 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21диол-3,20-диона культурой Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. Показано, что 1(2)дегидрирование сопровождается дезацетилированием в положении 21 и 20(3восстановлением. Впервые показана неферментативная миграция ацетильной группы из положения 17 в положение 21 при микробиологической конверсии 17а,21-диацетата д4,9< 11 >3-кехостероидов.

Изучены особенности микробиологического дезацетилирования 21-моно- и 17а,21-диацетатов А4'9( 11-3-кетостероидов, выявлен конститутивный характер стероидных эстераз Nocardioides simplex, а также их цитозольная и мембраносвязанная локализация.

Исследованы особенности трансформации Д4,9(П-3-кетостероидов в присутствии химически модифицированных циклодекстринов. Показано, что ведение процесса в присутствии метилового эфира p-циклодекстрина обеспечивает полную конверсию 3-кетостероидов при высоких (5 г/л) концентрациях.

Практическая значимость работы.

Определены условия эффективной конверсии клетками N. simplex ВКМ Ас-2033Д ацетатных форм 3-кетостероидов, ненасыщенных по кольцу С и D, и предложены эффективные микробиологические методы получения 21-ацетата прегна-1(2),4,9(11)-триен-17а,21-диол-3,20-диона, 17а-ацетата прегна-1(2),4,9(11)-триен-3,20-дион-17а,21 -диола, 21 -ацетокси-прегна-1 (2),4,9( 11), 16( 17)-тетраен-3,20-диона.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 5-ой Пущинской конференции молодых ученых (2001), International Symposium "Biocatalysis and Biotransformations" Biotrans-2001, (2001, Darmstadt), Biotrans-2003 (2003, Olomouc), на ежегодном конкурсе научных работ ИБФМ РАН (2001).

Основные положения диссертации были представлены на совместных семинарах Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений и Лаборатории энзиматической деградации органических соединений.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 статьи и 3 тезисов.

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 144 страницы машинописного текста, 17 таблиц и 48 рисунков. Библиография включает 179 наименований, из них 137 иностранных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Фокина, Виктория Валерьевна

4. ВЫВОДЫ

2. Показана возможность микробиологического получения 1 (2)-дегидроаналогов 3-кетостероидов, ненасыщенных по кольцу С и D, и их ацетилированных производных. Найдены условия, обеспечивающие селективное получение 1 (2)-дегидроаналогов с выходом выше 90% при концентрациях субстратов, значительно превышающих пределы их растворимости (свыше 5 г/л).

3. Изучены особенности конверсии 21-ацетата и 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-3,20-дион-17а,21-диола N. simplex ВКМ Ас-2033Д. Показано, что 1(2)-дегидрирование сопровождается дезацетилированием и 20Р-восстановлением стероидов. Впервые установлена неферментативная миграция ацетильной группы из положения 17 в положение 21 при микробиологической трансформации 17а,21-диацетата стероида.

4. Изучены особенности конверсии 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона N. simplex ВКМ Ас-2033Д. Показано, что в отличие от 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназ, стероид-эстеразы являются конститутивными ферментами. Установлена их цитозольная и мембраносвязанная локализация.

6. Впервые разработан метод выращивания уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д. Метод обеспечивает получение биомассы до 21 г/л с сохранением высокой стероид-1 (2)-дегидрогеназной активности.

7. Разработаны микробиологические методы получения 21-ацетата прегна-1(2),4,9(11)-триен-17а,21-диол-3,20-диона, 17а-ацетата прегна-1(2),4,9(11)-триен-3,20-дион-17а,21-диола, 21-ацетокси-прегна-1(2),4,9(11),16(17)-тетраен-3,20-диона -интермедиатов синтеза фторированных кортикостероидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фокина, Виктория Валерьевна, Пущино

1. Редикульцев Ю.В., Кощеенко К.А., Скрябин Г.К., Литвиненко JI.A., Борман Е.А., Суходольская Г.В., Меньшова Н.И., Гриненко Г .С., Корзинкина Н.А. 1985. Способ получения преднизолона. А.С. СССР 1471561.

2. Агре Н.С. 1986. Систематика термофильных актиномицетов. Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 132 с.

3. Алехина Т.М, Рыжкова В.М., Гусарова Т.И, Куракова В.В, Клубничкина Г.А, 1993. Микробиологическая трансформация соединений включения стероидов с Р-циклодекстрином. Химико-фармацев. журнал. Вып. 4. С. 59-62.

4. Ананьин В.М., Боев А.В., Вельков В.В. 1997. Два подхода к получению уплотнённых культур рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae. Прикл. Биохим. и микробиол. Т. 33. N. 1. С. 84-87.

5. Ананьин В.М., Боев А.В., Горлатова Н.В., Крюкова Е.Г., Ловля Д.И., Вельков В.В. 1992. Два подхода к получению уплотнённых культур рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae. Биотехнология. Вып. 6. С. 80-82.

6. Аринбасарова А.Ю. Окислительно-восстановительные превращения гидрокортизона свободными и иммобилизованными клетками Arthrobacter globiformis. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Пущино. 1985.

