Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов импульсного гель-электрофореза биополимеров

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов импульсного гель-электрофореза биополимеров"

|0СК0ВСКИИ ОРДЕНГ ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

"V*" ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

«rr.f)

На правах рукописи

ЧЕБОТАРЕВ ВАЛЕРИИ ВРЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОЙ ИМПУЛЬСНОГО ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА БИОПОЛИМЕРОВ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Отделе проблей генома Института молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук А.Н,Реке«

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А.А.Александров ,ат физико-математических наук Е.Н.Твердохлебов

Ведущая организация: Всесовэный Научно-Исследовательский Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится АУр— 1993 г. в 1-- часов

на заседании Специализированного совета К 083.91.10 при Московском Физико-Техническом институте по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский пер., 9, МФТИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского Физико-Технического института.

Учений секретарь Специализированного совета кандидат физико-математических наук

В.Б.Киреев.

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ«

Актуальность проблемы.

Злектрофоретические методы являются эффективным и наиболее доступным инструментом исследования биополимеров. В настоящее время наряду с классическим электрофорезом широкое распространение получапт методы импульсного гель-электрофореза, использование которых позволило принципиально увеличить диапазон длин разделяемых в геле молекул ДНК - от 30 тысяч пар нуклеотидов до 10 миллионов пар. Хотя идея применения импульсных электрических полей в электрофоретическом анализе возникла относительно недавно, количество используемых методов импульсного гель-электрофореза уже достаточно велико и продолжает увеличиваться.

Для каждого из методов накоплено огромное количество практического материала по разделении определенных молекулярных смесей, так что целенаправленный выбор метода и методики, наиболее подходящих для разделения конкретной смеси, становится затруднительным даже для опытного специалиста. Поскольку в литературе представлено большое количество различных методик и протоколов к ним, каждый из которых требует, как правило, специализированного оборудования, сложивваяся в аппаратурном отнонении ситуация характеризуется следувчиыи особенностями.

Во-первых, исследователь в бодьвишггве случаев не может воспроизвести уже апробированные условия конкретного импульсного метода, приведенные в оригинальной статье, и вынужден самостоятельно подбирать подходящий режим на имеющемся у него оборудовании, что сопряжено со значительными и непроизводительными затратами труда; во-вторых, узкая специализация оборудования не позволяет производить обмен информацией или аппаратными компонентами между различными электрофоретиче.скими устройствами: в-третьих. поскольку проектирование коммутирующего оборудования для конкретной цели всегда основано на компромиссе между коммутируемой мощностьв, быстродействие*. надежность» и стоижостьв системы, ни одна из описанных в литературе специализированных систем не в состоянии удовлетворить требованиям различных импульсных методов даже по нагрузочнм характеристикам, не говоря уже о требованиях к конфигурации пом.

- г -

Далее. имеется ряд новых направлений использования импульсного гель-электрофореза (прецизионная идентификация рестрикцион-них Фрагментов в методе генной дактилоскопии, высокочастотное секвенирование, влияние частоты импульсного поля на разделение топоизомеров сверхспирализовашшх молекул ДНК и т.д.), которые ожидают практической проработки своих возможностей. К оборудовании, используемому для таких исследований, предъявляются жесткие требования в отношении ширины реализуемого системой диапазона изменения параметров электрофоретического процесса, поскольку строгой количественной теории гель-электрофореза, которая могла бы указать достаточную величину этого диапазона, не существует даже для классического случая с постоянной напряженностью поля, не говоря уже о методах импульсного электрофореза.

Наконец, специфика гель-злектрофореза предъявляет ряд особых требований к пользовательскому интерфейсу и надежности электро-Форетической системы. Кроме того, при реализации такой системы на персональных компьютерах становятся необходимыми минимизация ипользуемых ев ресурсов компьютера и фоновый (не монополизирующий процессор) режим работы, поскольку процесс электрофореза может занимать весьма длительное время.

Все это обуславливает своевременность к актуальность задачи разработки универсального унифицируемого электрофоретического оборудования и внедрения в электрофоретический анализ компьютерных систем управления, процессом электрофореза, которые бы, во-первых, реализовали возможно большое количество известных импульсных методов с помощью одного и того же программно-аппаратного обеспечения на одном и том же оборудовании, избавляя пользователя от рутинной работы по подбору и отладке параметров конкретного метода при разделении интересующих его молекулярных смесей, во-вторых, обеспечивали диапазон изменения этих параметров, достаточный для проведения поисковых исследований и совервенствова-ния методик импульсного гель-электрофореза и, в-третьих, обеспечивали высокую надежность комплекса и максимально удобный пользовательский интерфейс.

До настоящего времени таких автоматизированных систем не существовало.

Цель работы.

Целью настоящей работы являлись анализ существующих методов импульсного гель-электрофореза и создание на его основе приклад-

ной злектрофоретическай системы, пригодной как для реализации рутинного злектрофоретического анализа, та.т к для проведения поисковых исследований по оптимизации нови* импульсных методик.

В процессе работы рееаяись следца-ие. задачи:

- анализ принципов разделения, дегачих в основе известии* импульсных методов, и разработка на его основе иебходииого формализованного набора параметров универсальной азтоматизирпваи-ной злектрофоретической системы, а такте необходимой сирины диапазона изменения этих параметров;

- формализация описания параметров злегстроОпретяческих циклов it их последовательностей с цельп изучепкз возногности реализации различных импульсных нотодов при помоци одного и того яе программно-аппаратного обеспечения;

- разработка обпей структуры автоматизированной злектрофорети-чесной системы, обеспечиваяцей реализация рутинного и поискового злектрофоретического анализа;

- создание программно-аппаратного комплекса, реализув^его воз-моано более широкий набор импульсных методов и обеспечипагще-го эффективный контроль их парлаатров;

- учет особых требований; предъявляемых спсцисикой гедь-злект-рофореза, к интерфейсу с пользователей и падегппсти комплекса - устойчивости к сбоям в текучих программах, помеходсгяй'игао-сти и защите от несанкционированных действий;

- минимизация ресурсов, используема* системой в процессе контроля электрофореза:

- экспериментальное изучение электрофсрсгяческой- подвигности биополимеров в знакопеременном щсгцлъсг.г.» nose с цеяъа ускорения процесса и повышения разренавчей способности' метода.