7. Аринбасарова А.Ю., Кощеенко К.А. 1980. Ковалентное связывание клеток с активированным силикагелем. Прикл. биохимия и микробиология. Т. 16. Вып. 6. С. 854861.

8. Аринбасарова А.Ю., Фокина В.В., Карпов А.В., Меденцев А.Г., Кощеенко К. А. 1995. 1-ен-дегидрирование ба-метилгидрокортизона клетками Arthrobacter globiformis 193. Биохимия. Т. 60. Вып. 10. С. 1679-1687.

9. Аринбасарова А.Ю., Кощеенко К. А. 1983. Использование водно-органических систем в энзиматической трансформации стероидов. Прикл. биохим. микробиол. Т. 19. Вып. 1. С. 20-31.

10. Аринбасарова А.Ю., Кощеенко К.А., Андрюшина В.А., Гриненко Г.С., Скрябин Г.К. 1993. Способ получения 1,2-дегидропроизводных кортикостероидов. Патент РФ 1830949.

11. Ахрем А.А., Титов Ю.А. 1965. Микробиологические трансформации стероидов. Москва, "Наука".

12. Ахрем А.А., Титов Ю.А. 1970. Стероиды и микроорганизмы. Москва, "Наука".

13. Борман Е.А., Кощеенко К.А., Соколова JI.B., Ковылкина Н.Ф. 1975. Микробиологическое дегидрирование микрокристаллических Д4-3-кетостероидов. Изв. ак. наук. Серия биологическая. Вып. 1.

14. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н., Аринбасарова А.Ю., Вагабова Л.М., Морозова З.В., Кощеенко К.А. 1995. Способ получения андроста-1,4-диен-3,17-диона. Патент РФ 2039824.

15. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н., Аринбасарова А.Ю., Вагабова Л.М., Морозова З.В., Кощеенко К.А. 1997. Способ получения андрост-4-ен-3,17-диона. Патент РФ 2079258. БИ N. 13.

16. Готовцева В.А., Скворцова Л.Ф., Коровкина А.С. 1979. Влияние некоторых соединений на процесс восстановления 20-кетогруппы кортикостероидов культурой Mycobacterium globiforme. Микробиология. Т. 158. Вып. 5. С. 833-837.

17. Евтушенко Л.И. и Зеленкова Н.Ф. 1989. Таксономическое положение Proactinomyces farineus. Микробиология. Т. 58. С. 498-500.

18. Кощеенко К.А. 1981. Живые иммобилизованные клетки как биокатализаторы процессов трансформации и биосинтеза органических соединений. Прикл. биохимия и микробиология. Т. 17. Вып. 4. С.477-493.

19. Красильников Н.А., Скрябин Г.К., Асеева И.В., Корсунская Л.О. 1959. Дегидрирование в положении 1,2-гидрокортизона при помощи Mycobacterium sp. 193. Докл. АН СССР. Т. 128. Вып. 5. С. 1063-1065.

20. Ксандопуло Г.Б. 1971. Влияние некоторых факторов на процесс трансформации стероидов микроорганизмами. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва.

21. Лестровая Н.Н., Назарук М.М., Скрябин Г.К. 1965. Дегидрирование и восстановление кольца А Д4-3-кетостероидов бесклеточными препаратами из Mycobacterium globiforme 193. Докл. АН СССР. Т. 163. Вып. 3. С. 768-770.

22. Лестровая Н.Н., Бухар М.И., Скрябин Г.К. 1966. Ферментативный механизм микробиологического дегидрирования и восстановления кольца А стероидов. Биохимия. Т. 32. С. 741.

23. Лестровая Н.Н., Бухар М.И. 1970. Доказательство участия двух ферментов в процессе микробиологического 1,2-дегидрирования и восстановления Д'-связи в кольце А стероидов. Биохимия. Т. 35. С. 1182-1186.

24. Лестровая Н.Н., Кузнецова В.И. 1971. Закономерности индуцированного синтеза -Д'-стероидной дегидрогеназы Mycobacterium sp. 193. Изв. АН СССР. Серия микробиологическая. Вып. 1. С. 74.

25. Лестровая Н.Н., Ксандопуло Г.Б., Карасевич Ж.Г. 1971. Влияние стероидов на эстеразную активность Mycobacterium album Jensen. Микробиология. Т. 50. Вып. 3. С. 461-465.

26. Лестровая Н.Н., Бухар М.И. 1973. Дегидрирование и восстановление кольца А стероидов ферментными препаратами микробного происхождения. В сб. Ферменты микроорганизмов. "Наука", Москва.

27. Лестровая Н.Н. 1973. Получение очищенных препаратов Д1-стероидной дегидрогеназы микобактерий. Изв. АН СССР. Сер. биол. Вып. 5. С. 755-759.

28. Лестровая Н.Н. 1981. Локализация З-оксостероид-д'-дегидрогеназы в клетках Mycobacterium rubrum и Arthrobacter globiformis. Микробиология. Т. 50. Вып. 4. С. 619-625.

29. Матыс В.Ю., Ананьин В.М., Соколов Д.М., Вельков В.В. 1994. Сравнение физиологических и биохимических характеристик метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha DL-1 при хемостатном и уплотнённом культивировании. Биотехнология. N 8. С. 14-17.

30. Машковский М.Д. 1997. Лекарственные средства (пособие для врачей) Том 2 (издание тринадцатое, новое). Харьков "Торсинг" стр. 28-45.

31. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Кощеенко К.А., Акименко В.К. 1983. Связь З-кетостероид-Д'-дегидрирогеназы с дыхательной цепью бактерий Arthrobacter globiformis. Биохимия. Т. 48. Вып. 10. С. 1726-1732.

32. Методы общей бактериологии под ред. Гердхардта Ф. 1984. М.: Мир. Том 3. Систематика. С. 5-163.

33. Назарук М.И. 1972. Влияние рС>2 на процесс Д'-дегидрирования стероидов культурой Мус. globiforme 193. Микробиологическая промышленность. Т. 6. Вып. 90. С. 31-35.

34. Наумова И.Б. и Шашков А.С. 1997. Анионные полимеры в клеточной стенке грамположительных бактерий. Биохимия. Т. 62. С. 809-840.

35. Нестеренко О.А., Квасников Е.И. и Ногина Т.М. 1985. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. Киев: Наукова думка. 334с.

36. Кощеенко К.А., Аринбасарова А.Ю., Донова М.В., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Пашкин И.И., Кузькина И.Ф., Кирш Э.Ю., Карапутадзе Т.М., Зубов В.П. 1995. Способ получения дегидроаналогов стероидов. Патент РФ 2042687.

37. Суходольская Г.В., Донова М.В., Николаева В.М., Кощеенко К.А., Довбня Д.В., Хомутов С.М., Гулевская С.А. 2000. Способ получения 1,2-дегидропроизводных 4-дельта-3-кетостероидов. Патент РФ 2156302.

38. Abul-Hajj Y.J. 1978. Isolation of vitamin K2 (35) from Nocardia restrictus and Corynebacterium simplex. J. Biol. Chem. V. 253. pp. 2356-2360.

39. Abul-Hajj Y.J. 1972. Stereochemistry of C-l,2-dehydrogenation of 5P-pregnane-3,11,20-trione by Septomyxa affinis. J. Biol. Chem. V. 147. pp. 686-691.

40. Ananjin V.M., Komkov A.S., Solovyeva I.V., Boyev A.V., Okunev O.N. 1991. Some approaches to adaptive control of fed-batch culture of the celtobiase producer Aspergillus japonicus. Acta Biotechnol. V. 11. N 2. pp. 121-128.

41. Andriantsoa M., Laget M., Cremieux A., Dumenil G. 1984. Constant fed-batch-culture of methanol-utilizing corynebacterium producing vitamin В12. Biotechnol. Lett. V. 6. N 12. pp. 783-788.

42. Arinbasarova A Yu., Medentsev A.G., Akimenko V.K., Koshcheyenko K.A., and Skryabin G.K. 1985. Redox reactions in hydrocortisone transformation by Arthrobacter globiformis cells. J. steroid Biochem. V. 23. N. 3. pp. 307-312.

43. Atrat P., Deppmeyer V., and Horhold C. 1980. Efficient purification of a microbial steroid 1-dehydrogenase by electrophoretic desorption from the affinity matrix on a preparative scale. J. Cromatog. V.189. pp. 279-283.

44. Baddiley J. 1988. The function of teichoic asids in walls and membranes of bacteria. In: The roots of modern biochemistry, pp. 223-229. Edited by Kleinkauf von Dohren, Jaenicke. Berlin-New-York: Walter de Gruyter and Co.

45. Becker В., Lechevalier M.P., Gordon R.E., Lechevalier H.A. 1964. Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates. Appl. Microbiol. 1964. V. 12. pp. 421-423.

46. Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology 9ed. 1989. Baltimore: Williams and Wilkins Co.

47. Bernstein S„ Lenhard R.H., Allen W.S., Heller M., Littell R., Stolar S. M., Feldman L.J., Blank R.H. 1956. 16a-hydro derivatives of 9a-halo-steroids. J. Amer. Chem. Soc. V. 78. N. 21. pp. 5693-5699.

48. Bork K.H., Bruekner K., Mannhardt H., Metz H. von Werder F.V. 1968. 16-Methylene-9a-fluoro steroids. German Patent 1,263,765.

49. Bunch A.W. 1994. High cell density growth of micro-organisms. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. V. 12. pp. 535-561.

50. Charney W., and Herzog H. 1967. Microbial transformation of steroids. Academic Press, Inc., New York, pp. 4-9,236-261.

51. Carruthers N.I., Garshasb S., McPhail A.T. 1992. Synthesis of corticoids from 9a-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione. J. Org. Chem. V. 57. pp. 961-965.