Научная новизна работы.

Проведенные принципиальный анализ различных ишщльстшх методов и формализация описания их параметров впервые зозвеяттли разработать логический структуру универсальной Ст.е*. пригодной для дпбих импульсных методов) автоматизированной эяеатроСоретический. системы и создать программно-аппаратный комплекс для- ппддерюпе лвбых методов импульсного гель-электрофореза. Сказанная автоматизированная система предоставляет исследователя' возможность эффективного: управления параметрами электрофоретидестсих методов!, обеспечивая автоматическое проведение рутинного злегстрзфореткческогсг агаяюа

и поиск оптимальных режимов при исследовании биополимеров методами импульсного гель-электрофореза. С ее помоцы), в частности, была продемонстрирована возможность быстрого прецизионного разделения близких фрагментов ДНК, а также впервые показано, что элект-рофоретическая подвижность молекул ДНК уменьвается с рястом частоты знакопеременного импульсного поля.

Практическая ценность работы.

В процессе работы на основе анализа известных импульсных методов разработаны формализованный набор параметров и общая структура универсальной автоматизированной электрофоретической системы, обеспечивавшей реализации рутинного и поискового электрофор'тиче-ского анализа с помощьп одного и того же программно-аппаратного обеспечения. Созданы первые ве{>сии программно-аппаратного комплекса (Electrophoretlc Pulse Generator) для исследования 'Оиопмлиие-ров методами импульсного гель-злектрофореза, обладапцего «ирокими возможностями по управлении параметрами последовательностей злек-трофоретических циклов (отладка и текущий контроль параметров. Фоновый режим работы, защита и помехоустойчивость контролируемого процесса). Комплекс используется при работе на IBM PC/AT - tовме-стимых компызтерах, имевших систеннув иину типа "1/0 Channel".

Апробация работы.

Иатериалы диссертации были доложены на I и 11 Всесоозны/ конференциях по Государственной программе "Геном человека" (г. Пере-яславль-Залесский, 1990, 1991) и Отчетной конференции Института молекулярной генетики ЙН СССР (1991).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано пять статей.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и i аиска цитируемой литературы. Работа изложена на 212 страницах машинописного текста, вклвчая 28 рисунков, 3 таблицы и список литературы, содержащий 13? наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ, Во введении кратко рассмотрены проблемы, которым посвящена диссертация, отмечены основные практические цели работы.

ГЛАВА 1. Является обзором литературы, состоящим из двух разделов.

В разделе 1.1 кратко излагаотся современные представления о движении молекул биополимеров в гелях под действием постоянного и импульсного электрических полей. Отмечено, что поскольку эле-ктрофоретическая подвижность биополимеров определяется целым рядом различных факторов - размерами молекул, их зарядом, топологией, кривизной оси двойной спирали (ДНК) в релаксированном состоянии, условиями эксперимента (структурой матрицы геля, ионной силой раствора, температурой, концентрацией интеркалятора и т.д.), строгая количественная теория гелъ-злектрофореза не построена не только для импульсного, но и для классического случая. Приведены сучествувщие количественные оценки ваянейяих зависимостей, имеющих практическое значение при реализации классического и импульсных методов электрофореза.

Раздел 1.2 посвящен описании физических принципов, на которых основаны методы импульсного гель-электрофореза. Приведены имеющиеся качественные и количественные оценки подвижности макромолекул и разрежающей способности различных методов. С принципиальной точки зрения рассмотрен ряд новых методик, использующих временное масатабирование цикловых последовательностей (параметры цикловых пакетов непрерывно или дискретно изменяются во время эксперимента), "высокочастотное" модулирование медленных базовых электрофоретических циклов при делении хромосомной ДНК (усиление эффекта конденсации хромосомных зон), а такхе использование импульсных методов при сиквенировании ДНК (разделение фрагментов в интервале 200-1000 нуклеотидов в виде комплексов стрептавидин-ДНК).

Показано, что автоматизированная электрофоретическая система должна обеспечивать иирокий диапазон изменения параметров процесса. Так, реализация уже известных методов требует, чтобы ди-

апаэон временных выдержек внутри электрофоретического цикла составлял от 100 икс до 10000 с (т.е. 8 порядков), диапазон соотношений между временными параметрами циклов - от 1 до 10000 (т. е. 4 порядка), длительностей процесса - от единиц минут до сотен часов, коммутируемых напряжений - от 20 В до 5 кВ, коммутируемых токов - от 10 мА до 50 А и т.д.

Отмечено также, что разработка и исследования больвинства новых методов импульсного гель-электрофореза первоначально проводятся на оборудовании, которое специально для этой цели не предназначено и не может использоваться для проведения рутинного электрофоретического анализа (даже если бы такое оборудование и было доступно) по причине крайнего неудобства для пользователя, обусловленного как указанными выше аппаратными ограничениями, так и необходимостьа ручного управления процессом электрофореза. Электрофоретическая система должна обеспечивать автоматическое проведение полного (многостадийного) процесса без участия оператора.

Наконец, электрофоретическая система должна обеспечивать максимально удобный пользовательский интерфейс, при необходимости предоставляя пользователи возможность оперативно управлять процессом электрофореза.