52. Castro N.M., Ruiz J.A. 1994-1995. Synthesis of 17a,21-dihydroxy-pregna-1,4,9(1 l)-triene3,20-dione 21-acetat. Rev. CENIC Cienc. Quim. V. 25-26. N 1-2-3. pp. 9-12.

53. Catroux Y., Fournier J., Blachere H. 1968. Importance de la forme cristalline de e'acetate de cortisone pour la dehydrogenation en C-l par Arthrobacter simplex. Can. J. Biochem. V. 46. pp. 537-542.

54. Chen K.-C., Chang C.-C., Chiu C.-F. and Ling A.C. 1985. Mathematical simulation of pseudo-crystallofermentation of hydrocortisone by Arthrobacter simplex. Biotech. Bioeng. V. 27. N. 3. pp. 253-259.

55. Choi K.P., Molnar I., Murooka Y. 1995. Secretory overproduction of Arthrobacter simplex 3-ketosteroid-Д1 -dehydrogenase by Streptomyces lividans with a multicopy shuttle vector. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 43. N. 6. pp. 1044-1049.

56. Cirilo G.M., Jorge R.L., and Pedro J.N. 1993. Synthesis and lH and 13C nuclear magnetic resonance of 16-methylene-17a-hydroxypregna-l,4,9(l l)-triene-3,20-dione. Steroids. V. 58. pp. 396-399.

57. Collins M.D. 1985. Isoprenoid quinone analisis in bacterial classification and identification. Chemical methods in bacterial systematics V. 23. pp. 267-287.

58. Collins M.D., Dorschet M. and Stackebrandt E. 1989. Transfer of Pimelobacter tumescens to Terrabacter gen. nov. as Terrabacter tumescens comb. nov. and Pimelobacter jensertii to Nocardioides jensenii comb. nov. Int J Syst Bacteriol V. 39. pp. 1-6.

59. Collins M.D., Jones D., Keddie R.M., Kroppenstedt R.M. and Schleifer K.H. 1983. Classification of some coryneform bacteria in a new genus Aureobacterium. Syst Appl Microbiol V. 4. pp. 236-252.

60. Collins M.D., Cockcroft S. and Wallbanks S. 1994. Phylogenetic analysis of a new LL-diaminopimelic acid-containing corineform bacterium from herbage, Nocardioides plantarum sp. nov. Int J Syst Bacteriol V. 44. pp. 523-526.

61. Collins M.D. and Jones D. 1981. The distribution of isoprenoid quinone structural types in bacteria and their taxonomic implication. Microbiol. Rev. V. 45. N. 1. pp. 316-354.

62. Collins M.D., Jones D., Keddie R.M., Kroppenstedt R.M., Schliefer K.H. 1983. Classification of some corineform bacteria in a new genus Aureobacterium. Syst. Appl. Microbiol. N4. pp. 236-252.

63. Cross T. and Alderson G. 1988. What weight morphology in current actinomycete taxonomy. Biology of Actinomycetes'&8 Y. Eds.: Okami Т., Beppu H„ Ogawara. Proceeddings of 7th Int. Symp. on biology of Actinomycetes. p. 216-220.

64. Culos D., Watanabe M. 1982. Testosterone-dependent oxygen consumption in membrane vesicles of Pseudomonas testosteroni. J Steroid Biochem. V. 17. N. 1. pp.67-69.

65. Dannenberg H., Neuman H.-G. Dehydrierung von steroiden. 1964. 9-Abhangigkeit der dehydrierung mit chinonen von chinon, reaktion-smilen und steroid. Annalen der Chemie. V. 675. pp. 109-111.

66. Deppmeyer V. 1982. Dissertation zur promotion A. Friedrich-Schiller-Universitat,1. Jena.

67. Donova M.V., Dovbnya D.V., Koshcheyenko K.A. 1996. Modified CDs-mediated enhancement of microbial sterol sidechain degradation. In: Proc. of Eighth Int. Symp. on Cyclodextrins. Kluwer Ac. Pub. Dordrecht, pp.527-530.

68. Drobnii К., Krizaj I., Gubensek F., and Komel R. 1993. Improved purification of steroid 1:2-dehydrogenase from Nocardia opaca and partial characterization of its cloned gene sequence. Biochem. and Biophys. Res. Com. V. 190. N. 2. pp. 509-515.

69. Duchene D. 1991. New trends in cyclodextrins and derivatives. Editor Dominique Duchene. Editions de Sante. 19, rue Louis-le-Grand-75002, Paris, p. 604.

70. Dutta R.K., Roy M.K., Singh H.D. 1992. Metabolic blocks in the degradation of beta-sitosterol by a plasmid-cured strain of Arthrobacter oxydans. J. Basic Microbiol. V. 32. N. 3. pp. 167-76.

71. El-Refai A.-M., Sallam L., Nairn N. 1976. Enzymic oxidation and reduction of Cortisol with Bacillus cereus. J. Gen. Appl. Microbiol. V. 22. pp. 25-33.

72. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. 1970. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat. Methods in Microbiology. V. 2 pp. 277-327.

73. Evtushenko L.I., Taptykova S.D., Akimov V.N. and Dobritsa S.V. 1989. A new species of actinomycete, Amycolata alni. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 39. pp. 72-77.

74. Fass R., Bahar S., Kaufman J., Shiloach J. 1995. High-yield production of diphtheria toxin mutants by high-density culture of C7 (beta)tox+ strains grown in a non-deferrated medium. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 43. N 1. pp. 83-88.

75. Fernandes P., Cabral J.M.S., Pinheiro H.M. 1995. Bioconversion of a hydrocortisone derivative in a organic-aqueous two-liquid-phase sistem. Enzyme Microbiol. Technol. V. 17. N.2. pp.163-167.

76. Fieschko J.C. 1989. Fermentation technology using recombinant microorganisms in biotechnology. Biotechnology (New York). Eds.: Rehm H.J. and Reed G. VCH, Weinheim. V. 7b. N 1. pp. 117-140.

77. Florin C., Kohler Т., Grandguillot M., Plesiat P. 1996. Comamonas testosteroni 3-ketosteriod-A4-(5a)-dehydrogenase: gene and protein characterization. J. Bacteriol. V. 178. No 11. pp. 3322-3330.

78. Freeman A. and Lilly M.D. 1987. The effect of water-miscible solvents on the 1-dehydrogenase activity of free and PAAG-entrapped Arthrobacter simplex. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 25, pp .495-501.

79. Fried J. and Thoma R.W. 1956. Production of Д1-bonds in the A ring of the cyclopentano-polyhydrophenanthrene nucleus by Streptomyces lavendulae. US pat., 2756179.

80. Fromming K.-H. and Szejtli J., 1994. Topics in inclusion science. V. 5. Cyclodextrins in pharmacy. Series Editor: Davies J.E.D. Editorial board: Iwamoto Т., Lipkowski J., Saenger W. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht / Boston / London, pp. 1 -224.

81. Galdecki Z., Grochulski P., Wawrzak Z., Duax W.L., Strong P., Segaloff A. 1985. Structure determination of 3 beta,17-dihydroxy-17alpha-pregn-5-ene-20-one. Steroids. V. 45. N. 3-4. pp. 289-296.

82. Galdecki Z., Grochulski P., Wawrzak Z., Duax W.L., Strong Ph.D. 1990. Structure of 21-fluoro-4,9(ll)-pregnadiene-3,20-dione-17a-yl acetate, C23H29O4F. J. Cryst Spectr Res. V. 20. N. 2. pp. 441-444.

83. Gale P.H., Page A.C., Stoudt Т.Н., Folkers K. 1962. Identification of vitamin K2 (35) an apparent cofactor of a steroid-1-dehydrogenase of Bacillus sphaericus. Biochemistry. V. l.pp. 788-792.

84. Goodfellow M. 1989. The Actinomyceles I. Suprageneric classification of actinomycetes. In: Bergey's manual of systematic bacteriology. Eds.: Williams S.T., Sharpe M.E. and Holt J.G. Baltimore: Williams and Wilkins.V. 4. pp. 2333-2339.

85. Goodfellow M. and Minnikin D.E. 1985. Introduction to chemosystematics. In: Chemical Methods in Bacterial Systematics. Ed.: Goodfellow M. and Minnikin D.E. London: Academic Press, pp. 1-15.

86. Goodfellow M. and Cross T. 1984. The biology of the actinomycetes. In: The Biology of the Actinomyces. Eds.:ited by M. Goodfellow, M. Mordarski, S.T. Williams. London: Academic Press, pp. 7-164.

87. Goren Т., Harnik M., Rimon S., Aharonowitz Y. 1983. 1-Ene-steroid reductase of Mycobacterium sp. NRRL B-3805. J. Steroid Biochem. V. 19. N. 6. pp.1789-1797.

88. Groh H., Komel R., Deppmeyer V., Schade W. and Horhold C. 1980. Steroid transforming enzymes from microorganisms: the reverse reaction of the steroid 1-dehydrogenase from Nocardia. J. Steroid Biochem. V.13. pp. 1413-1415.

89. Grove M.J., Strandberg G.W., Smiley K.L. 1971. Steroid esterase bound to porous glass beads. Biotechnol. Bioeng. V. 13. N. 5. pp. 709-711.

90. Higushi T. and Connors K. 1965. Phase-solubility techniques. In: C.N. Reilly (Ed.). Advances in analitical chemistry and instrumentation. Intercsience. New York. NY. pp. 117-212.

91. Hocknull M.D. and Lilly M.D. The stability of the 1-dehydrogenation system of Arthrobacter simplex in organicsolvent/aqueous two-liquid phase environments. 1988. Enzym. Microb. Technol. V. 10. pp.669-674.

92. Honda H., Sugiyama H., Saito I., Kobayashi T. 1998. High cell density culture of Rhodococcus rhodochrous by pH-stat feeding and dibenzothiophene degradation. J. Ferment. Bioeng. V. 85. N. 3. pp. 334-338.

93. Hubener H. J. and Sahrholz F. G. 1960. 20-(5-Hydroxy-steroid-dehydrogenase. II. Darstelling und Kristallization. Biochem. Z. V. 333. p. 95.

94. Ikeda M„ Katsumata R. 1999. Hyperproduction of tryptophan by Corynebacterium glutamicum with the modified pentose phosphate pathway. Appl. Environ. Microbiol. V. 65. N 6. pp. 2497-2502.

95. Itagaki E., Matushita Т., Hatta T. 1990. Steroid transhydrogenase activity of 3-ketosteroid-Д1-dehydrogenase from Nocardia corallina. J. Biochem. V. 108. N. 1. pp. 122-127.

96. Itagaki E., Hatta Т., Wakabayashi Т., Suzuki K. 1990. Spectral properties of 3-ketosteroid-A'-dehydrogenase from Nocardia corallina. Biochim. Biophys. Acta. V. 1040. N. 2. pp. 281-286.

97. Jukes Т.Н. and Cantor C.R. 1969. Evolution of protein molecules. In Mammalian Protein Metabolism. Ed. Munro H.N. N. Y. A. P. pp. 21-132.

98. Kaul R. and Mattiasson B. 1986. Steroid bioconversion in aqueous two-phase system. Laane C., Tramper J. and Lilly M.D. (Eds.) Biocatalysis in organic media. Proc. Int. Symp. at Wageningen, The Netherlands, 7-10 December 1986. pp. 107-113.

99. Kampfer P, and Kroppenstedt M. 1996. Numerical analysis of fatty acid patterns of coryneform bacteria and related taxa. Can. J. Microbiol. V. 42. pp. 989-1005.

100. Kleman G.L., Strohl W.R. 1994. Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation. Review. Curr. Opin. Biotechnol. V. 5. N 2. pp. 180-186.

101. Kleman G.L., Strohl W.R. 1992. High cell density and high-productivity microbial fermentation. Curr. Opin. Biotechnol. Review. V. 3. N 2. pp. 93-98.

102. Kominek L.A., Wolf H.J. 1985. Process for preparing 1,2-dehydro steroids. US Patent 4.524.134.

103. Kominek L.A. 1973. Process for the micbiological 1-dehydrogenation of certain 4,17(20)-pregnadienes. US Patent 3.770.586.

104. Kondo E., Masuo. E. 1961. Pseudocrystallofermentation of steroids: a new process for preparing prednisolone by a microorganism. J. Gen. Appl. Microbiol. V. 7. pp. 113117.

105. Kroppenstedt R.M., Stackebrandt E. and Goodfellow M. 1990. Taxonomic revision of the actinomycete genera Actinomadura and Microtetraspora. Syst. Appl. Microbiol. V. 13. pp. 148-160.

106. Laane С., Boeren В., Vos К., Veeger С. 1987. Rules for optimization of biocatalysis in organic solvents. Biotechnol. Bioeng. V. 30. pp. 81-87.

107. Labeda D.P. 1987. Actinomycete taxonomy: generic characterization. Developments in Industrial Microbiology. V. 28. pp. 115-121.

108. Lee J., Lee S.Y., Park S., Middelberg A.P.J. 1999. Control of fed-batch fermentations. Biotechnol. Adv. V. 17. pp. 29-48.

109. Levy R.H., Talalay P. 1959. Bacterial oxidation of steroids. I. Ring A dehydrogenations by intact cells. J. Biol. Chem. V. 234. pp. 2009-2013.

110. Levy R.H., Talalay P. 1959. Bacterial oxidation of steroids. II. Studies on the enzymatic mechanism of ring A dehydrogenation. J. Biol. Chem. V. 234. pp. 2014-2026.

111. Lilly M.D. 1990. The use of free and immobilized Arthrobacter simplex in organic solvent/aqueous two-liquid phase reactors. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 22. N. 2. pp. 148-153.

112. Medentsev A.G., Arinbasarova A.Y., Koshcheyenko K.A., Akimenko V.K. and Skryabin G.K. 1985. Regulation of 3-ketosteroid-l-en-dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis cells by a respiratory chain. J. Steroid Biochem. V. 23. N. 3. pp. 365-368.

113. Minehane B.J., Brown D.E. 1986. Fed-batch culture technology. Biotechnol. Adv.1. V. 4. N. 2. pp. 207-218.

114. Nagy U.E., Bartho I., Hantos G„ Trinn M., Vida Z., Szejtli J., Stadler A., Habon I., Balazs M. 1981. Intensification of microbiological conversion of steroids by using cyclodextrin additives. UK Patent GB 2 108 965 A.

115. Nobile A., Charney W., Perlman D., Herzog H., Payne C., Tully M., Jevnik M., Hershberg E. 1955. Microbiological transformation of steroids. 1. Al,4-diene-3-ketosteroids. J. Amer. Chem. S. V. 77. N. 15. pp. 1484-1488.