ГЛАВА 2. Содержит обзор практических методик основных импульсных методов - Siaple Pulsed Electrophoresis (SPE), Pulsed Blotting Transfer (P8T), Field-Inversion Gel Electrophoresis (FIGE), Pulsed Homogeneous Orthogonal field Gel Electrophoresis (PH0GE), Uertical System Gel Electrophoresis (USGE). Claaped Hoaogeneous Electric Fields (CHEF), Field-Uibration Gel Electrophoresis (FUGE), Orthogonal-Field-Alternation Gel Electrophoresis (0FAGE) и других, а также эффективных модификаций этих методов, использупцих временное насвтабирование и "высокочастотную" модуляции базовых злектрофоретических циклов.

Дана характеристика возможностей методов, отмечены их основные особенности (используемая аппаратура, конструкции злектрофоретических камер, пространственная и временная конфигурация поля, характер и качество деления и т.п.), на основании чего определены необходимые требования к временным и нагрузочным параметрам универсальной электрофоретической системы.

ГЛАВА 3. В этой главе проведена формализация параметров используемых в электрофорезе импульсных последовательностей и представлена общая структура универсальной автоматизированной электрофоретической системы (ЙЗФС). Последняя (рис.1) рассматривается как совокупность трех функциональных элементов - электрофоретической камеры (определяющей пространственнуи конфигурации поля путем соответствувщего размещения электродов и имеющей специфическую для данного импульсного метода конструкцию), силового коммутатора с источниками питания (обеспечивающего требуемые конкретной задачей нагрузочные параметры) и генератора состояний (определяющего временную конфигурацию поля путем соответствувщего управления силовыми ключами), что позволяет вынести особенности аппаратной реализации конкретного метода за пределы генератора состояний, собрав их в конструкции силовых ключей коммутатора.

Показано, что любой электрофоретический процесс может быть реализован в виде ряда последовательно выполняющихся блоков параметров (для пользователя - файлов), каждый из которых, установив надлежащую конфигурацию силового коммутатора, на протяжении времени ТГ генерирует непрерывно повторяющуюся серию цикловых пакетов, содержащую (М+1) состояний; каждое состояние, имеющее номер X (X = 0...И), характеризуется четырьмя параметрами: Ип(Х) масатабирует базовое время Т цикла относительно вага реального времени I; Ир(X).КиСXI определяют форму цикла относительно Т; Р(Х) задает длину пакета; Я(Х) управляет маскированием фаз, генерируемых фазовым формирователем на основе Нп(Х),Нр(Х). На(X). Реализация конкретного метода сводится к надлежащему манипулированию управлявшими фазами, формируемыми на основе одной и той же базовой управляющей последовательности. Примеры реализации элементарных одноблоковых процессов приведены на рис.2.

Поскольку электрофорез крупных молекул занимает десятки и сотни часов, управление этим процессом необходимо реализовать так. чтобы в течение всего времени электрофореза на компьвтере можно было выполнять еще какув-то работу (пусть даже с некоторыми ограничениями), т.е. необходим фоновый режим контроля процесса, не монополизирующий процессор и предоставляющий пользователю возможность использовать текущие программы параллельно процессу электрофореза. При наличии такой возможности необходим механизм защиты контролируемого процесса, предотвращавщий сбой эксперимента в случае каких-либо нарушений при выполнении текущих программ.

Хота любая программная защита не может быть абсолютной, большинство возникающих на практике причин такого сбоя может быть устранено.

Таким образом, рассмотренная структура злектрофоретической системы позволяет автоматизировать проведение рутинного электрофо-ретического анализа, реализуя различные импульсные методы при помощи одного и того же программно-аппаратного обеспечения на персональном компьютере, не монополизируя компьютер и избавляя пользователя от необходимости самостоятельно управлять этим процессом на протяжении эксперимента.

ГílARfi 4. Содержит описание (ШС "Electrophoretic Pulse Generator" (EPG): общей структуры EPG (раздел 4.1), адаптерной платы EPG fldapler (EPGfi, раздел 4.2), системного драйвера EPG Driver (EPGD, раздел 4.3) и отладочной программы EPG Coíoander (EPGC, раздел 4.4).

Общая структура EPG показана на рис.1. Комплекс состоит из аппаратного (EPGft) и двух программных (EPGD. EPGC) блоков (с целью достижения максимального быстродействия и гибкости системы, а также минимизации используемых ресурсов компьютера программные блоки реализованы на языке ассемблера ASM 286/386), а также силового коммутатора, содержащего набор силовых ключей (блоковых вентилей и фазовых ключей), заменяемых в соответствии с требуемыми нагрузочными характеристиками эксперимента, и адаптер камеры, обеспечивающий необходимую для конкретного импульсного метода коммутацию силовых ключей между собой.

Основная схема реализации электрофоретического процесса: а) Исходный процесс разбивается на несколько (возможно, один) блоков из соображений удобства реализации каждого из них пользователем; б) Параметры каждого из блоков описываются и отдельной файле и при необходимости независимо отлаживаются с помощью EPGC; з) Полный процесс программируется простым перечислением имен.блоковых Файлов в файле конфигурации процесса; г) При ста-, рте процесса EPGC тестирует все используемые файлы и запускает EPGD, который устанавливает фоновый режим и последовательно выполняет блоки в порядке их следования в файле конфигурации, счи-

«АЭОИМ4 ФОРПМ*Ю-■АТСЛЬ ♦ ^IXKCTPU rvKOH АДЛЛТ№ ЛИ1«4И связи

* ■

TAMrtCPU £»*** ГЕНЕРАТОР ГГНГРАТ« детосов KPGD

KPO ACAPTSK

БЛОК 3AUHTW Б ЛОЛ РЫИПОБ

КОИВСРТОР ДЛ1«1Д БЛОК ЗАПРОСOt КРОА

СЧЕТНЫЙ елок МНТЕР«СйС С ПОЛЬЭОВАТСЛЕН

л/wit up

ли» ми

связи

СИЛО»О* КОЛПУТАТОР

ч

» 1

1 1 источтми ГМТА»ЫЯ ЭЛСМ Tf4mX«LTM'<LCKAK KAFttJVt

1 БАСМ ТБСТИР08А»«» KPUA БЛОК TCCTMPOBA»M4 ДАН«и CTWTOfctM «¿лои

БЛОК TPACCMCQBKH КС» ПЕРТ UP ДОМА БЛОК эмичкок

ЭПУЛ5ГТЦР КИ*А счет***) БЛОК ИМТГРМ'.Ж. «.

K№ ajftlANI»!-.*

РИС. 1. 0£ЫА9 crevHTVP* -KLKCTHUPHURKTIC PUI-S« UKMKKATUK'.

I

co I

- гГй

PMC. 2. ПРОСТСММИС ММАИТМ PCAAIMUMM : А - 6P1.PST. 8 - FVGl,

» » г - »ig», а - vaoi. t - aatr. s - fhogk. i - o*agä.

HJiñlmexM

E*tí B/en + -

Е1«2в/<« + -

Е2«ДОфЬ) + -

Ьенгтл*

Я

1+К2

0-J

С**4 Sue кун*

KA*i Ы па

Р^ЛИЗАЦМЯ ЙАанОПЦРИи« частотном KKiK-noAV/HiawM.

ь/хж 1 X е M M n : i , '

Kl RV: UH> »)► V (44 ии> ON ill

OVK 1*4 оы ii Ii Ii Ii Il i il'

M (Км) OKK о* К ом в

L Kr» HP К» - lu MÍ; lO * Меню lot) HiU'. lo ¿ooo jyoo»x ioo«i>*oo«x im Hi -

1' Tf 0.30 l.ÜU .КЮ«Х гг.и . х-0 JULULl

тывая их с диска по мере необходимости; д) взаимодействие пары EPGD - EPGA реализуется путем аппаратных запросов (прерываний) драйверу на обслуживание со стороны EPGfl и прямой записью в порты адаптера со стороны EPGD.

При реализации однажды отработанного процесса (для которого существуют блоковые файлы) достаточно запустить EPGC с ключом -1 при указании соответствувщего файла процесса в качестве конфигурационного - тестирование блоков (EPGC) и запуск процесса (EPGD) производятся автоматически.

EPS Adapter представляет собой плату, устанавливаемую в

стандартный слот IBM PC AT и обеспечивающую аппаратнуа реализации одиночных и пакетных электрофоретических циклов путем управления блоковыми вентилями и фазовыми кличами силового коммутатора. Основными узлами являются: управляемый генератор, формирувщий тактовые сигналы с частотой, индивидуальной для каждого цикла или циклового пакета; блок таймеров, реализующий необходимые временные выдержки в текучем цикле; фазовый формирователь с регистрами масок, формирувщий выходную управляющую последовательность: блок прерываний, генерирующий аппаратные запросы EPGD на обслуживание адаптера по набору различных условий (в частности, в соответствии с требованиями по надежности лпбой аппаратный сбой последовательной логики приводит к генерации соответствующего запроса прерывания с последующим восстановлением исходного режима и перезагрузкой "сбитого" циклового пакета).

EPG Driver предназначен для обслуживания запросов EPS

адаптера и пользователя в oohodom ревкые и и представляет собой последовательный системный драйвер, включаемый в файл конфигурации системы и загружаемый вкесте с операци онной системой при включении компьютера. Занимаемое пространен во: на диске - 4.2 Кбайт, в памяти - 2.3 Кбайт кода (после отра ботки стартовых функций) плис 4.5 Кбайт под соупаняемый экран и стеки. EPGD содержит процедуры, часть которых заменяет собой соответствуете процедуры BIOS, а остальные выполняют вычислитель нне, защитные и прочие функции. Ядром драйвера являются три про рывания (таймерное, адаптерное и клавиатурное), взаимодействующие через флаги. Основные блоки показаны на рис.1.

Все функции драйвера по взаимодействию с адаптером и пользователем являются прерываниями, поэтому сбои в текущих программах

«

приводящие к "зависании" компьютера, не отражаются на работе EPGD и EPSft, - процесс продолжается при "висячей" машине без каких бы то ни было нарушений или ограничений. Код драйвера располагается в области памяти, отмеченной как тело системного драйвера (операционная система рассматривает его как часть себя самой).

Основное внимание при создании защиты обращено на следующие моменты:

1. Защита кода в памяти от изменения текучими программами (обеспечивается автоматически);

2. Защита от несанкционированного доступа к элементам EPG во избежание некорректного управления адаптером (кодирование обмена и блокирование портов адаптера);

3. Защита векторов собственных прерываний EPG Driver и используемых им векторов BIOS от модификации их текущими программами и запускаемыми резидентами (все аппаратные и ряд прерываний BIOS модифицируются таким образом, что при замене "охраняемого" вектора любое последующее действие, как-либо связанное с изменением аппаратного состояния ыаяины, приведет к восстановлении исходного вектора и выдаче соответствующего сообщения); программы, пытающиеся заменить взктора EPGQ, потеряют управление;

4. Защита от запрещенных и случайных нажатий на клавиатуре (соответствующая замена клавиатурной процедуры BIOS);

5. Поддержание требуемых режимов работы используемых EPGD контроллеров (периодическое восстановление режимов);

6. Автоматическое восстановление процесса при аппаратных сбоях адаптера, вызванных внесшими помехами (обработка соответствующих запросов адаптера).

Под быстродействием драйвера понимается скорость его реакции на заЕермение (или сбой) текущего циклового пакета - время, проходящее между запросом адаптера на обслуживание и фактическим предоставлением этого обслуживания, включающее в себя прохождение запроса через контроллеры прерываний, идентификацию типа прерывания, обработку этого прерывания и загрузку параметров нового (или восстанавливаемого) пакета. С целью достижения максимального быстродействия:

1. Вычисление параметров циклов реализуется в целых числах итерационным (вдоль серии циклов) методом в регистрах процессора или в памяти с использованием строковых команд в зависимости от степени полинома и типа процессора;

2, Код счетного блока в оперативной памяти перезаписывается на

оптииалышй всякий раз при загрузке очередного блока параметров с отличными от прежних режимами;

3. Приоритет адаптерного прерывания поддерживается равны* 2 (следующим за таймерным (0) и клавиатурным (1) приоритетами) путем периодического восстановления режимов контроллеров прерываний;

4. Буферируптся параметры текущего (восстановление) и следующего (очередной) пакетов; расчет параметров нового пакета проводится параллельно с реализацией адаптером текущего пакета.

Основные особенности пользовательского интерфейса:

1. В момент запуска драйвера EPGD возникает фоновый режим работы системы, существующий до момента выхода из драйвера и не зависящий от процессов в текущих программах, но налагающий некоторые ограничения на возможности этих программ, обусловленные требованиями защиты процесса электрофореза;

2. Любая информация о контролируемом злсктрофоретическом процессе может быть получена в любой момент времени (иезаписимо от действий текущей программы) - при вызове EPGD на экран выдаются все исходные и текущие (непрерывно изменяющиеся) параметры; пользователь может вызвать драйвер, находясь, например, в текстовом редакторе, при этом содержимое экрана запоминается (в случае 810S video aode 3), восстанавливаясь при возврате в редактор;

3. Процесс может быть остановлен (с последующим продолжением) или завершен (выход из драйвера) в любой момент времени;

4. При любом нарушении условий процесса (повреждение конфигурационного или блоковых файлов, обрыв линий связи с коммутатором, попытки наруиения защити и т.п.), а также в случае "подозрительных" действий (например, останов процесса), факт наруиения фиксируется, а также, если нужно, включается звуковая сигнализация.

EPG Со«жап(1ег обеспечивает установку, проверку, отладку,

трассировку блоковых файлов, запуск EPGD, а также ряд специальных функций, связочных с тестированием и трассировкой адаптерной платы и с прямым управлением адаптером (например, в случае ручной трассировки платы). Наличие режима эмулятора адаптера позволяет отлаживать полный процесс на компьютерах, не имеющих адаптера (EPGC, эмулируя адаптер, сам генерирует запросы драйверу). EPGC может также выполнять все функции EPGD. исключая реализацию фонового режима и защиты (EPG Cooander Tracer); при этом снижается быстродействие (часть функций вызывается из EPGD), зато предоставляется возможность контролировать (при необ-

ходимости) все регистры EPG Adapter, оперативно управляя процессом трассировки; запуск трассировщика производится автоматически при загрузке EPGC с ключом -t и указанием соответствующего конфигурационного файла. Занимаемое пространство: на диске - 22.7 Кбайт, в памяти - 17.9 Кбайт основного кода (после отработки стартовых функций) плюс 4 Кбайт под сохраняемый экран.

Г/lflBft 5. Содержит описания конкретных примеров использования системы Electrophoretlc Pulse Generator при реализации классического и различных импульсных методов рутинного эле-ктрофоретического анализа (раздел 5.1) и при изучении электро-форетической подвижности молекул ДНК (раздел 5.2). Ниже приведены некоторые из этих примеров.

Пример 1. Реализация метода равномерной частотной

FIGE - модуляции.

Задача: Реализовать условия процесса (Turnel et al.. NfiR, 1990, U.18. P.569-575) по разделению хромосомной ДНК (5.7, 4.6 и 3.5 НЬ. 1%-агароза, ТВЕ). Условия: Разделение проводится методом FIGE в течение трех суток в стандартной двухэлектродной электрофоретической камере при Е1=2 В/см,Е1/Е2=3.2, TU1575 с. Т1/Т2=0.714, где Е1.Е2 и Т1,Т2 - амплитуды и длительности импульсов положительной и отрицательной полярностей соответственно, причем в указанный цикл FIGE каждые .2 секунды врезается "впилька" (инверсия напряжения) длительностью 0.1 секунды (равномерная частотная модуляция). Спустя 30 минут после установки вставок с ДНК в карманы геля и заполнения системы буфером на протяжении полутора часов производится ввод ДНК в гель при Е=1.2 В/см.

Данный процесс может быть реализован в виде трех блоков: 1 -ожидание "стабилизации" системы гель-ДНК-буфер в течение Tf =' 30 минут; 2 - ввод ДНК в гель при постоянной напряженности поля Е = 1.2 В/см в течение Tf=l ч 30 мин; 3 - частотная модуляция (основной процесс) в течение Tf=72 ч. Схема эксперимента приведена на рис.3 (используется схема классического двухамплитудного FIGE).

Блок 1. Все источники напряжения блокированы (отключены все управляющие фазы к блоковые вентили). Установлен режим TIME (любые параметры, кроме Tf, безразличны). По истечении 30 минут подается звуковой сигнал окончания блока, после чего EPGD считывает из файла PROCESS.CFG имя следующего блока (ENTER.EPG).

Блок 2. Камера подключена к источнику Е, остальные источники блокированы. Можно замаскировать все управляющие фазы, кроме Fp (режимы FULL или MASK). Параметры t. Nn, Np выбраны так, чтобы длительность "положительного" полупериода FIGE превыжала- время Tf. Остальные параметры безразличны. По истечении времени Tf подается звуковой сигнал окончания текущего блока и производится запуск следующего (PR0CS.EPG).

Блок 3. Камера подключена к источникам Е1,Е2, источник Е блокирован. Можно замаскирован все управляющие фазы, кроме Fp и Fa (режим FULL). Последовательность циклов FIGE с равномерно врезаемыми в них "опильками" можно представить непрерывно повторяющейся серией циклов, имеющей два состояния (рис.3), Н=1 (Х=0,1): при Х=0 выполняются Р(0) циклов с Т1(0)= 2 с, Т2(0)= 0.1 с, а при Х=1 выполняются Р(1) циклов с ТК1)=0.1 с, Т2( 1 )= 2 с. Требуемая равномерная частотная FIGE-модуляция реализуется элементарным набором параметров Independent Linear Function: И=1. t= 100 ses, Nn=10, Np=2Q00--13C0*X, Ni = 100+1900*X, P = 750+300*X. По истечении времени Tf подается звуковой сигнал окончания блока, после чего, обнаружив отсутствие следующего блока, ЕР GD подает звуковые сигналы, ожидая команды заверяения процесса; по получении т^иовой происходит блокирование функций защиты и выход из драйвера.

Итак, заданный процесс полностью определяется четырьмя следующими файлами:

1. Файл конфигурации процесса (PROCESS.CFGЭ: DELAY.EPG; ENTER.EPG; PROCS.EPG;

2.

Блок 1;

3.

Блок 2:

4.

Блок 3:

Файл DELAY.EPG:

Наже: DELAY.EPG;

Kode: TIKE;

Function : UC;

Pause: OFF;

Sound: ом;

Tf: 0.30;

t: loo »s:

P: 1.0,0.0;

И: l:

Nn: 2.0,0.0;

Np: 1.0.0.0;

Na: 1.0,0.0;

Fn: OFF;

Fp: OFF;

Fn: OFF;

Fr: OFF;

Fl: OFF;

Kl: OFF;

K2: OFF;

КЗ: OFF;

K4: OFF;

K5: OFF;

Оайл enter.epg:

Naae: enter.epg

Hode: FULL;

Function:. uc;

Pause: OFF;

Sound: ON;

Tf; 1.30;

t: 10 «s;

p: 1.0.0.0;

k: 1;

Nn: 10.0,0.0;

Np: 60000,0,0.0;

Ni: 1.0.0,0;

Fn: OFF;

Fp: ON;

fi: OFF;

Fr: OFF;

fl: OFF;

kl: ON;

k2: OFF;

кз: OFF;

k4: OFF;

k5: OFF:

Файл PfeOCS.EPG:

Naae: PR0CS.EPG;

Kode: FULL;

Function: IL;

Pause: OFF;

Sound: ON;

Tf: 72.0;

t: 100 «es;

P: 750,300,0,0;

H: i:

Nn: 10,0,0,0;

Np: 2000,-1900,0,0;

Ni: 100,1900.0,0:

Fn: OFF;

Fp: ON;

Fa: OH;

Fr: OFF;

Fl: OFF;

Kl: OFF;

K2: ON;

кз: OFF;

K4: OFF; ■

К5: . OFF;

Таким образом, использование системы EPG позволяет реализовать эффективный метод равномерной частотной FIGE-модуляции на персональном компьютере без использования специализированного оборудования, не монополизируя компьютер и избавляя пользователя от необходимости самостоятельно управлять этим процессом на протяжении эксперимента. При необходимости повторения эксперимента достаточно запустить процесс, указав в качестве файла конфигурации файл PROCESS.CFG.

Пример 2. Подвижность коротких молекул ДНК в импульсном поле FIGE.

Приведены данные экспериментов по изучению подвижности коротких линейных и сверхспирализованных молекул ДНК в импульсном поле FIGE. Подвижность таких молекул в поле FIGE недостаточно изучена, хотя подобные исследования представляют значительный инте-

pec с точки зрения повышения чувствительности метода FIGE и его вариантов в приложении, например, а проблеме прецизионной идентификации рестрикционных фрагментов в методе генной дактилоскопии.

Исследовалась подвижность рестрикционных фрагментов ДНУ. фага Л ( X/Pstl.X/liindlII: 1,1-11,5 kbp) и сверхспирализованных кольцевых ДНК (рАОЗ, pUC13. pBR322, Col El : 1.7-6,6 kbp; iZ-агароза. TOE ptl 8.3) при 20°С в поле FIGE с частотой 1-1000 Гц.

Использовалась одноамплитудная схема классического FIGE при Е =10 В/см, Т1/Т2=10 и Т1- 1,5,10,50,100,500 и 1000 ис в различных опытах с предварительным вводом ДНК в гель при Е= 2 3/си в течение 10 минут. В терминах системы EPG укапанная конфигурация пол-ностьп описывается тремя файлами:

1. Файл PROCESS.CFG (конфигурация): CONST.НОТ; PULSE.DAT;

?.. Файл CONST.DAT (ввод ДИК в гель): Hane-.COHST.IMT: Mode: FULL; FimctionrUC; Pause:GFF: Soimd:0M: Tf: 0.10; t: 100 as; P:l.0,0,0; H:l; KnrlO.0.0.0; Hp:60000,0. 0,0; Mart.0.0.0; Fn: OFF; Fp:0K; Fa:OFF; Fr:0FF; FT.0FF; KlrON; K2-.0FF; K3:0FF; K4:0FF;K5:0FF;

3. Файл PULSE.DAT (классический FIGE): Nane:PULSE.DAT; Mo de:FULL; Function:UC; Pause;0FF; Sound;0N; Tf:?; tr?: P:1.0.0,0; M:l; Hn:2,0.0,0; Np:50,0,0.0; Na: 5,0,0,0; Fn: OFF; Fp;0N; Fa: ON; Fr:0FF; F1:0FF; KlrON; K2:0FF; K3:0FF; K4:0FF; K5:0FF;

где параметр t составлял 10,50,100.500 bcs, 1,5,10 as в различных экспериментах, а длительность процесса Tf задавалась индивидуально .

Полученные результаты приведены на рис.4. Отметим, что подвижность молекул монотонно снижается с ростом частоты поля FIGE, начиная примерно с 20 Гц. Указанный эффект находился в противоречии с суцествовавними к 1383 году .«ачественными теоретическими оценками. В указанном'интервале частот никаких иуцествешшх особенностей поведения сверхспирализованных молекул ДНК (влияние частоты на подвижность различных топоизоиероа) не наблвдалось.

Таким образок, с помоцьо EPG было впервые показано, что зле-ктрофорзтическая подвижность коротких линейных (1,1-11,5 kbp) и сверхспирализованных (1,7-8.В kbp) молекул ДНК в агарозном геле уменьяагтся с ростом частоты знакопеременного псяя.

Припер 3. Быстрое разделение фрагментов ДНК.

Разделить фрагменты Л/Xhol (33,5 и 15,0 kbp) за B03MOIHO меньшее врема (1%-агароза, 0.25 х TBE, 1 мкг/мл EtBr).

Разделение проводится в стандартной двухэлектрод-ной электрофоретической камере либо в постоянном поле при Е=2 В/см или Е= Í5 В/см, либо методом FICE при Е=15 В/см, Т1/Т2= 3 по классической одноампли-тудной схеме.

Полученные результаты приведены на рис.5: 1 - постоянное поле Е- 2 В/см, Tf= 10 часов; 2 - постоянное поле, Е= 15 В/см, Tf= 30 минут; 3 - FIGE, Е=15 В/см. T1-3Î5 мс, Tf=0 минут; 4 - FIGE. Е= 15 В/см, Т1=335 мс, Tf = 30 минут.

Описание блоков для случаев постоянного поля совпадает с файловым описанием CQHST.OftT из примера 2 (за исключением значений Tf). В случае FIGE разделение осуществлялось путем максимального торможения длинного (33.5 kbp) фрагмента. Поскольку в постоянном поле Е=15 В/см этот фрагмент проходит 18 мм за 30 минут (рис. 5.2), оптимальная длительность положительного полупериода составит Т1= 1.8(30/18)(33.5/0.3)= 335 мс. что реализуется выбором Unvariable Const Function при t=5 вез, Nn=20, Нр=3350. Ни=1117. Например, деление рис.5.3. реализуется следующим блоком:

Файл LL_XhoI.RST (разделение фрагментов X/Xhol):

NaBe:LL_XhoI.RST; Mode:FÜLL; Function: UC; Pause:0FF; Sound:0N; Tf:0,8; t:5 bcs; P:1.0,0,0; К: 1; Nn: 20,0,0,0; Hp:3550,0,0,0; Nk:1117,0.0,0; Fn:0FF; Fp:0N; Fe: 0N; Fr:OFF; F1:0FF; K1:0K; K2:0FF; K3:0FF; K4:0FF; K5:0FF;

Выводы: Отметим, что: а) при расхождении зон на одно и то же расстояние FIGE занимает в 4 раза меньве времени, нежели классический электрофорез, причем ■ пройденное зонами расстояние уменьвается в 8 раз (или, что то же, при одном и том же времени разделения FIGE разводит зоны на расстояние, в 4 раза большее, сокращая при этом б 2 раза пройденное ими расстояние): б) з пале

Задача: Условия:

Результаты:

Реализация:

Закигинистн ЭП (и сы'/В-с) линейных (и) н С№рМ-П!ф1.1ИХ<1«ИИЫ* (в) ЖО«у.1 ДНК ' ЧТ и> М.НТЧ'НОЙ .1НПНН (Л, г.п.щ • ИМ Г1С.1: при £-10 В/с», г,/1,-0.1. I,/1,-002 ' н рахш'ныч значении« I,: 1 — 1000. 2- 500. 1—100. <-50. 3—10. (—5. 7—1 ас. | Пунктирные линии 3 л 9 получены и Шктоинним п.по с напражениостыо 10 и 7,9 8,'сч.|

РИС. 4. ПОДВИЖНОСТЬ КОРОТКИХ ПОЛЕКVл дик

В ИППУЛЬСИОН ПОЛЕ Р1ак. _

III.II

± г

РИС. 5.

БЫСТРОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ Ч*>АГНЕ»(ТОВ ДНК.

т

г

о «М

РИС . е.

EUCTI'OE ПРЕЦИЗИОННОЕ

|>пздг.т;ииЕ спсси ят>лгпентов аи.

h

I

iva сэ I

FIGE наблюдается уменьиение эффекта расширения зон в процессе электрофореза по сравнении с классическим случаем. Таким образом'. использование EPG позволяет элементарно реализовать следующие важные преимущества, присущие методу FIGE:

- малое время разделения;

- использование коротких гелей и миниатюрных электрофорети-ческих камер;

- повышение разрешающей способности за счет сяатия зон. Обеспечивается также удобство воспроизведения эксперимента: для расхождения фрагментов Л/Xhol на расстояние I мм за 8 минут п геле длиной 1 см достаточно запустить EPG Coaisander с ключом -I, указав в конфигурационном файло уже отработанный однажды файл LL_XhoI.RST.

Пример 4. Быстрое прецизионное разделение

смеси фрагментов ДНК.

Задача: Разделить смесь ДНК фага X и ее фрагментов Л / /Xhol. A/Xbal (48.5, 33.5. 24.5 5 24.0 и 15.0 kbp) так, чтобы соседние зоны разовлись на одинаковое расстояние друг от друга за возможно меньшее время (1%-агароза, 0.25 х TRE, 1 мкг/мл EtBr).

Условия: Разделение проводится в стандартной дпухэлектрод-ной элсктрофоретической камере либо в постоянном поле при Е=2 В/см или Е=15 В/см, либо методом FIGE при Е=15 В/см, Т1/Т2= 3 по классической одноампли-■ тудной схеме.

Результаты: Полученный результаты приведены на рис.8: 1 - постоянное поле Е= 2 В/см, Tf= 10 часов; 2 - постоянное поле, Е= 15 В/см. Tf= 30 минут; 3 - FIGE, Е=13 В/см, Т1-448 мс, Tf=30 кинут; 4 - FIGE, Е= 15 8/см, Т1=584 мс, Tf= 30 минут; 5 - FIGE, Е=15 В/см, Tf= 60 минут. Independent Linear Function при M=l, t=5 «es. Kn-20. Np--4480vl360*X, Na^i4r33+454*X, P--4018--936*X.

Реализация; Описание блоков для случаев постоянного поля аналогично описанию CONST.DftT из примера 2, для процессов FIGE - рис.6.3 и рис.6.4 - описанию LLJUioI.RST из примера 3; деление в последних случаях осуществлялось путем максимального торможения зоны л (19.5

ии / 30 минут, рис.6.2; 40.3 kbp) и фиктивной зоны С 18.5 ми / 30 ыипут; 60 kbp) соответственно, откуда Т1 составит 1.8(30/19.5)* ♦ (48.5/0.3) - 448 иг. и 1 .8(30/10,5)( 60/0.3 ) = 584 мс. Процесс l._XhoXba.FG0 (рис.В.5) реализует линейное масштабирование по времени (линейная комбинация процессов 3 и 4 с весами 0.5):

Файл L_XhoXba.F60 (прецизионное деление 4-коипонентной смеси): Плие: L.XhoXba.FGO; Mode: FULL; Fundi on:IL: Pause:0FF; Sound;0H; Tf:l,0; t: 5 mes; P:'40i8,--93G, 0.0; H: I; Nn:20,0.0,0; Np:4480,1300,0,0; Na:1493,454,0,0; Fn:0FF; Fp: OK; Fa: ON; Fr:0FF; F1:0FF; K1:0H; K2:0FF; КЗ: OFF; K4:0FF; K5:0FK;

Выводи: В постоянных полях спесь не делится, при Е= 15 В/см происходит сильное рассеивание материала зон. Либой из процессов FIEE обеспечивает деление смеси не более чем за 30 минут с одновременный конденсированием зон. Процесс L.XhoXba.FGO (рис.G.5) обеспечивает кроме того еце и равномерное удаление соседних зон друг от друга, что, повивая разрешение, позволяет еце больше сократить время процесса: для расхождения зон на 0.7 мы (две наиболыих миршш зоны) достаточно 20 минут; быстрое деление реализуется блоком:

Файл L_XhoXba.F20 (быстрое прецизионное деление 4-компонент-ной смеси): Haae;L-XhoXba.F20; Mode : FULL : Function: IL; Pause:0FF; Sound: ON; Tt": 0,20; t: 5 acs; P: 1339,-312,0,0; H: 1; Nn: 20,0.0,0; Np: 4480,1360,0,0; Na: 1493,454,0,0; Fn:0FF; Fp:0U; Fa:0N; Fr:0FF: Fl:0fF; K1:0N; K2:0FF; КЗ:OFF; K4:0FF; KS-.0FF;

Таким образом, использование системы ЕРЕ позволяет принципиально повысить разрешающую способность метода FIGE путем линеаризации расхождения зон в процессе электрофореза, обеспечивая максимально возможную точность деления при минимальных затратах сремени. Так, для расхождения ДИК фага X и ее фрагментов Л/ /Xhol и X/Xbal на расстояние 0.7 мм друг от друга за 20 минут в геле длиной 1 см с одновременным сжатием зон достаточно запустить EPG CoMander с ключом -1, указав в конфигурационном файле уже отработанный файл L_XhoXba.F20.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВМВОДИ

1. На основе анализа известных иетодов импульсного гель-электрофореза разработан формализовании!* набор параметров универсальной автоматизированной электрофоретичесной снстеиц (АЭОС). Показано, что указанная структура параметров позволяет реализовать все известные в настоящее вреыя импульсные методы при помочи одного и того ае программно-аппаратного обеспечения.

2. Разработана общая структура универсальной АЭФС, обеспечивающей автоматическое проведение рутинного и поискового элек-трофоретического анализа и допускающей расвирение в экспертную систему.

3. Разработана и реализована прикладная АЗФС - комплекс Elect-rophoretic Pulse Generator (EPG). реализующий временные и нагрузочные характеристики произвольных методик импульсного гель-электрофореза и обладающий яирокнми возможностями по управлении их параметрами (отладка и текущий контроль, фоновый режим работн, защита и помехоустойчивость контролируемого процесса).

4. При разработке АЭФС учтена особые требования, предъявляемые спецификой гель-электрофореза к надежности комплекса и интерфейсу с пользователем - устойчивости к сбоям в текущих программах, помехоустойчивости и защите от несанкцйонировашшх действий (предусмотрены, в частности, защита векторов собственных прерываний АЭФС и автоматическое восстановление процесса при возможных аппаратных сбоях). Особое внимание обращено также на минимизации используемых ресурсов н быстродействие системы.

5. Продемонстрирована эффективность автоматизированной системы при реализации рутинного электрофоретического анализа и исследовании электрофоретической подвижности биополимеров (с помоцьш EPG. в частности, впервые было показано, что элект-рофоретическая подвижность коротких линейных и сверхспирали-

зованных молекул ДНК убывает с ростов частоты знакопеременного импульсного электрического пола). Внедрение ЙЭФС в лабораторную практику позволит резко повысить эффективность исследований.

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

1. Чеботарев B.D.. Реке« ft.H. Метод импульсного гель-элект-

рофореза в исследовании биологических макромолекул. - ,. - Молекулярная биология. 1990, Т.24. N 4. С.598-613.

2. Чеботарев B.D.. Рекеа ft.H. Импульсный гель-электрофорез

биополимеров. - Препринт ИМГ АН СССР, N 90.02, М., 1990, 89 с.

3. Чеботарев B.D. Электрофо-ретическая подвижность коротких

линейных и сверхспирализованных молекул ДНК в знакопеременном импульсном электрическом поле. - Биофизика, 1990, Т.35. H 6. С.938-939.

4. Чеботарев B.D., Реке« А.Н. Классический и импульсный ге-

льздектрофорез биополимеров: Теория и приложения.- Биофизика. 1992. Т.37. H 2, £.243—¿89.

5. Чеботарев i.D. Программно-аппаратный комплекс для иссле-

дования биополимеров методами импульсного гель-электрофореза. - Приборы и техника эксперимента, 1992, N 6.