116. Park T.G., and Hoffman A.S. 1989. Immobilization of Arthrobacter simplex cells in thermally reversible hydrogels: comparative effects of organic solvent and polymeric surfactant on steroid conversion. Biotechnol. Lett. V. 11. N. 1. pp. 17-22.

117. Penasse I., Peyre H. 1968. Studies of З-oxo-steroid-A'-oxidoreductase of Arthrobacter simplex. Steroids. V. 12. pp. 525-544.

118. Pinheiro H.M. Bioconversion of 6a-methylhydrocortisone by immobilized cells of Arthrobacter simplex. M. Sc. Thesis. Instituto Superio Tecnico, Lisboa. 1988.

119. Pinheiro H.M., and Cabral J.M.S. 1991. Effects of solvent molecular toxicity and microenvironment composition on the Д1 dehydrogenation activity of Arthrobacter simplex cells. Biotech. Bioeng. V. 37. pp. 97-102.

120. Plesiat P., Grandgulliot M., Harayama S., Vragar S. and Michel-Briand Y. 1991. Cloning, sequencing, and expression of the Pseudomonas testosteroni gene encoding 3-oxosteroid A'-dehydrogenase. J. Bacteriol. V. 173. N. 22. pp. 7219-7227.

121. Prauser H. 1976. Nocardioides, a new genus of the order Actinomycetales. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 26. pp. 58-65.

122. Prauser H. 1984. Nocardioides luteus spec. now. Z. Allg. Microbiol. V. 24. pp. 647-648.

123. Pridham T.G., Gottlieb D. 1948. The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination. J. Bacteriol. V. 56. pp. 107-114.

124. Ringold H.J., Hayano M. and Stefanovic V. 1963. Conelring the stereochemistry and mechanism of bacterial C-l,2-dehydrogenation of steroids. J. Biol. Chem. V. 238. pp. 19601965.

125. Rossello-Mora R and Amann R. 2001. The species concept for prokaryotes. FEMS Microbiol. Rev. V. 25. pp. 39-67.

126. Ryu D. Y„ Lee B.K., Thoma R.W., Humphrey A.E. 1971. Semicontinuos production of 3 ketosteroid Д1-dehydrogenase for steroid transformation at high substrate concentrartion. Chem. Eng. Progr. Symp. Ser. V. 67. N. 108. pp. 80-83.

127. Saitou N. and Nei M. 1987. The neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. V. 4. pp. 406-425.

128. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York.

129. Sebek O.K., and Perlman D. 1979. Microbial technology. Eds: Peppier H. J. and Perlman D. Academic Press. V. 1. pp. 483-496.

130. Scharfenberg-Pfeiffer D., Megges R., Bohl M., Simon K., Stopsack H. 1990. Crystal and molecular structure of 17a-acetoxy-21-hydroxy-l,4-pregnadiene-3,20-dione. Cryst. Res. Technol. V. 25. N. 2. pp. 151-156.

131. Scharfenberg-Pfeiffer D., Megges R., Hohne E., Stopsack H. 1990. Crystal and molecular structure of 17a,21-dihydroxy-l,4-pregnadiene-3,20-dione. Cryst. Res. Technol. V. 25. N. 5. pp. 505-509.

132. Schleifer K.H. and Kandler O. 1972. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriol. Rev. V. 36. pp. 407-477.

133. Shephard, Kenneth Paul, Van Rheen, Verlan H. 1977. Process for the preparation of 17a-hydroxyprogesterones and corticoids from androstenes. US Pat.No 4,041,055.

134. Sih J.C., Bennett E.R. 1962. Steroid-1-dehydrogenase of Nocardia restrictus. Biochem. Biophys. Acta. V. 56. pp. 584-592.

135. Singer Y., Shity H., Bar R. 1991. Microbial transformation in a cyclodextrin medium. Part 2. Reduction of androstenedione to testosterone by Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 35. pp. 731-737.

136. Smolders A.S.S., Pinheiro H.M., Noronha P., Cabral J.M.S. 1991. Steroid bioconversion in microemultion system. Biotech. Bioeng. V. 39. N. 10. pp. 1210-1217.

137. Solovyeva I.V., Ananjin V.M., Boyev A.V., Okunev O.N. 1997. Controlled biosynthesis of eellobiase by Aspergillus fungi. Process Biochem. V. 32. N. 1. pp. 21-28.

138. Spassov G., Krutzfeldt R., Sheldrick W.S., Wania W., Vlahov R. and Snatzke G. 1983. Crystallographic monitoring of microbiological steroid transformations. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 17. pp. 80-84.

139. Stackebrandt E. and Liesack W. 1994. Nucleic acids and classification. In: Handbook of new bacterial systematics. pp. 152-194. Edited by Goodfellow M. and O'Donnel A.G. London: Academic Press.

140. Stackebrandt E., Rainey F.A. and Ward-Rainey N.L. 1997. Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 47. pp. 479-491.

141. Stefanovic V., Hyano M., Dorfman R.J. 1963. Some observation the Д1-dehydrogenation by Bacillus sphaericus. Biochem. Biophys. Acta. V.71. pp. 429-437.

142. Suzuki K., Goodfellow M. and O'Donnel A.G. 1994. Cell envelopes and classification. In: Handbook of new bacterial systematics. pp. 195-250. Edited by Goodfellow M. and O'Donnel A.G. London: Academic Press.

143. Sutcliffe I.C. 1994. The lipoteichoic acids and lypoglycans of Gram-positive bacteria: a chemotaxonomic perspective. System Appl Microbiol V. 17. pp. 467-480.

144. Szejtli J. 1991. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed.: Duchene D. Published in France by Editions de Sante. 625 p.

145. The United States Pharmacopeia. USP 26. The National Formulary. NF 21. Solubilities. Reference tables. United States Pharmacopeial Convention, INC. 12601 Twinbrook Parway, Rockville, MD 20852. pp. 2588-2594.

146. Todhunter J.A. 1979. In: Meth. Enzymol. Ed.: Purich D.L. Ac. Press, London. V. 63A. pp. 383-411.

147. Tramper J., Wolters I., Verlaan P. In Biocatalysis in organic media. Eds.: Laane C., Tramper J., Lilly M.D. pp.311-316.

148. Vandamme P., Pot В., Gillins M., De Vos P., Kersters K. and Swings J. 1996. Poliphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol. Rev. V. 60. pp. 407-438.

149. Vischer E., Wettstein A. Enzymatic transformations of steroids by microorganisms. 1958. Adv. Enzymology. V. 20. N.-Y.-London, pp. 1-237.

150. Wagner В., Atrat P.G., Clark-Curtiss J.E., and Wagner M. 1992. Localization of the steroid 1-dehydrogenease in Rhodococcus erythropolis IMET 7030 by immunoelectorn microscopy. J. Basic Microbiol. V. 32. N. 1. pp. 65-71.

151. Watanabe M., Lefebvre D., Lefebvre Y., Sy L.P. 1980. Membrane-bound dehydrogenases of Pseudomonas testosteroni. J. Steroid Biochem. V. 13. N. 7. pp. 821-827.

152. Wittmann C., Zeng A.P., Deckwer W.D. 1995. Growth inhibition by ammonia and use of a pH-controlled feeding strategy for the effective cultivation of Mycobacterium chlorophenolicum. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 44. N. 3-4. pp. 519-525.

153. Wolf H.J., and Kominek L.A. 1984. Improved steroid-1-dehydrogenation using heat-dried cells. Ann. of the N.-Y. Ac. of Sci. Eds.: Laskin A.I., Tsao G.T., Wingard L.B., Jr. In: Enz. Engineering 7. V. 434. pp. 106-109.

154. Wovcha M.G., and Merle G. 1977. Process for preparing 9a-hydroxyandrostenedione. US Pat 4,035,236.

155. Wovcha M.G., Brooks K.E. and Kominek L.A. 1979. Evidence for two steroid 1,2-dehydrogenase activities in Mycobacterium fortuitum. Biochim. Biophys. Acta. V. 574. pp. 471-479.

156. Yan H., Kishimoto M., Omasa Т., Katakura Y., Suga K.-I., Okumura K., Yoshikawa 0. 1995. Increase in desulfurization activity of Rhodococcus erythropolis KA 2-5-1 using ethanol feeding. J. Biosci. Bioeng. 2000. V. 89. N 4. pp. 361-366.

157. Yoon J.-H., Rhee S.-K., Lee J.-S., Park Y.-H. and Lee S.T. 1997. Nocardioides pyridinolyticus sp. nov., a pyridine-degrading bacterium isolated from the oxic zone of an oil shale column. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 47. pp. 933-938.

158. Yoon J.-H., Cho Y.-G., Lee S. Т., Suzuki K., Nakase T. and Park Y.-H. 1999. Nocardioides nitrophenolicus sp. nov., a p-nitrophenol-degrading bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 49. pp. 675-680.

159. Российская академия наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

160. УТВЕРЖДАЮ директора ИБФМ РАН ;.биолл£аук1. М.Б.Вайнштейн 2003 г.1. Актиспытаний способа микробиологического 1(2)-дегидрирования 21-ацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона клетками

161. N. simplex VKM Ас-2033Д, представленного сотрудниками лаборатории микробиологической трансформации органических соединений ст.н.с. к.б.н. Суходольской Г.В., м.н.с. Фокиной В.В., Н.С. KiX«H« Николаевой В.М. и зав.лаб. к.б.н. Доновой М.В.

162. Для определения соответствия данного способа лабораторно-техническому уровню было проведено сравнение балансовых операций по пяти ферментациям в аппаратах АНКУМ 2М с общим объемом 3 литра.

Информация о работе

Фокина, Виктория Валерьевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2003
ВАК 03.00.23

Диссертация

Конверсия 3-кетостероидов Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы